ES2317379T3 - Peptidos asociados a tumor unidos a moleculas mhc. - Google Patents
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Abstract
Un péptido asociado a tumor con la secuencia de aminoácidos SVASTITGV (SEQ ID n.º 2), en donde el péptido tiene la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I.
Description
Péptidos asociados a tumor unidos a moléculas
MHC.
La presente invención se refiere a péptidos
asociados a tumor con la capacidad de unirse a una molécula del
complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase I.
Los péptidos de este tipo son utilizados, por
ejemplo, en la inmunoterapia de las enfermedades tumorales.
La identificación de antígenos asociados a
tumores (TAA) mediante componentes del sistema inmune desempeña un
papel fundamental en la destrucción de células tumorales por parte
del sistema inmune. Este mecanismo se basa en la condición de que
entre las células tumorales y las células normales existen
diferencias cualitativas o cuantitativas. Para desencadenar una
respuesta antitumoral, las células tumorales deben expresar a los
antígenos, lo cual provoca una respuesta inmunológica suficiente
para la destrucción del tumor.
Los linfocitos T citotóxicos que expresan la
molécula CD8 (en adelante, CTL) tienen un papel importante en el
rechazo a tumores. Para que se desencadene una reacción inmune de
este tipo a través de los linfocitos T citotóxicos, deben
presentarse proteínas o péptidos foráneos ante los linfocitos T. Los
linfocitos T sólo reconocen a los antígenos como fragmentos de
péptidos cuando éstos son presentados por moléculas MHC en la
superficie de la célula. Estas moléculas MHC (Major
Histocompatibility Complex) son receptoras de péptidos que,
normalmente, los unen dentro de la célula para transportarlos a la
superficie de la célula. Este complejo formado por péptidos y
moléculas MHC es reconocido por los linfocitos T. Las moléculas MHC
del ser humano también se conocen como "antígenos de leucocito
humano" (HLA).
Existen dos clases de moléculas MHC: Las
moléculas MHC de clase I, que aparecen en la mayoría de células con
núcleo, presentan péptidos producidos por degradación proteolítica
de proteínas endógenas. Las moléculas MHC de clase II sólo aparecen
en células especializadas presentadoras de antígenos (APC) y
presentan péptidos de proteínas exógenas que, en el transcurso de
la endocitosis, son absorbidos y transformados por las APC. Los
complejos formados por péptido y MHC de clase I son reconocidos por
linfocitos T CD8^{+} citotóxicos; los complejos formados por
péptido y MHC de clase II son reconocidos por linfocitos T
colaboradores CD4.
Para que un péptido pueda desencadenar una
respuesta celular inmune, debe estar unido a una molécula MHC. Este
proceso depende del alelo de la molécula MHC y de la secuencia de
aminoácidos del péptido. Los péptidos unidos a moléculas MHC de
clase I suelen tener de 8 a 10 residuos y contienen en su secuencia
dos residuos conservados (Anchor), que interactúan con el
surco de unión correspondiente de la molécula MHC.
Para que el sistema inmune pueda desencadenar
una respuesta efectiva de CTL contra los péptidos derivados de
tumor, es necesario que dichos péptidos, además de poder unirse a
las moléculas MHC de clase I expresadas por las células tumorales,
también sean reconocidos por linfocitos T con receptores específicos
de linfocitos T (TCR, T-cell receptor).
El objetivo principal para el desarrollo de una
vacuna antitumoral es la identificación y caracterización de
antígenos asociados a tumores que son reconocidos por CTL
CD8^{+}.
Los antígenos que son reconocidos por linfocitos
T citotóxicos específicos de tumores o sus epítopos pueden ser
moléculas de cualquier clase de proteína como, por ejemplo, encimas,
receptores, factores de transcripción, etc. Otra clase importante
de antígenos asociados a tumores son las estructuras específicas de
tejidos como, por ejemplo, los antígenos CT (cancer testis),
expresados en distintos tipos de tumor y en tejido sano de los
testículos.
Para que las proteínas sean reconocidas por los
linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos de tumores y,
por lo tanto, puedan ser aplicadas como tratamiento, deben cumplirse
determinadas condiciones: el antígeno debe estar expresado
fundamentalmente por células tumorales, no por tejido normal o, si
éste lo expresa, debe ser en cantidades inferiores a las de los
tumores. En caso de que el antígeno en cuestión no sólo se exprese
en un tipo de tumor, sino en varios, también es deseable que lo haga
en concentraciones altas. También es esencial la presencia de
epítopos en la secuencia de aminoácidos del antígeno, ya que dichos
péptidos derivados de un antígeno asociado a un tumor ("péptidos
inmunógenos") desencadenan una respuesta de linfocitos T, ya sea
in vitro o in vivo.
Los antígenos asociados a tumores (TAA)
representan, por tanto, el punto de partida para el desarrollo de
una vacuna antitumoral. Los métodos para la identificación y
caracterización de los TAA se basan en la acción de los CTL ya
inducidos en el paciente o en la creación de perfiles de
transcripción diferenciados entre tumores y tejidos normales.
El hallazgo de genes sobreexpresados en tejidos
tumorales o expresados de manera selectiva en dichos tejidos no
proporciona, sin embargo, información precisa sobre la acción de los
antígenos transcritos por estos genes en la inmunoterapia. La causa
de ello es que sólo los péptidos aislados de estos antígenos son
aptos para una acción de ese tipo, ya que sólo los epítopos de los
antígenos -no todo el antígeno- son capaces de provocar una
respuesta de linfocitos T mediante la presentación de MHC. Por eso
es importante seleccionar péptidos de proteínas sobreexpresadas o
expresadas de manera selectiva, presentados con moléculas MHC y así
obtener blancos para el reconocimiento específico de tumores
mediante linfocitos T citotóxicos.
Ante estos antecedentes, el objetivo de la
presente invención es facilitar al menos una nueva secuencia de
aminoácidos para un péptido con la capacidad de unirse a una
molécula de complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de
clase I.
Este objetivo se alcanza conforme a la presente
invención mediante la preparación de un péptido asociado a tumor
con una secuencia de aminoácidos que es seleccionada del grupo
compuesto por las secuencias SEQ ID n.º 1 hasta SEQ ID n.º 79 en el
protocolo de secuencias adjunto, en donde el péptido muestra la
capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) humano de clase I.
De esta forma, se alcanza el objetivo que sirve
de base para la presente invención.
Con ello se entiende que los péptidos
identificados por el tumor son sintetizados para obtener mayores
cantidades y para su aplicación para los fines descritos más abajo
o transportados en células para su expresión.
Los inventores pudieron aislar e identificar los
péptidos mencionados como ligandos específicos de moléculas MHC de
clase I a partir de tejido tumoral. Se denominan péptidos
"asociados a tumores" a aquellos aislados e identificados a
partir de material tumoral. Estos péptidos, que son presentados en
tumores auténticos (primarios) están sujetos al procesamiento de
antígenos en una célula tumoral.
Los ligandos específicos se pueden aplicar en la
terapia contra el cáncer; por ejemplo para inducir una respuesta
inmune contra células tumorales que expresan los antígenos de los
que proceden los péptidos.
Dicha respuesta inmune en forma de una inducción
de CTL se puede obtener in vivo. Para ello, se administra el
péptido por ejemplo en forma de composición farmacéutica a un
paciente con una enfermedad tumoral asociada a TAA.
Por otro lado, también se puede desencadenar una
respuesta CTL ex vivo en un tumor que expresa los antígenos
de los que proceden los péptidos. Para ello se incuban las células
precursoras de CTL junto con células presentadoras de antígenos y
los péptidos. Finalmente, se cultivan los CTL así estimulados y se
administran al paciente estos CTL activados.
También existe la posibilidad de cargar ex
vivo las APC con los péptidos y administrar al paciente estas
APC cargadas. El antígeno se expresa en el tejido tumoral del que
procede el péptido. Las APC pueden entonces presentar a los CTL el
péptido y activarlos.
Los péptidos conformes a la invención también se
pueden aplicar como reactivos diagnósticos.
De esta forma, con los péptidos se puede saber
si en una población de CTL existen CTL dirigidos específicamente
contra un péptido o si fueron inducidos por terapia.
Además, con los péptidos también se puede
comprobar el aumento de linfocitos T precursores que muestran una
reactividad contra el péptido definido.
Además, el péptido puede ser utilizado como
marcador para seguir el desarrollo de un tumor que expresa el
antígeno des que procede el péptido.
En la tabla 1 adjunta se presentan los péptidos
identificados. Aparecen clasificados según el tipo de HLA al que se
unen. En la tabla también se dan las proteínas de las que proviene
el péptido y la posición correspondiente del péptido en la
proteína. Se mantienen los nombres en inglés de las proteínas, con
el fin de evitar traducciones confusas. También se dan los números
de registro de la base de datos Genbank del National Center for
Biotechnology Information del Instituto Nacional de Salud
(véase http:\\www.ncbi.nlm.nih.gov).
Los inventores pudieron aislar los péptidos (o
ligandos) de tumores de células renales de dos pacientes, RCC01 y
RCC13. Se aislaron 68 ligandos del tejido tumoral del paciente RCC01
y 13 ligandos del tejido tumoral del paciente RCC13. Dos de los
ligandos identificados en ambos pacientes eran idénticos. Éstos eran
los péptidos con SEQ ID n.º 1 y 3 (YVDPVITSI del
proto-oncogén met [C-Met] y
ALLNIKVKL de la queratina 18).
Se identificaron 79 ligandos a partir de los
tumores de los pacientes, de los cuales 30 estaban unidos a los
subtipos de HLA HLA-A*02, 13 a los subtipos
HLA-A*68, 34 a los subtipos HLA-B*18
o HLA-B*44 y 2 a los subtipos HLA*24
Todos los ligandos HLA-A*02
presentan el motivo peptídico específico del alelo: (Leucina/valina,
isoleucina, alanina o metionina en la posición 2; leucina/valina,
isoleucina o alanina en el C-terminal.
Algunos de los ligandos provienen de genes de
mantenimiento fuertemente expresados, que en la mayoría de los
tejidos son expresados de forma regular, aunque muchos se distinguen
por su asociación a tumores.
\newpage
En el caso del péptido con ID de secuencia n.º
YVDPVITSI, se trata, por ejemplo, de un ligando relacionado
especialmente con tumores y que procede del
proto-oncogén met (c-met) (posición
654-662). Los péptidos con ID de secuencia n.º 2,
22 y 23 proceden de la adipofilina (también llamada "proteína
relacionada con la diferenciación adiposa") y presentan las
posiciones 129-137, 62-71 y
349-358 en esta proteína, en la que las dos últimas
figuran entre los péptidos presentados por HLA-A*68.
En el caso del ligando con ID de secuencia n.º 3, se trata de un
ligando que procede de la queratina 18 y allí se encuentra
localizado en la posición 365-373.
La mayor parte de los ligandos presentan el
aminoácido ácido glutamínico (E) en la posición 2, un residuo
conservado-aminoácido del subtipo
HLA-B*44. Así se pudieron identificar péptidos
procedentes de proteínas que ya en anteriores intentos se
identificaron como inmunógenos como, por ejemplo, el péptido con ID
de secuencia n.º 5, que procede de la proteína anexina II (posición
en la anexina II: 55-63). Esta proteína se presenta
como inmunógena con respecto a las moléculas MHC de clase II en
pacientes con melanoma (véase Heinzel y col,. The self peptide
annexin II [208 - 223] presented by dendritic cells
sentisizes autologous CD4+ T lymphocytes to recognize melanoma
cells, 2001, "Cancer Immunol. Immunother."
49:671-678).
Además, se pudieron identificar algunos péptidos
procedentes de proteínas, sobreexpresadas en tejido tumoral. Así,
se pudieron identificar fragmentos de Vimentina (EEIAFLKKL, posición
229-237) y Caldesmon (DEAAFLERL, posición
92-100). Young y col. (Expression profiling of
renal epithelial neoplasms: a method for tumor
classification and discovery of diagnostic molecular markers,
2001, "Am. J. Pathol.", 158:1639-1651) que
estas proteínas estaban sobreexpresadas en tejidos de células
tumorales renales.
Los inventores pudieron además identificar,
entre otros, ligandos procedentes de ets-1
(NEFSLKGVDF, posición 86-95),
Alfa-Catenina (NEQDLGIQY, posición
169-177) y Galectina 2 (SEVKFTVTF, posición
80-88).
Además, los inventores aislaron el fragmento
YYMIGEQKF (ID de secuencia n.º 79), procedente de la enzima
Nicotinamida-N-Metiltransferasa
(posición 203-211). Takahashi y col. (Gene
expression profiling of clear cell renal cell carcinoma: gene
identification and prognostic classification, 2001, "Proc.
Natl. Acad. Sci." EUA, 98:9754-9749) demostraron
que esta enzima se encontraba sobreexpresada en el tejido tumoral de
las células renales.
De forma sorprendente, los inventores pudieron
mostrar, para uno de los péptidos identificados, linfocitos T
citotóxicos específicos en sangre de donantes. De esta forma se da
el potencial para desencadenar una respuesta de CTL específica
contra los tumores.
Además, los inventores pudieron mostrar con
experimentos propios que, mediante la utilización de dos péptidos
modelo seleccionados, era posible generar in vitro linfocitos
T citotóxicos específicos para el péptido con SEQ ID n.º 1
(fragmento del
proto-oncogén-c-met
o del péptido c-met) o específicos para el péptido
con SEQ ID n.º 2 (fragmento de adipofilina o péptido de
adipofilina). Con estos CTL se pudieron destruir células tumorales
diana, las cuales expresaban las proteínas correspondientes y,
además, provenían de distintas líneas celulares tumorales de
diferentes pacientes. Los inventores pudieron demostrar, además, que
los mencionados CTL también lisaron, por ejemplo, células
dendríticas previamente sensibilizadas (cargadas) con los
correspondientes péptidos. Con estos experimentos, los inventores
demostraron que, con los péptidos conforme a la presente invención
como epítopos, linfocitos T humanos pudieron ser activados in
vitro. Por lo tanto, los inventores demostraron que los CTL
obtenidos de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) de un
paciente y específicos para un péptido determinado, pudieron
destruir células del mismo tipo de tumor de otro paciente.
Los inventores también demostraron que con estos CTL se pudieron
lisar células de otros tipos de tumor.
En una forma de realización preferida, los
péptidos también se pueden aplicar para la estimulación de una
respuesta inmune, presentando los ID de secuencia n.º 1 a n.º 79 y
en los que al menos un aminoácido es sustituido por otro aminoácido
con propiedades químicas parecidas.
Estos son, con referencia a los correspondientes
subtipos de MHC, por ejemplo los aminoácidos de anclaje, que pueden
ser sustituidos por aminoácidos con propiedades químicas parecidas.
De esta forma, se puede intercambiar, en el caso de péptidos
asociados al subtipo MHC HLA-A*02, por ejemplo en la
posición 2 la leucina por la isoleucina, la valina o la metionina,
y viceversa; y, en el C-terminal, la leucina por la
valina, la isoleucina y la alanina, que presentan cadenas laterales
no polares.
También es posible utilizar péptidos con ID de
secuencia n.º 1 a n.º 79, que presentan, al menos, otro aminoácido
en N- y/o C-terminal o en los que se ha borrado, al
menos, un aminoácido.
Además, pueden utilizarse péptidos con ID de
secuencia n.º 1 a n.º 79, en los que al menos un aminoácido se ha
modificado químicamente.
El/los aminoácido(s) cambiante(s)
se escoge(n) de tal forma que la variación no influye en la
inmunogenicidad del péptido, es decir, que presenta una afinidad de
unión a la molécula MHC similar y capacidad de estimulación de los
linfocitos T.
Conforme a la presente invención, el péptido
puede ser utilizado para el tratamiento de enfermedades tumorales
y/o enfermedades adenomatosas.
Entre las enfermedades tumorales que se pueden
tratar se encuentran los cánceres de riñón, mama, páncreas,
estómago, testículo y piel. La enumeración de enfermedades tumorales
es sólo un ejemplo, es decir, no limita el campo de aplicación.
Los inventores pudieron demostrar mediante
experimentos propios que los péptidos conforme a la invención son
adecuados para dicha utilización. Se demostró que CTL generados
expresamente, específicos para determinados péptidos, pudieron
destruir de forma efectiva y selectiva células tumorales.
Para la aplicación de antígenos asociados a
tumores en una vacuna tumoral, son posibles varias formas de
aplicación. De esta forma, Tighe y col., (1998, Gene
vaccination: plasmid DNA is more than just a blueprint,
"Immunol. Today" 19(2):89-97)
describían que el antígeno puede ser administrado como proteína
recombinante con los adyuvantes o los vehículos apropiados o como
ADNc codificante para el antígeno en vectores plasmídicos. En estos
casos, el antígeno debe ser empleado y presentado en el cuerpo del
paciente por células presentadoras de antígenos (APC), con el fin
de que se desencadene una respuesta inmune.
Melief y col. (1996,
Peptide-based cancer vaccines, "Curr. Opin.
Immunol." 8:651-657) muestran otra posibilidad:
la utilización de péptidos sintéticos como vacuna.
En una forma de realización preferida, el
péptido se aplica con adyuvantes o en su forma aislada.
Se puede utilizar como adyuvante, por ejemplo,
el factor estimulante de colonias
granulocito-macrófago (GM-CSF).
Otros ejemplos de adyuvantes son el hidróxido de
aluminio o emulsiones de aceites minerales como, por ejemplo, el
adyuvante de Freund, la saponina o los compuestos de silicio.
La utilización de adyuvantes ofrece la ventaja
de que la respuesta inmune desencadenada por el péptido se puede
reforzar y/o que el péptido se estabiliza.
En otra forma de realización, el péptido se
aplica unido a una célula presentadora de antígeno.
Esta medida presenta la ventaja de que los
péptidos pueden ser presentados al sistema inmune, especialmente a
los linfocitos T citotóxicos (CTL). De esta forma, los CTL pueden
reconocer a las células tumorales y destruirlas selectivamente.
Como células presentadoras de antígenos son apropiadas para dicha
aplicación, por ejemplo, las células dendríticas, los monocitos o
los linfocitos B.
Las células se cargan con los péptidos ex
vivo, por ejemplo. Por otro lado, también existe la posibilidad
de transfectar las células con el ADN codificante de los péptidos o
el ARN correspondiente para llevar a la expresión de los péptidos
en las células.
Los inventores pudieron mostrar en experimentos
propios que es posible cargar células dendríticas (DC) con péptidos
específicos y que estas células dendríticas cargadas activan CTL
específicas de péptidos. Esto significa que el sistema inmunológico
puede ser estimulado para desarrollar CTL contra los tumores, que
expresan los péptidos correspondientes.
Las células presentadoras de antígenos
portadoras del péptido pueden utilizarse para ello de forma directa,
o bien ser activadas antes de su aplicación, por ejemplo, con la
proteína de choque térmico gp96. Esta proteína de choque térmico
induce la expresión de moléculas MHC de clase I y de moléculas
coestimulantes como la B7 y estimula además la producción de
citocinas. De esta forma, se estimula de forma global el
desencadenamiento de respuestas inmunes.
En otra forma de realización preferida, los
péptidos son utilizados para la marcación de leucocitos,
especialmente de linfocitos T.
Esta aplicación es ventajosa cuando los péptidos
se utilizan para descubrir si en una población de CTL existen CTL
dirigidos específicamente contra un péptido.
El péptido también se puede aplicar como
marcador en la evaluación de un tratamiento contra una enfermedad
tumoral.
En inmunizaciones u otros tratamientos también
se puede aplicar el péptido para la monitorización. Por lo tanto,
el péptido no sólo es útil para el tratamiento, sino también para el
diagnóstico.
En otra forma de realización preferida, los
péptidos se aplican para la preparación de un anticuerpo.
Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse de
manera convencional mediante la inmunización de animales con una
inyección de los péptidos y la posterior tinción de la
inmunoglobulina.
Los anticuerpos monoclonales pueden producirse
por protocolos estándar, como se describe, por ejemplo, en
"Methods Enzymol." (1986), 121, Hybridoma technology and
monoclonal antibodies.
En otro de sus aspectos, la invención también se
refiere a una composición farmacéutica que contiene uno o más
péptidos.
Esta composición se puede administrar por vía
parenteral, como subcutánea, intradérmica o intramuscular, o por
vía oral. Para ello, los péptidos son suspendidos o disueltos en un
vehículo farmacéuticamente aceptable, preferentemente acuoso.
Además, la composición puede contener coadyuvantes como, por
ejemplo, amortiguadores, aglutinantes, agentes de acoplamiento,
etc.
Los péptidos también pueden administrarse junto
con sustancias inmunoestimulantes como, por ejemplo, citocinas. Se
puede encontrar una descripción completa de adyuvantes para una
composición de este tipo en A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical
Excipients, 3ª Ed, 2000, "American Pharmaceutical Association
and Pharmaceutical Press".
El medio puede aplicarse en la prevención,
profilaxis y/o terapia de enfermedades tumorales y/o
adenomatosas.
El medio farmacéutico que contiene al menos uno
de los péptidos con ID de secuencia n.º 1 a n.º 79 se administra a
un paciente con una enfermedad tumoral a la que se está asociada el
péptido o antígeno en cuestión. De esta forma, puede desencadenarse
una respuesta inmune específica de tumor en base a CTL específicos
de tumor.
La cantidad de péptido o péptidos existente en
la composición farmacéutica se da en una cantidad terapéuticamente
efectiva. Por ello, los péptidos contenidos en la composición
también pueden unirse, al menos, a dos tipos distintos de HLA.
En otro de sus aspectos, la presente invención
se refiere a moléculas de ácidos nucleicos que codifican los
péptidos con ID de secuencia n.º 1 a n.º 79.
Las moléculas de ácidos nucleicos pueden ser
moléculas de ADN o ARN y, asimismo, se pueden aplicar en la
inmunoterapia del cáncer. Para ello, el péptido expresado por la
molécula de ácidos nucleicos induce una respuesta inmune contra las
células tumorales que expresan el péptido.
Conforme a la presente invención, las moléculas
de ácidos nucleicos también pueden encontrarse en un vector.
Además, la invención se refiere a células que,
con ayuda de la molécula de ácidos nucleicos, la cual codifica los
péptidos, se modificaron genéticamente de tal forma que producen un
péptido con ID de secuencia n.º 1 a n.º 79.
Para ello, las células son transfectadas con el
ADN codificante de los péptidos o el ARN correspondiente, de tal
forma que los péptidos son expresados en las células. Para dicha
aplicación son apropiadas como células presentadoras de antígenos,
por ejemplo, las células dendríticas, los monocitos o los linfocitos
B.
Se entiende que las características mencionadas
con anterioridad y las que se aclararán más adelante no sólo se
aplican en la combinación dada, sino también en su forma aislada,
sin que por ello se abandone el marco de la presente invención.
A continuación se presentan y explican, en los
ejemplos siguientes y las figuras incluidas, ejemplos de realización
de la invención. Muestran los siguiente:
Fig. 1 la detección de linfocitos T CD8^{+}
específicos de queratina 18;
Fig. 2a-d la inducción de
reacciones de CTL in vitro específicas de
péptido-c-met (SEQ ID n.º 1), Fig.
2a+b o de péptido-adipofilina (SEQ ID n.º 2), Fig.
2c+d;
Fig. 3a-f las lisis específica
de antígeno de las líneas celulares que expresan
c-met o adipofilina mediante CTL, inducida por CTL
inducidos por péptido-c-met- (SEQ ID
n.º 1), Fig. 3a-d, o
péptido-adipofilina (SEQ ID n.º 2), Fig.
3e-f;
Fig. 4a-c ensayos de inhibición
de lisis con células tumorales marcadas con ^{51}Cr y células T2
no marcadas, sensibilizadas con el péptido, mediante CTL inducidos
por el péptido-c-Met (SEQ ID n.º 1),
Fig. 4a+b o péptido-adipofilina (SEQ ID n.º 2),
Fig. 4c;
Fig. 5a+b la lisis de DC autólogas,
transfectadas con ARN del tumor, mediante CTL inducidos por el
péptido-c-met (SEQ ID n.º 1), Fig.
5a, o el péptido-adipofilina (SEQ ID n.º 2), Fig.
5b;
Fig. 6 los CTL autólogos específicos de
adipofilina inducidos in vitro reconocen las células
tumorales de un paciente con leucemia linfática crónica, pero no
células B o células dendríticas autólogas.
El departamento de urología de la Universidad de
Tubinga facilitó dos muestras de pacientes que presentaban tumor de
células del riñón confirmado histológicamente. Ninguno de los
pacientes había recibido tratamiento preoperatorio. El paciente n.º
1 (en adelante, RCC01) presentaba la siguiente tipificación HLA:
HLA-A*02 A*68 B*18 B*44; el paciente n.º 2 (en
adelante, RCC13), HLA-A*02 A*24 B*07 B*40.
Las muestras de tumor sometidas a choque térmico
se procesaron como se describe en Schirle, M. y col.
(Identification of tumor-associated MHC class I
ligands by a novel T cell-independent approach,
2000, "European Journal of Immunology",
30:2216-2225). Los péptidos se aislaron con
protocolos estándar mediante el uso del anticuerpo monoclonal
W6/32, específico para la molécula HLA de clase I, o del anticuerpo
monoclonal BB7.2, específico para HLA-A2.
Barnstable, C.J. y col. (Production of monoclonal antibodies to
group A erythrocytes, HLA and other human cell surface
antigens-new tools for genetic analysis, 1978,
"Cell", 14:9-20) y Parham, P. & Brodsky,
F.M. (Partial purification and some properties of BB7.2. A
cytotoxic monoclonal antibody with specificity for
HLA-A2 and a variant of HLA-A28,
1981, "Hum. Immunol.", 3:277-299) describen la
preparación y uso de estos anticuerpos.
Los péptidos obtenidos a partir del tejido
tumoral del paciente RCC01 se separaron mediante HPLC en fase
invertida (sistema SMART, \muRPC C2/C18 SC 2.1/19, Amersham
Pharmacia Biotech) y las fracciones obtenidas se analizaron
mediante nano espectrometría de masas ESI. Se procedió como se
describe en Schirle, M. y col, Identification of
tumor-associated MHC class I ligands by a novel T
cell-independent approach, 2000, "European
Journal of Immunology", 30:2216-2225.
Los péptidos obtenidos a partir de tejido
tumoral del paciente RCC13 se identificaron, como se ha
mencionado, mediante LC MS capilar, pero con ligeras
modificaciones: 100 \mul de muestra se cargaron, desmineralizaron
y preconcentraron en una precolumna de 300 \mum * 5 mm C18 \mu
(LC Packings). El disolvente y la muestra se administraron con una
bomba de inyección (PHD 2000, Harvard Apparatur, Inc.) con una
inyección impermeabilizada de 100 \mul (1710 RNR, Hamilton) a una
velocidad de 2 \mul/min. Para la separación de los péptidos se
conectó una columna de preconcentración a 75 \mum * 250 mm
C-18 (LC Packings). Finalmente, se efectuó un
gradiente binario con 25-60% B en 70 min, en el que
se redujo la tasa de flujo de 12 \mul/min a, aproximadamente, 300
\mum/min, mediante el uso de una conexión TEE (ZT1C, Valco) y una
columna de 300 \mum * 150 mm C-18.
Con el fin de asegurar que el sistema estaba
libre de péptidos sobrantes, se realizó una medición de una muestra
vacía. Se efectuaron fragmentaciones en línea, como se ha descrito,
y los espectros de los fragmentos fueron analizados manualmente.
Los análisis de las bases de datos (NCBInr, EST) se efectuaron con
MASCOT (http://www.matrixscien-
ce.com).
ce.com).
En la tabla 1 adjunta se presentan los ligandos
unidos a HLA-A*02, HLA-A*68,
HLA-B*18 o HLA-B*44. Los péptidos
que estaban asociados a HLA-A*02 presentan el motivo
peptídico específico de alelo: así, en la posición 2 había leucina,
valina, isoleucina, alanina o metionina y en el
C-terminal, leucina, valina isoleucina o alanina.
La mayoría de los ligandos procedían de las llamadas proteínas de
mantenimiento, aunque también se identificaron ligandos de
proteínas asociados a tumores.
Los ligandos asociados a
HLA-A*68 se identificaron por sus aminoácidos de
anclaje treonina, isoleucina, valina, alanina o leucina en la
posición 2 y arginina o lisina en el C-terminal.
Esto señalaba hacia el subtipo HLA-A*6801. Entre
los péptidos asociados a HLA-A*68 se incluyeron dos
ligandos de adipofilina, MTSALPEIQK y MAGDIYSVFR, además del
ETIPLTAEKL procedente de ciclina D1 asociada a tumor. De la anexina
II procedía el péptido TIVNILTNR. Esta proteína se presenta como
inmunógena con respecto a las moléculas MHC de clase II en pacientes
con melanoma (véase Heinzel y col,. The self peptide annexin II
[208 - 223] presented by dendritic cells sentisizes
autologous CD4+ T lymphocytes to recognize melanoma cells, 2001,
"Cancer Immunol. Immunother." 49:671-678). Los
otros ligandos presentaban ácido glutamínico en la posición 2, que
es un aminoácido de anclaje para el subtipo
HLA-B*44. El motivo peptídico del
HLA-B*18 todavía no se conoce, por lo que los
ligandos de estas dos moléculas HLA-B no se pueden
distinguir.
También para este tejido tumoral se pudieron
identificar los mismos ligandos que se identificaron para el
paciente RCC01 y los que procedían del proto-oncogén
met (c-met) y la queratina 18. Eran los péptidos con
SEQ ID n.º 1 y 3. Además, se pudieron obtener otros ligandos de
este tejido tumoral. De esta forma se identificó, por ejemplo, un
ligando procedente de la
nicotinamida-N-metiltransferasa
(NNMT), un gen que en más de 95% de todos los tumores de riñón
aparece sobreexpresado. Además, se solaparon otros ligandos con el
repertorio de péptidos de RCC01.
Las células mononucleares de sangre periférica
de pacientes sanos se tiñeron con tetrámeros de
HLA-A*0201, contruidos con péptidos de adipofilina,
queratina 18 o proto-oncogén met
(c-met): Para la preparación de los tetrámeros se
constituyeron moléculas HLA-A*0201 recombinantes
in vitro con los péptidos SVASTITGV (SEQ ID n.º 2,
adipofilina), ALLNIKVKL (SEQ ID n.º 3, queratina 18) o YVDPVITSI
(SEQ ID n.º 1, proto-oncogén met
(c-met), se limpiaron con filtrado de gel, se
biotinilaron y se mezclaron con estreptavidina para el ligado de los
monómeros.
De forma sorprendente, se encontró una población
significativa de linfocitos T CD8^{+} específica para la
queratina 18 en cuatro de 22 pacientes sanos. En la figura 1 se
muestran los resultados del teñido doble mediante representación de
puntos, en donde la fila central muestra los resultados del teñido
con queratina 18. Entre el 0,02% y el 0,2% de los linfocitos T
CD8^{+} era específico para la queratina 18. En la fila inferior
de la representación de puntos se puede apreciar que esta unión era
específica del tetrámero de queratina 18.
Con el fin de analizar la presentación de los
péptidos con la SEQ ID n.º 1 (YVDPVITSI) (fragmento peptídico del
proto-oncogén c-met) y la SEQ ID n.º
2 (fragmento peptídico de la adipofilina) mediante células tumorales
y el reconocimiento del péptido mediante CTL, se indujeron CTL
in vitro específicos del péptido c-met
(péptido con SEQ ID n.º 1) y CTL específicos del péptido de
adipofilina (SEQ ID n.º 2). Para ello se utilizaron células
dendríticas (DC) procedentes de células mononucleares de sangre
periférica (PBMC) de donantes HLA-A*02^{+}
sanos.
Las células dendríticas se aislaron de PBMC de
sangre heparinizada mediante centrifugación en gradiente de
densidad Ficoll/Paque (Biochrom, Berlín, Alemania). La sangre
heparinizada se obtuvo a partir de preparaciones de capa de
leucocitos de donantes sanos del banco de sangre de la Universidad
de Tubinga. Las células se colocaron en placas de 6 pocillos
(Falcon, Heidelberg, Alemania) (1 x 10^{7} células/3 ml por
pocillo) en medio RP10 (RPMI 1640, complementado con un 10% de
suero fetal de ternero inactivado por calor y con antibióticos).
Tras una incubación de 2 horas a 37ºC y con un 5% de CO_{2}, se
quitaron las células no adheridas y se cultivaron en medio RP10 los
monocitos adheridos. Se añadieron al medio las siguientes citocinas:
GM-CSF humano recombinante (factor estimulante de
colonias granulocito-macrófago; Leukomax, Novartis;
100 ng/ml), interleucina IL-4 (R&D Systems,
Wiesbaden, Alemania; 1000 IU [ml]) y TNF-\alpha
(factor \alpha de necrosis tumoral) (R&D Systems, Wiesbaden,
Alemania; 10 ng/ml).
Por ejemplo, se sintetizaron dos péptidos unidos
a HLA-A*02 (c-Met [SEQ ID n.º 1,
YVDPVITSI] o adipofilina [SEQ-ID n.º 2, SVASTITGV],
como se identificaron los mencionados anteriormente) mediante la
utilización de grupos protectores F-moc
(9-Fluorenilmetiloxicarbonilo) en un sintetizador de
péptidos (432A, Applied Biosystems, Weiterstadt, Alemania) y se
analizaron mediante HPLC en fase invertida y espectrometría de
masas. De esta forma, se pudieron preparar suficientes cantidades
del péptido identificado.
Para la inducción de CTL se sensibilizaron
durante 2 horas las DC obtenidas en el paso 2.1 (5 x 10^{5}) con
los péptidos obtenidos en el paso 2.2. con SEQ ID n.º 1 o SEQ ID n.º
2, cada uno con 50 \mug/ml, se lavaron y se incubaron con 2,5 x
10^{6} PBMC autólogas en medio RP10. Después de 7 días de
incubación, las células se volvieron a estimular con PBMC autólogas
sensibilizadas con péptidos. Los días 1, 3 y 5 se añadió 1 ng/ml de
interleucina IL-2 (R&D Systems) recombinante
humana. La actividad citotóxica de los CTL inducidos de esta manera
se examinó el 5º día, tras la última reestimulación, mediante un
ensayo estándar de liberación de ^{51}Cr (véase más abajo, en 2.4
[ensayo CTL]).
Para los ensayos de CTL se utilizaron como
células diana células tumorales, células sensibilizadas con péptido
y de distintas líneas celulares y DC autólogas. Las células
sensibilizadas con péptido se sensibilizaron durante 2 horas con 50
\mug/ml de péptido (SEQ ID n.º 1 o SEQ ID n.º 2). Todas las
células diana se marcaron en medio RP10 (RPMI 1640, complementado
con un 10% de suero fetal de ternero inactivado por calor y con
antibióticos) durante 1 hora a 37ºC con [^{51}Cr]cromato
de sodio (^{51}Cr). Finalmente, se repartieron 10^{4} células
por pocillo en una placa de 96 pocillos con suelo redondeado. Se
añadieron distintas cantidades de CTL hasta alcanzar un volumen de
200 \mul, con una incubación final de 4 horas a 37ºC. Después se
recogieron los resultados (50 \mul/pocillo) y se hizo un recuento
en un contador de placas beta. El porcentaje de la lisis específica
se calculó de la siguiente forma: 100 x (liberación experimental -
liberación espontánea/liberación máxima - liberación espontánea).
La liberación espontánea y la liberación máxima se fijaron en
presencia de medio o de Triton X-100 al 2%.
En la figura 2 se muestran los resultados del
ensayo de liberación de Cr^{51} (véase el epígrafe 2.4. más
abajo) con referencia a la actividad citotóxica de CTL inducidos
(véase el epígrafe 2.3. más abajo) frente a células T2 o
dendríticas. La línea celular T2 es HLA-A*02^{+} y
carente de TAP (transportador asociado al procesamiento
antigénico); (los transportadores de péptidos TAP transportan
fragmentos peptídicos de un antígeno proteico desde el citosol
hasta el retículo endoplasmático, donde se asocia a moléculas
MHC).
En las figuras 2a y 2b se muestra la actividad
citotóxica de los CTL, inducidos mediante la utilización del
péptido con la SEQ ID n.º 1, frente a células T2 y dendríticas.
Ambos tipos de célula fueron previamente sensibilizados con el
péptido c-met con SEQ ID n.º 1 (cuadrícula rellena
de negro) o con un péptido irrelevante (Survivin [Sv];
ELTLGEFLKL; SEQ ID n.º 80) o VIH (ILKEPVHGV; Pol. péptido
HIV-1 con transcripción inversa, posición de los
ácidos nucleicos 476-484; SEQ ID n.º 81). En las
figuras 2c y 2d se muestra la actividad citotóxica de los CTL,
inducidos mediante la utilización del péptido con SEQ ID n.º 2,
frente a células T2 y dendríticas, que previamente fueron
sensibilizadas con el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2.
La lisis específica reflejada en la liberación
de ^{51}Cr se muestra en las figuras 2a a 2d y en los diagramas
de lisis de CTL de las figuras 3 a 5, frente a diferentes
proporciones de células efectoras (CTL) y células diana (células
marcadas con ^{51}Cr, para lisar).
Como se puede ver en las figuras 2a a 2d, se
pudo mostrar, con una línea celular de CTL obtenida tras 2 semanas
de reestimulación, una destrucción de las células específica de
antígeno. Sólo se destruyeron, mediante una cantidad en aumento de
CTL, las células que presentaban el péptido de c-met
con SEQ ID n.º 1 (figuras 2a y 2b) o el péptido de adipofilina con
SEQ ID n.º 2 (figuras 2c y 2d) (véanse en las figuras 2a a 2d las
curvas correspondientes con las cuadrículas en negro). Las células
de control cargadas con péptidos irrelevantes no fueron destruidas
(las curvas con cuadrículas vacías). De esta forma, se pudo mostrar
la especificidad de la actividad citolítica.
\vskip1.000000\baselineskip
En una etapa posterior, se volvió a utilizar un
ensayo de liberación de ^{51}Cr para evaluar si los CTL -que son
específicos para el péptido de c-met con SEQ ID n.º
1 o para el péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2- reconocen y
lisan células tumorales que expresan endógenamente el
proto-oncogén c-met o
adipofilina.
Para ello se aplicaron las siguientes líneas
celulares HLA-A*02 positivas marcadas con ^{51}Cr:
HCT 116 (cáncer de intestino; obtenida de el Prof. G.
Pawelec, Tubinga, Alemania), A 498, MZ 1257 y MZ
1774 (carcinoma de células renales; obtenida de el Prof. A.
Knuth, Fráncfort, Alemania), MCF-7 (cáncer de
mama; adquirida de la ATCC, American Type Culture
Collection), Mel 1479 (melanoma; obtenida de el Prof. G.
Pawelec, Tubinga, Alemania) y U 266 (mieloma múltiple;
obtenida de el Prof. G. Pawelec, Tubinga, Alemania). Estas líneas
celulares expresan el proto-oncogén
c-met y la adipofilina como estructuras diana
(targets).
Las líneas celulares B Croft (VEB [virus
de Epstein-Barr]); HLA-A*02^{+};
obtenida de O.J. Finn, Pittsburgh, EUA) y
SK-OV-3 (tumor ovárico;
HLA-A*03^{+}; obtenida de O.J. Finn, Pittsburgh,
EUA) se utilizaron en los análisis como controles negativos. Las
células K 562 (que se pueden obtener, por ejemplo, en la
Deutschen Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen,
DSMZ; ACC 10) se utilizaron para determinar la actividad de las
células asesinas naturales (NK), ya que esta línea celular está
altamente sensibilizada frente a estas células asesinas.
Todas las líneas celulares se cultivaron en
medio RP10 (RPMI 1640, complementado con un 10% de suero fetal de
ternero inactivado por calor y antibióticos).
Con las líneas celulares de tumor mencionadas
anteriormente y los CTL inducidos como se describe en el epígrafe
2.3, se efectuaron los ensayos de liberación de ^{51}Cr (véase el
epígrafe 2.4).
Las figuras 3a a 3f muestran los resultados de
estos ensayos de CTL: en las figuras 3a a 3d se muestran los CTL
inducidos mediante la utilización del péptido de
c-met con SEQ ID n.º 1; en las figuras 3e y 3f se
muestran los CTL inducidos mediante la utilización del péptido de
adipofilina con SEQ ID n.º 2.
Como se puede ver en las figuras 3a a 3f, los
CTL, específicos para el péptido c-met con SEQ ID
n.º 1 (Fig. 3a a 3d) o para el péptido de adipofilina con SEQ ID
n.º 2 (Fig. 3e y 3f), lisaron de forma eficaz células tumorales que
expresaban tanto HLA-A*02 como c-met
o adipofilina (también en la Fig. 3a la línea celular HCT 116, en
la Fig. 3b la línea celular A 498, en la Fig. 3c las líneas
celulares MZ 1257 y MEL 1479 y en la Fig. 3d las líneas celulares
MCF-7 y U 266; en la Fig. 3e las líneas celulares A
498, U 266 y MCF-7, en la Fig. 3f las líneas
celulares MZ 1774, Mel 1479 y MZ 1257). La lisis específica se midió
-como se dio anteriormente en el epígrafe 2.4.- mediante la
liberación de ^{51}Cr. Por el contrario, la línea celular de
control SK-OV-3
(HLA-A-*02-negativa) no fue lisada
por los CTL inducidos con el péptido con SEQ ID n.º 1 ni por los CTL
inducidos por el péptido con SEQ ID n.º 2. Esto demuestra que ambos
péptidos deben ser presentados en relación con las moléculas
HLA-A*02 en las células tumorales, con el fin de
lisar las células diana de forma efectiva. Además, de esta forma se
comprobó la especificidad antigénica y la restricción de MHC de los
CTL.
Además, los CTL inducidos in vitro por el
péptido con SEQ ID n.º 1 no reconocieron la línea celular K562
(véanse las Fig. 3a, 3b y 3d), lo que demuestra que la actividad
citotóxica no es proporcionada por células asesinas naturales
(NK).
\vskip1.000000\baselineskip
Con el fin de seguir verificando la
especificidad antigénica y la restricción de MHC de los CTL
inducidos in vitro, se efectuaron ensayos de inhibición con
líneas celulares de inhibidores no marcadas con ^{51}Cr
(fríos).
Con ello se analizó la capacidad de las líneas
celulares sensibilizadas con péptidos para inhibir o competir con
la lisis de células tumorales. Para ello se aplicó un exceso de
inhibidor (es decir, de células sensibilizadas no marcadas). La
proporción del inhibidor (células sensibilizadas con péptidos) y la
diana (células tumorales) fue de 20:1. En la lisis de las líneas
celulares del inhibidor no se pudo liberar ^{51}Cr, ya que las
líneas celulares del inhibidores no estaban marcadas.
Como inhibidor se aplicó la línea celular T2
(HLA-A*02; deficiente de TAP; véase el epígrafe
2.5.a). La línea celular T2 se sensibilizó antes de cada ensayo con
los péptidos relevantes (SEQ ID n.º 1 o 2) o con un péptido de
control irrelevante (Survivin [Sv], SEQ ID n.º 80).
Los resultados de estos ensayos se muestran en
las figuras 4a a 4c: en las figuras 4a y 4b se aplicaron CTL que
fueron inducidos con el péptido de c-met con SEQ ID
n.º 1; en la figura 4c, CTL que fueron inducidos por el péptido de
adipofilina con SEQ ID n.º 2.
En las figuras 4a y 4b se evaluó la lisis de las
líneas celulares U 266 y A 498 marcadas con ^{51}Cr, sin línea
celular de inhibidor (cada curva con cuadrículas negras); con la
línea celular T2 del inhibidor, sensibilizada con un péptido
irrelevante (Survivin; SEQ ID n.º 80; control negativo, las curvas
con los triángulos rellenos); y con la línea celular T2 del
inhibidor, sensibilizada con el péptido de c-met con
SEQ ID n.º 1 (curvas con los rombos en blanco).
Sin la existencia de las células del inhibidor,
se observó una lisis de las células tumorales mediante CTL (véanse
en las figuras 4a a 4d las curvas con las cuadrículas rellenas de
negro). Como se deduce de las figuras 4a y 4b, con un exceso de
blanco inhibidor no tuvo lugar la lisis de las células tumorales (y
por lo tanto, la liberación de ^{51}Cr), siempre que el blanco
inhibidor estaba sensibilizado con el péptido c-met
con SEQ ID n.º 1 (véanse las curvas con los rombos en blanco). La
actividad de los CTL se orientó hacia el exceso de células T2 sin
marcar, de forma que se lisaron éstas, y no las células tumorales.
Las células T2, sensibilizadas con un péptido irrelevante
(Survivin; SEQ ID n.º 80), no pudieron inhibir la lisis de las
células tumorales por los CTL, de forma que se pudo medir el
^{51}Cr liberado (véanse en las figuras 4a y 4b las curvas con los
triángulos rellenos de negro).
Se pudo observar algo parecido al utilizar CTL
inducidos por la aplicación del péptido de adipofilina con SEQ ID
n.º 2 (véase la figura 4c):
La restricción MHC y la especificidad antigénica
de la actividad citotóxica, transmitida a través de los CTL
inducidos por adipofilina, pudo confirmarse mediante la utilización
de un anticuerpo monoclonal específico de HLA-A*02
y en un ensayo de inhibición con un inhibidor sin marcar (frío): Los
resultados de este experimento se muestran en la figura 4c. Las
células tumorales A 498 se bloquearon mediante la adición del
anticuerpo específico de HLA-A*02 (anticuerpo
monoclonal BB7.2, IgG2b, obtenido de S. Stefanovic, Tubinga), de
forma que no se lisaron por la adición de CTL y no se liberó
^{51}Cr (véase en la figura 4c la curva con símbolos de
triángulos en blanco). Como control se utilizó un anticuerpo
inespecífico que no bloqueaba la molécula HLA-A*02
(ChromPure Maus IgG, Dianova, Alemania; véase en la Fig. 4c la curva
con las cuadrículas rellenas). Para estos experimentos de
inhibición, se incubaron las células en las placas de 96 pocillos
durante 30 min. con 10 \mug/ml de anticuerpos.
Además, se demostró que la línea celular T2 de
competición, que se sensibilizó con el péptido irrelevante Survivin
con SEQ ID n.º 80 (T2/SV), no pudo inhibir la lisis de la línea
celular tumoral A 498 producida por los CTL (véase en la figura 4c
la curva con los círculos en negro), pero que la línea celular del
inhibidor T2 (T2/AD) sensibilizada con el péptido de adipofilina
con SEQ ID n.º 2 pudo inhibir la lisis de la línea celular del
tumor, de forma que, al final, no se pudo medir ninguna liberación
de ^{51}Cr (véase en la figura 4c la curva con los símbolos
x).
\vskip1.000000\baselineskip
En un paso posterior, se analizó la actividad
citotóxica de los CTL en un experimento autólogo. Para ello se
utilizaron DC autólogas, obtenidas de la misma PBMC que la utilizada
para la inducción de CTL (véase el epígrafe 2.2.), como células
diana. Antes de efectuar los ensayos de CTL se realizó la
electroporación de las DC con ARN, que, o bien se aisló
anteriormente de líneas celulares de tumor o bien mostraba ARN de
control (EGFP-ARN transcrito in vitro
[enhanced Green fluorescent Protein-RNA];
plásmido utilizado: pSP64 Poly(A) EGFPII, obtenido de Van
Tendeloo, Amberes, Bélgica). El ARN completo se aisló de las células
tumorales con el kit QIAGEN Rneasy Mini (QIAGEN, Hilden, Alemania)
conforme a los datos del fabricante. La cantidad y pureza del ARN
se fijó fotométricamente y se guardó en partes alícuotas a
-80ºC.
Antes de la electroporación el sexto día, se
lavaron DC inmaduras dos veces con medio X-VIVO 20
sin suero (BioWhittaker, Walkersville, EUA) y se volvieron a
suspender en una concentración final de 2 x 10^{7} células/ml.
Finalmente, se mezclaron 200 \mul de la suspensión celular con 10
\mug del ARN total y se sometieron a electroporación en una
cubeta de 4 mm mediante Easyject Plus^{TM} (Peqlab, Erlangen,
Alemania) (Parámetros: 300 V, 150 \muF, 1540 \Omega, tiempo de
pulsación: 231 ms). Después de la electroporación, las células se
traspasaron de inmediato a medio RP10 y se devolvieron al incubador.
Más del 80% de las células eran viables tras la
electroporación.
Los resultados de estos experimentos se muestran
en las figuras 5a y 5b. En la figura 5a se aplicaron CTL inducidos
mediante la utilización del péptido c-met con SEQ ID
n.º 1; en la figura 5b se aplicaron CTL inducidos mediante la
utilización del péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2.
Tras efectuarse el ensayo de CTL con CTL
inducidos por el péptido de c-met con SEQ ID n.º 1
(véase el epígrafe 2.4.), se pudo observar una lisis específica de
DC, electroporadas con ARN de líneas celulares de tumor que
expresaban c-met (A 498 y MCF-7)
(véanse en la figura 5a las curvas con los símbolos en negro). Por
el contrario, las DC que fueron electroporadas con ARN de la línea
celular tumoral Croft que no expresaba el c-met no
fueron lisadas (véase la curva con los rombos en blanco).
Los CTL inducidos por el péptido de adipofilina
con SEQ ID n.º 2, lisaron las DC, que fueron electroporadas con ARN
de la línea celular A-498 que expresaba adipofilina
(véase en la figura 5b la curva con los triángulos en negro).
Además, se lisaron DC que fueron sensibilizadas con el péptido de
adipofilina con SEQ ID n.º 2 (véase en la figura 5b la curva con
los rombos en negro). Por el contrario, las DC que fueron
electroporadas con el (EGFP)ARN de control no se lisaron
(véase en la figura 5b la curva con los triángulos en blanco).
Esto demuestra que -después de la transfección
de las DC con ARN de células tumorales positivas de
c-met o adipofilina- los péptidos identificados, es
decir, el péptido de c-met con SEQ ID n.º 1 y el
péptido de adipofilina con SEQ ID n.º 2 fueron procesados y
presentados.
\vskip1.000000\baselineskip
En otro experimento, se generaron, a partir de
PBMC de un paciente HLA-A-*0201^{+} con leucemia
linfática crónica (CLL) CTL específicos para el péptido de
adipofilina con SEQ ID n.º 2. El paciente se encontraba en remisión
tras un tratamiento con fludarabina. Además, se aplicaron en un
ensayo linfocitos CLL autólogos primarios y DC de dicho paciente
como blancos marcados con ^{51}Cr, en el que se transmitió una
liberación de ^{51}Cr mediante los CTL inducidos por péptidos.
Como se muestra en la figura 6, tanto las DC autólogas de este
paciente, que se sensibilizaron con el péptido de adipofilina con
SEQ ID n.º 2 (DC+AD), como los linfocitos CLL autólogos (linfocitos
CLL) fueron lisados por los CTL inducidos por el péptido. Por el
contrario, las DC, sensibilizadas con el péptido irrelevante
Survivin con SEQ ID n.º 80, no fueron lisadas (DC+SV). Los
linfocitos B no malignos y la línea celular K 562 tampoco fueron
lisados por los CTL.
La especificidad de la respuesta de los CTL se
comprobó en un ensayo de inhibición del blanco, en el que se aplicó
como células del inhibidor la línea celular T2 (véase más arriba),
que estaba sensibilizada con el péptido de adipofilina con SEQ ID
n.º 2 o con el péptido irrelevante Survivin con SEQ ID n.º 80. Los
CTL inducidos mediante la utilización del péptido de adipofilina
con SEQ ID n.º 2 también lisaron aquí las líneas celulares del
inhibidor existentes en exceso, que fueron sensibilizadas con el
péptido relevante con SEQ ID n.º 2, de forma que las células
tumorales marcadas con ^{51}Cr no fueron lisadas en este caso
(véase en la figura 6 la curva con las casillas en blanco).
En resumen, los inventores pueden demostrar que
los péptidos identificados producen sustancias muy prometedoras en
la inmunoterapia de una variedad de enfermedades (tumorales).
<110> Immatics Biotechnologies GmbH
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<120> Péptidos asociados a tumor unidos a
moléculas MHC
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FB15156/A
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<160> 81
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<170> PatentIn version 3.1
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 1
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 1
\hskip1cm8
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 2
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 2
\hskip1cm9
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 3
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 3
\hskip1cm10
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 4
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 4
\hskip1cm11
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 5
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 5
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm12
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 6
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 6
\hskip1cm13
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 7
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 7
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm14
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 8
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm15
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 9
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm16
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Homo sapiens
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 10
\vskip1.000000\baselineskip
\hskip1cm17
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<212> PRT
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Humanes Immundefizienz Virus
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<400> 81
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\hskip1cm88
Claims (15)
1. Un péptido asociado a tumor con la secuencia
de aminoácidos SVASTITGV (SEQ ID n.º 2), en donde el péptido tiene
la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) humano de clase I.
2. El péptido conforme a la reivindicación 1,
caracterizado porque un aminoácido puede ser sustituido por
otro aminoácido con propiedades químicas parecidas.
3. El péptido conforme a las reivindicaciones 1
o 2, caracterizado porque en N- y/o
C-terminal existe otro aminoácido.
4. El péptido conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque un aminoácido se
ha eliminado.
5. El péptido conforme a una de las
reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque al menos un
aminoácido se ha modificado químicamente.
6. La utilización del péptido conforme a las
reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de un medicamento para
el tratamiento de enfermedades tumorales y/o enfermedades
adenomatosas.
7. La utilización del péptido conforme a las
reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de una composición
farmacéutica para el tratamiento de enfermedades tumorales y/o
enfermedades adenomatosas.
8. La utilización conforme a las
reivindicaciones 6 o 7, caracterizada porque la enfermedad es
cáncer renal, de mama, de páncreas, de estómago, de vejiga y/o de
testículo.
9. La utilización conforme a las
reivindicaciones 7 o 8, caracterizada porque el péptido es
aplicado junto con un adyuvante.
10. La utilización conforme a las
reivindicaciones 7 o 8, caracterizada porque el péptido se
aplica unido a una célula presentadora de antígeno.
11. La utilización del péptido conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de un
anticuerpo.
12. Una composición farmacéutica que contiene el
péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
13. Una molécula de ácidos nucleicos que
codifica el péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1
a 5.
14. Un vector que contiene la molécula de ácidos
nucleicos conforme a la reivindicación 13.
15. Células que, con ayuda de la molécula de
ácidos nucleicos conforme a la reivindicación 13 o con ayuda del
vector conforme a la reivindicación 14, son modificadas
genéticamente de tal forma que producen un péptido conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.
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