MXPA06005738A

MXPA06005738A - Proteinas que pertenecen a la familia bcl-2 y fragmentos de las mismas y su uso en pacientes con cancer.

Info

Publication number: MXPA06005738A
Application number: MXPA06005738A
Authority: MX
Inventors: Eivind Per Thor Straten; Mads Hald Andersen
Original assignee: Survac Aps
Priority date: 2003-11-19
Filing date: 2004-11-18
Publication date: 2006-12-14
Also published as: US20080050396A1; JP2011246496A; ES2436429T3; HK1101131A1; DK1691824T3; CA2546794A1; KR20130026527A; JP2007511547A; CN1921878B; PT1691824E; ES2323588T3; CA2546794C; WO2005049073A3; EP1691824B1; AU2004290866A1; KR101216655B1; ATE424842T1; EP2087904B1; EP2087904A1; ZA200604866B

Abstract

La presente invencion se refiere a las proteinas que pertenecen a la familia de proteinas Bcl-2 y los fragmentos peptidicos de las mismas, para el uso en composiciones farmaceuticas. La proteinas descritas y los fragmentos peptidicos son en particular utiles en composiciones de vacuna para el tratamiento del cancer. La invencion se refiere ademas a los metodos de tratamiento utilizando dichas composiciones. Un aspecto de la invencion es tambien proporcionar las celulas T y los receptores de celulas T que reconocen especificamente las proteinas descritas y los fragmentos peptidicos.

Description

una variedad de condiciones, incluyendo la retención del potencial de membrana mitocondrial y la estimulación de citocinas. La búsqueda de las proteínas responsables de los fenotipos resistentes a fármacos han implicado la molécula anti-apoptótica Bcl-2. La sobreexpresión de Bcl-2 juega un papel en el desarrollo de la resistencia a fármacos en la leucemia y otros tumores propensos a la apoptosis y, en consecuencia, un pobre · pronóstico en diversos cánceres humanos. Bcl-2 pertenece a la familia de proteínas, la familia Bcl-2, los miembros de la cual regulan la apoptosis. La familia incluye miembros pro-apoptóticos y anti-apoptóticos . Aunque un entendimiento preciso de cómo ejercen Bcl-2 o sus efectos anti-apoptóticos que sigue siendo elusivo, se ha encontrado que es sobreexpresado en muchos cánceres incluyendo cánceres de pulmón, colorrectal, próstata y mama, así como en leucemias y linfornas. De este modo, Bcl-2 es un factor celular crítico, ya que los niveles de expresión incrementados de esa proteína confieren resistencia a estímulos apoptóticos, con lo cual se contribuye a la patogénesis y a la progresión del cáncer. El proceso mediante el cual el sistema inmune de mamífero reconoce y reacciona a materiales extraños o ajenos es complejo. Una faceta importante del sistema es la respuesta de células T. Esta respuesta requiere que las células T reconozcan e interactúen con los complejos de las moléculas de la superficie celular referidas como antígenos leucocitarios humanos (HLA, por sus siglas en inglés) que constituyen el complejo de histocompatibilidad mayor humano en (MHC) y los péptidos . Los péptidos ' son derivados de moléculas más grandes, las cuales son procesadas por las células, que a su vez presentan la molécula HLA/MHC. La interacción de las células T y los complejos de HLA/péptido está restringida, requiriendo una célula T que es específica para una combinación particular de la molécula HLA y un péptido. Si una célula T específica no está presente, no existe respuesta de célula T incluso si su complejo socio está presente. Similármente-, no existe respuesta si el complejo específico está ausente, pero la célula T está presente. El mecanismo mediante el cual las células T reconocen anormalidades celulares ha sido también implicado en cáncer. Por ejemplo, en WO92/20356, es descrita una familia de genes que son procesadas en péptidos los cuales, a su vez, son expresados sobre las superficies celulares, y pueden conducir a lisis de las células tumorales por CTL específicos. Estos genes son denominados en la familia MAGE y se dice que codifican para los "precursores de antígeno de rechazo de tumores" o "TRAP" , y los péptidos derivados de los mismos son denominados como "antígenos de rechazo de tumor" o "TRAs" . En el documento WO 94/05304, son descritos los nanopéptidos que se enlazan a la molécula HLA-A1. Esta referencia describe que, dando la especificidad conocida de los ' péptidos particulares para las moléculas HLA particulares, se debería esperar que un peptido particular se enlace a una molécula HLA, pero no a otras. Esto es significativo, ya que diferentes individuos poseen diferentes fenotipos de HLA. Como resultado, mientras que la identificación de un péptido particular por ser un socio para una molécula de HLA especifica tiene ramificaciones de diagnóstico terapéuticas, éstas son únicamente relevantes para individuos con ese fenotipo de HLA particular. De este modo, se establece bien que los epitopos peptídicos derivados de antígenos asociados al tumor (???) pueden ser reconocidos como antígenos por los linfocitos T citotóxicos (CTL) en el contexto de las moléculas de MHC. No obstante, aunque se acepta en general que la mayoría, sino es que todos, los tumores son antigénicos, únicamente unos pocos son más bien inmunogénicos en el sentido de que la progresión del tumor es fácilmente controlada por el sistema inmune. Para superar esta limitación, han sido iniciados varios estudios inmunoterapéuticos, por ejemplo vacunaciones con péptidos derivados de TAA. Para el melanoma, el tumor para el cual ha sido caracterizado el número más grande de TAA definidos por CTL, respuestas de CTL poderosas contra los antígenos han sido inducidas por vacunación, y algunos pacientes experimentan una remisión completa de su enfermedad. No obstante, la mayoría de los epitopos peptídicos utilizados en estas pruebas de vacunación son específicos de melanocitos, y éstos péptidos no pueden ser aplicados para tumores de origen no melanocito. Además, la expresión de estos TAA es heterogénea entre los tumores provenientes de diferentes pacientes y puede incluso variar entre las metástasis obtenidas de un paciente. No obstante, durante el último par de años ha sido identificado un número de antígenos peptídicos específicos del tumor, los cuales son expresados en un número de diferentes cánceres, por ejemplo, HER-2, Muc-1 y telomerasa. La apoptosis es un programa genético de suicidio celular, y la inhibición de la apoptosis ha sido sugerida como un mecanismo importante involucrado en la formación del cáncer, por la extensión del lapso de vida de las células que favorecen la acumulación de mutaciones transformantes. La survivina es un miembro recientemente identificado de la familia de inhibidores de las proteínas de apoptosis (IAPs) . En un análisis de expresión global de genes de aproximadamente 4 millones de transcriptos, la survivina fue identificada como uno de los genes superiores invariablemente supra-regulados de muchos tipos de cánceres pero no en tejido normal . Las malignidades sólidas que sobreexpresan la survivina incluye cáncer de pulmón, colón, mama, páncreas y próstata, así como malignidades hematopoyéticas . Adicionalmente, una serie de cánceres de piel melanoma y no melanoma han sido reportados por ser invariablemente positivas a las survivina. Las sobreexpresiones de survivina en la mayoría de los cánceres humanos sugiere un papel general de la inhibición de la apoptosis en la progresión del tumor, una noción sustancial por la observación de que en el caso del cáncer colorrectal y de vejiga, así como de neuroblastoma, la expresión de la survivina estuvo asociada con una prognosis desfavorable. En contraste, la survivina es indetectable en tejidos normales de adulto. Estas características califican en la survivina como un ??? adecuado para fines de diagnóstico y fines terapéuticos . De este modo, durante la última década han sido identificados un gran número de TAA que son reconocidos por CTL de una manera restringida en el complejo de histocompatibilidad mayor (MHC) por sus siglas en inglés. Ya que la survivina es sobreexpresada en la mayoría de los cánceres humanos y la inhibición de su función da como resultado apoptosis incrementada, ésta proteína puede servir como un objetivo para las respuestas terapéuticas de CTL. La proteína survivina y el potencial uso de diagnóstico terapéutico de la misma se describen en (1) y en la patente de los Estados Unidos No. 6,245,523, que se incorpora por referencia en la presente. La survivina es una proteina citopl smica de 16.5 kDa que contiene un BIR simple y una región helicoidal enrollada carboxilo-terminal altamente cargada en vez de un dedo RING, que inhibe la apoptosis inducida por el retiro del factor de crecimiento (IL-3) cuando se transfiere en precursores de células B. El gen que codifica para la survivina casi idéntica a la secuencia del receptor 1 de proteasas de células efectoras (EPR-1) , pero orientado en la dirección opuesta, sugiriendo de este modo la existencia de dos genes separados duplicados en una configuración cabeza a cabeza. En consecuencia, la survivina puede ser descrita como un producto EPR-1 antisentido. Funcionalmente, la inhibición de la expresión survivina por la supra-regulación de su transcrito de EPR-1 antisentido natural, da como resultado apoptosis masiva y crecimiento celular disminuido. La patente de los Estados Unidos No. 6,245,523 el aislamiento de la survivina purificada, y ésta proporciona las moléculas de ácido nucleico que codifican para la proteina survivina, y los anticuerpos y otras moléculas que se enlazan a la survivina. La patente de los Estados Unidos No. 6,245,523 también describe los fragmentos anti-apoptóticamente activos de la proteína survivina y variantes de la misma, en donde un residuo de aminoácidos ha sido insertado en N- y C-terminal a, o dentro de, la secuencia de survi ina descrita. Se describe específicamente que tales péptidos deben contener residuos funcionales claves requeridos para la apoptosis, por ejemplo, Trp en la posición 67, Pro en la posición 73 y Cys en la posición 84. Durante la última década numerosas pruebas clínicas han mostrado la factibilidad de la vacunación específica de péptidos para inducir respuestas de células T anti-tumorales, en pacientes con cáncer. El curso clínico de los pacientes, no obstante, en la mayoría de los casos no son mejorados. Esta discrepancia ha sido explicada en numerosos casos por los mecanismos de escape al sistema inmune de las células tumorales . Para estrategias terapéuticas de dirección a los antígenos que juegan un papel insignificante en el desarrollo del cáncer, la selección de las células cancerosas deficientes en antígenos es una limitación bien reconocida. En el caso de pacientes de cáncer de mama, no obstante, ha sido observado un papel paradójico de la proteína Bcl-2.. En los tumores de mama primarios, la negatividad al Bcl-2 ha sido asociada con un resultado clínico peor. Adicionalmente, se ha reportado que la sobreexpresión de la proteína Bcl-2 está correlacionada con los tumores positivos al receptor de estrógeno, mediados por los elementos de respuesta al receptor de estrógeno, en la región promotora del gen de Bcl-2. La prognosis de los tumores positivos al estrógeno es más favorable que aquella de los tumores negativos al receptor de estrógeno . Varias explicaciones posibles para estos resultados al parecer paradójicos, han sido sugeridas, por ejemplo, los efectos inhibitorios de Bcl-2 sobre la proliferación celular, la regulación de la expresión de Bcl-2 por el estrógeno, y/o la presencia de antagonista de Bcl-2 que inhibe su función citoprotectora . Todavía, los estudios anteriores también mostraron que la sobreexpresión de Bcl-2 en cáncer de mama está correlacionada con la resistencia al fármaco, y que la subregulación de Bcl-2 por los oligonucleótidos antisentido madura la sensibilidad del fármaco en asociación con la apoptosis. Además, la transfección de gen de Bcl-2 en lineas celulares de cáncer de mama ha dado como resultado uniformemente resistencia incrementada a la apoptosis. Además, se ha descrito la presencia de otro inhibidor de la apoptosis, la proteína survivina en el carcinoma de mama estuvo fuertemente asociada con la expresión de Bcl-2 y con el índice apoptótico (Al) reducido, y la pobre supervivencia general. Una asociación similar entre la survivina y Bcl-2 ha sido descrita en neuroblastoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, y linfoma no Hodgkin de alto grado. De este modo, en el carcinoma de mama como en la mayoría de otros cánceres humanos, la inhibición de la apoptosis es una característica general, y la expresión de los genes anti-apoptosis por ejemplo, los genes de survivina y/o Bel-2, puede provocar efectos anti-apoptóticos más pronunciados, cuando es reflejado en el índice apoptótico reducido. Recientemente, se ha mostrado que la survivina es un objetivo para la reactividad espontánea de las células T en pacientes con diversos cánceres. Estos hallazgos iniciales han sido confirmados posteriormente y también reforzados (por nosotros mismos y otros) .

BREVE DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN La presente invención está basada en el descubrimiento de que los péptidos restringidos a MHC de la clase 1 pueden ser derivados de una clase diferente de proteínas reguladoras de la apoptosis diferente a la survivina, por ejemplo, la familia de proteínas de Bcl-2 que son capaces de enlazarse a las moléculas de HLA de la clase 1 de MHC, y con ésta promover las respuestas inmunes de CTL en pacientes que sufren de enfermedades cancerosas . Estos hallazgos demuestran que las proteínas que pertenecen a la familia de proteínas de Bcl-2 actúan como moléculas TRAP, que son procesadas in vivo por las células en péptidos que tienen funcionalidad de TRA. Estos hallazgos abren el camino para novedosos procedimientos terapéuticos y de diagnóstico que pueden ser en general aplicables en el control de enfermedades cancerosas . La presente invención describe que Bel-2 es un objetivo adecuado para la inmunoterapia contra , una gama de enfermedades cancerosas. Bcl-2 es un factor celular crítico y su expresión es de importancia para la supervivencia de las células tumorales. De este modo, Bcl-2 es un objetivo atractivo para la vacunación, debido a que el escape inmune por la subregulación en la pérdida de expresión de esta proteína, podría deteriorar el crecimiento tumoral sostenido. Además, en los estudios que conducen a la presente invención, los inventores buscaron y detectaron la reactividad espontánea de células T en PBL contra péptidos derivados de Bcl-2 en pacientes con cáncer de mama utilizando un ensayo ELISPOT. En consecuencia, la presente invención pertenece en un primer aspecto a una proteína aislada que pertenece a la familia de proteínas de Bcl-2 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de la misma, para el uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de un cáncer. En particular, la invención pertenece a los fragmentos peptídicos inmunogénicamente activos, aislados, derivados de una proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 para el uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de un cáncer. En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteina anterior y/o un fragmento peptídico de la invención. Es también un aspecto de la invención el proporcionar una composición de vacuna que comprende una proteína aislada que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de las mismas, o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína o el fragmento peptídico, para el uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de un cáncer. En otros aspectos adicionales, la invención se refiere a un equipo de diagnóstico para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente con cáncer, de células T en PBLs en el tejido tumoral, que son reactivas con un miembro de la familia de proteínas Bcl-2, el equipo comprende el fragmento peptídico de la invención, como se define anteriormente; un complejo de un fragmento peptídico de la invención y una molécula HLA de la clase I o un fragmento de tal molécula. Un objetivo de la invención es también proporcionar un método para detectar en un paciente con cáncer, la presencia de un miembro de la familia de proteínas Bcl-2 reactivo con las células T, el método comprende poner en contacto un tejido tumoral o una mezcla de sangre con un complejo de la invención, como es definida anteriormente, y detectar el enlace del complejo al tejido o a las células sanguíneas . Además, se proporciona una molécula que es capaz de enlazarse específicamente a un fragmento peptídico de la invención, y a una molécula que es capaz de bloquear tal enlace. En otro aspecto más, la invención pertenece a un método para tratar una enfermedad cancerosa, el método comprende administrarle a un paciente que sufre de la enfermedad, una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de la invención, la molécula de la invención que es capaz de enlazarse específicamente a un fragmento peptídico de la invención y/o una molécula de la invención que es capaz de bloquear tal enlace . En otro aspecto más, la invención proporciona el uso de la proteína o fragmento peptídico como se define en la presente, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad cancerosa.

DESCRIPCIÓN DETALLADA DE LA INVENCIÓN Un objetivo principal de la presente invención es proporcionar las proteínas aisladas que pertenecen a la familia de proteínas Bel-2 o un fragmento peptídico inmunológicamente activo de las mismas para el uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de un cáncer. La familia de proteínas Bel-2 incluye varias proteínas, las cuales regulan la apoptosis. Esta familia incluye los miembros pro-apoptóticos y anti-apoptóticos. En la presente especificación, el potencial de esta familia de proteínas como sustancias farmacéuticas o diagnósticamente activas en el cáncer, ha sido estudiado con referencia particular a la proteína Bel -2. Además, se describe con detalle el potencial de Blc-XL y Mcl-1 como sustancias farmacéutica y diagnósticamente activas. No obstante, parece muy probable que las respuestas inmunes similares a aquellas observadas contra la proteína Bel-2 o fragmento de la misma, existan o puedan ser introducidas en pacientes con cáncer contra otros miembros de la familia de proteínas Bcl-2, por ejemplo, otras proteínas anti-apoptóticas tales como Mcl-1 o Bcl-XL, que están también relacionadas a la resistencia a fármacos y la sobreexpresión en el cáncer. En consecuencia, la invención pertenece a cualquier miembro de la familia de proteínas Bcl-2, preferentemente cualquier miembro anti-apoptótico que sea capaz de promover respuestas inmunes en pacientes con cáncer, por ejemplo, una proteína seleccionada del grupo que consiste de Bcl-2, Bcl-w, Mcl-1, Bfl-l/Al, Belfa, Bcl2-L-10 y Bcl-XL, preferentemente seleccionadas del grupo que consiste de Bcl-2, Mcl-1, Bcl-w y Bcl-XL, más preferentemente seleccionadas del grupo que consiste de Bcl-2, Mcl-1 y Bcl-XL. Los miembros de la familia anti-apoptótica Bcl-2 ejerce sus efectos oncogénicos al inhibir la apoptosis en células que están normalmente destinadas para la muerte, con lo cual se promueve la acumulación de células in vivo . Todos los miembros de la familia de proteínas Bcl-2 contienen al menos una de las cuatro porciones conservadas conocidas como dominios de homología (BH) a Bcl-2 (BH1, BH2 , BH3 , y BH4) . Además de la presencia de los dominios de BH, las moléculas anti-apoptóticas preferidas poseen un dominio de anclaje a la membrana, carboxilo-terminal (TM) . Los miembros antiapoptóticos tales como Bcl-2 y Bcl-XL contienen los cuatro dominios de BH, junto con el dominio transmembranal . Las proteínas pro-apoptóticas de dominios múltiples tales como Bax y Bak contienen todos excepto el dominio BH4. Un segundo subgrupo de proteínas pro-apoptóticas, conocidas como proteínas de "solo dominio BH3" (por ejemplo Bad y Bid) , consiste de moléculas que contienen únicamente el dominio BH3 que carecen de otros dominios BH. Las proteínas pro-apoptóticas tales como Bcl-Xs y Mcl-lS, que representan formas alternativamente empalmadas de los genes bcl-x y mcl-1, respectivamente, carecen de los dominios BH1 y BH2. Además, Mcl-lS carece de un dominio transmembranal. Las proteínas que pertenecen a la familia de Bcl-2 son por ejemplo descritas en la referencia 6. Aún cuando se prefiere que la proteína que pertenece a la familia de proteína Bcl-2 tenga propiedades apoptóticas, ésta también está comprendida dentro de la presente invención que la proteína que pertenece a la familia Bcl-2 puede ser una proteína pro-apoptótica, por ejemplo, una proteína seleccionada del grupo que consiste de Bax, Bok/Mtd, Bad, Bik/Nbk, Bid, Hrk/DP5, Bim, Noxa, Bmf y PUMA/bbc3. En una modalidad preferida de la invención, la proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2, es Bcl-2, preferentemente Bcl-2 humana, más preferentemente Bcl-2 de la secuencia con el número de acceso primario P10415 en la base de datos SwissProt. En otras modalidades preferidas de la invención, la proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 es Bcl-XL, preferentemente Bcl-XL humana, más preferentemente Bcl-XL de la secuencia con el número de acceso primario Q07817.en la base de' datos SwissProt. En otra modalidad preferida adicional de la invención, la proteína que pertenece a la familia Bcl-2 es Mcl-1, preferentemente Bcl-1 humano, más preferentemente Mcl-1 de la secuencia con el número de acceso primario Q07820 en la base de datos SwissProt . Ya que un número de cánceres humanos expresan altos niveles de Bcl-2 y otros miembros de la familia de Bcl-2, las estrategias inmunoterapéuticas dirigidas a estos antígenos pueden tener amplias aplicaciones clínicas. El problema principal de tal procedimiento sería la inducción de respuestas inmunes auto-reactivas . De este modo, el futuro de la vacunación basado en miembros de esta familia de proteínas dependerá de la eficacia terapéutica y del tipo de efectos colaterales que pueden seguir la inmunización. Cuando los péptidos derivados de antígenos de diferenciación de melanocitos fueron primeramente utilizados para tratar pacientes con melanoma en etapa IV, se consideró que esto puede conducir a la destrucción pronunciada de los melanocitos, lo cual a su vez podría manifestarse clínicamente, por ejemplo, como vitíligo o retinitis. No obstante, la experiencia clínica demostró que la incidencia del vitíligo en pacientes que reciben vacunaciones, no fue significativamente más alta que la incidencia de la hipopigmentación asociada en melanoma en pacientes que reciben otras formas de terapia. Además, no han sido reportados efectos colaterales serios en diversas pruebas de vacunación contra los auto-antígenos . En una modalidad útil, se proporcionan los nuevos fragmentos peptídicos restringidos a la clase I de MHC (también denominados en la presente como "péptidos") que están caracterizados por poseer al menos una de las diversas características, una de las cuales es la habilidad para enlazarse a la molécula HLA de la clase I a la cual está restringida a una afinidad como se mide por la cantidad del péptido que es capaz de realizar la recuperación media máxima de la molécula HLA de la clase I (valor C50) que es a lo más de 50 µ? como se determinó por el ensayo de enlace al montaje, como se describe en la presente. Este ensayo de montaje es llevado a cabo como se describió previamente (2) , y está basado en la estabilización de la molécula de HLA después de la carga del péptido a la línea celular T2 deficiente en el transportador de peptidos .

Subsecuentemente, las cadenas pesadas de HLA estables, correctamente plegadas, son inmunoprecipitadas utilizando anticuerpos dependientes de la conformación, y el enlace peptídico es cuantificado . Este ensayo proporciona un medio simple para seleccionar péptidos candidatos para su habilidad de enlazarse a una molécula alelo de HLA dada, a la afinidad anterior. En modalidades preferidas, el fragmento peptídico de la invención es uno que tiene un valor C50, el cual es además de 30 µ?, tal como un valor C50, el cual es a lo más 20 µ? incluyendo valores de C50 de a lo más 10 µ?, a lo más 5 µ? y a lo más 2 µ?. No obstante, los péptidos más preferidos de acuerdo a la presente invención son péptidos capaces de producir una respuesta específica de células T como es determinada por un ensayo de ELISPOT por ejemplo, el ensayo de ELISPOT descrito más adelante en la presente, en el ejemplo 1, sección 4.

Algunos peptidos aunque no se enlazan a MHC con alta afinidad todavía pueden dar origen a una respuesta de célula T como es determinado por ELISPOT. Otros péptidos capaces de enlazarse a MHC con alta afinidad, también dan origen a una respuesta de células T, como es determinada por ELISPOT. Ambos tipos de péptidos son péptidos preferidos de acuerdo a la invención. De aquí que los péptidos preferidos de acuerdo a la presente invención sean péptidos capaces de producir una respuesta específica de células T como se mide por un ensayo ELISPOT, en donde más de 50 puntos específicos peptídicos por 108 células, más preferentemente por 107, aún más preferentemente por 10s, todavía aún más preferentemente por 10s células, tales como por 104 células, son medidos. Como se mencionó anteriormente, el sistema HLA representa el sistema humano de histocompatibilidad mayor (MHC) . En general, los sistemas MHC controlan una gama de características: antígenos de transplante, respuestas inmunes dependientes del tipo, ciertos factores de complemento y predisposición para ciertas enfermedades . Más específicamente, el MHC codifica para tres diferentes tipos de moléculas, por ejemplo moléculas de la clase I, II y III, que determinan las características más generales en los MHC. De estas moléculas, las moléculas de la clase I son denominadas moléculas HLA-A, HLA-B y HLA-C que son presentadas sobre la superficie de la mayoría de las células nucleadas y los trombocitos . Los péptidos de la presente invención son caracterizados por su habilidad para enlazarse a (que está restringida por) una molécula HLA de la clase I de MHC particular. De este modo, en una modalidad, el péptido es uno que está restringido por una molécula HLA-A de la clase I de MHC, que incluye: HLA-Al, HLA-A2 , HLA-A3 , HLA-A9, HLA-A10, HLA-Al1 , HLA-AW19, HLA-A23 (9) , HLA-A2 (9) , HLA-A25 (10) , HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29 (wl9) , HLA-A30 (wl9) , HLA-A31 (wl9) , HLA-A32 (wl9) , HLA-Aw33 (wl9) , HLA-Aw34 (10) , HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw6S (10) , HLA-Aw68 (28) , HLA-A69 (28 ) . Designaciones más simples son también utilizadas a todo lo largo de la literatura, donde únicamente es utilizada la designación numérica primaria, por ejemplo, HLA-A19 o HLA-A24 en vez de HLA-Awl9 y HLA-A24 (49) , respectivamente. En modalidades específicas, el péptido de la invención está restringido a especies de HLA de la clase I de MHC seleccionada del grupo que consiste de HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-Al 1 y HLA-A24. Los péptidos de la invención pueden ser por ejemplo, derivados de secuencias conocidas de un miembro de la familia de Bel-2 (3) . En una modalidad preferida de la invención, el péptido comprende (o más preferentemente consiste de) a lo más 200, preferentemente a lo más 100, más preferentemente a lo más 50, todavía más preferentemente a lo más 25, aún más preferentemente a lo más 20, todavía aún más preferentemente a lo más 15, tal como a lo más 10, por ejemplo en el intervalo de 9 a 10 aminoácidos contiguos de uno de los miembros anteriormente mencionados de la familia de proteínas Bel-2, preferentemente de Bel-2 con acceso primario número P10 15, Mcl-1 con el acceso primario número Q07820 o Bcl-XL con el acceso primario no. Q07817 en la base de datos SwissProt . La selección de los péptidos que tienen potencialmente la habilidad para enlazarse a una molécula HLA particular, puede ser realizada mediante la alineación de secuencias conocidas que se enlazan a una molécula HLA ' particular dada, para revelar con esto la predominancia de unos pocos aminoácidos relacionados en posiciones particulares en los péptidos. Tales residuos de aminoácidos predominantes son también denominados en la presente como "residuos de ancla" o "porciones de residuos de ancla" . Al seguir tal procedimiento relativamente simple con base en los datos de secuencia conocidos, que pueden ser encontrados en bases de datos accesibles, los péptidos pueden ser derivados de la molécula de la familia de proteínas Bel-2 que es probable que se enlacen a la molécula HLA particular. Los ejemplos representativos de tales análisis para una gama de moléculas HLA se dan en la siguiente tabla.

Alelo de Posición Posición Posición Posición Posición Posición C-HLA 1 2 3 5 6 7 terminal HLA-Al T,S D,E L Y HLA-A2 L,M V L,V HLA-A3 L,V,M F,Y K,Y,F HLA- V5I,F,Y M,L,F,Y, K,R Al 1 I HLA-23 I,Y W,I HLA- Y I,V F I,L,F A24 HLA- ?,?,? W A25 HLA- E,D V,T,I,L5F I,L,V Y,F A26 HLA- E,D V,A,L A,R A28 HLA- E Y,L A29 HLA- Y,L,F,V Y A30 HLA- L,M,F,Y R A31 HLA- A32 HLA- Y,I,L,V R A33 HLA- V,L R A34 HLA- E,D T,V R,K A66 HLA- E,D T,V R,K A68 HLA- V,T,A V,L A69 HLA- T V,L A74 HLA-B5 A,P F,Y I,L HLA-B7 * P L,F HLA-B8 K K,R L HLA- R,K L,V B14 HLA- Q,L,K,P, F,Y,W B15 H5VSI,M, (B62) ST HLA- L,V B17 HLA- R Y,K,F,L B27 HLA- I,L,M,Y B35 HLA- D,E I,L,M B37 HLA- H D,E F,L B38 HLA- R,H L,F B39 HLA- F,I,V L,V,A,W, B40 M,T,R (B60.61) HLA- L,P Y,L B42 HLA- E F,Y,W B44 HLA-46 M,I,L,V Y,F HLA-48 L HLA- A,P,G F,Y,I,V B51 HLA- F,Y I,V B52 HLA- W,F,L B53 HLA- B54 HLA- A,V B55 HLA- A,V B56 HLA- A,T,S F,W,Y B57 HLA- A,T,S F,W,Y B58 HLA- B67 HLA- R B73 HLA- A,L Cwl HLA- A,L F,Y Cw2 HLA- A,L L,M Cw3 HLA- Y,P,F L,M,F,Y Cw4 HLA- L,I,V,Y Cw6 HLA- Y L,Y,F Cw6 HLA- Y L,I Cw8 HLA- A,L L,V Cwl6 * En una modalidad, no existe residuo de ancla especifico para esta posición, no obstante, en una modalidad preferida el residuo de ancla es R ó A.

De este modo, como un ejemplo, los nonapéptidos que tienen potencialmente la habilidad para enlazarse a HLA-Al podrían tener una de las siguientes secuencias: Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y, Xaa-T-E-Xaa-Xaa- Xaa-L-Xaa-Y; Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y o Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y (Xaa indica cualquier residuo de aminoácidos). De una manera similar, las secuencias que tienen potencialmente la habilidad para enlazarse a cualquier otra molécula HLA pueden ser diseñadas. Se apreciará que la persona de experiencia ordinaria en la técnica será capaz de identificar adicionalmente las "porciones de residuo de ancla" para una molécula de HLA dada.

De este modo, en modalidades útiles, los péptidos de la invención incluyen péptidos, las secuencias de los cuales comprenden, para cada uno de los alelos HLA específicos listados en la tabla, cualquiera de los residuos de aminoácidos como se indican en la tabla. De este modo, los péptidos de la invención pueden ser cualquiera de los péptidos anteriormente mencionados que comprenden secuencias contiguas provenientes de los miembros de la familia de proteínas de Bcl-2, en donde en el intervalo de 1 a 10, preferentemente en el intervalo de 1 a 5, más preferentemente en el intervalo de 1 a 3 , aún más preferentemente en el intervalo de 1 a 2 , todavía más preferentemente un aminoácido, ha sido intercambiado por otro aminoácido, preferentemente de una manera de modo que el péptido comprende uno o más, preferentemente todos los residuos de ancla de un péptido específico de HLA-A dado, como se indica en la tabla anterior. Un ejemplo no limitante de cómo preparar los péptidos de los miembros de la familia de proteínas de Bcl-2 que comprenden los residuos de ancla de un péptido específico de HLA-A dado, se describe en el ejemplo 3 en la sección "respuesta peptídica modificada" . De este modo, en una modalidad de la invención, el péptido puede ser cualquier péptido que comprenda a lo más 200, preferentemente a lo más 100, más preferentemente a lo más 50, aún más preferentemente a lo más 25, aún más preferentemente a lo más 25, aún más i preferentemente a lo más 20, aún más preferentemente a lo más 15, aún más preferentemente a lo más 10 aminoácidos y que comprenden (o más preferentemente que consiste de) una secuencia seleccionada de un grupo que consiste de RLK DWLVK (SEQ ID NO: 62), QSDEIISRY (SEQ ID NO: 63) y QSEEIISRY (SEQ ID NO: 64) , más preferentemente seleccionado del grupo que consiste de RLKRDWLVK (SEQ ID NO: 62) . De este modo, un procedimiento simple para identificar un péptido de la invención incluye los siguientes pasos: seleccionar una molécula HLA particular, por ejemplo, uno que aparece a una alta proporción en una población dada, llevando a cabo un análisis de alineamiento como se describe anteriormente para identificar las "porciones de residuo de ancla" en la proteína de la familia de proteínas Bel-2, aislando o construyendo péptidos de un tamaño adecuado que comprenden uno o más de los residuos de ancla identificados y probando los péptidos resultantes para (i) la capacidad de enlazarse a la molécula HLA particular utilizando el ensayo de ensamble como se describe en la presente, (ii) la capacidad de los péptidos para promover células productoras de INF-? en una población PBL de un paciente con cáncer, a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBLs como es determinado por un ensayo de ELISPOT, como se describe en la presente, y/o (iii) la capacidad de los péptidos para detectar in situ en un tejido tumoral CTL que son reactivos con los péptidos de epitopos que son probados . En modalidades específicas, el peptido de la invención es un peptido derivado de Bel-2 restringido a HLA-A2 que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes : ALVGACITL (SEQ ID NO : 1), ALSPVPPW (SEQ ID NO: 2), SLALVGACI (SEQ ID NO: 3), KTLLSLALV (SEQ ID NO : 4), LLSLALVGA (SEQ ID NO: 5), WLSLKTLLSL (SEQ ID NO: 6), AAAGPALSPV (SEQ ID NO: 7), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO: 8), FTARGRFATV (SEQ ID NO: 9), YLNRHLHT I (SEQ ID NO: 10), NIALWMTEYL (SEQ ID NO: 11). En una modalidad preferida, el peptido puede ser cualquier péptido que consiste de a lo más 200, preferentemente a lo más 100, más preferentemente a lo más 50, todavía más preferentemente a lo más a lo más 25, aún más preferentemente a lo más 20, aún más preferentemente a lo más 15, aún más preferentemente a lo más 10 aminoácidos y que comprende (o más preferentemente que consiste de) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de, ALVGACITL (SEQ ID N0:1), ALSPVPPW (SEQ ID N0:2), SLALVGACI (SEQ ID NO:3), KTLLSLALV (SEQ ID NO: 4), LLSLALVGA (SEQ ID NO: 5), WLSLKTLLSL (SEQ ID NO: 6), AAAGPALSPV (SEQ ID NO: 7), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO: 8), FTARGRFATV (SEQ ID NO: 9), YLNRHLHTWI (SEQ ID NO: 10), NIALWMTEYL (SEQ ID NO: 11), más preferentemente seleccionada del grupo que consiste de NIALWMTEYL (SEQ ID NO: 11), YLNRHLHTWI (SEQ ID NO: 10), PLFDFS LSL (SEQ ID NO : 8) y WLSLKTLLSL (SEQ ID NO: 6) aún más preferentemente seleccionada del grupo que consiste de PLFDFSWLSL (SEQ ID NO: 8) y WLSLKTLLSL (SEQ ID NO: 6) . En otra modalidad preferida el péptido puede ser cualquier péptido que consiste de a lo más 200, preferentemente a lo más 100, más preferentemente a lo más 50, aún más preferentemente a lo más 25, aún más preferentemente a lo más 20, aún más preferentemente a lo más 15, aún más preferentemente a lo más 10 aminoácidos y que comprende (o más preferentemente que consiste de) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de EMQVLVSRI (SEQ ID NO: 44), TAYQSFEQV (SEQ ID NO:43), YLNDHLEPWI (SEQ ID NO: 42), RIAAWMATYL (SEQ ID NO: 45), WMATYLNDHL (SEQ ID NO: 46) , VLVSRIAAW (SEQ ID NO: 48) y VAFFSFGGAL (SEQ ID NO: 49) , más preferentemente del grupo que consiste de TAYQSFEQV (SEQ ID NO:43), YLNDHLEPWI (SEQ ID NO: 42), RIAAWMATYL (SEQ ID NO:45), WMATYLNDHL (SEQ ID NO:46), VLVSRIAAWM (SEQ ID NO: 48) y VAFFSFGGAL (SEQ ID NO: 49), aún más preferentemente seleccionada del grupo que consiste de TAYQSFEQV (SEQ ID NO: 43), VAFFSFGGAL (SEQ ID NO: 49), VLVSRIAAWM (SEQ ID NO: 48) y RIAAWMATYL (SEQ ID NO: 45) o seleccionada del grupo que consiste de TAYQSFEQV (SEQ ID NO: 43) y WMATYLNDHL (SEQ ID NO: 46) o seleccionada del grupo que consiste de YLNDHLEPWI (SEQ ID NO: 42) . En otra modalidad preferida, el péptido puede ser cualquier' péptido que consista de a lo más 200, preferentemente a lo más 100, más preferentemente a lo más 50, aún más preferentemente a lo más 25, aún más preferentemente a lo más 20, aún más preferentemente a lo más 15, aún más preferentemente a lo más 10 aminoácidos y que comprende (o más preferentemente que consiste de) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de RIAAWMATY (SEQ ID NO:50) y ALCVESVDK (SEQ ID NO: 51), más preferentemente seleccionada del grupo que consiste de RIAAWMATY (SEQ ID NO: 50) . En otra modalidad preferida, el péptido puede ser cualquier péptido que consista de a lo más 200, preferentemente a lo más 100, más preferentemente a lo más 50, todavía más preferentemente a lo más 25, aún más preferentemente a lo más 20, todavía más preferentemente a lo más 15, aún más preferentemente a lo más 10 aminoácidos y que comprende (o más preferentemente que consiste de) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de YLREQATGAK (SEQ ID NO: 52), SITDVLVRTK (SEQ ID NO: 53), LISFGAFVAK (SEQ ID NO: 54), RLLFFAPTR (SEQ ID NO: 55), RTKRDWLVK (SEQ ID NO: 56) y DIKNEDDVK (SEQ ID NO: 57), más preferentemente seleccionado del grupo que consiste de RLLFFAPTR (SEQ ID NO: 55) y RTKRDWLVK (SEQ ID NO: 56) . En otra modalidad preferida el péptido puede ser cualquier péptido que consista de a lo más 200, preferentemente a lo más 100, más preferentemente a lo más 50, todavía más preferentemente a lo más 25, aún más preferentemente a lo más 20, aún más preferentemente a lo más 15, aún más preferentemente a lo más 10 aminoácidos y que comprende (o más preferentemente que consiste de) una secuencia seleccionada del grupo que consiste de PAEEEEDDLY (SEQ ID NO: 58), SPEEELDGY (SEQ ID NO: 59), QSLEIISRY . (SEQ ID NO: 60) y AGVGAGLAY (SEQ ID NO: 61), más preferentemente seleccionada del grupo que consiste de PAEEEEDDLY (SEQ ID NO: 58) y QSLEIISRY (SEQ ID NO: 60) . En modalidades útiles adicionales, el péptido de la invención es un péptido, el cual está restringido por una molécula HLA-B de la Clase I de MHC que incluye cualquiera de las siguientes: HLA-B5 , HLA-B7 , HLA- B8 , HLA-B12 , HLA-B13 , HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-BW41, HLA-BW42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 y HLA-Bw47. En modalidades especificas, la especie HLA-B de la Clase I de MHC a la cual el péptido de la invención es capaz de enlazarse, se selecciona de HLA-B7 , HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 y HLA-B51. En modalidades útiles adicionales, el péptido de la invención es un péptido, el cual está restringido por una molécula HLA-C de la Clase I de MHC que incluye cualquiera de las siguientes: HLA-C l, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-CW7 y HLA-Cwl. Preferentemente, el fragmento del péptido de la invención comprende menos de 50 residuos de aminoácidos, y más preferentemente comprende a lo más 20 residuos de aminoácidos, tal como a lo más 10 residuos de aminoácidos. En modalidades específicas, el péptido es un heptapéptido, un octopéptido, un nonapéptido, un decapéptido o un undecapéptido . El péptido de la invención es, como se mencionó anteriormente, derivado de un miembro de la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento del mismo. La proteína a partir de la cual puede ser derivado el péptido, puede ser cualquier miembro de la familia de proteínas Bcl-2 proveniente de cualquier especie animal en la cual la proteína sea expresada. En modalidades preferidas, la proteína inicial es proveniente de una especie de mamífero que incluye una especie de roedor, conejo y una especie de primate tales como humanos . Con base en la secuencia de la proteína seleccionada, el péptido de la invención es derivado de cualquier tratamiento químico o enzimático del material inicial proteico, que de cómo resultado un péptido de un tamaño adecuado como se indicó anteriormente, o que puede ser sintetizado mediante cualesquiera procedimientos convencionales de síntesis de péptido con los cuales la persona de experiencia ordinaria en la técnica esté familiarizada . El péptido de la invención puede tener una secuencia que es una secuencia nativa del miembro de la familia de proteínas Bel -2 a partir de la cual se deriva. No obstante, los péptidos que tienen una más alta afinidad para una molécula de HLA dada pueden ser derivados de tal secuencia nativa mediante la modificación de la secuencia al sustituir, suprimir o agregar al menos un residuo de aminoácidos, por ejemplo con base en el procedimiento descrito anteriormente, con lo cual las porciones del residuo de ancla con respecto a la molécula de HLA dada, son identificadas . Una característica significativa del péptido de la invención es su capacidad para reconocer o promover células T respondedoras productoras de IFN-?, por ejemplo células T citotóxicas (CTL) que específicamente reconocen el péptido particular en una población de PBL o células tumorales de un paciente con cáncer (células objetivo o diana) . Esta actividad es fácilmente determinada al someter las PBLs o las células tumorales provenientes de un paciente, a un ensayo ELISPOT como se describe en la referencia (4) y en el siguiente ejemplo. Antes del ensayo, puede ser ventajoso estimular la población de PBL o las células tumorales que van a ser evaluadas, al poner en contacto las células con el péptido que va a ser probado. Preferentemente, el péptidó es capaz de promover o reconocer las células T productoras de IFN-? a una frecuencia de al menos 1 por 104 PLBs como se determinó por un ensayo ELISPOT como se utiliza en la presente. Más preferentemente, la frecuencia es al menos 5 por 104 PBLs, más preferentemente al menos 10 por 104 PBLs, tal como al menos 50 ó 100 por 104 PBLs . El ensayo ELISPOT representa una herramienta fuerte para monitorizar las respuestas de células T especificas del péptido derivado de la familia Bcl-2. No obstante, aunque se ha mostrado que la reactividad de ELISPOT en la mayoría de los casos, correlaciona con la capacidad de las CTL para lisar las células diana, la evidencia concluyente para esta noción puede ser únicamente dada directamente. Por lo tanto, una explicación mayor de los hallazgos en la presente, es que los péptidos de la invención pueden ser expresados y complejados con moléculas HLA sobre células cancerosas. Esto hace a estas células cancerosas susceptibles a la destrucción por CTL y enfatiza la utilidad potencial de la inmunización con proteínas de la familia Bcl-2 para controlar el crecimiento de los neoplasmas . La presencia de respuestas de CTL espontáneas en PBLs provenientes de pacientes con cáncer de mama por los epitopos de péptidos derivados de Bcl-2 restringidos en HLA, apoya sustancialmente el potencial inmunoterapéutico de estos antígenos tumorales, no solamente en pacientes con cáncer de mama, sino también, ya que el miembro de la familia de proteínas Bcl-2 es sobreexpresado en muchos cánceres incluyendo cánceres de pulmón, colorrectal, de próstata y en leucemia y linfornas, en una amplia gama de enfermedades cancerosas . En consecuencia, en otra modalidad preferida, el péptido de la invención es capaz de producir células productoras de IFN-? en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa, en donde una familia de proteínas Bcl-2 es expresada, incluyendo una malignidad hematopoyética, por ejemplo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cerviz, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. Además de su capacidad para promover respuestas inmunes en poblaciones de PBL, se contempla también que los péptidos de la invención sean capaces de promover respuestas inmunes citolíticas in situ, por ejemplo en tejidos tumorales sólidos . Esto puede ser demostrado por la provisión de complejos HLA-péptido, por ejemplo que son multimerizados y que están provistos con un marcador detectable, y utilizando tales complejos para las tinciones de inmunohistoquímica, para detectar en un tejido tumoral las CTL que son reactivas con el péptido epitopo de la invención. En consecuencia, una característica significativa adicional del péptido de la invención es que éste sea capaz de realizar la detección in si tu en un tejido tumoral de CTL que son reactivas con el peptido epitopo. Se contempla también que los péptidos de la invención, además de su capacidad para enlazarse a las moléculas HLA que dan como resultado la presentación de complejos de HLA y péptidos sobre las superficies celulares, cuyos complejos a su vez actúan como epitopos u objetivos para las células T citoliticas, pueden promover otros tipos de respuestas inmunes, tales como las respuestas de células B que dan como resultado la producción de anticuerpos contra los complejos y/o una reacción de Hipersensibilidad Tipo Tardía (DTH por- sus siglas en ingles) . El último tipo de respuesta inmune es definido como un enrojecimiento e induración palpable en el sitio de inyección del péptido de la invención. La composición de vacuna de la presente invención puede comprender un ácido nucleico que codifica para una proteína que pertenezca a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico de la misma. El ácido nucleico puede de este modo codificar para cualquiera de las proteínas anteriormente mencionadas y los fragmentos peptídicos mencionados. El ácido nucleico puede ser por ejemplo ADN, AR , LNA, H A, PNA, preferentemente el ácido nucleico es ADN o ARN. Los ácidos nucleicos de la invención pueden estar comprendidos dentro de cualquier vector adecuado, tal como un vector de expresión. Numerosos vectores son disponibles y la persona experta será capaz de seleccionar un vector útil para el propósito específico. El vector puede, por ejemplo, estar en la forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o cromosoma artificial . La secuencia apropiada de ácido nucleico puede ser insertada dentro del vector mediante una variedad de procedimientos, por ejemplo, el ADN puede ser insertado dentro de uno o varios sitios de endonucleasa de restricción apropiados utilizando técnicas bien conocidas en la materia. Aparte de la secuencia de ácido nucleico de acuerdo a la invención, el vector puede comprender además una o más de una secuencia de señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento aumentador, un promotor, y una secuencia de terminación de la transcripción. El vector puede también comprender secuencias adicionales. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplean técnicas de ligadura estándares que son conocidas para una persona experta en la técnica. El vector es preferentemente un vector de expresión, que comprende el ácido nucleico operablemente enlazado a una secuencia de ácido nucleico reguladora que dirige la expresión de la misma en una célula adecuada. Dentro del alcance de la presente invención la secuencia reguladora de ácido nucleico debe ser en general capaz de dirigir la expresión en una célula de mamífero, preferentemente una célula humana, más preferentemente en una célula presentadora de antígeno . En una modalidad preferida, el vector es un vector viral. Dicho vector viral puede, en adición al ácido nucleico que codifica para un miembro de la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico de las mismas, comprender una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido estimulador de células T. El polipéptido estimulador de células T es preferentemente seleccionado del grupo que consiste de B7.1, ICAM-l y LFA-3. El vector puede también ser un vector bacteriano, tal como un vector bacteriano atenuado. Los vectores bacterianos atenuados pueden ser utilizados con el fin de inducir respuestas inmunes mucosales de larga duración en los sitios de infección y persistencia. Las diferentes bacterias recombinantes pueden ser utilizadas como vectores, por ejemplo el vector bacteriano puede ser seleccionado del grupo que consiste de Salmonella, Lactococcus y Listeria. En general, la inducción de inmunidad para el antígeno heterólogo HPV16L1 o E7 podría ser mostrado, con fuerte inducción de CTL y regresión del tumor en ratones . La invención también se refiere a un equipo de partes que comprende : i) cualquiera de las composiciones de vacuna descritas en la presente y/o ii) cualquiera de las proteínas que pertenecen a la familia de proteínas Bel-2 descritas en la presente y/o iii) cualquiera de los fragmentos peptídicos de las proteínas de ii) descritas en la presente y/o iv) cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de ii) o los péptidos de iii). • y un agente anticanceroso adicional. Los componentes del equipo de partes están preferentemente comprendidos en composiciones individuales, no obstante, dentro del alcance de la presente invención está comprendido que los componentes del equipo de partes sean todos incluidos dentro de la misma composición. Los componentes del equipo de partes pueden ser de este modo administrados simultánea o secuencialmente en cualquier orden. El agente anti-canceroso puede ser un agente utilizado en quimioterapia o terapia génica, sustancias inmunoestimuladoras o anticuerpos. Las sustancias inmunoestimuladoras pueden ser por ejemplo citocinas, tales como citocinas seleccionadas del grupo que consiste de GM- CSF, IFN tipo I, interleucina 12 e interleucina 15. El anticuerpo es preferentemente un anticuerpo inmunoestimulador tales como los anticuerpos anti-CD40 o anti-CTLA-4. La sustancia inmunoestimuladora puede también ser una sustancia capaz de realizar el agotamiento de las células inhibitorias inmunes (por ejemplo células T reguladoras) o factores, dicha sustancia puede ser por ejemplo ligasa de ubiquitina E3. Las ligasas de ubiquitina E3 (las proteínas HECT, RING y U-box) han surgido como reguladores - moleculares clave de la función de las células inmunes, y cada uno puede estar involucrado en la regulación de las respuestas inmunes durante la infección al dirigir las moléculas inhibitorias específicas para la destrucción proteolítica. Varias proteínas HECT y RING E3 han sido ahora ligadas a la inducción y mantenimiento de la auto-tolerancia inmune: c-Cbl, Cbl-b, GRAIL, Itch y Nedd4 cada una regula negativamente la producción del factor de crecimiento de células T y la proliferación de los mismos. Es evidente que los hallazgos de la presente invención proporcionan la base para aplicaciones terapéuticas así como de diagnóstico de la proteína o el fragmento peptídico de la invención. En consecuencia, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína o el fragmento peptídico de la invención, en particular una composición farmacéutica la cual, cuando es administrada a un paciente con cáncer, es capaz de promover una respuesta inmune contra la enfermedad cancerosa, incluyendo la promoción de la producción en el paciente vacunado, de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas . Como es bien conocido, que las diferentes moléculas de HLA son de diferente prevalencia en poblaciones mayores humanas, existe un requerimiento de identificar epitopos peptidicos restringidos a varias moléculas HLA' de la Clase I para extender la gama de pacientes que pueden ser tratados de acuerdo a los métodos de la presente invención. La caracterización de múltiples epitopos de Bcl-2 con diferentes elementos de restricción de HLA amplía el potencial clínico de este antigeno objetivo en dos formas importantes: (i) incrementa el número de pacientes elegibles para la inmunoterapia con base en los péptidos derivados de Bcl-2. el antigeno HLA-A2 es expresado por alrededor de 50% de las poblaciones Caucásicas y Asiáticas, los antígenos HLA-A1 y HLA-A3 son ambos expresados por alrededor de 25% de Caucásicos ' y 5% de Asiáticos, mientras que el antígeno HLA-All es expresado por alrededor de 15% de Caucásicos y 30% de Asiáticos. Aún cuando estos números no pueden ser agregados debido a la co-expresión, una combinación de péptidos restringidos por una pluralidad de éstos, podría ciertamente abarcar a la mayoría de los pacientes con cáncer, (ii) la dirección colectiva de los diversos elementos de restricción en cada paciente, es probable que disminuye el riesgo de escape inmune por la pérdida del alelo de HLA. La pérdida de un alelo simple de HLA es un componente significativo de las alteraciones de MHC descritas para células cancerosas, mientras que la pérdida total de la expresión de la Clase I es un evento más bien poco frecuente. De este modo, con la identificación de los epitopos de Bcl-2 restringidos a diferentes alelos de HLA, podría ser posible dirigir más de una molécula de HLA simultáneamente en pacientes con traslape alélico . De este modo, sería posible desarrollar vacunas altamente inmunogénicas de epitopos múltiples . Preferentemente, tales vacunas deben ser diseñadas para facilitar una distribución simultánea de los péptidos derivados de Bcl-2 mejor adecuados, opcionalmente en combinación con otros péptidos y/o adyuvantes adecuados como se describe posteriormente en la presente. La presente invención abarca tales vacunas de epitopos múltiples que comprenden péptidos derivados de Bcl-2 opcionalmente en combinación con proteínas o fragmentos peptídicos adicionales que no pertenecen a o derivados de la familia de proteínas Bcl-2 y/o adyuvantes como se describe posteriormente en la presente, y/o epitopos restringidos a MHC de la Clase II, como se describe más adelante . Ha existido un foco incrementado a la promoción de la inmunidad celular de células T cooperadoras, específicas del tumor, por ejemplo, la vacunación con epitopos restringidos a MHC de la Clase II, a pesar del hecho de que los tumores en general no expresan MHC de la Clase II. Esto está basado en el hallazgo reciente de que la inducción y la eficacia de la respuesta antitumoral inducida por la vacuna, en muchos casos requiere la cooperación de las células ¾ positivas a CD4, específicas del tumor. De este modo, un factor importante que impulsa el desarrollo de las vacunas que tienen una composición más compleja es el deseo de dirigir múltiples antígenos tumorales, por ejemplo, mediante el diseño de vacunas que comprenden o que codifican para una colección de epitopos de CTL y de células ¾ cuidadosamente seleccionados . Obviamente, las vacunas de epitopos múltiples constituyen una manera eficiente de producir la inmunidad contra los epitopos derivados de varios antígenos diferentes sin la necesidad para introducir (codificación de genes) proteínas potencialmente peligrosas tales como oncoprotexnas. Tales vacunas también permiten la inducción selectiva de la inmunidad contra epitopos de células T subdominantes y crípticos, los cuales pueden, ser especialmente importantes en el caso de autoantígenos asociados al tumor, para los cuales puede existir tolerancia para los epitopos que son prominentemente presentados en tejidos normales. Además, las células presentadoras de antígeno pueden fallar en presentar ciertos epitopos que son expresados sobre las células tumorales, debido a las diferencias funcionales entre los inmunoproteasomas de las células presentadoras de antígeno y los proteasomas "constitutivos" presentes en la mayoría de las células tumorales . En el caso de las vacunas basadas en péptidos, tales epitopos pueden ser administrados en una forma "lista para MHC" , que hace posible la presentación a través de la carga exogena independientemente de la captación del antígeno y el procesamiento por las células presentadoras de antígeno, del hospedero. Ya que los péptidos de la invención son moléculas relativamente pequeñas, puede ser requerido en tales composiciones combinar los péptidos con varios materiales tales como adyuvantes, para producir vacunas, composiciones inmunogénicas, etc. Los adyuvantes, ampliamente definidos, son sustancias que promueven las respuestas inmunes . Frecuentemente, el adyuvante de elección es el adyuvante completo o incompleto de Freund, u organismos de B. pertussis muerto, utilizados por ejemplo en combinación con el antígeno precipitado con alumbre. Una discusión general de los adyuvantes es proporcionada en Goding, Monoclonal Antibodies: Principies & Practice (2a edición, 1986) en las páginas 61-63. Goding nota, no obstante, que cuando el antígeno de interés es de bajo peso molecular, o es pobremente inmunogénico, el acoplamiento a un portador inmunogénico es recomendado. Los ejemplos de tales moléculas portadoras incluyen la hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura, albúmina sérica bovina, ovoalbúmina e inmunoglobulina de ave de corral. Han sido también sugeridos diversos extractos de saponina que son útiles como adyuvantes en composiciones inmunogénicas . Recientemente, se ha propuesto utilizar el factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , una citocina bien conocida como un adyuvante (W097/28816) . Las composiciones de vacuna de acuerdo a la invención comprenden preferentemente un adyuvante y/o un portador. Los ejemplos de adyuvantes y portadores útiles son dados más adelante en la presente. De este modo, la proteína que pertenece a la familia de proteínas Bel-2 o el fragmento peptídico de la misma presentes en la composición, pueden ser asociados con un portador tal como, por ejemplo, una proteína o una célula presentadora de antígeno, tal como por ejemplo, una célula dendrítica (DC) capaz de presentar a la familia de proteínas Bel-2 o el fragmento peptídico de las mismas, a una célula T. Los adyuvantes son cualquier sustancia cuya mezcla dentro de la composición de vacuna incrementa o de otro modo modifica la respuesta inmune a la familia de proteínas de Bcl-2 o el fragmento peptídico de las mismas. Los portadores son estructuras de andamio, por ejemplo un polipéptido o un polisacárido, al cual es capaz de asociarse una familia de proteínas de Bcl-2 o el fragmento peptídico de las mismas.

Los adyuvantes podrían ser por ejemplo seleccionados del grupo que consiste de: AlK(S04)2, AlNa(S04)2, A1NH4(S04), sílice, alumbre, A1(0H)3, Ca3(P04)2, kaolín, carbono, hidróxido de aluminio, dipéptidos de muramilo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP) , N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también denominado como nor-MDP) , N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanin-2- (1' 2 ' -dipalmitoil-sn-glicero-3- idroxifosforiloxi) -etilamina (CGP 19835A, también denominada como MTP-PE) , RIBI (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de 2% de escualeno/T een 80.RTM, lipopolisacáridos y sus diversos derivados, incluyendo lípido A, Adyuvante Completo de Freund (FCA) , Adyuvantes Incompletos de Freund, Adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, poli IC y ácidos poli AU) , cera D proveniente de Mycobacterium, tuberculosis, sustancias encontradas en Corynejbacterium parvum, Bordetella pertusis, y miembros del género Brucella, liposomas y otras emulsiones lipídicas, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALU (ver Patentes de los Estados Unidos No. 58767 y 5,554,372), derivados de Lípido A, derivados de coleratoxina, derivados de HSP, derivados de LPS, matrices peptídicas sintéticas o GMDP, Interleucina 1, Interleucina 2, Monatide ISA-51 y QS-21. . Los adyuvantes preferidos que van a ser utilizaos con la invención incluyen adyuvantes basados en aceite/surfactante tales como adyuvantes de Montanide (disponibles de Seppic, Bélgica), preferentemente Montanide ISA-51. Otros adyuvantes preferidos son adyuvantes basados en ADN bacteriano, tales como adyuvantes que incluyen secuencias oligonucleotidicas de CpG. Otros adyuvantes preferidos son adyuvantes basados en dsAR viral, tales como poli I:C. Las imidazoquinilinas son otro ejemplo más de adyuvantes preferidos. Además, un ad uvante preferido es los liposomas. La mayoría de los adyuvantes preferidos son adyuvantes adecuados para el uso en humanos . Los adyuvantes Montanide (todos disponibles de Seppic, Bélgica) , pueden ser seleccionados del grupo que consiste de Montanide ISA-51, Montanide ISA-50, Montanide ISA-70, Montanide ISA-206, Montanide ISA-25, Montanide ISA-270, Montanide ISA-708, Montanide ISA-763A, Montanide ISA-207, Montanide ISA-264, Montanide ISA-27, Montanide ISA-35, Montanide ISA 51F, Montanide ISA 016D y Montanide IMS, preferentemente el grupo que consiste de Montanide ISA-51, Montanide IMS, y Montanide ISA-720, más preferenteme te del grupo que consiste de Montanide ISA-51, Montanide ISA-51, (Seppic, Inc) es adyuvantes basados en aceite/surfactante en el cual son combinados diferentes surfactantes ya sea con un aceite mineral no metabolizable, un aceite metabolizable, o una mezcla de los dos. Éstos son preparados para el uso como una emulsión con una solución acuosa que comprende la proteina que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico de la misma. El surfactante es oleato de mannide. QS-21 (Antigenics : Aguila Bipharmaeuticals , Framingham, ??) es una saponina soluble en agua, altamente purificada, que se maneja como una solución acuosa. Los adyuvantes QS-21 y Montanide ISA-51 pueden ser proporcionados en frascos estériles, para uso único. Una discusión general de los adyuvantes es proporcionada en Goding, Monoclonal Antibodies : Principies & Practice (2a edición, 1986) en las páginas 61-63. Goding nota, no obstante, que cuando el antígeno de interés es de bajo peso molecular, o es pobremente inmunogénico, es recomendado el acoplamiento a un portador inmunogénico. Los ejemplos de tales moléculas portadoras incluyen la hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura, albúmina sérica bovina, ovoalvúmina e inmunoglobulina de ave de corral . Han sido también sugeridos diversos extractos de saponina por ser útiles como adyuvantes en las composiciones inmunogénicas . Recientemente, se ha propuesto utilizar el factor de estimulación de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF) , una citocina bien conocida, como un adyuvante ( 097/28816) . Funcionalidades deseables de adyuvantes capaces de ser utilizaos de acuerdo con la presente invención son listados en la siguiente tabla.

Tabla 1. Modos de acción del adyuvante Acción Tipo de adyuvante Beneficio 1. Inmunomodulación Moléculas en Suprarregulación de general pequeñas o la respuesta proteínas que inmune. Selección modifican la red de de Thl o Th2 la citocina 2. Presentación Moléculas en Respuesta general antipáticas incrementada de o complejos que anticuerpo interactúan con el neutralizador . inmunógeno en su Mayor duración de conformación nativa respuesta 3. Inducción de CTL · Partículas que Procesamiento pueden enlazarse a citosólico de la o encerrar el proteína, inmunógeno y que produciendo pueden fusionarse péptidos con o desintegrar restringidos de la las membranas clase 1 correctos celulares • con o sin Proceso simple si emulsiones para el es uno ° varios acoplamiento péptidos promiscuos directo a la conocidos superficie celular MHC-1 4. Dirección al · Adyuvantes Uso eficiente del objetivo oarticulados aue se adyuvante y el Adyuvantes de Como se describió carbohidrato que se anteriormente . dirigen a los Pueden también receptores de determinar el tipo lectina sobre los de respuesta si se macrofagos y DCS dirigen selecti amente 5. Generación de · con/sin emulsión Eficiencia Depósito para corto plazo • Microesferas o Potencial para nanoesferas para vacuna de una sola largo plazo dosis Fuente: Cox, J.C., y Coulter, A.R. (1997). Vaccine 15, 248-56.

Una composición de vacuna de acuerdo a la presente invención puede comprender más de un adyuvante diferente . Además, la invención abarca una composición terapéutica que comprende además cualquier sustancia adyuvante que incluye cualquiera de los anteriores o combinaciones de los mismos . Se contempla también que la proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o los fragmentos peptídicos de la misma, y el adyuvante pueden ser administrados separadamente en cualquier secuencia apropiada. Un portador puede estar presente independientemente de un adyuvante. La función de un portador puede ser por ejemplo incrementar el peso molecular de un fragmento peptídico particular, con el fin de incrementar su actividad o inmunogenicidad, para conferir estabilidad, incrementar la actividad biológica, o para incrementar la vida media en suero. Además, un portador puede ayudar a presentar la proteína que pertenece a la familia Bcl-2 o fragmentos peptídicos de la misma, a las células T. El portador puede ser cualquier portador adecuado, conocido por la persona de experiencia en la técnica, por ejemplo una proteína o una célula presentadora de antígeno. Una proteína portadora puede ser, pero no está limitada a, la hemocianina de lapa en forma de hoyo de cerradura, proteínas séricas tales como transferrina, albúmina sérica bovina, albúmina sérica humana, tiroglobulina u ovoalbúmina, inmunoglobulinas , u hormonas, tales como insulina o ácido palmítico. Para la inmunización de humanos, el portador debe ser un portador fisiológicamente aceptable, aceptable para humanos y seguro. No obstante, el toxoide tetánico y/o el toxoide de la difteria son portadores adecuados en una modalidad de la invención. Alternativamente, el portador puede ser dextranos por ejemplo sefarosa. En consecuencia, la invención abarca una composición terapéutica que comprende además una sustancia adyuvante que incluye cualquiera de las anteriores o combinaciones de las mismas. Se contempla también que el antigeno, por ejemplo el péptido de la invención y el adyuvante pueden ser administrados simultánea o separadamente en cualquier secuencia apropiada. La elección del antígeno en la composición farmacéutica de la invención dependerá de parámetros determinables por la persona de experiencia en la técnica. Como ha sido mencionado, cada uno de los diferentes péptidos de la invención es presentado sobre las superficies celulares por una molécula HLA particular. Como tal, si un sujeto que va a ser tratado es tipificado con respecto al fenotipo de HLA, uno o varios péptidos son seleccionados los cuales se sabe que se enlazan a esa molécula de HLA particular. Alternativamente, el antígeno de interés es seleccionado con base en la prevalencia de los diversos fenotipos de HLA en una población dada. Como un ejemplo, HLA-A2 es el fenotipo más prevalente en la población Caucásica, y por lo tanto, una composición que contiene un péptido derivado de survivina que se enlaza a HLA-A2 será activo en una proporción grande de esa población. No obstante, la composición de la invención puede también contener una combinación de dos o más péptidos derivados de survivina, cada uno interactuando específicamente con una molécula HLA diferente para cubrir así una proporción más grande de la población objetivo. De este modo, como ejemplos, la composición farmacéutica puede contener una combinación de un péptido restringido por una molécula HLA-A y un péptido restringido por una molécula HLA-B, por ejemplo que incluye aquellas moléculas HLA-A y HLA-B que corresponden a la prevalencia de los fenotipos de HLA en la población objetivo, tal como por ejemplo HLA-A2 y HLA-B35. Adicionalmente, la composición puede comprender un péptido restringido por una molécula HLA-C. Se contempla que las composiciones inmunogénicas útiles de la invención, además de un miembro de la familia de proteínas de Bel-2 o el péptido derivado, como se define en la presente, puede comprender una cantidad inmunológicamente efectiva del miembro de la familia de proteínas Bel-2 como tal, como se define en la presente, o un fragmento inmunogénico del mismo. La cantidad del péptido inmunogénico de la invención en la composición farmacéutica puede variar, dependiendo de la aplicación particular. No obstante, una dosis simple del inmunogeno está preferentemente en cualquier sitio desde aproximadamente 10 µg hasta aproximadamente 5000 µg, más preferentemente desde aproximadamente 50 µg hasta aproximadamente 2500 µg tal como de aproximadamente 100 µg hasta aproximadamente 1000 g. Los modos de administración incluyen la administración intradérmica, subcutánea e intravenosa, la implantación en la forma de una formulación de liberación en el tiempo, etc. Cualesquiera y todas las formas de administración conocidas en la técnica son abarcadas en la presente. También, cualesquiera y todas las formas de dosificación convencionales que sean conocidas en la técnica como apropiadas para la formulación de la composición peptídica inmunogénica inyectable, son abarcadas, tales como las formas liofilizadas y soluciones suspensiones o formas en emulsión que contienen, si se requiere, portadores, diluyentes, conservadores, adyuvantes, componentes amortiguadores, todos convencionales y farmacéuticamente aceptables, etc. Las composiciones farmacéuticas pueden ser preparadas y administradas utilizando cualquier protocolo convencional conocido por una persona de experiencia en la técnica. En el ejemplo 5, un ejemplo no limitante de preparación de una vacuna de acuerdo a la invención es dado aqui como un ejemplo no limitante de administración de tal vacuna. Podrá ser apreciado por la persona de experiencia en la técnica que el protocolo puede ser fácilmente adaptado a cualquiera de las composiciones de vacuna descritas en la presente . En una modalidad adicional de la invención, la composición farmacéutica de la invención es útil para tratar un paciente con cáncer, donde, durante la progresión del cáncer en ese paciente, las células cancerosas han desarrollado una susceptibilidad reducida a un fármaco anticanceroso quimioterapéuticamente activo, y/o radioterapia. La composición farmacéutica de la invención puede comprender ventajosamente al menos otra proteína inmunogénica adicional o fragmento peptídico de la misma, seleccionada de una proteína o fragmento peptídico que no pertenece a o que no es derivado de la familia de proteínas Bcl-2, incluyendo una proteína involucrada en la regulación de la apoptosis celular, o un fragmento peptídico derivado de ésta. Como un ejemplo, tal proteína o péptido adicional es la survivina como se define anteriormente, o un fragmento peptídico de la misma. En modalidades específicas, un péptido derivado de survivina inmunogénico adicional es un péptido restringido a HLA-A2 que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: FLKLDRERA (survivinaioi-109) (SEQ ID NO: 12), TLPPAWQPFL (survivina5-14) (SEQ ID NO: 13), ELTLGEFLKL (survivina95-104) (SEQ ID NO: 14), LLLGEPLKL (SEQ ID NO: 15) y LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 16) (Las designaciones en corchetes indican las posiciones de los residuos en la proteína survivina como se describe en US 6,245,523). LLLGEFLKL (SEQ ID NO: 15) es una secuencia derivada de la survivina96-io4 al sustituir "T" en la posición 2 del peptido con un nL" y LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 16) es derivada de survivina9s_104 al sustituir la UT" en la posición 2 con "M" . En modalidades específicas adicionales, el peptido derivado de survivina inmunogénico, adicional es un péptido derivado de survivina restringido a HLA-B35 que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: CPTENEPDL (survivina4S-54) (SEQ ID NO: 17), EPDLAQCFF (survivinasi-ss) (SEQ ID NO: 18) , CPTENEPDY (SEQ ID NO: 19) y EPDLAQCFY (SEQ ID NO : 20) . (Las designaciones en corchetes indican las posiciones de los residuos en la proteína survivina como se describe en US 6,245,523) . CPTENEPDY (SEQ ID NO: 19) es una secuencia derivada de la survivina46-54 al sustituir "L" en el extremo C del péptido con una "Y" y EPDLAQCFY (SEQ ID NO: 20) es derivada de la survivina51_59 al sustituir un residuo de "F" en la posición 2 C-terminal con un "Y" . En modalidades adicionales, el péptido adicional es un péptido restringido a HLA-A1 que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: Survivina38-46 (Sur38Y9) (una C cambiada a una Y en P9, MAEAGFIHY) (SEQ ID NO: 21), Survivina47-5S (Sur47Y10) (una Q cambiada a una Y en PIO, PTENEPDLAY (SEQ ID NO: 22)) Survivina92-ioi (Sur92-101) (QFEELTLGEF) (SEQ ID NO: 23) y Survivina93-10i (Sur93T2 (una E cambiada a T en P2 , FTELTLGEF (SEQ ID NO: 24)) . El péptido de la invención puede también ser un péptido restringido a HLA-A3 tal como Survivinai8-24 (Surl8K10) (una F cambiada a una K en PIO, RISTFKNWPK (SEQ ID NO: 25) y/o un péptido restringido a HLA-A11 tal como Survivina53-62 (Sur53-62) (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 26) y/o un péptido restringido HLA-A2 tal como Survivinai8.28 (Surl8-28) (RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO: 27) . No obstante, en una modalidad preferida de la invención, las composiciones de vacuna no comprenden la supervivencia o fragmentos de los mismos. Otros péptidos adicionales útiles incluyen el polipéptido ML-IAP inhibidor de la apoptosis, conocido, el cual tiene una expresión más bien selectiva, y es detectado en melanoma. De este modo, los fragmentos de ML-IAP capaces de promover una respuesta específica de células T, por ejemplo una respuesta de células T citotoxica o una respuesta de células T cooperadoras pueden ser opcionalmente incluidos en la composición de la presente invención. Los fragmentos péptidos útiles de ML-IAP incluyen cualquiera de los fragmentos de ML-IAP descritos en la solicitud de patente WO2004/089980, la cual se incorporada por referencia en la presente en su totalidad, preferentemente ML-IAP2 5 (RLQEERTCKV) (SEQ ID NO: 28), ML-IAP28o (QLCPICRAPV) (SEQ ID NO: 29), ML-IAP90 (RLASFYD PL) (SEQ ID NO: 30), L-IAP154 (LLRSKGRDFV) (SEQ ID NO: 31), ML-IAP23o (VLEPPGARDV) (SEQ ID NO: 32), ML-IAP98 (PLTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 33), ML-IAP34 (SLGSPVLGL) (SEQ ID NO: 34), ML-IAP54 (QILGQLRPL) (SEQ ID NO: 35), ML-IAP99 (LTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 36), L-IAP83 (GMGSEELRL) (SEQ ID NO: 37) y ML-IAP200 (ELPTPRREV) (SEQ ID NO : 38) . Otros peptidos adicionales útiles incluyen TRAG-3 y fragmento peptídicos de los mismos. TRAG-3 existe en al menos dos formas alternativamente empalmadas y peptidos de todas las formas empalmadas de TRAG-3 son útiles como peptidos adicionales. En particular, los fragmentos de cualquier forma de empalme de TRAG-3, en donde dichos fragmentos sean capaces de promover una respuesta especifica de células T, por ejemplo una respuesta de células T citotóxicas o una respuesta de células T cooperadoras puede ser opcionalmente incluido en la composición de la presente invención. Además, la composición de acuerdo a la presente invención puede ser proporcionada como una vacuna de ep topos múltiples que comprende el epxtopo restringido a la Clase I y los epxtopos restringidos a la Clase II, como se definen anteriormente en la presente. El efecto inmunoprotector de la composición de la invención puede ser determinado utilizando diversos procedimientos, por ejemplo, como se describe en W097/28816, supra. Una respuesta inmune útil puede ser también determinada por la aparición de reacciones DTH después de la inmunización y/o la detección de anticuerpos que reconocen específicamente el o los péptidos de la composición de vacuna . En modalidades preferidas, la composición farmacéutica de la invención es una composición de vacuna. La composición farmacéutica puede de este modo ser una composición inmunogénica o vacuna capaz de promover una respuesta inmune a una enfermedad cancerosa. Como se utiliza en la presente, la expresión "composición inmunogénica o vacuna" se refiere a una composición que promueve al menos un tipo de respuesta inmune dirigida contra las células cancerosas. De este modo, tal respuesta inmune puede ser cualquiera de los tipos anteriormente mencionados: una respuesta de CTL donde las CTL son generadas, que son capaces de reconocer el complejo HLA/péptido presentado sobre las superficies celulares, dando como resultado la lisis celular, por ejemplo la vacuna promueve la producción en el sujeto vacunado de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas; una respuesta de células B que da origen a la producción de anticuerpos anti-cáncer; y/o un tipo DTH de respuesta inmune.

En modalidades útiles una respuesta inmunogénica dirigida contra una enfermedad cancerosa es promovida por la administración del péptido de la invención ya sea mediante la carga de moléculas MHC de la Clase I sobre las células presentadoras de antígeno (APCs) provenientes del paciente, mediante el aislamiento de las PBLs provenientes del paciente y la incubación de las células con el péptido, antes de inyectar las células nuevamente al paciente, o mediante el aislamiento de las APCs precursoras provenientes del paciente, y diferenciando las células en APCs profesionales utilizando citocinas y antígeno antes de inyectar las células nuevamente al paciente. De este modo, un aspecto de la invención es proporcionar las composiciones de vacuna que comprenden células presentadas de antígeno que comprenden una proteína perteneciente a la familia Bel-2 o un fragmento peptídico de la misma o un ácido nucleico que codifica para la proteína o un fragmento peptídico. La célula presentadora de antígeno puede ser cualquier célula capaz de presentar un antígeno a una célula T. Las células presentadoras de antígeno preferidas son células dendríticas. Las células dendríticas (DC) pueden ser preparadas y utilizadas en un procedimiento terapéutico de acuerdo a cualquier protocolo adecuado, por ejemplo como se describe más adelante en la presente. Podrá ser apreciado por la persona de experiencia en la técnica que el protocolo puede ser adoptado para utilizarse con pacientes con diferente tipo de HLA y diferentes enfermedades. Las células dendríticas (DC) son pulsadas con 50 µ9/t?1 del peptido restringido HLA (sintetizado con calidad GMP) (buenas tácticas de fabricación) por 1 hora a 37°C, el peptido y 5 x 106 células son administrados subcutáneamente en el día 1 y 14, subsecuentemente cada 4 semanas, la leucaferesis adicional después de 5 vacunaciones. La generación de DC para el uso químico y el control de calidad pueden ser realizados esencialmente como se describe en la referencia 5. De este modo, en una modalidad de la presente invención, un método para tratar pacientes con cáncer es una en donde el péptido es administrado al presentar el péptido a las células presentadoras de antígeno del paciente (APCs) ex vivo, seguido por la inyección de las APCs tratadas de este modo, nuevamente al paciente. Existen al menos dos formas alternativas de realizar esto. Una alternativa es aislar las APCs del paciente con cáncer e incubar (cargar) las moléculas MHC de la Clase I con el péptido. La carga de las moléculas MHC de la Clase I significa incubar las APCs con el péptido, de modo que las APCs con las moléculas MHC de la Clase I específicas para el péptido, se enlazarán al péptido y por lo tanto serán capaces de presentarlo a las células T. Subsecuentemente, las APCs son reinyectadas al paciente.

Otra forma alternativa confía en los descubrimientos recientes realizados en el campo de la biología de las células dendríticas. En este caso, los monocitos (que son precursores de células dendríticas) son aislados del paciente y diferenciados in vitro en APC profesional (o células dendríticas) mediante el uso de citocinas y antígeno. Subsecuentemente, las DCs generadas in vitro son pulsadas con el péptido e inyectadas en el paciente . Debido al hecho de que los miembros de la familia de proteínas Bcl-2 parecen ser expresados en una gama de formas cancerosas, es muy probable que las vacunas de la invención puedan ser proporcionadas para controlar cualquier tipo de enfermedad cancerosa donde tales proteínas sean expresadas. De este modo, como ejemplos, la composición de vacuna de la invención es inmunológicamente activa contra una malignidad hematopoyética que incluye la leucemia linfática crónica, o la leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cerviz, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas o cáncer de próstata. A partir de la descripción anterior, la persona experta se dará cuenta fácilmente que las proteínas y/o péptidos de la invención son útiles como herramientas de diagnóstico para el cáncer. Por lo tanto, los péptidos de la invención proporcionan la base para desarrollar procedimientos de diagnóstico y de pronóstico ampliamente aplicables, con respecto a las enfermedades cancerosas. De este modo, en otras modalidades útiles la composición de la invención es una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente con cáncer, por ejemplo, basado en la detección de las células T reactivas a los miembros de la familia de proteínas Bcl-2, entre las PBLs o en un tej ido tumoral . En consecuencia, en ciertos aspectos adicionales se proporciona un equipo diagnóstico para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia, en un paciente con cáncer, de las células T reactivas a los miembros de la familia de proteínas Bcl-2, entre las PBLs o en el tejido tumoral, que comprende uno o más péptidos de la invención, y un método para detectar, en un paciente con cáncer, la presencia de tales células T reactivas, el método comprende poner en contacto un tejido tumoral o una muestra de sangre con un complejo de un péptido de la invención y una molécula de HLA de la Clase I, o un fragmento de tal molécula, y detectar el enlace del complejo al tejido o a las células sanguíneas. Otro procedimiento de diagnóstico o de pronóstico útil está basado en la generación de anticuerpos en una especie de animal heterólogo, por ejemplo, anticuerpos murinos dirigidos contra un péptido derivado del miembro de la familia de proteínas Bcl-2 humanas de la invención, que puede ser luego utilizado, por ejemplo, para diagnosticar la presencia de las células cancerosas que presentan el péptido. Para tales propósitos de inmunización, la cantidad del péptido puede ser menor que aquella utilizada en el curso de la terapia in vivo, tal como aquella mencionada anteriormente. En general, una dosis preferida puede estar en el intervalo de aproximadamente 1 µg hasta aproximadamente 750 µg del péptido. Es también posible producir anticuerpos monoclonales con base en la inmunización con un péptido de la invención. En consecuencia, la presente invención también se refiere a una molécula, en particular un anticuerpo monoclonal o policlonal incluyendo un fragmento del mismo, que es capaz de enlazarse específicamente a un péptido de la invención, y a una molécula que es capaz de bloquear tal enlace, por ejemplo un anticuerpo producido contra el anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra un péptido de la invención. La invención se refiere además a los receptores de células T aislados, capaces de enlazarse específicamente a un péptido o a una proteína de la invención, así como a los ácidos nucleicos aislados que codifican para los mismos. Tales receptores de células T pueden ser por ejemplo clonados a partir de las proteínas o de células T especificas del péptido utilizando técnicas estándares bien conocidas para la persona experta en la técnica. En un aspecto, la invención también se refiere a las células T aisladas que comprenden los receptores de células T capaces de enlazarse específicamente a cualquiera de las proteínas que pertenecen a la familia Bel-2 y/o los fragmento peptídicos de los mismos, descritos en la presente. Las células T aisladas son preferentemente células T que han sido expandidas in vitro. Los métodos para expandir células T in vitro son bien conocidos para la persona experta en la técnica. Tales células T pueden ser en particular útiles en el tratamiento del cáncer mediante transferencia adaptativa o transferencia de células autólogas . De este modo, la invención también se refiere a los métodos de tratamiento que comprenden administrar las células T que incluyen receptores de células T, capaces de enlazarse específicamente a una proteína que pertenece a la familia Bel-2 o fragmentos peptídicos de los mismos a un individuo, tal como un ser humano que sufre de cáncer. La invención se refiere además al uso de las células T que comprenden receptores de células T capaces de enlazarse específicamente a una proteína que pertenece a la familia Bcl-2 o fragmento peptídicos de las mismas, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. La transferencia de células autólogas puede ser realizada esencialmente como se describe en la referencia 7. En un aspecto, la invención proporciona un complejo de un péptido de la invención de una molécula HLA de la Clase I o un fragmento de tal molécula, que es útil como un reactivo de diagnóstico tal como se describe anteriormente menciona. Tal complejo puede ser monomérico o multimérico. La presente invención proporciona los medios para aliviar o curar una enfermedad cancerosa. En consecuencia,, un aspecto adicional de la invención es proporcionar un método para tratar una enfermedad cancerosa asociada con la expresión de un miembro de la familia de proteínas Bcl-2, que incluye como ejemplos: una malignidad hematopoyética que incluye leucemia linfática crónica, y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cerviz, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata, cuyo método comprende administrarle a un paciente que sufre de la enfermedad una cantidad efectiva de la composición farmacéutica de acuerdo a la invención, una molécula que es capaz de enlazarse específ camente a un péptido de la invención, y/o una molécula que es capaz de bloquear el enlace de tal molécula. En algunos casos, será apropiado combinar el método de tratamiento de la invención con un tratamiento convencional para el cáncer, tal como quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimuladoras, terapia génica, tratamiento con anticuerpos y tratamiento utilizando células dendríticas. Ya que la expresión elevada de los miembros de la familia de proteínas Bcl-2 en células tumorales está correlacionada con la resistencia a fármacos, la combinación de una inmunoterapia basada en Bel-2 como es descrita por la presente invención, con quimioterapia citotóxica puede ser un procedimiento efectivo para tratar el cáncer. En un aspecto, la invención se refiere a los métodos de monitoreo de la inmunización, el método comprende los pasos de : i) proporcionar una muestra de sangre proveniente de un individuo ii) proporcionar una proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico de las mismas, en donde la proteína o peptido puede ser cualquiera de las proteínas o péptidos descritos en la presente iii) determinar si la muestra de sangre comprende anticuerpos o células T que comprendan receptores de células T que se enlazan específicamente a la proteína o al péptido iv) determinar con esto si una respuesta inmune a dicha proteína o péptido ha sido producida en el individuo. El individuo es preferentemente un humano, un ser humano que ha sido inmunizado con una proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico de las mismas, o un ácido nucleico que codifica para la proteína o el péptido . La invención será ilustrada ahora por los siguientes ejemplos no limitantes y las figuras, en donde: La Figura 1 muestra la identificación de los péptidos que se enlazan a HLA-A2 provenientes de Bcl-2. Las bandas de cadena pesada de MHC de la Clase I fueron cuantificadas utilizando Phosphorimager . La cantidad de cadena pesada de HLA-A2 estabilizada está directamente relacionada a la afinidad de enlace del péptido agregado. El enlace del HIV Pol476 del péptido control pósito restringido a HLA-A2 (cuadro negro) fue comparado, con los péptidos Bcl172 (triángulo negro) , Bcliso (círculo negro) y Bcl2oo (circulo blanco) y La Figura 2 ilustra la respuesta de células T contra los péptidos Bcl172, Bcli80, Bcl2os y Bcl2i4 ¦ PLB proveniente de 15 pacientes con cáncer de mama fueron analizados. Los linfocitos T fueron estimulados una vez con el péptido antes de sembrarse en placa a 105 células por pozo por triplicado ya sea con o sin el péptido. El número promedio de puntos específicos del péptido (después de la sustracción de los puntos sin el péptido agregado) fue calculado para cada paciente utilizando el Analizador ImmunoSport® 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EU) . Las Figuras 3A-3B ilustran las respuestas de células T contra Bcl-2 como se mide por ELISPOT de IFN-?. PBL proveniente de diez pacientes con CLL positivos a HLA-A2 , tres pacientes AML positivos a HLA-A2 y dos pacientes con cáncer pancreático (PC) fueron analizados. Los péptidos Bcl2o8 (A) y Bcl2i4 (B) fueron examinados. Los linfocitos T fueron estimulados una vez con el péptido antes de sembrarse en placa a 105 células por pozo por triplicado, ya sea con o sin péptido. El número promedio de puntos específicos del péptido (después de la sustracción de los puntos sin el péptido agregado) fue calculado para cada paciente utilizando el Analizador ImmunoSpot Serie 2.0 (CT Analyzers, LLC, Cleveland, EU) . Los respondedores (definidos como número promedio de puntos específicos del antígeno ± 1/2 desviación estándar >25 por 105 linfocitos) son marcados como cuadros negros, mientras que los individuos no respondedores son marcados como cuadros blancos . Las Figuras 4A-4B ilustran la detección de CTL específica de Bcl-2 mediante granzyme B ELISPOT. Los linfocitos T provenientes de cuatro diferentes pacientes con cáncer de mama en etapa tardía (bl9, b20, b22, b!6) y un control saludable (hl) fueron estimulados con el péptido antes de sembrarse en placas a 105 células por pozo por triplicado, ya sea con o sin el péptido bcl20s (A) o Bcl2i4 (B) . El número promedio de puntos de Granzyme B específicos del péptido (después de la sustracción de los puntos sin el péptido agregado) se calculó para cada paciente utilizando el Analizador ImmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EU) . Los respondedores (definidos como el número promedio de puntos específicos del antígeno ± 1/2 desviación estándar >25 por 105 linfocitos) son marcados como cuadros negros, mientras que los individuos no respondedores son marcados como cuadros blancos . Las Figuras 5A-5B ilustran la capacidad citolítica de la CTL específica de Bcl-2. Las CTL reactiva a Bcl2o8 fueron aisladas de la PBL provenientes de un paciente con cáncer de mama utilizando esferas magnéticas recubiertas con HLA-A2/bcl2o8 · A) El cultivo a granel aislado fue analizado para la lisis específica de las células T2 con (cuadros negros) o sin (cuadros blancos) el péptido bcl2os. B) Lisis por las células T aisladas de bcl208 de la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 positiva a HLA-A2 (círculo negro) y la línea celular de cáncer de mama ZR75-1 negativa a HLA-A2 (círculo blanco) . Las Figuras 6A-6D ilustra las respuestas de células T restringidas a HLA-A2 contra Bcl-XL, como se mide por ELISPOT de IFN-?. Las PBL provenientes de doce individuos saludables, dieciocho pacientes con cáncer de mama (paciente BC) , seis pacientes con melanoma y dos pacientes con cáncer pancreático (pacientes PC) fueron analizados. Todos los individuos fueron positivos a HLA-A2. Fueron examinados los péptidos BCI-XLI-73-182 (YL DHLEPWI) (SEQ ID NO:48) (A), Bcl-XLI4I-I5O (VAFFSFGGAL) (SEQ ID NO: 49) (B) , Bcl-XL161_170 (VLVSRIAAWM) (SEQ ID N0:48) (C) , y Bcl-XL165-i74 (RIAAWMATYL) (SEQ ID NO:45) (D) . Los linfocitos T fueron estimulados una vez con el péptido antes de ser sembrados en placa a 105 células por pozo por triplicado, ya sea con o sin el péptido relevante. El número promedio de puntos específicos del péptido (después de la sustracción de los puntos sin el péptido agregado) fue calculado para cada paciente utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EU) . Los respondedores (definidos como el número promedio de puntos específicos del antígeno + 1/2 desviación estándar >25 por 105 linfocitos) son marcados como cuadros negros, mientras que los individuos no respondedores son marcados como cuadros blancos . La Figura 7 ilustra la detección de las CTL específicas de Bcl-XL por B ELISPOT de granzyme . Los linfocitos T provenientes de tres diferentes pacientes con cáncer de mama (BC35, BC36 y BC17) fueron estimulados una vez con el péptido antes de sembrarse en placa a 3 x 105 células por pozo por triplicado, ya sea con o sin el péptido Bcl-XLi73-182 (YLNDHLEPWI) . El número promedio de puntos de Granzyme B específicos del péptido (después de la sustracción de los puntos sin el péptido agregado) fue calculado para cada paciente utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EU) . Los individuos respondedores (definidos como el número promedio de puntos específicos del antígeno ± 1/2 desviación estándar >25 por 105 linfocitos) son marcados como cuadros negros, mientras que los individuos no respondedores son marcados como cuadros blancos . Las Figuras 8A-8C ilustran el análisis de las células positivas a CD8, específicas de Bcl-XL, en PBL provenientes de un paciente con cáncer de mama. Las PBL provenientes del paciente BC36 fueron estimuladas una vez con Bcl-XLi73-i82 in vitro y las células CD8+ fueron aisladas antes del análisis. La tinción de FACS del cultivo utilizando un anticuerpo anti-CD8 y el complejo pentámero HLA-A2/BclLi73-i82 reveló que 95.5% de las células fueron positivas a CD8, y 0.24% de éstas fueron positivas al pentámero (A). El pentámero HLA-A2/HIV fue utilizado como el control negativo (B) . El cultivo celular fue adicionalmente analizado por medio de ELISPOT (C) . Las Figuras 9A-9B ilustran las respuestas de células T restringidas a HLA-A2, contra Bcl-XL como se mide por ELISPOT de INF-?. PBL provenientes de doce individuos saludables, dieciocho pacientes con cáncer de mama (pacientes BC) , seis pacientes con melanoma y dos pacientes con cáncer pancreático (pacientes PC) fueron analizados. Todos los individuos fueron positivos a HLA-A2. Los péptidos Bcl-XLi18_ 126 (TAYQSFEQV) (SEQ'ID NO:43) (A) y Bcl-XL169-178 ( MATYL DHL) (SEQ ID NO:46) (B) fueron examinados. Los linfocitos T fueron estimulados una vez con el péptido antes de ser sembrados en placa a 105 células por pozo por triplicado, ya sea con o sin el péptido relevante. El número promedio de puntos específicos del péptido (después de la sustracción de los puntos sin el péptido agregado) fue calculado para cada paciente utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EU) . Los respondedores (definidos como el número promedio de puntos específicos del antígeno + 1/2 desviación estándar >25 por 105 linfocitos) son marcados como cuadros negros, mientras que los individuos no respondedores son marcados como cuadros blancos . La Figura 10 ilustra las respuestas de células T la respuesta de células T restringida a HLA-A3 contra Bcl-XL, como se mide por ELISPOT de INF-?. Los linfocitos T fueron estimulados una vez con el péptido antes de ser sembrados en placa a 105 células por pozo por triplicado, ya sea con o sin el péptido Bcl-XLiS5-i73 (RIAAWMATY) (SEQ ID NO: 50) . Las PBL provenientes de siete individuos saludables, cinco pacientes con cáncer de mama, cuatro pacientes con melanoma, dos pacientes con cáncer pancreático, y cinco pacientes con mieloma múltiple fueron examinados . Todos los individuos fueron positivos a HLA-A3. El número promedio de puntos específicos del péptido (después de la sustracción de los puntos sin el péptido agregado) fue calculado para cada paciente utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EU) . La Figura 11 ilustra las respuestas de células T restringidas a HLA-A3 contra Mcl-1, como se mide por ELISPOT IFN-?. Los linfocitos T fueron estimulados una vez con el peptido antes de ser sembrados en placa a 3xl05 células por pozo por triplicado, ya sea con o sin el peptido PBL a partir de diez individuos saludables, seis pacientes con cáncer de mama (BC) , dos pacientes con cáncer pancreático (PC) y seis pacientes con CLL fueron examinados contra el peptido Mcl-195_ io3 (izquierdo) y el peptido Mcl-l30o-308 {derecho) . Todos los individuos fueron positivos a HLA-A3. El número promedio de puntos específicos del peptido (después de la sustracción de los puntos sin el peptido agregado) fue calculado para cada paciente utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EU) . Los respondedores (definidos como el número promedio de puntos específicos del antígeno + 1/2 desviación estándar >25 por 105 linfocitos) son marcados como cuadros negros, mientras que los individuos no respondedores son marcados como cuadros blancos . La Figura 12 ilustra las respuestas de células T restringidas a HLA-A1 contra Mcl-1 como se mide por ELISPOT IFN-?. Los linfocitos T fueron estimulados una vez con el péptido antes de ser colocados en placa a 3xl05 células por pozo por triplicado, ya sea con o sin el péptido Mcl-l166-i75 o Mcl-li77-i85 ¦ Las PBL provenientes de seis individuos saludables, cuatro pacientes con cáncer de mama (BC) , y siete pacientes con melanoma fueron examinados contra el péptido Mcl-l95-io3 {izquierdo) y el péptido Mcl-l30o-308 [derecho) . Todos los individuos fueron positivos a HLA-A1. El número promedio de puntos específicos del péptido (después de la sustitución de los puntos sin el péptido agregado) fue calculado para cada paciente utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EU) . Los respondedores (definidos como el número promedio de puntos específicos del antxgeno ± 1/2 desviación estándar >25 por 105 linfocitos) son marcados como cuadros blancos, mientras que los individuos no respondedores son marcados como cuadros blancos .

EJEMPLOS Ejemplo 1 Respuestas inmunes contra Bel-2 en pacientes con cáncer de mama Materiales y Métodos 1. Pacientes Linfocitos de sangre periférica (PBL) fueron recolectados de pacientes con cáncer de mama. Los PBL fueron aislados utilizando separación Lymphoprep, tipificados para HLA (Departamento de Inmunología Clínica, University Hospital, Copenhague, Dinamarca) y congelados e FCS con 10% de DMSO. Ninguno de los pacientes recibieron inmunoterapia antes del muestreo de la sangre . 2. Ensayo de ensamble para los péptidos que se enlazan a las moléculas MCH de la Clase I La actividad de enlace de los péptidos sintéticos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) a las moléculas de HLA-A2 marcadas metabólicamente con [35S] -metionina, se midió en el ensayo de ensamble, como se describió previamente. El ensayo está basado en- la estabilización mediada por péptidos de las moléculas HLA liberadas de la lisis celular, a partir de la línea celular T2 deficiente en TAP. Las moléculas HLA establemente plegadas fueron inmunoprecipitadas utilizando el mAb 6/32 dependiente de la conformación, específico de HLA de la Clase I, y separadas mediante enfoque isoeléctrico (electroforesis en gel de enfoque (IEF) ) . Las bandas de cadena pesada MHC fueron cuant ficadas utilizando el programa Phosphorimager de ImageGauge (FUJI photo film Co., Carrollton, X, EUA) . La intensidad de la banda está directamente relacionada a la cantidad de complejo de MCH de la Clase I enlazado al péptido, recuperado durante el ensayo. Subsecuentemente, el grado de estabilización de HLA-A2 está directamente relacionado a la afinidad de enlace del péptido agregado. La recuperación de HLA-A2 fue medida en presencia de 50, 5, 0.5, 0.05 µ? del péptido relevante. El valor de C50 fue calculado para cada péptido como la concentración del péptido suficiente para la estabilización media máxima. 3. Estimulación del antlgeno de PBL Para extender la sensibilidad del ensayo ELISPOT, se estimularon PBL una vez in vi tro antes del análisis. En el día 0, las PBL o los nodulos linfáticos triturados fueron descongelados y cortados en placas de 2 ml/pozo a una concentración de 2x10S células en placas de 24 pozos (Nunc, Dinamarca) en medio X-vivo (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland) , 5% de suero humano inactivado por calor, y L-glutamina 2 m en presencia de 10 µ? de péptido. Dos días después se agregaron a los cultivos 20 Ul/ml de interleucina 2 recombinante (IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemania) . Las células cultivadas fueron probadas para la reactividad en el ELISPOT en el día 12. 4. Ensayo ELISPOT El ensayo ELISPOT fue utilizado para cuantificar las células efectoras que liberan interferón-?, específicas del epitopo peptídico, como se describió previamente (4) . En resumen, placas de 96 pozos de fondo redondo, de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) fueron recubiertas con el anticuerpo anti-IFN-? (1-D1K, abtech, Nacka, Suecia) . Los pozos fueron lavados, bloqueados por el medio X-vivo, y las células agregadas por duplicado a diferentes concentraciones celulares. Los péptidos fueron luego agregados a cada pozo y las placas fueron incubadas toda la noche. Al siguiente día, el medio se desechó y los pozos fueron lavados antes de la adición del anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-l-Biotin, Mabtech) . Las placas fueron incubadas por 2 horas, lavadas y el conjugado Avidin-enzima (AP-Avidin, Calbiochem, Life Technologies) fue agregada a cada pozo. Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente por 1 hora y el sustrato enzimático NBT/BCIP (Gibco, Life Technologies) fue agregado a cada pozo e incubado a temperatura ambiente por 5 a 10 minutos . La reacción fue terminada mediante el lavado con agua de la llave después de la emergencia de puntos púrpura oscuros. Los puntos fueron contados utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EU) y la frecuencia de CTL específico del péptido pudo ser calculada a partir de los números de las células formadoras de puntos. Todos los ensayos fueron realizados por triplicado para cada antígeno peptxdico. 5. Resultados Enlace de péptidos derivados de Bel-2 a HLA-A2 La secuencia de aminoácidos de la proteína Bcl-2 fue seleccionada para los epitopos peptídicos de nona- y decámero de HLA-A2, utilizando los residuos de ancla específicos de HLA-A2 (2) . Trece péptidos derivados de Bcl-2 fueron sintetizados y examinados para el enlace a HLA-A2 por comparación con el epitopo control positivo de alta afinidad HLA-A2 proveniente del VIH-1 pol47S-484 (ILKEPVHGV) (SEQ ID NO: 39) mediante el ensayo del montaje. El ensayo de montaje está basado en la estabilización de la molécula de la Clase I después de la carga de diferentes concentraciones del peptido a la línea celular T2 deficiente en TAP . Las cadenas pesadas de MHC estables, correctamente plegadas, subsecuentemente son inmunoprecipitadas utilizando anticuerpos dependientes de la conformación. El grado de estabilización de las moléculas MHC de la Clase I está directamente relacionada a la afinidad de enlace del péptido agregado como es ejemplificado en la Figura 1. La concentración peptídica requerida para la recuperación medía máxima de las moléculas MHC de la Clase I (valor de C50) fueron de 0.7 µ?? para HIV-1 pol476-484 (Tabla 1) . Ocho péptidos derivados de Bcl-2 se enlazaron con afinidad alta casi similar como el control positivo: Bcl224, Bcl85, Bcl222, Bcl2i8, bcl220, Bcl2i4, Bcl124 y Bcli72 (C50 = 0.7, 1, 1, 2, 1, 3, 1 y 2 µ?, respectivamente) (Tabla 1) . Los péptidos Bcl80, Bcl208 Y Bcli80 se enlazaron únicamente con afinidad intermedia o débil (C50 = 36, 7 y 20 µ , respectivamente) . Dos de los péptidos examinados (Bcl2i6, Bcl2o0) no se enlazaron a HLA-A2 del todo. Una lista de los péptidos incluidos en este estudio se muestran en la Tabla 1: Tabla 1. Péptidos examinados en este estudio Proteína3 Secuencia SEQ ID c50 (µ?) NO: HIV-1 POl4 6 ILKEPVHGV 39 0.7 Bcl224 A L V G A C I T L 1 0.7 Bcl85 A L S P V P P V V 2 1 bcl222 S L A L V G A C I 3 1 bcl220 L L S L A L V G A 5 1 o bcl8o A A A G P A L S P V 1 36 bcl2i6 S L K T L L S L A L 40 No enlace bcli24 F T A R G R F A T V 9 1 bcliso Y L N R H L H T W I 10 15 bcli72 N I A L W M T E Y L 11 2 bcl2oo E L Y G P S M R P L 41 No enlace El intervalo de valores listados en el subíndice indica la posición del primer aminoácido en la secuencia b El valor de C50 es la concentración del péptido requerido para el enlace medio máximo a HLA-A2 respuestas de CTL contra los peptidos derivados de BCL-2 en pacientes con cáncer de mama tratados con quimioterapia Utilizando el ensayo de secreción de IFN-? ELISPOT, se examinó la presencia de las respuestas de células T especificas contra los peptidos derivados de Bcl-2 en células T de sangre periférica a partir de pacientes con cáncer de mama. Éste método ha sido previamente altamente efectivo cuando se identifican las CTL específicas de tumores en pacientes con cáncer. Los PBL provenientes de 15 pacientes con cáncer de mama positivos a HLA-A2 fueron estimulados una vez in vitro antes del examen en el ELISPOT. Este procedimiento fue elegido para extender la sensibilidad del ELISPOT como se describe (4) . Ya que muchos epitopos CTL descritos son de hecho peptidos de baja afinidad se incluyeron los trece péptidos deducidos de bcl-2 en la primera línea de experimentos. Las respuestas fueron detectadas contra Bcl172, Bcliso, Bcl2o8 y Bcl2i4 y únicamente los datos de estos péptidos se dan en la Figura 2. Las respuestas de CTL espontáneas fueron detectadas contra Bcli72 en PBL provenientes de ocho de los pacientes (50%) , y contra Bcliso en cuatro de los pacientes (aproximadamente 25%) (Figura 2) . No obstante, las respuestas más frecuentes fueron detectadas contra Bcl2os y Bcl2i4, ya que doce (aproximadamente 80%) de los pacientes alojaron una respuesta de CTL detectable contra Bcl2o8 y once de los pacientes (aproximadamente 75%) alojaron una respuesta de Bcl2i4 (Figura 2) .

Ej emplo 2 Inmunogenicidad de Bel-2 en pacientes con cáncer Resumen En la presente, se describe la reactividad espontánea de células T contra Bcl-2 en sangre periférica de pacientes que sufren de tipos de tumores no relacionados, por ejemplo, cáncer pancreático, AML y CLL. Además, se muestra que estas células T reactivas a Bcl-2 son por supuesto células efectoras citotóxicas, especificas del péptido. De este modo, Bcl-2 pueden servir como un objetivo importante y ampliamente aplicable para las estrategias inmunoterapéuticas anti-cáncer, por ejemplo, en la combinación con radioterapia y quimioterapia convencionales .

Introducción La familia de Bcl-2 comprende varios jugadores clave en la regulación de la apoptosis e incluye las moléculas proapoptóticas así como la antiapoptótica . Bcl-2 es un factor celular crítico que contribuye a la patogénesis y la progresión del cáncer. En el presente estudio, se examinó la inmunogenicidad natural celular de Bel -2 en pacientes con cáncer.

Métodos Pacientes Las PBL fueron aisladas utilizando separación Lymphoprep, tipificadas por HLA (Departament de Inmunología Clínica, University Hospital, Copenhague, Dinamarca) y congeladas en FCS con 10% de DMSO. Ninguno de los pacientes recibieron ínmunoterapia antes de la toma de muestra de la sangre . El consentimiento informado fue obtenido de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas . Los linfocitos de sangre periférica (PBL) fueron recolectados de trece pacientes con cáncer de mama positivos a HLA-A2 que presentan enfermedad progresiva con metástasis distantes que definen la enfermedad en etapa IV; la mayoría de los pacientes tuvieron más de un sitio tumoral (8/13 pacientes) . El . tratamiento previo incluyó quimioterapia, terapia endocrina, y radioterapia. Ocho pacientes fueron previamente tratados con quimioterapia, mientras que cinco pacientes habían únicamente recibido terapia endocrina y ninguna quimioterapia antes de la inclusión en el estudio. Además, doce pacientes positivos a HLA-A2 con cáncer de mama operable localizado fueron incluidos, y las muestras de sangre fueron recolectadas antes de la cirugía primaria y la quimioterapia. Adicionalmente, se recolectaron PBL de doce pacientes con cáncer pancreático positivos a HLA-A2 que presentan enfermedad progresiva con metástasis distantes que definen la enfermedad en etapa IV. Finalmente, se recolectaron PBL de diez pacientes con CLL recién diagnosticados con HLA-A2 y tres con AML, antes de la terapia. Los PBL provenientes de doce individuos saludables positivos a HLA-A2 sirvieron como controles .

ELISPOT DE Granzyme B El ensayo ELISPOT de Granzyme B (GrB) fue utilizado para medir la citotoxicidad de CTL específico del antígeno como se describe. En resumen, placas de 96 pozos de fondo redondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, illipore) fueron recubiertas con el Anticuerpo de Captura GrB (BD Biosciences, Brondby, Dinamarca) . Los pozos fueron lavados y bloqueados por el medio X-vivo con 5% de suero humano. Las células fueron agregadas a diferentes concentraciones celulares. Las células T2 y los péptidos fueron luego agregados a cada pozo y las placas fueron incubadas 4 horas, el medio se desechó y los pozos fueron lavados antes de la adición del Anticuerpo de Detección GrB (BD Biosciences) . Las placas fueron incubadas por 2 horas, lavadas y se agregó a cada pozo la peroxidasa de rábano conjugada a la Avidina (BD Biosciences) . Las placas fueron incubadas a temperatura ambiente por 1 hora, se agregó el Reactivo de Sustrato AEC (BD Biosciences) a cada pozo, y se incubaron a temperatura ambiente por 5 a 10 minutos. La reacción fue terminada mediante lavado con agua de la llave después de la aparición de los puntos rojos. Los puntos fueron contados y la frecuencia de CTL específicos del peptido fue calculada como para ELISPOT de IF -?. Todos los ensayos fueron realizados por duplicado o triplicado para cada antigeno peptídico.

Aislamiento de células T especificas del peptido Las células específicas del antigeno fueron aisladas por medio de esferas magnéticas recubiertas con Bcl2o8/HLA-A2 como se describió previamente. Los monómeros biotinilados (Prolmmune, Oxford, Reino Unido) fueron acoplados a esferas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280, Dynal A/S, Oslo, Noruega) mediante la incubación de 2.5 µg de monómeros con 5xl06 esferas en 40 µ? de PBS, por 20 minutos a temperatura ambiente. Los complejos magnéticos fueron lavados tres veces en PBS en un campo magnético (Dynal A/S, Oslo, Noruega) y subsecuentemente mezclados con PBLs, a una proporción de 1:10 en PBS con 5% de BSA, y rotados muy suavemente por 1 hora. Las células T CDI+ específicas del antígeno que se asocian con los complejos magnéticos fueron lavadas suavemente tres veces. Las células aisladas fueron resuspendidas numerosas veces en X-vivo con 5% de HS, e incubadas por 2 horas, antes de que las esferas magnéticas fueran liberadas y removidas de la suspensión celular. Las células aisladas fueron cultivadas en una placa de 48 pozos en X-vivo, 5% de HS y 106 células presentadoras de antígeno basadas en células artificiales recubiertas con anti-CD28 o anti-CD3 (K32/41BBL) que expresan el ligando 4-1BB (4-1BBL) (amablemente proporcionado por el Dr. Cari H. June, Departamento, de Patología y Medicina de Laboratorio, Universidad de Pennsylvania) . Un día después del aislamiento, se agregaron 20 unidades/ml de IL-2 y en el día 5 se probó la capacidad de estas células para matar las células diana ya sea en ensayos de liberación estándar de 51Cr. Clonación mediante dilución limitante Los clones CTL fueron establecidos a partir de cultivos aislados mediante dilución limitante en placas de 96 pozos utilizando PBMC irradiados como células alimentadoras en presencia de 40 Ul/ml e IL-2 y 1 µg/ml de PHA en X-vivo con 5% de HS . El medio fresco e IL-2 se agregaron a los clones cada 3 a 4 días.

Ensayo de citotoxicidad Ensayos convencionales de liberación [51Cr] para la citotoxicidad mediada por CTL fueron llevados a cabo como se describe en la presente. Las células diana u objetivo fueron células T2 con o sin el péptido relevante, la línea celular MDA-MB-231 de cáncer de mama positiva a HLA-A2 , y la línea celular ZR75-1 de cáncer de mama, negativa a HLA-A2. Ambas líneas celulares de cáncer de mama expresaron Bcl-2 como fue examinado por la PCR de transcripción inversa (datos no mostrados) .

Resultados Respuestas de CTL contra los péptidos derivados de Bcl-2 Para examinar si las células T específicas de Bcl-2 estaban también presentes en PBL provenientes de pacientes con leucemia, se examinaron PBL provenientes de diez pacientes con CLL positivos a HLA-A2 y tres pacientes con AML para la reactividad contra los dos péptidos bcl208 y bcl2i4. Las respuestas de Bcl-2 estuvieron presentes en cinco de los pacientes con CLL y dos de los pacientes con AML (Figura 3) . Además, se examinó PBL proveniente de dos cánceres pancreáticos y se identificó que ambos pacientes alojaban una respuesta de CTL contra los péptidos bcl208 y bcl2i4 (Figura 3) . Similarmente, PBL proveniente de 12 individuos saludables positivos a HLA-A2 fueron examinados. Sorprendentemente, se detectó una respuesta débil de CTL contra el péptido bcl208 en uno de los individuos saludables (datos no mostrados) .

Liberación de Granzyme B específica de Bcl-2, en PBL Utilizando el ensayo ELISPOT de GrB se evaluó si las células T específicas de bcl-2 detectadas en PBL mostraban función citotóxica. De este modo, los PBL provenientes de tres de los pacientes con cáncer de mama reactivos a bcl-2 (pacientes Nos. 19, 20 y 22) fueron analizados para la reactividad contra los dos epitopos bcl20s y bcl2i4 (Figura 4) . En los tres pacientes, las respuestas contra amb.os péptidos pudieron ser detectadas con una frecuencia a aproximadamente 50 a 140 CTL específicos del péptido por 105 PBL. Como un control, se incluyó un paciente (paciente No. 16) , en el cual se puede detectar únicamente una respuesta contra bcli72 pero no contra bcl20s Y bcl214 en el ELISPOT de IFN-? y un control saludable (hl) . Como se esperaba, no se detectó ninguna liberación de GrB contra bcl208 o bcl2i4 ni en el paciente no. 16 con cáncer de mama ni en el control saludable .

La capacidad funcional de CTL reactivos a Bcl-2 Para caracterizar opcionalmente la capacidad funcional de los CTL reactivos hacia Bcl-2, estas células fueron enriquecidas por medio de esferas magnéticas recubiertas · con los complejos de HLA-A2/bcl208 como se describe. Las células fueron estimuladas una vez con péptido in vitro antes del aislamiento. Una fracción pequeña de las células aisladas fue clonada por dilución limitante. Los cultivos en expansión fueron examinados para reconocimiento de las células T2 ya sea sin el péptido o pulsadas con bcl208 en un ELISPOT de GrB. Varios de estos clones mostraron reconocimiento específico de las células T2 pulsadas con bcl208 (datos no mostrados) . No obstante, desafortunadamente no fueron capaces de expandir estos clones para el análisis posterior. Un día después del aislamiento se agregó IL-2 a las células remanentes, y en el día 5 se probó la capacidad de las células para matar las células T2 cargadas con péptido, en ensayos estándares de liberación de 51Cr. Para este fin, las células T2 no cargadas o las células T2 cargadas con péptido bcl208 sirvieron como objetivos. Este ensayo reveló que únicamente las células T2 pulsadas con bcl2os fueron muertas (Figura 5a) . Éstas se enriquecieron y las células T reactivas a bcl208 estimuladas in vitro fueron utilizadas adicionalmente para probar la capacidad para matar la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231 que expresa Bcl-2 positiva a HLA-A2. Las células T enriquecidas Usaron eficientemente las células MDA-MB-231, mientras que en contraste, no se observó ninguna citotoxicidad contra la línea celular de cáncer de mama ZR75-1 negativa a HLA-A2, que expresa Bel-2 (Figura 5b) Ejemplo 3 Inmunogenicidad de Bcl-X (L) en pacientes con cáncer Breve Resumen Aguí, se demuestra que Bcl-XL es un objetivo para el reconocimiento de células T en pacientes con cáncer. De este modo, se describen las respuestas de células T citotóxicas restringidas en HLA-A2 y HLA-A3 contra los epitopos peptídicos derivados de Bcl-XL, por medio de ELISPOT y tinciones de citometría de flujo. De este modo, las respuestas inmunes celulares contra los inhibidores de la apoptosis como las proteínas de la familia Bcl-2 parecen representar un fenómeno general en el cáncer, y en consecuencia, este grupo de proteínas representa proteínas objetivo universales, atractivas, para la inmunoterapia anticáncer. Adicionalmente, ya que la expresión elevada de estas proteínas en células está correlacionada con la resistencia a fármacos, la combinación de la inmunoterapia con quimioterapia citotóxica es una manera muy atractiva para tratar el cáncer.

Introducción La proteína antiapoptótica Bcl-XL es producida a partir de la forma de empalme alternativa larga del gen bcl-x, mientras que Bcl-Xs proapoptótico es derivado de la forma de empalme alternativa corta del mismo gen. Bcl-XL juega un papel importante en el cáncer ya que éste ha sido directamente vinculado a la resistencia a formas convencionales de terapias y pobre pronóstico. La inhibición funcional de Bcl-XL restaura el proceso apoptótico y hace a las células neoplásicas sensibles a las quimioterapias y a las radioterapias, mientras que la manipulación de las líneas celulares cancerosas para expresar altos niveles de Bcl-XL da como resultado un fenotipo de resistencia a fármacos múltiples. La expresión incrementada de Bcl-XL ha sido reportada en una variedad de diferentes malignidades incluyendo AML y mieloma múltiple, así cánceres sólidos como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer pancreático y melanoma. Los objetivos ideales para la inmunoterapia son productos génicos silenciados en tejidos normales, sobreexpresados en células cancerosas, y directamente involucrados en la supervivencia y progresión de las células tumorales . Materiales y métodos Pacientes Los linfocitos de sangre periférica (PBL) fueron recolectados de pacientes que sufrían de cáncer de diferente origen, y de controles saludables, y fueron aislados utilizando la separación Lymphoprep, tipificados por HLA (Departamento de Inmunología Clínica, University hospital, Copenhague, Dinamarca) y congelados en FCS con 10% de DMSO. Ninguno de los pacientes recibió inmunoterapia antes de la toma de muestra de sangre . Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas .

Citómetría de flujo (FACS) Los PBL provenientes de un paciente con cáncer de mama fueron estimulados una vez in vitro con el péptido relevante y en el día siete las células CD8+ fueron aisladas de PBL utilizando el equipo de aislamiento negativo a CD8, Dynal (Dynal Biotech ASA, Oslo, Noruega) . El cultivo de células T positivas a CD8, resultantes, fue teñido con los pentámeros de MCH, PE couplet ProB^ (Prolmmune, Oxford, Reino Unido) , seguido por tinción del anticuerpo con los anticuerpos monoclonales acoplados al fluorocromo: CD8-APC y CD3-FITC (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, San José, CA) . Ambas tinciones fueron realizadas en PBS+2% de FCS, por 30 minutos a 4°C, en la oscuridad. Los complejos del pentámero MHC ProtMR utilizados fueron: HLA-A2/Bcl-XLi73-i82 (YLNDHLEPWI) (SEQ ID NO: 42) y HLA-A2/HIV-1 pol476-484 (IL EPVHGV) (SEQ ID NO: 39) . Las muestras fueron analizadas sobre FACS BD aria, utilizando el software DIVA (BD, San José, CA) .

Resultados Respuesta de CTL espontánea contra los pétidos derivados de Bel -XL El gen bcl-x es transcrito dentro de los dos ARNms a través del empalme alternativo. La proteína antiapoptótica Bcl-XL es producida a partir del empalme alternativo largo, mientras que Bcl-XS proapoptótico es derivado del empalme alternativo corto de este gen. El producto proteico de BCL-XL más grande difiere de la proteína Bcl-XS por una región insertada (aminoácidos 126-188) . De este modo, para investigar si Bcl-XL es un objetivo natural para las células T en pacientes con cáncer, se realizó el escrutinio de esta región insertada (incluyendo los nueve aminoácidos en cada extremo) para los epitopos putativos de HLA-A2 utilizando los residuos de ancla específicos de HLA-A2 principales. Subsecuentemente, se sintetizaron siete péptidos deducidos de BCI-XL (Bcl-XL158-iS6 (EMQVLVSRI) (SEQ ID NO: 44), Bcl-XLn8-i26 (TAYQSFEQV) (SEQ ID NO: 43), Bcl-XLi73-i82 (YLNDHLEPWI) (SEQ ID NO: 42), Bcl-XL165-i74 (RIAAWMATYL) (SEQ ID NO: 45), Bcl-XLie9-i78 ( MATYLNDHL) (SEQ ID NO: 46), Bcl-XLi6i-i70 (VLVSRIAAW ) (SEQ ID NO: 48, Bcl-XLi4i-i5o (VAFFSFGGAL) (SEQ ID NO: 49)) y se realizó el escrutinio de PBL a partir de pacientes con cáncer HLA-A2+ de diferente origen, por medio de ELISPOT contra estos péptidos. Este método ha mostrado previamente que es altamente efectivo para identificar CTL específico en pacientes con cáncer. Más bien, las respuestas fuertes y frecuentes de CTL fueron detectadas contra cuatro de los péptidos examinados (Bcl-XLi73~i82/ Bcl-XLi4-i-i50/ BC1-XLI6I-I70/ Y Bcl-XLi65-i74) en pacientes con cáncer y de diferente origen (Figura 6). En total,' quince de dieciocho pacientes con cáncer de mama HLA-A2+ alojaron una respuesta inmune contra al menos uno de estos péptidos Bcl-XL (los respondedores son definidos como el número promedio de células específicas al antígeno ± 1/2 desviación estándar >25 x 105 células) . De igual modo, cuatro de los seis pacientes con melanoma examinados y uno de dos pacientes con cáncer pancreático examinados alojaron una respuesta inmune contra al menos uno de estos cuatro péptidos. De este modo, nueve de los dieciocho pacientes con cáncer de mama examinados alojaron una respuesta inmune contra Bcl-XLx73_182, mientras que dos de seis de los pacientes con melanoma HLA-A2+ examinados alojaron una respuesta inmune contra este péptido (Figura 6a) . Cuatro de los dieciocho pacientes _con cáncer de mama examinados alojaron una respuesta inmune contra Bcl-XLi i-i50 mientras que se detectaron respuestas en PBL a partir de uno de los dos pacientes con cáncer pancreático examinados. No fue posible detectar una respuesta en PBL a partir de cualquiera de los cinco pacientes con melanoma examinados contra este péptido (Figura 6b) . De igual modo, se detectó una respuesta en PBL a partir de seis pacientes con cáncer de mama, y un paciente con cáncer pancreático examinado contra BCI-XLISI-170 (Figura 6c) . Finalmente, cuatro pacientes con cáncer de mama, dos pacientes con melanoma y un paciente con cáncer pancreático alojaron una respuesta contra Bcl-XLi65-i74 (Figura 6d) . Como control se examinaron los PBL de 12 individuos saludables HLA-A2+. De manera importante, no se detectaron respuestas contra ninguno de los péptidos Bcl-XLi73_ 182, BC1-XKL I-I5O, Bel-XLI6I-I7O O Bcl-XLi65-i7 en cualquiera de los individuos saludables (Figura 6) .

Liberación de Granzyme B en PBL específico de Bcl-XL Utilizando el GrB ELISPOT se evaluó si las células T específicas de Bcl-XL detectadas en PBL mostraron función citotóxica. De este modo, los PBL provenientes de dos de los pacientes con cáncer de mama reactivos a Bcl-XL (pacientes Nos. 35 y 36) fueron analizados para la reactividad contra Bel-XLi73-182 (Figura 7) . En ambos pacientes, las respuestas contra Bcl-XLi73-i82 pudieron ser detectadas con una frecuencia de aproximadamente 50 a 100 péptidos específicos de CTL por 3?10? ( células. Como un control, se incluyó un paciente (paciente No. 17) , en el cual se pudo detectar únicamente una respuesta contra Bcl-XLi4i-iso pero no contra Bcl-XL173_i82 en el ELISPOT de IFN-?. Como se esperaba, no se detectó ninguna liberación de GrB contra Bcl-XL173_182 en el paciente No. 17 con cáncer de mama.

Análisis de FACS de las células T específicas de Bcl-XL La aparición espontánea de CTL especifica de Bcl- LI73-I82 en PBL provenientes de pacientes con cáncer de mama fue evaluada adicionalmente utilizando análisis de FACS y la tinción con el Pentamero HC ProtMR. Los PBL provenientes del paciente No. 36 con cáncer de mama fueron estimulados una vez in vi tro con el peptido y se aislaron las células positivas a CD8. Este cultivo fue teñido con el complejo pentamérico HLA-A2/BCL-X. Los análisis de FACS revelaron una población fácilmente detectable de las células T positivas al pentámero constituyendo 0.24% de las células T de CD8+ (Figura 8a). En comparación, las mismas células T CD8+ mostraron alrededor de 1.4% de células T CD8+ que secretan IFNy, específicas de Bcl-XLI73-I82/ cuando fueron analizadas por medio de ELISPOT (Figura 8c) .

Epi topos restringidos en HLA-A2 adicionales, contra Bcl-X(L) Se escrutaron PBL provenientes de pacientes con cáncer HLA-A2+ de diferentes orígenes por medio de ELISPOT contra Bcl-XLn8-126 (TAYQSFEQV) (SEQ ID NO: 43) (Figura 9a) y Bcl-XLi69-i78 (WMATYLNDHL) (SEQ ID NO : 46) (Figura 9b) identificando una respuesta de CTL . espontánea débil en pacientes con cáncer de diferentes orígenes, contra ambos péptidos .

Respuestas restringidas a HLA-A3 contra Bcl-X(L) Adicionalmente, se escrutó la región insertada (incluyendo nueve aminoácidos en cada extremo) para los epitopos de HLA-A3 putativos utilizando los residuos de ancla específicos de HLA-A3 principales. Subsecuentemente, se sintetizaron dos péptidos: Bcl-XLi65-i73 (RIAA MATY) (SEQ ID NO: 50) y el Bcl-XLi49-i57 (ALCVESVDK) (SEQ ID NO: 51) . Enseguida, se escrutaron PBL provenientes de pacientes con cáncer HLA-A3+ de diferente origen por medio de ELISPOT contra BC1-XLI65- (RIAAWMATY) (SEQ ID NO : 50) y el péptido Bcl-XLi49-i57 (ALCVESVDK) (SEQ ID NO: 51) . Este método ha mostrado previamente que es altamente efectivo para identificar CTL específicos de tumor en pacientes con cáncer. Por su puesto, las respuestas de CTL fuertes y frecuentes fueron detectadas contra Bcl-XLi65-i73 (RIAAWMATY) (SEQ ID NO: 50) en pacientes con cáncer de diferente origen. Fuimos capaces de detectar una respuesta contra BC1- LI65-173 en PBL HLA-A3+ en cuatro de los cinco pacientes con cáncer de mama examinados (los respondedores son definidos como el número promedio de células específicas al antígeno ± 1/2 desviación estándar >25 x 105 células) , cuatro de los cuatro pacientes examinados con melanoma, dos de los dos pacientes examinados con cáncer pancreático así como uno de los cuatro pacientes examinados con mieloma múltiple (Figura 10) . De manera importante, fuimos capaces de detectar una respuesta en cualquiera de los siete individuos saludables HLA-A3+ que se examinaron como controles (Figura 10) .

Ejemplo 4 Inmunogenicidad de Mcl-1 en pacientes con cáncer Breve Resumen Aquí, se demuestra que Mcl-1 es un objetivo para el reconocimiento de las células T en pacientes con cáncer. De este modo, se describen las respuestas de células T citotóxicas espontáneas restringidas en HLA-A1 y HLA-A3 contra los epitopos peptídicos derivados de Mcl-1 por medio de ELISPOT.

Introducción El factor 1 de células mieloides (Mcl-1) es un miembro inhibidor de muerte de la familia Bcl-2 que es expresado en la diferenciación temprana de monocitos y puede promover la viabilidad sobre la transfección en células mieloides inmaduras. Mcl-1 en ratones transgénicos promueve la supervivencia en un espectro de tipos de células hematopoyéticas e inmortalización de células mieloides. Han sido reportados niveles elevados de Mcl-1 para un número de cánceres humanos incluyendo cánceres de próstata, cánceres pancreáticos, melanomas, cánceres de mama, pacientes con cáncer de ovario, y cáncer cervical, así como leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) y en AML y ALL después de la recaída. En pacientes con B-CLL, los más altos niveles de Mcl-1 están fuertemente correlacionados con la falla para lograr la remisión completa después de la terapia con agente simple. En el mieloma múltiple, Mcl-1 juega un papel importante en la supervivencia de las células malignas. A este respecto, se ha demostrado que los ratones que expresan un transgen mcl-1 bajo el control de su propio promotor desarrollan neoplasias de células B con alta frecuencia, que van desde el linfoma folicular hasta el linfoma de células grandes difusas.

Respuestas restringidas a HLA-A3 contra Mcl-1 Para investigar si Mcl-1 es un objetivo natural para las células T en pacientes con cáncer, se examinó la secuencia de la proteína para los epitopos peptídicos nona- y decaméricos de HLA-A3 , más probables, utilizando los residuos de ancla específicos de HLA-A3 principales. Subsecuentemente, se sintetizaron seis péptidos deducidos de (Mcl-lass-194 (YLREQATGAK) (SEQ ID NO : 52), Mcl-l293-302 (SITDVLVRT ) (SEQ ID NO : 53, Mcl~l257-276 (LISFGAFVAK) (SEQ ID NO: 54), Mcl-l95-io3 (RLLFFAPTR) (SEQ ID NO : 55), cl-l30o-308 (RTKRDWLVK) (SEQ ID NO : 56), Mcl-1235.244 (DIK EDDVK) (SEQ ID NO: 57)) y se escrutaron PBL provenientes de pacientes con cáncer HLA-A3+ de diferente origen para la reactividad contra estos péptidos, tomando ventaja del ensayo ELISPOT. Este método ha mostrado previamente que es altamente eficiente para la identificación de CTL específico de tumor en pacientes con cáncer. Por supuesto, las respuestas de CTL fuertes y frecuentes fueron detectadas contra dos péptidos derivados de Mcl-1 en pacientes con cáncer de diferente origen (Mcl-l95-i03 y Mcl-l3oo-3os) (Figura 11) . En general, cinco de seis pacientes examinados con cáncer de mama HLA-A3+ alojaron una respuesta inmune contra uno de estos dos péptidos Mcl-1. De este modo, cinco pacientes con cáncer de mama alojaron una respuesta contra ??1~195-103 (los respondedores son definidos como el' número promedio de células específicas al antígeno ± 1/2 desviación estándar >25 x 105 células) , y tres pacientes alojaron una respuesta contra Mcl-l30o-3os (Figura 11) . Además, dos de dos pacientes examinados con cáncer pancreático HLA-A3+ alojaron una respuesta inmune contra el péptido Mcl-l95-io3, mientras que uno de éstos también reaccionó contra Mcl-l30o-308 · Además, se examinaron los PBL de seis pacientes que sufrieron de B-CLL y se identificó una respuesta contra Mcl-l95_i03 en dos de estos pacientes. Como un control, los PBL provenientes de diez individuos HLA-A3+ saludables fueron examinados. De manera importante, no fueron detectadas respuestas contra de Mcl-195_ io3 o el péptido Mcl-l30o-308 en ninguno de los donadores saludables (Figura 11) . Similarmente , no pudieron ser detectadas respuestas contra cualquiera de los cuatro peptidos derivados de Mcl-1 adicionales en ninguno de los pacientes con cáncer o los controles saludables (datos no mostrados) .

Respuestas restringidas en HLA-Al contra Mcl-1 Para investigar si Mcl-1 es un objetivo natural para las células T en pacientes con cáncer, se examinó la secuencia proteica para los epxtopos peptídicos nona- y deca-méricos de HLA-Al más probables, utilizando los residuos de ancla específicos de HLA-Al principales. Subsecuentemente, se sintetizaron cuatro peptidos deducidos de Mcl-1 (Mcl-li66_ 175 (PAEEEEDDLY) (SEQ ID NO: 58), Mcl-l12i-i29 (SPEEELDGY) (SEQ ID NO: 59), Mcl-l177-i85 (QSLEIISRY) (SEQ ID NO: 60), Mcl-l339-347 (AGVGAGLAY) (SEQ ID NO: 61)) y se escrutaron los PBL a partir de los pacientes con cáncer HLA-A1+ de diferente origen para la reactividad contra estos peptidos, tomando ventaja del ensayo ELISPSOT. Por supuesto, las respuestas de CTL fueron detectadas contra dos peptidos derivados de Mcl-1 en pacientes con cáncer de diferente origen (Mcl-la66-i75 y Mcl-I177-185) (Figura 12) . En general, tres de los cuatro pacientes con cáncer de mama HLA-A1+ examinados alojaron una respuesta inmune contra MCI-I177-185 y uno de éstos además alojó una respuesta contra Mcl-li66-i75 (Figura 12) . Adicionalmente, uno de siete pacientes con melanoma alojaron una respuesta inmune contra el pétido Mcl-li77-185 y otro más de éstos alojó una respuesta contra Mcl-li6s-i75 ¦ Como un control, fueron examinados los PBL provenientes de seis individuos HLA-A1+ saludables. De manera importante, no fueron detectadas respuestas contra ninguno de Mcl-l166-i75 o el péptido Mcl-l177-185 en cualquiera de los donadores saludables (Figura 12) .

Respuestas peptídicas modificadas La inmunogenicidad del cl-l30o-308 peptídico restringido a HLA-A3 fue incrementada por el reemplazo de la treonina en la posición 2 con un mejor residuo de ancla HLA-A3, a saber (Mcl-l30o-3os ( L RDWLVK) (SEQ ID NO: 62)). Las respuestas inmunes espontáneas fueron detectadas en dos pacientes con cáncer de mamá contra Mcl-l30o-308L2 (datos no mostrados) . De igual modo, para generar un epitopo más inmunogénico se modificó el Mcl-l166-ns peptídico restringido en HLA-A1 Mcl-li77-i85 (QSLEIISRY) (SEQ ID NO: 60) en la posición 3, generando los dos péptidos Mcl-li77-185D3 (QSDEIISRY) (SEQ ID NO: 63) y Mcl-li77-i85E3 (QSEEIISRY) (SEQ ID NO: 64) .

Discusión Casi todas las malignidades están caracterizadas por defectos en la señalización de la apoptosis. Esto hace a las células malignas resistentes a estímulos apoptóticos endógenos, así como estímulos exógenos tales como fármacos quimioterapéuticos y radiación. La apoptosis defectuosa en cánceres humanos es f ecuentemente el resultado de la sobreexpresion de proteínas antiapoptóticas en la familia de proteínas Bel-2, por ejemplo, Bcl-2, Bcl-XL y Mcl-1, Bcl-w, Bfl-lAl, Bcl-b y Bcl2-L-10. Utilizando tales inhibidores de las proteínas de la apoptosis para fines de vacunación, es ventajosos debido a la supbregulación o pérdida de expresión de estas proteínas ya que alguna forma de escape inmune podría deteriorar el crecimiento tumoral sostenido, ya que la supervivencia de las células tumorales requiere miembros funcionalmente activos de la familia Bcl-2. Para las estrategias terapéuticas, la dirección de los antígenos que juegan un papel significativo en relación al crecimiento de las células tumorales y la supervivencia de las mismas, la selección de tumores deficientes en el antígeno es una limitación bien reconocida. Además, ya que la expresión elevada de las proteínas de la familia Bcl-2 en las células está correlacionada con la resistencia a fármacos, la combinación de una inmunoterapia basada en la familia Bel-2 con quimioterapia citotóxica es una nueva manera muy excitante de tratar el cáncer. Se exploraron las proteínas Bcl-2, Bcl-X(L) y Mcl-1 para la presencia de las porciones de enlace a los péptidos y se utilizaron éstas para buscar las respuestas de células T especificas en pacientes con cáncer. Para este fin, la reactividad de las células T espontáneas fue detectada contra todos los miembros de la familia Bcl-2 en pacientes que sufren de tipos tumorales no relacionados, por ejemplo, cáncer pancreático, cáncer de mama, melanoma AML y CLL por medio de ELISPOT. La presencia de las células Bcl-XL CD8+ específicas en PBL provenientes de pacientes con cáncer, fue confirmada por las tinciones de FACS de CD8/pentámero . Tomadas conjuntamente, estos datos muestran que los epitopos definidos por CTL provenientes de estas proteínas, pueden ser altamente aplicables en vacunaciones terapéuticas contra el cáncer, y son por lo tanto de valor inmunoterapéutico sustancial . Además, once de los pacientes con cáncer de mama poseían CTL específicos de Bcl-2, ocho de estos pacientes fueron tratados previamente con al menos un tipo de quimioterapia. En dos pacientes (pacientes Nos. 14 y 17) no fueron detectables las respuestas de CTL para cuatro diferentes péptidos de Bcl-2. Ambos pacientes habían recibido previamente terapia anti-hormonal pero no quimioterapia. Similarmente, fuimos también capaces de detectar algunas respuestas en pacientes con cáncer de mama localizado primario, antes de la quimioterapia. De este modo, en pacientes con cáncer de mama las respuestas de Bcl-2 fueron únicamente detectadas en los pacientes quienes habían recibido quimioterapia. Aunque la carga tumoral puede jugar un papel importante, esto puede indicar que las respuestas inmunes son introducidas o incrementadas como una consecuencia del incremento inducido por el tratamiento de la expresión de Bcl-2. Esto señala hacia un escenario en el cual la combinación de la inmunoterapia basada en la familia Bcl-2 con la quimioterapia citotóxica puede en sinergia, mejorar las actuales tasas de respuesta. El estado del tratamiento de los pacientes examinados para las respuestas de Bcl-X(L) y Mcl-1 no fue disponible. En el presente estudio, se tomó ventaja del ensayo ELISPOT de GrB para demostrar que los CTL específicos de Bcl-2 y Bcl-X(L) en los pacientes, PBL son más bien células efectoras citotóxicas . Para probar adicionalmente esta noción, se enriquecieron las células T reactivas a Bcl-2 provenientes de PBL del paciente, y mostraron que la línea de células T resultante fue capaz de lisar las células T2 pulsadas con péptidos en un ensayo de liberación de 51Cr convencional. Además, esta línea de células T reactiva a Bel-2 fue capaz de matar una línea celular de cáncer de mama equiparada a HLA, mientras que las células objetivo negativas a HLA-A2 no fueron muertas. Estos hallazgos muestran que las células cancerosas más bien procesan y presentan el péptido Bel-2 en el contexto de la molécula HLA-A2. Finalmente, fuimos capaces de clonar estas células aisladas y se mostró que éstas reaccionaban de manera altamente específica contra el epitopo peptídico de Bcl-2. Cuando los péptidos derivados de los antígenos de diferenciación de melanocitos fueron primeramente utilizados para tratar los pacientes con melanoma de etapa IV se consideró que esto puede conducir a destrucción pronunciada de los melanocitos, lo cual a su vez podría manifestarse clínicamente, por ejemplo, como vitíligo o retinitis. No obstante, la experiencia clínica demostró que la incidencia del vitíligo en pacientes que reciben vacunaciones no fue significativamente más alta que la incidencia de la hipopigmentación asociada al melanoma en pacientes que reciben otras formas de terapia. Adicionalmente, no han sido reportados los efectos colaterales serios en diversas pruebas de vacunación contra, auto-antígenos . Los presentes datos, tomados conjuntamente prueban que las respuestas inmunes celulares contra el grupo de las proteínas de la familia Bcl-2 son una característica general en el cáncer. En un intento para elevar al máximo el impacto de la inmunoterapia, una estrategia excitante sería considerar el perfil de expresión y la significancia pronostica del objetivo elegido en la enfermedad particular, o la etapa de la enfermedad, que se trata. De este modo, mientras que la coexpresión de Bel-2, Mcl-1 y Bcl-XL es observada en algunos cánceres, o en una etapa particular de la enfermedad, otros cánceres muestran expresión excluyente de una o la otra proteína. De este modo, en algunas enfermedades como el cáncer de ovario, la expresión de Mcl-1, pero no de Bcl-2, está asociada con la etapa avanzada y la pobre supervivencia por cuya razón Mcl-1 puede ser el antígeno primario, mientras que en enfermedades tales como CLL, donde Bcl-2 y Mcl-1 son co-sobre-expresadas , la dirección al objetivo simultánea de ambas proteínas puede representar una estrategia más efectiva que la dirección a cualquier molécula sola. Similarmente , Tanaka et al. describieron que la presencia de otra proteína inhibidora de la apoptosis, la survivina en carcinoma de mama estuvo fuertemente asociada con la expresión de Bcl-2 y con el índice apoptótico reducido (AI) y pobre supervivencia general. Una asociación similar entre la survivina y Bcl-2 ha sido descrita en neuroblastoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, y linfoma no Hodgkin de alto grado. La seguridad y la eficacia potencial de los péptidos derivados de survivina en vacunaciones terapéuticas contra el cáncer, está siendo actualmente investigada en pruebas clínicas de fase I/II (J. Becker, comunicación personal) . De este, una estrategia inmunoterapéutica excitante podría ser dirigir la familia de proteínas Bcl-2 y la survivina, especialmente ya que éstas ejecutan su función anti-apoptótica a través de diferentes vías celulares .

Ejemplo 5 Vacuna peptídica Los péptidos de la familia de proteínas Bcl-2 pueden ser por ejemplo sintetizados en la instalación del núcleo biomolecular UVA (UVA Biomolecular Core Facility) con un extremo NH2 de amida libre y el extremo COOH de ácido libre. Cada uno es proporcionado como un péptido liofilizado, el cual es luego reconstituido en agua estéril y diluido con solución de Ringer Lactatada (LR, Baxter Healthcare, Deerfield, IL) como un amortiguador para una concentración final de 67 a 80% de Ringer Lactatado en agua. Estas soluciones son luego esterilizadas por filtración, colocadas en frascos de vidrio de borosilicato, y sometidas a una serie de estudios de aseguramiento de calidad que incluyen la confirmación de la identidad, la esterilidad, la seguridad general, y la pureza, de acuerdo con los lineamientos de FDA, como se define en IND 6453. Las pruebas de la estabilidad de los péptidos no demostraron disminución en la pureza o en la concentración del péptido, cuando estas soluciones peptídicas fueron almacenadas a -20°C por 3 años. En circunstancias prácticas, los pacientes recibirán una vacuna que comprende aproximadamente 100 µg de un péptido restringido a HLA de la Clase I con o sin un péptido cooperador restringido HLA de la Clase II. Los pacientes son vacunados por ejemplo con aproximadamente 100 µg del péptido HLA de la Clase I en adyuvante solo, o son vacunados por ejemplo con aproximadamente 100 µg del péptido restringido HLA de la Clase I más 190 g del péptido cooperador restringido a la Clase II. La dosis más alta del péptido cooperador es calculada para proporcionar cantidades equimolares de los epitopos cooperador y citotóxico. Además, los pacientes pueden ser vacunados con un péptido más largo que comprende las secuencias de aminoácidos de ambos péptidos . Los péptidos anteriores, en solución acuosa de 1 mi, pueden ser administrados ya sea como una solución/suspensión con aproximadamente 100 µg de QS-21, o como una emulsión con aproximadamente 1 mi de adyuvante Montanide ISA-51. Los pacientes son inmunizados por ejemplo en el día 0 y los meses 1, 2, 3, 6, 9 y 12, con los péptidos más adyuvante, para un total de siete inmunizaciones. Con excepciones raras, las vacunaciones son administradas al mismo brazo con cada vacuna. Los péptidos son preferentemente administrados subcutáneamente.

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Claims

REIVINDICACIONES Habiéndose descrito la invención como antecede, se reclama como propiedad lo contenido en las siguientes reivindicaciones : 1. Una composición de vacuna, caracterizada porque comprende una proteína aislada que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico inmunogénicamente activo de las mismas o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína o el fragmento peptídico, para el uso como un medicamento. 2. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición de vacuna cuando es administrada a un paciente con cáncer, es capaz de promover una respuesta inmune contra la enfermedad cancerosa . 3. La composición de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque la composición de vacuna, cuando es administrada a un paciente con cáncer donde es expresado un miembro de la familia de proteínas Bcl-2, es capaz de promover una respuesta inmune contra la enfermedad cancerosa . 4. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porgue la proteína se selecciona del grupo que consiste de los miembros anti-apoptóticos de la familia Bcl-2. 5. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de Bcl-2, Bcl-w, Mcl-1, Bfl-l/Al, Bcl-b, Bcl2-L-10 y Bcl-XL. 6. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de Bax, Bok/Mtd, Bad, Bik/Nbk, Bid, Hrk/DP5, Bim, Noxa, Bmf y PUMA/bbc3. 7. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteína es Bcl-2. 8. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteína es Bcl-XL. 9. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 5, caracterizada porque la proteína es Mcl-1. 10. Un fragmento peptídico inmunogénicamente activo, aislado, caracterizado porque es derivado de una proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 para el uso como un medicamento en la prevención o tratamiento de un cáncer. 11. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de Bcl-2, Bcl-w, Mcl-1, Bfl-l/Al, Bcl-b, Bcl2-L-10 y Bcl-XL. 12. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 10, caracterizado porque la proteína se selecciona del grupo que consiste de Bax, Bok/Mtd, Bad, Bik/Nbk, Bid, Hrk/DP5, Bim, Noxa, Bmf y PUMA/bbc3. 13. El f agmento peptídico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína es Bcl-2. 14. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína es Bcl-XL. 15. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 11, caracterizado porque la proteína es Mcl-1. 16. El fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 15, caracterizado porque es capaz de promover una respuesta inmune celular en un paciente con cáncer. 17. El fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 16, caracterizado porque es un péptido restringido a MHC de la Clase I que tiene al menos una de las siguientes características: (i) capaz de enlazarse a la molécula HLA de la Clase I a la cual está restringida a una afinidad como se mide por la cantidad del péptido que es capaz de realizar la recuperación media máxima de la molécula HLA de la Clase I (valor de C50) que es a lo más 50 µ?, como se determinó por el ensayo de enlace de montaje como se describe en la presente. (ii) capaz de promover células productoras de IFN-? en una población de PBL de un paciente con cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBLs como es determinado por un ensayo ELISPOT, y/o (iii) capaz de realizar la detección in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido epitopo. 18. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque tiene un valor de C50 que es a lo más de 30 µp?. 19. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque tiene un valor de C50 que es a lo más de 20 µtt?. 20. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque está restringido por una molécula HLA-A de la Clase I de MHC. 21. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 20, caracterizado porque está restringido por una especie de HLA de la Clase I de MHC seleccionada del grupo que consiste de HLA-Al , HLA-A2 , HLA-A3 , HLA-Al1 y HLA-A24. 22. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque está restringido por el HLA-A2. 23. El fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 y 16 a 19, caracterizado porgue comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de ALVGACITL (SEQ ID NO: 1), ALSPVPPW (SEQ ID NO: 2), SLALVGACI (SEQ ID NO : 3), KTLLSLALV (SEQ ID NO: 4), LLSLALVGA (SEQ ID NO: 5), WLSLKTLLSL (SEQ ID NO: 6), AAAGPALSPV (SEQ ID NO: 7), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO: 8) FTARGRFATV (SEQ ID NO: 9), YLNRHLHT I (SEQ ID NO: 10), NI LWMTEYL (SEQ ID NO: 11) . 24. El fragmento peptidico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 y 16 a 19, caracterizado porque el péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de TAYQSFEQV (SEQ ID NO: 43), YLNDHLEPWI (SEQ ID NO: 42), RIAA MATYL (SEQ ID NO: 45), WMATYLNDHL (SEQ ID NO: 46), VLVSRIAAWM (SEQ ID NO : 48) y VAFFSFGGAL (SEQ ID NO: 49) . 25. El fragmento peptidico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 y 16 a 19, caracterizado porque el péptido comprende la secuencia RIAAWMATY (SEQ ID NO: 50) . 26. El fragmento peptidico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 y 16 a 19, caracterizado porque el péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de RLLFFAPTR (SEQ ID NO: 55) y RTKRDWLVK (SEQ ID NO: 56) . 27. El fragmento peptidico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 y 16 a 19, caracterizado porque el péptido comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste de PAEEEEDDLY (SEQ ID NO: 58) y QSLEIISRY (SEQ ID NO: 60) . 28. El fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 11 y 16 a 19, caracterizado porque el péptido. se selecciona del grupo que consiste de RLKRDWLVK (SEQ ID NO: 62), QSDEIISRY (SEQ ID NO: 63) y QSEEIISRY (SEQ ID NO : 64) . 29. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 17, caracterizado porque está restringido por una molécula HLA-B de la Clase I de MHC. 30. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 29, caracterizado porque está restringido por una especie de HLA-B de la Clase I de MHC seleccionada del grupo que consiste de HLA-B7, HLA-B35, HLA-B 4 , HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 y HLA-B51. 31. El fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 30, caracterizado porque comprende a lo más 20 residuos de aminoácidos. 32. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 31, caracterizado porque comprende a lo más 15 residuos de aminoácidos . 33. El fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 32, caracterizado porque es un nonapéptido o un decapéptido. 34. La proteína o el fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 33, caracterizada porque es una secuencia nativa aislada o derivada de una especie de mamífero. 35. La proteína o fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 34, caracterizada porque la proteína es una proteína humana. 36. La proteína o fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 36, caracterizada porque es derivado de una secuencia de un miembro de la familia de proteínas Bel-2 mediante sustitución, supresión o adición en al menos un residuo de aminoácido . 37. El fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 36, caracterizado porque comprende, para cada alelo de HLA específico, cualquiera de los residuos de aminoácidos como se indican en la siguiente tabla: Alelo de Posición Posición Posición Posición Posición Posición C-HLA 1 2 3 5 6 7 terminal HLA-Al T,S D,E L Y HLA-A2 L,M V L,V HLA-A3 L,V,M F,Y K,Y,F HLA- V,I,F,Y M,L,F,Y, K,R Al 1 I HLA-23 I,Y W,I HLA- Y i,v F I,L,F A24 HLA- ?,?,? W A25 HLA- E,D V,T,I,L,F I,L,V Y,F A26 HLA- E,D V,A,L A,R A28 HLA- E Y,L A29 HLA- Y,L,F,V Y A30 HLA- L,M,F,Y R A31 HLA- I,L W A32 HLA- Y,I,L,V R A33 HLA- V,L R A34 HLA- E,D T,V R,K A66 HLA- E,D T,V R3K A68 HLA- V,T,A V,L A69 HLA- T V,L A74 HLA-B5 A,P F,Y I,L HLA-B7 R,A P L5F HLA-B8 K K,R L HLA- R,K L,V B14 HLA- Q,L3K,P, F,Y,W B15 ?,?,?,?, (B62) ST HLA- B17 HLA- Y,K,F,L B27 HLA- I,L,M,Y B35 HLA- D,E I,L,M B37 HLA- H D,E F,L B38 HLA- R,H L,F B39 HLA- F,I,V L,V,A,W, B40 M,T,R (B60,61) HLA- L,P Y,L B42 HLA- F,Y5W B44 HLA-46 M,I,L5V Y,F HLA-48 Q,K L HLA- A,P,G F,YJ,V B51 HLA- F,Y I,V B52 HLA- ,F,L B53 HLA- B54 HLA- A,V B55 HLA- A,V B56 HLA- A,T,S F,W,Y B57 HLA- A,T,S F,W,Y B58 HLA- L B67 HLA- R B73 HLA- A,L Cwl HLA- A,L F,Y Cw2 HLA- A,L Cw3 HLA- Y,P,F L,M,F,Y Cw4 HLA- L,I,F,Y Cw6 HLA- Y L,I Cw8 HLA- A,L L,V Cwl6 38. El fragmento peptidico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 37, caracterizado porque es capaz de promover células promotoras de INF-? en una población de PBL de un paciente con cáncer a una frecuencia de al menos 10 por 104 PBLs. 39. el fragmento peptidico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 38, caracterizado porque es capaz de promover células promotoras de INF-? en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa, donde es expresada una proteina que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2. 40. El fragmento peptidico de conformidad con la reivindicación 39, caracterizado porque la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste de malignidad hematopoyética que incluye leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cerviz, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colón, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. 41. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque comprende el fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 40. 42. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 41, caracterizada porque comprende un fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 18, en combinación con un fragmento peptídico de conformidad con la reivindicación 29. 43. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 41 a 42, caracterizada porque la vacuna promueve la producción, en un paciente vacunado, de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas. 4 . La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 41 a 43, caracterizada además porque comprende una proteína inmunogénica o un fragmento peptídico seleccionado de una proteína o fragmento peptídico que no pertenece a o que no es derivado de la familia de proteínas Bcl-2. 45. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la proteína o el fragmento peptídico que no pertenece a o no es derivado de la familia de proteínas Bcl-2, es una proteína involucrada en la regulación de la apoptosis celular o un fragmento peptídico derivado de ésta. 46. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la proteína inmunogénica o el fragmento peptídico seleccionado de una proteína o fragmento peptídico que no pertenece a o no es derivado de la familia de proteínas Bcl-2, es la survivina o un frágmento peptídico de la misma. 47. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 44, caracterizada porque la proteína inmunogénica o el fragmento peptídico seleccionado de una proteína o fragmento peptídico que no pertenece a o no es derivado de la familia de proteínas Bcl-2, es ML-IAP o un fragmento peptídico de la misma. 48. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 41 a 47, caracterizada porque la composición comprende un adyuvante. 49. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 48, caracterizada porque el adyuvante se selecciona del grupo que consiste de adyuvantes basados en ADN bacteriano, adyuvantes basados en aceite/surfactante, adyuvantes basados en dsARN viral e imidazoquinilinas . 50. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 41 a 49, caracterizada porque la composición de vacuna comprende las células presentadoras de antígeno que comprenden la proteína o el fragmento peptldico o el ácido nucleico. 51. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 50, caracterizada porque la célula presentadora de antigeno es una célula dendrítica. 52. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 41 a 51, caracterizada porque la composición comprende un liposoma. .53. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 1, caracterizada porque el ácido nucleico codifica para el p ptido de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 40. 54. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de. las reivindicaciones 1 a 53, caracterizada porque el ácido nucleico está comprendido dentro de un vector. 55. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 54, caracterizada porque el vector se selecciona del grupo que consiste de vectores virales y vectores bacterianos . 56. La composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 54 a 55, caracterizada porque el vector comprende además ácidos nucleicos que codifican para un polipéptido estimulador de células T. 57. La composición de vacuna de conformidad con la reivindicación 56, caracterizada porque el polipéptido estimulador de células T se selecciona del grupo que consiste de B7.1, ICAM-1 y LFA-3." 58. Un equipo de partes, caracterizado porque comprende la composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 41 a 57, y un agente anti-canceroso adicional. 59. El equipo de partes de conformidad con la reivindicación 58, caracterizado porque el agente anticanceroso es un anticuerpo. 60. El equipo de partes de conformidad con la reivindicación 59, caracterizado porque el agente anticanceroso es una citocina. 61. Una composición para el diagnóstico ex vivo o in sítu de la presencia, en un paciente con cáncer, de células T en PBL o en tejido tumoral, que son reactivos con el miembro de la familia de proteínas Bel-2, la composición está caracterizada porque comprende un fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 40. 62. Un equipo de diagnóstico para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia, en un paciente con cáncer, de células T en PBL o en tejido tumoral, que son reactivos con el miembro de la familia de proteínas Bcl-2, el equipo está caracterizado porque comprende un fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 40. 63. Un complejo caracterizado porque es de un fragmento peptldico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 40, y una molécula HLA de la Clase I o un fragmento de tal molécula. 64. El complejo de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque es monomérico. 65. El complejo de conformidad con la reivindicación 63, caracterizado porque es multimérico. 66. Un método para detectar en un paciente con cáncer la presencia de células T reactivas a algún miembro de la familia de proteínas Bcl-2, el método está caracterizado porque comprende poner en contacto un tejido tumoral o una muestra de sangre con un complejo de conformidad con la reivindicación 63 y detectar el enlace del complejo al tejido o a las células sanguíneas . 67. Una molécula, caracterizada porque es capaz de enlazarse específicamente a un fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 40. 68. La molécula de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque es un anticuerpo o un fragmento del mismo. 69. La molécula de conformidad con la reivindicación 67, caracterizada porque la molécula es un receptor de células T. 70. Una molécula, caracterizada porque que es capaz de bloquear el enlace de la molécula de conformidad con la reivindicación 67 o 69. 71. Un método para tratar una enfermedad cancerosa, el método está caracterizado porque comprende administrarle a un paciente que sufre de la enfermedad, una cantidad efectiva de la composición de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 41 a 57, la molécula de conformidad con la reivindicación 67, o la molécula de conformidad con la reivindicación 70, o el equipo de partes de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 58 a 60. 72. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la enfermedad que va a ser tratada es una enfermedad cancerosa donde es expresado un miembro de la familia de proteínas Bcl-2. 73. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste de malignidad hematopoyética que incluye leucemia linfática crónica, leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cerviz, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colón, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. 74. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque es combinado con un tratamiento adicional para el cáncer. 75. El método de conformidad con la reivindicación 71, caracterizado porque el tratamiento adicional se selecciona del grupo que consiste de quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimuladoras, terapia génica, tratamiento con anticuerpos y tratamiento utilizando células dendríticas. 76. El uso del fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 10 a 40 o la composición de vacuna de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 y 41 a 57, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o prevención de una enfermedad cancerosa. 77. El uso de conformidad con la reivindicación 76, en donde la enfermedad que va a ser tratada es una enfermedad cancerosa donde es expresado un miembro de la familia de proteínas Bcl-2. 78. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 76-77, en donde la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste de una malignidad hematopoyética que incluye leucemia linfática crónica, leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cerviz, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colón, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. 79. El uso de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones 76-78, el cual se combina con un tratamiento adicional para el cáncer. 80. El uso de conformidad con la reivindicación 79, en donde el tratamiento adicional se selecciona del grupo que consiste de quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimuladoras, terapia génica, tratamiento con anticuerpos y tratamiento utilizando células dendríticas . 81. Un método para monitorizar la inmunización, caracterizado el método porque comprende los pasos de: i) proporcionar una muestra de sangre de un individuo ii) proporcionar una proteína que pertenece a la familia de proteínas Bel-2 o un fragmento peptídico de las mismas iii) determinar si la muestra de sangre comprende anticuerpos o células T que comprende receptores de células T que se enlazan específicamente a la proteína o al péptido iv) con lo cual se determina si una respuesta inmune para dicha proteína o péptido ha sido producida o no en el individuo. 82. El método de conformidad con la reivindicación 81, caracterizado porque el fragmento peptídico es un fragmento peptídico de conformidad con cualquiera de las reivindicaciones . 83. Una célula T aislada caracterizada porque comprende un receptor de células T de conformidad con la reivindicación 69.