ES2323588T3

ES2323588T3 - Proteinas que pertenecen a la familia bcl-2 y fragmentos de las mismas, y su uso en pacientes con cancer.

Info

Publication number: ES2323588T3
Application number: ES04797460T
Authority: ES
Inventors: Eivind Per Thor Straten; Mads Hald Andersen
Original assignee: Merck Patent GmbH
Current assignee: Merck Patent GmbH
Priority date: 2003-11-19
Filing date: 2004-11-18
Publication date: 2009-07-21
Anticipated expiration: 2024-11-18
Also published as: AU2004290866A1; CN1921878A; EP1691824B1; AU2004290866B2; JP2011246496A; JP4926714B2; WO2005049073A3; EP2087904A1; RU2006121466A; CA2546794C; JP2007511547A; DK1691824T3; ES2436429T3; JP5502823B2; DE602004019965D1; PL1691824T3; DK2087904T3; ATE424842T1; ZA200604866B; CN1921878B

Abstract

Péptido inmunogénicamente activo aislado que comprende como máximo 15 aminoácidos, derivado de la proteína Bcl-2, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: WLSLKTLLSL (SEQ ID NO:6), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO:8), YLNRHLHTWI (SEQ ID NO:10) y NIALWMTEYL (SEQ ID NO:11) para su uso como medicamento.

Description

Proteínas que pertenecen a la familia Bcl-2 y fragmentos de las mismas, y su uso en pacientes con cáncer.

Campo de la invención

La presente invención se refiere en general al campo del tratamiento y la profilaxis contra el cáncer. En particular, se proporcionan proteínas reguladoras de la apoptosis aisladas o fragmentos peptídicos de las mismas que pueden provocar respuestas inmunitarias contra el cáncer. Específicamente, se proporciona el uso de tales proteínas que pertenecen a la familia de proteínas Bcl-2 y fragmentos peptídicos inmunogénicos de las mismas en el diagnóstico, pronóstico y tratamiento contra el cáncer.

Antecedentes técnicos y técnica anterior

El desarrollo de resistencia de las células cancerosas a una amplia variedad de agentes quimioterápicos representa un obstáculo principal en el tratamiento satisfactorio del cáncer. Se observa resistencia a fármacos en una amplia gama de tipos de células cancerosas. Muchos mecanismos contribuyen a la resistencia a fármacos, incluyendo inactivación del fármaco, extrusión del fármaco por bombas de la membrana celular, mutaciones de dianas farmacológicas y fallo para iniciar la apoptosis. La prevención de la apoptosis puede resultar de una variedad de estados, incluyendo la retención del potencial de membrana mitocondrial y la estimulación de citocinas.

La búsqueda de proteínas responsables de los fenotipos resistentes a fármacos ha implicado a la molécula antiapoptótica Bcl-2. La sobreexpresión de Bcl-2 desempeña un papel en el desarrollo de la resistencia a fármacos en la leucemia y otros tumores propensos a la apoptosis y, por consiguiente, un mal pronóstico en diversos cánceres en seres humanos. Bcl-2 pertenece a una familia de proteínas, la familia Bcl-2, cuyos miembros regulan la apoptosis (para revisión, véase Reed et al (Oncogen, 1998, vol. 17, nº 24). La familia incluye miembros tanto proapoptóticos como antiapoptóticos. El documento WO89/58541 describía la identificación de una región interna de 63 aminoácidos en Bcl-XL implicada en la unión al citocromo C por péptidos Bcl-XL/Bcl-2. Se demostró que péptidos de los mismos competían con los péptidos de longitud completa por la unión al citocromo C. En el documento US 5.856.171, se usó la proteína Bax de unión a Bcl-2 como diana para el desarrollo de agentes de modulación de la apoptosis, y se dieron a conocer péptidos adecuados para la generación de anticuerpos específicos frente a Bax. El documento WO 02/05835 describía canales iónicos formados por miembros de la familia Bcl-2, implicados en la liberación del citocromo C y métodos para identificar un compuesto que puede interferir con estos canales. El documento WO 01/44282 describía las secuencias de ADN y de proteína de BCL-G y la modulación de la apoptosis mediante la modulación de la actividad de BCL-G. El documento US 5.470.955 describía Mcl-1 y anticuerpos frente a Mcl-1 para su uso en diagnóstico y tratamiento.

Aunque sigue siendo difícil de alcanzar un entendimiento preciso de cómo Bcl-2 ejerce sus efectos antiapoptóticos, se ha descubierto que se sobreexpresa en muchos cánceres incluyendo cánceres de pulmón, colorrectal, de próstata y de mama así como en leucemias y linfomas.

Por tanto, Bcl-2 es un factor celular crítico, ya que el aumento de los niveles de expresión de esa proteína confiere resistencia a estímulos apoptóticos, contribuyendo de ese modo a la patogenia y progresión del cáncer.

El proceso mediante el cual el sistema inmunitario de los mamíferos reconoce y reacciona frente a materiales extraños o ajenos es complejo. Una faceta importante del sistema es la respuesta de células T. Esta respuesta requiere que las células T reconozcan e interaccionen con complejos de moléculas de la superficie celular denominadas antígenos leucocitarios humanos (HLA) que constituyen el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) humano, y péptidos. Los péptidos se derivan de moléculas más grandes, que se procesan por las células, que a su vez presentan la molécula de HLA/CMH. La interacción de las células T y los complejos de HLA/péptido está restringida, requiriendo una célula T que es específica para una combinación particular de una molécula de HLA y un péptido. Si no está presente una célula T específica, no existe ninguna respuesta de células T incluso si está presente su complejo asociado. De manera similar, no existe ninguna respuesta si el complejo específico está ausente, pero la célula T está presente.

El mecanismo por el que las células T reconocen anomalías celulares se ha implicado también en el cáncer. Por ejemplo, en el documento WO92/20356, se da a conocer una familia de genes que se procesan para dar péptidos que, a su vez, se expresan sobre superficies celulares, y pueden conducir a la lisis de las células tumorales mediante CTL específicos. Estos genes se denominan la familia MAGE y se dice que codifican para "precursores de antígenos de rechazo de tumores" o moléculas "TRAP", y los péptidos derivados de los mismos se denominan "antígenos de rechazo de tumores" o "TRA".

En Akatsuka Yoshiki et al (Journal of Exp. Med. 2003, vol. 197, nº 11) se identificaron péptidos derivados de BCL2A1 como epítopos reconocidos por clones de CTL restringidos a HLA aislados de pacientes con cáncer que habían recibido un transplante de médula ósea. Igualmente, se ha descrito un epítopo derivado de BCL2A1 por Tetsuya et al (British journal of Hematology, 2004, vol. 124, nº 5) Sæterdal et al (PNAS. 2001, vol. 98. nº 23) describían un péptido TGF\betaRII derivado de una mutación con desplazamiento del marco de lectura que funciona como un antígeno específico de tumor en el cáncer colorrectal.

En el documento WO 94/05304, se dan a conocer nonapéptidos que se unen a la molécula HLA-A1. Esta referencia da a conocer que, dada la especificidad conocida de péptidos particulares por moléculas de HLA particulares, debería esperarse que un péptido particular se una a una molécula de HLA, pero no a otras. Esto es significativo, ya que individuos diferentes presentan fenotipos de HLA diferentes. Como resultado, mientras que la identificación de un péptido particular como capaz de interaccionar con una molécula de HLA específica tiene repercusiones diagnósticas y terapéuticas, éstas son sólo relevantes para individuos con ese fenotipo de HLA particular.

El documento WO 02/072627 presentaba un método para la identificación de péptidos para su uso en vacunas para la inducción de un efecto citotóxico anti-tumoral. Se sugerían péptidos de varias proteínas humanas incluyendo miembros de la familia de proteínas Bcl-2.

Por tanto, está bien establecido que los epítopos peptídicos derivados de antígenos asociados a tumores (TAAs) pueden ser reconocidos como antígenos por los linfocitos T citotóxicos (CTLs) en el contexto de moléculas de CMH. Sin embargo, aunque generalmente se acepta que la mayoría si no todos los tumores son antigénicos, sólo algunos son de hecho inmunogénicos en el sentido de que la progresión tumoral se controla fácilmente por el sistema inmunitario.

Para vencer esta limitación, se han iniciado varios estudios inmunoterapéuticos, por ejemplo vacunaciones con péptidos derivados de TAA. Para el melanoma, el tumor para el que se ha caracterizado el mayor número de TAAs definidos por CTL, se han inducido respuestas de CTL potentes frente a antígenos mediante vacunación, y algunos pacientes experimentaron una remisión completa de su enfermedad. Sin embargo, la mayoría de los epítopos peptídicos usados en estos ensayos de vacunación son específicos de melanocitos, y estos péptidos no pueden aplicarse para tumores de origen no melanocítico. Además, la expresión de estos TAAs es heterogénea entre tumores de pacientes diferentes y puede incluso variar entre metástasis obtenidas de un paciente. Sin embargo, durante los últimos dos años se han identificado varios antígenos peptídicos específicos de tumores, que se expresan en varios cánceres diferentes, es decir, HER-2, Muc-1 y telomerasa.

La apoptosis es un programa genético de suicidio celular, y se ha sugerido que la inhibición de la apoptosis es un mecanismo importante implicado en la formación del cáncer prolongando la vida de las células que favorecen la acumulación de mutaciones transformantes. La survivina es un miembro de la familia de proteínas inhibidoras de la apoptosis (IAPs) recientemente identificado. En un análisis de expresión génica global de aproximadamente 4 millones de tránscritos, se identificó la survivina como una de los principales genes regulados por incremento invariablemente en muchos tipos de cáncer pero no en tejido normal. Los tumores malignos sólidos que sobreexpresan survivina incluyen cáncer de pulmón, de colon, de mama, de páncreas y de próstata así como tumores malignos hematopoyéticos. Adicionalmente, se ha informado de que series de cánceres de piel de melanoma y no melanoma son invariablemente positivos para survivina. La sobreexpresión de survivina en la mayoría de los cánceres en seres humanos sugiere un papel general de la inhibición de la apoptosis en la progresión tumoral, un concepto corroborado por la observación de que en el caso de cáncer colorrectal y de vejiga, así como neuroblastoma, la expresión de survivina estaba asociada a un pronóstico desfavorable. Por el contrario, la survivina no puede detectarse en tejidos adultos normales. Estas características cualifican a la survivina como un TAA adecuado para fines tanto diagnósticos como terapéuticos.

Por tanto, durante la última década se ha identificado un gran número de TAAs que se reconocen por los CTLs de una manera restringida por el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Ya que la survivina se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres en seres humanos y la inhibición de su función da como resultado un aumento de la apoptosis, esta proteína puede servir como diana para respuestas de CTL terapéuticas.

La proteína survivina y el uso diagnóstico y terapéutico potencial de la misma se dan a conocer en (1) y en el documento US 6.245.523. La survivina es una proteína citoplasmática de 16,5 kDa que contiene un único BIR y una región de superhélice carboxilo terminal altamente cargada de un dedo RING, que inhibe la apoptosis inducida por la retirada del factor de crecimiento (IL-3) cuando se transfiere en precursores de células B. El gen que codifica para survivina es casi idéntico a la secuencia del receptor de proteasa de células efectoras 1 (EPR-1), pero orientado en la dirección opuesta, lo que sugiere por tanto la existencia de dos genes separados duplicados en una configuración cabeza-a-cabeza. En consecuencia, la survivina puede describirse como un producto de EPR-1 antisentido. Funcionalmente, la inhibición de la expresión de survivina regulando por incremento su tránscrito de EPR-1 antisentido natural da como resultado una apoptosis masiva y un crecimiento celular disminuido.

El documento US 6.245.523 da a conocer el aislamiento de survivina purificada y proporciona moléculas de ácido nucleico que codifican para la proteína survivina, y anticuerpos y otras moléculas que se unen a la survivina. El documento US 6.245.523 también da a conocer fragmentos activos de manera anti-apoptótica de la proteína survivina y variantes de la misma en las que se ha insertado un residuo de aminoácido de manera N- o C-terminal en, o dentro de, la secuencia de survivina dada a conocer. Se da a conocer específicamente que tales péptidos deben contener residuos funcionales clave requeridos para la apoptosis, es decir Trp en la posición 67, Pro en la posición 73 y Cys en la posición 84. Schmidt et al (Blood. 15 de julio de 2003, vol. 102. nº 2) describían además que la survivina y los péptidos de survivina son reconocidos por células T citotóxicas específicas.

Durante la última década, numerosos ensayos clínicos han demostrado la viabilidad de la vacunación específica de péptido para inducir respuestas de células T anti-tumorales en pacientes con cáncer. Sin embargo, la evolución clínica de los pacientes no se mejoró en la mayoría de los casos. Esta discrepancia se ha explicado en numerosos casos mediante mecanismos de escape inmunitario de las células tumorales. Para estrategias terapéuticas que seleccionan como diana antígenos que desempeñan un papel insignificante en el crecimiento del cáncer, la selección de células cancerosas deficientes en antígenos es una limitación bien reconocida.

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Sin embargo, en el caso de pacientes con cáncer de mama, se ha observado un papel paradójico de la proteína Bcl-2. En tumores de mama primarios se ha asociado la negatividad para Bcl-2 con un peor resultado clínico. Adicionalmente, se ha informado de que la sobreexpresión de la proteína Bcl-2 está correlacionada con tumores positivos para receptores de estrógenos mediados por elementos de respuesta a receptores de estrógenos en la región promotora del gen de Bcl-2. El pronóstico de tumores positivos para estrógenos es más favorable que el de tumores negativos para estrógenos. Se han sugerido varias explicaciones posibles para estos resultados aparentemente paradójicos, por ejemplo efectos inhibidores de Bcl-2 sobre la proliferación celular, la regulación de la expresión de Bcl-2 mediante estrógenos y/o la presencia de antagonistas de Bcl-2 que inhiben su función citoprotectora.

Todavía, los estudios anteriores han demostrado que la sobreexpresión de Bcl-2 en el cáncer de mama está correlacionada con la resistencia a fármacos, y que la regulación por disminución de Bcl-2 mediante oligonucleótidos antisentido modula la sensibilidad a fármacos en asociación con la apoptosis. Además, la transfección génica de Bcl-2 en líneas celulares de cáncer de mama ha dado como resultado de manera uniforme una resistencia potenciada a la apoptosis. Además, se ha descrito que la presencia de otro inhibidor de la apoptosis, la proteína survivina en carcinoma de mama estaba fuertemente asociada a la expresión de Bcl-2 y a un índice apoptótico reducido (AI) y a una escasa supervivencia global. Se ha descrito una asociación similar entre la survivina y Bcl-2 en neuroblastoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal, y linfoma no Hodgkin de alto grado. Por tanto, en el carcinoma de mama al igual que en la mayoría de los demás cánceres en seres humanos, la inhibición de la apoptosis es una característica general, y la expresión de genes anti-apoptóticos, por ejemplo genes de survivina y/o Bcl-2, puede producir efectos antiapoptóticos más pronunciados, tal como se refleja en un índice apoptótico reducido. Recientemente, se ha demostrado que la survivina es una diana para la reactividad espontánea de células T en pacientes con diversos cánceres. Estos hallazgos iniciales se han con-
firmado y afianzado más tarde (por los presentes inventores y por otros) tal como en el documento WO 2004/067023.

Sumario de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de que péptidos restringidos a CMH de clase I pueden derivarse de una clase de proteínas reguladoras de la apoptosis diferente de la survivina, es decir la familia de proteínas Bcl-2, que pueden unirse a una moléculas de HLA de CMH de clase I y que provocan de ese modo respuestas inmunitarias de CTL en pacientes que padecen enfermedades de cáncer. Estos hallazgos demuestran que las proteínas que pertenecen a la familia de proteínas Bcl-2 actúan como moléculas TRAP, que se procesan in vivo por las células para dar péptidos que tienen funcionalidad de TRA. Estos hallazgos abren el camino a enfoques terapéuticos y diagnósticos novedosos que pueden aplicarse en general en el control de enfermedades de cáncer.

La presente invención da a conocer que Bcl-2 es una diana adecuada para la inmunoterapia frente a una gama de enfermedades de cáncer. Bcl-2 es un factor celular crítico y su expresión es de importancia para la supervivencia de células tumorales. Por tanto, Bcl-2 es una diana atractiva para la vacunación debido a que el escape inmunitario mediante regulación por disminución o pérdida de expresión de esta proteína perjudicaría el crecimiento tumoral sostenido. Además, en los estudios que condujeron a la presente invención, los inventores buscaron y detectaron reactividad espontánea de células T en PBL frente a péptidos derivados de Bcl-2 en pacientes con cáncer de mama usando un ensayo ELISPOT.

En consecuencia, la presente invención se refiere en un primer aspecto a un péptido inmunogénicamente activo aislado que comprende como máximo 15 aminoácidos, derivado de la proteína Bcl-2, que comprende una secuencias seleccionada del grupo que consiste en: WLSLKTLLSL (SEQ ID NO:6), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO:8), YLNRHLHTWI (SEQ ID NO:10) y NIALWMTEYL (SEQ ID NO:11) para su uso como medicamento en la prevención o el tratamiento de un cáncer.

En un aspecto adicional, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende los péptidos anteriores de la invención.

También es un aspecto de la invención proporcionar una composición de vacuna que comprende un péptido inmunogénicamente activo aislado que comprende como máximo 15 aminoácidos, derivado de la proteína Bcl-2, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: WLSLKTLLSL (SEQ ID NO:6), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO:8), YLNRHLHTWI (SEQ ID NO:10) y NIALWMTEYL (SEQ ID NO:11) para su uso como medicamento en la prevención o el tratamiento de un cáncer.

Todavía en aspectos adicionales la invención se refiere a un kit de diagnóstico para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente con cáncer de células T en PBL o en tejido tumoral que son reactivas con un miembro de la familia de proteínas Bcl-2, comprendiendo el kit el péptido de la invención tal como se definió anteriormente; un complejo de un fragmento de péptido de la invención y una molécula de HLA de clase I o un fragmento de tal molécula.

También es un objetivo de la invención proporcionar un método de detección en un paciente con cáncer de la presencia de células T reactivas con un miembro de la familia de proteínas Bcl-2, comprendiendo el método poner en contacto un tejido tumoral o una muestra de sangre con un complejo de la invención tal como se definió anteriormente y detectar la unión del complejo al tejido o a las células sanguíneas.

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Aún en otro aspecto la invención proporciona el uso de la proteína o el fragmento peptídico tal como se define en el presente documento en la fabricación de un medicamento para el tratamiento de una enfermedad de cáncer.

Descripción detallada de la invención

Un objetivo principal de la presente invención es proporcionar proteínas aisladas que pertenecen a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico inmunológicamente activo de las mismas para su uso como medicamento en la prevención o el tratamiento de un cáncer.

La familia de proteínas Bcl-2 incluye varias proteínas que regulan la apoptosis. Esta familia incluye miembros tanto proapoptóticos como antiapoptóticos. En la presente memoria descriptiva se ha estudiado el potencial de esta familia de proteínas como sustancias activas farmacéuticamente o desde el punto de vista del diagnóstico en el cáncer con particular referencia a la proteína Bcl-2. Además, se describe en detalle el potencial de Bcl-X_{L} y Mcl-1 como sustancia activa farmacéuticamente y desde el punto de vista del diagnóstico. Sin embargo, parece muy probable que existan respuestas inmunitarias similares a las observadas frente a la proteína Bcl-2 o fragmentos de la misma o que puedan introducirse en pacientes con cáncer frente a otros miembros de la familia de proteínas Bcl-2, por ejemplo otras proteínas antiapoptóticas tales como Mcl-1 o Bcl-X_{L}, que están relacionadas también con la resistencia a fármacos y la sobreexpresión en el cáncer. En consecuencia, la invención se refiere a cualquier miembro de la familia de proteínas Bcl-2, preferiblemente cualquier miembro antiapoptótico que pueda provocar respuestas inmunitarias en pacientes con cáncer, por ejemplo una proteína seleccionada del grupo que consiste en Bcl-2, Bcl-w, Mcl-1, Bfl-1/A1, Bcl-b, Bcl2-L-10 y Bcl-X_{L}, preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en Bcl-2, Mcl-1, Bcl-w y Bcl-X_{L}, más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en Bcl-2, Mcl-1 y Bcl-X_{L}.

Los miembros antiapoptóticos de la familia Bcl-2 ejercen sus efectos oncogénicos inhibiendo la apoptosis en células que normalmente están destinadas a morir, promoviendo de ese modo la acumulación de células in vivo.

Todos los miembros de la familia de proteínas Bcl-2 contienen al menos uno de los cuatro motivos conservados conocidos como dominios de homología (BH) de Bcl-2 (BH1, BH2, BH3 y BH4). Además de la presencia de dominios BH, las moléculas antiapoptóticas preferidas presentan un dominio de anclaje a la membrana carboxilo terminal (TM). Miembros antiapoptóticos tales como Bcl-2 y Bcl-X_{L} contienen los cuatro dominios BH, junto con el dominio transmembrana. Proteínas proapoptóticas de múltiples dominios tales como Bax y Bak contienen todos los dominios excepto el BH4. Un segundo subgrupo de proteínas proapoptóticas, conocidas como proteínas de "sólo dominio BH3" (por ejemplo, Bad y Bid), consiste en moléculas que contienen sólo el dominio BH3 y carecen de otros dominios BH. Proteínas proapoptóticas tales como Bcl-X_{S} y Mcl-1S, que representan formas cortadas y empalmadas de manera alternativa de los genes bcl-x y mcl-1, respectivamente, carecen de dominios BH1 y BH2. Adicionalmente, Mcl-1S carece de un
dominio transmembrana. Proteínas que pertenecen a la familia Bcl-2 se describen por ejemplo en la referencia 6.

Aunque se prefiere que la proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 tenga propiedades antiapoptóticas, también está comprendido dentro de la presente invención que la proteína que pertenece a la familia Bcl-2 pueda ser una proteína proapoptótica, por ejemplo una proteína seleccionada del grupo que consiste en Bax, Bok/Mtd, Bad, Bik/Nbk, Bid, Hrk/DP5, Bim, Noxa, Bmf y PUMA/bbc3.

En una realización preferida de la invención, la proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 es Bcl-2, preferiblemente Bcl-2 humana, más preferiblemente Bcl-2 de la secuencia con el número de registro primario P10415 en la base de datos SwissProt.

Puesto que varios cánceres en seres humanos expresan niveles altos de Bcl-2 y otros miembros de la familia Bcl-2, estrategias inmunoterapéuticas dirigidas a estos antígenos pueden tener amplias aplicaciones clínicas. La principal preocupación de un enfoque de este tipo sería la inducción de respuestas inmunitarias autorreactivas. Por tanto, el futuro de la vacunación basada en miembros de esta familia de proteínas dependerá tanto de la eficacia terapéutica como del tipo de efectos secundarios que pudieran seguir a la inmunización. Cuando se usaron por primera vez péptidos derivados de antígenos de diferenciación melanocítica para tratar pacientes con melanoma en estadio IV se previó que esto podría conducir a una destrucción pronunciada de melanocitos, lo que a su vez se manifestaría en sí clínicamente, por ejemplo como, vitíligo o retinitis. Sin embargo, la experiencia clínica demostró que la incidencia de vitíligo en pacientes que recibieron vacunaciones no era significativamente superior a la incidencia de hipopegmentación asociada a melanoma en pacientes que recibieron otras formas de tratamiento. Adicionalmente, no se ha notificado ningún efecto secundario grave en diversos ensayos de vacunación frente a autoantígenos.

En una realización útil, se proporcionan fragmentos de péptido restringidos a CMH de clase I novedosos (en el presente documento también denominados "péptidos") que se caracterizan por tener al menos una de varias características, de las que una es la capacidad para unirse a la molécula de HLA de clase I a la que está restringido a una afinidad tal como se mide mediante la cantidad del péptido que puede realizar la mitad de la recuperación máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo de 50 \muM tal como se determina mediante el ensayo de unión-ensamblaje tal como se describe en el presente documento. Este ensayo de ensamblaje se lleva a cabo tal como se describió anteriormente (2), y se basa en la estabilización de la molécula de HLA tras cargar el péptido en la línea celular T2 deficiente en transportador de péptido. Posteriormente, se inmunoprecipitan cadenas pesadas de HLA estables plegadas correctamente usando anticuerpos dependientes de la conformación y se cuantifica la unión al péptido.

Este ensayo proporciona un medio sencillo de examinar péptidos candidatos para determinar su capacidad para unirse a una molécula de alelo de HLA dada a la afinidad anterior. En realizaciones preferidas, el fragmento peptídico de la invención es uno que tiene un valor C_{50}, que es como máximo de 30 \muM, tal como un valor C_{50}, que es como máximo de 20 \muM incluyendo valores C_{50} de como máximo 10 \muM, como máximo 5 \muM y como máximo 2 \muM.

Sin embargo, péptidos más preferidos según la presente invención son péptidos que pueden generar una respuesta de células T específica tal como se determina mediante un ensayo ELISPOT, por ejemplo el ensayo ELISPOT descrito más adelante en el presente documento en el ejemplo 1, sección 4. Algunos péptidos, aunque no se unen al CMH con alta afinidad, pueden dar lugar todavía a una respuesta de células T tal como se determina mediante ELISPOT. Otros péptidos que pueden unirse al CMH con alta afinidad dan lugar también a una respuesta de células T tal como se determina mediante ELISPOT. Ambas clases de péptidos son péptidos preferidos según la invención.

Por tanto, péptidos preferidos según la presente invención son péptidos que pueden generar una respuesta de células T específica tal como se mide mediante un ensayo ELISPOT, en el que se miden más de 50 puntos específicos de péptido por 10^{8} células, más preferiblemente por 10^{7}, incluso más preferiblemente por 10^{6}, aún más preferiblemente por 10^{5} células, tal como por 10^{4} células.

Tal como se mencionó anteriormente, el sistema de HLA representa el sistema mayor de histocompatibilidad (CMH) humano. Generalmente, los sistemas CMH controlan una gama de características: antígenos de transplante, respuestas inmunitarias dependientes del timo, ciertos factores del complemento y predisposición a ciertas enfermedades. Más específicamente, el CMH codifica para tres tipos diferentes de moléculas, es decir moléculas de clase I, II y III, que determinan las características más generales del CMH. De estas moléculas, las moléculas de clase I son las denominadas moléculas HLA-A, HLA-B y HLA-C que se presentan sobre la superficie de la mayoría de células nucleadas y trombocitos.

Los péptidos de la presente invención se caracterizan por su capacidad para unirse a (estando restringidos a) una molécula de HLA del CMH de clase I particular. Por tanto, en una realización el péptido es uno que está restringido a una molécula HLA-A del CMH de clase I incluyendo HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A10, HLA-A11, HLA-Aw19, HLA-A23(9), HLA-A24(9), HLA-A25(10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29(w19), HLA-A30(w19), HLA-A31(w19), HLA-A32(w19), HLA-Aw33(w19), HLA-Aw34(10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66(10), HLA-Aw68(28), HLA-A69(28). A lo largo de la bibliografía se usan también denominaciones más sencillas, usándose solamente la denominación numérica primaria, por ejemplo HLA-A19 o HLA-A24 en lugar de HLA-Aw19 y HLA-A24(49), respectivamente. En realizaciones específicas, el péptido de la invención está restringido a una especie de HLA del CMH de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 y HLA-A24.

Los péptidos de la invención pueden derivarse por ejemplo de secuencias conocidas de un miembro de la familia de proteínas Bcl-2 (3). En una realización preferida de la invención, el péptido comprende (o más preferiblemente consiste en) como máximo 200, preferiblemente como máximo 100, más preferiblemente como máximo 50, aún más preferiblemente como máximo 25, incluso más preferiblemente como máximo 20, aún incluso más preferiblemente como máximo 15, tal como como máximo 10, por ejemplo en el intervalo de 9 a 10 aminoácidos contiguos de uno de los miembros de la familia de proteínas Bcl-2 mencionados anteriormente, preferiblemente de Bcl-2 con el número de registro primario P10415, Mcl-1 con el número de registro primario Q07820 o Bcl-X_{L} con el número de registro primario Q07817 en la base de datos SwissProt.

La selección de péptidos que tienen potencialmente la capacidad para unirse a una molécula de HLA particular puede realizarse mediante la alineación de secuencias conocidas que se unen a una molécula de HLA particular dada para revelar de ese modo el predominio de algunos aminoácidos relacionados en posiciones particulares en los péptidos. Tales residuos de aminoácido predominantes se denominan también en el presente documento "residuos de anclaje" o "motivos de residuos de anclaje". Siguiendo un procedimiento relativamente sencillo de este tipo basado en datos de secuencia conocidos que pueden encontrarse en bases de datos accesibles, los péptidos pueden derivarse de moléculas de la familia de proteínas Bcl-2, que es probable que se unan a la molécula de HLA particular. Ejemplos representativos de tales análisis para determinar una gama de moléculas de HLA se facilitan en la tabla a continuación.

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Por tanto, como ejemplo, nonapéptidos que tienen potencialmente la capacidad para unirse a HLA-A1 tendrían una de las siguientes secuencias: Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y, Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y; Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y o Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y (indicando Xaa cualquier residuo de aminoácido). De una manera similar, pueden diseñarse secuencias que tengan potencialmente la capacidad para unirse a cualquier otra molécula de HLA.

Se apreciará que el experto en la técnica podrá identificar "motivos de residuos de anclaje" adicionales para una molécula de HLA dada.

Por tanto, en realizaciones útiles, los péptidos de la invención incluyen péptidos, cuyas secuencias comprenden, para cada uno de los alelos de HLA específicos enumerados en la tabla, cualquiera de los residuos de aminoácido tal como se indica en la tabla.

Por tanto, los péptidos de la invención pueden ser cualquiera de los péptidos mencionados anteriormente que comprenden secuencias contiguas de miembros de la familia de proteínas Bcl-2, habiéndose intercambiado en el intervalo de 1 a 10, preferiblemente en el intervalo de 1 a 5, más preferiblemente en el intervalo de 1 a 3, incluso más preferiblemente en el intervalo de 1 a 2, aún más preferiblemente 1 aminoácido por otro aminoácido, preferiblemente de una manera tal que el péptido comprende uno o más, preferiblemente todos los residuos de anclaje de un péptido específico de HLA-A dado tal como se indicó en la tabla anterior.

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Un ejemplo no limitativo de cómo preparar péptidos de miembros de la familia de proteínas Bcl-2 que comprenden residuos de anclaje de un péptido específico de HLA-A dado se describe en el ejemplo 3 en la sección "Respuesta frente a péptidos modificados". Por tanto, en una realización de la invención, el péptido puede ser cualquier péptido que comprende como máximo 200, preferiblemente como máximo 100, más preferiblemente como máximo 50, aún más preferiblemente como máximo 25, incluso más preferiblemente como máximo 20, aún más preferiblemente como máximo 15, incluso más preferiblemente como máximo 10 aminoácidos y que comprende (o más preferiblemente que consiste en) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en RLKRDWLVK (SEQ ID NO:62), QSDEIISRY (SEQ ID NO:63) y QSEEIISRY (SEQ ID NO:64), más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en RLKRDWLVK (SEQ ID NO:62).

Por tanto, un enfoque sencillo para identificar péptidos de la invención incluye las siguientes etapas: seleccionar una molécula de HLA particular, por ejemplo una que se produce a una alta tasa en una población dada, llevar a cabo un análisis de alineación tal como se describió anteriormente para identificar los "motivos de residuos de anclaje" en proteína de la familia de proteínas Bcl-2, aislar o construir péptidos de un tamaño adecuado que comprendan uno o más de los residuos de anclaje identificados y someter a prueba los péptidos resultantes para determinar (i) la capacidad para unirse a la molécula de HLA particular usando el ensayo de ensamblaje tal como se describe en el presente documento, (ii) la capacidad de los péptidos para provocar células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente con cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL tal como se determina mediante un ensayo ELISPOT tal como se describe en el presente documento y/o (iii) la capacidad de los péptidos para detectar in situ en un tejido tumoral CTL que son reactivos con los péptidos de epítopo que están sometiéndose a prueba.

En realizaciones específicas, el péptido de la invención es un péptido derivado de Bcl-2 restringido a HLA-A2 que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: WLSLKTLLSL (SEQ ID NO:6), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO:8), YLNRHLHTWI (SEQ ID NO:10), NIALWMTEYL (SEQ ID NO:11).

En una realización preferida el péptido puede ser cualquier péptido que consiste en como máximo 15, incluso más preferiblemente como máximo 10 aminoácidos y que comprende (o más preferiblemente que consiste en) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en WLSLKTLLSL (SEQ ID NO:6), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO:8), YLNRHLHTWI (SEQ ID NO:10), NIALWMTEYL (SEQ ID NO:11), más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en NIALWMTEYL (SEQ ID NO:11), YLNRHLHTWI (SEQ ID NO:10), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO:8) y WLSLKTLLSL (SEQ ID NO:6), incluso más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en PLFDFSWLSL (SEQ ID NO:8) y WLSLKTLLSL (SEQ ID NO:6).

El péptido puede ser cualquier péptido que consiste en como máximo 200, preferiblemente como máximo 100, más preferiblemente como máximo 50, aún más preferiblemente como máximo 25, incluso más preferiblemente como máximo 20, aún más preferiblemente como máximo 15, incluso más preferiblemente como máximo 10 aminoácidos y que comprende (o más preferiblemente que consiste en) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en EMQVLVSRI (SEQ ID NO:44), TAYQSFEQV (SEQ ID NO:43), YLNDHLEPWI (SEQ ID NO:42), RIAAWMATYL (SEQ ID NO:45), WMATYLNDHL (SEQ ID NO:46), VLVSRIAAWM (SEQ ID NO:48) y VAFFSFGGAL (SEQ ID NO:49), más preferiblemente del grupo que consiste en TAYQSFEQV (SEQ ID NO:43), YLNDHLEPWI (SEQ ID NO:42), RIAAWMATYL (SEQ ID NO:45), WMATYLNDHL (SEQ ID NO:46), VLVSRIAAWM (SEQ ID NO:48) y VAFFSFGGAL (SEQ ID NO:49), incluso más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en TAYQSFEQV (SEQ ID NO:43), VAFFSFGGAL (SEQ ID NO:49), VLVSRIAAWM (SEQ ID NO:48) y RIAAWMATYL (SEQ ID NO:45) o seleccionada del grupo que consiste en TAYQSFEQV (SEQ ID NO:43) y WMATYLNDHL (SEQ ID NO:46) o seleccionada del grupo que consiste en YLNDHLEPWI (SEQ ID NO:42).

El péptido puede ser cualquier péptido que consiste en como máximo 200, preferiblemente como máximo 100, más preferiblemente como máximo 50, aún más preferiblemente como máximo 25, incluso más preferiblemente como máximo 20, aún más preferiblemente como máximo 15, incluso más preferiblemente como máximo 10 aminoácidos y que comprende (o más preferiblemente que consiste en) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en RIAAWMATY (SEQ ID NO:50) y ALCVESVDK (SEQ ID NO:51), más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en RIAAWMATY (SEQ ID NO:50).

El péptido puede ser cualquier péptido que consiste en como máximo 200, preferiblemente como máximo 100, más preferiblemente como máximo 50, aún más preferiblemente como máximo 25, incluso más preferiblemente como máximo 20, aún más preferiblemente como máximo 15, incluso más preferiblemente como máximo 10 aminoácidos y que comprende (o más preferiblemente que consiste en) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en YLREQATGAK (SEQ ID NO:52), SITDVLVRTK (SEQ ID NO:53), LISFGAFVAK (SEQ ID NO:54), RLLFFAPTR (SEQ ID NO:55), RTKRDWLVK (SEQ ID NO:56) y DIKNEDDVK (SEQ ID NO:57), más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en RLLFFAPTR (SEQ ID NO:55) y RTKRDWLVK (SEQ ID NO:56).

El péptido puede ser cualquier péptido que consiste en como máximo 200, preferiblemente como máximo 100, más preferiblemente como máximo 50, aún más preferiblemente como máximo 25, incluso más preferiblemente como máximo 20, aún más preferiblemente como máximo 15, incluso más preferiblemente como máximo 10 aminoácidos y que comprende (o más preferiblemente que consiste en) una secuencia seleccionada del grupo que consiste en PAEEEEDDLY (SEQ ID NO:58), SPEEELDGY (SEQ ID NO:59), QSLEIISRY (SEQ ID NO:60) y AGVGAGLAY (SEQ ID NO:61), más preferiblemente seleccionada del grupo que consiste en PAEEEEDDLY (SEQ ID NO:58) y QSLEIISRY (SEQ ID NO:60).

En realizaciones útiles adicionales, el péptido de la invención es un péptido, que está restringido a una molécula HLA-B del CMH de clase I incluyendo cualquiera de las siguientes: HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 y HLA-Bw47. En realizaciones específicas, la especie de HLA-B del CMH de clase I a la que puede unirse el péptido de la invención se selecciona de HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 y HLA-B51.

En realizaciones útiles adicionales, el péptido de la invención es un péptido, que está restringido a una molécula HLA-C del CMH de clase I incluyendo cualquiera de las siguientes: HLA-Cw1, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLACw7 y HLA-Cw1.

Preferiblemente, el fragmento peptídico de la invención comprende menos de 50 residuos de aminoácido, y más preferiblemente comprende como máximo 20 residuos de aminoácido, tal como como máximo 10 residuos de aminoácido. En realizaciones específicas, el péptido es un heptapéptido, un octapéptido, un nonapéptido, un decapéptido o un undecapéptido.

El péptido de la invención se deriva, tal como se mencionó anteriormente, de Bcl-2 o un fragmento de la misma. La proteína de la que puede derivarse el péptido puede ser cualquier proteína Bcl-2 de cualquier especie animal en la que se expresa la proteína. En realizaciones preferidas, la proteína de partida es de una especie de mamífero incluyendo una especie de roedor, conejo y una especie de primate tal como seres humanos. Basándose en la secuencia de la proteína seleccionada, el péptido de la invención se deriva mediante cualquier tratamiento químico o enzimático apropiado del material de partida proteico que da como resultado un péptido de un tamaño adecuado tal como se indicó anteriormente, o puede sintetizarse mediante cualquier procedimiento de síntesis de péptidos convencional con el que está familiarizado el experto.

El péptido de la invención puede tener una secuencia que es una secuencia nativa del miembro de la familia de proteínas Bcl-2 del que se deriva. Sin embargo, péptidos que tienen una mayor afinidad hacia cualquier molécula de HLA dada pueden derivarse de una secuencia nativa de este tipo modificando la secuencia mediante sustitución, deleción o adición de al menos un residuo de aminoácido, por ejemplo basándose en el procedimiento descrito anteriormente mediante el cual se identifican motivos de residuos de anclaje con respecto a la molécula de HLA dada.

Una característica significativa del péptido de la invención es su capacidad para reconocer o provocar células T de respuesta productoras de INF-\gamma, es decir células T citotóxicas (CTL) que reconocen específicamente el péptido particular en una población de PBL o células tumorales de un paciente con cáncer (células diana). Esta actividad se determina fácilmente sometiendo PBL o células tumorales de un paciente a un ensayo ELISPOT tal como se describe en la referencia (4) y en el ejemplo siguiente. Antes del ensayo, puede ser ventajoso estimular la población de PBL o las células tumorales que van a someterse a ensayo poniendo en contacto las células con el péptido que va a someterse a prueba. Preferiblemente, el péptido puede provocar o reconocer células T productoras de INF-\gamma a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL tal como se determina mediante un ensayo ELISPOT tal como se usa en el presente documento. Más preferiblemente la frecuencia es de al menos 5 por 10^{4} PBL, lo más preferiblemente al menos 10 por 10^{4} PBL, tal como al menos 50 o 100 por 10^{4} PBL.

El ensayo ELISPOT representa una herramienta potente para monitorizar respuestas de células T específicas de péptidos derivados de la familia Bcl-2. Sin embargo, aunque se ha demostrado que la reactividad de ELISPOT en la mayoría casos está correlacionada con la capacidad de los CTL para lisar células diana, la evidencia concluyente para este concepto puede darse sólo directamente. Por tanto, una implicación principal de los hallazgos del presente documento es que los péptidos de la invención pueden expresarse y complejarse con moléculas de HLA en células cancerosas. Esto hace a estas células cancerosas sensibles a la destrucción por CTL y resalta la utilidad potencial de la inmunización con proteínas de la familia Bcl-2 para controlar el crecimiento de neoplasmas. La presencia de respuestas de CTL espontáneas en PBL de pacientes con cáncer de mama frente a epítopos peptídicos derivados de Bcl-2 restringidos a HLA corrobora el potencial inmunoterapéutico de estos antígenos tumorales no sólo en pacientes con cáncer de mama, sino también, ya que los miembros de la familia de proteínas Bcl-2 se sobreexpresan en muchos cánceres incluyendo cánceres de pulmón, colorrectal, de próstata y en leucemia y linfomas, en una amplia gama de enfermedades de cáncer.

En consecuencia, en otra realización preferida el péptido de la invención puede provocar células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad de cáncer en la que se expresa una familia de proteínas Bcl-2 incluyendo un tumor maligno hematopoyético, por ejemplo, leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cérvix, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

Además de su capacidad para provocar respuestas inmunitarias en poblaciones de PBL, también se contempla que los péptidos de la invención pueden provocar respuestas inmunitarias citolíticas in situ, es decir en tejidos tumorales sólidos. Esto puede demostrarse proporcionando complejos de HLA-péptido, por ejemplo multimerizándose y dotándose de un marcador detectable, y usando tales complejos para tinciones de inmunohistoquímica para detectar en un tejido tumoral CTL que son reactivos con el péptido de epítopo de la invención. En consecuencia, una característica significativa adicional del péptido de la invención es que puede realizar la detección in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido de epítopo.

También se contempla que los péptidos de la invención, además de su capacidad para unirse a moléculas de HLA dando como resultado la presentación de complejos de HLA y péptidos en superficies celulares, complejos que a su vez actúan como epítopos o dianas para células T citolíticas, pueden provocar otros tipos de respuestas inmunitarias, tales como respuestas de células B dando como resultado la producción de anticuerpos frente a los complejos y/o una reacción de hipersensibilidad de tipo retardado (DTH). El último tipo de respuesta inmunitaria se define como rojez e induración palpable en el sitio de inyección del péptido de la invención.

La composición de vacuna según la presente invención puede comprender un ácido nucleico que codifica para una proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico de la misma. Dicho ácido nucleico puede codificar por tanto para cualquiera de las proteínas y fragmentos de péptido mencionados anteriormente. El ácido nucleico puede ser por ejemplo ADN, ARN, LNA, HNA, PNA, preferiblemente el ácido nucleico es ADN o ARN.

Los ácidos nucleicos de la invención pueden estar comprendidos dentro de cualquier vector adecuado, tal como un vector de expresión. Se encuentran disponibles numerosos vectores y el experto podrá seleccionar un vector útil para el fin específico. El vector puede estar, por ejemplo, en forma de un plásmido, cósmido, partícula viral o cromosoma artificial. La secuencia de ácido nucleico apropiada puede insertarse en el vector mediante una variedad de procedimientos, por ejemplo, puede insertarse ADN en un(os) sitio(s) de endonucleasa de restricción apropiado(s) usando técnicas bien conocidas en la técnica. Aparte de la secuencia de ácido nucleico según la invención, el vector puede comprender además una o más de una secuencia señal, un origen de replicación, uno o más genes marcadores, un elemento potenciador, un promotor y una secuencia de terminación de la transcripción. El vector puede comprender también secuencias adicionales. La construcción de vectores adecuados que contienen uno o más de estos componentes emplea técnicas de ligamiento convencionales que conoce el experto en la técnica. El vector es preferiblemente un vector de expresión que comprende el ácido nucleico operativamente unido a una secuencia de ácido nucleico reguladora que dirige la expresión del mismo en una célula adecuada. Dentro del alcance de la presente invención, dicha secuencia de ácido nucleico reguladora debe poder dirigir en general la expresión en una célula de mamífero, preferiblemente una célula humana, más preferiblemente en una célula presentadora de antígeno.

En una realización preferida el vector es un vector viral. Dicho vector viral puede comprender, además del ácido nucleico que codifica para un miembro de la familia de proteínas Bcl-2 o fragmento peptídico del mismo, una segunda secuencia de ácido nucleico que codifica para un polipéptido estimulador de células T. El polipéptido estimulador de células T se selecciona preferiblemente del grupo que consiste en B7.1, ICAM-1 y LFA-3.

El vector puede ser también un vector bacteriano, tal como un vector bacteriano atenuado. Pueden usarse vectores bacterianos atenuados con el fin de inducir respuestas inmunitarias duraderas de la mucosa en los sitios de infección y persistencia. Pueden usarse como vectores bacterias recombinantes diferentes, por ejemplo, el vector bacteriano puede seleccionarse del grupo que consiste en Salmonella, Lactococcus y Listeria. En general, pudo demostrarse la inducción de inmunidad frente al antígeno heterólogo VPH16 L1 o E7, con una fuerte inducción de CTL y remisión tumoral en ratones.

La invención se refiere también a un kit de partes que comprende

i): cualquiera de las de las composiciones de vacuna descritas en el presente documento y/o

ii): cualquiera de las proteínas que pertenecen a la familia de proteínas Bcl-2 descrita en el presente documento y/o

iii): cualquiera de los fragmentos peptídicos de las proteínas de ii) descritas en el presente documento y/o

iv): cualquiera de los ácidos nucleicos que codifican para las proteínas de ii) o los péptidos de iii)

y un agente antineoplásico adicional.

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Los componentes del kit de partes están comprendidos preferiblemente en composiciones individuales, sin embargo, está comprendido dentro del alcance de la presente invención que todos los componentes del kit de partes están comprendidos dentro de la misma composición. Por tanto, los componentes del kit de partes pueden administrarse de manera simultánea o secuencial en cualquier orden.

El agente antineoplásico puede ser un agente usado en quimioterapia o terapia génica, sustancias inmunoestimulantes o anticuerpos. Las sustancias inmunoestimulantes pueden ser por ejemplo citocinas, tales como citocinas seleccionadas del grupo que consiste en GM-CSF, IFN de tipo I, interleucina 12 e interleucina 15. El anticuerpo es preferiblemente un anticuerpo inmunoestimulante tal como los anticuerpos anti-CD40 o anti-CTLA-4. La sustancia inmunoestimuladora puede ser también una sustancia que puede agotar factores o células de inhibición inmunitaria (por ejemplo células T reguladoras), dicha sustancia puede ser por ejemplo ubiquitina-ligasas E3. Las ubiquitina-ligasas E3 (las proteínas HECT, RING y U-box) han surgido como reguladores moleculares clave de la función celular inmunitaria, y cada una puede estar implicada en la regulación de respuestas inmunitarias durante la infección por moléculas inhibidoras específicas de selección como diana para la destrucción proteolítica. Varias proteínas HECT y RING E3 se han relacionado ahora también con la inducción y el mantenimiento de la autotolerancia inmunitaria: c-Cbl, Cbl-b, GRAIL, Itch y Nedd4 regula cada una negativamente la proliferación y producción del factor de crecimiento de células T.

Es evidente que los hallazgos de la presente invención proporcionan la base para aplicaciones terapéuticas así como diagnósticas de la proteína o el fragmento peptídico de la invención.

En consecuencia, en un aspecto adicional, la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende la proteína o el fragmento peptídico de la invención, en particular una composición farmacéutica que, cuando se administra a un paciente con cáncer, puede provocar una respuesta inmunitaria frente a la enfermedad de cáncer incluyendo provocar la producción en el paciente vacunado de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico frente a las células cancerosas.

Tal como se sabe bien, que las moléculas de HLA diferentes son de prevalencia diferente en las principales poblaciones de seres humanos, existe un requisito de identificar epítopos peptídicos restringidos a varias moléculas de HLA de clase I para extender la cohorte de pacientes que puede tratarse según los métodos de la presente invención. La caracterización de múltiples epítopos de Bcl-2 con elementos de restricción de HLA diferentes amplia el potencial clínico de este antígeno diana de dos modos importantes: (i) aumenta el número de pacientes elegibles para la inmunoterapia basada en péptidos derivados de Bcl-2. El antígeno HLA-A2 se expresa en aproximadamente el 50% de las poblaciones caucásica y asiática, los dos antígenos HLA-A1 y HLA-A3 se expresan en aproximadamente el 25% de los caucásicos y el 5% de los asiáticos, mientras que el antígeno HLA-A11 se expresa en aproximadamente el 15% de los caucásicos y el 30% de los asiáticos. Aunque estas cifras no pueden cuadrar debido a la coexpresión, una combinación de péptidos restringidos a una multiplicidad de éstos englobaría ciertamente a la mayoría de los pacientes con cáncer, (ii) Es probable que la selección como diana colectiva de varios elementos de restricción de cada paciente disminuya el riesgo de escape inmunitario por la pérdida de alelos de HLA. La pérdida de un único alelo de HLA es un componente significativo de las alteraciones del CMH descritas para células cancerosas, mientras que la pérdida total de la expresión de clase I es un acontecimiento bastante poco frecuente. Por tanto, con la identificación de epítopos de Bcl-2 restringidos a diferentes alelos de HLA, sería posible seleccionar como diana más de una molécula de HLA simultáneamente en pacientes con solapamiento de alelos.

Por tanto, sería posible desarrollar vacunas de múltiples epítopos altamente inmunogénicas. Preferiblemente, tales vacunas deben diseñarse para facilitar un suministro simultáneo de los péptidos derivados de Bcl-2 más adecuados opcionalmente en combinación con otros péptidos y/o adyuvantes adecuados tal como se describe a continuación en el presente documento. La presente invención engloba tales vacunas de múltiples epítopos que comprenden péptidos derivados de Bcl-2 opcionalmente en combinación con otras proteínas o fragmentos de péptidos que no pertenecen a o derivados de la familia de proteínas Bcl-2 y/o adyuvantes tal como se describe a continuación en el presente documento y/o epítopos restringidos a CMH de clase II tal como se describe a continuación.

Ha habido un aumento de atención en la provocación de inmunidad de célula T auxiliar específica de tumores, es decir, vacunación con epítopos restringidos a CMH de clase II a pesar del hecho de que los tumores generalmente no expresan CMH de clase II. Esto se basa en el hallazgo reciente de que la inducción y la eficacia de la respuesta antitumoral inducida por vacuna requieren en muchos casos la cooperación de células T_{h} CD4 positivas específicas de tumores. Por tanto, un factor importante que dirige el desarrollo de vacunas que tienen una composición más compleja es el deseo de seleccionar como diana múltiples antígenos tumorales por ejemplo diseñando vacunas que comprenden o que codifican para un conjunto de epítopos de células T_{h} y CTL seleccionados cuidadosamente.

Obviamente, la vacunas de múltiples epítopos constituyen un modo eficaz para generar inmunidad frente a epítopos derivados de varios antígenos diferentes sin la necesidad de introducir (genes que codifican para) proteínas potencialmente peligrosas tales como oncoproteínas. Tales vacunas permiten también una inducción selectiva de inmunidad frente a epítopos de células T subdominantes y crípticos, que puede ser especialmente importante en el caso de autoantígenos asociados a tumores para los que puede existir tolerancia por los epítopos que se presentan de manera prominente en tejidos normales. Además, las células presentadoras de antígeno pueden no presentar ciertos epítopos que se expresan en las células tumorales debido a diferencias funcionales entre los inmunoproteasomas de células presentadoras de antígeno y los proteasomas "constitutivos" presentes en la mayoría de células tumorales. En el caso de vacunas a base de péptidos, tales epítopos pueden administrarse de una forma de "lista para CMH", que permite la presentación a través de carga exógena independientemente de la captación y el procesamiento de antígenos por las células presentadoras de antígeno huésped.

Ya que los péptidos de la invención son moléculas relativamente pequeñas, puede requerirse en tales composiciones combinar los péptidos con diversos materiales tales como adyuvantes, para producir vacunas, composiciones inmunogénicas, etc. Los adyuvantes, ampliamente definidos, son sustancias que promueven respuestas inmunitarias. Frecuentemente, el adyuvante de elección es adyuvante completo o incompleto de Freund, u organismos de B. pertussis inactivados, usados por ejemplo en combinación con antígenos precipitados con alumbre. Una discusión general de adyuvantes se proporciona en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2ª edición, 1986) en las páginas 61-63. Goding indica, sin embargo, que cuando el antígeno de interés es de bajo peso molecular, o es poco inmunogénico, se recomienda el acoplamiento a un portador inmunogénico. Los ejemplos de tales moléculas portadoras incluyen hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero bovino, ovoalbúmina e inmunoglobulina de ave. También se ha sugerido que diversos extractos de saponina son útiles como adyuvantes en composiciones inmunogénicas. Recientemente, se ha propuesto usar el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), una citocina muy conocida, como adyuvante (documento WO 97/28816).

Las composiciones de vacuna según la invención comprenden preferiblemente un adyuvante y/o un portador. Ejemplos de adyuvantes y portadores útiles se facilitan a continuación en el presente documento. Por tanto, la proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o fragmento peptídico de la misma presente en la composición puede asociarse a un portador tal como por ejemplo una proteína o una célula presentadora de antígeno tal como por ejemplo una célula dendrítica (DC) que puede presentarse a la familia de proteínas Bcl-2 o fragmento peptídico de la misma a una célula T.

Los adyuvantes son cualquier sustancia cuya mezcla en la composición de vacuna aumenta o modifica de otro modo la respuesta inmunitaria frente a la familia de proteínas Bcl-2 o fragmento peptídico de la misma. Los portadores son estructuras de armazón, por ejemplo un polipéptido o un polisacárido, al que puede estar asociada la familia de proteínas Bcl-2 o fragmento peptídico de la misma.

Los adyuvantes podrían seleccionarse por ejemplo del grupo que consiste en: AlK(SO_{4})_{2}, AlNa(SO_{4})_{2}, AlNH_{4}(SO_{4}), sílice, alumbre, Al(OH)_{3}, Ca_{3}(PO_{4})_{2}, caolín, carbono, hidróxido de aluminio, dipéptidos de muramilo, N-acetil-muramil-L-treonil-D-isoglutamina (thr-DMP), N-acetil-normuramil-L-alanil-D-isoglutamina (CGP 11687, también denominada nor-MDP), N-acetilmuramil-L-alanil-D-isoglutaminil-L-alanina-2-(1'2'-dipalmitoil-sn-glicero-3-hidroxifosforiloxi)-etilamina (CGP 19835A, también denominada MTP-PE), RIBI (MPL+TDM+CWS) en una emulsión de escualeno al 2%/Tween-80.RTM., lipopolisacáridos y sus diversos derivados, incluyendo lípido A, adyuvante completo de Freund (FCA), adyuvante incompleto de Freund, adyuvante 65 de Merck, polinucleótidos (por ejemplo, ácidos poli IC y poli AU), cera D de Mycobacterium tuberculosis, sustancias halladas en Corynebacterium parvum, Bordetella pertussis y miembros del género Brucella, liposomas u otras emulsiones de lípidos, Titermax, ISCOMS, Quil A, ALUN (véase los documentos US 58767 y 5.554.372), derivados del lípido A, derivados de toxina del cólera, derivados de HSP, derivados de LPS, matrices peptídicas sintéticas o GMDP, interleucina 1, interleucina 2, Montanide ISA-51 y QS-21. Los adyuvantes preferidos para usarse con la invención incluyen adyuvantes a base de aceite/tensioactivo tales como adyuvantes de Montanide (disponibles de Seppic, Bélgica), preferiblemente Montanide ISA-51. Otros adyuvantes preferidos son adyuvantes a base de ADN bacteriano, tales como adyuvantes que incluyen secuencias de olinucleótidos CpG. Aún otros adyuvantes preferidos son adyuvantes a base de ARN bicatenario viral, tal como poli I:C. Imidazoquinilinas son aún otro ejemplo de adyuvantes preferidos. Además, un adyuvante preferido son liposomas. Los adyuvantes más preferidos son adyuvantes adecuados para su uso en seres humanos.

Los adyuvantes de Montanide (todos disponibles de Seppic, Bélgica), pueden seleccionarse del grupo que consiste en Montanide ISA-51, Montanide ISA-50, Montanide ISA-70, Montanide ISA-206, Montanide ISA-25, Montanide ISA-720, Montanide ISA-708, Montanide ISA-763A, Montanide ISA-207, Montanide ISA-264, Montanide ISA-27, Montanide ISA-35, Montanide ISA 51 F, Montanide ISA 016D y Montanide IMS, preferiblemente del grupo que consiste en Montanide ISA- 51, Montanide IMS y Montanide ISA-720, más preferiblemente del grupo que consiste en Montanide ISA-51. Montanida ISA-51 (Seppic, Inc.) son adyuvantes a base de aceite/tensioactivo en los que se combinan tensioactivos diferentes o bien con un aceite mineral que no puede metabolizarse, un aceite que puede metabolizarse, o bien con una mezcla de los dos. Se preparan para su uso como emulsión con una disolución acuosa que comprende la proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o fragmento peptídico de la misma. El tensioactivo es oleato de manida. QS-21 (Antigenics; Aquila Biopharmaceuticals, Framingham, MA) es una saponina soluble en agua altamente purificada que se trata como una disolución acuosa. Los adyuvantes QS-21 y Montanide ISA-51 pueden proporcionarse en viales estériles de un solo uso.

Una discusión general de adyuvantes se proporciona en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2ª edición, 1986) en las páginas 61-63. Goding indica, sin embargo, que cuando el antígeno de interés es de bajo peso molecular, o es poco inmunogénico, se recomienda el acoplamiento a un portador inmunogénico. Ejemplos de tales moléculas portadoras incluyen hemocianina de lapa californiana, albúmina de suero bovino, ovoalbúmina e inmunoglobulina de ave. También se ha sugerido que diversos extractos de saponina son útiles como adyuvantes en composiciones inmunogénicas. Recientemente, se ha propuesto usar el factor estimulador de colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF), una citocina muy conocida, como adyuvante (documento WO 97/28816).

Las funcionalidades deseables de adyuvantes que pueden usarse según la presente invención se enumeran el la tabla a continuación.

TABLA 1 Modos de acción de adyuvante

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Una composición de vacuna según la presente invención puede comprender más de un adyuvante diferente. Además, la invención engloba una composición terapéutica que comprende además cualquier sustancia adyuvante incluyendo cualquiera de los anteriores o combinaciones de los mismos. También se contempla que la proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o fragmentos de péptido de la misma y el adyuvante pueden administrarse por separado en cualquier secuencia apropiada.

Un portador puede estar presente independientemente de un adyuvante. La función de un portador puede ser por ejemplo aumentar el peso molecular de, en particular fragmentos de péptido con el fin de aumentar su actividad o inmunogenicidad, para conferir estabilidad, para aumentar la actividad biológica o para aumentar la semivida en suero. Además, un portador puede ayudar a presentar la proteína que pertenece a la familia Bcl-2 o fragmentos de péptido de la misma a células T. El portador puede ser cualquier portador adecuado conocido por el experto en la técnica, por ejemplo una proteína o una célula presentadora de antígeno. Una proteína portadora podría ser, pero no se limita a, hemocianina de lapa californiana, proteínas séricas tales como transferrina, albúmina de suero bovino, albúmina de suero humano, tiroglobulina u ovoalbúmina, inmunoglobulinas u hormonas, tales como insulina o ácido palmítico. Para la inmunización de seres humanos, el portador debe ser un portador aceptable fisiológicamente aceptable para seres humanos y seguro. Sin embargo, el toxoide tetánico y/o toxoide de la difteria son portadores adecuados en una realización de la invención. Alternativamente, el portador puede ser dextranos por ejemplo Sepharose.

En consecuencia, la invención engloba una composición terapéutica que comprende además una sustancia adyuvante incluyendo cualquiera de los anteriores o combinaciones de los mismos. También se contempla que el antígeno, es decir el péptido de la invención y el adyuvante pueden administrarse simultáneamente o por separado en cualquier secuencia apropiada.

La elección del antígeno en la composición farmacéutica de la invención dependerá de parámetros que pueden determinarse por el experto en la técnica. Tal como se ha mencionado, cada uno de los péptidos diferentes de la invención se presenta sobre las superficies celulares por una molécula de HLA particular. Como tal, si un sujeto que va a tratarse se tipifica con respecto al fenotipo de HLA, se selecciona un péptido/péptidos que se sabe que se une(n) a esa molécula de HLA particular.

Alternativamente, el antígeno de interés se selecciona basándose en la prevalencia de diversos fenotipos de HLA en una población dada. Como un ejemplo, HLA-A2 es el fenotipo más prevalente en la población caucásica, y por tanto, una composición que contiene un péptido derivado de survivina que se une a HLA-A2 será activa en una gran proporción de esa población. Sin embargo, la composición de la invención puede contener también una combinación de dos o más péptidos derivados de survivina, interaccionando cada uno específicamente con una molécula de HLA diferente para cubrir una mayor proporción de la población diana. Por tanto, como ejemplos, la composición farmacéutica puede contener una combinación de un péptido restringido a una molécula HLA-A y un péptido restringido a una molécula HLA-B, por ejemplo incluyendo aquellas moléculas HLA-A y HLA-B que corresponden a la prevalencia de fenotipos de HLA en la población diana, tal como por ejemplo HLA-A2 y HLA-B35. Adicionalmente, la composición puede comprender un péptido restringido a una molécula HLA-C.

Se contempla que composiciones inmunogénicas útiles de la invención, además de un péptido derivado de miembros de la familia de proteínas Bcl-2 tal como se definen en el presente documento pueden comprender una cantidad inmunológicamente eficaz del miembro de la familia de proteínas Bcl-2 como tal, tal como se define en el presente documento o un fragmento inmunogénico del mismo.

La cantidad del péptido inmunogénico de la invención en la composición farmacéutica puede variar, dependiendo de la aplicación particular. Sin embargo, una única dosis del inmunógeno es preferiblemente cualquiera desde aproximadamente 10 \mug hasta aproximadamente 5000 \mug, más preferiblemente desde aproximadamente 50 \mug hasta aproximadamente 2500 \mug, tal como de aproximadamente 100 \mug a aproximadamente 1000 \mug. Los modos de administración incluyen administración intradérmica, subcutánea e intravenosa, implantación en forma de una formulación de liberación en el tiempo, etc. Cualquiera y todas las formas de administración conocidas en la técnica están englobadas en el presente documento. También están englobadas cualquiera y todas las formas farmacéuticas convencionales que en la técnica se conoce que son apropiadas para la formulación de una composición de péptido inmunogénico inyectable, tal como disoluciones y formas liofilizadas, suspensiones o formas en emulsión que contienen, si se requiere, portadores, diluyentes, conservantes, adyuvantes, componentes de tampón farmacéuticamente aceptables, etc.

Las composiciones farmacéuticas pueden prepararse y administrarse usando cualquier protocolo convencional conocido por un experto en la técnica. En el ejemplo 5 se facilita un ejemplo de preparación no limitativo de una composición de vacuna según la invención, así como un ejemplo de administración no limitativo de la misma como vacuna. Un experto en la técnica apreciará que el protocolo puede adaptarse fácilmente a cualquiera de las composiciones de vacuna descritas en el presente documento.

En una realización adicional de la invención, la composición farmacéutica de la invención es útil para tratar a un paciente con cáncer, en la que, durante la evolución del cáncer en ese paciente, las células cancerosas han desarrollado una susceptibilidad reducida a un fármaco contra el cáncer quimioterápicamente activo y/o la radioterapia.

La composición farmacéutica de la invención puede comprender de manera ventajosa al menos una proteína inmunogénica o fragmento peptídico de la misma adicional seleccionado de una proteína o fragmento peptídico que no pertenece a o derivado de la familia de proteínas Bcl-2, incluyendo una proteína implicada en la regulación de la apoptosis celular o un fragmento peptídico derivado de la misma. Como un ejemplo, una proteína o un péptido adicional de este tipo es survivina tal como se definió anteriormente, o un fragmento peptídico de la misma. En realizaciones específicas, un péptido derivado de survivina inmunogénico adicional es un péptido restringido a HLA-A2 que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: FLKLDRERA (survivina_{101-109}) (SEQ ID NO:12), TLPPAWQPFL (survivina_{5-14}) (SEQ ID NO:13), ELTLGEFLKL (survivina_{95-104}) (SEQ ID NO:14), LLLGEFLKL (SEQ ID NO:15) y LMLGEFLKL (SEQ ID NO:16). (Las denominaciones entre paréntesis indican las posiciones de los residuos en la proteína survivina tal como se da a conocer en el documento US 6.245.523). LLLGEFLKL (SEQ ID NO:15) es una secuencia derivada de survivina_{96-104} sustituyendo "T" en la posición 2 del péptido por "L" y LMLGEFLKL (SEQ ID NO:16) se deriva de survivina_{96-104} sustituyendo "T" en la posición 2 por "M". En realizaciones específicas adicionales, el péptido derivado de survivina inmunogénico adicional es un péptido derivado de survivina restringido a HLA-B35 que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: CPTENEPDL (survivina_{46-54}) (SEQ ID NO:17), EPDLAQCFF (survivina_{51-59}) (SEQ ID NO:18), CPTENEPDY (SEQ ID NO:19) y EPDLAQCFY (SEQ ID NO:20). (Las denominaciones entre paréntesis indican las posiciones de los residuos en la proteína survivina tal como se da a conocer en el documento US 6.245.523). CPTENEPDY (SEQ ID NO:19) es una secuencia derivada de survivina_{46-54} sustituyendo "L" en el extremo C-terminal del péptido por "Y" y EPDLAQCFY (SEQ ID NO:20) se deriva de survivina_{51-59} sustituyendo un residuo "F" en el extremo C-terminal 2 por "Y".

Aún en realizaciones adicionales, el péptido adicional es un péptido restringido a HLA-A1 que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: survivina_{38-46} (Sur38Y9) (C cambia a Y en P9, MAEAGFIHY)(SEQ ID NO:21), survivina_{47-56} (Sur47Y10) (Q cambia a Y en P10, PTENEPDLAY (SEQ ID NO:22)), survivina_{92-101} (Sur92-101) (QFEELTLGEF) (SEQ ID NO:23) y survivina_{93-101} (Sur93T2 (E cambia a T en P2, FTELTLGEF (SEQ ID NO:24)). El péptido de la invención puede ser también un péptido restringido a HLA-A3 tal como survivina_{18-24} (Sur18K10) (F cambia a K en P10, RISTFKNWPK (SEQ ID NO:25) y/o un péptido restringido a HLA-A11 tal como survivina_{53-62} (Sur53-62) (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO:26) y/o un péptido restringido a HLA-A2 tal como survivina_{18-28} (Sur18-28) (RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO:27).

Sin embargo, en una realización preferida de la invención, las composiciones de vacuna no comprenden survivina o fragmentos de la misma.

Otros péptidos adicionales útiles incluyen el polipéptido inhibidor de la apoptosis conocido ML-IAP que tiene una expresión bastante selectiva, y se detecta en los melanomas. Por tanto, fragmentos de ML-IAP que pueden provocar una respuesta de células T específica, es decir una respuesta de células T citotóxicas o una respuesta de células T auxiliares pueden incluirse opcionalmente en la composición de la presente invención. Los fragmentos de péptido de ML-IAP útiles incluyen cualquiera de los fragmentos de ML-IAP descritos en la solicitud de patente WO2004/089980, preferiblemente ML-IAP_{245} (RLQEERTCKV) (SEQ ID NO:28), ML-IAP_{280} (QLCPICRAPV) (SEQ ID NO:29), ML-IAP_{90} (RLASFYDWPL) (SEQ ID NO:30), ML-IAP_{154} (LLRSKGRDFV) (SEQ ID NO:31), ML-IAP_{230} (VLEPPGARDV) (SEQ ID NO:32), ML-IAP_{98} (PLTAEVPPEL) (SEQ ID NO:33), ML-IAP_{34} (SLGSPVLGL) (SEQ ID NO:34), MLIAP_{54} (QILGQLRPL) (SEQ ID NO:35), ML-IAP_{99} (LTAEVPPEL) (SEQ ID NO:36), ML-IAP_{83} (GMGSEELRL) (SEQ ID NO:37) y ML-IAP_{200} (ELPTPRREV) (SEQ ID NO:38).

Otros péptidos adicionales útiles incluyen TRAG-3 y fragmentos de péptido de la misma. TRAG-3 existe en al menos dos formas alternativamente cortadas y empalmadas y los péptidos de todas las formas de corte y empalme de TRAG-3 son útiles como péptidos adicionales. En particular, fragmentos de cualquier forma de corte y empalme de TRAG-3, en la que dichos fragmentos pueden provocar una respuesta de células T específica, es decir una respuesta de células T citotóxicas o una respuesta de células T auxiliares pueden incluirse opcionalmente en la composición de la presente invención.

Adicionalmente, la composición según la presente invención puede proporcionarse como una vacuna de múltiples epítopos que comprende epítopo restringido a la clase I y epítopos restringidos a la clase II tal como se definió anteriormente en el presente documento.

El efecto inmunoprotector de la composición de la invención puede determinarse usando varios enfoques, por ejemplo tal como se describe en el documento WO 97/28816, citado anteriormente. Una respuesta inmunitaria satisfactoria puede determinarse también mediante la aparición de reacciones DTH tras la inmunización y/o la detección de anticuerpos que reconocen específicamente el/los péptido(s) de la composición de vacuna.

En realizaciones preferidas, la composición farmacéutica de la invención es una composición de vacuna. Por tanto, la composición farmacéutica puede una vacuna o composición inmunogénica que puede provocar una respuesta inmunitaria frente a una enfermedad de cáncer. Tal como se usa en el presente documento; la expresión "vacuna o composición inmunogénica" se refiere a una composición que provoca al menos un tipo de respuesta inmunitaria dirigida frente a células cancerosas. Por tanto, una respuesta inmunitaria de este tipo puede ser cualquiera de los tipos mencionados anteriormente: una respuesta de CTL generándose CTL que pueden reconocer el complejo de HLA/péptido presentado sobre las superficies celulares dando como resultado la lisis celular, es decir la vacuna provoca la producción en el sujeto vacunado de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico frente a las células cancerosas; una respuesta de
célula B dando lugar a la producción de anticuerpos contra el cáncer; y/o un tipo de DTH de respuesta inmunitaria.

En realizaciones útiles, se provoca una respuesta inmunogénica dirigida frente a una enfermedad de cáncer administrando el péptido de la invención o bien cargando moléculas de CMH de clase I en células presentadoras de antígeno (APC) del paciente, aislando PBL del paciente e incubando las células con el péptido antes de inyectar las células de nuevo en el paciente, o bien aislando APC precursoras del paciente y diferenciando las células en APC profesionales usando citocinas y el antígeno antes de inyectar las células de nuevo en el paciente.

Por tanto, es un aspecto de la invención proporcionar composiciones de vacuna que comprenden células presentadoras de antígeno que comprenden una proteína que pertenece a la familia Bcl-2 o un fragmento peptídico de la misma o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína o dicho fragmento peptídico. La célula presentadora de antígeno puede ser cualquier célula que pueda presentar un antígeno a una célula T. Células presentadoras de antígeno preferidas son células dendríticas. Las células dendríticas (DC) pueden prepararse y usarse en un procedimiento terapéutico según cualquier protocolo adecuado, por ejemplo tal como se describe a continuación en el presente documento. El experto en la técnica apreciará que el protocolo puede adaptarse para usarse en pacientes con tipo de HLA diferente y enfermedades diferentes.

Se someten las células dendríticas (DC) a pulsos con péptido restringido a HLA 50 \mug/ml (sintetizado según la calidad de GMP) durante 1 h a 37ºC péptido y 5 x 10^{6} células se administran por vía subcutánea en el día 1 y 14, posteriormente cada 4 semanas, leucoforesis adicional tras 5 vacunaciones. La generación de DC para su uso clínico y el control de calidad pueden realizares esencialmente tal como se describe en la referencia 5.

Por tanto, en una realización de la presente invención, un método para tratar a pacientes con cáncer es uno en el que el péptido se administra presentando el péptido a las células presentadoras de antígeno (APC) del paciente ex vivo seguido de inyectar las APC tratadas de este modo de nuevo en el paciente. Existen al menos dos modos alternativos de realizarlo. Una alternativa es aislar APC del paciente con cáncer e incubar (cargar) las moléculas de CMH de clase I con el péptido. Cargar las moléculas de CMH de clase I significa incubar las APC con el péptido de modo que las APC con las moléculas de CMH de clase I específicas para el péptido se unirán al péptido y por tanto podrán presentarlo a las células T. Posteriormente, las APC se vuelven a inyectar en el paciente. Otro modo alternativo se basa en descubrimientos recientes realizados en el campo de la biología de las células dendríticas. En este caso, se aíslan monocitos (que son precursores de células dendríticas) del paciente y se diferencia in vitro en APC profesionales (o células dendríticas) mediante el uso de citocinas y el antígeno. Posteriormente, se someten a pulsos las DC generadas in vitro con el péptido y se inyectan en el paciente.

Debido al hecho de que miembros de la familia de proteínas Bcl-2 parecen expresarse en una gama de formas de cáncer, es muy probable que las vacunas de la invención puedan proporcionarse para controlar cualquier tipo de enfermedad de cáncer en la que se expresen tales proteínas. Por tanto, como ejemplos, la composición de vacuna de la invención es inmunológicamente activa frente a un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cérvix, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

A partir de la descripción anterior, el experto comprenderá fácilmente que las proteínas y/o los péptidos de la invención son útiles como herramientas de diagnóstico del cáncer. Por tanto, los péptidos de la invención proporcionan la base para desarrollar procedimientos de diagnóstico y pronóstico ampliamente aplicables con respecto a las enfermedades de cáncer. Por tanto, en otras realizaciones útiles, la composición de la invención es una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente con cáncer, por ejemplo basado en la detección de células T reactivas con miembros de la familia de proteínas Bcl-2 familia entre PBL o en tejido tumoral.

En consecuencia, se proporciona, todavía en aspectos adicionales, un kit de diagnóstico para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente con cáncer de células T reactivas con miembros de la familia Bcl-2 entre PBL o en tejido tumoral que comprende uno o más péptidos de la invención, y un método de detección en un paciente con cáncer de la presencia de tales células T reactivas, comprendiendo el método poner en contacto un tejido tumoral o una muestra de sangre con un complejo de un péptido de la invención y una molécula de HLA de clase I o un fragmento de tal molécula y detectar la unión del complejo al tejido o las células sanguíneas.

Otro enfoque de diagnóstico o pronóstico útil se basa en la generación de anticuerpos en una especie animal heteróloga, por ejemplo anticuerpos murinos dirigidos frente a un péptido derivado de miembros de la familia de proteínas Bcl-2 humano de la invención, que puede usarse luego, por ejemplo para diagnosticar la presencia de células cancerosas que presentan el péptido. Para tales fines de inmunización, la cantidad de péptido puede ser inferior a la usada en el transcurso del tratamiento in vivo, tal como el mencionado anteriormente. En general, una dosis preferida puede oscilar desde aproximadamente 1 \mug hasta aproximadamente 750 \mug de péptido. También es posible producir anticuerpos monoclonales basándose en la inmunización con un péptido de la invención. En consecuencia, la presente invención se refiere también a una molécula, en particular un anticuerpo monoclonal o policlonal incluyendo un fragmento del mismo, que puede unirse específicamente a un péptido de la invención y a una molécula que puede bloquear una unión de este tipo, por ejemplo un anticuerpo generado frente al anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido frente a un péptido de la invención. La invención se refiere además a receptores de célula T aislados que pueden unirse específicamente a un péptido o una proteína de la invención así como a ácidos nucleicos aislados que codifican para los mismos. Tales receptores de célula T pueden clonarse por ejemplo a partir de células T específicas de proteína o péptido usando técnicas convencionales bien conocidas por el experto.

En un aspecto, la invención se refiere también a células T aisladas que comprenden receptores de célula T que pueden unirse específicamente a cualquiera de las proteínas que pertenecen a la familia Bcl-2 y/o fragmentos de péptido de las mismas descritos en el presente documento. Las células T aisladas son preferiblemente células T que se han expandido in vitro. Métodos para expandir células T in vitro son muy conocidos por el experto. Tales células T pueden ser útiles en particular en el tratamiento del cáncer mediante transferencia adaptativa o transferencia de células autólogas. Por tanto, la invención se refiere también a métodos de tratamiento que comprenden administrar células T que comprenden receptores de célula T que pueden unirse específicamente a una proteína que pertenece a la familia Bcl-2 o fragmentos de péptido de la misma a un individuo, tal como un ser humano que está padeciendo cáncer. La invención se refiere además al uso de células T que comprenden receptores de célula T que pueden unirse específicamente a una proteína que pertenece a la familia Bcl-2 o fragmentos de péptido de la misma para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. La transferencia de células autólogas puede realizarse esencialmente tal como se describe en la referencia 7.

En un aspecto, la invención proporciona un complejo de un péptido de la invención y una molécula de HLA de clase I o un fragmento de tal molécula, que es útil como reactivo de diagnóstico tal como se describió anteriormente. Un complejo de este tipo puede ser monomérico o multimérico.

La presente invención proporciona los medios para aliviar o curar una enfermedad de cáncer. En consecuencia, un aspecto adicional de la invención es proporcionar un método para tratar una enfermedad de cáncer asociada a la expresión de un miembro de la familia de proteínas Bcl-2, incluyendo como ejemplos: un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cérvix, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata, comprendiendo el método administrar a un paciente que padece la enfermedad una cantidad eficaz de la composición farmacéutica según la invención, una molécula que puede unirse específicamente a un péptido de la invención y/o una molécula que puede bloquear la unión de una molécula de este tipo.

En algunos casos será apropiado combinar el método de tratamiento de la invención con un tratamiento convencional contra el cáncer tal como quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimulantes, terapia génica, tratamiento con anticuerpos y tratamiento usando células dendríticas. Puesto que la expresión elevada de miembros de la familia de proteínas Bcl-2 en células tumorales está correlacionada con la resistencia a fármacos, la combinación de una inmunoterapia a base de Bcl-2 tal como se da a conocer mediante la presente invención con quimioterapia citotóxica podría ser un enfoque eficaz para tratar el cáncer.

En un aspecto, la invención se refiere a métodos para monitorizar la inmunización, comprendiendo dicho método las etapas de

i): proporcionar una muestra de sangre de un individuo

ii): proporcionar una proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico de la misma, pudiendo ser dicha proteína o dicho péptido cualquiera de las proteínas o los péptidos descritos en el presente documento

iiii): determinar si dicha muestra de sangre comprende anticuerpos o células T que comprenden receptores de célula T que se unen específicamente a la proteína o el péptido

iiv): determinar de ese modo si se ha generado una respuesta inmunitaria a dicha proteína o dicho péptido en dicho individuo.

El individuo es preferiblemente un ser humano, por ejemplo un ser humano que se ha inmunizado con una proteína que pertenece a la familia de proteínas Bcl-2 o un fragmento peptídico de la misma o un ácido nucleico que codifica para dicha proteína o dicho péptido.

La invención se ilustrará ahora mediante los siguientes ejemplos no limitativos y los dibujos en los que

la figura 1 muestra la identificación de péptidos de unión a HLA-A2 de Bcl-2. Las bandas de cadena pesada del CMH de clase I se cuantificaron usando un aparato Phosphorimager. La cantidad de cadena pesada de HLA-A2 estabilizada está directamente relacionada con la afinidad de unión del péptido añadido. La unión del péptido control positivo restringido a HLA-A2 VIH Pol_{476} (cuadrado en negro) se comparó con los péptidos Bcl_{172} (triángulo en negro), Bcl_{180} (círculo en negro) y Bcl_{200} (círculo en blanco) y

la figura 2 ilustra la respuesta de células T frente a los péptidos Bcl_{172}, Bcl_{180}, Bcl_{208} y Bcl_{214}. Se analizaron PBL de 15 pacientes con cáncer de mama. Se estimularon los linfocitos T una vez con el péptido antes de sembrarlos en placa a 10^{5} células por pocillo por triplicado o bien sin o bien con péptido. El número promedio de puntos específicos de péptido (tras restar los puntos sin péptido añadido) se calculó para cada paciente usando el analizador InmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.).

La figura 3 ilustra la respuesta de células T frente a Bcl-2 tal como se mide mediante ELISPOT de INF-\gamma. Se analizaron PBL de diez pacientes con LLC positivos para HLA-A2, tres pacientes con LMA positivos para HLA-A2 y dos pacientes con cáncer pancreático (PC). Se examinaron los péptidos Bcl_{208} (A) y Bcl_{214} (B). Se estimularon los linfocitos T una vez con el péptido antes de sembrarse en placa a 10^{5} células por pocillo por triplicado o bien sin o bien con péptido. El número promedio de puntos específicos de péptido (tras restar los puntos sin péptido añadido) se calculó para cada paciente usando el analizador InmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.). Los pacientes que responden al tratamiento (definido como el número promedio de puntos específicos de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} linfocitos) están marcados como cuadrados en negro, mientras que los individuos que no responden están marcados como cuadrados en blanco.

La figura 4 ilustra la detección de CTL específicos de Bcl-2 mediante ELISPOT de granzima B. Se estimularon linfocitos T de cuatro pacientes con cáncer de mama en diferente estadio tardío (b19, b20, b22, b16) y un control sano (h1) una vez con el péptido antes de sembrarse en placa a 10^{5} células por pocillo por triplicado o bien sin o bien con péptido Bcl_{208} (A) o Bcl_{214} (B). El número promedio de puntos de granzima B específicos de péptido (tras restar los puntos sin péptido añadido) se calculó para cada paciente usando el analizador InmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.). Pacientes que responden al tratamiento (definido como el número promedio de puntos específicos de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} linfocitos) están marcados como cuadrados en negro, mientras que los individuos que no responden están marcados como cuadrados en blanco.

La figura 5 ilustra la capacidad citolítica de CTL específicos de Bcl-2.bcl_{208}. Se aislaron CTL reactivos de PBL de un paciente con cáncer de mama usando perlas magnéticas recubiertas con HLA-A2/bcl_{208}. A) Se analizó el cultivo en masa aislado para determinar la lisis específica de células T2 con (cuadrado en negro) o sin (cuadrado en blanco) péptido bcl_{208}. B) Lisis mediante células T aisladas por bcl_{208} de la línea celular de cáncer de mama positivas para HLA-A2 MDA-MB-231 (círculo en negro) y la línea celular de cáncer de mama negativas para HLA-A2 ZR75-1 (círculo en blanco).

La figura 6 ilustra las respuestas de célula T restringidas por HLA-A2 frente a Bcl-X_{L} tal como se mide mediante ELISPOT de INF-\gamma. Se analizaron PBL de doce individuos sanos, dieciocho pacientes con cáncer de mama (pacientes BC), seis pacientes con melanoma y dos pacientes con cáncer pancreático (pacientes PC). Todos los individuos eran positivos para HLA-A2. Se examinaron los péptidos Bcl-X_{L173-182} (YLNDHLEPWI) (SEQ ID NO:48) (A), Bcl-X_{L141-150} (VAFFSFGGAL) (SEQ ID NO:49) (B), Bcl-X_{L161-170} (VLVSRIAAWM) (SEQ ID NO:48) (C), y Bcl-X_{L165-174} (RIAAWMATYL) (SEQ ID NO:45) (D). Se estimularon los linfocitos T una vez con péptido antes de sembrarse en placa a 10^{5} células por pocillo por triplicado o bien sin o bien con el péptido relevante. Se calculó el número promedio de puntos específicos de péptido (tras restar los puntos sin péptido añadido) para cada paciente usando el analizador InmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.). Los pacientes que responden al tratamiento (definido como el número promedio de puntos específicos de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} linfocitos) están marcados como cuadrados en negro, mientras que los individuos que no responden están marcados como cuadrados en blanco.

La figura 7 ilustra la detección de CTL específicos de Bcl-X_{L} mediante ELISPOT de granzima B. Se estimularon los linfocitos T de tres pacientes con cáncer de mama diferentes (BC35, BC36 y BC17) una vez con el péptido antes de sembrarse en placa a 3x10^{5} células por pocillo por triplicado o bien sin o bien con péptido Bcl-X_{L173-182} (YLNDHLEPWI). Se calculó el número promedio de puntos de granzima B específicos de péptido (tras restar los puntos sin péptido añadido) para cada paciente usando el analizador InmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.). Los pacientes que responden al tratamiento (definido como el número promedio de puntos específicos de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} linfocitos) están marcados como cuadrados en negro, mientras que los individuos que no responden están marcados como cuadrados en blanco.

La figura 8 ilustra el análisis de células CD8 positivas, específicas de Bcl-X_{L}, en PBL de un paciente con cáncer de mama. Se estimularon PBL del paciente BC36 una vez con Bcl-X_{L173-182} in vitro y se aislaron las células CD8+ antes del análisis. La tinción de FACS del cultivo usando un anticuerpo anti-CD8 y el complejo de pentámero HLA-A2/Bcl-X_{L173-182} reveló que el 95,5% de las células eran CD8 positivas y el 0,24% de éstas eran positivas para el pentámero (A). Se usó el pentámero HLA-A2/VIH como control negativo (B). Se analizó el cultivo celular adicionalmente por medio de ELISPOT (C).

La figura 9 ilustra las respuestas de célula T restringidas por HLA-A2 frente a Bcl-X_{L} tal como se mide mediante ELISPOT de INF-\gamma. Se analizaron PBL de doce individuos sanos, dieciocho pacientes con cáncer de mama (pacientes BC), seis pacientes con melanoma y dos pacientes con cáncer pancreático (pacientes PC). Todos los individuos era positivos para HLA-A2. Se examinaron los péptidos Bcl-X_{L118-126} (TAYQSFEQV) (SEQ ID NO:43) (A) y Bcl-X_{L169-178} (WMATYLNDHL) (SEQ ID NO:46) (B). Se estimularon los linfocitos T una vez con péptido antes de sembrarse en placa a 10^{5} células por pocillo por triplicado o bien sin o bien con el péptido relevante. Se calculó el número promedio de puntos específicos de péptido (tras restar los puntos sin péptido añadido) para cada paciente usando el analizador InmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.). Los pacientes que responden al tratamiento (definido como el número promedio de puntos específicos de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} linfocitos) están marcados como cuadrados en negro, mientras que los individuos que no responden están marcados como cuadrados en blanco.

La figura 10 ilustra las respuestas de célula T restringidas por HLA-A3 frente a Bcl-X_{L} tal como se mide mediante ELISPOT de INF-\gamma. Se estimularon los linfocitos T una vez con péptido antes de sembrarse en placa a 10^{5} células por pocillo por triplicado o bien sin o bien con el péptido Bcl-X_{L165-173} (RIAAWMATY) (SEQ ID NO:50). Se examinaron PBL de siete individuos sanos, cinco pacientes con cáncer de mama, cuatro pacientes con melanoma, dos pacientes con cáncer pancreático, y cinco pacientes con mieloma múltiple. Todos los individuos eran positivos para HLA-A3. Se calculó el número promedio de puntos específicos de péptido (tras restar los puntos sin péptido añadido) para cada paciente usando el analizador InmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.).

La figura 11 ilustra las respuestas de célula T restringidas por HLA-A3 frente a Mcl-1 tal como se mide mediante ELISPOT de INF-\gamma. Se estimularon los linfocitos T una vez con péptido antes de sembrarse en placa a 3x10^{5} células por pocillo por triplicado o bien sin o bien con el péptido. Se examinaron PBL de diez individuos sanos, seis pacientes con cáncer de mama (BC), dos pacientes con cáncer pancreático (PC), y seis pacientes con LLC frente al péptido Mcl-195-103 péptido (izquierda) y el péptido Mcl-1300-308 (derecha). Todos los individuos eran positivos para HLA-A3. Se calculó el número promedio de puntos específicos de péptido (tras restar los puntos sin péptido añadido) para cada paciente usando el analizador InmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.). Los pacientes que responden al tratamiento (definido como el número promedio de puntos específicos de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} linfocitos) están marcados como cuadrados en negro, mientras que los individuos que no responden están marcados como cuadrados en blanco.

La figura 12 ilustra las respuestas de célula T restringidas por HLA-A1 frente a Mcl-1 tal como se mide mediante ELISPOT de INF-\gamma. Se estimularon los linfocitos T una vez con péptido antes de sembrarse en placa a 3x10^{5} células por pocillo por triplicado o bien sin o bien con el péptido Mcl-1166-175 o Mcl-1177-185. Se examinaron PBL de seis individuos sanos, cuatro pacientes con cáncer de mama (BC) y siete pacientes con melanoma frente al péptido Mcl-195-103 (izquierda) y el péptido Mcl-1300-308 (derecha). Todos los individuos eran positivos para HLA-A1. El número promedio de puntos específicos de péptido (tras restar los puntos sin péptido añadido) se calculó para cada paciente usando el analizador InmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.). Los pacientes que responden al tratamiento (definido como el número promedio de puntos específicos de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} linfocitos) están marcados como cuadrados en negro, mientras que los individuos que no responden están marcados como cuadrados en blanco.

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Ejemplos Ejemplo 1 Respuestas inmunitarias frente a Bcl-2 en pacientes con cáncer de mama Materiales y métodos 1. Pacientes

Se recogieron linfocitos de sangre periférica (PBL) de pacientes con cáncer de mama. Se aislaron los PBL usando separación con Lymphoprep, se tipificaron para HLA (Departamento de Inmunología Clínica, Hospital Universitario, Copenhague, Dinamarca) y se congelaron en FCS con DMSO al 10%. Ninguno de los pacientes recibió inmunoterapia antes de la toma de la muestra de sangre.

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2. Ensayo de ensamblaje para la unión de péptidos a moléculas de CMH de clase I

Se midió la afinidad de unión de los péptidos sintéticos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE.UU.) a moléculas HLA-A2, marcadas metabólicamente con [^{35}S]-metionina, en el ensayo de ensamblaje, tal como se describió anteriormente. El ensayo se basa en la estabilización mediada por péptidos de moléculas de HLA vacías liberadas tras la lisis celular, a partir de la línea celular T2 deficiente en TAP. Se inmunoprecipitaron moléculas de HLA plegadas de manera estable usando el AcM W6/32 dependiente de la conformación, específico de HLA de clase I, y se separaron mediante electroforesis en gel e isoelectroenfoque (IEF). Se cuantificaron las bandas de cadena pesada del CMH usando el programa ImageGauge Phosphorimager (FUJI photo film Co., Carrollton, TX, EE.UU.). La intensidad de la banda está directamente relacionada con la cantidad de complejo del CMH de clase I unido a péptido recuperado durante el ensayo. Posteriormente, el grado de estabilización de HLA-A2 se relaciona directamente con la afinidad de unión del péptido añadido. Se midió la recuperación de HLA-A2 en presencia de 50, 5, 0,5, 0,05 \muM del péptido relevante. Se calculó el valor C_{50} para cada péptido como la concentración de péptido suficiente para obtener la mitad de la estabilización máxima.

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3. Estimulación antigénica de PBL

Para extender la sensibilidad del ensayo ELISPOT, se estimularon los PBL una vez in vitro antes del análisis. En el día 0, se descongelaron PBL o ganglios linfáticos triturados y se sembraron en placa en 2 ml/pocillo a una concentración de 2 10^{6} células en placas de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca) en medio X-vivo (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland), suero humano inactivado con calor al 5% y 2 mM de L-glutamina en presencia de 10 \muM de péptido. Dos días después, se añadió a los cultivos interleucina-2 (IL-2) recombinante 20 UI/ml (Chiron, Ratingen, Alemania). Se sometieron a prueba las células cultivadas para determinar su reactividad en el ELISPOT en el día 12.

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4. Ensayo ELISPOT

Se usó el ensayo ELISPOT para cuantificar las células efectoras que liberan interferón-\gamma específicas de epítopo peptídico tal como se describió anteriormente (4). En resumen, se recubrieron placas de 96-pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) con anticuerpo anti-IFN-\gamma (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suecia). Se lavaron los pocillos, se bloquearon mediante medio X-vivo y se añadieron células por duplicado a diferentes concentraciones celulares. Entonces se añadieron péptidos a cada pocillo y se incubaron las placas durante la noche. Al día siguiente, se desechó el medio y se lavaron los pocillos antes de la adición de anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotin, Mabtech). Se incubaron las placas durante 2 horas, se lavaron y se añadió conjugado de avidina-enzima (AP-Avidin, Calbiochem, Life Technologies) a cada pocillo. Se incubaron las placas a TA durante 1 hora y se añadió el sustrato enzimático NBT/BCIP (Gibco, Life Technologies) a cada pocillo y se incubó a TA durante 5-10 min. Se puso fin a la reacción lavando con agua corriente tras el surgimiento de puntos de color púrpura oscuro. Se contaron los puntos usando el analizador ImmunoSpot® serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE.UU.) y pudo calcularse la frecuencia de CTL específicos de péptido a partir de los números de células que formaban puntos. Todos los ensayos se realizaron por triplicado para cada antígeno peptídico.

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5. Resultados Unión de péptidos derivados de Bcl-2 a HLA-A2

Se investigó la secuencia de aminoácidos de la proteína Bcl-2 para determinar los epítopos peptídicos de nona y decámero de HLA-A2 más probables, usando los residuos de anclaje específicos de HLA-A2 principales (2). Se sintetizaron trece péptidos derivados de Bcl-2 y se examinaron para determinar su unión a HLA-A2 mediante comparación con el epítopo control positivo de alta afinidad por HLA-A2, VIH-1 pol_{476-484} (ILKEPVHGV) (SEQ ID NO:39) mediante el ensayo de ensamblaje. El ensayo de ensamblaje se basa en la estabilización de la molécula de clase I tras cargar diferentes concentraciones de péptido en la línea celular T2 deficiente en TAP. Posteriormente, se inmunoprecipitan cadenas pesadas del CMH estables plegadas correctamente usando anticuerpos dependientes de la conformación. El grado de estabilización de moléculas de CMH de clase I está directamente relacionado con la afinidad de unión del péptido añadido tal como se muestra como ejemplo en la figura 1. La concentración de péptido requerida para lograr la mitad de la recuperación máxima de moléculas de CMH de clase I (valor C_{50}) fue de 0,7 \muM para el VIH-1 pol_{476-484} (tabla 1). Ocho péptidos derivados de Bcl-2 se unieron con una alta afinidad casi similar al control positivo; Bcl_{224}, Bcl_{85}, Bcl_{222}, Bcl_{218}, Bcl_{220}, Bcl_{214}, Bcl_{124} y Bcl_{172} (C_{50} = 0,7, 1, 1, 2, 1, 3, 1 y 2 \muM, respectivamente) (tabla 1). Los péptidos Bcl_{80}, Bcl_{208} y Bcl_{180} se unieron sólo con una afinidad intermedia o débil (C_{50} = 36, 7 y 20 \muM, respectivamente). Dos de los péptidos examinados (Bcl_{216}, Bcl_{200}) no se unieron a HLA-A2 en absoluto. En la tabla 1 se muestra una lista de los péptidos incluidos en este estudio:

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TABLA 1 Péptidos examinados en este estudio

7

: ^{a} El intervalo de valores enumerado en subíndices indica la posición del primer aminoácido en la secuencia

: ^{b} El valor C_{50} es la concentración del péptido requerida para lograr la mitad de la unión máxima a HLA-A2

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Respuestas de CTL frente a péptidos derivados de BCL-2 en pacientes con cáncer de mama tratados con quimioterapia

Usando el ensayo de secreción de IFN-\gamma ELISPOT, se examinó la presencia de respuestas de células T específicas frente a los péptidos derivados de Bcl-2 en células T de sangre periférica de pacientes con cáncer de mama. Este método ha sido anteriormente altamente eficaz cuando se identificaban CTL específicos de tumores en pacientes con cáncer.

Se estimularon una vez in vitro PBL de 15 pacientes con cáncer de mama positivos para HLA-A2 antes del examen en el ELISPOT. Se eligió este procedimiento para extender la sensibilidad del ELISPOT tal como se describió (4). Puesto que muchos epítopos de CTL descritos son de hecho péptidos de baja afinidad, se incluyeron los trece péptidos deducidos de Bcl-2 en la primera línea de experimentos. Se detectaron respuestas frente a Bcl_{172}, Bcl_{180}, Bcl_{208} y Bcl_{214} y en la figura 2 se facilitan sólo datos de estos péptidos. Se detectaron respuestas de CTL espontáneas frente a Bcl_{172} en PBL de ocho de los pacientes (50%), y frente a Bcl_{180} en cuatro de los pacientes (\approx25%) (figura 2). Sin embargo, las respuestas más frecuentes se detectaron frente a Bcl_{208} y Bcl_{214}, ya que doce (\approx80%) de los pacientes albergaron una respuesta de CTL detectable frente a Bcl_{208} y once de los pacientes (\approx75%) albergaron una respuesta frente a Bcl_{214} (figura 2).

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Ejemplo 2 Inmunogenicidad de Bcl-2 en pacientes con cáncer Resumen

En este ejemplo, se describe la reactividad de células T espontánea frente a Bcl-2 en sangre periférica de pacientes que padecen tipos de tumores no relacionados, es decir, cáncer pancreático, AML y CLL. Adicionalmente, se muestra que estas células T reactivas frente a Bcl-2 son de hecho células efectoras citotóxicas, específicas de péptido. Por tanto, Bcl-2 puede servir como una diana importante y ampliamente aplicable para estrategias inmunoterapéuticas contra el cáncer, por ejemplo en combinación con radio y quimioterapia convencionales.

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Introducción

La familia Bcl-2 comprende varios actores clave en la regulación de la apoptosis e incluye tanto moléculas proapoptóticas como antiapoptóticas. Bcl-2 es un factor celular crítico que contribuye a la patogenia y la progresión del cáncer. En el presente estudio, se examinó la inmunogenicidad celular natural de Bcl-2 en pacientes con cáncer.

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Métodos Pacientes

Se aislaron PBL usando separación con Lymphoprep, se tipificaron para HLA (Departamento de Inmunología Clínica, Hospital Universitario, Copenhague, Dinamarca) y se congelaron en FCS con DMSO al 10%. Ninguno de los pacientes recibió inmunoterapia antes de la toma de la muestra de sangre. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas. Se recogieron linfocitos de sangre periférica (PBL) de trece pacientes con cáncer de mama positivos para HLA-A2 que presentaban enfermedad progresiva con metástasis a distancia que definían la enfermedad en estadio IV; la mayoría de los pacientes tenían más de una ubicación de tumor (8/13 pacientes). El tratamiento anterior incluía quimioterapia, tratamiento endocrino y radioterapia. Ocho pacientes se trataron anteriormente con quimioterapia, mientras que cinco pacientes habían recibido sólo tratamiento endocrino y no quimioterapia antes de su inclusión en el estudio. Además, se incluyeron doce pacientes positivos para HLA-A2 con cáncer de mama operable localizado y se recogieron muestras de sangre antes de la intervención quirúrgica primaria y quimioterapia. Adicionalmente, se recogieron PBL de dos pacientes con cáncer pancreático positivos para HLA-A2 que presentaban enfermedad progresiva con metástasis a distancia que definían la enfermedad en estadio IV. Finalmente, se recogieron PBL de diez pacientes con CLL recién diagnosticados HLA-A2 y tres con AML antes del tratamiento. Como controles, sirvieron PBL de doce individuos sanos positivos para HLA-A2.

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ELISPOT de granzima B

Se usó el ensayo ELISPOT de granzima B (GrB) para medir la citotoxicidad de CTL específica de antígeno tal como se describe. En resumen, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore) con anticuerpo de captura de GrB (BD Biosciences, Brondby, Dinamarca). Se lavaron los pocillos y se bloquearon mediante medio X-vivo con suero humano al 5%. Se añadieron las células a diferentes concentraciones celulares. Entonces se añadieron células T2 y péptidos a cada pocillo y se incubaron las placas durante 4 horas, se desechó el medio y se lavaron los pocillos antes de la adición del anticuerpo de detección de GrB (BD Biosciences). Se incubaron las placas durante 2 horas, se lavaron y se añadió avidina-peroxidasa del rábano (BD Biosciences) a cada pocillo. Se incubaron las placas a TA durante 1 hora, se añadió reactivo de sustrato AEC (BD Biosciences) a cada pocillo y se incubó a TA durante 5-10 min. Se puso fin a la reacción lavando con agua corriente tras el surgimiento de puntos rojos. Se contaron los puntos y se calculó la frecuencia de CTL específicos de péptido como para el ELISPOT de IFN-\gamma. Se realizaron todos los ensayos por duplicado o triplicado para cada antígeno peptídico.

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Aislamiento de células T específicas de péptido

Se aislaron células específicas de antígeno por medio de perlas magnéticas recubiertas con Bcl_{208}/HLA-A2 tal como se describió anteriormente. Se acoplaron monómeros biotinilados (Prolmmune, Oxford, RU) a perlas magnéticas recubiertas con estreptatividina (Dynabeads M-280, Dynal A/S, Oslo, Noruega) incubando 2,5 \mug de monómeros con 5x10^{6} perlas en 40 \mul de PBS, durante 20 min. a temperatura ambiente. Se lavaron los complejos magnéticos tres veces en PBS en un campo magnético (Dynal A/S, Oslo, Noruega) y posteriormente se mezclaron con PBL, a una razón de 1:10 en PBS con BSA al 5%, y se hicieron rotar muy suavemente durante 1 h. Se lavaron muy suavemente tres veces células T CD8^{+} específicas de antígeno que se asociaban a los complejos magnéticos. Se resuspendieron las células aisladas numerosas veces en X-vivo con HS al 5% y se incubaron durante 2 h, antes de liberarse las perlas magnéticas y eliminarlas de las suspensión celular. Se cultivaron las células aisladas en una placa de 48 pocillos en X-vivo, HS al 5% y 10^{6} células presentadoras de antígeno basadas en células artificiales recubiertas con anticuerpo anti-CD28, anticuerpo anti-CD3 (K32/41 BBL) que expresan el ligando de 4-1BB (4-1 BBL) (proporcionadas por gentileza del Dr. Carl H. June, Departamento de Patología y Medicina de laboratorio, Universidad de Pensilvania). Un día tras el aislamiento, se añadió IL-2 20 unidades/ml, y en el día 5 se sometió a prueba la capacidad de estas células para destruir células diana cualquiera en ensayos de liberación de ^{51}Cr convencionales.

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Clonación mediante dilución límite

Se establecieron clones de CTL a partir de los cultivos aislados mediante dilución límite en placas de 96 pocillos usando PBMC irradiadas como células alimentadoras en presencia de IL-2 40 UI/ml y PHA 1 \mug/ml en X-vivo con HS al 5%. Se añadieron medio nuevo e IL-2 a los clones cada 3-4 días.

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Ensayo de citotoxicidad

Se llevaron a cabo ensayos de liberación de [^{51}Cr] convencionales para determinar la citotoxicidad mediada por CTL tal como se describe en otra parte en el presente documento. Las células diana eran células T2 con o sin el péptido relevante, la línea celular de cáncer de mama positiva para HLA-A2 MDA-MB-231 y la línea celular de cáncer de mama negativa para HLA-A2 ZR75-1. Ambas líneas de cáncer de mama expresaban Bcl-2 tal como se examinó mediante PCR de transcripción inversa (datos no mostrados).

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Resultados Respuestas de CTL frente a péptidos derivados de Bcl-2

Para examinar si células T específicas de Bcl-2 estaban también presentes en PBL de pacientes con leucemia, se examinaron PBL de diez pacientes con CLL positivos para HLA-A2 y tres pacientes con AML para determinar la reactividad frente a los dos péptidos bcl_{208} y bcl_{214}. Estaban presentes respuestas frente a Bcl-2 en cinco de los pacientes con CLL y dos de los pacientes con AML (figura 3). Además, se examinaron PBL de dos cánceres pancreáticos y se identificó que ambos pacientes albergaban una respuesta de CTL frente a los péptidos bcl_{208} y bcl_{214} (figura 3). De manera similar, se examinaron PBL de doce individuos sanos positivos para HLA-A2. Sorprendentemente, se detectó una respuesta de CTL débil frente al péptido bcl_{208} en uno de los individuos sanos (datos no mostrados).

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Liberación de granzima B específica de Bcl-2 en PBL

Usando el ELISPOT de GrB, se evaluó si las células T específicas de bcl-2 detectadas en PBL mostraban función citotóxica. Por tanto, se analizaron PBL de tres de los pacientes con cáncer de mama reactivos con bcl-2 (pacientes nº: 19, 20 y 22) para determinar la reactividad frente a los dos epítopos bcl_{208} y bcl_{214} (figura 4). En los tres pacientes, pudieron detectarse respuestas frente a ambos péptidos con una frecuencia a aproximadamente 50-140 CTL específicos de péptido por 10^{5} PBL. Como control, se incluyó un paciente (paciente nº: 16), en el que sólo pudo detectarse una respuesta frente a bcl_{172} pero no frente a bcl_{208} y bcl_{214} en el ELISPOT de IFN-\gamma y un control sano (h1). Tal como se esperaba, no se detectó liberación de GrB frente a bcl_{208} o bcl_{214} ni en el paciente con cáncer de mama nº 16 ni en el control sano.

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La capacidad funcional de CTL reactivos con Bcl-2

Para caracterizar adicionalmente la capacidad funcional de CTL reactivos con Bcl-2, se enriquecieron estas células por medio de perlas magnéticas recubiertas con complejos de HLA-A2/bcl_{208} tal como se describe. Se estimularon las células una vez con péptido in vitro antes del aislamiento. Se clonó una pequeña fracción de las células aisladas mediante dilución límite. Se examinaron los cultivos en expansión para el reconocimiento de las células T2 o bien sin péptido o bien pulsadas con bcl_{208} en un ELISPOT de GrB. Varios de estos clones mostraron un reconocimiento específico de células T2 pulsadas con bcl_{208} (datos no mostrados). Sin embargo, desafortunadamente no se pudieron expandir estos clones para análisis adicionales.

Un día tras el aislamiento, se añadió IL-2 a las células restantes, y en el día 5 se sometió a prueba la capacidad de las células para destruir células T2 cargadas con péptido en ensayos de liberación de ^{51}Cr convencionales. Para este fin, o bien células T2 no cargadas o bien células T2 cargadas con péptido bcl_{208} sirvieron como dianas. Este ensayo reveló que sólo se destruían células T2 pulsadas con bcl_{208} (figura 5a). Se usaron adicionalmente estas células T reactivas con bcl_{208} estimuladas in vitro y enriquecidas para someter a prueba la capacidad para destruir la línea celular de cáncer de mama MDA-MB-231, que expresa Bcl-2 y es positiva para HLA-A2. Las células T enriquecidas lisaron eficazmente las células MDA-MB-231, mientras que en cambio no se observó citotoxicidad frente a la línea celular de cáncer de mama ZR75-1, que es negativa para HLA-A2 y expresa Bcl-2 (figura 5b).

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Ejemplo 3 Inmunogenicidad de Bcl-X(L) en pacientes con cáncer Resumen

En este ejemplo, se demuestra que Bcl-X_{L} es una diana para el reconocimiento de células T en pacientes con cáncer. Por tanto, se describen respuestas de células T citotóxicas espontáneas restringidas por HLA-A2 y HLA-A3 frente a epítopos peptídicos derivados de Bcl-X_{L} por medio de tinciones de citometría de flujo y ELISPOT. Por tanto, las respuestas inmunitarias celulares frente a inhibidores de la apoptosis como las proteínas de la familia Bcl-2 parecen representar un fenómeno general en el cáncer, y en consecuencia, este grupo de proteínas representa proteínas diana universales atractivas para la inmunoterapia contra el cáncer. Adicionalmente, puesto que la expresión elevada de estas proteínas en células está correlacionada con la resistencia a fármacos, la combinación de inmunoterapia con quimioterapia citotóxica es un modo muy atractivo para tratar el cáncer.

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Introducción

La proteína antiapoptótica Bcl-X_{L} se produce a partir de la forma de corte y empalme alternativo larga del gen bcl-x, mientras que Bcl-X_{S} proapoptótica se deriva de la forma de corte y empalme alternativo corta del mismo gen. Bcl-X_{L} desempeña un importante papel ya que se ha relacionado directamente con la resistencia a formas convencionales de tratamientos y malos pronósticos. La inhibición funcional de Bcl-X_{L} restablece el proceso apoptótico y hace a las células neoplásicas sensibles a quimio y radioterapias, mientras que la manipulación de líneas celulares cancerosas para que expresen altos niveles de Bcl-X_{L} da como resultado un fenotipo de resistencia a múltiples fármacos. Se ha notificado el aumento de la expresión de Bcl-X_{L} en una variedad de tumores malignos diferentes incluyendo AML y mieloma múltiple así como cánceres sólidos como cáncer de vejiga, cáncer de mama, cáncer pancreático y melanoma.

Dianas ideales para inmunoterapia son productos génicos silenciados en tejidos normales, sobreexpresados en células cancerosas, e implicados directamente en la progresión y supervivencia de las células tumorales.

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Materiales y métodos Pacientes

Se recogieron linfocitos de sangre periférica (PBL) de pacientes que padecían cáncer de origen diferente y de controles sanos y se aislaron usando separación con Lymphoprep, se tipificaron para HLA (Departamento de Inmunología Clínica, Hospital Universitario, Copenhague, Dinamarca) y se congelaron en FCS con DMSO al 10%. Ninguno de los pacientes recibió inmunoterapia antes de la toma de la muestra de sangre. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas.

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Citometría de flujo (FACS)

Se estimularon una vez in vitro PBL de un paciente con cáncer de mama con el péptido relevante y en el día siete se aislaron las células CD8^{+} a partir de PBL usando el kit de aislamiento de CD8 negativo Dynal (Dynal Biotech ASA, Oslo, Noruega). Se tiñó el cultivo de células T CD8 positivas resultante con pentámeros de CMH Pro5^{TM} acoplados con PE (ProImmune, Oxford, RU), seguido de tinción de anticuerpos con los AcM acoplados a fluorocromo: CD8-APC y CD3-FITC (Becton Dickinson, Immunocytometry Systems, San José, CA). Se realizaron ambas tinciones en PBS + FCS al 2%, durante 30 min., 4ºC, en la oscuridad. Se usaron los complejos de pentámero del CMH Pro5^{TM}: HLA-A2/Bcl-X_{L173-182} (YLNDHLEPWI) (SEQ ID NO:42) y HLA-A2/VIH-1 pol_{476-484} (ILKEPVHGV) (SEQ ID NO:39). Se analizaron las muestras sobre BD FACS aria, usando el software DIVA (BD, San José, CA).

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Resultados Respuestas de CTL espontáneas frente a péptidos derivados de Bcl-X_{L}

El gen bcl-x se transcribe en dos ARNm a través de corte y empalme alternativo. La proteína antiapoptótica Bcl-X_{L} se produce a partir de la forma de corte y empalme alternativo larga, mientras que Bcl-X_{S} proapoptótica se deriva de la forma de corte y empalme alternativo corta de este gen. El producto proteico de la BCL-X_{L} más grande difiere de la proteína Bcl-X_{S} en una región insertada (aminoácidos 126-188). Por tanto, para investigar si Bcl-X_{L} es una diana natural para las células T en pacientes con cáncer, se inspeccionó esta región insertada (incluyendo nueve aminoácidos en cada extremo) para determinar epítopos de HLA-A2 supuestos usando los residuos de anclaje específicos de HLA-A2 principales. Posteriormente, se sintetizaron siete péptidos deducidos de Bcl-X_{L} (Bcl-X_{L158-166} (EMQVLVSRI) (SEQ ID NO:44), Bcl-X_{L118-126} (TAYQSFEQV) (SEQ ID NO:43), Bcl-X_{L173-182} (YLNDHLEPWI) (SEQ ID NO:42), Bcl-X_{L165-174} (RIAAWMATYL) (SEQ ID NO:45), Bcl-X_{L169-178} (WMATYLNDHL) (SEQ ID NO:46), Bcl-X_{L161-170} (VLVSRIAAWM) (SEQ ID NO:48), Bcl-X_{L141-150} (VAFFSFGGAL) (SEQ ID NO:49)) y se inspeccionaron PBL de pacientes con cáncer HLA-A2+ de origen diferente por medio de ELISPOT frente a estos péptidos. Anteriormente, se ha demostrado que este método es altamente eficaz para identificar CTL específicos de tumores en pacientes con cáncer. De hecho, se detectaron respuestas de CTL fuertes y frecuentes frente a cuatro de los péptidos examinados (Bcl-X_{L173-182}, Bcl-X_{L141-150}, Bcl-X_{L161-170} y Bcl-X_{L165-174}) en pacientes con cáncer de origen diferente (figura 6). En total, quince de los dieciocho pacientes con cáncer de mama HLA-A2+ albergaron una respuesta inmunitaria frente a al menos uno de estos cuatro péptidos de Bcl-X_{L} (los pacientes que responden al tratamiento se definen como el número promedio de células específicas de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} células). Asimismo, cuatro de los seis pacientes con melanoma examinados y uno de los dos pacientes con cáncer pancreático examinados albergaron una respuesta inmunitaria frente a al menos uno de estos cuatro péptidos. Por tanto, nueve de los dieciocho pacientes con cáncer de mama examinados albergaron una respuesta inmunitaria frente a Bcl-X_{L173-182}, mientras que dos de los seis pacientes con melanoma HLA-A2+ examinados albergaron una respuesta inmunitaria frente a este péptido (figura 6a). Cuatro de los dieciocho pacientes con cáncer de mama examinados albergaron una respuesta inmunitaria frente a Bcl-X_{L141-150}, mientras que se detectaron respuestas en PBL de uno de los dos pacientes con cáncer pancreático examinados. No se pudo detectar una respuesta en PBL de ninguno de los cinco pacientes con melanoma examinados frente a este péptido (figura 6b). Asimismo, se detectó una respuesta en PBL de seis pacientes con cáncer de mama y un paciente con cáncer pancreático examinado frente a Bcl-X_{L161-170} (figura 6c). Finalmente, cuatro pacientes con cáncer de mama, dos pacientes con melanoma y un paciente con cáncer pancreático albergaron una respuesta frente a Bcl-X_{L165-174} (figura 6d). Como control, se examinaron PBL de 12 individuos sanos HLA-A2+. De manera importante, no se detectaron respuestas frente a ningún péptido Bcl-X_{L173-182}, Bcl-X_{L141-150}, Bcl-X_{L161-170} ni Bcl-X_{L165-174} en ninguno de los individuos sanos (figura 6)

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Liberación de granzima B específica de Bcl-X_{L} en PBL

Usando el ELISPOT de GrB, se evaluó si las células T específicas de Bcl-X_{L} detectadas en PBL mostraban función citotóxica. Por tanto, se analizaron PBL de dos de los pacientes con cáncer de mama reactivos frente a Bcl-X_{L} (pacientes nº: 35 y 36) para determinar la reactividad frente a Bcl-X_{L173-182} (figura 7). En ambos pacientes, pudieron detectarse respuestas frente a Bcl-X_{L173-182} con una frecuencia a aproximadamente 50-100 CTL específicos de péptido por 3x10^{5} células. Como control se incluyó un paciente (paciente nº: 17), en el que sólo pudo detectarse una respuesta frente a Bcl-X_{L141-150} pero no frente a Bcl-X_{L173-182} en el ELISPOT de IFN-\gamma. Tal como se esperaba, no se detectó liberación de GrB frente a Bcl-X_{L173-182} en el paciente con cáncer de mama nº 17.

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Análisis de FACS de células T específicas de Bcl-X_{L}

Se evaluó adicionalmente la aparición espontánea de CTL específicos de Bcl-X_{L173-182} en PBL de pacientes con cáncer de mama usando análisis de FACS y tinción con pentámero de CMH Pro5^{TM}. Se estimularon una vez in vitro PBL del paciente con cáncer de mama nº 36 con péptido y se aislaron las células CD8 positivas. Se tiñó este cultivo con el complejo de pentámero de HLA-A2/BCL-X. Los análisis de FACS revelaron una población fácilmente detectable de células T positivas para el pentámero que constituían el 0,24% de las células T CD8^{+} (figura 8a). En comparación, las mismas células T CD8+ mostraron aproximadamente el 1,4% de células T CD8^{+} que secretan IFN\gamma, específicas de Bcl-X_{L173-182} cuando se analizaron por medio de ELISPOT (figura 8c).

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Epítopos restringidos a HLA-A2 adicionales frente a Bcl-X(L)

Se inspeccionaron PBL de pacientes con cáncer HLA-A2+ de origen diferente por medio de ELISPOT frente a Bcl-X_{L118-126} (TAYQSFEQV) (SEQ ID NO:43) (figura 9a) y Bcl-X_{L169-178} (WMATYLNDHL) (SEQ ID NO:46) (figura 9b) identificando una respuesta de CTL espontánea débil en pacientes con cáncer de origen diferente frente a ambos péptidos.

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Respuestas restringidas por HLA-A3 frente a Bcl-X(L)

Adicionalmente, se inspeccionó la región insertada (incluyendo nueve aminoácidos en cada extremo) para determinar epítopos de HLA-A3 supuestos usando los residuos de anclaje específicos de HLA-A3 principales. Posteriormente, se sintetizaron dos péptidos; Bcl-X_{L165-173} (RIAAWMATY) (SEQ ID NO:50) y el Bcl-X_{L149-157} (ALCVESVDK) (SEQ ID NO 51). A continuación, se inspeccionaron PBL de pacientes con cáncer HLA-A3+ de origen diferente por medio de ELISPOT frente al péptido Bcl-X_{L165-173} (RIAAWMATY) (SEQ ID NO:50) y el Bcl-X_{L149-157} (ALCVESVDK) (SEQ ID NO:51). Anteriormente, se ha demostrado que este método es altamente eficaz para identificar CTL específicos de tumores en pacientes con cáncer. De hecho, se detectaron respuestas de CTL fuertes y frecuentes frente a Bcl-X_{L165-173} (RIAAWMATY) (SEQ ID NO:50) en pacientes con cáncer de origen diferente. También se pudo detectar una respuesta frente al Bcl-X_{L165-173} en PBL HLA-A3+ en cuatro de los cinco pacientes con cáncer de mama examinados (los pacientes que responden al tratamiento se definen como el número promedio de células específicas de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} células), cuatro de los cuatro pacientes con melanoma examinados, dos de los dos pacientes con cáncer pancreático examinados así como uno de los cuatro pacientes con mieloma múltiple examinados (figura 10). De manera importante, no pudo detectarse una respuesta en ninguno de los siete individuos sanos HLA-A3+ que se examinaron como controles (figura 10).

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Ejemplo 4 Inmunogenicidad de Mcl-1 en pacientes con cáncer Resumen

En este ejemplo, se demuestra que Mcl-1 es una diana para el reconocimiento de células T en pacientes con cáncer. Por tanto, se describen respuestas de células T espontáneas restringidas por HLA-A1 y HLA-A3 frente a epítopos peptídicos derivados de Mcl-1 por medio de ELISPOT

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Introducción

El factor-1 de célula mieloide (Mcl-1) es un miembro que inhibe la muerte de la familia Bcl-2 que se expresa en la diferenciación monocítica temprana y que puede promover la viabilidad en la transfección en células mieloides inmaduras. Mcl-1 en ratones transgénicos promueve la supervivencia en un espectro de tipos de células hematopoyéticas y la inmortalización de células mieloides. Se han notificado niveles elevados de Mcl-1 para varios cánceres en seres humanos incluyendo cánceres de próstata, cánceres pancreáticos, melanoma, cánceres de mama, pacientes con cáncer de ovario y cáncer de cérvix, así como leucemia linfocítica crónica de células B (B-CLL) y en AML y ALL tras recidiva. En pacientes con B-CLL, niveles superiores de Mcl-1 están fuertemente correlacionados con no poder lograr una remisión completa tras el tratamiento con un único agente. En el mieloma múltiple, Mcl-1 desempeña un importante papel en la supervivencia de las células malignas. En este aspecto, se ha demostrado que los ratones que expresan un transgén mcl-1 bajo el control de su propio promotor desarrollan neoplasias de células B con alta frecuencia, que oscilan desde linfoma folicular hasta linfoma de células grandes difusas.

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Respuestas restringidas por HLA-A3 frente a Mcl-1

Para investigar si Mcl-1 es una diana natural para células T en pacientes con cáncer, se examinó la secuencia de proteína para los epítopos peptídicos de nona y decámero de HLA-A3 más probables, usando los residuos de anclaje específicos de HLA-A3 principales. Posteriormente, se sintetizaron seis péptidos deducidos de Mcl-1 (Mcl-1_{185-194} (YLREQATGAK) (SEQ ID NO:52), Mcl-1_{293-302} (SITDVLVRTK) (SEQ ID NO:53), Mcl-1_{267-276} (LISFGAFVAK) (SEQ ID NO:54), Mcl-1_{95-103} (RLLFFAPTR) (SEQ ID NO:55), Mcl-1_{300-308} (RTKRDWLVK) (SEQ ID NO:56), Mcl-1_{236-244} (DIKNEDDVK) (SEQ ID NO:57)) y se examinaron PBL de pacientes con cáncer HLA-A3+ de origen diferente para determinar la reactividad frente a estos péptidos, aprovechándose del ensayo ELISPOT. Anteriormente, se ha demostrado que este método es altamente eficaz para la identificación de CTL específicos de tumores en pacientes con cáncer. De hecho, se detectaron respuestas de CTL fuertes y frecuentes frente a dos péptidos derivados de Mcl-1 en pacientes con cáncer de origen diferente (Mcl-1_{95-103} y Mcl-1_{300-308}) (figura 11). En total, cinco de los seis pacientes con cáncer de mama HLA-A3+ examinados albergaron una respuesta inmunitaria frente a uno de estos dos péptidos de Mcl-1. Por tanto, cinco pacientes con cáncer de mama albergaron una respuesta frente a Mcl-1_{95-103} (los pacientes que responden al tratamiento se definen como el número promedio de células específicas de antígeno \pm ½ de la desviación estándar > 25 por 10^{5} células), y tres pacientes albergaron una respuesta frente a Mcl-1_{300-308} (figura 11). Adicionalmente dos de los dos pacientes con cáncer pancreático HLA-A3+ examinados albergaron una respuesta inmunitaria frente al péptido Mcl-1_{95-103}, mientras que uno de éstos también reaccionó frente a Mcl-1_{300-308}. Adicionalmente se examinaron los PBL de seis pacientes que padecían B-CLL y se identificó una respuesta frente a Mcl-1_{95-103} en dos de estos pacientes. Como control, se examinaron PBL de 10 individuos sanos HLA-A3+. De manera importante, no se detectaron respuestas frente a o bien el péptido Mcl-1_{95-103} o bien el Mcl-1_{300-308} en ninguno de los donantes sanos (figura 11). De manera similar, no pudieron detectarse respuestas frente a ninguno de los cuatro péptidos derivados de Mcl-1 adicionales en ninguno de los pacientes con cáncer o controles sanos (datos no mostrados).

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Respuestas restringidas por HLA-A1 frente a Mcl-1

Para investigar si Mcl-1 es una diana natural para células T en pacientes con cáncer, se examinó la secuencia de proteína para los epítopos peptídicos de nona y decámero de HLA-A1 más probables, usando los residuos de anclaje específicos de HLA-A1 principales. Posteriormente, se sintetizaron cuatro péptidos deducidos de Mcl-1 (Mcl-1_{166-175} (PAEEEEDDLY) (SEQ ID NO:58), Mcl-1_{121-129} (SPEEELDGY) (SEQ ID NO:59), Mcl-1_{177-185} (QSLEIISRY) (SEQ ID NO:60), Mcl-1_{339-347} (AGVGAGLAY) (SEQ ID NO:61)) y se inspeccionaron PBL de pacientes con cáncer HLA-A1+ de origen diferente para determinar la reactividad frente a estos péptidos, aprovechándose del ensayo ELISPOT. De hecho, se detectaron respuestas de CTL frente a dos péptidos derivados de Mcl-1 en pacientes con cáncer de origen diferente (Mcl-1_{166-175} y Mcl-1_{177-185}) (figura 12). En total, tres de los cuatro pacientes con cáncer de mama HLA-A1+ examinados albergaron una respuesta inmunitaria frente a Mcl-1_{177-185} y uno de éstos albergó además una respuesta frente a Mcl-1_{166-175} (figura 12). Adicionalmente uno de los siete pacientes con melanoma albergó una respuesta inmunitaria frente al péptido Mcl-1_{177-185}, y otro de éstos albergó una respuesta frente a Mcl-1_{166-175}. Como control, se examinaron PBL de seis individuos sanos HLA-A1+. De manera importante, no se detectaron respuestas frente a o bien el péptido Mcl-1_{166-175} o bien el Mcl-1_{177-185} en ninguno de los donantes sanos (figura 12).

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Respuestas frente a péptidos modificados

La inmunogenicidad del péptido Mcl-1_{300-308} restringido a HLA-A3 se aumentó sustituyendo treonina en la posición 2 por un mejor residuo de anclaje de HLA-A3, concretamente leucina (Mcl-1_{300-308}L2 (RLKRDWLVK) (SEQ ID NO:62)). Se detectaron respuestas inmunitarias espontáneas en dos pacientes con cáncer de mama frente a Mcl-1_{300-308}L2 (datos no mostrados). Asimismo, para generar epítopo más inmunogenético, se modificó el péptido Mcl-1_{177-185} restringido a HLA-A1 (QSLEIISRY) (SEQ ID NO:60) en la posición 3 generando los dos péptidos Mcl-1_{177-185}D3 (QSDEIISRY) (SEQ ID NO:63) y Mcl-1_{177-185}E3 (QSEEIISRY) (SEQ ID NO:64).

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Discusión

Casi todos los tumores malignos se caracterizan por defectos en la señalización de la apoptosis. Esto hace que las células malignas sean resistentes a estímulos apoptóticos endógenos, así como estímulos exógenos tales como radiación y fármacos quimioterápicos. La apoptosis defectuosa observada en cánceres en seres humanos resulta a menudo de la sobreexpresión de proteínas antiapoptóticas en la familia de proteínas Bcl-2, es decir, Bcl-2, Bcl-X_{L} y Mcl-1, Bcl-w, Bfl-1A1, Bcl-b y Bcl2-L-10. El uso de tales inhibidores de proteínas de apoptosis para fines de vacunación es ventajoso porque la regulación por disminución o la pérdida de expresión de estas proteínas como alguna forma de escape inmunitario alteraría el crecimiento tumoral sostenido, puesto que la supervivencia de células tumorales requiere miembros funcionalmente activos de la familia Bcl-2. Para estrategias terapéuticas, la selección como diana de antígenos que desempeñan un papel insignificante en relación con el crecimiento y la supervivencia de células tumorales, la selección de tumores deficientes en antígenos es una limitación bien reconocida. Además, puesto que la expresión elevada de proteínas de la familia Bcl-2 en células está correlacionada con la resistencia a fármacos, la combinación de una inmunoterapia basada en la familia Bcl-2 con quimioterapia citotóxica es un nuevo modo muy fascinante para tratar el cáncer.

Se exploraron las proteínas Bcl-2, Bcl-X(L) y Mcl-1 para determinar la presencia de motivos de unión a péptido y se usaron éstos para la búsqueda de respuestas de células T específicas en pacientes con cáncer. Para este fin, se detectó la reactividad de células T espontánea frente a todos los miembros de la familia Bcl-2 en pacientes que padecían tipos de tumor no relacionados, es decir, cáncer pancreático, cáncer de mama, melanoma, AML y CLL por medio de ELISPOT. Se confirmó la presencia de células CD8+ específicas de Bcl-X_{L} en PBL de pacientes con cáncer mediante tinciones de FACS de CD8/ pentámero. Tomados juntos, estos datos muestran que los epítopos definidos por CTL de estas proteínas podrían aplicarse ampliamente en la vacunación terapéutica contra el cáncer y por tanto son de valor inmunoterapéutico sustancial.

Además, once de los pacientes con cáncer de mama poseían CTL específicos de Bcl-2, ocho de éstos pacientes se trataron anteriormente con al menos un tipo de quimioterapia. En dos pacientes (pacientes nº: 14 y 17) no pudieron detectarse respuestas de CTL frente a los cuatro péptidos de Bcl-2 diferentes. Ambos pacientes habían recibido anteriormente tratamiento anti-hormonal pero no quimioterapia. De manera similar, no pudo detectarse ninguna respuesta en pacientes con cáncer de mama localizado primario antes de la quimioterapia. Por tanto, en pacientes con cáncer de mama, se detectaron sólo respuestas frente a Bcl-2 en los pacientes que habían recibido quimioterapia. Aunque la carga tumoral puede desempeñar un papel importante, esto podría indicar que las respuestas inmunitarias se introducen o aumentan como consecuencia del aumento inducido por el tratamiento de la expresión de Bcl-2. Esto apunta a un caso en el que la combinación de una inmunoterapia basada en la familia Bcl-2 con quimioterapia citotóxica podría mejorar de manera sinérgica las tasas de respuesta actuales. El estado de tratamiento de los pacientes examinados para determinar las respuestas frente a Bcl-X(L) y Mcl-1 no estaba disponible.

En el presente estudio, se aprovechó el ensayo ELISPOT de GrB para demostrar que los CTL específicos de Bcl-2 o Bcl-X(L) en los PBL de pacientes son de hecho células efectoras citotóxicas. Para demostrar adicionalmente este concepto, se enriquecieron células T reactivas frente a Bcl-2 a partir de PBL de pacientes, y se mostró que la línea de células T resultante podía lisar células T2 pulsadas con péptidos en un ensayo de liberación de ^{51}Cr convencional. Además, esta línea de células T reactivas frente a Bcl-2 podía destruir una línea celular de cáncer de mama ajustada para HLA, mientras que las células diana HLA-A2 negativas no se destruían. Estos hallazgos muestran que de hecho las células cancerosas procesan y presentan el péptido Bcl-2 en el contexto de la molécula HLA-A2. Finalmente, se pudieron clonar estas células aisladas y se mostró que reaccionaban de manera altamente eficaz frente al epítopo peptídico de Bcl-2.

Cuando se usaron por primera vez péptidos derivados de antígenos de diferenciación melanocítica para tratar pacientes con melanoma en estadio IV, se previó que esto podría conducir a una destrucción de melanocitos pronunciada, que a su vez se manifestaría clínicamente, es decir, vitíligo o retinitis. Sin embargo, la experiencia clínica demostró que la incidencia de vitíligo en pacientes que recibieron vacunaciones no era significativamente superior a la incidencia de hipopigmentación asociada a melanoma en pacientes que recibieron otras formas de tratamiento. Adicionalmente, no se han notificado efectos secundarios graves en diversas campañas de vacunación frente a autoantígenos. Los datos, tomados juntos, demuestran que las respuestas inmunitarias celulares frente al grupo de proteínas de la familia Bcl-2 son una característica general en el cáncer. En el intento por maximizar el impacto de la inmunoterapia, una estrategia fascinante sería considerar el perfil de expresión y la significación del pronóstico de la diana elegida en la enfermedad particular, o estadio de enfermedad, que está tratándose. Por tanto, mientras que se observa la expresión conjunta de Bcl-2, Mcl-1 y Bcl-X_{L} en algunos cánceres, o un estadio de enfermedad particular, otros cánceres muestran la expresión exclusiva de una o la otra proteína. Por tanto, en algunas enfermedades como cáncer de ovario, la expresión de Mcl-1, pero no de Bcl-2, está asociada al estadio avanzado y a la mala supervivencia, razón por la que Mcl-1 podría ser el antígeno principal, mientras que en enfermedades tales como CLL, en la que se sobreexpresan conjuntamente Bcl-2 y Mcl-1, la selección como diana simultánea de ambas proteínas puede representar una estrategia más eficaz que la selección como diana de cualquier molécula sola. De manera similar, Tanaka et al describieron que la presencia de otra proteína survivina inhibidora de la apoptosis en el carcinoma de mama estaba fuertemente asociada a la expresión de Bcl-2 y a un índice apoptótico reducido (AI) y a una mala supervivencia global. Se ha descrito una asociación similar entre la survivina y Bcl-2 en el neuroblastoma, cáncer gástrico, cáncer colorrectal y linfoma no Hodgkin de alto grado. La eficacia potencial y la seguridad de péptidos derivados de survivina en vacunaciones terapéuticas contra el cáncer se están investigando actualmente en ensayos clínicos de fase I/II (J. Becker, comunicación personal). Por tanto, una estrategia inmunoterapeútica fascinante sería seleccionar como diana tanto la familia de proteínas Bcl-2 como la survivina especialmente debido a que ejecutan su función antiapoptótica a través de rutas celulares
diferentes.

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Ejemplo 5 Vacuna peptídica

Los péptidos de la familia de proteínas Bcl-2 pueden por ejemplo sintetizarse por ejemplo en la instalación UVA Biomolecular Core con un extremo NH_{2} terminal de amida libre y un extremo COOH terminal de ácido libre. Cada uno se proporciona como un péptido liofilizado, que entonces se reconstituye en agua estéril y se diluye con solución de Ringer con lactato (LR, Baxter Healthcare, Deerfield, IL) como tampón para una concentración final del 67-80% de solución de Ringer con lactato en agua. Entonces, se someten a filtración estéril estas disoluciones, se colocan en viales de vidrio de borosilicato y se someten a una serie de estudios de garantía de calidad incluyendo confirmación de la identidad, esterilidad, seguridad general y pureza, según las directrices de la FDA, tal como se define en la norma IND 6453. Las pruebas de la estabilidad del péptido demostraron que no disminuía la pureza o la concentración de péptido, cuando se almacenaban estas disoluciones de péptido a -20ºC durante 3 años.

En circunstancias prácticas, los pacientes recibirán una vacuna que comprende aproximadamente 100 \mug de un péptido restringido a HLA de clase I con o sin un péptido auxiliar restringido a HLA de clase II. Los pacientes se vacunan con por ejemplo aproximadamente 100 \mug del péptido de HLA de clase I en adyuvante solo, o se vacunan con por ejemplo aproximadamente 100 \mug del péptido restringido a HLA de clase I más 190 \mug del péptido auxiliar restringido a la clase II. Se calcula la dosis superior del péptido auxiliar para proporcionar cantidades equimolares de los péptidos auxiliar y citotóxico. Adicionalmente, los pacientes pueden vacunarse con un péptido más largo que comprende las secuencias de aminoácidos de ambos péptidos.

Los péptidos anteriores, en 1 ml de disolución acuosa, pueden administrarse o bien como una disolución/suspensión con aproximadamente 100 \mug de QS-21, o bien como una emulsión con aproximadamente 1 ml de adyuvante Montanide ISA-51.

Se inmunizaron los pacientes por ejemplo en el día 0 y los meses 1, 2, 3, 6, 9 y 12, con los péptidos más adyuvante, para un total de siete inmunizaciones. Con raras excepciones, las vacunaciones se administran en el mismo brazo con cada vacuna. Los péptidos se administran preferiblemente por vía s.c.

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Bibliografía

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11. Schmidt et al. Blood. 15 July, 2003, vol. 102. nº 2.

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<110> Kæftens Bekæmpelse

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<120> Proteínas que pertenecen a la familia Bcl-2 y fragmentos de las mismas y su uso en pacientes con cáncer

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<130> P 985 PC00

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<160> 64

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<170> PatentIn versión 3.1

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<210> 1

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<210> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 11

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

18

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 12

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

19

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 13

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

20

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 14

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

21

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 15

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

22

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 16

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

23

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 17

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

24

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 18

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 18

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

25

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 19

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

26

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 20

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

27

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 21

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

28

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 22

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

29

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 23

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

30

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 24

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 24

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

31

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 25

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

32

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 26

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 26

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

33

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 27

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 11

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de survivina

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 27

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

34

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 28

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 28

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

35

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 29

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 29

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

36

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 30

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

37

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

38

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

39

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

40

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

41

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

42

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

43

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

44

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de ML-IAP

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

45

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Epítopo de VIH-1 pol

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

46

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

47

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-2

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

48

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-XL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

49

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-XL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

50

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-XL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

51

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-XL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

52

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-XL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

53

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido de Bcl-2 modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

54

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-XL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

55

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-XL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

56

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-XL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

57

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Bcl-XL

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

58

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

59

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

60

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

61

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

62

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

63

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

64

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 10

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

65

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

66

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

67

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido derivado de Mcl-1

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

68

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Mcl-1 modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

69

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Mcl-1 modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

70

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 9

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Secuencia artificial

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<220>

\vskip0.400000\baselineskip

<223> Péptido Mcl-1 modificado

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\vskip1.000000\baselineskip

\hskip1cm

71

Claims

1. Péptido inmunogénicamente activo aislado que comprende como máximo 15 aminoácidos, derivado de la proteína Bcl-2, que comprende una secuencia seleccionada del grupo que consiste en: WLSLKTLLSL (SEQ ID NO:6), PLFDFSWLSL (SEQ ID NO:8), YLNRHLHTWI (SEQ ID NO:10) y NIALWMTEYL (SEQ ID NO:11) para su uso como medicamento.

2. Péptido según la reivindicación 1, siendo dicho péptido un péptido restringido a CMH de clase I, que tiene al menos una de las siguientes características;

(i): puede unirse a la molécula de HLA de clase I a la que está restringido a una afinidad, tal como se mide mediante la cantidad del péptido que puede realizar la mitad de la recuperación máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}), que es como máximo de 50 \muM tal como se determina mediante el ensayo de unión-ensamblaje,

(ii): puede provocar células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente con cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBLs tal como se determina mediante un ensayo ELISPOT, y/o

(iii): puede realizar la detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que son reactivos con el péptido de epítopo.

3. Péptido según la reivindicación 1, que tiene un valor C_{50}, que es como máximo de 30 \muM.

4. Péptido según la reivindicación 2, que tiene un valor C_{50}, que es como máximo de 20 \muM.

5. Péptido según la reivindicación 3, que tiene un valor C_{50}, que es como máximo de 10 \muM.

6. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-5, que puede provocar una respuesta inmunitaria celular en un paciente con cáncer.

7. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-6, que está restringido a una molécula HLA-A del CMH de clase I o una HLA-B del CMH de clase I.

8. Péptido según la reivindicación 6, que está restringido a una especie de HLA del CMH de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 y HLA-A24.

9. Péptido según la reivindicación 8, que está restringido a HLA-A2.

10. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 2 a 9, que comprende una secuencia seleccionada del grupo de WLSLKTLLSL (SEQ ID NO:6) y PLFDFSWLSL (SEQ ID NO:8).

11. Péptido según la reivindicación 7, que está restringido a una especie de HLA-B del CMH de clase I seleccionada del grupo que consiste en HLA-B7, HLA-B35, HLA-B44, HLA-B8, HLA-B15, HLA-B27 y HLA-B51.

12. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, que es un nonapéptido o un decapéptido.

13. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-12, que se deriva de Bcl-2 mediante sustitución, deleción o adición de al menos un residuo de aminoácido.

14. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 13, que puede provocar células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente con cáncer a una frecuencia de al menos 10 por 10^{4} PBLs.

15. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 5 a 14, que puede provocar células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad de cáncer en la que se expresa la proteína Bcl-2.

16. Péptido según la reivindicación 15, en el que la enfermedad de cáncer se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cérvix, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

17. Composición de vacuna que comprende un péptido inmunogénicamente activo aislado derivado de Bcl-2 según la reivindicación 1-16, o un ácido nucleico que codifica para dicho péptido, en la que dicho péptido es un péptido restringido a CMH de clase I que tiene al menos una de las siguientes características;

(i): puede unirse a la molécula de HLA de clase I a la que está restringido a una afinidad tal como se mide mediante la cantidad del péptido que puede realizar la mitad de la recuperación máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo de 50 \muM tal como se determina mediante el ensayo de unión-ensamblaje tal como se describe en el presente documento,

(ii): puede provocar células productoras de INF-\gamma en una población de PBL de un paciente con cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL tal como se determina mediante un ensayo ELISPOT, y/o

(iii): puede realizar la detección in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido de epítopo,

para su uso como medicamento.

18. Composición de vacuna según la reivindicación 17, en la que la vacuna provoca la producción en un paciente vacunado de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico frente a las células cancerosas.

19. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17-18, en la que la composición comprende un adyuvante.

20. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17-19, que comprende un péptido que está restringido a una molécula HLA-A del CMH de clase I en combinación con un péptido que está restringido a una molécula HLA-B del CMH de clase I.

21. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17-20, que comprende además un péptido o proteína inmunogénico seleccionado de survivina, ML-IAP o TRAG-3 o péptidos derivados de los mismos.

22. Composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 19-21, en la que el adyuvante se selecciona del grupo que consiste en adyuvantes a base de ADN bacteriano, adyuvantes a base de aceite/tensioactivo, adyuvantes a base de ARN bicatenario viral e imidazoquinolinas.

23. Kit de partes que comprende la composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17 a 22 y un agente antineoplásico adicional.

24. Kit de partes según la reivindicación 23, en el que el agente antineoplásico es un anticuerpo.

25. Kit de partes según la reivindicación 23, en el que el agente antineoplásico es una citocina.

26. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, en una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente con cáncer de células T en PBL o en tejido tumoral que son reactivas con Bcl-2.

27. Uso del péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, o la composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17-22, en la fabricación de un medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad de cáncer.

28. Uso según 27, en el que la enfermedad que va a tratarse es una enfermedad de cáncer en la que se expresa un miembro de la familia de proteínas Bcl-2.

29. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 28, en el que la enfermedad de cáncer se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cérvix, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

30. Uso según cualquiera de las reivindicaciones 27-29, que se combina con un tratamiento contra el cáncer adicional.

31. Uso según 30, en el que el tratamiento adicional se selecciona del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimulantes, terapia génica, tratamiento con anticuerpos y tratamiento usando células dendríticas.

32. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17-22, para su uso como medicamento para el tratamiento o la prevención de una enfermedad de cáncer.

33. Medicamento según la reivindicación 32, en el que la enfermedad de cáncer se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cérvix, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

34. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-16, para su uso en un método para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente con cáncer de células T en PBL o en tejido tumoral que son reactivas con Bcl-2.

35. Péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-16 o composición de vacuna según cualquiera de las reivindicaciones 17-22, para su uso en un método para el tratamiento o la prevención de una enfermedad de cáncer.

36. Péptidos o composición de vacuna según la reivindicación 35, siendo la enfermedad de cáncer un cáncer en el que se expresa un miembro de la familia de proteínas Bcl-2.

37. Péptidos o composición de vacuna según la reivindicación 35, en el que la enfermedad de cáncer se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético, incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer de cérvix, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

38. Péptidos o composición de vacuna según la reivindicación 35, combinándose en el tratamiento con un tratamiento contra el cáncer adicional.

39. Péptidos o composición de vacuna según la reivindicación 38, en el que el tratamiento adicional se selecciona del grupo que consiste en quimioterapia, radioterapia, tratamiento con sustancias inmunoestimulantes, terapia génica, tratamiento con anticuerpos y tratamiento usando células dendríticas.