PL211158B1

PL211158B1 - Związane z nowotworem peptydy wiążące się z cząsteczkami MHC

Info

Publication number: PL211158B1
Application number: PL390815A
Authority: PL
Inventors: Toni Weinschenk; Hans Georg Rammensee; Stefan Stevanovic
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2002-05-29
Filing date: 2003-03-27
Publication date: 2012-04-30
Also published as: JP2010088449A; PL373700A1; CA2736926C; ES2348468T3; DE50313004D1; ES2350461T3; JP5042302B2; JP5042303B2; SI1507795T1; PT1507795E; JP2010099079A; EP2006294A1; US7763711B2; ES2314196T3; JP4472520B2; DK1507795T3; EP1734049B1; CY1111174T1; SI2006294T1; US20050222390A1

Description

Urząd Patentowy Rzeczypospolitej Polskiej (22) Data zgłoszenia: 27.03.2003 (62) Numer zgłoszenia, z którego nastąpiło wydzielenie:

373700 (86) Data i numer zgłoszenia międzynarodowego:

27.03.2003, PCT/EP03/003181 (87) Data i numer publikacji zgłoszenia międzynarodowego:

11.12.2003, WO03/102023 (51) Int.Cl.

C07K 7/06 (2006.01) C07K 14/47 (2006.01) C07K 16/00 (2006.01) C12N 15/00 (2006.01) C12N 15/12 (2006.01) A61K 38/08 (2006.01) A61P 35/00 (2006.01) (54) Związane z nowotworem peptydy wiążące się z cząsteczkami MHC (73) Uprawniony z patentu:

(30) Pierwszeństwo:

29.05.2002, DE, 10225144.4

IMMATICS BIOTECHNOLOGIES GMBH, ^bingen, DE (43) Zgłoszenie ogłoszono:

24.05.2010 BUP 11/00 (72) Twórca(y) wynalazku:

TONI WEINSCHENK, Esslingen, DE

HANS GEORG RAMMENSEE, ^bingen, DE STEFAN STEVANOVIC, Kibingen, DE (45) O udzieleniu patentu ogłoszono:

30.04.2012 WUP 04/12 (74) Pełnomocnik:

rzecz. pat. Rafał Witek

PL 211 158 B1

Opis wynalazku

Niniejszy wynalazek dotyczy związanych z nowotworem peptydów mających zdolność do wiązana się z cząsteczką ludzkiego głównego układu zgodności tkankowej (MHC, ang. Major histocompatibility), klasy I.

Takie peptydy są stosowane - na przykład - w immunoterapii chorób związanych z nowotworem.

Kiedy komórki nowotworowe są usuwane przez układ odpornościowy, kluczową rolę odgrywa identyfikacja związanych z nowotworem antygenów (TAA, ang. tumor-associated antigens) przez składniki układu odpornościowego. Mechanizm ten jest oparty na fakcie, że istnieją jakościowe i ilościowe różnice pomiędzy komórkami nowotworowymi i komórkami zdrowymi. Aby indukować odpowiedź przeciwnowotworową, komórki nowotworowe muszą wykazywać ekspresję antygenów, które indukują odpowiedź immunologiczną wystarczającą do usunięcia nowotworu.

W szczególności, w odrzucenie nowotworów zaangażowane są cytotoksyczne limfocyty T (w dalszym tekście CTL) wykazujące ekspresję CD8. Aby indukować taką reakcję immunologiczną przez cytotoksyczne limfocyty T, komórkom T muszą być prezentowane obce białka/peptydy. Antygeny są rozpoznawane przez komórki T jako fragmenty peptydów tylko, jeśli są prezentowane przez cząsteczki MHC na powierzchniach komórek. Te cząsteczki MHC („główny układ zgodności tkankowej”) są receptorami peptydów, które zwykle wiążą peptydy wewnątrz komórki i transportują je na powierzchnię komórki. Ten kompleks peptydu i cząsteczki MHC jest rozpoznawany przez komórki T.

Ludzkie cząsteczki MHC określane są także jako ludzkie antygeny leukocytów (HLA, ang. human leukocyte antigens).

Istnieją dwie klasy cząsteczek MHC: cząsteczki MHC klasy I, które są obecne na większości komórek posiadających jądro, prezentują peptydy wytworzone w wyniku degradacji białek endogennych. Cząsteczki MHC klasy II są obecne tylko na profesjonalnych komórkach prezentujących antygen (APC, ang. antigen-presenting cells) i prezentują peptydy białek egzogennych, które są pobierane i przetwarzane podczas endocytozy. Kompleksy peptyd/MHC klasy I są rozpoznawane przez CD8dodatnie cytotoksyczne limfocyty T, kompleksy peptyd/MHC klasy II są rozpoznawane przez pomocnicze komórki T CD4.

W celu indukowania komórkowej odpowiedzi immunologicznej peptyd musi zostać zwią zany z cząsteczką MHC. To zdarzenie zależy od allelu cząsteczki MHC i od sekwencji aminokwasowej peptydu. Peptydy wiążące MHC klasy I, mające - co jest ogólną regułą - długość 8-10 reszt, zawierają dwie konsenrwowane reszty („kotwiczące”) w swojej sekwencji, które angażują komplementarne kieszenie usytuowane w cząsteczce MHC.

W celu indukowania przez ukł ad odpornościowy efektywnej odpowiedzi CTL skierowanej przeciwko peptydom związanym z nowotworem, peptydy te muszą nie tylko być w stanie wiązać się ze specyficznymi cząsteczkami MHC klasy I ulegającymi ekspresji w komórkach nowotworowych, ale muszą także być w stanie być rozpoznawane przez komórki T posiadające specyficzne receptory komórek T (TCR, ang. T-cell receptor).

Podczas opracowywania szczepionki przeciwnowotworowej głównym celem jest, aby zidentyfikować i scharakteryzować związane z nowotworem antygeny, które są rozpoznawane przez CD8⁺ CTL.

Antygeny - lub, odpowiednio, ich epitopy - które są rozpoznawane przez specyficzne dla nowotworu cytotoksyczne limfocyty T mogą być cząsteczkami białek wszystkich klas, takimi jak enzymy, receptory, czynniki transkrypcyjne, itp. Inną ważną klasą antygenów związanych z nowotworem są struktury specyficzne dla tkanki, takie jak antygeny rakowe-jądra, które ulegają ekspresji w różnych typach nowotworów i zdrowej tkance jądra.

W celu zidentyfikowania przez limfocyty T białek, jako antygenów specyficznych dla nowotworu i w celu zastosowania ich w terapii, muszą zostać speł nione pewne wymagania: Antygen musi ulegać ekspresji głównie w komórkach nowotworowych, a nie w zdrowych komórkach lub przynajmniej w mniejszym stopniu niż w nowotworach. Ponadto, pożądane jest, jeś li specyficzny antygen jest obecny nie tylko w jednym rodzaju nowotworu, ale także w innych rodzajach w wysokich stężeniach. Ponadto, istotna jest obecność epitopów w sekwencji aminokwasowej antygenu, ponieważ przypuszcza się, że te peptydy pochodzące od antygenu związanego z nowotworem indukują odpowiedź komórek T, albo in vitro, albo in vivo.

Zatem, TAA stanowią punkt wyjścia dla rozwoju szczepionki przeciwnowotworowej. Sposoby identyfikacji i charakteryzacji TAA są oparte na wykorzystaniu pochodzących od pacjenta CTL lub na wytworzeniu różnicowych profili transkrypcji pomiędzy nowotworami a zdrową tkanką.

PL 211 158 B1

Identyfikacja genów, które ulegają nadekspresji w tkankach nowotworowych lub które selektywnie ulegają ekspresji w takich tkankach, nie zapewnia dokładnej informacji o wykorzystaniu antygenów powstałych po transkrypcji tych genów w terapii immunologicznej. Oparte jest to na fakcie, że tylko kilka epitopów z tych antygenów jest odpowiednich do takiego wykorzystania, ponieważ odpowiedź komórek T jest indukowana - poprzez prezentację MHC - tylko przez epitopy antygenów, a nie przez antygeny jako całość. Zatem, ważne jest, aby wybrać te peptydy z białek ulegających nadekspresji lub selektywnej ekspresji, które są prezentowane przez cząsteczki MHC, tym samym tworząc punkty ataku dla specyficznego rozpoznania nowotworu przez cytotoksyczne limfocyty T.

W ś wietle powyż szych faktów, celem niniejszego wynalazku jest dostarczenie przynajmniej jednej nowej sekwencji aminokwasowej takiego peptydu, który może wiązać się z cząsteczką ludzkiego głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I.

Ten cel zostaje osiągnięty, według wynalazku, przez dostarczenie związanego z nowotworem peptydu zawierającego sekwencję aminokwasową SEK ID NR 4, która jest wybrana z grupy składającej się z SEK ID NR 1 do SEK ID NR 79 załączonego protokołu sekwencji, przy czym ten peptyd ma zdolność do wiązania się z cząsteczką ludzkiego głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I.

Cel postawiony przed wynalazkiem zostaje całkowicie osiągnięty w taki sposób.

Rozumie się, że peptydy zidentyfikowane w nowotworze mogą być syntetyzowane lub ulegać ekspresji w komórkach) w celu otrzymania większych ilości i w celu wykorzystania ich do celów opisanych poniżej.

Wynalazcy byli w stanie zidentyfikować w tkance nowotworowej wyżej wspomniane peptydy, jako specyficzne ligandy cząsteczek MHC klasy I. W związku z tym, określeniem „związane z nowotworem”, określa się tutaj peptydy, które zostały wyizolowane i zidentyfikowane z substancji nowotworowej. Peptydy te - prezentowane na samoistnych (pierwotnych) nowotworach - są przedmiotem przetwarzania antygenu w komórce nowotworowej.

W terapii raka można zastosować specyficzne ligandy, na przykład, aby indukować odpowiedź immunologiczną skierowaną przeciwko komórkom nowotworowym, które wykazują ekspresję odpowiadających im antygenów, od których pochodzą peptydy.

Z jednej strony, taką odpowiedź immunologiczną, w kategoriach indukcji CTL, można osiągnąć in vivo. W tym celu peptyd podaje się - na przykład w postaci kompozycji farmaceutycznej - pacjentowi, który cierpi na chorobę nowotworową związaną z TAA.

Z drugiej strony, odpowiedź CTL przeciwko nowotworowi wykazują cemu ekspresję antygenu, od którego pochodzą peptydy, można indukować ex vivo. W tym celu komórki prekursorowe CTL inkubuje się razem z komórkami prezentującymi antygen i peptydami. CTL w ten sposób stymulowane następnie hoduje się i te aktywowane CTL podaje się pacjentowi.

Dalszą możliwością jest przyłączenie peptydów ex vivo do APC i podanie tych naładowanych APC pacjentowi, który w tkance nowotworowej wykazuje ekspresję antygenu, od którego pochodzi peptyd. APC mogą, z kolei, prezentować peptyd CTL in vivo i aktywować je.

Peptydy według wynalazku można ponadto wykorzystać, jako odczynniki diagnostyczne.

W ten sposób peptydy moż na zastosować w celu dowiedzenia się , czy w populacji CTL istnieją CTL specyficznie skierowane przeciwko peptydowi lub czy CTL są indukowane w terapii.

Ponadto, przy użyciu peptydu można testować zwiększenie się liczby komórek prekursorowych T, które wykazują reaktywność przeciwko określonemu peptydowi.

Dodatkowo, peptyd można zastosować, jako znacznik do oszacowania przebiegu choroby nowotworu wykazującego ekspresję antygenu, od którego pochodzi peptyd.

W załączonej tabeli 1 wymienione są zidentyfikowane peptydy. Są one ułożone według odpowiednich typów HLA, z którymi się wiążą. Ponadto, w tabeli peptydy są ułożone według białek, od których pochodzi peptyd, i według odpowiedniej pozycji peptydu w odpowiadającym mu białku. W tym celu zostały zachowane angielskie oznaczenia białek, aby uniknąć mylących tłumaczeń. Ponadto, przytoczono numery ACC, które są stosowane w banku genów „Narodowego Centrum Informacji Biotechnologicznej” Narodowego Instytutu Zdrowia (zobacz http://www.ncbi.nlm.nih.gov).

Wynalazcy byli w stanie wyizolować peptydy (lub ligandy) z raków komórek nerkowych dwóch pacjentów, RCC01 i RCC13. W tym celu wyizolowano 68 ligandów z tkanki nowotworowej pacjenta RCC01 i 13 ligandów z tkanki nowotworowej pacjenta RCC13. Dwa z ligandów zidentyfikowanych u obydwu pacjentów były identyczne. Były to peptydy mające sekwencję ID NR 1 i 3 (YVDPVITSI protoonkogenu met (C-met) i ALLNIKVKL keratyny 18).

PL 211 158 B1

Można było zidentyfikować 79 ligandów z nowotworów pacjentów, z których 30 było związanych z podtypami HLA HLA-A*02, 13 by ł o zwią zanych z podtypami HLA-A*68, 34 z HLA-B*18 lub HLA-B*44 i 2 z HLA*24.

Ligandy HLA-A*02 wszystkie wykazywały specyficzny dla allelu motyw peptydowy: (leucyna/walina, izowalina, alanina lub metionina w pozycji 2; leucyna/walina, izowalina lub alanina na C-końcu).

Niektóre z ligandów pochodziły z powszechnie ulegających ekspresji tak zwanych genów podstawowego metabolizmu, które ulegają ekspresji w równej mierze w większości tkanek, ale ekspresja wielu zmienia się w związku z nowotworem.

Peptyd mający sekwencję ID NR 1 YVDPVITSI, na przykład, uważany jest za ligand, który, w szczególnoś ci, jest związany z nowotworami i który pochodzi od protoonkogenu met (c-met) (pozycje 654-662). Peptydy mające sekwencję ID NR 2, 22 i 23 pochodzą od adypofiliny (określanej także, jako białko „związane z różnicowaniem się tkanki tłuszczowej”) i obejmują pozycje 129-137, 62-71 i 349-358 w tym białku, przy czym dwie ostatnie znajdują się pośród peptydów prezentowanych przez HLA-A*68. Ligand mający sekwencję ID NR 3 jest ligandem, który pochodzi od keratyny 18 i jest usytuowany w pozycji 365-373.

Większa część ligandów zawierała aminokwas kwas glutaminowy (E) w pozycji 2, który jest aminokwasem kotwiczącym podtypu HLA-B*44. W ten sposób można zidentyfikować peptydy, które pochodzą od białek, które we wcześniejszych doświadczeniach okazały się być immunogenne, na przykład peptyd mający sekwencję ID NR 5, który pochodzi od białka aneksyny II (pozycja w aneksynie II: 55-63). Białko to okazało się być immunogenne pod względem cząsteczek MHC klasy II u pacjentów z czerniakiem (zobacz Heinzel i wsp., The self peptide annexin II (208-223) presented by dendrytic cells sentisizes autologous CD4+ T-lymphocytes to recognize melanoma cells, 2001, Cancer Immunol. Immunother. 49: 671-678).

Ponadto, można by zidentyfikować niektóre peptydy, które pochodzą od białek, które, w szczególności, ulegają nadekspresji w tkance nowotworowej. Zatem, można by zidentyfikować fragmenty wimentyny (EEIAFLKKL, pozycja 229-237) i kaldesmonu (DEAAFLERL, pozycja 92-100). Young i wsp., Expression profiling of renal epithelial neoplasms: a method for tumor classification and discovery of diagnostic molecular markers, 2001, Am. J. Pathol., 158: 1639-1651) ujawnili, że te białka ulegały nadekspresji w tkankach raka komórek nerkowych.

Wynalazcy byli ponadto w stanie - między innymi - zidentyfikować ligandy, które pochodziły od ets-1 (NEFSLKGVDF, pozycja 86-95), alfa-kateiny (NEODLGIGY, pozycja 169-177) i galektyny 2 (SEVKFTVTF, pozycja 80-88).

Wynalazcy ponadto wyizolowali fragment YYMIGEOKF (sekwencja ID NR 79), który pochodzi od enzymu nikotynamido-N-metylotransferazy (pozycja 203-211). Takahashi i wsp., Gene expression profiling of elear cell renal cell carcinoma: gene Identification and prognostic classification, 2001, Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 98: 9754-9749, ujawnili, że ten enzym ulegał nadekspresji w raku komórek nerkowych.

Nieoczekiwanie, wynalazcy byli w stanie wykryć cytotoksyczne limfocyty T specyficzne dla jednego ze zidentyfikowanych peptydów we krwi dawcy. Zatem, możliwe jest indukowanie odpowiedzi CTL specyficznej przeciwko nowotworom.

Wynalazcy byli w stanie pokazać we własnych doświadczeniach, że poprzez zastosowanie dwóch przykładowo wybranych peptydów można wytworzyć in vivo cytotoksyczne limfocyty T (CTL), które były specyficzne dla peptydów mających sekwencję ID NR 1 (fragment protoonkogenu c-met lub peptyd c-met) lub specyficzne dla peptydu mającego sekwencję ID NR 2 (fragment adypofiliny lub peptyd adypofilinowy). Te CTL były w stanie specyficznie zabijać komórki nowotworowe, które wykazywały ekspresję odpowiednich białek i które pochodziły od różnych linii komórek nowotworowych różnych pacjentów.

Wynalazcy ponadto mogli pokazać, że przez wspomniane CTL mogły ulec lizie, na przykład, komórki dendrytyczne, do których zostały wcześniej przyłączone (naniesione) odpowiednie peptydy. Wynalazcy pokazali tymi doświadczeniami, że ludzkie komórki T można aktywować in vitro poprzez zastosowanie peptydów według wynalazku, jako epitopów. Wynalazcy mogli nie tylko pokazać, że CTL, które otrzymano z monojądrzastych komórek krwi obwodowej (PBMNC, ang. periphieral blood mononuclear cells) pacjenta i które były specyficzne dla pewnego peptydu, były w stanie zabijać komórki tego samego rodzaju nowotworu u innego pacjenta. Wynalazcy ponadto pokazali, że nawet komórki innych rodzajów nowotworów mogły ulec lizie przez te CTL.

PL 211 158 B1

W korzystnym wykonaniu, do stymulacji odpowiedzi immunologicznej można zastosować, także, peptydy, które obejmują sekwencję SEK ID NR 4, i w których sekwencji przynajmniej jeden aminokwas można zastąpić innym aminokwasem o podobnych właściwościach chemicznych.

Odnośnie odpowiednich podtypów MHC, są to, na przykład, aminokwasy kotwiczące, które można zastąpić aminokwasem o podobnych właściwościach chemicznych. Na przykład, w peptydach, które są związane z podtypem MHC HLA-A*02, leucynę w pozycji 2 można zastąpić izoleucyną, waliną lub metionina i vice versa, a leucynę na C-końcu waliną, izoleucyną i alaniną, które wszystkie zawierają niepolarne łańcuchy boczne.

Ponadto, możliwe jest zastosowanie peptydów mających sekwencję ID NR 4, która obejmuje przynajmniej jeden dodatkowy aminokwas na N- lub C-końcu, lub z sekwencji, której można przynajmniej jeden aminokwas usunąć.

Ponadto, można zastosować peptydy mające sekwencję ID NR 4, która obejmuje przynajmniej jeden aminokwas chemicznie zmodyfikowany.

Zmieniający(e) się aminokwas(y) jest (są) wybrany(e) w ten sposób, że zmiana nie wpływa na immunogeniczność peptydu, to znaczy peptyd wciąż wykazuje podobne powinowactwo wiązania się z czą steczki MHC i zdolność do stymulowania komórek T.

Według wynalazku peptyd można zastosować do leczenia chorób nowotworowych i/lub chorób gruczolakowatych.

Choroby nowotworowe, które mają być leczone, obejmują, na przykład, raka nerek, piersi, trzustki, żołądka, jąder i/lub skóry. Lista chorób nowotworowych ma być jedynie przykładem i nie powinna ograniczać zakresu zastosowania.

Wynalazcy byli w stanie pokazać, we własnych doświadczeniach, że peptydy według wynalazku są odpowiednie do takiego zastosowania. Zatem, pokazano, że przez specyficznie wytworzone CTL, które były specyficzne dla pewnych peptydów, mogą być skutecznie i selektywnie zabijane komórki nowotworowe.

Do zastosowania antygenów związanych z nowotworem w szczepionce przeciwnowotworowej jest, co jest regułą ogólną, kilka możliwych postaci aplikacji. Tighe i wsp., 1998, Gene vaccination: plasmid DNA is more than just a blueprint, Immunol. Today 19(2):89-97, pokazali, że antygen można podawać albo jako białko rekombinowane z odpowiednimi adiuwantami lub systemami nośników, albo - w wektorach plazmidowych - jako cDNA kodują cy antygen. W tych drugich przypadkach, aby indukować odpowiedź immunologiczną, antygen musi być przetworzony i prezentowany przez komórki prezentujące antygen (APC) w organizmie pacjenta.

Melief i wsp., 1996, Peptide-based cancer vaccines, Curr. Opin. Immunol. 8:651-657, pokazali dalszą możliwość, tj. zastosowanie syntetycznych peptydów jako szczepionki.

W korzystnym wykonaniu peptyd moż na zastosować z dodatkiem adiuwantów lub sam.

Jako adiuwant można zastosować na przykład czynnik stymulujący tworzenie się kolonii granulocytów i makrofagów (GM-CSF, ang. granulocyte-macrophage-colony-stimulating-factor).

Dalszymi przykładami takich adiuwantów są wodorotlenek glinu, emulsje z olei mineralnych, takie jak adiuwanty Freunda, saponiny i związki silikonowe.

Zastosowanie adiuwantów jest korzystne, ponieważ można zwiększyć odpowiedź immunologiczną indukowaną przez peptyd i/lub można stabilizować peptyd.

W innym korzystnym wykonaniu podaje się peptyd zwią zany z komórką prezentują c ą antygen.

Ten etap jest korzystny, ponieważ peptydy można prezentować układowi odpornościowemu, w szczególnoś ci cytotoksycznym limfocytom T (CTL). W ten sposób CTL mogą identyfikować i specyficznie zabijać komórki nowotworowe. Na przykład, komórki dendrytyczne, monocyty lub limfocyty B są odpowiednie do tego celu, jako komórki prezentujące antygen.

W tym celu do komórek, na przykł ad, przyłącza się ex vivo peptydy. Z drugiej strony, komórki można transfekować przy użyciu DNA lub odpowiadającego mu RNA kodującego peptydy w tym celu, aby peptydy ulegały ekspresji na komórkach.

Wynalazcy byli w stanie pokazać, we własnych doświadczeniach, że do komórek dendrytycznych (DC) można by przyłączyć specyficzne peptydy i że te naładowane komórki dendrytyczne aktywowały specyficzne dla peptydu CTL. To oznacza, że układ odpornościowy można stymulować w celu wytworzenia CTL skierowanych przeciwko nowotworom, które wykazują ekspresję odpowiednich peptydów.

Komórki prezentujące antygen niosące peptyd można zastosować albo w sposób bezpośredni, albo można je aktywować przed użyciem białkiem szoku cieplnego gp96. To białko szoku cieplnego indukuje ekspresję cząsteczek MHC klasy I i współstymuluje cząsteczki takie jak B7 i, w dodatku,

PL 211 158 B1 stymuluje wytwarzanie cytokin. W ten sposób indukcja odpowiedzi immunologicznych jest razem wziąwszy wzmocniona.

W innym korzystnym wykonaniu peptydy stosuje się w celu znakowania leukocytów, w szczególności limfocytów T.

To zastosowanie jest korzystne, jeśli stosuje się peptydy w celu wykrycia, w populacji CTL, CTL specyficznie skierowanych przeciwko peptydom.

Peptyd można dalej zastosować, jako znacznik do oszacowania przebiegu terapii choroby nowotworowej.

Peptyd można także zastosować do monitorowania terapii w innych immunizacjach lub terapiach. W ten sposób peptyd można nie tylko zastosować w sposób terapeutyczny, ale także w sposób diagnostyczny.

W dalszym wykonaniu stosuje się peptydy do wytworzenia przeciwciała.

Przeciwciała poliklonalne można otrzymać, w ogólny sposób, przez immunizację zwierząt z zastosowaniem wstrzyknięcia peptydów i następującego później oczyszczania immunoglobuliny.

Przeciwciała monoklonalne można wytworzyć według standardowych protokołów, na przykład, jak to opisano w Methods Enzymol. (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies.

W dalszym aspekcie wynalazek dotyczy kompozycji farmaceutycznej zawierającej jeden lub więcej peptydów.

Tę kompozycję można na przykład podawać pozajelitowe, na przykład, podskórnie, doskórnie lub domięśniowo, lub można ją podawać doustnie. W tym celu peptydy rozpuszcza się lub zawiesza w farmaceutycznie akceptowanym nośniku, korzystnie wodnym nośniku. Kompozycja może ponadto zawierać dodatki, na przykład bufory, środki wiążące, rozcieńczalniki itp.

Peptydy można także podawać razem z substancjami immunostymulującymi, na przykład cytokinami. Wyczerpujący opis dodatków, które można zastosować w kompozycji tego rodzaju, jest podany, na przykład, w A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, wyd. trzecie, 2000, American Pharmaceutical Association i w czasopismach farmaceutycznych.

Kompozycję można zastosować do zapobiegania, profilaktyki i/lub terapii chorób nowotworowych i/lub chorób gruczolakowatych.

Kompozycję farmaceutyczną zawierającą peptyd mający sekwencję ID NR 4 podaje się pacjentowi, który cierpi na chorobę nowotworową, z którą jest związany odpowiedni peptyd lub antygen. Tym samym można indukować odpowiedź immunologiczną specyficzną dla nowotworu na podstawie CTL specyficznych dla nowotworu.

Ilością peptydu lub peptydów obecnych w kompozycji farmaceutycznej jest terapeutycznie skuteczna ilość. W związku z tym, peptydy zawarte w kompozycji mogą wiązać się z przynajmniej dwoma różnymi typami HLA.

Niniejszy wynalazek dotyczy, w dalszym aspekcie, cząsteczek kwasów nukleinowych kodujących peptydy o sekwencji ID NR 4.

Cząsteczki kwasów nukleinowych mogą stanowić cząsteczki DNA lub RNA i można je również zastosować do terapii immunologicznej raka. Tym samym peptyd ulegający ekspresji przez cząsteczkę kwasu nukleinowego indukuje odpowiedź immunologiczną przeciwko komórkom nowotworowym, które wykazują ekspresję peptydu.

Według wynalazku cząsteczki kwasu nukleinowego mogą być dostarczone na wektorze.

Wynalazek ponadto dotyczy komórki zmodyfikowanej genetycznie przy użyciu cząsteczki kwasu nukleinowego tak, aby komórka wytwarzała peptyd mający sekwencję ID NR 4.

W tym celu komórki transfekuje się DNA lub odpowiadającym mu RNA kodującym peptydy, przez co komórki wykazują ekspresję peptydów na powierzchni komórkowej. W tym celu, jako komórki prezentujące antygen odpowiednie są na przykład komórki dendrytyczne, monocyty lub limfocyty B.

Zrozumiały będzie fakt, że indywidua wymienione powyżej i indywidua, które będą jeszcze wyjaśnione poniżej, można zastosować nie tylko w tych kombinacjach, które są w każdym wypadku wyszczególnione, ale także w innych kombinacjach lub same bez wykraczania poza zakres niniejszego wynalazku.

Wykonania według wynalazku są przedstawione i wyjaśnione na poniższych rysunkach).

Fig. 1 pokazuje wykrywanie limfocytów T CD8⁺ specyficznych dla keratyny 18;

Fig. 2a-d pokazują indukcję odpowiedzi CTL in vitro, specyficznych dla peptydu c-Met (SEK ID NR 1), fig. 2a+b, lub peptydu adypofiliny (SEK ID NR 2), Fig. 2c+d;

PL 211 158 B1

Fig. 3a-f pokazują specyficzną dla antygenu lizę linii komórek nowotworowych, wykazujących ekspresję c-Met lub adypofiliny, za pośrednictwem peptydu c-Met (SEK ID NR 1), fig. 3a-d, lub peptydu adypofiliny (SEK ID NR 2), Fig. 3e-f, które to peptydy indukują CTL;

Fig. 4a-c pokazują oznaczenia hamowania lizy w znakowanych ⁵¹Cr komórkach nowotworowych i nieznakowanych komórkach, do których dodano T2, za pośrednictwem peptydu c-Met (SEK ID NR 1), fig. 4a+b, lub peptydu adypofiliny (SEK ID NR 2), fig. 4c, które to peptydy indukują CTL;

Fig. 5a+b pokazują lizę autologicznej komórki dendrytycznej transfekowanej nowotworowym RNA za pośrednictwem peptydu c-Met (SEK ID NR 1), fig. 5a, lub peptydu adypofiliny (SEK ID NR 2), fig. 5b, które to peptydy indukują CTL; Fig. 6 pokazuje, że autologiczne CTL specyficzne dla adypofiliny indukowane in vitro rozpoznają autologiczne komórki nowotworowe pacjenta z przewlekłą białaczką limfatyczną, ale nie komórki autologiczne dendrytyczne lub B.

P r z y k ł a d 1

1.1 Próbki od pacjentów

Próbki od pacjentów mających histologicznie potwierdzonego raka komórek nerek uzyskano z oddziału urologicznego. Uniwersytetu w Tiibingen. Obydwaj pacjenci nie byli poddani terapii przedoperacyjnej. Pacjent nr 1 (poniżej określany RCC01) posiadał następujące typy HLA: HLA-A*02 A*68 B*18 B*44; pacjent nr 2 (poniżej określany RCC13) HLA-A*02 A*24 B*07 B*40.

1.2 Izolacja peptydów związanych z MHC klasy I

Gwałtownie zamrożone próbki nowotworów przetwarzano, jak to opisano w Schirle, M. i wsp., Identification of tumor-associated MHC-class I ligands by a novel T cell-independent approach, 2000, European Journal of Immunology, 30:2216-2225. Peptydy Izolowano zgodnie ze standardowymi protokołami przy użyciu przeciwciała monoklonalnego W6/32 specyficznego dla HLA klasy I lub przeciwciała monoklonalnego BB7.2 specyficznego dla HLA-A2. Wytwarzanie i wykorzystanie tych przeciwciał jest opisane przez Barnstable'a, C.J. i wsp., Production of monoclonal antibodies to group A erythrocytes, HLA and other human cell surface antigens - New Tools for genetic analysis, 1978, Cell, 14:9-20 oraz Parhama, P. & Brodsky'ego, F.M., Partial purification and some properties of BB7.2. A cytotoxic monoclonal antibody with specificity for HLA-A2 and a variant of HLA-A28, 1981, Hum. Immunol., 3:277-299.

1.3 Spektrometria masowa

Peptydy z tkanki nowotworowej pacjenta RCC01 wydzielono przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami (SMART-system, μRPC C2/C18 SC 2.1/19, Amersham Pharmacia Biotech), a frakcje analizowano przy użyciu nanoESI MS. W tym celu postępowano, jak to opisano w Schirle, M. i wsp., Identification of tumor-associated MHC class I ligands by a novel T cell-independent approach, 2000, European Journal of Immunology, 30:2216-2225.

Peptydy z tkanki nowotworowej pacjenta RCC13 identyfikowano przy użyciu współbieżnej kapilarnej LC-MS, jak to wspomniano powyżej, z małymi modyfikacjami: Naniesiono objętości próbek około 100 pl, odsolone je i wstępnie zatężono na μ-prekolumnie 300 μm * 5 mm C18 (LC packings). Pompka wstrzykująca (PHD 2000, Harvard Apparatus, Inc.) wyposażona w gazoszczelną strzykawkę 100 μl (1710 RNR, Hamilton), dostarczała rozpuszczalnik i próbkę z prędkością 2 μl/min. W celu oddzielenia peptydu podłączono kolumnę wstępnie zatężającą do kolumny 75 μm * 250 mm C-18 (LC packings). Następnie zastosowano gradient dwuskładnikowy 25% - 60% B w ciągu 70 min, stosując prędkość przepływu 12 pl/min, zmniejszoną do około 300 μl/min na prekolumnie, przy użyciu części TEE (ZT1C, Valco) i kolumny 300 pi * 150 mm C-18.

Zawsze dodatkowo włączano pusty przebieg, aby upewnić się, czy układ jest wolny od pozostałości peptydów. Przeprowadzono współbieżną fragmentację, jak to opisano, a fragment widma analizowano ręcznie. Przeszukiwanie baz danych (NCBInr, EST) wykonano przy użyciu MASCOT (http://www.matrixscience.com).

1.4 Identyfikacja 77 ligandów MHC klasy I z tkanek nowotworowych pacjenta RCC01

W załączonej Tabeli 1 wymienione są ligandy, które były związane z HLA-A*02, HLA-A*68, HLAB*18 lub HLA-BM4. Peptydy, które wiążą się z HLA-A*02, odzwierciedlały specyficzny dla allelu motyw peptydowy: W pozycji 2 leucyna, walina, izoleucyną, alanina lub metionina, a na C-końcu leucyna, walina, izoleucyną lub alanina. Większość ligandów pochodziła od tak zwanych białek metabolizmu podstawowego, ale można było także wykryć ligandy od białek o opisanych związkach z nowotworem.

Ligandy HLA-A*68 zidentyfikowano poprzez ich aminokwas kotwiczący treoninę, izoleucynę, walinę, alaninę lub leucynę w pozycji 2 i argininę lub lizynę na C-końcu. To wskazywało na podtyp HLA-A*6801. Pośród peptydów prezentowanych przez HLA-A*68 znaleziono dwa inne ligandy od adypofiliny,

PL 211 158 B1

MTSALPEIOK i MAGDIYSVFR, a ponadto ETIPLTAEKL pochodzący od związanej z nowotworem cykliny D1. Peptyd TIVNILTNR pochodzi od aneksyny II, które to białko udowodniono, że jest immunogenne w powiązaniu z MHC klasy II u pacjentów z czerniakiem (zobacz Heinzel i wsp., The self peptide annexin II (208-223) presented by dendritic cells sentisizes autologous CD4+ T-lymphocytes to recognize melanoma cells, 2001, Cancer Immunol. Immunother. 49:671-678). Dalsze ligandy niosły kwas glutaminowy w pozycji 2, który jest aminokwasem kotwiczącym podtypu HLA-B*44. Ponieważ motyw peptydowy HLA-B*18 jest nieznany, rozróżnienie pomiędzy Ugandami tych dwóch cząsteczek HLA-B nie było możliwe.

1.5 Ligandy MHC klasy I z tkanki nowotworowej pacjenta RCC13

W tej tkance nowotworowej także można było zidentyfikować te same ligandy, które zostały zidentyfikowane u pacjenta RCC01 i które pochodziły od protoonkogenu met (c-Met) i keratyny 18: peptydy mające sekwencję ID NR 1 i 3. Dodatkowo, można było uzyskać z tej tkanki nowotworowej dalsze ligandy: Można było zidentyfikować ligand, który pochodzi od nikotynamido-N-metylotransferazy (NNMT); ten gen ulega nadekspresji w ponad 95% wszystkich raków nerek. Ponadto, niektóre inne ligandy pokrywają się z repertuarem peptydów z RCC01. 1.6 Wykrywanie specyficznych) dla keratyny 18 komórek T w repertuarze zdrowych komórek T CD8*.

Monojądrzaste komórki krwi obwodowej od zdrowych pacjentów wybarwiono tetramerami HLA-A*0201, które fałdowały się z peptydami adypofiliny, keratyny 18 lub protoonkogenu met (c-Met): W celu wytworzenia tetramerów fałdowano in vitro rekombinowane cząsteczki HLA-A*0201 z peptydami SVASTITGV (SEK ID NR 2, adypofilina), ALLNIKYKL (SEK ID NR 3, keratyna 18) lub YVDPVITSI (SEK ID NR 1, protoonkogen met, c-Met), oczyszczonymi przy użyciu filtracji na żelu, biotynylowanymi i zmieszanymi ze streptawidyną w celu połączenia monomerów.

Nieoczekiwanie, w czterech z 22 zdrowych osobników odkryto znaczącą populację limfocytów T CD8⁺ specyficznych dla keratyny 18. Na fig. 1 pokazane są wyniki podwójnego barwienia w postaci wykresów punktowych, przy czym w środkowym rzędzie pokazane są wyniki barwienia keratyną 18. Pomiędzy 0,02 a 0,2% CD8⁺ - dodatnich komórek T było specyficznych dla keratyny 18. Jak można zobaczyć w niższym rzędzie wykresu punktowego, wiązanie tetrameru keratyny 18 było specyficzne.

P r z y k ł a d 2

W celu analizy prezentowania peptydów o SEK ID NR 1 (YVDPVITSI) (fragment peptydu protoonkogenu c-Met) i SEK ID NR 2 (fragment peptydu adypofiliny) przez komórki nowotworowe i ich rozpoznawania przez CTL, indukowano in vitro CTL, które były specyficzne dla peptydu adypofiliny (SEK ID NR 2). W tym celu zastosowano komórki dendrytyczne (DC, ang. dendritic cells) pochodzące od zdrowych dawców HLA-A*02-dodatnich.

2.1 Wytwarzanie DC

Monojądrzaste komórki krwi obwodowej (PBMNC) izolowano przy użyciu wirowania w gradientach gęstości Ficoll/Paque (Biochrom, Berlin, Niemcy) heparynizowanej krwi uzyskanej z preparatów górnej warstwy skrzepu krwi zdrowych ochotników z banku krwi Uniwersytetu w Tiibingen. Komórki wysiano (1 x 10⁷ komórek/3 ml na studzienkę) w 6-studzienkowych płytkach (Falcon, Heidelberg, Niemcy) w pożywce RP10 (RPMI 1640 z dodatkiem 10% inaktywowanej ogrzewaniem cielęcej surowicy płodowej i antybiotyków). Po 2 godzinach inkubacji w 37°C i 5% CO2, usunięto komórki nieprzylegające, a przylegające monocyty krwi hodowano w pożywce RP10 z dodatkiem następujących cytokin: ludzkiego rekombinowanego GM-CSF (czynnik stymulujący tworzenie się kolonii granulocytów i makrofagów; Leukomax, Novartis; 100 ng/ml), interleukiny IL-4 (R&D Systems, Wiesbaden, Niemcy, 1000 lU/ml) i TNF-α (czynnika a martwicy nowotworów) (R&D Systems, Wiesbaden, Niemcy, 10 ng/ml).

2.2 Synteza peptydów

Przykładowo, dwa peptydy wiążące się z HLA-A*02 (c-Met (SEK ID NR 1, YVDPVITSI) lub adypofiliny (SEK ID NR 2, SVASTITGV), które zidentyfikowano, jak to opisano powyżej) zsyntetyzowano przy użyciu standardowych technik chemicznych F-moc w urządzeniu do syntezy peptydów (432A, Applied Biosystems, Weiterstadt, Niemcy) i analizowano przy użyciu HPLC z odwróconymi fazami oraz spektrometrii masowej. W ten sposób wytworzono wystarczające ilości zidentyfikowanych peptydów.

2.3 Indukcja odpowiedzi CTL specyficznej dla antygenu przy użyciu ograniczonych do HLA-A*02 syntetycznych peptydów

W celu indukcji CTL do otrzymanych w etapie 2.1 DC (5 x 10⁵) dodano peptydy uzyskane w etapie 2.2 o SEK ID NR 1 lub SEK ID NR 2, każdy w stężeniu 50 μg/ml, na 2 godziny, przemyto i inkubowano z 2,5 x 10⁶ autologicznych PBMNC w pożywce RP10.

PL 211 158 B1

Po 7 dniach hodowli komórki ponownie stymulowano autologicznymi PBMNC z dodanymi peptydami. W tym celu dodano 1 ng/ml ludzkiej rekombinowanej interleukiny IL-2 (R&D Systems) w dniu

1, 3 i 5. Aktywność cytolityczną w ten sposób stymulowanych CTL analizowano w dniu 5 po ostatniej ponownej stymulacji przy użyciu standardowego oznaczenia uwalniania ⁵¹Cr (zobacz poniżej, pod 2.4:

oznaczenie CTL).

2.4 Oznaczenie CTL

W oznaczeniu CTL, jako komórki docelowe stosowano komórki nowotworowe, komórki różnych linii komórkowych, do których dodano peptyd, i autologiczne DC. Do komórek, do których dodano peptyd, dodano 50 μg/ml peptydu (SEK ID NR 1 lub SEK ID NR 2) na 2 godziny. Wszystkie komórki docelowe wyznakowano chromianem sodu [⁵¹Cr] w RP10 (RPMI 1640 z dodatkiem 10% inaktywowanej ogrzewaniem cielęcej surowicy i antybiotyków) przez 1 godzinę w 37°C. Następnie, przeniesiono 10⁴komórek/studzienkę na 96-studzienkową okrągłodenną płytkę. Dodano różne liczby CTL tak, aby otrzymać końcową objętość 200 μΐ i inkubowano przez 4 godziny w 37°C. Na końcu oznaczeń zebrano supernatanty (50 μΐ/studzienkę) i policzono w liczniku płytkowym promieniowania beta. Procent specyficznej lizy obliczono jako: 100 x (uwalnianie w doświadczeniu - spontaniczne uwalnianie/maksymalne uwalnianie - spontaniczne uwalnianie). Spontaniczne i maksymalne uwalnianie określono w obecności, odpowiednio, albo pożywki, albo 2% Triton X-100.

2.5 Wyniki indukcji CTL

a) Aktywność cytotoksyczna CTL przeciwko DC, do których dodano peptyd

Na fig. 2 pokazane są wyniki oznaczania uwalniania ⁵¹Cr (zobacz pod 2.4) w odniesieniu do aktywności cytotoksycznej indukowanych CTL (zobacz pod 2.3) przeciwko komórkom T2 lub DC. Linia komórkowa T2 jest HLA-A*02-dodatnia i ma niedobór TAP (przenośnika związanego z obróbką antygenu, ang. transporter associated with antigen processing); (przenośnik TAP-peptyd transportuje fragmenty peptydu antygenu białkowego z cytozolu do siateczki wewnątrzplazmatycznej, gdzie wiążą się one z cząsteczkami IVIHC).

Na fig. 2a i 2b pokazana jest aktywność cytotoksyczna CTL indukowanych peptydem o SEK ID NR 1 przeciwko komórkom T2 i DC, do obydwóch typów komórek wcześniej dodano peptydu (c-Met) o SEK ID NR 1 (wypełnione kwadraty) lub peptydu kontrolnego (surwiwiny (= „Sv”; ELTLGEFLKL; SEK ID NR 80) lub HIV (ILKEPVHGV; peptyd odwrotnej transkryptazy Pol. HIV-1, pozycje 476-484; SEK ID NR 81). Na fig. 2c i 2d pokazana jest aktywność cytotoksyczna CTL indukowanych peptydem o SEK ID NR 2 przeciwko komórkom T2 lub DC, do których wcześniej dodano peptyd (adypofiliny) o SEK ID NR 2.

Specyficzna liza, którą pokazano w uwalnianiu ⁵¹Cr, jest przedstawiona na fig. 2a - 2d, jak również na diagramach lizy CTL na fig. 3-5, względem różnych stosunków komórek efektorowych (CTL) do docelowych (znakowanych ⁵¹Cr komórek, które mają ulec lizie).

Jak można zobaczyć na fig. 2a - 2d, można było pokazać specyficzne dla antygenu zabijanie komórek przy użyciu linii komórkowej CTL, która została wytworzona po 2-tygodniowej ponownej stymulacji: Przy zwiększaniu ilości CTL lizie ulegały tylko komórki, które prezentowały albo peptyd c-Met o SEK ID NR 1 (fig. 2a i 2b) lub peptyd adypofiliny o SEK ID NR 2 (fig. 2c i 2d) (zobacz, odpowiednio, na fig. 2a - 2d krzywe z wypełnionymi kwadratami); podczas gdy komórki kontrolne, do których dodano peptydy kontrolne, nie ulegały lizie (krzywe z pustymi kwadratami). Tym samym można było przedstawić specyficzność aktywności cytotoksycznej.

b) Aktywność cytotoksyczna CTL przeciwko nowotworowym liniom komórkowym

Następnie testowano, znów przy użyciu standardowych oznaczeń uwalniania ⁵¹Cr w nowotworach, czy CTL specyficzne dla peptydu c-Met o SEK ID NR 1 lub dla peptydu adypofiliny o SEK ID NR 2 rozpoznawały i przeprowadzały lizę komórek nowotworowych, które w sposób endogenny wykazują ekspresję protoonkogenu c-Met lub adypofiliny.

W tym celu zastosowano następujące linie komórkowe, znakowane ⁵¹Cr, HLA-A*02-dodatnie: HCT 116 (rak okrężnicy; uzyskana od prof. G. Pawelca, Tiibingen, Niemcy), A 498, MZ 1257 i MZ 1774 (rak komórek nerkowych, uzyskana od prof. A. Knutha, Frankfurt, Niemcy), MCF-7 (rak piersi; uzyskana z ATCC, Amerykańskiego Zbioru Typów Hodowlanych), Mel 1479 (czerniak złośliwy; uzyskana od prof. G. Pawelca, Tiibingen, Niemcy) i U 266 (szpiczak mnogi; uzyskana od prof. G. Pawelca, Tiibingen, Niemcy). Te linie komórkowe wykazują ekspresję protoonkogenu c-Met i adypofiliny jako struktur docelowych („celów”).

W doświadczeniach, jako kontrolę negatywną stosowano CEBV (unieśmiertelniona wirusem Epstein-Barra linia komórek B Croft, HLA-A*01-dodatnia; uzyskana od O.J. Finn, Pittsburgh, USA)

PL 211 158 B1 i linię komórkową SK-OV-3 (rak jajnika; HLA-A*03-dodatnia; uzyskana od O.J. Finn, Pittsburgh, USA).

Komórki K 562 (na przykład dostępne z Niemieckiego Zbioru Mikroorganizmów i Hodowli Komórkowych DSMZ; ACC 10) stosowano, aby określić aktywność naturalnych komórek cytotoksycznych (NK, ang. natural killers), ponieważ ta linia komórkowa jest wysoce wrażliwa na te komórki zabijające.

Wszystkie komórki hodowano w pożywce RP10 (RPMI 1640 z dodatkiem 10% inaktywowanej ogrzewaniem cielęcej surowicy płodowej i antybiotyków).

Oznaczenia uwalniania ⁵¹Cr (zobacz pod 2.4) przeprowadzono, jak to opisano powyżej, z wyżej wspomnianymi liniami komórek nowotworowych i indukowanymi CTL.

Fig. 3a - 3f pokazują wyniki tych oznaczeń CTL, przy czym na fig. 3a - 3d zastosowano CTL, które były indukowane przy użyciu peptydu c-Met o SEK ID NR 1, a na fig. 3e - 3f zastosowano CTL, które były indukowane przy użyciu peptydu adypofiliny o SEK ID NR 2.

Jak można zobaczyć na fig. 3a - 3f, CTL specyficzne dla peptydu c-Met o SEK ID NR 1 (fig. 3a - 3d) lub specyficzne dla peptydu adypofiliny o SEK ID NR 2 (fig. 3e - 3f) były w stanie skutecznie przeprowadzać lizę komórek nowotworowych) wykazujących ekspresję zarówno HLA-A*02, jak i c-Met lub adypofiliny (to znaczy na fig. 3a linia komórkowa HCT 116, na fig. 3b linia komórkowa A 498, na fig. 3c linie komórkowe MZ 1257 i MEL 1479, a na fig. 3d linie komórkowe MCF-7 i U 266; na fig. 3e linie komórkowe A 494, U 266 i MCF-7, na fig. 3f linie komórkowe MZ 1774, Mel 1479 i MZ 1257). Specyficzną lizę zmierzono - jak wspomniano pod 2.4 - poprzez uwalnianie ⁵¹Cr. Nie było żadnej lizy linii komórek kontrolnych SK-OV-3 (HLA-A*02-ujemne), ani poprzez CTL, które były indukowane peptydem o SEK ID NR 1, ani przez CTL, które były indukowane peptydem o SEK ID NR 2. Zatem, można było pokazać, że obydwa peptydy muszą być prezentowane na komórkach nowotworowych w powiązaniu z cząsteczkami HLA-A*02, aby skutecznie przeprowadzać lizę komórek docelowych. Ponadto, w ten sposób udowodniono specyficzność dla antygenu i ograniczenie do MHC CTL.

Komórki CTL indukowane in vitro peptydem mającym SEK ID NR 1 nie rozpoznają linii komórkowej K562 (zobacz fig. 3a, 3b i 3d), co wskazuje na to, że aktywność cytotoksyczna nie odbywa się za pośrednictwem komórek naturalnych zabójców (NK).

c) Oznaczenia inhibicji

W celu dalszej weryfikacji specyficzności dla antygenu i ograniczenia do MHC indukowanych in vitro CTL, przeprowadzono oznaczenia inhibicji z inhibitorowymi liniami komórkowymi nieznakowanymi ⁵¹Cr („zimnymi”).

W tym celu analizowano zdolność linii komórek, do których dodano peptyd, do hamowania lizy komórek nowotworowych (oznaczenie kompetycyjne). W tym celu zastosowano nadmiar inhibitora (to znaczy nadmiar komórek, do których dodano nieznakowanej substancji). Stosunek inhibitora (komórek, do których dodano peptyd) do komórek docelowych (komórek nowotworowych) wynosił 20:1.

Kiedy linie komórek inhibitorowych uległy lizie, nie uwalniał się żaden ⁵¹Cr, ponieważ linie komórek inhibitorowych nie były znakowane.

Jako inhibitor stosowano linię komórkową 12 (HLA-A*02; z niedoborem TAP; zobacz pod 2.5.a)). Przed oznaczeniem, do tej linii komórkowej T2 dodano, odpowiednio, odpowiedniego peptydu (SEK ID NR 1 lub 2) lub niezwiązanego z doświadczeniem peptydu kontrolnego (surwiwiny (= Sv), SEK ID NR 80).

Wyniki tych oznaczeń są pokazane na fig. 4a - 4c, przy czym na fig. 4a i 4b zastosowano CTL, które były indukowane peptydem c-Met (SEK ID NR 1), a na fig. 4c zastosowano CTL, które były indukowane peptydem adypofiliny (SEK ID NR 2).

Na fig. 4a i 4b testowano lizę znakowanych ⁵¹Cr linii komórkowych U 266 i A 498 bez linii komórek inhibitorowych (zobacz krzywa z wypełnionymi kwadratami); lizę z linią komórek inhibitorowych T2, do których dodano peptydu kontrolnego (surwiwiny; SEK ID NR 80; kontrola negatywna, krzywa z wypełnionymi trójkątami); lizę z linią komórek inhibitorowych T2, do których dodano peptydu c-Met o SEK ID NR 1 (krzywa z pustymi rombami).

Można pokazać lizę poprzez CTL komórek nowotworowych bez komórek inhibitorowych (zobacz na fig. 4a - 4d, odpowiednio, krzywe z wypełnionymi kwadratami). Ponadto, jak można zobaczyć na fig. 4a i 4b, podczas stosowania nadmiaru inhibitorowych komórek docelowych komórki nowotworowe nie uległy lizie (i nie było uwalniania ⁵¹Cr), jeśli do inhibitorowych komórek docelowych dodano peptyd c-Met o SEK ID NR 1 (zobacz, odpowiednio, krzywe z symbolami pustych rombów). Aktywność CTL była skierowana przeciwko nadmiarowi nieznakowanych komórek T tak, że te komórki, a nie komórki nowotworowe uległy lizie. Komórki T2, do których dodano peptyd kontrolny (odpowiednio surwiwiny; SEK ID NR 80), nie były zdolne do hamowania lizy komórek nowotworowych przez CTL tak, że można było zmierzyć uwalnianie ⁵¹Cr (zobacz na fig. 4a i 4b krzywe z wypełnionymi trójkątami).

PL 211 158 B1

Można pokazać podobny efekt, kiedy się zastosuje CTL indukowane peptydem adypofiliny o SEK ID NR 2 (zobacz fig. 4c):

Ograniczenie do MHC i specyficzność dla antygenu aktywności cytotoksycznej indukowanych przy użyciu adypofiliny CTL można pokazać poprzez zastosowanie przeciwciała monoklonalnego specyficznego dla HLA-A*02 i poprzez oznaczenie inhibicji z nieznakowanym („zimnym”) inhibitorem: Wyniki tego doświadczenia są pokazane na fig. 4c. Komórki nowotworowe A 498 zablokowano, kiedy zastosowano przeciwciało specyficzne dla HLA-A*02 (przeciwciało monoklonalne BB7.2, lgG2b, uzyskane od

S. Stefanovica, Tiibingen) tak, że nie ulegały one lizie poprzez dodanie CTL i nie było uwalniania ⁵¹Cr (zobacz fig. 4c krzywa z symbolami wypełnionych trójkątów). Jako kontrolę zastosowano niespecyficzne przeciwciało, które nie blokowało cząsteczki HLA-A*02 (ChromPure Maus IgG, Dianova, Niemcy; zobacz na fig. 4c krzywa z wypełnionymi kwadratami). Przy tych oznaczeniach inhibicji, komórki inkubowano przez 30 min z 10 μg/ml przeciwciała przed wysianiem ich na 96-studzienkowe płytki.

Ponadto, można było pokazać, że linia komórek współzawodniczących T2, do których dodano peptydu kontrolnego surwiwiny (SEK ID NR 80) (T2/SV), nie była w stanie hamować lizy linii komórek nowotworowych A 498 indukowanej CTL (zobacz na fig. 4c krzywa z wypełnionymi kółkami), ale linia komórek inhibitorowych T2, do których dodano peptydu adypofiliny o SEK ID NR 2 (T2/AD) była w stanie hamować lizę linii komórek nowotworowych tak, że - ograniczając się do tego drugiego przypadku - nie można było zmierzyć żadnego uwalniania ⁵¹Cr (zobacz na fig. 4c krzywa z symbolami x).

d) Specyficzna liza transfekowanych DC

W następnym doświadczeniu była analizowana aktywność cytotoksyczna CTL w układzie autologicznym. W tym celu, jako komórki docelowe zastosowano autologiczne DC wytworzone z tych samych PBMNC, które wykorzystano do indukcji CTL (zobacz pod 2.2). Przed oznaczeniem CTL DC poddano elektroporacji RNA, który wcześniej został wyizolowany albo z linii komórek nowotworowych, albo który stanowi kontrolny RNA (ulegający transkrypcji in vitro EGFP-RNA, wzmocniony kompleksem zielone białko fluorescencyjne-RNA); plazmid: pSP64 Poli(A) EGFPII uzyskany od Van Tendeloo, Antwerpia, Belgia). Całkowity RNA komórek nowotworowych izolowano przy użyciu OIAGEN Rneasy Mini Kit (OIAGEN, Hilden, Niemcy) według protokołu producenta. Ilość i czystość RNA określono spektrometrycznie i przechowywano w małych ilościach w -80°C.

Przed elektroporacją w dniu 6 niedojrzałe DC przemyto dwa razy wolną od surowicy pożywką X-VIVO 20 (BioWhittaker, Walkersville, USA) i ponownie zawieszono przy końcowym stężeniu 2 x 10⁷komórek/ml. Następnie, 200 μΐ zawiesiny komórek zmieszano z 10 μg całkowitego RNA i poddawano elektroporacji w 4 mm kuwecie przy użyciu Easyject Plus™ (Peglab, Eriangen, Niemcy) (parametry: 300 V, 150 μF, 1540 Ω, czas pulsu 231 ms). Po elektroporacji komórki natychmiast przeniesiono do pożywki RP10 i ponownie wstawiono do inkubatora. Okazało się, że ponad 80% komórek było żywych po elektroporacji.

Wyniki tych doświadczeń są pokazane na fig. 5a i 5b. Na fig. 5a zastosowano CTL, które indukowano peptydem c-Met o SEK ID NR 1, na fig. 5b zastosowano CTL, które indukowano peptydem adypofiliny o SEK ID NR 2.

Po przeprowadzeniu oznaczenia CTL z CTL indukowanymi peptydem c-Met (SEK ID NR 1) (zobacz pod 2.4) można było zademonstrować specyficzną lizę DC, które zostały poddane elektroporacji RNA linii komórkowej A 498 wykazującej ekspresję adypofiliny (zobacz na fig. 5b krzywa z wypełnionymi trójkątami). Ponadto, lizie ulegały DC, do których dodano peptyd adypofiliny SEK ID NR 2 (zobacz na fig. 5b krzywa z wypełnionymi rombami). Z drugiej strony, DC, które zostały poddane elektroporacji kontrolnym RNA (EGFP) nie uległy lizie (zobacz na fig. 5b krzywa z pustymi trójkątami).

Zatem, można było pokazać, że - po transfekcji DC przy użyciu RNA komórek nowotworowych c-Met- lub adypofilinododatnich - zidentyfikowane peptydy, to znaczy peptyd c-Met o SEK ID NR 1 i peptyd adypofiliny o SEK ID NR 2, były przetwarzane i prezentowane.

e) Indukcja specyficznych dla adypofiliny CTL u pacjenta z przewlekłą białaczką limfatyczną

W dalszym doświadczeniu wytwarzano CTL z PBMNC pacjenta HLA-A*02-dodatniego z przewlekłą białaczką limfatyczną (CLL, ang. chronić lymphatic leukemia), które były specyficzne dla peptydu adypofiliny o SEK ID NR 2. Pacjent był w fazie remisji choroby po leczeniu fludarabiną. Ponadto, zastosowano autologiczne komórki CLL i DC tego pacjenta jako znakowane ⁵¹Cr komórki docelowe w oznaczeniu, w których uwalnianie ⁵¹Cr odbywa się za pośrednictwem CTL indukowanych peptydem.

Jak to pokazano na fig. 6, CTL indukowane peptydem skutecznie przeprowadzały lizę autologicznych DC z tego pacjenta, do których dodano peptyd adypofiliny o SEK ID NR 2 („DC + AD”), jak również autologicznych komórek CLL („komórki CLL”). DC, do których dodano peptydu kontrolnego

PL 211 158 B1 surwiwiny o SEK ID NR 80, - z drugiej strony - nie ulegały lizie („DC + SV”). Także niezłośliwe komórki B i linia komórkowa K 562 nie ulegała lizie przez CTL.

Specyficzność odpowiedzi CTL potwierdzono dalej w oznaczeniu hamowania komórek docelowych, przy użyciu linii komórkowej T2 (zobacz powyżej) jako komórek inhibitorowych, do których dodano, odpowiednio, peptyd adypofiliny o SEK ID NR 2 lub peptyd kontrolny surwiwinę o SEK ID NR 80. CTL indukowane peptydem adypofiliny o SEK ID NR 2 przeprowadzały lizę nadmiarowych inhibitorowych linii komórkowych, do których dodano związanego peptydu o SEK ID NR 2 tak, że komórki nowotworowe znakowane ⁵¹Cr nie ulegały lizie w tym przypadku (zobacz na fig. 6 krzywa z pustymi kwadratami).

W końcu, wynalazcy mogli pokazać, że zidentyfikowane peptydy stanowią obiecujące substancje w zakresie terapii immunologicznej wielu chorób (nowotworowych).

T a b e l a 1

	Sekwencja	Pozycja/Gen	Nr dostępu ACC	SEK ID NR
1	2	3	4	5
pacjent RCC01 HLA-A*02
1.	YVDPVITSI	654-662 protoonkogen met (ang. met proto-oncogen)	J02958	SEK ID NR 1
2.	SVASTITGV	129-137 białko związane z różnicowaniem się tkanki tłuszczowej (ang. adipose differentiation-related	X97324	SEK ID NR 2
3.	ALLNIKVKL	365-373 keratyna 18 (ang. keratin 18)	M26326	SEK ID NR 3
4.	ALFDGDPHL	1-9 KIAA0367	AB002365	SEK ID NR 4
5.	RLLDYWNI	679-687 hipotetyczne białko FLJ20004 (ang. hypothetical protein FLJ20004)	AB040951	SEK ID NR 5
6.	ALANGIEEV	101-109 apolipoprotelna L, 3 (ang. apolipoproteln L, 3)	AY014906	SEK ID NR 6
7.	QLIDKVWQL	593-601 białko SEC14 1 podobne do białka 8. cerevislae (ang. (S. cerevisiae)-like 1)	D67029	SEK ID NR 7
8.	ALSDLEITL	389-397 indukowane mitogenem białko 2 (ang. mitogen inducible 2)	Z24725	SEK ID NR 8
9.	ILDTGTIOL	174-182 gen specyficzny dla nerki i wątroby (ang. kidney- and liver-speclflc gene)	AB013094	SEK ID NR 9
10.	SLLGGDWSV	27-36 immunoreaktor, peptyd delta indukujący zasypianie (ang. delta sleep inducing peptide,	AF153603	SEK ID NR 10
11,	FLDGNELTL	167-175 wewnątrzkomórkowy kanał chlorkowy 1 (ang. chloride intracellular channel 1)	U93205	SEK ID NR 11
12.	NLLPKLH1V	179-187 wewnątrzkomórkowy kanał chlorkowy 1 (ang. chloride intracellular channel 1)	U93205	SEK ID NR 12
13.	ALASHLIEA	507-515 białko 2 zawierające domenę EH (ang. EH-domain containing 2)	AF181263	SEK ID NR 13
14.	SLYGGTITI	296-304 hipotetyczne białko FLJ11189 (ang. Hypothetical protein FLJ11189)	AK000697	SEK ID NR 14
15.	FLLDKKIGV	218-226 TCP1 zawierające chaperoninę, podjednostka 2 (beta) (ang. chaperonin containing	AF026166	SEK ID NR 15

PL 211 158 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5
16.	FLDGNEMTL	178-186 wewnątrzkomórkowy kanał chlorkowy 4 (ang. chloride intracellular channel 4)	AF097330	SEK ID NR 16
17.	AIVDKVPSV	147-155 białko płaszcza gamma-COP (ang. coat-protein gamma-cop)	AF100756	SEK ID NR 17
18.	DVASVIVTKL	241-250 cząsteczka 54 kD rozpoznawania sygnału (ang. signal recognition particie 54kD)	U51920	SEK ID NR 18
19.	LASVSTVL	130-137 hemoglobina, alfa 2 (ang. hemoglobin, alpha 2)	AF230076	SEK ID NR 19
20.	VMAPRTLVL	3-11 HLA-A		SEK ID NR 20
21.	LLFDRPMHV	267-275 hnRNP M	L03532	SEK ID NR 21
HLA-A-68
22.	MTSALPIIOK	62-71 białko związane z różnicowaniem się tkanki tłuszczowej (ang. adipose differentiation-related	X97324	SEK ID NR 22
23.	MAGDIYSVFR	349-358 białko związane z różnicowaniem się tkanki tłuszczowej (ang. adipose differentiation-related	X97324	SEK ID NR 23
24.	ETIPLTAEKL	115-124 cyklina D1/PRAD1 (ang. cyclin D1/PRAD1)	X59798	SEK ID NR 24
25.	DVMVGPFKLR	934-943 białko 2 kotwiczące kinazy A (PRKA) (ang. A kinase (PRKA) anchor protein 2)	AJ303079	SEK ID NR 25
26.	TIIDILTKR	64-72 aneksyna A1 (ang. annexin A1)	X05908	SEK ID NR 26
27.	TIVNILTNR	55-63 aneksyna A2 (ang. annexin A2)	BC001388	SEK ID NR 27
28.	TIIDIITHR	385-393 aneksyna A6 (ang. annexin A6)	J03578	SEK ID NR 28
29.	SIFDGRWAK	107-116 przypuszczalne białko błonowe (ang. putative membranę protein)	AB020980	SEK ID NR 29
30.	STIEWIOR	115-123 homolog B białka Sec23 (S. cerevisiae) (ang. Sec23 (S. cerevisiae) homolog B)	BC005032	SEK ID NR 30
31.	ELIKPPTILR	132-141 kompleks 3 białka związanego z adaptorem (ang. adaptor-related protein complex 3)	AF092092	SEK ID NR 31
32.	EIAMAWTALR	248-258 aldolaza A, fruktozobifosforan (ang. aldolase A, fructose-biphosphate)	X12447	SEK ID NR 32
33.	ETIGEILKK	95-103 hnRNP K	BC000355	SEK ID NR 33
34.	SLADIMAKR	86-94 rybosomalne białko L24 (ang. ribosomal protein L24)	BC000690	SEK ID NR 34
	HLA-B44lub HLA-B18
35.	EEIAFLKKL	229-237 wimentyna (ang. vimentin)	M14144	SEK ID NR 35
36.	DEAAFLERL	92-100 kaldesmon 1 (ang. caldesmon 1)	M64110	SEK ID NR 36
37.	DEMKVLVL	545-552 spektryna, beta, nieerytrocytarna 1 (ang. spectrin, beta, non-erythrocytic 1)	M96803	SEK ID NR 37
38.	DEVKFLTV	191-198 aneksyna A4 (ang. annexin A4)	M82809	SEK ID NR 38
39.	NENSLFKSL	935-943 klatryna, polipeptyd ciężki (Hc) (ang. clathrin, heavy polypeptide (Hc))	D21260	SEK ID NR 39
40.	DEFKWW	373-380 białko płaszcza, gamma-COP (ang. coat protein, gamma-cop)	AF100756	SEK ID NR 40
41.	EEVKLIKKM	137-145 ferrytyna, polipeptyd lekki (ang. ferritin, light polypeptide)	M11147	SEK ID NR 41

PL 211 158 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5
42.	DEVKLPAKL	158-166 polimeraza 1 i czynnik uwalniający transkrypt (ang polymerase 1 and transcript release factor)	AF312393	SEK ID NR 42
43.	TERELKVAY	637-645 hipotetyczne białko FLJ20004 (ang. hypothetical protein FLJ20004)	AB040951	SEK ID NR 43
44.	NEFSLKGVDF	86-95 ets-1	J04101	SEK ID NR 44
45.	NEQDLGIQY	169-177 katenina alfa 1 (ang. catenin alpha 1)	Dl 3866	SEK ID NR 45
46.	EERIVELF	306-313 przekaźnik sygnału i aktywator 3 transkrypcji (ang signal transducer and activator of transcription 3)	BC000627	SEK ID NR 46
47.	EEIREAFRVF	84-93 kalmodulina 3 (ang. calmodulin 3)	J04046	SEK ID NR 47
48.	DEYIYRHFF	344-352 białko 8 postępu cyklu komórkowego (ang. celi cycle progression 8 protein)	AF011794	SEK ID NR 48
49.	DELELHORF	308-316 białko wiążące adenowirusa 5 E1A (ang. adenovirus 5 E1A binding protein)	Χ86098	SEK ID NR 49
50.	SEVKFTVTF	80-88 galektyna 2 (ang. galectin 2)	M87842	SEK ID NR 50
51.	lETlINTF	12-19 kalgranulina B (ang. calgranulin B)	M26311	SEK ID NR 51
52.	KENPLOFKF	61-69/72-80 wilina 2 (ezryna)/(radyksyna) (ang. villin 2 (ezrin)/ (radixin))	J05021/L023 20	SEK ID NR 52
53.	DEVRTLTY	41-48 metylotransferaza hnRNP, białko 2 podobne do białka S. cerevisiae (ang. hnRNP methyltransferase,	Y10807	SEK ID NR 53
54.	GEAWNRVF	43-51 wielka wielofunkcyjna proteaza 2 (ang. large multifunctional protease 2), LMP2	Zł 4977	SEK ID NR 54
55.	EEVLIPDQKY	385-394 białko 3A z domeną F i powtarzającą się sekwencją bogatą w leucynę (ang. F-box and leucine-	AF126028	SEK ID NR 55
56.	DEGRLVLEF	163-171 0-acetylotransferaza 1 steroli (ang. sterol 0-acyltransferase 1)	L21934	SEK ID NR 56
57.	DEVELIHF	838-845 specyficzny dla chromatyny czynnik fazy elongacji transkrypcji (ang. chromatin-specific	AF152961	SEK ID NR 57
58.	VEVLLNYAY	83-91 białko wiążące NS1 (ang. NSI-binding protein)	AF205218	SEK ID NR 58
59.	TENDIRVMF	120-128 białko wiążące się z RNA z powtórzeniami trypletu CUG (ang. CUG triplet repeat, RNAbinding	AF267534	SEK ID NR 59
60.	LEGLTWY	62-69 podjednostka zeta 1 kompleksu białka będącego podjednostka płaszcza (ang. coatomer	AF151878	SEK ID NR 60
61.	NELPTYAF	192-199 hipotetyczne białko (ang. hypothetical protein)	AK001475	SEK ID NR 61
62.	EEFGOAFSF	77-85 MHC klasy II, DP alfa 1 (ang. MHC, class II, DP alpha 1)	Χ03100	SEK ID NR 62
63.	VEAIFSKY	33-40 hnRNP C (C1/C2)	M29063	SEK ID NR 63
64.	DERTFHIFY	277-285 miozyna, polipeptyd ciężki 10, niemięśniowa (ang. myosin, heavy polypeptide 10, non-muscie)	M69181	SEK ID NR 64
65.	TEKVLAAVY	206-214 aldolaza B, fruktozobisfosforan (ang. aldolase B, fructose-bisphosphate)	KO1177	SEK ID NR 65

PL 211 158 B1 cd. tabeli 1

1	2	3	4	5
66.	VESPLSVSF	159-167 hipotetyczne białko FLJ22318 (ang. hypothetical protein FLJ22318)	AK025971	SEK ID NR 66
67.	SEAGSHTLOW	MHC-I		SEK ID NR 67
68.	DEGKVIRF	56-63 EST ramka odczytu-1 (ang. EST reading frame-1)	BF431469	SEK ID NR 68
pacjent RCC13
HLA-A*02
69.	ALAAVVTEV	przesunięcie ramki odczytu, ramka odczytu DDX3 +2 (ang. frameshift, DDX3 reading frame +2)	AF061337	SEK ID NR 69
70.	TLIEDILGV	209-217 białko związane z białkiem 4 przejściowego receptora (ang. transient receptor protein 4 associated	ALI 32825	SEK ID NR 70
71.	ALFGALFLA	2-10 białko przenoszące fosfolipidy (ang. phospholipid transfer protein)	L26232	SEK ID NR 71
72.	VLATLVLLL	72-80 EST	AA483794	SEK ID NR 72
73.	TLDDLIAAV	325-333 hipotetyczne białko FLJ10042 (ang. hypothetical protein FLJ 10042)	AK000904	SEK ID NR 73
74.	YLDNGWFV	316-324 specyficzne dla uszkodzenia białko 1 wiążące się z DNA (127 kD) (ang. damagespecific DNA	U18299	SEK ID NR 74
75.	SVFAGWGV	581-589 cyklaza 1 guanylanu, rozpuszczalna, alfa 3 (ang. guanylate cyclase 1, soluble, alpha 3)	U58855	SEK ID NR 75
76.	SLINVGLISV	48-57 kwaśne białko bogate w leucyny (ang. acidic protein rich in leucines)	BC000476	SEK ID NR 76
77.	ALADGVQKV	176-184 apolipoprotelna L, 1) (ang. apolipoproteln L, D)	AF323540	SEK ID NR 77
HLA-A*24
78.	TYGEIFEKF	107-115 dehydrogenaza NADH (ubichinon) 1, (B14.5b) (ang. NADH dehydrogenase (ubiguinone) 1,	AF070652	SEK ID NR 78
79.	YYMIGEOKF	203-211 nikotynamido-N-metylotransferaza (ang. nicotinamide-n-methyltransferase)	U08021	SEK ID NR 79

Zastrzeżenia patentowe

Claims

1. Peptyd związany z nowotworem obejmujący sekwencję aminokwasową ALFDGDPHL (SEK ID NR 4), przy czym peptyd ten ma zdolność do wiązania się z cząsteczką ludzkiego głównego układu zgodności tkankowej (MHC) klasy I.

2. Peptyd według zastrz.1, znamienny tym, że rzeczony peptyd składa się z sekwencji aminokwasowej SEQ ID NR 4.

3. Peptyd według zastrz. 1 albo 2, znamienny tym, że zawiera przynajmniej jeden dodatkowy aminokwas na N- lub C-końcu.

4. Peptyd według dowolnego z zastrz. 1 do 3, znamienny tym, że przynajmniej jeden aminokwas jest chemicznie zmodyfikowany.

5. Zastosowanie peptydu jak określono w dowolnym z zastrz. 1 do 4 do wytworzenia leku do leczenia chorób nowotworowych i/lub chorób gruczolakowatych.

6. Zastosowanie według zastrz. 5, znamienne tym, że tą chorobą jest rak nerek, piersi, trzustki, żołądka, pęcherza moczowego i/lub jąder.

PL 211 158 B1

7. Zastosowanie według zastrz. 5 albo 6, znamienne tym, że ten peptyd jest stosowany w połączeniu z adiuwantem.

8. Zastosowanie według zastrz. 5 albo 6, znamienne tym, że ten peptyd jest stosowany, kiedy jest związany z komórką prezentującą antygen.

9. Zastosowanie peptydu jak określono w dowolnym z zastrz. 1 do 4do znakowania in vitro leukocytów, w szczególności limfocytów T.

10. Zastosowanie według zastrz. 9 do oszacowania przebiegu terapii choroby nowotworowej.

11. Zastosowanie peptydu jak określono w dowolnym z zastrz. 1 do 4 do przygotowania przeciwciała.

12. Kompozycja farmaceutyczna zawierająca peptyd jak określono w dowolnym z zastrz. 1 do 4.

13. Cząsteczka kwasu nukleinowego kodująca peptyd jak określono w dowolnym z zastrz. 1 do 4.

14. Wektor obejmujący cząsteczkę kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 13.

15. Komórka zmodyfikowana genetycznie przy użyciu cząsteczki kwasu nukleinowego jak określono w zastrz. 13 albo przy użyciu wektora jak określono w zastrz. 14 w celu wytworzenia peptydu jak określono w dowolnym z zastrz. 1 do 4.