ES2928331T3 - Composiciones de variantes de anexina II y métodos - Google Patents

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Abstract

Esta divulgación describe fragmentos de polipéptidos de anexina II, variantes de los mismos, composiciones que incluyen tales fragmentos y/o variantes, y métodos para usar tales fragmentos y/o variantes. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN
Composiciones de variantes de anexina II y métodos
Referencia cruzada a la solicitud relacionada
Esta solicitud reivindica la prioridad de la solicitud de patente provisional US con número de serie 61/903.628, presentada el 13 de noviembre de 2013, que se incorpora aquí como referencia.
Financiación pública
Esta invención se realizó con el apoyo del gobierno bajo NIH R01 CA15434 otorgado por Institutos Nacionales de Salud. El gobierno tiene ciertos derechos en la invención.
Antecedentes
Se estima que cada año se diagnostican 200.000 nuevos tumores cerebrales en Norteamérica. De estos, más de 50.000 casos son tumores primarios. Los cánceres cerebrales primarios afectan aproximadamente a 14 de cada 100.000 personas y son responsables de más de 13000 muertes al año. Los tumores cerebrales metastásicos son más comunes que los tumores cerebrales primarios y representan aproximadamente 150.000 casos nuevos diagnosticados por año. El pulmón y la mama son ubicaciones habituales de tumores primarios que pueden hacer metástasis en el cerebro.
Las opciones de tratamiento para ciertos tumores cerebrales pueden ser limitadas. Por ejemplo, los gliomas de alto grado pueden tratarse en algunos casos mediante reducción quirúrgica, pero la cirugía no siempre es posible. La radiación puede ser otra opción, ya sea con o sin quimioterapia adyuvante. En algunos casos, el tratamiento preferido puede no proporcionar una supervivencia significativa a largo plazo. Por ejemplo, los pacientes que reciben radioterapia para glioblastoma, incluso con quimioterapia adyuvante con temozolomida, pueden afrontar una tasa de supervivencia a los tres años de no mucho más del 25 %.
Otra opción terapéutica implica vacunas que incluyen, por ejemplo, vacunas de lisado de células tumorales. Tales vacunas implican el cultivo por separado de monocitos obtenidos de un paciente y células tumorales obtenidas del paciente, lisando las células tumorales cultivadas y recogiendo uno o más antígenos expresados por las células tumorales cultivadas. Los antígenos recogidos se utilizan para pulsar células dendríticas (DC) derivadas del cultivo de monocitos. Las DC pulsadas se administran de nuevo al paciente, proporcionando al paciente una población de DC cebadas y activadas por la exposición a los antígenos tumorales, que pueden cebar aún más el propio sistema inmunitario del paciente contra el tumor.
Los métodos que emplean el sistema inmunitario de un paciente para ayudar a curar tumores pueden beneficiarse de los avances en adyuvantes que pueden aumentar la eficacia de dichos tratamientos. Se ha identificado que el monómero de 36 kDa de anexina II tiene propiedades inmunoestimuladoras. En particular, el documento WO 2012/048190 A1 divulga composiciones que comprenden el monómero de 36 kDa de anexina II o un fragmento inmunoestimulador del mismo, que pueden ser útiles, por ejemplo, en inmunoterapia.
Sumario de la invención
Esta divulgación describe fragmentos polipeptídicos de anexina II, sus variantes, composiciones que incluyen tales fragmentos y/o variantes y métodos para usar tales fragmentos y/o variantes.
En un aspecto, esta divulgación describe una variante de anexina II.
En otro aspecto, esta divulgación describe composiciones que incluyen una variante de anexina II. En algunas realizaciones, dicha composición puede incluir además al menos un antígeno y/o un segundo adyuvante. En algunas de estas realizaciones, el antígeno y/o el segundo adyuvante pueden acoplarse a la variante de anexina II.
En otro aspecto, esta divulgación describe un método que generalmente incluye administrar a un sujeto que necesita dicho tratamiento una cantidad eficaz de composición que incluye una variante de anexina II.
En otro aspecto, esta divulgación describe un método que generalmente incluye poner en contacto células dendríticas con una composición que incluye una variante de anexina II y un antígeno. En algunas realizaciones, el método puede incluir además la administración posterior de células dendríticas a un sujeto.
En particular, la presente invención proporciona un fragmento de anexina II que consiste en una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 2 - 4 y una composición que comprende dicho fragmento de anexina II que consiste en una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 2 - 4.
Breve descripción de las figuras
Figura 1. Datos que muestran actividad adyuvante de N-terminal de anexina II.
Figura 2. Datos que demuestran mejora de la respuesta IFN-y frente al antígeno modelo OVA usando, como adyuvante, un péptido N-terminal de anexina II.
Figura 3. Datos que muestran que la actividad de la proteína de fusión anexina II-OVA está mediada por TLR2. Figura 4. (A) Protocolo experimental; (B) Datos que demuestran la actividad de la proteína de fusión anexina II-OVA in vivo.
Figura 5. (A) Protocolo experimental; (B) Datos que demuestran la actividad de la proteína de fusión anexina II-OVA en la reducción del tamaño de un tumor in vivo; (C) Datos que demuestran la actividad de la proteína de fusión anexina II-OVA en el aumento de supervivencia.
Figura 6. Datos que demuestran actividad de anexina II del péptido N-terminal de 15 aminoácidos.
Figura 7. Datos que demuestran la actividad de anexina II de variantes de anexina II.
Figura 8. Datos que comparan in vivo la actividad de anexina II de longitud completa y el fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos.
Figura 9. Datos que comparan in vivo la actividad de anexina II con el fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos y una variante de anexina II.
Figura 10. Datos que comparan in vitro la actividad de anexina II de longitud completa y el fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos.
Figura 11. Datos que comparan in vitro la actividad de anexina II del fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos y una variante de anexina II.
Figura 12. Datos que comparan in vitro la actividad de anexina II del fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos y una variante de anexina II.
Descripción detallada
Esta divulgación describe fragmentos polipeptídicos de anexina II y sus variantes. Los fragmentos y/o variantes pueden presentar actividad de anexina II, incluida actividad terapéutica. Debido a que los fragmentos y/o variantes son más pequeños que la proteína anexina II de longitud completa, pueden usarse más fácilmente en composiciones farmacéuticas. En particular, la presente invención proporciona un fragmento de anexina II que consiste en una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 2 - 4 y una composición que comprende dicho fragmento de anexina II que consiste en una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 2 - 4.
A lo largo de la siguiente descripción, los siguientes términos tendrán los significados indicados.
Por “antígeno” y sus variantes se entiende cualquier material capaz de inducir una respuesta inmunitaria en un sujeto al que se ha aplicado el material. En varias realizaciones, un antígeno puede inducir una respuesta inmunitaria mediada por células, una respuesta inmunitaria humoral o ambas. Los antígenos adecuados pueden ser sintéticos o de origen natural y, cuando se producen de forma natural, pueden ser endógenos (p. ej., un autoantígeno) o exógenos. Materiales antigénicos adecuados incluyen, entre otros, péptidos o polipéptidos (incluido un ácido nucleico, al menos una parte del cual codifica el péptido o polipéptido); lípidos; glicolípidos; polisacáridos; carbohidratos; polinucleótidos; priones; bacterias vivas o inactivadas, virus, hongos o parásitos; e inmunógenos, toxinas o toxoides bacterianos, virales, fúngicos, protozoarios, derivados de tumores o derivados de organismos.
Por “fracción” y sus variantes se entiende una porción de un compuesto químico que presenta un carácter particular tal como, por ejemplo, una función biológica o química particular (por ejemplo, inmunomodulación y/o especificidad diana).
Por “profiláctico” y sus variantes se entiende un tratamiento que limita, en cualquier medida, el desarrollo y/o la aparición de un síntoma o signo clínico de una enfermedad (p. ej., una enfermedad neoplásica o una enfermedad infecciosa), incluida la prevención o limitación del desarrollo inicial y/o aparición de la enfermedad, previniendo o limitando la propagación de una enfermedad subclínica existente, o ambas. Por “subclínica” se entiende el estado de una enfermedad antes de la manifestación de un síntoma o signo de la enfermedad.
Por “signo” o “signo clínico” se entiende un hallazgo físico objetivo relacionado con una enfermedad particular que puede encontrar alguien que no sea el paciente.
Por “fracción estabilizante” se entiende esa porción de una composición que posee actividad funcional que aumenta la estabilidad de la composición en el cuerpo en comparación con una composición correspondiente sin la fracción estabilizante.
Por “síntoma” se entiende cualquier evidencia subjetiva de patología o de enfermedad de un paciente. Por “fracción de direccionamiento” se entiende esa porción de una composición que posee afinidad específica por la diana. La fracción de direccionamiento puede ser, o derivar de, un anticuerpo, pero, por otro lado, puede ser o derivar de una proteína o péptido que no sea un anticuerpo, o un material que no sea una proteína que incluye, por ejemplo, una molécula pequeña.
Por “terapéutico” y sus variantes se entiende un tratamiento que mejora uno o más síntomas o signos clínicos existentes asociados con una enfermedad.
Por “tratar” o sus variantes se entiende reducir, limitar la progresión, mejorar o resolver, en cualquier medida, los síntomas o signos relacionados con una enfermedad. Por “mejorar” se entiende cualquier reducción del grado, gravedad, frecuencia y/o probabilidad de un síntoma o signo clínico característico de una enfermedad particular.
El término “y/o” significa uno o todos los elementos enumerados o una combinación de dos o más de los elementos enumerados; los términos “comprende” y sus variantes no tienen un significado limitativo cuando estos términos aparecen en la descripción y las reivindicaciones, a menos que se especifique lo contrario, “un”, “uno”, “el” y “al menos uno” se usan indistintamente y significan uno o más de uno; y las relaciones de rangos numéricos por criterios de valoración incluyen todos los números incluidos dentro de ese rango (por ejemplo, 1 a 5 incluye 1, 1,5, 2, 2,75, 3, 3,80, 4, 5, etc.).
La familia de proteínas anexinas incluye al menos diez genes de mamíferos. Las anexinas generalmente unen calcio y fosfolípidos en presencia de calcio. La anexina II (también denominada a veces “anexina A2” o “AII”) es una anexina abundante que se sabe que existe como un monómero (AIIm, 36 kDa), un heterodímero (AIId) o un heterotetrámero (AIIt). El heterodímero incluye una subunidad AIIm y una subunidad de 3-fosfoglicerato quinasa. El heterotetrámero incluye dos subunidades AIIm y dos subunidades de 11 kDa.
El monómero de 36 kDa de anexina II posee actividad modificadora de la respuesta inmunitaria (solicitud de patente internacional PCT/US2011/055211; publicación de solicitud de patente US 2013/0331546 A1). Esta divulgación informa sobre la identificación de un fragmento del monómero de 36 kDa de anexina II que posee actividad de anexina II y variantes del fragmento. Por razones de brevedad en la siguiente descripción, a menos que se especifique lo contrario, la referencia a la anexina II se refiere al monómero de 36 kDa en oposición al heterodímero o heterotetrámero. La referencia a una “variante de anexina II” se refiere a un fragmento del monómero de 36 kDa o una forma modificada de dicho fragmento. Una forma modificada de un fragmento del monómero de 36 kDa de anexina II puede ser cualquier polipéptido que posea un nivel medible de actividad de anexina II y similitud estructural con una secuencia de aminoácidos de referencia correspondiente de una porción correspondiente del monómero de 36 kDa de anexina II de tipo salvaje. Además, debido a que una variante de anexina II se refiere a un fragmento del monómero de 36 kDa, una variante de anexina II incluye necesariamente menos que la secuencia de aminoácidos de anexina II de longitud completa. En consecuencia, el análisis de realizaciones de variantes de anexina II que pueden incluir residuos de aminoácidos adicionales, por definición, excluye necesariamente el polipéptido de anexina II de tipo salvaje de longitud completa.
Tal como se usa en el presente documento, un polipéptido es “estructuralmente similar” a una secuencia de aminoácidos de un fragmento de anexina II de tipo salvaje de referencia si la secuencia de aminoácidos del polipéptido posee una cantidad específica de identidad en comparación con la secuencia de aminoácidos de referencia. La similitud estructural de dos polipéptidos se puede determinar alineando los residuos de los dos polipéptidos (por ejemplo, un polipéptido candidato y el polipéptido de, por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - 6) para optimizar el número de aminoácidos idénticos a lo largo de sus secuencias; se permiten huecos en una o ambas secuencias al hacer el alineamiento para optimizar el número de aminoácidos idénticos, aunque no obstante los aminoácidos en cada secuencia deben permanecer en su orden correcto. Un polipéptido candidato es el polipéptido que se compara con el polipéptido de referencia (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 1 - 6). Un polipéptido candidato puede aislarse, por ejemplo, de un animal, o puede producirse utilizando técnicas recombinantes, o sintetizarse química o enzimáticamente.
Puede llevarse a cabo un análisis comparativo por pares de secuencias de aminoácidos usando el algoritmo BESTFIT en el paquete GCG (versión 10.2, Madison WI). Alternativamente, los polipéptidos pueden compararse usando el programa Blastp del algoritmo de búsqueda BLAST 2, como describen Tatiana et al, (FEMS Microbiol Lett, 174, 247­ 250 (1999)), y disponible en la página web del Centro Nacional de Información Biotecnológica (NCBI). Se pueden utilizar los valores por defecto para todos los parámetros de búsqueda BLAST 2, incluidos matrix = BLOSUM62; penalización por hueco abierto = 11, penalización por extensión de hueco = 1, hueco x_ dropoff = 50, expectativa = 10, tamaño de palabra = 3 y filtro activado.
En la comparación de dos secuencias de aminoácidos, se puede hacer referencia a la similitud estructural mediante porcentaje de “identidad” o mediante porcentaje de “similitud”. Por “identidad” se entiende la presencia de aminoácidos idénticos. Por “similitud” se entiende la presencia no solo de aminoácidos idénticos sino también la presencia de sustituciones conservadoras. Una sustitución conservadora de un aminoácido en un polipéptido, según se describe en el presente documento, se puede seleccionar de entre otros miembros de la clase a la que pertenece el aminoácido. Por ejemplo, es bien conocido en el campo de la bioquímica de proteínas que un aminoácido que pertenece a un grupo de aminoácidos que tienen un tamaño o característica particular (tal como carga, hidrofobicidad o hidrofilicidad) puede sustituirse por otro aminoácido sin alterar la actividad de una proteína, particularmente en regiones de la proteína que no están directamente asociadas con la actividad biológica. Por ejemplo, los aminoácidos no polares (hidrofóbicos) incluyen alanina, leucina, isoleucina, valina, prolina, fenilalanina, triptófano y tirosina. Los aminoácidos polares neutros incluyen glicina, serina, treonina, cisteína, tirosina, asparagina y glutamina. Los aminoácidos cargados positivamente (básicos) incluyen arginina, lisina e histidina. Los aminoácidos cargados negativamente (ácidos) incluyen ácido aspártico y ácido glutámico. Las sustituciones conservadoras incluyen, por ejemplo, Lys para Arg y viceversa para mantener una carga positiva; Glu para Asp y viceversa para mantener una carga negativa; Ser para Thr de modo que se mantenga un Oh libre; y Gln para Asn para mantener un NH2 libre. Asimismo, también se contemplan los análogos biológicamente activos de un polipéptido que contiene deleciones o adiciones de uno o más aminoácidos contiguos o no contiguos que no eliminan una actividad funcional del polipéptido.
Por lo tanto, una variante de anexina II puede incluir un polipéptido con al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 81 %, al menos el 82 %, al menos el 83 %, al menos el 84 %, al menos el 85 %, al menos el 86 %, al menos el 87 %, al menos el 88 %, al menos el 89 %, al menos el 90 %, al menos el 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de similitud de secuencia con una secuencia de aminoácidos de referencia del fragmento de anexina II de tipo salvaje adecuada.
En algunas realizaciones, una variante de anexina II puede incluir un polipéptido con al menos 50 %, al menos 55 %, al menos 60 %, al menos 65 %, al menos 70 %, al menos 75 %, al menos 80 %, al menos 81%, al menos 82%, al menos 83%, al menos 84%, al menos 85%, al menos 86%, al menos 87%, al menos 88%, al menos 89%, al menos 90%, al menos 91 %, al menos 92 %, al menos 93 %, al menos 94 %, al menos 95 %, al menos 96 %, al menos 97 %, al menos 98 % o al menos 99 % de identidad de secuencia con un secuencia de aminoácidos de referencia del fragmento de anexina II de tipo salvaje adecuada.
También se puede diseñar una variante de anexina II para proporcionar secuencias adicionales, tales como, por ejemplo, aminoácidos C-terminal o N-terminal adicionales que pueden, por ejemplo, facilitar la purificación mediante atrapamiento en columna o usando anticuerpos. Tales etiquetas incluyen, por ejemplo, etiquetas ricas en histidina que permiten la purificación de polipéptidos en columnas de níquel.
En algunas realizaciones, una variante de anexina II puede incluir una secuencia de aminoácidos que incorpora una o más sustituciones de aminoácidos independientemente de si cada sustitución de aminoácidos es natural o modificada (p. ej., utilizando técnicas recombinantes u otras técnicas de laboratorio). En algunas realizaciones, una variante de anexina II puede incluir una combinación de sustituciones de aminoácidos y cada una, independientemente de cualquier otra sustitución, puede ser natural o modificada. Variantes de anexina II ejemplares se reflejan en las secuencias de aminoácidos de las SEQ ID NO: 12 - 26. Una realización de este tipo, que tiene una sustitución de alanina por isoleucina en la posición seis (16A, A-6, Tabla 1, a continuación) de un fragmento de anexina II de 15 aminoácidos, posee un aumento en la actividad de anexina II (figuras 7, 9, 11 y 12).
El monómero de 36 kDa de anexina II posee actividad modificadora de respuesta inmunitaria (solicitud de patente internacional PCT/US2011/055211; publicación de solicitud de patente US 2013/0331546 A1). La anexina II puede aumentar la eficacia de vacunas que dependen de las respuestas de las células CD8+ T para mediar un efecto terapéutico o profiláctico. Por consiguiente, las composiciones que incluyen anexina II pueden ser útiles como adyuvantes en inmunoterapias tales como, por ejemplo, vacunas contra el cáncer y vacunas dirigidas contra agentes infecciosos (por ejemplo, virus, bacterias, parásitos).
De ese modo, tal como se usa en el presente documento, “actividad de la anexina II” incluye la modulación de una respuesta inmunitaria. Por ejemplo, la “actividad de la anexina II” puede incluir redirigir el antígeno endocitosado a la molécula MHC I sin cambiar de manera apreciable la expresión de la molécula coestimuladora, poseer actividad agonista del receptor tipo Toll 2 (TLR2), poseer actividad agonista del receptor tipo Toll 4 (TLR4), aumentar de manera selectiva la presentación de antígenos en MHC I, reducir la producción de citoquinas “tipo II” (p. ej., IL-10, IL-4), inducir la secreción de citoquinas tipo I (p. ej., IL-12, TFN-a, IL-1p), potenciar la maduración de células dendríticas, potenciar la maduración de células B y/o estimular la producción de anticuerpos o células T.
Fragmento N-terminal de anexina II como adyuvante
Para probar si el N-terminal de 35 aminoácidos de anexina II, que distingue la anexina II de otras anexinas, presenta actividad adyuvante, pulsamos células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) con gp100 ± A2OVA, conteniendo el péptido de fusión este fragmento de 35 aminoácidos. A2OVA ejerció actividad adyuvante tanto en concentraciones iguales como en relación molecular en comparación con la proteína anexina II de longitud completa en una medida de la respuesta de células CD8 T específicas de gp100 (figura 1). Después probamos si este péptido de fusión mejoraba la actividad adyuvante con respecto a la de la adición de OVA y la proteína anexina II de longitud completa. Se pulsaron BMDC con A2OVA y medimos la respuesta de las células T CD8 OT-1 específicas de OVA. El péptido de fusión A2OVA indujo una respuesta en IFNy superior a la del monómero A2 (A2m) OVA añadido como agentes separados (figura 2). Para investigar más a fondo la capacidad de derivar un nuevo péptido de fusión de antígeno único, construimos péptidos de fusión OVA en los que un péptido OVA (SEQ ID No: 9) se fusionó con un fragmento de anexina II N-terminal o con un péptido de 35 aminoácidos codificado para producir las SEQ ID No: 30 y SEQ ID No: 29, respectivamente. Los péptidos se pulsaron sobre células transfectadas con TLR2 y se usó actividad de fosfatasa alcalina para determinar actividad de NF-Kp (figura 3). La proteína de fusión A2OVA estimuló NF-Kp a través de TLR2. Sin embargo, para nuestra sorpresa, la proteína de fusión (SEQ ID No: 30) que carece de los aminoácidos de anexina II más terminales no provocó una respuesta.
El péptido de fusión anexina II-OVA estimula una respuesta de células T específicas de antígeno in vivo
A continuación, investigamos el uso del A2OVA in vivo. El péptido A2OVA (SEQ ID No: 32) se administró a ratones libres de tumor como se describe en la figura 4A para ver si provocaba una respuesta de células T específicas de OVA. El péptido de fusión A2OVA estimuló respuesta in vivo de células T CD8+ específicas de antígeno (figura 4B). Para determinar si el fragmento de anexina II de 35 aminoácidos puede prolongar la supervivencia en animales portadores de tumores de manera no específica de antígeno, utilizamos ratones BALB/c portadores de tumores de mama que carecen del haplotipo MHC para presentar SIINFEKL. Los ratones se trataron con péptido A2OVA como se resume en la figura 5A y se les hizo un seguimiento de supervivencia. Los ratones a los que se les inyectó el péptido A2OVA demostraron una mayor supervivencia en comparación con el control de solución salina o codificado. Una vez más, se requerían los primeros 15 aminoácidos N-terminal, ya que el A2OVA-S100 (denominado de otro modo en el presente documento como A2OVA-pp11, SEQ ID No: 30) no confería ningún beneficio de supervivencia (figura 5B).
Los 15 aminoácidos N-terminal de anexina II tienen actividad agonista de TLR2 y actividad agonista de TLR4
Para caracterizar mejor los 35 aminoácidos N-terminal como adyuvante, eliminamos en serie cinco aminoácidos del extremo de C-terminal del fragmento N-terminal para producir variantes de anexina II SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5 y SEQ ID NO: 6. Se ensayaron los péptidos resultantes para determinar la actividad de NF-Kp. El fragmento de anexina II que consiste en la mayoría de los 15 aminoácidos N-terminal (SEQ ID NO: 5) activó TLR2 y, en menor medida, TLR4 (figura 6). Con el fin de probar la capacidad del fragmento de anexina II de 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) para estimular una respuesta inmunitaria, y para determinar si su capacidad para hacerlo está mediada a través de TLR2, se administró a ratones de tipo salvaje y de tipo knockout TLR-2 OVA ± anexina II u OVA ± el fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos (SEQ ID No:5).
Un fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos induce la secreción de citoquinas a partir de células dendríticas derivadas de médula ósea (BDMC)
Para determinar la actividad del fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos en células dendríticas, se derivaron BMDC para ratones de tipo salvaje, knockout TLR4 y knockout MyD88. Los diferentes BMDC se pulsaron con el fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 5). Esto demostró que el fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) mediaba la inducción de secreción de TFN y que la actividad era dependiente de MyD88 (figura 10).
La sustitución de isoleucina por alanina en el sexto aminoácido N-terminal mejora la señalización de TLR2 y TLR4
Para caracterizar aún más el fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos, construimos variantes del fragmento en las que cada fragmento albergaba una única sustitución del aminoácido alanina por un aminoácido diferente. Las variantes se enumeran en la Tabla 1. La variante que albergaba una sustitución de isoleucina por alanina (A-6, SEQ ID NO: 17) mostró una señalización mejorada de Tl R2 y TLR4 (figura 7). Además, la variante A-6 (SEQ ID NO: 17) puede inducir in vivo un cebado de células T específico de OVA mejorado (figura 9, 15aaP6).
Para caracterizar aún más la actividad de la variante A-6 (SEQ ID NO: 17), se pulsaron BMDC de ratones de tipo salvaje, knockout TLR2, knockout TLR4 y knockout MyD88 con el péptido y se analizaron en busca de moléculas coestimuladoras CD80 (figura 11) y CD86 (figura 12). Tanto el fragmento N-terminal de 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 5) como la variante A-6 (SEQ ID NO: 17) aumentaron la expresión de las moléculas coestimuladoras CD80 y CD86 de manera dependiente de TLR4 y MyD88.
En consecuencia, en un aspecto, esta divulgación describe una composición que incluye una variante de anexina II tal como, por ejemplo, un fragmento inmunomodulador de anexina II. Se puede determinar si una variante de anexina II posee actividad inmunomoduladora mediante cualquier método adecuado que incluya, por ejemplo, cualquier método descrito en el presente documento. Sin embargo, otros ensayos estándar de actividad inmunomoduladora están dentro de la capacidad de un experto en la materia.
En algunas realizaciones, una variante de anexina II puede incluir una porción N-terminal de anexina II tal como, por ejemplo, cualquiera de las secuencias de aminoácidos reflejadas en las SEQ ID NO: 1 - 6. En algunas de estas realizaciones, la variante de anexina II puede incluir un fragmento de 15 aminoácidos de anexina II (por ejemplo, SEQ ID NO: 5) o una forma modificada del mismo (por ejemplo, cualquiera de las SEQ ID NO: 12 - 26). En una realización particular (SEQ ID NO: 17), la variante de anexina II puede incluir una sustitución de aminoácidos de alanina por isoleucina en la posición seis (16A, A-6 en la Tabla 1) del fragmento de 15 aminoácidos que se muestra en la SEQ ID NO: 5.
Una composición puede incluir múltiples variantes de anexina II. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una composición puede incluir un polipéptido de fusión que incluya una pluralidad de variantes de anexina II.
En algunos casos, una composición puede incluir además uno o más antígenos contra los que se desea una respuesta inmunitaria. Aunque aquí se describe en el contexto de una realización ilustrativa en la que el antígeno modelo es el antígeno ovoalbúmina, las composiciones y los métodos descritos en el presente documento pueden implicar el uso de cualquier antígeno de interés. Así, el antígeno puede ser, por ejemplo, un antígeno tumoral o un antígeno expresado por un agente infeccioso. En algunas realizaciones, el antígeno puede derivar de un lisado de células tumorales. Ejemplos de antígenos tumorales incluyen, por ejemplo, gp100 (un antígeno asociado a melanoma), IL 13raa2, Epha2 (receptor 2 de efrina tipo A), fragmentos inmunogénicos de los mismos y fusiones de tales antígenos y/o fragmentos.
En algunas realizaciones, la variante de anexina II y el antígeno pueden proporcionarse en una mezcla, suspensión, emulsión, etc. Si se proporciona en una emulsión, es posible que la variante de anexina II y el antígeno se proporcionen en fases separadas de la emulsión.
En otras realizaciones, la variante de anexina II y el antígeno pueden acoplarse de manera que el antígeno y la variante de anexina II, como adyuvante, puedan presentarse conjuntamente a células del sistema inmunitario. La variante de anexina II y el antígeno pueden acoplarse covalentemente (p. ej., reticulación), acoplarse por afinidad (p. ej., avidinabiotina) o acoplarse como un polipéptido de fusión. La elaboración de dichas realizaciones se describe en el ejemplo 3.
Aún en otra realización, un polinucleótido que codifica una secuencia de codificación de la variante de anexina II (en lo sucesivo, un polinucleótido de la variante de anexina II), por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica cualquier variante de anexina II (por ejemplo, una secuencia de nucleótidos que codifica la secuencia de aminoácidos de cualquiera de las SEQ ID No: 1 - 6, l2 - 26), puede clonarse en el genoma de un virus atenuado de modo que la cápside del virus incluya al menos una variante de anexina II. Cuando se crea el virus, la superficie de la cápside se puede decorar con al menos una variante de anexina II que puede mejorar la respuesta inmunitaria antiviral. Este enfoque también puede ser útil para tratar ciertas enfermedades bacterianas. Por ejemplo, un polinucleótido de la variante de anexina II se puede clonar en una micobacteria atenuada que cause tuberculosis tal como, por ejemplo, Mycobacterium tuberculosis, de modo que el microbio exprese la variante de anexina II.
En algunas realizaciones, una variante de anexina II puede acoplarse a una fracción diana. La fracción diana de la composición puede ser cualquier material que pueda proporcionar una administración dirigida de la composición. En muchas realizaciones, la fracción diana puede proporcionar una diana inmunoespecífica, es decir, puede ser una porción suficiente de una inmunoglobulina (es decir, un anticuerpo) para promover la unión inmunoespecífica de la composición a un antígeno diana. Sin embargo, tales realizaciones pueden ponerse en práctica utilizando materiales de direccionamiento que no sean inmunoglobulinas, por ejemplo ciertas moléculas pequeñas o ligandos de receptores, tales como, por ejemplo, hormonas (naturales o sintéticas), lípidos, etc. Tal como se usa en el presente documento, “específico” y sus variantes (p. ej., “inmunoespecífico”, que tiene “especificidad”, etc.) se refieren a tener una afinidad diferencial o no genérica, en cualquier grado, con una diana particular.
Por lo tanto, en algunas realizaciones, una variante de anexina II se puede acoplar a una fracción diana antitumoral tal como, por ejemplo, un ligando de un marcador específico de tumor, un anticuerpo antitumoral o una fracción derivada de un anticuerpo antitumoral. Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo antitumoral se refiere a un anticuerpo (Ab) que reconoce células de un tumor con cierto grado de especificidad de entre las células de tejido normal. La composición acoplada variante de anexina II/Ab puede aprovechar la especificidad tumoral proporcionada por el anticuerpo para administrar de manera dirigida la variante de anexina II acoplada en los alrededores de los antígenos tumorales.
Dado que los anticuerpos antitumorales, como todas las inmunoglobulinas, son proteínas, se pueden realizar modificaciones en un anticuerpo antitumoral particular sin que el anticuerpo antitumoral modificado resulte inadecuado para su uso como una fracción diana. Por ejemplo, se pueden eliminar o sustituir una o más porciones de la secuencia de aminoácidos del anticuerpo antitumoral o se pueden agregar aminoácidos adicionales a un anticuerpo antitumoral, y el anticuerpo antitumoral aún puede retener suficiente carácter inmunoespecífico para ser adecuado para la práctica de la invención. Por lo tanto, en la descripción que sigue, la referencia a un anticuerpo antitumoral particular incluye anticuerpos antitumorales modificados que tienen dichas modificaciones (por ejemplo, adiciones, deleciones y/o sustituciones de aminoácidos) ya que éstos son posibles mientras mantengan una cantidad suficiente del carácter inmunoespecífico del anticuerpo.
Por lo tanto, en general, una fracción diana puede incluir un anticuerpo que dirija, por ejemplo, un antígeno microbiano (por ejemplo, antígenos bacterianos, virales, parasitarios o fúngicos), un antígeno asociado a un cáncer o a un tumor, una célula inmunitaria y/o un autoantígeno. En muchas realizaciones, un anticuerpo adecuado es el que reconoce y se une a un antígeno presente en o dentro de una célula. Un anticuerpo que se une a un material en particular (es decir, un antígeno) puede denominarse, indistintamente, “antiantígeno” o “anticuerpo de antígeno”. En algunos casos, se puede hacer referencia a un anticuerpo con un nombre genérico o una marca comercial.
Anticuerpos ilustrativos incluyen, entre otros, rituximab, anticuerpo anti-CD20 (p. ej., RITUXAN, Genentech, Inc., sur de San Francisco, CA/Biogen idec, Cambridge, MA); trastuzumab (p. ej., HERCEPTIN, Genentech, Inc., sur de San Francisco, CA); samarium (Sm153) lexidronam (samarium-153-etilendiaminotetrametilenfosfonato, abreviado samarium-153 EDTMP, por ejemplo, QUADRAMET, Lantheus Medical Imaging, Inc., Bellerica norte, MA); edrecolomab (MAb17-1A, por ejemplo, PANOREX, Centocor Ortho Biotech, Inc., Horsham, PA); IDEC-Y2B8; BEC2 (un anticuerpo monoclonal antiidiotípico que imita a GD3); cetixumab (C225 y anticuerpo monoclonal anti-EGFR, por ejemplo, ERBITUX, ImClone LLC, Nueva York, NY)); un anticuerpo anti-lyml (p. ej., On COLYM, Alpha Therapeutic Corp., Los Ángeles, CA); SMART M195 (por ejemplo, ZAMYL, Protein Design Labs, Inc., Freemont, CA); tretinoína (por ejemplo, ATRAGe N, Genzyme Corp., Cambridge, MA); un anticuerpo anti-CA125 (p. ej., OVAREX, AltaRex Medical Corp., Edmonton, AB, Canadá); tositumomab (p. ej., BEXXAR, Glaxo SmithKline l Lc , Wilmington, DE); LDP-03; ior t6; FcyRi (CD64)/HER-2/nuevo anticuerpo biespecífico MDX-210; MDX-11; MDX-22; OV103; anticuerpo monoclonal anti-interleucina-2 3622W94; un anticuerpo anti-VEGF; daclizumab (p. ej., ZENAPAX, Hoffman-LaRoche AG, Basilea, Suiza); anti-TAG-72 (MDX-220); el anticuerpo biespecífico FcyR1 (CD64)/EGFR MDX-447; MELIMMUNE-1 (Biogen idec, Cambridge, MA); Me LIMMUNE-2 (Biogen idec, Cambridge, MA); labetuzumab (p. ej., CEA-CIDE, Immunomedics, Inc., Morris Plains, NJ); PRETARGET, Aletheon Pharmaceuticals, Inc., Seattle, Wa); GNI-250; matuzumab (p. ej., EMD-72000, Merck Serono, Darmstadt, Alemania); epratuzumab (p. ej., LYMPHOCIDE, Immunomedics, Inc., Morris Plains, NJ); gemtuzumab zogamicina (CMA-676, por ejemplo, m YlOTARG, Pfizer Inc., Nueva York, NY); Monopharm-C; anticuerpo monoclonal anti-her-2/neu 4B5 (Ventana Medical Systems, Inc., Tucson, arizona); anticuerpo monoclonal anti-EGFR ior egf.r3; anticuerpo monoclonal anti-antígeno asociado a tumor (TAA) ior c5; un anticuerpo anti-FLK-2; el FcyRi (CD64)/HER-2/nuevo anticuerpo biespecífico MDX-260; un anticuerpo antinuclear (An A Ab); SMART ID10Ab; SMART A b L 364Ab; el anticuerpo monoclonal anti-tag72 CC49; ImmuRAIT-CEA (Immunomedics, Inc., Morris Plains, NJ); un anticuerpo anti-IL-4; un anticuerpo anti-IL-5; un anticuerpo anti-IL-9; un anticuerpo anti-Ig; un anticuerpo anti-IgE; un anticuerpo contra la hepatitis B derivado del suero; un anticuerpo contra la hepatitis B recombinante; un anticuerpo anti-CD40; un anticuerpo anti-OX40; un anticuerpo anti-receptor de citoquinas; y similares.
Otros anticuerpos igualmente útiles en la composición y/o métodos descritos en este documento, e indicaciones médicas para las que cada uno puede ser útil, incluyen alemtuzumab (leucemia linfocítica crónica de células B), gemtuzumab ozogamicina (leucemia mieloide aguda CD33+), hP67.6 (leucemia mieloide aguda CD33+), infliximab (enfermedad inflamatoria intestinal y artritis reumatoide), etanercept (artritis reumatoide), tositumomab, MDX-210, oregovomab, anti-receptor de EGF (mAb), proteína anti-factor tisular tisular (TF), edrecolomab, ibritumomab tiuxetan, mAb anti-idiotípico imitador del epítopo gangliósido GD3, mAb anti-HLA-Dr10, mAb humanizado anti-CD33, humAb anti-CD52, mAb anti-CD 1 (ior t6), m DX-22, celogovab, mAb anti-17-1A, bevacizumab, mAb antiidiotípico imitador del proteoglicano de alto peso molecular (I-Mel-1), mAb antiidiotípico imitador del proteoglicano de alto peso molecular (I-Mel-2), Ab anti-CEA, hmAbH11, mAb proteínas asociadas Ad N o anti-ADN (histonas), mAb Gliomab-H, mAb GNI-250, anti-CD22, CMA 676), mAb humano antiidiotípico del gangliósido GD2 ior egf/r3, mAb antiglicoproteína ior c2, mAb anti-FLK- 2/FLT-3, mAb biespecífico anti-GD-2, autoanticuerpos antinucleares, Ab anti-HLA-DR, mAb anti-CEA, palivizumab, alemtuzumab, BLyS-mAb, anti-VEGF2, anti-receptor Trail; mAb B3, mAb BR96, y mAb Abx-Cb1.
Anticuerpos adecuados también incluyen los siguientes:
Anticuerpos que se dirigen a células presentadoras de antígenos tales como, por ejemplo, anti-Dec205, anti-MHC II, anti-CD11c.
Anticuerpos de apoptosis tales como, por ejemplo, anticuerpos contra el ligando Fas/Fas, que incluyen, entre otros, anticuerpos contra el ligando Fas/Fas antihumano, anticuerpos contra el ligando Fas/Fas anti-murino, anticuerpos Granzyme, anticuerpos Granzyme B; anticuerpos Bcl, que incluyen, entre otros, anticuerpos anti-citocromo C, anticuerpos contra Bcl antihumano (monoclonales), anticuerpos contra Bcl antihumano (policlonales), anticuerpos contra Bcl anti-murino (monoclonales) y anticuerpos contra Bcl anti-murino (policlonales);
Diversos anticuerpos de apoptosis tales como, por ejemplo, anticuerpos anti-TRADD, anti-TRAIL y anti-DR3;
Diversos anticuerpos de apoptosis tales como, por ejemplo, anticuerpos contra Bim que incluyen, entre otros, anticuerpos contra bim antihumano murino (policlonales), anticuerpos contra bim antihumano murino (monoclonales); Anticuerpos caspasa tales como, por ejemplo, anticuerpos caspasa antihumana (monoclonales) y anticuerpos caspasa anti-murina.
Anticuerpos anti-CD tales como, por ejemplo, anti-CD25, anti-CD29, anti-CD29, anti-CD41a, anti-CD42b, anti-CD42b, anti-CD42b, anti-CD43, anti-CD46, anti-CD61, anti-CD61, anti-CD62/P-slctn, anti-CD62/P-slctn, y anti-CD 154; Anticuerpos de quimioquinas humanas tales como, por ejemplo, anticuerpos CNTF humanos, anticuerpos eotaxina humanos, anticuerpos péptido-78 activador de neutrófilos epiteliales humanos (ENA-78), anticuerpos éxodo humanos, anticuerpos GRO humanos HCC-1, anticuerpos 1-309 humanos, anticuerpos IP-10 humanos, anticuerpos I-TAC humanos, anticuerpos LIF humanos, anticuerpos de quimioquina expresadas en el hígado (LEC), anticuerpos de linfotaxinas humanos, anticuerpos MCP humanos, anticuerpos MIP humanos, monocina humana inducida por anticuerpos IFN-y (MIG/CXCL9), anticuerpos NAP-2 humanos, anticuerpos NP-1 humanos, anticuerpos del factor 4 plaquetario humanos, anticuerpos RANTES humanos, anticuerpos SDF humanos y anticuerpos TECK humanos; Anticuerpos de quimioquinas murinos tales como, por ejemplo, anticuerpos quimioquinas murina atrayentes de células B humanas, anticuerpos de quimioquina-1, anticuerpos eotaxina murinos, anticuerpos de éxodo murino, anticuerpos GCP-2 murinos, anticuerpos KC murinos, anticuerpos MCP murinos, anticuerpos MIP murinos y anticuerpos RANTES murinos;
Anticuerpos de quimioquinas de rata, tales como, por ejemplo, anticuerpos CNTF de rata, anticuerpos GRO de rata, anticuerpos MCP de rata, anticuerpos MIP de rata y anticuerpos RANTES de rata;
Anticuerpos de citoquinas/receptores de citoquinas tales como, por ejemplo, anticuerpos de citoquinas/receptores de citoquinas biotinilados humanos, anticuerpos de interferón humano (IFN), anticuerpos interleuquina humanos (IL), anticuerpos leptina humanos, anticuerpos oncostatina humanos, anticuerpos del factor de necrosis tumoral humanos (TFN), anticuerpos de la familia de receptores TFN humanos, anticuerpos de citoquinas/receptores de citoquinas biotiniladas murinas, anticuerpos IFN murinos, anticuerpos IL murinos, anticuerpos TFN murinos, anticuerpos receptores de TFN murinos, anticuerpos de citoquinas/receptores de citoquinas biotiniladas de rata, anticuerpos IFN de rata, anticuerpos IL de rata y anticuerpos TFN de rata;
Anticuerpos de matriz extracelular tales como, por ejemplo, anticuerpos de colágeno/procolágeno, anticuerpos de laminina, anticuerpos de colágeno humano, anticuerpos de laminina humana, anticuerpos de procolágeno humano, anticuerpos de vitronectinas/receptores de vitronectinas, anticuerpos de vitronectina humana, anticuerpos de receptores de vitronectina humanos, anticuerpos de fibronectina/receptores de fibronectina, anticuerpos de fibronectina humanos y anticuerpos de receptores de fibronectina humanos;
Anticuerpos del factor de crecimiento tales como, por ejemplo, anticuerpos del factor de crecimiento humano, anticuerpos del factor de crecimiento murino y anticuerpos del factor de crecimiento porcino;
Diversos anticuerpos tales como, por ejemplo, anticuerpos de baculovirus, anticuerpos de cadherina, anticuerpos de complemento, anticuerpos Clq, anticuerpos del factor VonWillebrand, anticuerpos Cre, anticuerpos VIH, anticuerpos de la gripe, anticuerpos de leptina humanos, anticuerpos de leptina murinos, anticuerpos CTLA-4 murinos, anticuerpos contra P450 y anticuerpos de ARN polimerasa; y
Anticuerpos neurobiológicos tales como, por ejemplo, anticuerpos amiloides, anticuerpos GFAP, anticuerpos NGF humanos, anticuerpos NT-3 humanos y n T-4 humanos.
Otros anticuerpos adecuados para su uso en la invención incluyen, por ejemplo, los anticuerpos enumerados en referencias tales como el catálogo MSRS de Anticuerpos Primarios y el Directorio de Linscott.
En algunas realizaciones, la fracción de direccionamiento puede incluir, en lugar de un anticuerpo completo, un fragmento de anticuerpo. Un fragmento de anticuerpo se puede obtener digiriendo (por ejemplo, con pepsina o papaína) un anticuerpo completo mediante cualquier método convencional para producir, por ejemplo, un fragmento 5S denominado F(ab')2, un fragmento monovalente Fab' 3,5S, un fragmento Fab' monovalente y/o un fragmento Fc. Alternativamente, se puede preparar un fragmento de anticuerpo mediante métodos conocidos habituales, que incluyen la expresión en una célula huésped heteróloga (p. ej., E. coli) de un polinucleótido que codifica el fragmento.
Fracciones de direccionamiento de moléculas pequeñas pueden incluir, por ejemplo, ligandos de marcadores expresados por células diana. En algunos casos, la fracción de direccionamiento puede incluir un ligando de TLR2 (receptor tipo Toll 2). Ligandos ilustrativos de TLR2 incluyen, por ejemplo, poliICLC, resiquimod, imiquimod, CpG ODN, flagelina, PAMCys3K, MALP2 y lipopolisacárido (LPS).
Otras fracciones de direccionamiento ejemplares incluyen fracciones que pueden dirigirse a células o tejidos tales como, por ejemplo, células del sistema inmunitario o tejidos endoteliales.
En algunas realizaciones alternativas, una variante de anexina II puede acoplarse en una fracción de direccionamiento de células dendríticas. La fracción de direccionamiento puede ser un anticuerpo (p. ej., un anticuerpo anti-DC) o un ligando que no sea un anticuerpo que reconozca un marcador específico de d C.
Marcadores específicos de DC adecuados pueden incluir, por ejemplo, un marcador coestimulador tal como, por ejemplo, cualquier miembro de la superfamilia TFNR (p. ej., CD40), CD70, CD80, CD86, B7-CD, B7.1, B7.2, etc. Otros marcadores específicos de DC incluyen algunos receptores de azúcar tales como, por ejemplo, el receptor de manosa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, una variante de anexina II puede acoplarse con un azúcar tal como, por ejemplo, manosa, para dirigir la administración de la variante de anexina II, por ejemplo, a células dendríticas presentadoras de antígeno.
Una composición inmunomoduladora que incluye una fracción de direccionamiento que reconoce un marcador coestimulador puede usarse para administrar dos estímulos activadores de DC (es decir, variante de anexina II y coestimulación) en una sola entidad química.
Tal como se usa en el presente documento, un anticuerpo anti-DC se refiere a un anticuerpo que reconoce un antígeno de células dendríticas. Una fracción de direccionamiento de células dendríticas adecuada puede unirse a cualquier antígeno que se exprese diferencialmente, ya sea cualitativa o cuantitativamente, mediante células dendríticas. Fracciones de direccionamiento de células dendríticas adecuadas pueden unirse a antígenos tales como, por ejemplo, DEC205, BDCA-1, BDCA-2, BDCA-3, BDCA-4, DC-SIGN, L-SIGN, HLR-DR, CD11c, CD13, CD14, CD21, CD33, CD35, CD123, lectinas de tipo C, integrinas (p. ej., a4, a6, a lp l) y/o cualquiera de los receptores tipo Toll (TLR), etc.
Independientemente de si la fracción de direccionamiento ha reconocido un marcador o un antígeno específico de DC, acoplar una variante de anexina II a la fracción de direccionamiento puede limitar la disponibilidad sistémica de la variante de anexina II, incluso aunque se administre por una vía de administración sistémica. Además, la variante de anexina II puede concentrarse en los alrededores de células dendríticas, madurando y activando así las células dendríticas de manera más eficaz. Las células dendríticas activadas en el sitio de un tumor, o incluso dentro de una masa tumoral, pueden utilizar un antígeno tumoral presente en la superficie de las células tumorales para iniciar una respuesta inmunitaria contra el tumor. Este método podría proporcionar una terapia antitumoral generalizada sin necesidad de anticuerpos específicos contra un tumor.
En otras realizaciones alternativas, una variante de anexina II puede acoplarse a una fracción de direccionamiento anti-macrófagos. Los macrófagos a menudo se localizan en los alrededores de células tumorales. Por lo tanto, de nuevo, la disponibilidad sistémica de la variante de anexina II se puede limitar y la variante de anexina II se puede concentrar en los alrededores de las células diana (es decir, macrófagos), activando así los macrófagos de manera más eficaz. Se sabe que los macrófagos activados poseen actividad antitumoral. Por lo tanto, este método podría proporcionar una terapia tumoral generalizada sin necesidad de anticuerpos específicos contra un tumor.
En otras realizaciones alternativas, una variante de anexina II puede acoplarse a una fracción específica de direccionamiento que reconozca un antígeno de superficie en un tipo de célula que puede matar directamente células tumorales tales como, por ejemplo, células T citotóxicas CD8+, células NK o células NKT. Una vez más, aunque la composición inmunomoduladora se administre sistémicamente, la variante de anexina II se puede concentrar alrededor de las células que matan tumores, (a) activando así las células que matan tumores de manera más efectiva y/o (b) limitando la disponibilidad sistémica de la variante de anexina II. Las células que matan tumores activadas en el sitio de un tumor, o incluso dentro de una masa tumoral, pueden utilizar un antígeno tumoral presente en la superficie de las células tumorales para iniciar una respuesta inmunitaria contra el tumor. Este método podría proporcionar una terapia tumoral generalizada sin necesidad de anticuerpos específicos contra un tumor.
En otras realizaciones alternativas, una variante de anexina II puede acoplarse a una fracción de direccionamiento que reconoce, por ejemplo, una diana endotelial. Existen diferencias significativas en los entornos del endotelio de masas tumorales en comparación con lechos capilares normales. Existen diferencias, por ejemplo, en la identidad y el grado en que se expresan ciertas proteínas de superficie endotelial, moléculas de adhesión (p. ej., integrinas), proteínas de la matriz extracelular, receptores del factor de crecimiento, etc. Estas diferencias pueden aprovecharse para dirigir la administración de una variante de anexina II al endotelio relacionado con el tumor. Se ha demostrado que algunos reactivos que se dirigen específicamente a tales diferencias son útiles como terapias antiangiogénicas. El acoplamiento de un agente antiangiogénico de este tipo, como una fracción de direccionamiento, a una variante de anexina II puede combinar dos terapias antitumorales eficaces: inmunoterapia y terapia antiangiogénesis.
Reactivos antiangiogénesis adecuados incluyen, por ejemplo, anticuerpos anti-CD 105 (CD 105 se sobreexpresa en el endotelio tumoral), anticuerpos anti-ED-B (ED-B es una isoforma de fibronectina que se encuentra en masas tumorales), péptidos reconocidos por integrinas endoteliales asociadas con tumores y factores de crecimiento cuyos receptores están regulados positivamente en el endotelio tumoral (p. ej., factor de crecimiento endotelial vascular).
El uso de reactivos antiangiogénicos de este modo puede ofrecer una combinación de antiangiogénesis e inmunoterapia. Además, la administración dirigida de una variante de anexina II al endotelio tumoral, a diferencia del propio tumor, puede proporcionar un tratamiento a largo plazo más efectivo ya que, en general, el endotelio es un tejido menos mutagénico que una masa tumoral. Por lo tanto, es mucho menos probable que la terapia dirigida al endotelio cause resistencia a medicamentos. Además, una terapia dirigida hacia el endotelio puede ser eficaz contra prácticamente cualquier tumor vascularizado (p. ej., cáncer de mama, cáncer de próstata, cáncer de pulmón) sin necesidad de reactivos específicos al tumor.
En algunas realizaciones, una variante de anexina II puede acoplarse a una fracción estabilizante. La fracción estabilizante puede ser, o derivarse de, cualquier material adecuado de modo que la fracción estabilizante aumente la estabilidad de la composición en el cuerpo en comparación con una composición correspondiente sin la fracción estabilizante. Por lo tanto, la fracción estabilizante puede aumentar la vida media de la composición. Tal como se usa en el presente documento, “vida media” puede referirse a la vida media biológica, es decir, el tiempo que tarda la composición en perder la mitad de su actividad biológica, o puede referirse a la vida media en plasma, es decir, el tiempo que tarda la concentración plasmática de la composición en disminuir a la mitad. La relación entre la vida media biológica y la vida media plasmática de una sustancia puede no estar necesariamente correlacionada entre sí debido, por ejemplo, a la acumulación de la sustancia en tejidos, la presencia de metabolitos activos y las interacciones sustancia-receptor. Los expertos en la materia entienden, para cada conjunto dado de circunstancias, si la vida media biológica o la vida media plasmática es más relevante para el conjunto dado de circunstancias. En algunos casos, la fracción estabilizante puede disminuir la tasa de eliminación, es decir, la tasa a la que los riñones eliminan la composición de la circulación. En otros casos, la fracción estabilizante puede disminuir la tasa a la que se degrada la composición. Fracciones estabilizadoras ejemplares incluyen, por ejemplo, polietilenglicol (PEG) y/o región Fc (fragmento cristalizable) de un anticuerpo.
La composición puede incluir además uno o más adyuvantes adicionales. Adyuvantes adicionales adecuados incluyen, por ejemplo, nucleótidos CpG, aminas imidazoquinolina o polipéptidos inmunomoduladores tales como, por ejemplo, diversas proteínas de choque térmico. Al igual que con las combinaciones de variante de anexina II/antígeno, una combinación de variante de anexina II/adyuvante puede mezclarse entre sí, en cosuspensión o proporcionarse en una emulsión. Cuando se proporciona en una emulsión, la variante de anexina II y el segundo adyuvante se pueden proporcionar en la misma fase de la emulsión o en fases separadas.
Cuando el segundo adyuvante incluye un polipéptido inmunomodulador, la combinación de variante de anexina II y adyuvante pueden acoplarse entre sí de manera que la variante de anexina II y el segundo adyuvante puedan funcionar como coadyuvantes. La variante de la anexina II y el segundo polipéptido inmunomodulador pueden acoplarse covalentemente, acoplarse por afinidad o acoplarse como un polipéptido de fusión.
En otras realizaciones, la composición puede incluir una o más moléculas asociadas a anexina, tales como, por ejemplo, la subunidad heterotetrámera de 11 kDa, una proteína de choque térmico (por ejemplo, Hsp1, Hsp8 o Hsp9) o un no proteico asociado con anexina tal como, por ejemplo, un fosfolípido o un carbohidrato.
En algunas realizaciones, las composiciones descritas en el presente documento pueden incluir opcionalmente además un vehículo farmacéuticamente aceptable. “Farmacéuticamente aceptable” se refiere a un diluyente, un vehículo, un excipiente, sal, etc., compatible con los demás ingredientes de la composición y no perjudicial para su receptor. Típicamente, una composición tal como se describe en este documento puede incluir un vehículo farmacéuticamente aceptable cuando la composición se usa como se describe en este documento. Una composición se puede formular en una preparación farmacéutica en cualquiera de una variedad de formas adaptadas a la vía de administración elegida, incluidas vías adecuadas para estimular una respuesta inmunitaria a un antígeno. Por lo tanto, se puede preparar una composición para la administración por vías conocidas que incluyen, por ejemplo, oral; parenteral incluyendo intradérmica, transcutánea, subcutánea, intramuscular, intravenosa, intraperitoneal, etc.; y/o vía tópica, tal como intranasal, intrapulmonar, intramamaria, intravaginal, intrauterina, intradérmica, transcutánea y/o rectal.
En algunas realizaciones, los métodos descritos en el presente documento pueden incluir la administración de una cantidad de variante de anexina II suficiente para proporcionar una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 100 ng/kg a aproximadamente 50 mg/kg, al sujeto, aunque en algunas realizaciones los métodos pueden realizarse mediante la administración de la variante de anexina II en una dosis fuera de este rango. En algunas de estas realizaciones, el método incluye administrar la variante de anexina II suficiente para proporcionar una dosis de alrededor de 10 pg/kg a alrededor de 5 mg/kg al sujeto, por ejemplo, una dosis de alrededor de 100 pg/kg a alrededor de 1 mg/kg o desde aproximadamente 50 pg/kg a aproximadamente 500 pg/kg.
Alternativamente, la dosis se puede calcular utilizando el peso corporal real obtenido justo antes del comienzo de un ciclo de tratamiento. Para las dosis calculadas de esta manera, la superficie corporal (m2) se calcula antes del comienzo del ciclo de tratamiento utilizando el método de Dubois: m2 = (peso kg0425 x altura cm0725) x 0,007184. En algunas realizaciones, los métodos pueden incluir la administración de variante de anexina II suficiente para proporcionar una dosis de, por ejemplo, aproximadamente 0,01 mg/m2 a aproximadamente 10 mg/m2.
En otro aspecto, esta divulgación describe varios métodos para proporcionar inmunoterapia a un sujeto que necesita dicho tratamiento. En general, los métodos implican la administración de una cantidad eficaz de una composición descrita en el presente documento a un sujeto que necesita dicho tratamiento. Tal como se usa aquí, una cantidad eficaz se refiere a una cantidad administrada en una dosis y régimen adecuados que proporciona una inmunoterapia profiláctica o terapéutica. Una cantidad eficaz puede ser cualquier cantidad que reduzca, limite la progresión, mejore o resuelva, en cualquier medida, los síntomas o signos clínicos relacionados con una enfermedad en comparación con un individuo en situación similar pero no tratado. “Mejorar” se refiere a cualquier reducción del grado, severidad, frecuencia y/o probabilidad de un síntoma o signo clínico característico de una enfermedad particular.
Las composiciones descritas en el presente documento proporcionan una nueva estrategia para proporcionar inmunoterapia aplicable a inmunoterapia dirigida contra una amplia gama de enfermedades. Tal como se ha analizado anteriormente, tales enfermedades pueden incluir tumores o enfermedades que resultan de la infección por un agente infeccioso, inmunoterapia en la que se desea una respuesta inmunitaria Th1 (es decir, una respuesta inmunitaria mediada por células). Por consiguiente, los métodos también pueden ser aplicables para terapia dirigida contra enfermedades mediadas porTh2 tales como, por ejemplo, alergia y/o asma. En tales casos, las composiciones tienen utilidad porque la administración de las composiciones predispone el sistema inmunitario a favor de una respuesta inmunitaria dominante Th1/ mediada por células y en contra de una respuesta inmunitaria Th2.
En algunas realizaciones, los métodos pueden implicar la preparación de una vacuna de células dendríticas, que luego se puede administrar a un sujeto que necesite dicho tratamiento. Las células dendríticas se pueden pulsar con una composición variante de anexina II/antígeno, tal como se describe en el presente documento. La preparación de las células dendríticas de esta manera puede aumentar la presentación cruzada del antígeno en MHC I y, por tanto, la respuesta de las células CD8+ T provocada por las células dendríticas de la vacuna.
Para cualquier método descrito en este documento que incluya pasos específicos, los pasos se pueden realizar en cualquier orden factible. Y, según corresponda, cualquier combinación de dos o más pasos puede realizarse simultáneamente.
Ejemplos
Tabla 1. Variantes de anexina II
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Ejemplo 1
Se diferenciaron células dendríticas derivadas de médula ósea (BMDC) de ratones C57BL/6 y se pulsaron con hgp10025-33 (SEQ ID NO: 27) con proteína de fusión anexina II-Ov A (SEQ ID NO: 32) a la misma concentración (*) o igual relación molecular (**) como monómero A2 (SEQ ID NO: 28) y se incubó durante 24 horas. El monómero de anexina A2 se utilizó como control positivo. Se añadieron células T CD8+ Pmel purificadas y se cocultivaron durante 48 horas más. Se cuantificó IFN-y en el sobrenadante de cultivo tisular mediante matriz de perlas. Los resultados se muestran en la figura 1.
Se pulsaron BMDC con OVA248-274 (SEQ ID NO: 31), anexina II (monómero A2, SEQ ID NO: 28), una combinación de OVA248-274 y anexina II (monómero A2 OVA), o proteína de fusión anexina II-OVA (A2OVA, SEQ ID NO: 32), y se incubó durante 24 horas. Se añadieron células CD8+ T OT-1 purificadas y se cocultivaron durante 48 horas adicionales. Se cuantificó IFN-y en el sobrenadante de cultivo tisular mediante matriz de perlas. Los resultados se muestran en la figura 2.
Se cultivaron BMDC (tipo salvaje, TLR4'/_, y MyD88'/_) con 20 ng/ml de GM-CSF durante seis días, luego se pulsaron con 50 ng de Pam3CSK4, 50 ng de LPS o 5o |jg del péptido de fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 5, A2-15aa). Después de 48 horas, se analizó el TFN en el sobrenadante de cultivo celular mediante matriz de perlas. Los resultados se muestran en la figura 10
Se cultivaron BDMC (tipo salvaje, TLR2'/_, TLR4'/_ y MyD88'/_) con 20 ng/ml de GM-CSF durante seis días, luego se pulsaron con 50 ng de Pam3CSK4, 50 ng de LPS, 50 jg del fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 5, 15aa A2p) o 50 |jg de variante de anexina II A-6 (SEQ ID NO: 17, 15aa A2p6 AL). Después de 48 horas, las células se tiñeron para CD11c, MHC II, CD80 y CD86 y se analizaron por citometría de flujo. El MFI que se muestra es de una célula viva, prueba CD11C+MHCII+. Los resultados de la prueba CD80 se muestran en la figura 11; los resultados de la prueba CD86 se muestran en la figura 12
Ejemplo 2
Células Azules HEK 293 (Invivogen, San Diego, CA) transfectadas de manera estable con hTLR2 se pulsaron con proteína de fusión anexina II-OVA (A2OVA, SEQ ID NO: 32) a la misma concentración que el monómero de anexina II (péptido A2, SEQ ID NO: 28). Se usaron polipéptido N-terminal de anexina II codificado (SEQ ID NO: 29, codificado) y un fragmento de anexina II (SEQ ID NO: 30, minus p11) como controles. Las células se incubaron durante 48 horas. Después de la incubación, se añadió sobrenadante a Quanti-Blue (Invivogen, San Diego, CA) para la detección de fosfatasa alcalina secretada. Los resultados se muestran en la figura 3.
Ejemplo 3
Tal como se muestra en la figura 4A, se vacunaron ratones BL/6 durante cuatro días consecutivos en la pata trasera con Poly:ICLC y 50 jg de proteína de fusión A2OVA (SEQ ID NO:32), A2OVA-pp11 (SEQ ID NO:30, o péptido A2OVA codificado (SEQ ID NO: 29). El día 8, se extrajo sangre de los ratones y se analizó la sangre completa para determinar la expansión de CD8+ SIINFEKL+. Los resultados se muestran en la figura 4B.
Los ratones BL/6 se vacunaron por separado durante cuatro días consecutivos en la pata trasera con ovoalbúmina (OVA), ovoalbúmina 50 jg del péptido de fragmento N-terminal de anexina II de 15 aminoácidos (SEQ ID NO: 5, 15aa), u ovoalbúmina 50 jg de anexina II (SEQ ID NO: 28, rA2). El día 8, se extrajo sangre de los ratones y se

Claims (15)

REIVINDICACIONES
1. Fragmento de anexina II que consta de una secuencia de aminoácidos según cualquiera de SEQ ID NO: 2 - 4.
2. Composición que comprende el fragmento de anexina II según la reivindicación 1.
3. Composición según la reivindicación 2 que comprende además al menos un antígeno.
4. Composición según la reivindicación 2 o la reivindicación 3 que comprende además un segundo adyuvante.
5. Composición según la reivindicación 3 o la reivindicación 4, en la que el antígeno o el segundo adyuvante se acopla al fragmento de anexina II.
6. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 5, que comprende además una fracción de direccionamiento acoplada al fragmento de anexina II.
7. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 6 que comprende además una fracción estabilizante acoplada al fragmento de anexina II.
8. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que el acoplamiento comprende un acoplamiento covalente.
9. Composición según la reivindicación 8, en la que el acoplamiento covalente comprende un entrecruzamiento covalente entre:
el fragmento de anexina II; y
el antígeno, la fracción de direccionamiento, la fracción estabilizante o el segundo adyuvante.
10. Composición según la reivindicación 8 o 9, en la que el acoplamiento covalente comprende una fusión polipeptídica entre:
el fragmento de anexina II; y
el antígeno, la fracción de direccionamiento, la fracción estabilizante o el segundo adyuvante.
11. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 7, en la que el acoplamiento comprende un acoplamiento por afinidad.
12. Composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que comprende además un vehículo farmacéuticamente aceptable.
13. Composición según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 12 para usar en medicina.
14. Método in vitro que comprende:
poner en contacto células dendríticas con la composición según cualquiera de las reivindicaciones 3 a 12, en donde la composición comprende un antígeno.
15. Composición para usar según la reivindicación 13, en la que las células dendríticas se ponen en contacto con la composición según el método de acuerdo con la reivindicación 14 y las células dendríticas se administran a un sujeto.
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