ES2633389T3 - Péptidos derivados de survivina y uso de los mismos - Google Patents

Abstract

Un péptido epítopo restringido a CMH de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epítopo la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes características: (i) es capaz de unirse a la molécula de HLA de clase I con una afinidad medida por la cantidad del péptido que es capaz de tener la mitad de la recuperación máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C50) que es como máximo de 50 μM como se determina mediante ensayo de estabilización de HLA, (ii) es capaz de inducir células productoras de IFN-γ en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL como se determina mediante un ensayo ELISPOT, y/o (iii) es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido epítopo, para su uso como un medicamento.

Description

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DESCRIPCION

Peptidos derivados de survivina y uso de los mismos Campo de la invencion

La presente invencion se refiere a un peptido epftopo restringido a CMH de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epftopo la secuencia FTELTLGEF (como se especifica en SEQ ID NO:36) y a su uso en medicina y en particular en cancer. En particular, los nuevos peptidos son epftopos de celulas T restringidos a CMH de clase I que son capaces de provocar respuestas de celulas T citotoxicas en pacientes de cancer, incluyendo respuestas in situ y ex vivo. Espedficamente, tales peptidos nuevos se derivan de la protema inhibidora de la apoptosis survivina, un antigeno asociado a tumor (TAA) reconocido.

Antecedentes tecnicos y tecnica anterior

El proceso mediante el cual el sistema inmune de mairftferos reconoce y reacciona a los materiales extranos o ajenos es complejo. Una faceta importante del sistema es la respuesta de celulas T. Esta respuesta requiere que las celulas T reconozcan e interaccionen con complejos de moleculas de la superficie celular denominados antigenos leucocitarios humanos (HLA), que constituyen el complejo mayor de histocompatibilidad (CMH) humano, y peptidos. Los peptidos derivan de moleculas mas grandes, que son procesadas por las celulas, que tambien presentan la molecula de HLA/CMH. La interaccion de las celulas T y complejos HLA/peptido esta restringida, requiriendo una celula T que sea espedfica para una combinacion particular de una molecula de HLA y un peptido. Si no esta presente una celula T espedfica, no hay respuesta de celulas T, incluso si esta presente su complejo asociado. De una manera similar, no hay respuesta si el complejo espedfico esta ausente, pero la celula T esta presente.

El mecanismo mediante el cual las celulas T reconocen las anormalidades celulares tambien se ha implicado en cancer. Por ejemplo, en el documento WO 92/20356, se da a conocer una familia de genes que se procesan a peptidos, que a su vez se expresan en las superficies celulares, y pueden producir lisis de las celulas tumorales por CTL espedficos. Estos genes se denominan la familia MAGE, y se dice que codifican para “precursores de antfgeno de rechazo tumoral” o moleculas “TRAP”, y los peptidos derivados de los mismos se denominan “antigenos de rechazo tumoral” o moleculas “TRA”.

En el documento WO 94/05304, se dan a conocer nonapeptidos que se unen a la molecula de HLA-A1. La referencia da a conocer que dada la especificidad conocida de peptidos particulares para moleculas de HLA particulares, se debe esperar que un peptido particular se una a una molecula de HLA, pero no a otras. Esto es significativo, porque diferentes individuos poseen diferentes fenotipos de HLA. Como resultado, aunque la identificacion de un peptido particular como que es un asociado para una molecula de HLA espedfica tiene ramificaciones diagnosticas y terapeuticas, estas solamente son pertinentes para los individuos con ese fenotipo de HLA particular.

Se han caracterizado varios peptidos presentados por las moleculas de CMH, y se ha encontrado que algunos de estos pueden llevar modificaciones postraduccionales que posiblemente tengan un impacto sobre la funcionalidad del complejo HLA-peptido. De esta manera, un numero de estudios han asociado las alteraciones en el patron de fosforilacion con la transformacion maligna. Ademas, se ha mostrado que la fosforilacion podna tener un efecto neutro, negativo, o incluso positivo, sobre la union del peptido al CMH de clase I, y que se podnan generar CTL espedficos de fosfopeptido, que discriminanan entre las versiones fosforilada y no fosforilada del peptido, mostrando que tales CTL lo mas probablemente sean parte del repertorio de cTl restringidos a cMh de clase I. Recientemente, se ha mostrado que los peptidos fosforilados realmente son procesados de una forma natural y presentados por las moleculas de CMH de clase I in vivo. Adicionalmente, se ha establecido la presencia de peptidos fosforilados en extractos de moleculas de clase I aisladas de varias celulas B transformadas por diferentes EBV.

De esta manera, esta bien establecido que los epftopos peptfdicos derivados de antfgenos asociados a tumor (TAA) pueden ser reconocidos como antfgenos por los linfocitos T citotoxicos (CTL) en el contexto de las moleculas de CMH (1). Sin embargo, aunque en general se acepta que la mayona de, si no todos, los tumores son antigenicos, solamente unos cuantos son en realidad inmunogenicos en el sentido de que la evolucion del tumor la controla facilmente el sistema inmune.

Para superar esta limitacion, se han iniciado varios ensayos inmunoterapeuticos, por ejemplo vacunaciones con peptidos derivados de TAA. Para melanoma, el tumor para el que se ha caracterizado el mayor numero de TAA definidos por CTL, se han inducido poderosas respuestas de CTL contra los antfgenos mediante vacunacion y algunos pacientes experimentaron una remision completa de su enfermedad (2,3). Sin embargo, la mayona de los epftopos peptfdicos utilizados en estos ensayos de vacunacion son espedficos del melanocito, y estos peptidos no se pueden aplicar para tumores de origen no melanodtico. Ademas, la expresion de estos TAA es heterogenea entre tumores de diferentes pacientes, e incluso puede variar entre las metastasis obtenidas de un paciente. Sin embargo, durante el ultimo par de anos, se han identificado un numero de antfgenos peptfdicos espedficos de tumores, que se expresan en un numero de canceres diferentes, es decir, HER-2 (4), Muc-1 (5) y telomerasa (6).

Tambien se ha mostrado que mediante la manipulacion apropiada los antfgenos tumorales presentes en los tumores se pueden exponer al sistema inmune. Hay estudios que han mostrado que el brazo CTL CD8+ de la respuesta

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inmune, solo o en combinacion con celulas Th CD4+, constituye el brazo efector anti-tumoral primario de la respuesta immune adaptativa. Hasta ahora, el enfoque ha estado principalmente sobre el brazo CTL de la respuesta inmune. Sin embargo, cada vez esta mas claro que la respuesta de celulas T CD4 desempena un papel esencial en el rechazo del tumor, en especial en la fase de induccion o en la extension de una respuesta de CTL in vivo. Por consiguiente, la incorporacion de antigenos tumorales restringidos a la clase II en protocolos de vacunacion de tumores eficaces, podna aumentar la eficacia de las vacunas.

La apoptosis es un programa genetico de suicidio celular, y se ha sugerido que la inhibicion de la apoptosis es un mecanismo importante involucrado en la formacion de cancer mediante la extension del lapso de vida de las celulas, que favorece la acumulacion de mutaciones transformantes (7). La survivina es un miembro recientemente identificado de la familia de inhibidores de las protemas de apoptosis (IAP). En un analisis de expresion genetica global de aproximadamente 4 millones de transcritos, se identifico la survivina como uno de los genes principales invariablemente aumentados en muchos tipos de cancer, pero no en tejido normal (8). Los tumores malignos solidos que sobreexpresan survivina incluyen cancer de pulmon, colon, mama, pancreas y prostata, asf como tumores malignos hematopoyeticos (9). Adicionalmente, se han descrito series de melanomas y canceres de piel no melanoma como invariablemente positivos para survivina (10, 11). La sobreexpresion de survivina en la mayona de los canceres humanos sugiere un papel general de inhibicion de la apoptosis en la evolucion del tumor, una nocion sustanciada por la observacion de que en el caso del cancer colorrectal y de vejiga, asf como en neuroblastoma, la expresion de survivina estaba asociada con un pronostico desfavorable. Por el contrario, la survivina es indetectable en tejidos adultos normales. Estas caractensticas califican a la survivina como un TAA adecuado tanto para fines diagnosticos como terapeuticos.

Por consiguiente, durante la ultima decada se han identificado un gran numero de TAA que son reconocidos por los CTL de una forma restringida al complejo mayor de histocompatibilidad (CMH). Debido a que la survivina se sobreexpresa en la mayona de los canceres humanos y la inhibicion de su funcion produce un aumento de la apoptosis, esta protema puede servir como una diana para las respuestas terapeuticas de CTL. La protema survivina y el potencial uso diagnostico y terapeutico de la misma se dan a conocer en (8) y en el documento US 6.245.523. La survivina es una protema citoplasmica de 16,5 kDa que contiene un unico BIR y una region carboxi-terminal enrollada altamente cargada en lugar de un dedo RING, que inhibe la apoptosis inducida por la retirada de factor de crecimiento (IL-3) cuando se transfiere a precursores de celulas B. El gen que codifica la survivina es casi identico a la secuencia del receptor de proteasa de celulas efectoras-1 (EPR-1), pero esta orientado en la direccion opuesta, lo que sugiere de esta manera la existencia de dos genes separados duplicados en una configuracion cabeza con cabeza. Segun esto, la survivina se puede describir como un producto anti-sentido de EPR-1. Funcionalmente, la inhibicion de la expresion de survivina mediante el aumento de su transcrito anti-sentido natural EPR-1, produce apoptosis masiva y crecimiento celular reducido.

El documento US 6.245.523 da a conocer el aislamiento de la survivina purificada y proporciona moleculas de acidos nucleicos que codifican la protema survivina, y anticuerpos y otras moleculas que se unen a survivina. El documento US 6.245.523 tambien da a conocer fragmentos anti-apoptoticamente activos de la protema survivina y variantes de los mismos en donde se ha insertado un residuo de aminoacido N- o C-terminal a, o dentro de, la secuencia de survivina divulgada. Se da a conocer espedficamente que tales peptidos deben contener residuos funcionales claves para la apoptosis, es decir, Trp en la posicion 67, Pro en la posicion 73 y Cys en la posicion 84.

Andersen et al. CANCER RESEARCH, Vol. 61, no. 3 (2001) 869-872 divulgan peptidos de survivina espedficos de HLA-A2: Sur1-Sur10, Sur1L2 y Sur1M2. Andersen et al. tambien divulgan respuestas de CTL espedficas contra dichos peptidos, valores de afinidad para la union de dichos peptidos a moleculas de HLA de clase I y sugiere el uso de los peptidos en vacunacion, terapia contra el cancer y diagnostico de cancer.

Andersen et al. CANCER RESEARCH, Vol. 61, no. 16 (2001) 5964-68 divulgan peptidos de survivina que se unen a HLA: Sur1 (LTLGEFLKL), Sur9 (ELTLGEFLKL) y Sur1M2 y la generacion de respuestas de CTL por dichos peptidos. El documento tambien divulga complejos CMH de clase I/peptidos que se multimerizaron, y su uso en la deteccion de celulas reactivas a survivina en tejido tumoral. Andersen y col. sugieren usos de tales peptidos de survivina para vacunas anticancer basadas en peptidos en combinacion con terapia convencional contra el cancer.

Schmitz et al. CANCER RESEARCH, Vol. 60, no. 17 (2000) 4845-49 divulga el peptido de union a HLA ELTLGEFLKL. El artmulo demuestra la generacion de respuestas de CTL por dicho peptido y sugiere el uso del peptido en vacunas anticancer.

Hirohashi et al. CLINICAL CANCER RESEARCH: AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, Vol. 8, no. 6 (2002) 1731-39 divulga un epftopo CTL restringido a HLA-A24 de survivina-2B (variante de ayuste encontrada en tumores). El artmulo tambien divulga otros peptidos de survivina, por ejemplo, AFLSVKKQF y QFEELTLGEF.

Fortugno et al. JOURNAL OF CELL SCIENCE, Vol. 115, no. 3 (2002) 575-85 divulga anticuerpos policlonales contra epftopos de survivina Ala3-Ile19, Met38-Thr48, Pro47-Phe58 y Cys57-Trp67.

La presente invencion se basa en el descubrimiento de que se pueden derivar peptidos restringidos a CMH de clase I de la protema survivina, que son capaces de unirse a las moleculas de HLA de CMH de clase I y de esta

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manera provocar respuestas inmunes de CTL tanto ex vivo como in situ en los pacientes que padecen una amplia variedad de enfermedades cancerosas. Estos hallazgos sugieren fuertemente que la survivina actua como una molecula TRAP, que es procesada por las celulas a peptidos que tienen funcionalidad TRA. Evidentemente, estos hallazgos abren el camino para planteamientos terapeuticos y diagnosticos nuevos que, debido al hecho de que la survivina parece estar expresada universalmente por las celulas tumorales, en general son aplicables en el control de enfermedades cancerosas.

Sumario de la invencion

Segun esto, la invencion se refiere en un primer aspecto a un peptido epftopo restringido a CMH de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epftopo la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes caractensticas:

(i) es capaz de unirse a la molecula de HLA de clase I con una afinidad medida por la cantidad del peptido que es capaz de tener una recuperacion semi-maxima de la molecula de HLA de clase I (valor C50) que es como maximo de 50 |iM, como se determina mediante un ensayo de estabilizacion de HLA (ensayo de union de ensamblaje como se describe en el presente documento),

(ii) es capaz de inducir celulas productoras de IFN-y en una poblacion dePBL de un paciente de cancer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL como se determina mediante un ensayo ELISPOT, y/o

(iii) es capaz de deteccion in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el peptido epftopo. para su uso como un medicamento.

Preferiblemente, el peptido de la invencion tiene al menos dos, lo mas preferiblemente estas tres caractensticas.

Un aspecto importante de la invencion se refiere al uso de los peptidos de la invencion para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de cancer. Un aspecto adicional se refiere al uso de la composicion o la molecula tal como se menciono anteriormente para la preparacion de un medicamento para el tratamiento de cancer.

Descripcion detallada de la invencion

El nuevo peptido epftopo restringido a CMH de clase I derivado de survivina de la invencion es un peptido que se caracteriza por tener la secuencia FTELTLGEF y al menos una de las siguientes caractensticas, una de las cuales es la capacidad para unirse a la molecula de HLA de clase I a la cual esta restringido con una afinidad, que cuando se mide por la cantidad de peptido que es capaz de una recuperacion semi-maxima de la molecula de HLA de clase I (valor C50) en un ensayo de estabilizacion (ensayo de ensamblaje) como se describe en el presente documento, es como maximo de 50 |iM. Este ensayo de ensamblaje se lleva a cabo como se ha descrito previamente (12, 13), y se basa en la estabilizacion de la molecula de HLA despues de cargar el peptido en la lrnea celular deficiente en transportador de peptidos T2. Posteriormente, se inmunoprecipitan las cadenas pesadas de HLA estables correctamente plegadas utilizando anticuerpos dependientes de la conformacion, y se cuantifica la union del peptido.

Este ensayo proporciona un medio sencillo para cribar peptidos candidatos por su capacidad para unirse a una molecula determinada de un alelo de HLA con la afinidad anterior. En formas de realizacion preferidas, el peptido de la invencion es uno que tiene un valor C50, que es como maximo de 30 |iM, tal como un valor C50, que es como maximo de 20 |iM incluyendo valores de C50 de como maximo 10 |iM, como maximo 5 |iM y como maximo 2 |iM.

Como se menciono anteriormente, el sistema de HLA representa el sistema mayor de histocompatibilidad (CMH) humano. En general, los sistemas de CMH controlan una gama de caractensticas: antfgenos de trasplante, respuestas inmunes dependientes del timo, ciertos factores del complemento y predisposicion para ciertas enfermedades. Mas espedficamente, el CMH codifica tres tipos diferentes de moleculas, es decir, moleculas de clase I, II y III, que determinan las caractensticas mas generales del CMH. De estas moleculas, las moleculas de clase I se denominan moleculas de HLA-A, HLA-B y HLA-C que se presentan en la superficie de la mayona de las celulas nucleadas y de los trombocitos.

Los peptidos de la presente divulgacion se caracterizan por su capacidad para unirse a (estar restringidos a) una molecula de HLA de CMH de clase I particular. Por tanto, en una realizacion, el peptido es uno que esta restringido a una molecula de HLA-A de CMH de clase I que incluye HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A10, HLA-A11, HLA-Aw19, HLA-A23(9), HLA-A24(9), HLAA25(10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA-A29(w19), HLA-A30(w19), HLA- A31(w19), HLA-A32(w19), HLA-Aw33(w19), HLA-Aw34(10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66(10), HLA-Aw68(28), HLA-A69(28). Se usan tambien designaciones mas sencillas a lo largo de toda la bibliograffa, donde solo se usa la designacion numerica primaria, por ejemplo HLA-A19 o HLA-A24 en lugar de HLA-Aw19 y HLA-A24(9), respectivamente. En realizaciones espedficas, el peptido de la invencion esta restringido a especies de HLA de CMH de clase I seleccionadas del grupo que consiste en HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A11 y hLa-A24.

Los peptidos de la invencion se derivan de la secuencia conocida de survivina, por ejemplo la secuencia dada a conocer en el documento US 6.245.523. La seleccion de peptidos que tienen potencialmente la capacidad de unirse

a una molecula de HLA particular puede hacerse mediante la alineacion de secuencias conocidas que se unen a una molecula de HLA particular dada para revelar de ese modo la predominancia de algunos aminoacidos relacionados en posiciones particulares en los peptidos. Tales residuos de aminoacido predominantes se denominan tambien en el presente documento “residuos de anclaje” o “motivos de residuos de anclaje”. Siguiendo un procedimiento 5 relativamente sencillo de este tipo basado en datos de secuencia conocidos que pueden encontrarse en bases de datos accesibles, pueden derivarse peptidos de la molecula de protema survivina que es probable que se unan a la molecula de HLA particular. En la tabla a continuacion se proporcionan ejemplos representativos de tales analisis para una gama de moleculas de HLA:

Alelo de HLA

Posicion 1 Posicion 2 Posicion 3 Posicion 5 Posicion 6 Posicion 7 C-terminal

HLA-A1

T,S D,E L Y

HLA-A2

L, M V L,V

HLA-A3

L,V,M F,Y K, Y, F

HLA-A11

V, I, F,Y M,L,F,Y,I K, R

HLA-A23

I,Y W,I

HLA-A24

Y I,V F I,L,F

HLA-A25

M,A,T I W

HLA-A26

E,D V,T,I,L,F I,L,V Y,F

HLA-A28

E,D V,A,L A,R

HLA-A29

E Y,L

HLA-A30

Y,L,F,V Y

HLA-A31

L,M,F,Y R

HLA-A32

I,L W

HLA-A33

Y,I,L,V R

HLA-A34

V,L R

HLA-A66

E,D T,V R,K

HLA-A68

E,D T,V R,K

HLA-A69

V,T,A V,L

HLA-A74

T V,L

HLA-B5

A,P F,Y I,L

HLA-B7

P L,F

HLA-B8

K K,R L

HLA-B14

R,K L,V

HLA-B15

Q,L,K,P,H, F,Y,W

(B62)

V,I,M,S,T

HLA-B17

L,V

HLA-B27

R Y,K,F,L

HLA-B35

P I, L, M, Y

HLA-B37

D,E I,L,M

HLA-B38

H D,E F,L

HLA-B39

R,H L,F

HLA-B40

E F,I,V L,V,A,W,M,

(B60,61)

T,R

HLA-B42

L,P Y,L

HLA-B44

E F,Y,W

HLA-B46

M,I,L,V Y,F

HLA-B48

Q,K L

HLA-B51

A,P,G F,Y,I,V

HLA-B52

Q F,Y I,V

HLA-B53

P W,F,L

HLA-B54

P

HLA-B55

P A,V

HLA-B56

P A,V

HLA-B57

A,T,S F,W,Y

HLA-B58

A,T,S F,W,Y

HLA-B67

P L

HLA-B73

R P

HLA-Cw1

A,L L

HLA-Cw2

A,L F,Y

HLA-Cw3

A,L L,M

HLA-Cw4

Y,P,F L,M,F,Y

HLA-Cw6

Y L,Y,F,Y

HLA-Cw8

Y L,I,

HLA-Cw16

A,L L,V

Por tanto, como ejemplo, nonapeptidos que tienen potencialmente la capacidad de unirse a HLA-A1 tendnan una de

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las siguientes secuencias: Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y, Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y; Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa- L-Xaa-Y o Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y (indicando Xaa cualquier residuo de aminoacido). De una manera similar, pueden disenarse secuencias que tienen potencialmente la capacidad de unirse a cualquier otra molecula de HLA.

Se apreciara que el experto habitual en la tecnica sera capaz de identificar “motivos de residuos de anclaje” adicionales para una molecula de HLA dada.

Por tanto, los peptidos de la presente descripcion incluyen peptidos, cuyas secuencias comprenden, para cada uno de los alelos de HLA espedficos enumerados en la tabla, cualquiera de los residuos de aminoacido tal como se indica en la tabla..

De esta manera, un planteamiento sencillo para identificar los peptidos de la invencion incluye los siguientes pasos: seleccionar una molecula de HLA particular, por ejemplo una que se da con un alto mdice en una poblacion determinada, llevar a cabo un analisis de alineamiento como se describe anteriormente para identificar los “motivos de residuos de anclaje” en la protema survivina, aislar o construir peptidos de un tamano adecuado que comprendan uno o mas de los residuos de anclaje identificados, y probar los peptidos resultantes para determinar (i) su capacidad para unirse a la molecula de HLA particular utilizando el ensayo de ensamblaje descrito en el presente documento, (ii) la capacidad de los peptidos para inducir celulas productoras de IFN-y en una poblacion de PBL de un paciente de cancer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT como se describe en el presente documento, y/o (iii) la capacidad de los peptidos para detectar in situ en un tejido tumoral los CTL que reaccionan con los peptidos epftopos que se estan probando.

El peptido de la invencion es un epttopo restringido a CMH de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epttopo una secuencia segun survivinag3-ioi (Sur93T2 (una E cambiada por una T en P2, FTELTLGEF (SEQ ID NO:36)).

Preferiblemente, el peptido de la invencion comprende menos de 50 residuos de aminoacido, y mas preferiblemente comprende como maximo 20 residuos de aminoacidos, tal como como maximo 10 residuos de aminoacido. En realizaciones espedficas, el peptido es un heptapeptido, un octopeptido, un nonapeptido, un decapeptido o un undecapeptido.

El peptido de la invencion, como se menciono anteriormente, deriva de una protema survivina o de un fragmento de la misma. La protema survivina de la que puede derivar el peptido, es la protema survivina de cualquier especie animal en la se expresa la protema. En formas de realizacion preferidas, la protema de partida survivina es de una especie de mairnfero incluyendo una especie de roedor, conejo, y una especie de primate, tal como seres humanos. Basandose en la secuencia de la protema survivina seleccionada, el peptido de la invencion se deriva mediante cualquier tratamiento qmmico o enzimatico apropiado del material de partida de survivina que produzca un peptido de un tamano adecuado como se indica anteriormente, o se puede sintetizar mediante cualquier procedimiento convencional de smtesis de peptidos con los que este familiarizado el experto en la materia.

Ademas, puede ser ventajoso llevar a cabo modificaciones postraduccionales de los peptidos de la invencion. Se ha mostrado que la exposicion de celulas MCF-7 de carcinoma de mama o celulas HeLa de carcinoma cervical a agentes anticancengenos incluyendo adriamicina, taxol o UVB dio como resultado un aumento de 4-5 veces de la expresion de survivina. Los cambios en los niveles de survivina tras el tratamiento anticancengeno no implicaron la modulacion de la expresion de ARNm de survivina y fueron independientes de la transcripcion genica de novo. A la inversa, la inhibicion de la fosforilacion de survivina en Thr34 mediante el inhibidor de cinasa dependiente de ciclina flavopiridol dio como resultado una perdida de expresion de survivina, y survivina Thr34^Ala no fosforilable presentaba un aclaramiento acelerado en comparacion con survivina silvestre. La supresion secuencial de la fosforilacion de survivina en Thr34 potencio la apoptosis de celulas tumorales inducida por agentes anticancengenos independientemente de p53 y suprimio el crecimiento tumoral sin toxicidad en un modelo de xenoinjerto de cancer de mama in vivo. Estos datos sugieren que la fosforilacion de Thr34 regula de manera cntica los niveles de survivina en celulas tumorales y que la supresion secuencial de la actividad cinasa de p34cdc2 puede eliminar el punto de control de viabilidad de la survivina y potenciar la apoptosis en celulas tumorales.

Por consiguiente, se contempla que los peptidos derivados de survivina de la invencion abarcan peptidos fosforilados. Pueden identificarse antfgenos de fosfopeptidos de survivina nativos explorando la presencia de motivos de union a peptido de CMH alrededor del sitio de fosforilacion Thr34. Por tanto, las posibles secuencias de fosfopeptidos derivados de survivina dadas a conocer en el presente documento incluyen TPERMAEAGF, un supuesto antfgeno de peptido restringido a HLA-B35 y/o HLA-B7 y/o HLA-B51. Los fosfopeptidos nativos adicionales dados a conocer en el presente documento incluyen: HLA-A2: CACTPERMA y CTPERMAEA; HLA-A3: FLEGCACTP; HLA-B7/HLA-B35/HLA-B51: WPFLEGCACT (residuo de Thr fosforilado marcado en negrita).

Una caractenstica significativa del peptido de la invencion es su capacidad para reconocer o inducir celulas T respondedoras productoras de IFN-y, es decir, celulas T citotoxicas (CTL) que reconocen de una manera espedfica el peptido particular en una poblacion de PBL o celulas tumorales de un paciente de cancer (celulas diana). Esta actividad se determina facilmente sometiendo los PBL o celulas tumorales de un paciente a un ensayo ELISPOT como se describe en la referencia (16) y en los ejemplos siguientes. Antes del ensayo, puede ser conveniente estimular la poblacion de PBL o las celulas tumorales que se vayan a ensayar poniendo en contacto las celulas con

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el peptido que se va a probar. Preferiblemente, el peptido es capaz de inducir o reconocer celulas T productoras de IFN-y a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL como se determina mediante un ensayo ELISPOT como se utiliza en el presente documento. Mas preferiblemente la frecuencia es de al menos 5 por 104 PBL, lo mas preferiblemente al menos 10 por 104 PBL, tal como al menos 50 o 100 por 104 PBL.

El ensayo ELISPOT representa una herramienta consistente para seguir las respuestas de celulas T espedficas del peptido de survivina. Sin embargo, aunque se ha demostrado que la reactividad de ELISPOT en la mayona de los casos se correlaciona con la capacidad de los CLL para lisar celulas diana, la evidencia conclusiva para esta nocion solamente se puede dar de una manera directa. Tal evidencia directa se proporciona en el presente documento, ya que se demostro (vease el ejemplo 2) que las celulas que reaccionan con survivina aisladas por medio de complejos HLA/peptido poseen la capacidad funcional para lisar celulas diana. Ademas, se demostro que los CTL aislados que reconocen espedficamente un peptido de la invencion, eran capaces de lisar las celulas tumorales con HLA coincidente de diferente origen, por ejemplo melanomas y cancer de mama. Este descubrimiento sugiere fuertemente que las celulas cancerosas en general procesan y presentan el mismo peptido de survivina endogeno. Por consiguiente, una implicacion principal de los descubrimientos del presente documento es que los peptidos de la invencion se expresan y forman complejos con las moleculas de HLA en una variedad de celulas cancerosas de diferentes ongenes histologicos. Esto hace que estas celulas de cancer sean susceptibles a la destruccion por los CTL y enfatiza la utilidad potencial de la inmunizacion con survivina para controlar el crecimiento de diferentes neoplasias. La presencia de respuestas espontaneas de CTL en PBL y celulas tumorales a epftopos pepftdicos derivados de survivina restringidos a HLA de los pacientes que padecen tres tipos de cancer no relacionados, es decir, cancer de mama, melanoma y LLC, sustancia ademas el potencial inmunoterapeutico universal de este anftgeno tumoral.

Segun esto, en otra forma de realizacion preferida el peptido de la invencion es capaz de inducir celulas productoras de IFN-y en una poblacion de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa la survivina incluyendo un tumor maligno hematopoyetico, incluyendo leucemia linfatica cronica y leucemia mieloide cronica, melanoma, cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de pancreas, y cancer de prostata. De una manera espedfica, el peptido de la invencion es capaz de provocar una respuesta inmune en forma de celulas T que tienen un efecto citotoxico contra las celulas que expresan survivina de una lmea celular de cancer, incluyendo una lmea celular seleccionada de la lmea celular de cancer de mama MCF-7 y la lmea celular de melanoma fM3.

Ademas de su capacidad para provocar respuestas inmunes en poblaciones de PBL y en lmeas celulares de cancer, se demostro que los peptidos de la invencion tambien son capaces de provocar respuestas inmunes citolfticas in situ, es decir, en tejidos tumorales solidos. Esto se demostro al suministrar complejos HLA-peptido, por ejemplo, que se multimerizan y que estan provistos de un marcador detectable, y utilizando estos complejos para tinciones inmunohistoqmmicas para detectar en un tejido tumoral CTL que reaccionan con el peptido epftopo de la invencion. Segun esto, una caractenstica significativa adicional del peptido de la invencion es que es capaz de detectar in situ en un tejido tumoral los CTL que son reactivos con el peptido epftopo.

Se contempla que los peptidos de la invencion, ademas de su capacidad para unirse a moleculas de HLA que produce la presentacion de complejos de HLA y peptidos en las superficies celulares, complejos que a su vez actuan como epftopos o dianas para celulas T citolfticas, pueden provocar otros tipos de respuestas inmunes, tales como respuestas de celulas B que den como resultado la produccion de anticuerpos contra los complejos y/o una reaccion de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH). El ultimo tipo de respuesta inmune se define como un enrojecimiento y endurecimiento palpable en el sitio de la inyeccion del peptido de la invencion.

Se sabe bien que las diferentes moleculas de HLA son de una prevalencia diferente en las poblaciones humanas principales. Segun esto, existe un requerimiento para identificar los epftopos pepftdicos restringidos a varias moleculas de HLA de clase I para extender la cohorte de pacientes que se puedan tratar segun los metodos de la presente invencion. La caracterizacion de multiples epftopos de survivina con diferentes elementos de restriccion de HLA ampfta el potencial clmico de este anftgeno diana de dos maneras importantes: (i) aumenta el numero de pacientes elegibles para inmunoterapia basada en los peptidos derivados de survivina. El anftgeno HLA-A2 se expresa en alrededor del 50 % de las poblaciones blanca y asiatica, los anftgenos HLA-A1 y HLA-A3 se expresan ambos en alrededor del 25 % de blancos y el 5 % de asiaticos, mientras que el anftgeno HLA-A11 se expresa en alrededor del 15 % de blancos y el 30 % de asiaticos. Aun cuando estos numeros no se puedan sumar debido a la coexpresion, una combinacion de peptidos restringidos por una multiplicidad de estos ciertamente abarcana a la mayona de los pacientes de cancer, (ii) el direccionamiento colectivo de varios elementos de restriccion en cada paciente probablemente reduzca el riesgo del escape inmune por la perdida del alelo de HLA. La perdida de un solo alelo de HLA es un componente significativo de las alteraciones del CMH descritas para las celulas cancerosas, mientras que la perdida total de la expresion de la clase I es un suceso bastante infrecuente. Por consiguiente, con la identificacion de los epftopos de survivina restringidos a diferentes alelos de HLA, ahora es posible atacar mas de una molecula de HLA simultaneamente en pacientes con solapamiento alelico.

Segun esto, basado en la divulgacion de la presente invencion, el experto en la materia sena capaz de desarrollar vacunas multiepftopo muy inmunogenicas. Preferiblemente, tales vacunas se deben disenar para facilitar una administracion simultanea de los peptidos derivados de survivina mas adecuados opcionalmente en combinacion

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con otros peptidos y/o adyuvantes adecuados como se describen posteriormente en el presente documento.

Ademas, como se ha descrito anteriormente, ha habido un enfoque aumentado sobre la provocacion de la inmunidad de celulas T auxiliares espedficas de tumor, es decir, vacunar con epftopos restringidos a CMH de clase II a pesar del hecho de que los tumores en general no expresan CMH de clase II. Esto se basa en el descubrimiento reciente de que la induccion y la eficacia de la respuesta antitumoral inducida por vacunas en muchos casos requieren la cooperacion de celulas Th CD4 positivas espedficas de tumor. Por tanto, un factor importante que impulsa el desarrollo de vacunas que tengan una composicion mas compleja es el deseo de atacar multiples antigenos tumorales, por ejemplo mediante el diseno de vacunas que comprendan o codifiquen una coleccion de epftopos de celulas CTL y Th cuidadosamente seleccionados.

Obviamente, las vacunas multiepftopo constituyen una manera eficiente de inducir la inmunidad contra los epftopos derivados de varios antigenos diferentes sin la necesidad de introducir (genes que codifiquen) protemas potencialmente peligrosas, tales como oncoprotemas. Tales vacunas tambien permiten la induccion selectiva de inmunidad contra los epftopos de celulas T subdominantes y cnpticos, que pueden ser especialmente importantes en el caso de los autoantigenos asociados a tumor, para los que puede existir tolerancia para los epftopos que se presentan prominentemente en tejidos normales. Ademas, las celulas presentadoras de antigeno pueden fracasar al presentar ciertos epftopos que se expresan en celulas tumorales debido a diferencias funcionales entre los inmunoproteasomas de las celulas presentadoras de antigeno y los proteasomas 'constitutivos' presentes en la mayona de las celulas tumorales. En el caso de vacunas basadas en peptidos, tales epftopos se pueden administrar en una forma 'lista para CMH', que permite la presentacion a traves de una carga exogena independientemente de la captacion y el procesamiento del antigeno por las celulas presentadoras de antigeno del huesped.

El peptido, cuando se usa segun la invencion, puede estar tambien en una composicion que comprende dos o mas peptidos derivados de survivina, interaccionando cada uno espedficamente con una molecula de HLA diferente para cubrir asf una gran proporcion de la poblacion diana, Por consiguiente, como ejemplos, la composicion farmaceutica puede contener una combinacion de un peptido restringido a una molecula de HLA-A y un peptido restringido a una molecula de HLA-B, por ejemplo, incluyendo aquellas moleculas de HLA-A y HLA-B que se corresponden con la prevalencia de fenotipos de HLA en la poblacion diana, tales como HLA-A2 y HLA-B35. Adicionalmente, la composicion puede comprender un peptido restringido a una molecula de HLA-C.

Por consiguiente, en un aspecto adicional, la presente invencion proporciona una composicion farmaceutica que comprende uno o mas de los peptidos de la invencion solos o en combinacion adecuada con otras protemas o fragmentos de peptido. En realizaciones espedficas, tales otras protemas o fragmentos de peptido incluyen pero no se limitan a protemas implicadas en la regulacion de la apoptosis celular o fragmentos de peptido de las mismas. Pueden seleccionarse ejemplos adecuados de tales protemas de la familia de protemas Bcl-2, por ejemplo, la protema Bcl-2, la protema Bcl-w, la protema Mcl-1, la protema Bcl-XL, y fragmentos de peptido derivados de cualquiera de las protemas. Otros inhibidores de la apoptosis conocidos incluyen miembros de la familia de protemas inhibidoras de la apoptosis (IAP) tales como X-IAP, C-IAP1 y C-IAP2, expresandose todas estas protemas de manera relativamente ubicua mientras que el polipeptido inhibidor de la apoptosis ML-IAP tiene una expresion bastante selectiva, y se detecta predominantemente en melanomas. Por tanto, pueden incluirse opcionalmente fragmentos de ML-IAP que pueden provocar una respuesta de celulas T espedfica, es decir una respuesta de celulas T citotoxicas o una respuesta de celulas T auxiliares en la composicion de la presente invencion. Los fragmentos de peptido utiles de ML-IAP incluyen ML-IAP245 (RLQEERTCKV) (SEQ ID NO:75), ML-IAP280 (QLCPICRAPV) (SEQ ID NO:76), ML-IAP90 (RLASFYDWPL) (SEQ ID NO:77), ML-IAP154 (LLRSKGRDFV) (SEQ ID NO:78), ML-IAP230 (VLEPPGARDV) (SEQ ID NO:79), MLIAP98 (PLTAEVPPEL) (SEQ ID NO:80), ML-IAP34 (SLGSPVLGL) (SEQ ID NO:81), ML-IAP54 (QILGQLRPL) (SEQ ID NO:82), ML-IAP99 (LTAEVPPEL) (SEQ ID NO:83), ML-IAP83 (GMGSEELRL) (SEQ ID NO:84) y ML-IAP200 (ELPTPRREV) (SEQ ID NO:85).

Adicionalmente, la composicion segun la presente invencion puede proporcionarse como una vacuna multiepitopica que comprende epftopo restringido a clase I y epftopos restringidos a clase II tal como se definio anteriormente en el presente documento.

Los ejemplos de vacunas multiepitopicas preferidas en el presente documento incluyen combinaciones “hechas a medida” de epftopos de peptidos derivados de survivina dependiendo del tipo de tejido del paciente dado, por ejemplo, un sujeto que porta los fenotipos HLA-A2, HLA-A3 y HLAB35 podna vacunarse con una vacuna que comprende sur1M2, sur9, sur18K10, sur46Y9, sur51Y9. Adicionalmente, la composicion farmaceutica de la invencion puede comprender ventajosamente al menos una protema inmunogenica adicional o fragmento de peptido de la misma seleccionado de una protema o fragmento de peptido que no pertenece a o se deriva de la protema survivina. En realizaciones espedficas, la protema inmunogenica o fragmento de peptido de la misma se deriva de la familia de protemas Bcl-2 tal como se describio anteriormente en el presente documento. Un peptido derivado de Bcl-2 inmunogenico adicional es un peptido restringido a HLA-A2 que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: Bcl-172, Bcl-180, Bcl208 y Bcl214

Como los peptidos de la invencion son moleculas relativamente pequenas se puede requerir en tales composiciones combinar los peptidos con varios materiales tales como adyuvantes, para producir vacunas, composiciones inmunogenicas, etc. Los adyuvantes, ampliamente definidos, son sustancias que fomentan las respuestas inmunes.

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Con frecuencia, el adyuvante de eleccion es un adyuvante completo o incompleto de Freund, u organismos muertos de B. pertussis, utilizados por ejemplo en combinacion con un antigeno precipitado en alumbre. Se proporciona un analisis general de los adyuvantes en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2a Edicion, 1986) en las paginas 61-63. Sin embargo, Goding observa que, cuando el antigeno de interes es de bajo peso molecular o es poco inmunogenico, se recomienda el acoplamiento con un soporte inmunogenico. Los ejemplos de tales moleculas soporte incluyen hemocianina de lapa californiana, seroalbumina bovina, ovoalbumina e inmunoglobulina de aves. Tambien se ha sugerido que diferentes extractos de saponina son utiles como adyuvantes en las composiciones inmunogenicas. Recientemente, se ha propuesto utilizar el factor estimulante de colonias de granulocitos- macrofagos (GM-CSF), una citoquina bien conocida, como un adyuvante (documento WO 97/28816).

Segun esto, la invencion abarca una composicion terapeutica que ademas comprende cualquier sustancia adyuvante incluyendo cualquiera de las anteriores o combinaciones de las mismas. Tambien se contempla que el antfgeno, es decir el peptido de la invencion y el adyuvante se puedan administrar por separado en cualquier secuencia apropiada.

La eleccion del antfgeno en la composicion farmaceutica de la invencion dependera de parametros que puede determinar el experto en la tecnica. Tal como se ha mencionado, cada uno de los diferentes peptidos de la invencion se presenta sobre las superficies celulares mediante una molecula de HLA particular. Como tal, si un sujeto que va a tratarse se tipifica con respecto al fenotipo de HLA, se selecciona(n) peptido/peptidos que se sabe que se une(n) a esa molecula de HLA particular.

Alternativamente, el antfgeno de interes se selecciona basandose en la prevalencia de los diversos fenotipos de HLA en una poblacion dada. Como ejemplo, HLA-A2 es el fenotipo mas prevalente en la poblacion caucasica, y por tanto, una composicion que contiene un peptido derivado de survivina que se une a HLA-A2 sera activo en una gran proporcion de esa poblacion. Sin embargo, la composicion de la invencion puede contener tambien una combinacion de dos o mas peptidos derivados de survivina, interaccionando cada uno espedficamente con una molecula de HLA diferente para cubrir una proporcion mayor de la poblacion objetivo. Por tanto, como ejemplos, la composicion farmaceutica puede contener una combinacion de un peptido restringido a una molecula de HLA-A y un peptido restringido a una molecula de HLA-B, por ejemplo incluyendo las moleculas de HLA-A y HLA-B que corresponden a la prevalencia de fenotipos de HLA en la poblacion objetivo, tal como por ejemplo HLA-A2 y HLA-B35. Adicionalmente, la composicion puede comprender un peptido restringido a una molecula de HLA-C.

Se contempla que las composiciones inmunogenicas utiles de las invenciones ademas de un peptido derivado de survivina tal como se define en el presente documento puedan comprender una cantidad inmunologicamente eficaz de la protema survivina como tal, tal como se define en el presente documento, o un fragmento inmunogenico de la misma.

La cantidad del peptido inmunogenico para su uso de acuerdo con la invencion en la composicion farmaceutica puede variar, dependiendo de la aplicacion particular. Sin embargo, una dosis individual del inmunogeno esta preferiblemente en cualquier zona desde aproximadamente 10 |ig hasta aproximadamente 5000 |ig, mas preferiblemente desde aproximadamente 50 |ig hasta aproximadamente 2500 |ig tal como de aproximadamente 100 |ig a aproximadamente 1000 |ig. Los modos de administracion incluyen la administracion intradermica, subcutanea e intravenosa, implantacion en forma de una formulacion de liberacion con el tiempo, etc. En el presente documento se abarcan cualquiera y todas las formas de administracion conocidas en la tecnica. Tambien se abarcan cualquiera y todas las formas de dosificacion convencionales que se conozcan en la tecnica como apropiadas para formular composiciones peptfdicas inmunogenicas inyectables, tales como formas liofilizadas y formas en solucion, suspension o emulsion que contengan, si se requiere, vehuculos convencionales farmaceuticamente aceptables, diluyentes, conservantes, adyuvantes, amortiguadores del pH, etc.

El efecto inmunoprotector de la composicion de la invencion se puede determinar empleando varios planteamientos. En los siguientes ejemplos se proporcionan ejemplos de los mismos. Un ejemplo adicional sobre como determinar una respuesta de CTL provocada por la composicion inmunogenica se proporciona en el documento WO 97/28816, supra. Tambien se puede determinar una respuesta inmune de exito por la presencia de reacciones de DTH despues de la inmunizacion y/o la deteccion de anticuerpos que reconozcan espedficamente el/los peptido(s) de la composicion de vacuna.

En realizaciones preferidas, la composicion farmaceutica de la invencion es una composicion inmunogenica o vacuna capaz de inducir una respuesta inmune a una enfermedad cancerosa. Como se utiliza en el presente documento, la expresion “composicion inmunogenica o vacuna” se refiere a una composicion que induce al menos un tipo de respuesta inmune dirigida contra las celulas cancerosas. Por consiguiente, tal respuesta inmune puede ser cualquiera de los tipos mencionados anteriormente: una respuesta de CTL donde se generan CTL que son capaces de reconocer el complejo HLA/peptido presentado en las superficies celulares que produce la lisis celular, es decir, la vacuna induce la produccion en el sujeto vacunado de celulas T efectoras que tienen un efecto citotoxico contra las celulas cancerosas; una respuesta de celulas B que da lugar a la produccion de anticuerpos anticancerosos; y/o una respuesta inmune de tipo DHT.

Se puede inducir una respuesta inmunogenica dirigida contra una enfermedad cancerosa mediante la administracion

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del peptido de la invencion ya sea mediante la carga de moleculas de CMH de clase I en celulas presentadoras de antigeno (CPA) del paciente, mediante el aislamiento de PBL del paciente e incubacion de las celulas con el peptido antes de inyectar las celulas de nuevo al paciente o mediante el aislamiento de CPA precursoras del paciente y la diferenciacion de las celulas a CPA profesionales utilizando citoquinas y antigeno antes de inyectar las celulas de nuevo al paciente. Por lo tanto, la presente descripcion da a conocer un metodo para tratar pacientes de cancer en el que el peptido se administra mediante la presentacion del peptido a celulas presentadoras de antigeno (CPA) del paciente ex vivo seguido por inyeccion de las CPA asf tratadas de nuevo al paciente. Existen al menos dos maneras alternativas de llevar esto a cabo. Una alternativa es aislar las CPA del paciente de cancer e incubar (cargar) las moleculas de CMH de clase I con el peptido. La carga de las moleculas de CMH de clase I significa incubar las CPA con el peptido de tal manera que las cPa con las moleculas de CMH de clase I espedficas para el peptido se uniran al peptido y por consiguiente seran capaces de presentarlo ante las celulas T. Posteriormente, las CPA se vuelven a inyectar en el paciente. Otra manera alternativa se apoya en los descubrimientos recientes hechos en el campo de la biologfa celular dendntica. En este caso, se afslan monocitos (que son precursores de celulas dendnticas) del paciente y se diferencian in vitro a CPA profesionales (o celulas dendnticas) mediante el uso de citoquinas y antigeno. Esto se describe en los ejemplos 3 y 5, donde se cultivan PBL adherentes (que son principalmente monocitos) in vitro, junto con GM-CSF, IL-4 y TNF-a. Posteriormente, se pulsan las CD generadas in vitro con el peptido y se inyectan en el paciente.

Debido al hecho de que parece que la survivina se expresa en la mayona de las formas de cancer, es muy probable que puedan proporcionarse las vacunas de la invencion para controlar cualquier tipo de enfermedad cancerosa donde se exprese survivina. Por consiguiente, como ejemplos, la composicion de vacuna de la invencion es inmunologicamente activa contra un tumor maligno hematopoyetico, incluyendo leucemia linfatica cronica y leucemia mieloide cronica, melanoma, cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de pancreas, y cancer de prostata.

A partir de la descripcion anterior, el experto se dara cuenta facilmente de que los peptidos de la invencion son utiles como herramientas de diagnostico de cancer, particularmente, ya que los peptidos se derivan de survivina expresada en todos los tipos de cancer. Por tanto, los peptidos dados a conocer en la presente descripcion proporcionan la base para desarrollar procedimientos de diagnostico y pronostico aplicables universalmente con respecto a enfermedades de cancer. Por tanto, la presente descripcion da a conocer una composicion para el diagnostico ex vivo o in situ de la presencia en paciente de cancer, por ejemplo basandose en la deteccion de celulas T reactivas con survivina entre los PBL o en tejido tumoral.

Por consiguiente, la presente descripcion da a conocer un kit de diagnostico para el diagnostico ex vivo o in situ de la presencia de celulas T reactivas con survivina entre los PBL o en tejido tumoral que comprende uno o mas peptidos de la invencion, y un metodo de deteccion en un paciente de cancer de la presencia de celulas T reactivas con survivina, comprendiendo el metodo poner en contacto un tejido tumoral o una muestra de sangre con un complejo de un peptido de la invencion y una molecula de HLA de clase I o un fragmento de tal molecula y detectar la union del complejo al tejido o las celulas sangumeas.

Otro enfoque de diagnostico o pronostico util se basa en generar anticuerpos en una especie animal heterologa, por ejemplo anticuerpos murinos dirigidos contra un peptido derivado de survivina humana de la invencion, que pueden usarse entonces, por ejemplo para diagnosticar la presencia de celulas cancerosas que presentan el peptido. Para tales fines de inmunizacion, la cantidad de peptido puede ser menor que la usada en el transcurso de la terapia in vivo, tal como la mencionada anteriormente. En general, una dosis preferida puede oscilar entre aproximadamente 1 |ig y aproximadamente 750 |ig de peptido. Tambien es posible producir anticuerpos monoclonales basandose en la inmunizacion con un peptido de la invencion. Por consiguiente, la presente descripcion tambien da a conocer una molecula, en particular un anticuerpo monoclonal o policlonal incluyendo un fragmento del mismo, que es capaz de unirse espedficamente a un peptido de la invencion y una molecula que es capaz de bloquear una union de este tipo, por ejemplo un anticuerpo generado contra el anticuerpo monoclonal o policlonal dirigido contra un peptido de la invencion.

La presente descripcion da a conocer un complejo de un peptido de la invencion y una molecula de HLA de clase I o un fragmento de tal molecula, que es util como reactivo de diagnostico tal como se describio anteriormente. El complejo se prepara por cualquier medio convencional incluyendo los descritos en los siguientes ejemplos. Un complejo de este tipo puede ser monomerico o multimerico.

La presente invencion proporciona el medio para aliviar o curar una enfermedad cancerosa. Segun esto, es un aspecto de la invencion usar los peptidos tal como se definieron anteriormente en el presente documento para la preparacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. Un aspecto todavfa adicional de la presente invencion se refiere al uso de una molecula o una composicion tal como se definio anteriormente en el presente documento para la preparacion de un medicamento para el tratamiento del cancer. Preferiblemente, una enfermedad cancerosa asociada con la expresion de survivina, incluyendo como ejemplos: un tumor maligno hematopoyetico, incluyendo leucemia linfatica cronica y leucemia mieloide cronica, melanoma, cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de pancreas y cancer de prostata. El uso comprende administrar a un paciente que padece la enfermedad, una cantidad eficaz de la composicion farmaceutica segun la invencion, una molecula que es capaz de unirse de forma espedfica a un peptido de la invencion y/o una molecula

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que es capaz de bloquear la union de tal molecula.

En algunos casos, sera apropiado combinar el uso de la invencion con un tratamiento contra el cancer convencional tal como radioterapia o quimioterapia.

Ahora se describira la invencion con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y en las figuras, en las cuales:

La figura 1 ilustra la respuesta de celulas T medida en un ELISPOT en el paciente LLC1 a sin peptido, al peptido Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) y al peptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3). Los PBL se estimularon una vez con el peptido antes de sembrarse a 6x105 celulas por pocillo en duplicado. Se calculo el numero medio de manchas por peptido utilizando un dispositivo de barrido CCD y un sistema de ordenador,

La figura 2 ilustra la respuesta de celulas T medida en un ELISPOT en el paciente LLC1 a sin peptido, al analogo de peptido Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO: 4) y al analogo de peptido Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5). Los PBL se estimularon una vez con el peptido antes de sembrarse a 104 celulas por pocillo en duplicado. Se calculo el numero medio de manchas por peptido utilizando un dispositivo de barrido CCD y un sistema de ordenador,

La figura 3 muestra las respuestas medidas en un ELISPOT en los pacientes LLC2 y LLC3 a ningun peptido (barra negra), al peptido Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) (barra gris), al peptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) (barra blanca), al analogo de peptido Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO: 4) (barra gris clara) y al analogo de peptido Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5) (barra gris oscura). Cada experimento se llevo a cabo con 105 celulas por pocillo en duplicado, y se calculo el numero medio de manchas,

La figura 4 representa celulas T que se aislaron de los ganglios linfaticos infiltrados por el tumor de los pacientes Mel1, Mel2 y Mel3, estimulados una vez in vitro y analizados en un ensayo ELISPOT para determinar la respuesta a sin peptido (barra negra), los peptidos Sur1 (LtLgEFLKL, SEQ ID NO: 10) (barra gris) y Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) (barra blanca). Cada experimento se llevo a cabo por duplicado con 105 celulas por pocillo. En cada experimento tambien se incluyeron dos pocillos sin adicion de peptido. Se calculo el numero medio de manchas por peptido para cada paciente,

La figura 5 muestra la actividad funcional de CTL espedficos de survivina. Los CTL se aislaron de un ganglio linfatico infiltrado por melanoma usando bolas magneticas recubiertas con survivina. (A) Lisis espedfica de lmeas celulares de melanoma: FM3 positiva para HLA-A2 (triangulo) y FM45 negativa para HLA-A2 (cuadrado). (B) Lisis espedfica de lmeas celulares de cancer de mama: MCF-7 positiva para HLA-A2 (triangulo) y BT-20 negativa para HLA-A2 (cuadrado),

La figura 6 muestra la frecuencia de CTL que reaccionan con survivina en PBL de pacientes de cancer de mama. La reactividad se examino en tres pacientes de cancer de mama (superior, media e inferior, respectivamente) mediante ELISPOT. Para cada paciente los ensayos se llevaron a cabo en ausencia de peptido, en presencia de peptido sur1, en presencia de peptido sur9 y en presencia del peptido modificado sur1M2. Se utilizaron 1x104 celulas efectoras por pocillo. La grafica representa la cuantificacion de celulas reactivas; las columnas grises representan el numero promedio de celulas productoras de IFN-y,

La figura 7 ilustra la union a HLA-35 de peptidos derivados de survivina y el analisis de la recuperacion mediada por peptido de las moleculas de HLA-B35 por los peptidos derivados de survivina. Se incubaron lisados de celulas T2- B35 metabolicamente marcadas a 4°C en presencia de peptido 50, 5, 0,5, 0,05, y 0,005 mM. La recuperacion de HLA-B35 se analizo en un ensayo de ensamblaje y se cuantifico posteriormente a electroforesis IEF en gel, usando el software de Phosphorimager ImageGauge (FUJI photo film Co., LTD., Japon). El valor C50 es la concentracion del peptido requerida para la union semi-maxima a HLA-B35,

La figura 8 muestra respuestas espontaneas de celulas T observadas en PBL de pacientes de cancer. A) El numero de celulas formadoras de mancha de IFNy medidas en el ensayo ELISPOT sin peptido (barras blancas), con sur51- 59 (barras negras) o sur46-54 (barras grises), entre PBL estimulados in vitro de los pacientes LLC5 (105 celulas/pocillo), HEM12 (105 celulas/pocillo) y HEM8 (5x104 celulas/pocillo). B) El numero de celulas formadoras de mancha entre 1,7x105 PBL de HEM12, cultivadas durante 10 dfas con celulas dendnticas autologas maduradas por pulsos con peptidos. Las columnas representan la media de dos medidas,

La figura 9 demuestra las respuestas espontaneas de celulas T contra peptidos de survivina nativos y modificados en pacientes de melanoma. A) El numero de celulas formadoras de manchas medidas en el ensayo ELISPOT contra sur51-59 y sur51Y9 del paciente FM25 en PBL (4x103 celulas/pocillo) y TIL (7x104 celulas/pocillo), asf como TIL de FM45 (105 celulas/pocillo). B) El numero de celulas formadoras de manchas medidas en el ensayo ELISPOT contra sur46 y sur46Y9 medidas en TIL de FM74 (5x103 celulas/pocillo). Las columnas representan la media de dos medidas con la liberacion no espedfica de IFNy restada,

La figura 10 ilustra la afinidad de union de los peptidos derivados de survivina a HLA-A1. Se cuantificaron las bandas de cadena pesada de CMH de clase I en un Phosphorimager. La cantidad de cadena pesada de HLA-A1 estabilizada esta directamente relacionada con la afinidad de union del peptido anadido. La recuperacion de HLA-Al

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mediada por peptido (unidades arbitrarias) inducida por 40, 4, 0,4, 0,04 |iM de Sur93-10l (lmea), Sur93T2 (cuadrado), Sur49-58 (drculo) o virus de la gripe A, PB1 591-599 (triangulo),

La figura 11 muestra las respuestas espontaneas contra los peptidos restringidos a HLA-A1. Respuestas espontaneas de celulas T contra peptidos derivados de survivina medidas mediante el ensayo ELISPOT. El numero medio de manchas de IFNy espedficas del peptido formadas en respuesta a Sur92-101, Sur38Y9, Sur47Y10 y Sur93T2 entre 5x104 PBL o TIL de pacientes de melanoma estimulados in vitro. Las respuestas espedficas de peptidos mostradas se observaron entre los analisis de seis muestras de PBL y tres muestras de TIL de pacientes de melanoma (Mel). Se restan las manchas de IFNy no espedficas. Barras: rango de duplicados,

La figura 12 muestra las respuestas espontaneas contra los peptidos restringidos a HLA-A11. Respuestas espontaneas de celulas T contra los peptidos derivados de survivina medidas mediante el ensayo ELISpOT. El numero medio de manchas de IFNy espedficas de peptidos formadas en respuesta a Sur53-62 entre 5x104 PBL o TIL de pacientes de cancer estimulados in vitro. Las respuestas espedficas de peptidos mostradas se observaron entre los analisis de cinco pacientes de melanoma (Mel) (5 PBL, 1 TIL), y dos pacientes de LLC (LLC) (PBL). Se restan las manchas no espedficas de IFNy. Barras: rango de duplicados,

La figura 13 ilustra las respuestas espontaneas contra los peptidos restringidos a HLA-A3. Respuestas espontaneas de celulas T contra los peptidos derivados de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El numero medio de manchas de IFNy espedficas de peptidos formadas en respuesta a Sur18K10 entre 5x104 PBL o TIL de pacientes de melanoma estimulados in vitro. Las respuestas espedficas de peptidos mostradas se observaron entre los analisis de 23 muestras de PBL y cuatro muestras de TIL de pacientes de melanoma (Mel). Se sustraen las manchas no espedficas de IFNy. Barras: rango de duplicados,

La figura 14 ilustra las respuestas espontaneas contra los peptidos restringidos a HLA-A2. Respuestas espontaneas de celulas T contra los peptidos derivados de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El numero medio de manchas de IFNy espedficas de peptidos formados en respuesta al peptido 11-mero, Sur18-28, entre 5x104 PBL de pacientes de cancer estimulados in vitro. Las respuestas espedficas de peptidos mostradas se observaron entre los analisis de 10 muestras de PBL de 2 pacientes de melanoma (Mel), 6 de LLC (LLC) y 2 de carcinoma de mama (CM). Se restan las manchas no espedficas de IFNy. Barras: rango de duplicados,

La figura 15 ilustra las respuestas espontaneas de celulas T contra los peptidos derivados de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El numero medio de manchas de IFNy espedficas de peptidos formadas en respuesta a sur6-14 (LPPAWQPFL) entre 105 PBL estimulados in vitro de 5 pacientes de melanoma (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), dos pacientes de LLC (LLC1, LLC54) y 2 pacientes de cancer de mama (mama11, mama15). Se restan las manchas no espedficas de IFNy,

La figura 16 ilustra los valores analfticos de la deteccion estable de LDH, colinesterasa, creatinina, hemoglobina, leucocitos, y trombocitos tras la terapia de vacunacion de cuatro pacientes (▲ RW, • KN, —WWE, ■ GB), y

La figura 17 demuestra el analisis cinetico de la inmunidad a peptidos de survivina evaluado mediante ELISPOT de IFNy. Se obtuvieron PBMC antes de la primera vacunacion con CD y tres meses despues de la misma. Se muestran los numeros de celulas formadoras de manchas de IFNy por encima del fondo.

En la siguiente tabla, se enumeran las secuencias de aminoacidos para los peptidos utilizados en el presente documento y sus respectivas SEQ ID NOs:

SEQ ID NO:

DESIGNACION SECUENCIA

1

Sur6 FLKLDRERA

2

Sur8 TLPPAWQPFL

3

Sur9 ELTLGEFLKL

4

Sur1L2 LLLGEFLKL

5

Sur1M2 LMLGEFLKL

6

Sur 46-54 CPTENEPDL

7

Sur51-59 EPDLAQCFF

8

Sur46Y9 CPTENEPDY

9

sur51Y9 EPDLAQCFY

10

Sur1 LTLGEFLKL

11

C1 ILKEPVHGV

12

Sur2 RAIEQLAAM

13

Sur3 KVRRAIEQL

14

Sur4 STFKNWPFL

15

Sur5 SVKKQFEEL

16

Sur7 TAKKVRRAI

17

Sur10 ETAKKVRRAI

18

Sur 6-14 LPPAWQPFL

19

Sur 11-19 QPFLKDHRI

20

Sur 34-43 TPERMAEAGF

21

C24 YPLHEQHQM

22

Sur14-22 LKDHRISTF

23

Sur38-46 MAEAGFIHC

24

Sur93-101 FEELTLGEF

25

Sur47-56 PTENEPDLAQ

26

Sur49-58 ENEPDLAQCF

27

Sur92-101 QFEELTLGEF

28

C1 VSDGGPNLY

29

Sur14Y9 LKDHRISTY

30

sur93Y9 FEELTLGEY

31

sur92Y9 QFEELTLGEY

32

sur34Y9 TPERMAEAGY

33

sur49Y9 ENEPDLAQCY

34

Sur92T2 QTEELTLGEF

35

Sur92S2 QSEELTLGEF

36

Sur93T2 FTELTLGEF

37

Sur93S2 FSELTLGEF

38

Sur38Y9 MAEAGFIHY

39

Sur47Y10 PTENEPDLAY

40

Sur 5-13 TLPPAWQPF

41

Sur 53-61 DLAQCFFCF

42

Sur 54-62 LAQCFFCFK

43

Sur 95-103 ELTLGEFLK

44

Sur 112-120 KIAKETNNK

45

Sur 13-22 FLKDHRISTF

47

Sur 53-62 DLAQCFFCFK

50

Sur 103-112 KLDRERAKNK

51

Sur 112-121 KIAKETNNKK

52

Sur 113-122 IAKETNNKKK

53

C3 ILRGSVAHK

54

Sur5K9 TLPPAWQPK

55

Sur53K9 DLAQCFFCK

56

Sur54L2 LLQCFFCFK

57

Sur13K9 FLKDHRISTK

58

Sur18K10 RISTFKNWPK

59

Sur113L2 ILKETNNKKK

60

SurEx3-A3-1 TIRRKNLRK

61

SurEx3-A3-2 PTIRRKNLRK

62

Sur2b-A3-1 RITREEHKK

63

C4 AVFDRKSDAK

64

C6 QPRAPIRPI

65

C7 RPPIFIRRL

66

Sur4-14 PTLPPAWQPFL

67

Sur18-28 RISTFKNWPFL

68

Sur54-64 LAQCFFCFKEL

69

Sur86-96 FLSVKKQFEEL

70

Sur88-98 SVKKQFEELTL

71

Sur103-113 KLDRERAKNKI

72

Ebv, BMLF1 GLCTLVAML

73

Hiv, Pol ILKEPVHGV

74

Gripe A, nucleoprotema 265-273 ILRGSVAHK

Ejemplo 1

Identificacion de una respuesta de linfocitos T citotoxicos a la protema inhibidora de apoptosis survivina en pacientes de cancer

Sumario

5 Utilizando epftopos de CTL derivados de survivina, se ha estudiado la reactividad de celulas T espedficas contra tales antigenos en sangre periferica de pacientes de leucemia linfatica cronica (LLC) y en los ganglios linfaticos infiltrados por el tumor de pacientes de melanoma, mediante analisis ELISPOT. Las respuestas de CTL a los epftopos de peptidos derivados de survivina se detectaron en tres de seis pacientes de melanoma y en tres de cuatro pacientes de LLC. No se detecto reactividad de celulas T en PBL de seis controles sanos. Por consiguiente, 10 los peptidos derivados de survivina pueden servir como dianas importantes y ampliamente aplicables para las estrategias inmunoterapeuticas contra el cancer.

Introduccion

La protema survivina se barrio para determinar la presencia de motivos de peptido de union a HLA-A*0201 (HLA-A2) y despues de una identificacion con exito, los peptidos se utilizaron para probar la reactividad de celulas T 15 espedficas en pacientes de leucemia y melanoma mediante ensayo ELISPOT. En ambas cohortes de pacientes se detectaron respuestas de CTL a dos epftopos de peptidos derivados de survivina, mientras que no se pudo detectar reactividad alguna de celulas T en los controles sanos. Estos datos sugieren que la survivina representa un antfgeno tumoral ampliamente expresado reconocido por las celulas T autologas.

Materiales y Metodos

20 Pacientes y controles normales

Se recogieron muestras de sangre de vena periferica de 4 pacientes diagnosticados con LLC (designados como

LLC1-4) y muestras de sangre de 6 individuos normales en tubos heparinizados. Se aislaron los PBL utilizando separacion por Limphoprep y se congelaron en suero fetal de ternera (sFt) con dimetilsulfoxido al 10 %. Ademas, se obtuvieron linfocitos T de los ganglios linfaticos infiltrados por el tumor de 6 pacientes de melanoma (designados como mel1-6). Los ganglios linfaticos recien cortados se trocearon en fragmentos pequenos, se trituraron para liberar 5 las celulas al cultivo y se crioconservaron. Estuvieron disponibles PBL de 4 pacientes de melanoma. Todos los individuos incluidos eran positivos para HLA-A2 determinado mediante analisis por FACS utilizando el anticuerpo BB7.2 espedfico de HLA-A2. El anticuerpo se purifico a partir del sobrenadante del hibridoma. Las muestras de los pacientes se obtuvieron del Hospital de la Universidad del Estado, Herlev, Dinamarca. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas.

10 Peptidos derivados de survivina

Todos los peptidos se obtuvieron de Research Genetics (Huntsville, AL, EE UU) y se suministraron a una pureza >90 % verificado mediante analisis por HPLC y EM. Los peptidos utilizados se enumeran en la Tabla 1.

Tabla 1. Peptidos examinados en este estudio y su afinidad de union a HLA-A2

Nombre

Protema3 Secuencia SEQ ID NO: C50 (|iM)b

C1

VIH-1 Pol476-484 ILKEPVHGV 11 0,7

Sur1

Survivinag6-104 LTLGEFLKL 10 >100

Sur2

Survivina-i33-141 RAIEQLAAM 12 Sin union

Sur3

Survivina-130-138 KVRRAIEQL 13 >100

Sur4

Survivina20-28 STFKNWPFL 14 Sin union

Sur5

Survivina88-96 SVKKQFEEL 15 Sin union

Sur6

Survivina101-10g FLKLDRERA 1 30

Sur7

Survivina-127-135 TAKKVRRAI 16 Sin union

Sur8

Survivina5-14 TLPPAWQPFL 2 30

Sur9

Survivinag5-104 ELTLGEFLKL 3 10

Sur10

Survivina126-135 ETAKKVRRAI 17 Sin union

Sur1L2

LLLGEFLKL 4 1

Sur1M2

LMLGEFLKL 5 1

a El intervalo de valores enumerado en los submdices indica la posicion del peptido en la secuencia de survivina 15 como se divulga en el documento US 6.245.523.

b El valor C50 es la concentracion del peptido requerida para una union semi-maxima a HLA-A2 determinado como se describe a continuacion.

Ensayo de ensamblaje para union del peptido a las moleculas de CMH de clase I.

Se llevaron a cabo los ensayos de ensamblaje para la union de los peptidos sinteticos a las moleculas de CMH de 20 clase I metabolicamente marcadas con [35S]-metionina, como se ha descrito (12, 13). El ensayo de ensamblaje se basa en la estabilizacion de las moleculas de clase I despues de cargar el peptido en la lmea celular deficiente en transportador peptfdico T2. Posteriormente, se inmunoprecipitan las cadenas pesadas de CMH estables correctamente plegadas utilizando anticuerpos dependientes de la conformacion. Despues de la electroforesis IEF, los geles se expusieron a pantallas de phosphorimager, y se cuantifico la union del peptido utilizando el programa 25 Imagequant Phosphorimager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Estimulacion de PBL por andgeno

Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, se estimularon los PBL una vez in vitro antes del analisis (14, 15). Los PBL recientes y los previamente congelados dieron resultados similares en el ensayo ELISPOT. El dfa 0, se descongelaron los PBL o ganglios linfaticos triturados y se sembraron a 2 ml/pocillo a una concentracion de 30 2x106 celulas, en placas de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca), en medio AIM V (Life Technologies, Roskilde,

Dinamarca), suero humano inactivado por calor al 5 % y L-glutamina 2 mM en presencia de peptido 10 |iM. En cada experimento, se incluyo un pocillo sin peptido. Dos dfas despues, se anadio interleuquina-2 recombinante (IL-2) 300 UI/ml (Chiron, Ratingen, Alemania) a los cultivos. Se probo la reactividad de las celulas cultivadas en el ensayo ELISPOT el dfa 12.

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

Ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT utilizado para cuantificar las celulas efectoras liberadoras de interferon-y espedficas del epftopo del peptido se llevo a cabo como en (16). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos de fondo de nitrocelulosa (Multiscreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) con anticuerpo anti-IFN-y (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se lavaron, se bloquearon con medio AIM V, y se anadieron las celulas en duplicados a diferentes concentraciones celulares. Luego se anadieron los peptidos a cada pocillo y las placas se incubaron durante la noche. Al dfa siguiente, se desecho el medio y los pocillos se lavaron antes de anadir el anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotina Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas, se lavaron y se anadio el conjugado avidina-enzima (AP-Avidina, Calbiochem, Life Technologies) a cada pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y se anadio el sustrato enzimatico NBT/BClP (Gibco, Life Technologies) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. La reaccion se termino lavando con agua del grifo hasta que surgieron manchas purpura oscuro. Las manchas se contaron utilizando un Sistema Alphalmager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, Ee. UU.) y se pudo calcular la frecuencia de CTL espedfica del peptido a partir de los numeros de celulas formadoras de manchas. Todos los ensayos se llevaron a cabo por duplicado para cada antfgeno peptfdico.

Resultados

Union de peptidos derivados de survivina a HLA-A2.

La secuencia de aminoacidos de la protema survivina se rastreo para determinar los epftopos de peptidos nona- y decamericos de HLA-A2 mas probables, utilizando los principales residuos de anclaje espedficos de HLA-A2 (17). Se sintetizaron diez peptidos derivados de survivina y se examino su union a HLA-A2. Se utilizo un epftopo de VIH-1 pol476-484 (ILKEPVHGV, SEQ ID NO: 11) (Tabla 1) como control positivo. La concentracion de peptido requerida para la recuperacion semi-maxima de CMH de clase I (valor C50) fue de 0,7 pM para el control positivo. En comparacion, el peptido designado Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) se unio con una afinidad de C50 = 10 pM. Los peptidos designados Sur6 (FLKLDRERA, SEQ ID NO: 1) y Sur8 (TLPPAWQPFL, SEQ ID NO: 2) se unieron respectivamente a HLA-A2 a C50 = 30 pM, mientras que Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) y Sur3 (KVRRAIEQL, SEQ ID NO: 13) se unieron mas debilmente (C50 >100 pM). Cinco de los peptidos examinados (Sur2, Sur4, Sur5, Sur7, y Sur10) no se unieron a HLA-A2.

Puesto que Sur1 se une de forma debil a HLA-A2, se sintetizaron dos peptidos analogos designados Sur1L2 y Sur1M2, respectivamente, en los que un residuo de anclaje mejor (leucina o metionina) reemplazo a la treonina nativa en la posicion 2. Ambos peptidos se unen a HLA-A2 con alta afinidad casi similar a la del control positivo (C50 = 1 pM).

Respuesta de CTL a survivina en pacientes de LLC.

Los PBL de cuatro pacientes de LLC positivos para HLA-A2 se estimularon una vez in vitro antes de examinarse en el ensayo ELISPOT. Este procedimiento se selecciono para aumentar la sensibilidad del ELISPOT. Se incluyeron los 10 peptidos derivados de survivina anteriores en la primera lmea de experimentos. Se detectaron respuestas a Sur1 y Sur9 y en las figuras solamente se dan los datos para estos peptidos. La figura 1 muestra la reactividad de CTL a Sur1 y Sur9 determinada en el paciente LLC1. Cada mancha representa una celula productora de IFN-y que reacciona con el peptido. El numero medio de manchas por peptido se calculo utilizando un dispositivo de barrido CCD y un sistema de ordenador. Se detectaron 52 manchas espedficas del peptido Sur9 (despues de la sustraccion de las manchas sin el peptido anadido) por 6x105 en el paciente LLC1 (Fig. 1). No se detecto respuesta alguna al peptido Sur1 de union debil a HLA-A2, sin embargo el paciente respondio fuertemente al analogo de peptido Sur1M2 de union fuerte a HLA-A2 (35 manchas espedficas del peptido por 104 celulas) (Fig. 2). No se detecto respuesta alguna al otro analogo de peptido Sur1L2 de fuerte union a HLA-A2 en este paciente (Fig. 2). El paciente LLC2 respondio fuertemente a Sur9 (128 manchas espedficas del peptido por 105 celulas) y debilmente a Sur1 (22 manchas espedficas del peptido por 105 celulas) (Fig. 3). La respuesta al analogo Sur1L2 se incremento solo ligeramente en relacion con el epftopo natural, mientras que el paciente respondio fuertemente de una manera similar al peptido Sur1M2 que al peptido decamerico Sur9. En el paciente LLC3 se observo una respuesta debil a Sur9 (Fig. 3). No se observo respuesta alguna a Sur1 o a los peptidos modificados de Sur1 en el paciente. No se detectaron respuestas de survivina en el ultimo paciente CLL4 (datos no mostrados). Se analizaron los PBL de seis controles positivos sanos para HLA-A2 con el fin de investigar si se podna detectar una respuesta a la survivina en los individuos sanos. No se observo respuesta alguna en ninguno de los controles a ninguno de los peptidos derivados de survivina.

Respuesta de CTL a survivina en pacientes de melanoma.

Se examinaron linfocitos T aislados de ganglios linfaticos infiltrados por tumor de pacientes de melanoma positivos para HLA-A2. El ganglio linfatico recien cortado se troceo en fragmentos pequenos y se aplasto para liberar las celulas al cultivo. Las celulas se estimularon una vez con el peptido in vitro antes de examinarse en el ensayo ELISPOT. Se detectaron celulas T espedficas de survivina en tres de los seis pacientes analizados. Se detecto una fuerte respuesta a Sur9 en los pacientes Mel2 y Mel3. Tambien se detecto una respuesta mas debil al peptido Sur1

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

55

en estos pacientes (Fig. 4). En Mel1 la respuesta al peptido de union debil Sur1 fue mas fuerte que la respuesta a Sur9 de union mas fuerte a HLA-A2 (Fig. 4). No se detecto respuesta alguna en los ganglios linfaticos infiltrados por tumor de los ultimos tres pacientes de melanoma (Mel4-6). Se examinaron los PBL de dos de los pacientes que reaccionaron a survivina, Mel1 y Mel2, y de dos de los pacientes que no reaccionaron, Mel4 y Mel5. No se pudo detectar respuesta alguna a Sur9 o Sur1 en los PBL de ninguno de estos pacientes (datos no mostrados).

Ejemplo 2

Respuestas espontaneas de celulas T citotoxicas a los epttopos de celulas T restringidos a CMH de clase I derivados de survivina in situ y ex vivo en pacientes de cancer

Sumario

Se demostraron respuestas espontaneas de celulas T citotoxicas a los epftopos de celulas T restringidos a CMH de clase I derivados de survivina in situ asf como ex vivo en pacientes de cancer de mama, leucemia y melanoma. Ademas, las celulas T que reaccionan con survivina aisladas mediante bolas magneticas recubiertas con complejos CMH/peptido eran citotoxicas a tumores con HLA coincidente de diferentes tipos de tejido. Al ser un antfgeno tumoral universal, la survivina puede servir como diana ampliamente aplicable para la inmunoterapia contra el cancer.

Materiales y Metodos

Construccion de complejos HLA-peptido para tincion de celulas T y separacion de celulas T.

Se expreso un sitio de reconocimiento para la biotinilizacion enzimatica utilizando la protema ligasa de biotina (BirA) en fusion con el extremo 5' de los dominios extracelulares de HLA A*0201 (residuos 1-275) en E. coli BL21 (DE3). La protema recombinante se purifico mediante cromatograffa por tamano (Sephadex G25, Pharmacia) y de intercambio ionico (mono-Q, Pharmacia) a partir de cuerpos de inclusion solubilizados en urea 8 M. HLA A*0201 se plego in vitro mediante dilucion en presencia del peptido modificado de survivina Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5) o del peptido MAA gp100154-163, y posteriormente se biotinilo como se ha descrito anteriormente (35, 36). Despues de la filtracion en gel en una columna de Sephadex G25 de Pharmacia para eliminar la biotina no unida, la protema se multimerizo con moleculas de dextrano conjugadas con estreptavidina-FITC (amablemente proporcionado por L. Winther, DAKO, Dinamarca) con el fin de generar compuestos multivalentes HLA-dextrano para la inmunohistoqmmica. La construccion HLA A*0201 fue un amable obsequio del Dr. Mark M. Davis (Departamento de Microbiologfa e Inmunologfa, Universidad de Stanford, Palo Alto, CA). La separacion celular se llevo a cabo como se ha descrito anteriormente (37). Brevemente, se lavaron 5x106 bolas magneticas conjugadas con estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega) dos veces en 200 |il de PBS fno, se anadieron 0,5 |ig de monomeros de peptido/A*0201 y la mezcla se incubo durante 15 minutos a temperatura ambiente. Despues de dos lavados estas bolas se mezclaron con PBL en una proporcion de 1:10 y posteriormente se incubaron durante 1 hora seguido por una precipitacion de las celulas unidas a las bolas en un campo magnetico. El paso de precipitacion se repitio una vez.

Tinciones inmunohistoqumicas

Para la tincion con los complejos peptido/CMH multimericos conjugados con FITC, las secciones de tejido se secaron durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fna durante 5 minutos. Todos los pasos de incubacion se llevaron a cabo a temperatura ambiente y en la oscuridad: (i) 45 minutos del anticuerpo primario (diluido 1:100), (ii) anticuerpo de cabra anti-raton conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; codigo 115-165-100, Jackson ImmunoResearch, obtenido de Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45 minutos, y finalmente (iii) los multimeros durante 75 minutos. Entre cada paso los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0,1 %. Los portaobjetos se montaron en Vectashield y se mantuvieron en la nevera hasta que se observaron con el microscopio confocal.

Ensayo de citotoxicidad

Se llevaron a cabo ensayos convencionales de liberacion de [51Cr] para determinar la citotoxicidad mediada por CTL como se describe en (13). Las celulas diana eran lmeas de celulas B autologas transformadas por EBV, la lmea celular de cancer de mama MCF-7 positiva para HLA-A2 (disponible en ATCC), la lmea celular de melanoma FM3 positiva para HLA-A2 (38), la lmea celular de cancer de mama BT-20 negativa para HLA-A2 (disponible en ATCC) y la lmea celular de melanoma FM45 negativa para HLA-A2 (38). Todas las lmeas celulares de cancer expresaban survivina examinadas por RT-PCR (datos no mostrados).

Ensayo ELISPOT

Se utilizo el ensayo ELISPOT para cuantificar las celulas efectoras liberadoras de IFN-y espedficas del epftopo del peptido y se ha descrito anteriormente (39). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore) con un anticuerpo anti-IFN-y (1-D1K, Mabtech, Suecia) y se bloqueo la union no espedfica utilizando AIM V (GibcoBRL, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, EE.UU.). Se anadieron linfocitos a diferentes concentraciones celulares junto con los peptidos espedficos y celulas T2 y se incubaron durante la noche a 37°C. Tras dos lavados, se anadio el anticuerpo de deteccion biotinilado (7-B6-1-

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Biotina Mabtech). La union espedfica se visualizo utilizando fosfatasa alcalina-avidina junto con el sustrato respectivo (GibcoBRL). La reaccion se termino tras la aparicion de manchas purpura oscuro, que se cuantificaron utilizando el Sistema Alphalmager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE. UU.). Los peptidos utilizados para el ELISPOT fueron Sur1, Sur9 y el peptido analogo de Sur1 Sur1M2, como se describe en el Ejemplo 1.

Resultados

Tincion in situ de celulas T que reaccionan con HLA-A2/survivina

En el Ejemplo 1 se identificaron dos epftopos peptidicos derivados de survivina reconocidos por las celulas T en leucemia y melanoma, es decir, Sur1. La debil afinidad de union de Sur1 a HLA-A2 mejoro sustancialmente mediante el reemplazo de la treonina en la posicion 2 con un residuo de anclaje mejor (metionina; Sur1M2). Esta medida permitio la construccion de complejos HLA-A2/peptido estables. Estos complejos se multimerizaron utilizando moleculas de dextrano, que se conjugaron con estreptavidina y FITC. Se utilizaron complejos de CMH multimerizados para tenir material congelado fijado con acetona. Utilizando un microscopio laser confocal se pudieron detectar facilmente los CTL que reaccionan con Sur1M2/HLA-A*0201 in situ en el microentorno tumoral. Se representan estas celulas en el tumor primario y en el ganglio linfatico centinela de un paciente de melanoma en etapa Ill asf como en una lesion de cancer de mama primario. Con el fin de asegurar la especificidad de la tincion, se llevaron a cabo una serie de controles negativos. Ni el uso de los multfmeros peptido/HLA-dextrano con peptidos derivados del antigeno de diferenciacion de melanoma gp100 en el mismo tumor, ni los multfmeros Sur1M2/HLA- dextrano en el caso de una muestra tumoral obtenida de un donante negativo para HLA-A2, produjeron una tincion positiva.

Los CTL aislados que reaccionan con survivina lisan tfneas celulares tumorales de diferente origen

Con el fin de caracterizar la capacidad funcional de los CTL que reaccionan con survivina, estas celulas se aislaron por medio de bolas magneticas recubiertas con complejos HLA-A2/Sur1M2 (36). Un ganglio linfatico infiltrado por melanoma recien cortado se troceo en fragmentos pequenos y se aplasto para liberar las celulas al cultivo. Las celulas se estimularon una vez con el peptido in vitro antes del aislamiento. Un dfa despues del aislamiento se anadio IL-2 y el dfa 5 se probo la capacidad de estas celulas para aniquilar celulas tumorales, ya sea mediante ELISPOT o en un ensayo estandar de liberacion de 51Cr. Primero, por medio del analisis ELISPOT fue posible establecer que los CTL aislados utilizando el complejo modificado Sur1M2/HLA-A2 tambien respondfan al peptido Sur1 nativo (datos no mostrados). Segundo, se probo la citotoxicidad de los CTL que reaccionan con survivina contra la lmea celular de melanoma FM3 positiva para HLA-A2 (Fig. 5A) y la lmea celular de cancer de mama MCF-7 positiva para HLA-A2 (Fig. 5B). Las celulas T aisladas lisaron de una manera eficaz ambas lmeas celulares de HLA- A*0201. En contraste, no se observo citotoxicidad alguna contra la lmea celular de melanoma FM45 negativa para HLA-A2 (Fig. 5A) o la lmea celular de cancer de mama BT-20 negativa para HLA-A2 (Fig. 5B).

Reactividad a survivina medida en PBL mediante ELISPOT

Se examino la presencia de celulas T que reaccionan con survivina en PBL de diez pacientes de cancer de mama positivos para HLA-A2 mediante el ELISPOT. Antes del analisis, los PBL se estimularon una vez in vitro para aumentar la sensibilidad del ensayo. Se examino la reactividad a los siguientes peptidos de survivina: Sur1, Sur9 y Sur1M2. Se detectaron celulas T espedficas de survivina en seis de los diez pacientes de cancer de mama positivos para HLA-A2. Se dan ejemplos representativos en la Figura 6. En los PBL de dos pacientes se detecto una respuesta contra Sur1 y el analogo modificado Sur1M2, pero no contra Sur9 (Fig. 6, parte superior, media), en tres pacientes se detecto una respuesta a Sur9, pero no a Sur1 o Sur1M2 (Fig. 6, parte inferior) y un paciente respondio solamente a Sur1M2. En contraste, no se detectaron respuestas a survivina en los PBL de 20 donantes sanos positivos para HLA-A2. De una manera similar, se examinaron los PBL de catorce pacientes de melanoma positivos para HLA-A2. Hubo respuestas a survivina presentes en siete de estos pacientes (Tabla 2). Dos pacientes respondieron al peptido Sur9, tres al peptido Sur1M2, uno tanto a Sur1 como a SurM2 y uno a los tres peptidos. En el ejemplo 1, se probo la respuesta de celulas T a survivina en tres pacientes de leucemia linfatica cronica (LLC) (Tabla 2; LLC1, LLC2, LLC3). Estos estudios se extendieron utilizando PBL de tres pacientes adicionales de LLC. Notablemente, todos los pacientes produjeron una respuesta de celulas T a al menos un epttopo de survivina (Tabla 2; LLC5, LLC6, LLC7). Ademas, se examinaron los PBL de un paciente que padeda leucemia mieloide cronica (LMC). En este paciente, se identifico una respuesta a los tres peptidos (datos no mostrados). Los datos se sumario en la Tabla 2.

Tabla 2. Pacientes con linfocitos T espedficos del peptido survivina en PBL medido mediante ELISPOT

Melanoma a)

Paciente

Sur1 Sur9 Sur1M2

P4

- - 97

P11

- - 112

P13

- - 71

P15

61 - 101

P17

- 172 -

P39

- 127 -

P64

112 70 128

Cancer de Mama b)

Paciente

Sur1 Sur9 Sur1M2

B1

122 - 208

B2

67 - 72

B3

- 54 -

B4

- 45 -

B5

- 19 -

B6

- - 24

LLC c)

Paciente

Sur1 Sur9 Sur1M2

LLC1

- 27 320

LLC2

- 39 -

CLL3

23 127 122

LLC5

- 100 124

LLC6

- 121 360

LLC7

68 132 174

a) Frecuencia de celulas reactivas por 104; 14 pacientes examinados.

b) Frecuencia de celulas reactivas por 104; 10 pacientes examinados.

c) Frecuencia de celulas reactivas por 105; 7 pacientes examinados.

Ejemplo 3

5 Respuestas inmunes restringidas a HLA-B35 a peptidos derivados de survivina en pacientes de cancer Sumario

En este estudio, se identificaron y caracterizaron dos epftopos derivados de survivina, que estan restringidos a HLA- B35. La reactividad de celulas T espedfica contra ambos epftopos estaba presente en la sangre periferica de los pacientes con diferentes tumores malignos hematopoyeticos y melanoma. Las sustituciones del residuo de anclaje 10 C-terminal mejoraron el reconocimiento por parte de los linfocitos infiltrantes en el tumor de los pacientes de melanoma. Ademas, se demostraron respuestas espontaneas de celulas T citotoxicas a survivina in situ en una lesion de melanoma primario. Estos epftopos extienden la aplicabilidad de futuras estrategias de vacuna basada en los peptidos de survivina en relacion con los tumores malignos asf como el perfil de HLA de los pacientes involucrados.

15 En los ejemplos 1 y 2, se estudiaron los epftopos de celulas T derivados de survivina restringidos a HLA-A2. Debido a que HLA-A2 solamente se expresa en aproximadamente el 30 % de la poblacion blanca (63), se necesita identificar los epftopos de peptidos restringidos a otras moleculas de HLA de clase I para extender la fraccion de pacientes que se podnan tratar. En este estudio, se identificaron dos epftopos nuevos de celulas T de survivina restringidos a HLA-B35, que se expresa en el 9 % de la poblacion blanca (63), y se detectaron respuestas inmunes 20 espontaneas a estos peptidos de survivina en pacientes con diferentes tumores malignos hematopoyeticos y melanoma.

Materiales y Metodos

Pacientes

5

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40

Se recogieron muestras de sangre de vena periferica de pacientes de cancer, se aislaron los PBL utilizando separacion por Lymphoprep, se tipifico el HLA (Departamento de Inmunolog^a Clmica, Hospital de la Universidad, Copenhague) y se congelaron en SFT con DMSO al 10 %. Se seleccionaron diez pacientes positivos para HLA-B35 para un analisis adicional. Estos pacientes padedan melanoma, LLC, linfoma folicular (LF), linfomas difusos de celulas B grandes (DLBCL) y mieloma multiple (MM), respectivamente. En el momento en que se recogieron las muestras de sangre los pacientes no hadan sido tratados medicamente en los cuatro meses anteriores. Adicionalmente, se recogieron linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) aislados de ganglios linfaticos de tres de los pacientes de melanoma, y se congelaron en SFT con DMSO al 10 %.

Peptidos

Se utilizaron siete peptidos sinteticos derivados de survivina en este estudio: Sur6-14, Sur11-19, Sur34-43, Sur46- 54, Sur51-59, Sur46Y9, Sur51Y9 y un peptido derivado de EBV, EBNA3A 457-466 (63). Todos los peptidos se obtuvieron de Research Genetics (Huntsville, AL) y se suministraron a una pureza >90 %, verificado mediante analisis de HPLC y MC. Los peptidos se enumeran en la tabla 3 a continuacion.

Tabla 3. Union de los peptidos derivados de survivina a HLA-B35

Nombre

Protema y posicion Secuencia SEQ ID NO: C50 (|iM)

Sur6-14

Survivina6-14 LPPAWQPFL 18 >100

Sur11-19

Survivinan-19 QPFLKDHRI 19 Sin union

Sur34-43

Survivina34-43 TPERMAEAGF 20 >100

Sur46-54

Survivina46-54 CPTENEPDL 6 20

Sur51-59

Survivina51-59 EPDLAQCFF 7 13

Sur46Y9

Peptido modificado CPTENEPDY 8 4

Sur51Y9

Peptido modificado EPDLAQCFY 9 1,5

C24

EBNA3A458-466 YPLHEQHQM 21 0,8

Ensayo de ensamblaje para la union del peptido a moleculas de CMH de clase I.

Se utilizo el ensayo de ensamblaje descrito en los ejemplos 1 y 2 para medir la afinidad de union de los peptidos sinteticos a las moleculas HLA-B35 metabolicamente marcadas con [S35]metionina. Brevemente, el ensayo se basa en la estabilizacion mediada por el peptido de las moleculas de HLA vadas liberadas, despues de la lisis celular, de la lmea celular T2 deficiente en TAP, establemente transfectada con HLA-B35 (amablemente proporcionada por el Dr. J. Haurum, Symphogen ApS, Lyngby, Dinamarca). Las moleculas de HLA establemente plegadas se inmunoprecipitaron utilizando el Acm W6/32 dependiente de conformacion. Las moleculas de HLA se separaron mediante electroforesis IEF, los geles se expusieron a pantallas de phosphorimager (Imaging plate, FUJI film Co., LTD., Japon), se analizaron y se cuantifico la cantidad de moleculas de HLA correctamente plegadas, utilizando el software de phosphorimager ImageGauge (FUJI photo film Co., LTD., Japon).

Estimulacion de PBL por antigeno

Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, los linfocitos se estimularon una vez in vitro con el peptido antes del analisis (14, 15). Los PBL o TIL se descongelaron y se estimularon con los epftopos peptidos individuales 50 |iM en placas de 96 pocillos durante 2 horas a 26 °C (5x105-106 celulas por peptido) y se juntaron durante 10 dfas adicionales de cultivo a 37 °C en x-vivo con suero humano (SH) al 5 %, en placas de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca), con 2x106 celulas por pocillo. El segundo dfa de la incubacion se anadio IL-2 40 |ig/ml (Apodan A/S, Dinamarca). El dfa 10, se probo la reactividad de las celulas cultivadas en el ensayo ELISPOT.

El ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT utilizado para cuantificar las celulas efectoras liberadoras de IFN-y espedficas del peptido en PBL o TIL recogidos de pacientes de cancer se llevo a cabo como se describe en el ejemplo 1. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45; Millipore, Hedehusene, Dinamarca) con el Acm contra IFN-y humano, 7,5 |ig/ml (1-D1K; Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se lavaron y se bloquearon con x-vivo (x-vivo 15TM BioWhittacker, Molecular Applications Aps, Dinamarca) y las celulas se anadieron en duplicados a diferentes concentraciones. Para la presentacion del antfgeno, se anadieron 104 celulas T2-B35, con y sin el peptido 10 |iM, por pocillo. Las placas se incubaron durante la noche, las celulas se desecharon y los pocillos se lavaron antes de anadir el anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotina; Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron y se anadio el conjugado avidina-fosfatasa alcalina (AP-Avidina; Calbiochem, Life Technologies, Inc.). Despues de 1 hora de incubacion a temperatura ambiente, se

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55

anadio el sustrato enzimatico nitroazul de tetrazolio/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (Codigo No. K0598, DakoCytomation Norden A/S) y surgieron manchas purpura oscuro en 3-7 minutes. La reaccion se termino lavando con agua del grifo. Las manchas se contaron utilizando el Sistema Alpha Imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA) y se calculo la frecuencia de celulas T espedficas del peptido a partir del numero de celulas formadoras de manchas.

Todos los ensayos se llevaron a cabo en duplicado para cada antigeno peptidico y los linfocitos cultivados en el mismo pocillo se probaron en numeros iguales de celulas con y sin peptido, para medir el numero de celulas espedficas del peptido en el cultivo.

Maduracion de celulas dendriticas (CD)

Se aislaron celulas adherentes a partir de PBL despues de 2 horas de cultivo. Estas se cultivaron durante 10 dfas adicionales en RPMI 1640 (GibcoTM Invitrogen Corporation, UK) con SFT al 10 %. Se anadieron GM-CSF 800 ng/ml (PreproTech, Londres, UK) e IL-4 40 ng/ml (PreproTech) cada tres dfas. El dfa 10, las CD se hicieron madurar durante 24 horas mediante la adicion de TNF-a 50 ng/ml (PreproTech). Despues de la maduracion, las CD se liberaron y se pulsaron con el peptido 20 |iM en presencia de p2-microglobulina 3 |ig/ml durante 2 horas a 26 °C.

Aislamiento de celulas T espedficas de peptido

Se aislaron celulas espedficas de antfgeno utilizando bolas magneticas recubiertas con sur51Y9/HLA-B35, como se describe en el ejemplo 2. Los monomeros biotinilados de HLA-B35 con sur51Y9 (obtenidos de Prolmmune, Oxford, UK) se acoplaron a bolas magneticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280, Dynal A/S, Oslo, Noruega), mediante incubacion de 2,5 |ig de monomeros con 5x106 bolas en 40 |il de PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los complejos magneticos se lavaron tres veces en PBS, utilizando un dispositivo magnetico (Dynal A/S, Oslo, Noruega) y posteriormente se mezclaron con los PBL en una proporcion de 1:10 en PBS con BSA al 5 % y se rotaron muy suavemente durante 1 hora. Las celulas T CD8+ espedficas del antfgeno que se asociaron con los complejos magneticos, se lavaron suavemente dos o tres veces. Las celulas aisladas se resuspendieron varias veces en x-vivo suplementado con suero humano al 5 % y se incubaron durante 2 horas antes de que se liberaran las bolas magneticas y se eliminaran de la suspension celular. Las celulas T CD8+ espedficas del antfgeno aisladas se utilizaron en el ensayo ELISPOT, para analizar la reactividad cruzada entre el peptido nativo y modificado.

Mapeo de clonotipo de TCR mediante electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE).

El mapeo del clonotipo por DGGE de las regiones 1-24 de TCR BV humanas se ha descrito con detalle (66). Brevemente, se aislo el ARN utilizando el kit de Aislamiento Purescript (Gentra Systems Inc. MN) y se amplifico el ADNc transcrito mediante PCR utilizando cebadores para las regiones variables de las cadenas beta de tCr junto con un cebador comun de la region constante. Se utilizo el programa de ordenador MELT87 para asegurar que las moleculas de ADN amplificadas fueran adecuadas para el analisis por DGGE, siempre que se uniera una secuencia rica en GC de 50 pb (pinza-GC) al extremo 5' del cebador de la region constante. El analisis por DGGE se hizo en geles de poliacrilamida al 6 % que conteman un gradiente de urea y formamida del 20 % al 80 %. La electroforesis se llevo a cabo a 160 V durante 4,5 horas en tampon TAE 1x a una temperatura constante de 54 °C.

Tinciones inmunohistoqumicas

Se utilizaron complejos peptido/HLA multimerizados para identificar las celulas T espedficas del antfgeno in situ en lesiones tumorales de pacientes de cancer empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 2. El monomero sur5lY9/HLA-B35 biotinilado fue suministrado por Proimmune Limited, Oxford, UK. Los monomeros biotinilados de sur51Y9/HLA-B35 se multimerizaron con moleculas de dextrano conjugadas con estreptavidina-FITC (amablemente proporcionado por L. Winther, DAKO, Glostrup, Dinamarca), para generar compuestos multivalentes HLA-dextrano para la inmunohistoqmmica. Las secciones de tejido se secaron durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fna durante 5 minutos. Todos los pasos de incubacion se llevaron a cabo en la oscuridad a temperatura ambiente: (a) 45 minutos del anticuerpo primario (diluido 1:100) (b) anticuerpo de cabra anti-raton conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; codigo 115-165-100; Jackson ImmunoResearch, obtenido en Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45 minutos; y finalmente (c) los multfmeros durante 75 minutos. Entre cada paso, los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0,1 %. Los portaobjetos se montaron en Vectashield y se mantuvieron en la nevera hasta que se observaron con el microscopio confocal (Leica).

Resultados

Identificacion de los peptidos derivados de survivina que se unen a HLA-B35

Se rastreo la secuencia de aminoacidos de survivina para determinar los peptidos nonamericos y decamericos con residuos de anclaje, segun el motivo de union a peptido de HLA-B35 (67). Se seleccionaron cinco peptidos que conteman prolina como el anclaje N-terminal en la posicion 2, y fenilalanina, leucina, isoleucina o tirosina como residuos de anclaje C-terminales (Tabla 3). El ensayo de ensamblaje revelo que dos peptidos, sur51-59 (EPDLAQCFF, SEQ ID NO: 7) y sur46-54 (CPTENEPDL, SEQ ID NO: 6) fueron capaces de estabilizar HLA-B35 de una manera eficaz. Ademas, dos peptidos, sur34-43 (TPERMAEAGF, SEQ ID NO: 20) y sur6-14 (LPPAWQPFL,

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SEQ ID NO: 18) mostraron una estabilizacion debil, mientras que el peptido restante no estabilizo HLA-B35 en absoluto. La concentracion del peptido requerida para la recuperacion semi-maxima de HLA-B35 (C50) se estimo en 13 |iM para sur51-59 y 20 |iM para sur46-54. En comparacion, el epftopo del control positivo C24 de EBNA3A458- 466 (YPLHEQHQM, SEQ ID NO: 21) tema un valor estimado de C50 de 0,8 |iM.

Con el fin de mejorar la afinidad de union de sur46-54 y sur51-59 el aminoacido C-terminal se sustituyo con tirosina, un residuo de anclaje mejor (67). Se analizo la recuperacion de HLA-B35 mediada por los peptidos modificados en el ensayo de ensamblaje, y se estimaron los valores C50 en 1,5 |iM para sur51Y9 y en 4 |iM para sur46Y9 (Fig. 7).

Respuestas inmunes espontaneas contra los epftopos de peptidos nativos.

Inicialmente, se analizaron las respuestas inmunes espontaneas de cinco pacientes a los cuatro peptidos de union a HLA-B35 nativos, sur51-59, sur46-54, sur34-43 y sur6-14. Estos cinco pacientes teman diferentes tumores malignos hematopoyeticos: HEM8 y HEM18 padedan MM, HEM12 padeda LF, HeM9 tema DLBCL y LLC5 tema LLC.

Se llevaron a cabo los ensayos ELISPOT de IFN-y sobre los PBL despues de 10 dfas de estimulacion in vitro para detectar los CTL precursores del peptido. Se detectaron respuestas inmunes espontaneas contra dos de los peptidos nativos de union a HLA-B35, sur51-59 y sur46-54. Dos pacientes, HEM12 y LLC5 mostraron respuesta tanto a sur51-59 como a sur46-54, mientras que HEM8 solamente mostro respuesta a sur51-59 (Figura 8A y B). No se pudo detectar respuesta alguna en los dos pacientes restantes, HEM9 y HEM18, y no se pudo detectar respuesta alguna a los peptidos de union mala sur34-46 y sur6-14 en ninguno de los pacientes.

Se utilizo un planteamiento alternativo a la estimulacion in vitro en el paciente HEM12, es decir, los PBL se cocultivaron con celulas dendnticas autologas maduras pulsadas con sur51-59 para estimular una respuesta de CTL in vitro. Los PBL de este cultivo mostraron una fuerte reactividad hacia sur51-59 en el ELISPOT (Figura 8B).

Reconocimiento aumentado de los peptidos modificados

Como se ha descrito anteriormente, las modificaciones de peptidos para mejorar la afinidad a HLA-B35 produjeron una afinidad 5-10 veces mas alta para HLA-B35 en relacion con los peptidos nativos. Se analizo un grupo de cinco pacientes de melanoma para determinar las respuestas inmunes espontaneas tanto a los peptidos nativos como modificados, por medio del ensayo ELISPOT. Las muestras de PBL se analizaron despues de la estimulacion in vitro, mientras que las muestras de TIL se analizaron directamente. Se observaron respuestas inmunes espontaneas ya sea en los PBL o en los TIL de tres de los cinco pacientes. FM25 mostro reactividad contra sur51-59 y sur51Y9 tanto en muestras de PBL como de TIL (Fig. 9A). FM45 respondio solamente al peptido modificado sur51Y9, con una fuerte respuesta detectable en los TIL. No hubo PBL disponibles de este paciente (Fig. 9A). FM74 mostro una fuerte respuesta a sur46Y9 en TIL, pero no fue detectable respuesta alguna al peptido nativo (Fig. 9B). Tambien se observo una respuesta debil a sur46Y9 en los PBL de FM74 (datos no mostrados).

Reactividad cruzada entre el peptido nativo y el modificado

La alta afinidad de sur51Y9 por HLA-B35 hace posible la produccion de monomeros estables de HLA-B35 con sur51Y9. Habiendose establecido la presencia de linfocitos T que reaccionan con survivina en los ganglios linfaticos infiltrados por el tumor y los PBL de diferentes pacientes de cancer, se recubrieron bolas magneticas con tales complejos HLA-B35/sur51Y9 y estos se utilizaron para aislar linfocitos T que reaccionan con el peptido de survivina a partir de PBL del paciente LLC5. Este paciente mostro una fuerte respuesta a sur51-59. Las bolas estaban fuertemente unidas a la superficie celular de las celulas espedficas, como se visualizo mediante microscopfa (datos no mostrados), permitiendo la precipitacion de celulas espedficas de antfgeno mediante un campo magnetico. Las celulas espedficas de sur51Y9 aisladas respondieron fuertemente a sur51-59 (Figura 9), mientras que no se pudo detectar respuesta alguna en los PBL restantes (datos no mostrados). El aislamiento se analizo mediante el mapeo de clonotipo de TCR basado en RT-PCR/DGGE. Esta tecnica permite hacer el analisis de la clonalidad de celulas T en poblaciones celulares complejas, incluso cuando solamente estan disponibles pequenos numeros de celulas. Estos analisis mostraron que se aislaron 8 clones distintos (datos no mostrados).

Celulas T espedficas de andgeno presentes in situ en lesiones de melanoma

Los monomeros sur51Y9/HLA-B35 se multimerizaron utilizando moleculas de dextrano conjugadas con estreptavidina y FITC. Los complejos de CMH multimerizados se utilizaron para tenir material congelado y fijado con acetona, empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Las celulas espedficas de antfgeno se visualizaron utilizando un microscopio laser confocal. Se analizaron secciones de melanoma primario de tres pacientes y se pudieron detectar facilmente los CTL que reaccionan con sur5lY9/HLA-B35 in situ, en el microentorno tumoral en uno de los pacientes. La cotincion con un Acm contra granzima B mostro que estos CTL espedficos de survivina liberaban granzima B, ejerciendo una actividad citotoxica, se utilizaron pacientes de melanoma negativos para HLA- B35 como controles (datos no mostrados).

Ejemplo 4

Identificacion de nuevos epftopos de CTL derivados de survivina con diferentes perfiles de restriccion a HLA-A

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Sumario

Se caracterizaron nuevos epftopos de survivina restringidos a HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3 y HLA-A11 en base en las respuestas de CTL en pacientes de cancer. Estos epftopos aumentan de manera significativa el numero de pacientes elegibles para la inmunoterapia basada en los peptidos derivados de survivina. Ademas, es probable que el direccionamiento colectivo a varios elementos de restriccion reduzca el riesgo de escape inmune por perdida del alelo HLA.

Materiales y Metodos Pacientes

Las muestras de pacientes se recibieron de la Universidad de Wurzburg, Alemania, y del Hospital de la Universidad en Herlev, Dinamarca. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas. La tipificacion del tejido se realizo en el Departamento de Inmunologfa Clmica, Hospital de la Universidad, Copenhague, Dinamarca. Se aislaron linfocitos de sangre periferica (PBL) de los pacientes de cancer con melanoma, carcinoma de mama y leucemia linfocftica cronica (LLC), utilizando separacion por Lymphoprep y se congelaron en suero fetal de ternera (SFT) con dimetilsulfoxido al 10%. Ademas, se obtuvieron linfocitos T de lesiones primarias y de ganglios linfaticos infiltrados por tumor de los pacientes de melanoma. El tejido tumoral recien cortado se troceo en fragmentos pequenos y se aplasto para liberar los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) para la crioconservacion.

Peptidos

Todos los peptidos se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE. UU.) y se suministraron a una pureza de >80 % verificado mediante analisis por HPLC y MS. Todos los peptidos utilizados se enumeran en la Tabla 4, en el ejemplo 5 posteriormente.

Lmeas celulares

La lmea celular humana T2 es un hforido deficiente en TAP1 y TAP2 de las celulas B-LCL.174 y T-LCL CEM, y por tanto, solamente expresa niveles bajos de moleculas de HLA de clase I (HLA-A*0201 y HLA-B*5101) en la superficie celular. Las celulas T2 transfectadas con HLA-A*0301 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. A. McMicheael, IMM, Hospital John Radcliffe, Oxford. Las celulas T2 transfectadas con HLA-A*1101 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. M. Masucci, MTC, Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia. La lmea celular BM36.1 tambien es deficiente para la funcion TAP y tiene un fenotipo similar a T2 con una baja expresion de HLA de clase I (HLA-A*0101, HLA-B*3501) en la superficie. Las celulas BM36.1 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. A. Ziegler, Universidad Humboldt, Berlin, Alemania.

Ensayo de ensamblaje para la union de peptido a moleculas de CMH de clase I

La afinidad de union de los peptidos sinteticos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) a las moleculas HLA-A1, -A2, -A3 o -A11 metabolicamente marcadas con [35S]-metionina, se midio en el ensayo de ensamblaje, como se ha descrito anteriormente (12). El ensayo se basa en la estabilizacion mediada por peptido de las moleculas de HLA vadas liberadas despues de la lisis celular, de las lmeas celulares deficientes en TAP. Las moleculas de HLA establemente plegadas se inmunoprecipitaron utilizando el Acm W6/32 dependiente de conformacion, espedfico de HLA de clase I y se separaron mediante electroforesis en gel por isoelectroenfoque (IEF). Las bandas de cadena pesada del CMH se cuantificaron utilizando el programa ImageGauge PhosphorImager (FUJI photo film Co., Carrollton, TX, EE. UU.). La intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de complejo de CMH de clase I unido al peptido recuperado durante el ensayo. Posteriormente, el nivel de la estabilizacion de la molecula de HLA esta directamente relacionado con la afinidad de union del peptido anadido. La concentracion del peptido utilizada para analizar la recuperacion de las moleculas HLA fue de 40, 4, 0,4, 0,04 |iM para HLA-A1 y HLA-A11, y de 100, 10, 1, 0,1, 0,01 |iM para HLA-A2 y HLA-A3. Posteriormente se calculo el valor C50 para cada peptido como la concentracion de peptido suficiente para una estabilizacion semi-maxima.

Estimulacion de PBL por antigeno

Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, los PBL se estimularon una vez in vitro antes del analisis. El dfa 0, se descongelaron los PBL o ganglios linfaticos aplastados y se sembraron como 2x106 celulas en 2 ml/pocillo en placas de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en medio x-vivo (BioWhittaker, Walkersville, Maryland), suero humano inactivado por calor al 5 % y L-glutamina 2 mM en presencia de peptido 10 |iM. Dos dfas despues, se anadio a los cultivos interleuquina-2 recombinante 20 UI/ml (IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemania). Se probo la reactividad de las celulas cultivadas en el ELISPOT en el dfa 10.

Ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT se utilizo para cuantificar las celulas efectoras liberadoras de interferon-y espedficas del epftopo peptfdico, como se ha descrito anteriormente (16). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de

nitrocelulosa (Multiscreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) con anticuerpo anti-IFN-y (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se lavaron, se bloquearon con medio x-vivo y las celulas se anadieron en duplicados a diferentes concentraciones celulares. Luego se anadieron los peptidos a cada pocillo y las placas se incubaron durante la noche. Al dfa siguiente, se elimino el medio y los pocillos se lavaron antes de anadir el 5 anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotina, Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas, se lavaron y se anadio a cada pocillo el conjugado avidina-fosfatasa alcalina (Calbiochem, Life Technologies, Inc. San Diego, CA, EE. UU.). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora, se lavaron y se anadio el sustrato enzimatico NBT/BCIP (DakoCytomation Norden A/S, Glostrup, Dinamarca) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Tras el surgimiento de manchas purpura oscuro, se termino la reaccion 10 lavando con agua del grifo. Las manchas se contaron utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE. UU.) y se pudo calcular la frecuencia de CTL espedficos de peptido a partir de los numeros de celulas formadoras de manchas. Todos los ensayos se llevaron a cabo por duplicado para cada antfgeno peptfdico.

Resultados

15 Identificacion de epftopos de survivina restringidos a HLA-A1 Union de peptidos derivados de survivina a HLA-A1

Se rastreo la secuencia de aminoacidos de la protema survivina para los epftopos de peptidos nonamericos o decamericos de HLA-A1 mas probables, utilizando los principales residuos de anclaje de HLA-A1, acido aspartico (D), acido glutamico (E) en la posicion 3 y tirosina (Y), fenilalanina (F) en el extremo C. Segun esto, se sintetizaron 20 seis peptidos derivados de survivina y se examino su union a HLA-A1 (Tabla 4). Adicionalmente, se incluyeron los dos peptidos sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID NO: 23) y Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO: 25), a pesar de que solamente conteman uno de los anclajes principales, debido a que ambos se identificaron como posibles buenos unidores mediante el algoritmo predictivo de Rammensee y col. disponible en
http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/. Se estimaron los valores C50 para cada peptido como la concentracion de peptido necesaria para la estabilizacion semi- 25 maxima de HLA-A1 (Tabla 4). Sin embargo, solamente uno de estos peptidos, sur92-10l (GFEELTLGEF) (SEQ ID NO: 27) se unio con una afinidad alta casi similar a la del epftopo del control positivo conocido de la protema del virus de la gripe A, polimerasa basica 1 (PB1) (VSDGGPNLY), como se ejemplifica en la Figura 10. Sur93-101 (FEELTLGEF) (SEQ ID NO: 24) tuvo una baja afinidad de union a HLA-A1, mientras que ninguno de los otros peptidos analizados se unio a HLA-A1 (Tabla 4). Por consiguiente, se sintetizaron un numero de peptidos analogos 30 en los que residuos de anclaje mejores reemplazaron a los aminoacidos naturales. Se modificaron los dos peptidos Sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID NO: 23) y Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO: 25), introduciendo tirosina (Y) en lugar de cistema (C) o glutamina (Q), respectivamente, en el extremo C. Ambos peptidos modificados se unieron fuertemente a HLA-A1 (Tabla 4). Adicionalmente, se sustituyeron los aminoacidos en la posicion 2 con los anclajes auxiliares de treonina (T) o serina (S) en los dos peptidos Sur92-101 y Sur93-101. Estas modificaciones no tuvieron 35 un efecto positivo en la union de Sur92-101 a HLA-A1. En contraste, Sur93T2 (FTELTLGEF) (SEQ ID NO: 36) se unio con una alta afinidad a HLA-A1 (Tabla 4). La Figura 10 ilustra la union del peptido nativo de baja afinidad Sur93- 101, del peptido modificado de alta afinidad Sur93T2 y del peptido que no se une Sur49-58, comparados con el epftopo del control positivo del virus de la gripe. Finalmente, se modificaron Sur14-22, Sur34-43, Sur49-58, Sur51- 59, Sur92-101 y Sur93-101 con tirosina (Y) en el extremo C, sin embargo esto no mejoro la afinidad de union a HLA- 40 A1 para ninguno de estos peptidos (datos no mostrados).

Respuestas de CTL restringidos a HLA-A1 contra peptidos derivados de survivina en pacientes de cancer

Se analizaron los PBL de seis pacientes de melanoma, y los TIL de tres pacientes de melanoma, para determinar la presencia de CTL espedficos contra cualquiera de los cuatro peptidos de alta afinidad deducidos de survivina Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101 y Sur93T2 por medio de ELISpOt. Se observo reactividad de celulas T contra al 45 menos uno de los peptidos derivados de survivina en tres muestras de PBL y una muestra de TIL del total de nueve pacientes analizados. Como se ve en la Figura 11, los PBL de un paciente, Mel.A1-3, alojaron una respuesta de celulas T contra los cuatro peptidos, Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101 y Sur93T2. Mel.A1-2 mostro respuestas contra Sur47Y10, Sur92-10 y Sur93T2, mientras que en Mel.A1-1/TIL y Mel.A1-4/PBL, se observaron respuestas contra Sur47Y10 y Sur93T2, respectivamente (Figura 11).

50 Ademas, se probo la reactividad inmune de diez pacientes de melanoma contra los peptidos nativos Sur93-101, Sur38-46 y Sur47-56, por medio de ELISPOT; sin embargo, no se detectaron respuestas espedficas de peptido en ninguno de estos pacientes (datos no mostrados).

Identificacion de los epftopos de survivina restringidos a HLA-A11

Union de peptidos derivados de survivina a HLA-A11

55 Se rastreo la secuencia de aminoacidos de la protema survivina para determinar los peptidos nonamericos o decamericos con motivos de union correspondientes al de la superfamilia de HLA-A3, incluyendo HLA-A3 y HLA- A11. Se seleccionaron las secuencias de peptidos con los residuos de anclaje principales, leucina (L) en la posicion 2 y lisina (K) en el extremo C, junto a las secuencias peptfdicas que tuvieran aminoacidos relacionados en estas

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posiciones, segun el algoritmo predictivo de Rammensee y colaboradores (Tabla 4).

Se predijeron trece peptidos a partir de la secuencia de protema de survivina y se analizo la union a HLA-A11 y HLA- A3. Tres de estos peptidos, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 47), Sur54-62 (LAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 42) y Sur112-120 (KIAkEtNNK) (SEQ ID NO: 44) se unieron a HLA-A11 con alta afinidad, comparable con el epftopo vmco del antigeno nuclear 4 de EBV (AvFdRKSDAK) (SEQ ID NO: 63). Ademas, un peptido, Sur112-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO: 51) se unio debilmente a HLA-A11 (Tabla 4).

Respuestas de CTL restringidos a HLA-A11 contra peptidos derivados de survivina en pacientes de cancer

Se probaron los PBL de cinco pacientes de melanoma y dos pacientes de LLC, para determinar la reactividad de celulas T contra los cuatro peptidos de union a HLA-A11, Sur53-62, Sur54-62, Sur112-120 y Sur112-121. Se pudieron detectar respuestas contra el peptido derivado de survivina Sur53-62 en los PBL de dos de los pacientes de melanoma, Mel.A11-1, Mel.A11-2, por medio de ELISPOT (Figura 12). Adicionalmente, se pudieron detectar celulas T espedficas de Sur53-62 entre los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) de un ganglio linfatico infiltrado por tumor en el paciente Mel.A11-2 (Figura 12). En el paciente Mel.A11-1 se observo una fuerte respuesta inmune contra el peptido de survivina Sur53-62 en cinco muestras diferentes de sangre tomadas durante un penodo de 2 anos (datos no mostrados).

Identificacion de los epftopos de survivina restringidos a HLA-A3 Union de peptidos derivados de survivina a HLA-A3

Los peptidos derivados de survivina predichos para la union a la superfamilia de HLA-A3 se analizaron adicionalmente para determinar la union a HLA-A3. Solamente dos de los peptidos, Sur112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO: 44) y Sur112-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO: 57) se unieron a HLA-A3 con alta afinidad, similar a la del epftopo vmco, la nucleoprotema del virus de la gripe A 265-273 (ILRGSVAHK) (SEQ ID NO: 74) (Tabla 4). Ademas, dos peptidos, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 47) y Sur95-103 (ELTLGEFLK) (SEQ ID NO: 43), se unieron debilmente a HLA-A3.

Algunos de los peptidos sin union detectable se modificaron en un intento por aumentar la afinidad de union a HLA- A3. Por tanto, se sintetizaron dos peptidos analogos de Sur54-62 y Sur113-122, en los que un mejor residuo de anclaje, leucina (L), reemplazo a la alanina natural (A) en la posicion 2. Sur54L2 (LLQCFFCFK) (SEQ ID NO: 56) se unio a HLA-A3 con alta afinidad, mientras que Sur113L2 (ILKETNNKKK) (SEQ ID NO: 59) solo se unio debilmente (Tabla 4). Ademas, se sintetizaron cuatro peptidos analogos de Sur5-13, Sur13-22, Sur18-27 y Sur53-61, en donde el residuo de anclaje mejor lisina (K) reemplazo a la fenilalanina natural (F) en el extremo C. Sur5K9 (TLPPAWQPK) (SEQ ID NO: 54) y Sur18K10 (RISTFKNWPK) (SEQ ID NO: 58) se unieron a HLA-A3 con alta afinidad, mientras que las sustituciones no tuvieron un efecto detectable sobre la union a HLA-A3 de Sur13K9 (FLKDHRISTK) (SEQ ID NO: 57) y Sur53K9 (DLAQCFFCK) (SEQ ID NO: 55), comparados con los analogos nativos.

Respuestas de CTL restringidos a HLA-A3 contra peptidos derivados de survivina en pacientes de cancer

Se analizaron nueve muestras de pacientes de melanoma (cinco de PBL y cuatro de TIL) para determinar la reactividad inmune contra los dos peptidos nativos de union a HLA-A3 de alta afinidad Sur112-120 y Sur112-121, asf como contra los dos peptidos nativos de union debil Sur53-62 y Sur95-103. Sin embargo, no se pudieron detectar respuestas inmunes contra estos peptidos mediante ELISPOT en ninguno de los pacientes. Posteriormente, los mismos pacientes se analizaron para determinar la reactividad inmune espontanea contra los tres peptidos modificados derivados de survivina, de alta afinidad, Sur5K9, Sur18K10 y Sur54L2. Se detecto reactividad de CTL contra Sur18K10 en muestras de TIL de tres pacientes, Mel.A3-1, Mel.A3-2, Mel.A3-3 (Figura 13). No se detectaron respuestas contra los otros dos peptidos, Sur5K9 y Sur54L2. Con el fin de verificar adicionalmente estas respuestas, se analizaron PBL de dieciocho pacientes adicionales de melanoma para determinar la reactividad de CTL contra Sur18K10. Entre estos, se encontraron tres pacientes que respondieron, Mel.A3-4, Mel.A3-5 y Mel.A3-6, produciendo un total de seis pacientes que respondieron, entre los veintisiete pacientes analizados (Figura 13).

Identificacion de un epftopo nuevo de survivina restringido a HLA-A2

Union de peptidos 11-meros derivados de survivina a HLA-A2

Se rastreo la secuencia de aminoacidos de la protema survivina para detectar los epftopos peptfdicos 11-meros de HLA-A2 mas probables, utilizando los principales residuos de anclaje espedficos de HLA-A2. Se sintetizaron seis peptidos deducidos de survivina, y se examino su union a HLA-A2. Ninguno de los peptidos examinados se unio con alta afinidad similar a la de un epftopo del control positivo conocido del peptido BMLF280-288 del virus Epstein-Barr (GLCTLVAML) (SEQ ID NO: 72) (Tabla 4). La concentracion de peptido requerida para la recuperacion semi-maxima de HLA-A2 (valor C50) fue de 0,9 |iM para el control positivo. En comparacion, los peptidos Sur18-28 (RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO: 67) y Sur86-96 (FLSVKKQFEEL) (SEQ ID NO: 69), se unieron debilmente a HLA-A2 (C50 = 69 |iM y 72 |iM, respectivamente). Sin embargo, los dos epftopos de survivina restringidos a HLA-A2 conocidos se unieron de manera similar debilmente a HLA-A2; Sur95-104 (ELTLGEFLKL) (SEQ ID NO: 43) se unio con una afinidad intermedia (C50 = 10 |iM), mientras que Sur96-104 (LTLGEFLKL) (SEQ ID NO: 10) se unio solo

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debilmente (C50 >100 |iM). Los cuatro peptidos 11-meros restantes examinados (Sur4-14 (PTLPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 66), Sur54-64 (LAQCFFCFKEL) (SEQ ID NO: 68), Sur88-98 (SVKKQFEELTL) (SEQ ID NO: 70), y Sur103-113 (KLDRERAKNKI) (SEQ ID NO: 74)), no se unieron a HLA-A2.

Respuestas de CTL restringidos a HLA-A2 contra peptidos derivados de survivina en pacientes de cancer

Los PBL de diez pacientes de cancer (dos pacientes de melanoma (Mel), seis de LLC (LLC), y dos de carcinoma de mama (CM)), se analizaron inicialmente para investigar si los dos peptidos 11-meros de union debil, Sur18-28 y Sur86-96, eran presentados por HLA-A2 y reconocidos por el sistema inmune de los pacientes con cancer. Se encontraron respuestas de CTL contra Sur18-28 en PBL de dos de los diez pacientes analizados (LLC-1, LLC-2, figura 14), mientras que no se pudieron detectar respuestas contra Sur86-96 (datos no mostrados). Con el fin de verificar adicionalmente estas respuestas espedficas de Sur18-28, se analizaron PBL de doce pacientes adicionales (siete pacientes de melanoma, uno de LLC y cuatro de carcinoma de mama) para determinar la reactividad de CTL contra este peptido. Entre estos, cuatro pacientes (LLC-3, CM-1, CM-2, Mel.A2-1) teman una actividad inmune espedfica de Sur18-28 detectable mediante ELISPOT (Figura 14). Por consiguiente, en conjunto, los PBL de seis de veintidos pacientes analizados, alojaban una respuesta de CTL contra Sur18-28.

Identificacion de epftopos de survivina restringidos a HLA-B7

Union de peptidos derivados de survivina a HLA-B7

Se rastreo la secuencia de aminoacidos de la protema survivina para determinar los peptidos de nueve a diez aminoacidos, con residuos de anclaje segun el motivo de union de peptido a HLA-B7. Se seleccionaron cinco peptidos y se analizo su capacidad para estabilizar HLA-B7 en el ensayo de ensamblaje. Se estimaron los valores C50 para cada peptido como la concentracion de peptido necesaria para la estabilizacion semi-maxima de HLA-B7 (Tabla 4). Dos peptidos derivados de survivina, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 18) y sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19) estabilizaron HLA-B7 debilmente, con valores C50 por encima de 100 |iM; mientras que sur46-54 (CPTENEPDL) (SEQ ID NO: 6), sur51-59 (EPDLAQCFF) (SEQ ID N0: 7), y sur34-43 (TPERMAEAGF) (SEQ ID NO: 20), no se unieron a HLA-B7 (Tabla 4).

Respuestas de CTL restringidos a HLA-B7 contra peptidos derivados de survivina en pacientes de cancer

Se probaron PBL positivos para HLA-B7 de cinco pacientes de melanoma (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), dos pacientes de LLC (LLC1, LLC54) y dos pacientes de cancer de mama (mama11, mama15), para determinar la reactividad de celulas T contra los peptidos de union debil a HLA-B7, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 18) y sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19). Se pudo detectar una fuerte respuesta espontanea de CTL contra el peptido derivado de survivina sur6-14 en PBL de un paciente de LLC y en un paciente de cancer de mama (Figura 15). Adicionalmente, se pudo detectar una debil respuesta contra este peptido en el paciente de melanoma mel3 (Figura 15).

Sumario de las respuestas inmunes restringidas al alelo de HLA a peptidos derivados de survivina en pacientes de cancer

Se probo la union de una gama de peptidos derivados de survivina que comprendfan de 9 a 11 residuos de aminoacidos, a los siguientes alelos de HLA: HLA-A1, HLA-A3, HLA-A11, y HLA-B7, utilizando el ensayo de ensamblaje para la union del peptido a las moleculas de CMH de clase I descritas en los ejemplos anteriores. Ademas, se probo la capacidad de varios de los peptidos para provocar una respuesta inmune de CTL utilizando el ensayo ELISPOT, tambien como se describe en lo anterior.

En la siguiente Tabla 4, se da un sumario de los resultados, incluyendo los resultados obtenidos en los ejemplos anteriores:

Tabla 4. Datos de C50 y ELISPOT para peptidos derivados de survivina seleccionados

Alelo HLA

Longitud de peptido Posicion Secuencia C50 (|iM) Comentarios SEQ ID NO: Notas

HLA-1

9mero Sur14-22 LKDHRISTF NB 22

Sur51-59 EPDLAQCFF NB 7

Sur38-46 MAEAGFIHC NB 23

Sur93-101 FEELTLGEF >100 24

10mero Sur34-43 TPERMAEAGF NB 20

Sur47-56 PTENEPDLAQ NB 25

Sur49-58 ENEPDLAQCF NB 26

Sur92-101 QFEELTLGEF 2 27

Peptido control C1 VSDGGPNLY 0,8 28

Peptidos modificados Sur14Y9 LKDHRISTY NB 29

sur51Y9 EPDLAQCFY Union debil 9

sur93Y9 FEELTLGEY NB 30

sur92Y9 QFEELTLGEY NB 31

sur34Y9 TPERMAEAGY NB 32

sur49Y9 ENEPDLAQCY NB 33

Sur92T2 QTEELTLGEF 2 34

Sur92S2 QSEELTLGEF 100 35

Sur93T2 FTELTLGEF 1 36

Sur93S2 FSELTLGEF 30 37

Sur38Y9 MAEAGFIHY 0,8 38

Sur47Y10 PTENEPDLAY 0,4 39

HLA-A2

Sur4-14 PTLPPAWQPFL NB 66

Sur18-28 RISTFKNWPFL 69 67

Sur54-64 LAQCFFCFKEL NB 68

Sur86-96 FLSVKKQFEEL 72 69

Sur88-98 SVKKQFEELTL NB 70

Sur103-113 KLDRERAKNKI NB 71

Peptido control EBV,BMLF1 GLCTLVAML 3 72

VIH, Pol ILKEPVHGV 0,2 73

HLA-A3

9mero Sur5-13 TLPPAWQPF NB 40

Sur53-61 DLAQCFFCF NB 41

Sur54-62 LAQCFFCFK NB 42

Sur95-103 ELTLGEFLK >100 43

Sur112-120 KIAKETNNK 2 44

10mero Sur13-22 FLKDHRISTF NB 45

Sur18-27 RISTFKNWPF NB 46

Sur53-62 DLAQCFFCFK 100 47 ii

Sur84-93 CAFLSVKKQF NB 48

Sur101-110 FLKLDRERAK NB 49

Sur103-112 KLDRERAKNK NB 50

Sur112-121 KIAKETNNKK 1 51

Sur113-122 IAKETNNKKK NB 52

Peptido control C3 ILRGSVAHK 0,1-0,3 53

Peptidos modificados Sur5K9 TLPPAWQPK 2 54

Sur53K9 DLAQCFFCK NB 55

Sur54L2 LLQCFFCFK 1 56

Sur13K9 FLKDHRISTK NB 57

Sur18K10 RISTFKNWPK 0,02 58

Sur113L2 ILKETNNKKK >100 59

SurEx3-A3-1 TIRRKNLRK 0,5 60 iii

SurEx3-A3-2 PTIRRKNLRK NB 61

Sur2b-A3-1 RITREEHKK NB 62

Peptido control Gripe A, nucleoprotema 265-273 ILRGSVAHK 0,1 74

HLA-A11

9mero Sur5-13 TLPPAWQPF NB 40

Sur53-61 DLAQCFFCF NB 41

Sur54-62 LAQCFFCFK 0,4 42

Sur95-103 ELTLGEFLK NB 43

Sur112-120 KIAKETNNK 1 44

10mero Sur13-22 FLKDHRISTF NB 45

Sur18-27 RISTFKNWPF NB 46

Sur53-62 DLAQCFFCFK 5 47

Sur84-93 CAFLSVKKQF NB 48

Sur101-110 FLKLDRERAK NB 49

Surl03-112 KLDRERAKNK NB 50

Sur112-121 KIAKETNNKK >100 51 iv

Sur113-122 IAKETNNKKK NB 52

Peptido control C4 AVFDRKSDAK 0,2 63

HLA-B7

9mero Sur6-14 LPPAWQPFL >100 18 v

Sur11-19 QPFLKDHRI >100 19

Sur46-54 CPTENEPDL NB 6

Sur51-59 EPDLAQCFF NB 7

10mero Sur34-43 TPERMAEAGF NB 20

Peptidos control C6 QPRAPIRPI 0,1 64

C7 RPPIFIRRL 0,5 65

1 Se observo una respuesta contra el peptido Sur112-120 en un paciente de linfoma (HEM34) por medio de ELISPOT. ii Se detectaron respuestas contra el peptido Sur53-62 en tres pacientes de linfoma (HEM9, 11, 34) por medio de ELISPOT. iv Se observo una respuesta debil en un paciente de melanoma (FM-TIL95) por medio de ELISPOT. vii Se observo una respuesta contra Sur112-121 en un paciente de melanoma (PM6), mas evidente en 5 suspension de ganglio linfatico metastasico, y mas debil en los TlL del tumor primario y los PBL por medio de ELISPOT.

viii Se observo una respuesta contra el peptido Sur6-14 en un paciente de LLC (LLC9) y se observo una respuesta mas debil en un paciente de linfoma por medio de ELISPOT (HEM21) (datos no mostrados).

Ejemplo 5

10 Procedimientos de ensayo terapeutico utilizando peptidos derivados de survivina como inmunogenos Sumario

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Se vacunaron cinco pacientes de melanoma en fase IV que hadan sido previamente muy tratados, con el epttopo de survivina restringido a HLA-A2 modificado, es decir, el peptido sur1M2, presentado por celulas dendnticas autologas en un marco de uso compasivo. Cuatro de los pacientes produjeron una respuesta fuerte de celulas T a este epttopo, medido mediante el ensayo ELISPOT. Ademas, la tincion in situ con multimero peptido/HLA-A2 revelo la infiltracion de celulas que reaccionaban con survivina tanto en las metastasis viscerales como en las de tejido blando. Notoriamente, no se observo toxicidad asociada con la vacunacion. Los datos demuestran que es factible inducir una respuesta de celulas T contra survivina incluso en pacientes de melanoma en fase tardfa, y que estas vacunaciones se toleran bien.

Materiales y Metodos

Criterios de elegibilidad de pacientes y pauta de tratamiento

Todos los procedimientos clmicos estuvieron de acuerdo con la Declaracion de Helsinki y todos los pacientes proporcionaron el consentimiento informado antes de la terapia. Los pacientes de melanoma cutaneo o uveal en fase IV fueron elegibles cuando su enfermedad era progresiva a pesar de al menos dos ciclos de quimio-, inmuno-, o quimioinmuno-terapia diferentes. Ademas, los pacientes dedan tener 18 anos de edad o mas, expresar HLA-A*0201 y padecer una enfermedad medible validada mediante exploraciones de tomograffa computarizada craneal, toracica y abdominal. El mdice de Karnofsky de los pacientes tema que ser del 60 % o mejor. No se permitio quimio- y/o inmunoterapia sistemica en las 4 semanas antes de la vacunacion. Los criterios de exclusion importantes fueron la evidencia de metastasis al SNC, enfermedades autoinmunes o infecciosas activas, embarazo y lactancia, asf como anormalidad psiquiatrica significativa. Se generaron celulas dendnticas pulsadas con peptidos como se ha descrito anteriormente (82). Brevemente, se aislaron PBMC por leucaferesis con Lymphoprep™ (Mycomed Pharma), se congelaron en almuotas y se almacenaron en nitrogeno lfquido. Una semana antes de la vacunacion, las PBMC se descongelaron, se lavaron y se cultivaron en un medio que contema gentamicina, glutamina y plasma autologo inactivado por calor. Los dfas 1 y 5, se anadieron IL-4 y GM-CSF. Con el fin de diferenciar CD maduras, se anadieron TNF-y y prostaglandina E2 el dfa 6. El dfa 7, las celulas que exhidan caractensticas fenotfpicas y morfologicas de CD maduras, es decir, apariencia en velo y expresion de CD83 = 75 %, se pulsaron con un epttopo modificado derivado de survivina restringido a HLA-A2 de survivinag6-i04, LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 10) (Clinalfa, Suiza) 14. Las celulas solamente se utilizaron para la vacunacion si las pruebas microbiologicas de las muestras tomadas de los cultivos los dfas 1 y 5 demostraron que eran esteriles.

Los pacientes se vacunaron a intervalos de 7 dfas para las dos primeras vacunaciones, seguidos por intervalos de 28 dfas para las vacunaciones adicionales. Se resuspendieron un total de 10-20x106 CD maduras, pulsadas con survivinag6-104 en PBS, que contema seroalbumina humana al 1 % y se inyectaron por via intradermica en almuotas de 1,5x106 CD por sitio de inyeccion en las regiones ventromediales de los muslos cerca de los ganglios linfaticos regionales. Se excluyeron los miembros donde se hubieran eliminado y/o irradiado los ganglios linfaticos de drenaje. Se repitio la leucaferesis despues de 5 vacunaciones en ausencia de un deterioro grave del estado de salud del paciente o de la aparicion de metastasis en el SNC.

Medida de las respuestas ctfnicas e inmunologicas

Se llevaron a cabo exploraciones por TAC antes de la vacunacion y cada tres meses posteriormente o en el caso de signos clmicos graves de evolucion de la enfermedad. Las respuestas inmunologicas se siguieron mediante el ensayo ELISPOT, utilizando las PBMC obtenidas cada tres meses, para detectar la liberacion de IFN-y espedfico de survivinag6-104. Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, las PBMC se estimularon una vez in vitro a una concentracion de 1x106 celulas por ml en placas de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca) en medio x-vivo (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland), suplementado con suero humano inactivado por calor al 5 % y L-glutamina 2 mM en presencia de peptido 10 |iM. Dos dfas despues, se anadio interleuquina-2 recombinante (IL-2) 40 UI/ml (Chiron, Ratingen, Alemania). Despues de 10 dfas se probo la reactividad de las celulas. Para este fin, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Glostrup, Dinamarca) con un anticuerpo anti-IFN-y (1-D1K, Mabtech, Suecia). Se anadieron linfocitos a 104-105 celulas en 200 |il de medio x-vivo por pocillo junto con 104 celulas T2 y los peptidos relevantes a una concentracion final de 2 |iM. Despues de una incubacion durante la noche a 37 °C y de dos lavados, se anadio el anticuerpo de deteccion biotinilado (7-B6-1-Biotina, Mabtech, Suecia); su union espedfica se visualizo utilizando fosfatasa alcalina-avidina junto con el sustrato respectivo (GibcoBRL). La reaccion se termino tras la aparicion de manchas purpura oscuro, que se cuantificaron utilizando el Sistema AlphaImager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE. UU.).

Tambien se siguieron in situ los linfocitos T CD8+ que reaccionan con survivinag6-104/HLA-A*0201, tanto en los sitios de vacunacion como en las metastasis viscerales, de tejido blando o cutaneas, por medio de complejos multimericos survivinag6-104/HLA-A*0201. Los sitios de vacunacion se cortaron 24 horas despues de la inyeccion intradermica en todos los pacientes, mientras que las lesiones metastasicas solamente se retiraron en pacientes seleccionados, si eran facilmente accesibles (pacientes KN y GB) o se retiraron durante un intento curativo (paciente WW). El procedimiento de tincion para los complejos multimericos peptido/CMH se ha descrito recientemente (68). Los complejos multimericos survivinag6-104/HLA-A*0201 se generaron mediante la introduccion de un sitio de reconocimiento para la biotinilacion enzimatica en el extremo 5' de los dominios extracelulares de HLA-A*0201 (residuos 1-275). La protema recombinante se purifico mediante cromatograffa de exclusion molecular (Sephadex

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G25, Pharmacia, Erlangen, Alemania) y de intercambio ionico (mono-Q, Pharmacia) y se plego in vitro mediante dilucion en presencia de los peptidos respectivos y p2-microglobulina. Despues de la filtracion en gel en una columna de Sephadex G25, la protema se multimerizo con estreptavidina-FITC conjugada con moleculas de dextrano (amablemente proporcionadas por L. Winther, DAKO, Copenhague, Dinamarca) para generar complejos multivalentes HLA-dextrano. Las secciones crioconservadas de las muestras respectivas se secaron durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fna durante 5 minutos. Todos los pasos de incubacion se llevaron a cabo en la oscuridad a temperatura ambiente como sigue: (i) 45 minutos de un anticuerpo anti-CD8 (1:100, clon HIT8a, Pharmingen, San Diego, CA), (ii) anticuerpo de cabra anti-raton conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; codigo 115-165-100, Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45 minutos, y finalmente (iii) los multfmeros durante 75 minutos. Entre cada paso los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0,1 %.

Finalmente, los portaobjetos se montaron en Vectashield y se observaron con un Microscopio Confocal Leica (TCS

4D, Leica, Mannheim, Alemania).

Resultados

Caractensticas de los pacientes, toxicidad y evolucion cHnica

Se inscribieron cinco pacientes de melanoma en fase IV muy avanzada, dos que padedan melanoma uveal, uno

melanoma de tejido blando y los dos restantes melanoma cutaneo. Debido a la manifestacion de metastasis

cerebrales sintomaticas un paciente se retiro de la terapia despues de solo dos vacunaciones. Los otros cuatro pacientes recibieron hasta 15 vacunaciones. Un paciente murio de paro cardfaco en un estado libre de tumor despues de la reseccion quirurgica de las metastasis restantes. Otro paciente se retiro de la terapia despues de 10 vacunaciones debido a la aparicion de metastasis viscerales (RW). Un paciente permanecio en el estudio despues de 15 vacunaciones. Las caractensticas detalladas de los pacientes, la terapia previa, el numero de vacunaciones y el estado de supervivencia, se sumario en la Tabla 5.

No se presentaron toxicidades importantes. Por tanto, la hemoglobina, leucocitos y trombocitos, asf como lactato- deshidrogenasa, creatinina y colinesterasa, no estuvieron influenciados por la terapia de vacunacion (Fig. 16). No se observaron signos de toxicidad sistemica o local en los sitios de inyeccion. Ademas, no hubo deteccion de deterioro en la cicatrizacion, trastornos hemorragicos, disfuncion cardfaca, vasculitis o enfermedad inflamatoria del intestino. En un paciente (WW), se pudieron estabilizar las metastasis de tngado previamente existentes con la terapia de vacunacion, pero aun se presento una nueva metastasis suprarrenal. Desafortunadamente, este paciente murio debido a paro cardfaco, incluso aunque estaba libre del tumor despues de la cirugfa curativa. Se detecto una metastasis de cerebro en el paciente PB solo cuatro semanas despues de iniciarse la vacunacion. Por consiguiente, este paciente se tuvo que excluir de vacunaciones adicionales despues de solamente dos inyecciones con CD. Los otros tres pacientes demostraron una evolucion lenta de la enfermedad metastasica sin un deterioro sustancial en su estado general de salud. Notoriamente, para el paciente KN se pudo alcanzar una supervivencia global de 13 meses (desde el inicio de la vacunacion hasta el fallecimiento) a pesar de una pesada carga metastasica y una rapida evolucion de la enfermedad al principio de la vacunacion. El paciente gB permanecio en el protocolo 14 meses despues de iniciarse la vacunacion con CD pulsadas con el peptido de survivina. Sin embargo, se debe observar que ambos pacientes (RW y GB) recibieron un tratamiento localizado adicional para el control del tumor, ya sea radiacion de tumores subcutaneos (RW) o quimioterapia local (GB).

Respuestas de celulas T CD8+ espedficas de survivina

Con el fin de seguir la cinetica de las respuestas de celulas T citotoxicas, se probaron PBMC obtenidas antes de y tres meses despues de la vacunacion para determinar su reactividad al epftopo modificado de survivinag6-104 mediante ELISPOT para IFN-y. Antes del analisis, las PBMC se estimularon una vez in vitro para aumentar la sensibilidad de este ensayo. En los cuatro pacientes ensayados, fue evidente una induccion de celulas T reactivas con survivinag6-104 (Fig. 17). El analisis de la reactividad a otros peptidos de survivina restringidos a HLA-A*0201, es decir, survivinag6-104 no modificado y el epftopo adyacente Sur9, demostro una respuesta de celulas T contra estos peptidos en dos de los pacientes (KN y RW) (datos no mostrados).

Se ha cuestionado repetidamente el valor pronostico y clrnico de las mediciones de las respuestas de celulas T espedficas de tumor en sangre periferica; por lo tanto, tambien se probo la presencia de linfocitos T CD8+ reactivos con survivinag6- WHLA-A*0201 entre los linfocitos infiltrantes de tumor in situ, mediante tincion con multimero peptido/CMH. Con el fin de validar el metodo, primero se analizaron muestras de tejido de reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado que se presentaron en el sitio de la vacunacion en 24 horas. Este analisis confirmo las observaciones anteriores de que las inyecciones intradermicas de CD pulsadas con peptido inducen un fuerte infiltrado de celulas T inflamatorias espedficas del peptido. Posteriormente, se aplico el procedimiento de tincion con multimero peptido/CMH en metastasis de tejido blando y viscerales, que revelo la presencia de celulas reactivas con survivinag6-104/HLA-A*0201 entre el infiltrado de CD8+. Esta observacion sugiere que la vacunacion no solo induce celulas T con la especificidad deseada, sino que tambien las dota con la capacidad necesaria de migracion dirigida.

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Tabla 5. Sumario de ensayos de vacunacion: caracteristicas de los pacientes

Paciente

Edad/sexo Tiempo desde el tumor primario a fase IV Terapia previa Enfermedad medible Desenlace clmico No. de vacunaciones Supervivencia tras la primera vacunacion*

GB

40/mujer 4 anos, 8 meses LITT, fotemusina/IL- 2IFNa, treosulfano/ gemcitabina hngado PD (crecimiento lento de lesiones hepaticas previas y nuevas, nuevas metastasis a pancreas y pleurales) 15 +14 meses

KN

53/hombre 11 anos IL-2IFNa/histamina, fotemustina, treosulfano/ gemcitabina hngado, rinon, tejido blando, hueso PD (crecimiento lento de lesiones previas, nuevas lesiones en ganglios linfaticos, pleurales y mediastinales) 13 13 meses

WW

73/hombre 14 meses cirug^a, vacunacion con CD, decarbazina hngado PD (metastasis hepatica estable, pero suprarrenales nuevas) 12 12 meses debido a embolia posquirurgica

RW

72/hombre 16 anos cirugfa, radioterapia, adriblastina/ifosfamida, ixoteno, decarbazina, TNF/melfalan tejido blando PD (crecimiento de metastasis anteriores y nuevas en tejido blando; deteccion de metastasis de corazon, pulmon y musculo tras 12 vacunaciones) 12 +12 meses

PB

52/hombre 2 anos, 3 meses radioterapia pulmon, rinon PD (nuevas metastasis de piel y cerebro) 2 4 meses

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LISTADO DE SECUENCIAS

<110> Straten, Eivind Per Thor Andersen, Mads Hald

<120> PEPTIDOS DERIVADOS DE SURVIVINA Y USO DE LOS MISMOS

<130> 31757EP01

<150> US 60/352.284

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<170> FastSEQ para Windows version 4.0 <210> 1 <211>9 <212> PRT

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<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 67

Arg lie Ser Thr Phe Lys Asn Trp Pro Phe Leu 15 10

<210> 68

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 68

Leu Ala Gin Cys Phe Phe Cys Phe Lys Glu Leu 15 10

<210> 69

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 69

Phe Leu Ser Val Lys Lys Gin Phe Glu Glu Leu 15 10

<210> 70 <211> 11

5

10

15

20

25

30

<212> PRT

<223> Peptido Sur53K9 <400> 70

Ser Val Lys Lys Gin Phe Glu Glu Leu Thr Leu 15 10

<210> 71

<211> 11

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 71

Lys Leu Asp Arg Glu Arg Ala Lys Asn Lys lie 15 10

<210> 72 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 72

Gly Leu Cys Thr Leu Val Ala Met Leu 1 5

<210> 73

<211>8

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 73

Leu Lys Glu Pro Val His Gly Val 1 5

<210> 74

<211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial

5

10

15

20

25

30

<223> Peptido Sur53K9 <400> 74

<210> 75

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 75

Arg Leu Gin Glu Glu Arg Thr Cys Lys Val 15 10

<210> 76

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 76

Gin Leu Cys Pro lie Cys Arg Ala Pro Val 15 10

<210> 77

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 77

Arg Leu Ala Ser Phe Tyr Asp Trp Pro Leu 15 10

<210> 78

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

5

10

15

20

25

30

<223> Peptido Sur53K9 <400> 78

Leu Leu Arg Ser Lys Gly Arg Asp Phe Val 15 10

<210> 79

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 79

Val Leu Glu Pro Pro Gly Ala Arg Asp Val 15 10

<210> 80

<211> 10

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 80

Pro Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu 15 10

<210> 81 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 81

Ser Leu Gly Ser Pro Val Leu Gly Leu 1 5

<210> 82 <211>9 <212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 82

5

10

15

20

25

Gin lie Leu Gly Gin Leu Arg Pro Leu 1 5

<210> 83

<211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 83

Leu Thr Ala Glu Val Pro Pro Glu Leu 1 5

<210> 84

<211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 84

Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu 1 5

<210> 85

<211>9

<212> PRT

<213> Secuencia artificial <220>

<223> Peptido Sur53K9 <400> 85

Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Val 1 5

Claims (17)

1. 5

   10
2. 2.
3. 3. 15
4. 4.
5. 5.

   20 6. 7.

   25

   30
6. 8.

   35

   40
7. 9.
8. 10.

   45 11.
9. 12.

   REIVINDICACIONES

   Un peptido epftopo restringido a CMH de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epftopo la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes caractensticas:

   (i) es capaz de unirse a la molecula de HLA de clase I con una afinidad medida por la cantidad del peptido que es capaz de tener la mitad de la recuperacion maxima de la molecula de HLA de clase I (valor C50) que es como maximo de 50 |iM como se determina mediante ensayo de estabilizacion de HLA,

   (ii) es capaz de inducir celulas productoras de IFN-y en una poblacion de PBL de un paciente de cancer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL como se determina mediante un ensayo ELISPOT, y/o

   (iii) es capaz de deteccion in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el peptido epftopo,

   para su uso como un medicamento.

   Un peptido segun la reivindicacion 1 para su uso como un medicamento, en el que dicho peptido es capaz de unirse a la molecula de HLA-A1 de clase I.

   Un peptido segun la reivindicacion 1 o 2 para su uso como un medicamento, teniendo dicho peptido un valor C50 que es como maximo de 30 |iM.

   Un peptido segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como un medicamento, teniendo dicho peptido un valor C50 que es como maximo de 20 |iM.

   Un peptido segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como un medicamento, comprendiendo dicho peptido como maximo 20 residuos de aminoacidos.

   Un peptido segun cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como un medicamento, comprendiendo dicho peptido como maximo 10 residuos de aminoacidos.

   Un peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes para su uso como un medicamento, siendo dicho peptido capaz de

   (i) inducir celulas productoras de IFN-y en una poblacion de PBL de un paciente de cancer a una frecuencia de al menos 10 por 104 PBL; y/o

   (ii) inducir celulas productoras de IFN-y en una poblacion de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina, tal como una enfermedad cancerosa seleccionada del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyetico incluyendo leucemia linfatica cronica y leucemia mieloide cronica, melanoma, cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de pancreas y cancer de prostata.

   Una composicion farmaceutica que comprende un peptido epftopo restringido a CMH de clase I derivado de survivina, teniendo dicho epftopo la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes caractensticas:

   (i) es capaz de unirse a la molecula de HLA de clase I con una afinidad medida por la cantidad del

   peptido que es capaz de tener la mitad de la recuperacion maxima de la molecula de HLA de clase I (valor

   C50) que es como maximo de 50 |iM como se determina mediante ensayo de estabilizacion de HLA,

   (ii) es capaz de inducir celulas productoras de IFN-y en una poblacion de PBL de un paciente de cancer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL como se determina mediante un ensayo ELISPOT, y/o

   (iii) es capaz de deteccion in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el peptido epftopo, y un portador farmaceuticamente aceptable.

   Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 8, teniendo dicho peptido un valor C50 que es como maximo de 30 |iM.

   Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 8 o 9, teniendo dicho peptido un valor C50 que es como maximo de 20 |iM.

   Una composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 10 precedentes,

   comprendiendo dicho peptido como maximo 20 residuos de aminoacidos.

   Una composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 11 precedentes,

   5

   10

   15

   20

   25

   comprendiendo dicho peptido como maximo 10 residuos de aminoacidos.
10. 13. Una composicion farmaceutica segun cualquiera de las reivindicaciones 8 a 12 precedentes, siendo dicho peptido capaz de

    (i) inducir celulas productoras de IFN-y en una poblacion de PBL de un paciente de cancer a una frecuencia de al menos 10 por 104 PBL; y/o

    (ii) inducir celulas productoras de IFN-y en una poblacion de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina, tal como una enfermedad cancerosa seleccionada del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyetico incluyendo leucemia linfatica cronica y leucemia mieloide cronica, melanoma, cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de pancreas y cancer de prostata.
11. 14. Una composicion farmaceutica segun las reivindicaciones 8-13, siendo dicha composicion una formulacion de liberacion con el tiempo.
12. 15. Una composicion farmaceutica segun las reivindicaciones 8-14, que comprende ademas un peptido restringido a una molecula de HLA-A y un peptido restringido a una molecula de HLA-B, y opcionalmente un peptido restringido a una molecula de HLA-C.
13. 16. Una composicion farmaceutica que comprende un peptido segun cualquiera de las reivindicaciones 1-7 y un portador farmaceuticamente aceptable, para su uso como un medicamento.
14. 17. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 16 para su uso como un medicamento, siendo dicha composicion una formulacion de liberacion con el tiempo.
15. 18. Una composicion farmaceutica segun la reivindicacion 16 para su uso como un medicamento, comprendiendo adicionalmente dicha composicion un peptido restringido a una molecula de HLA-A y un peptido restringido a una molecula de HLA-B, y opcionalmente un peptido restringido a una molecula de HLA-C.
16. 19. Un peptido segun una cualquiera de las reivindicaciones 1-7, para su uso en el tratamiento de cancer.
17. 20. Un peptido segun la reivindicacion 19 para su uso en el tratamiento de cancer, en el que dicho cancer se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyetico incluyendo leucemia linfatica cronica y leucemia mieloide cronica, melanoma, cancer de mama, cancer cervical, cancer de ovario, cancer de pulmon, cancer de colon, cancer de pancreas y cancer de prostata.