JP2015134762A

JP2015134762A - スルビビン誘導ペプチドおよびその使用

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Publication number: JP2015134762A
Application number: JP2015011806A
Authority: JP
Inventors: エイヴィン・ペール・トール・ストラテン; Eivind Per Thor Straten; マス・ハル・アナセン; Mads Hald Andersen
Original assignee: Survac ApS
Current assignee: Survac ApS
Priority date: 2003-01-30
Filing date: 2015-01-23
Publication date: 2015-07-27
Anticipated expiration: 2024-01-30
Also published as: ES2661082T3; JP5931585B2; CN103288920B; ES2633389T3; HK1134030A1; ES2529203T3; NO344833B1; EP2857035A1; JP5509185B2; JP2012082213A; HK1209050A1; NO20181511A1; JP2012211140A; NO343244B1; NO20170133A1; EP2857035B1; HK1209049A1; JP6021961B2; PT2359841E; DK2359841T3

Abstract

【課題】医薬用の、腫瘍関連抗原スルビビンから誘導されるＭＨＣクラスＩ限定エピトープペプチドを提供する。【解決手段】アミノ酸配列ＬＰＰＡＷＱＰＦＬを有し、以下の特性：（ｉ）クラスＩＨＬＡ分子を最大半分まで回復できるペプチドの量により測定される親和力（Ｃ５０値）（アセンブリー結合検定により測定すると最大５０μＭである）で限定されるクラスＩＨＬＡ分子との結合能；（ｉｉ）癌患者のＰＢＬ集団においてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定すると少なくとも１／１０４ＰＢＬの頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を惹起する能力；および／または（ｉｉｉ）エピトープペプチドと反応するＣＴＬの腫瘍組織におけるインサイチュ検出能；のうちの少なくとも一つを有する、ＭＨＣクラスＩ限定エピトープペプチド。【選択図】なし

Description

（技術分野）
本発明はスルビビン誘導ペプチドならび特に癌における診断および治療目的でのその使用に関する。特に、新規ペプチドは、インサイチュおよびエクスビボ応答をはじめとする、癌患者における細胞傷害性Ｔ細胞応答を惹起できるＭＨＣクラスＩ限定Ｔ細胞エピトープである。特に、かかる新規ペプチドは、認識されている腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）であるアポトーシス阻害タンパク質スルビビンから誘導される。

（背景技術）
哺乳動物免疫系が外来または異質物質を認識し、これと反応するプロセスは複雑である。この系の重要なファクターは、Ｔ細胞応答である。この応答は、Ｔ細胞が、ヒト主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）を構成するヒト白血球抗原（ＨＬＡ）と称する細胞表面分子、およびペプチドの複合体を認識し、これと相互作用することを必要とする。ペプチドは、ＨＬＡ／ＭＨＣ分子を提示する細胞により処理されるさらに大きな分子から誘導される。Ｔ細胞とＨＬＡ／ペプチド複合体の相互作用は限定され、ＨＬＡ分子とペプチドの特定の組み合わせについて特異的であるＴ細胞を必要とする。特異的Ｔ細胞が存在しないならば、そのパートナー複合体が存在するとしてもＴ細胞応答は存在しない。同様に、特異的複合体が存在しないならば、応答は存在しないが、Ｔ細胞は存在する。

Ｔ細胞が細胞の異常を認識するメカニズムは癌においても関連する。例えば、ＷＯ９２／２０３５６において、処理されてペプチドになり、これを次に細胞表面上で発現させて、特異的ＣＴＬにより腫瘍細胞の消散につながり得る遺伝子のファミリーが開示されている。これらの遺伝子は、ＭＡＧＥファミリーと呼ばれ、「腫瘍拒絶抗原前駆体」または「ＴＲＡＰ」分子をコードするとされ、これから誘導されるペプチドは「腫瘍拒絶抗原」または「ＴＲＡ」と呼ばれる。
ＷＯ９４／０５３０４において、ＨＬＡ−Ａ１分子と結合するノナペプチドが開示されている。該文献は、特定のＨＬＡ分子についての特定のペプチドの特異性がわかっているならば、特定のペプチドは１つのＨＬＡ分子と結合するが、他のものとは結合しないと予想される。これは、異なる個体は異なるＨＬＡ表現型を有するので明らかである。その結果、特定のペプチドが特異的ＨＬＡ分子のパートナーであるということの検証は、診断および治療的効果があるが、これらは特定のＨＬＡ表現型を有する個体についてのみ顕著である。

ＭＨＣ分子により提示されるいくつかのペプチドが特徴づけられており、これらのいくつかはＨＬＡ−ペプチド複合体の機能におそらくは影響を及ぼし得る転写後修飾を有し得る。従って、多くの研究が、悪性形質転換に関するリン酸化のパターンにおける変化と関連する。さらに、リン酸化は、クラスＩＭＨＣに結合するペプチドに対して、中性、負または正の影響さえも及ぼし、ホスホペプチド特異性ＣＴＬ（ペプチドのリン酸化と非リン酸化バージョンを区別）を生成することができ、このようなＣＴＬは多分クラスＩＭＨＣ限定ＣＴＬレパートリーの一部であることが示されている。最近、リン酸化ペプチドは実際に自然に処理され、インビボでＭＨＣクラスＩ分子により提示されることが示されている。さらに、いくつかの異なるＥＢＶ−形質転換されたＢ−細胞から単離されたクラスＩ分子からの抽出物中のリン酸化ペプチドの存在が立証されている。

従って、腫瘍関連抗原（ＴＡＡ）から誘導されるペプチドエピトープはＭＨＣ分子との関連で細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）により抗原として認識することができる（１）。しかしながら、全部でなくてもほとんどの腫瘍は抗原性であることが一般に認識されているが、腫瘍進行が免疫系により容易に制御されるという意味でごくわずかしか実際には免疫原性でない。
この限界を克服するために、例えばＴＡＡ−誘導ペプチドでのワクチン接種などいくつかの免疫治療試験が開始された。最大数のＣＴＬ規定ＴＡＡが特徴づけられている腫瘍である黒色腫に関して、抗原に対する強力なＣＴＬ応答がワクチン接種により惹起され、一部の患者は完全に疾患が寛解した（２，３）。しかしながら、これらのワクチン接種試験において用いられるほとんどのペプチドエピトープはメラニン細胞特異性であり、これらのペプチドは非メラニン細胞起源の腫瘍に適用できない。さらに、これらのＴＡＡの発現は異なる患者から得られる腫瘍間で異質であり、ある患者からの転移間でさえも異なり得る。しかしながら、この数年で、多くの異なる癌において発現される多くの腫瘍特異性ペプチド抗原、すなわち、ＨＥＲ−２（４）、Ｍｕｃ−１（５）およびテロメラーゼ（６）が同定されている。

適切な操作により、腫瘍中に存在する腫瘍抗原を免疫系に暴露することができることも示されている。研究により、免疫応答のＣＤ８＋ＣＴＬアームは、単独またはＣＤ４＋Ｔ_ｈ細胞との組み合わせにおいて、適応的免疫反応の主要な抗腫瘍エフェクターアームを構成することが示されている。これまで、免疫反応のＣＴＬアームに主に焦点が当てられてきた。しかしながら、ＣＤ４Ｔ細胞反応が腫瘍拒絶において、特に誘導期またはインビボでのＣＴＬ反応の延長において重要な役割を果たすことがますます明らかになってきている。従って、クラスＩＩ限定腫瘍抗原を有効な腫瘍ワクチン接種プロトコル中に組み入れることにより、ワクチンの有効性が増大し得る。
アポトーシスは細胞の自殺の遺伝子プログラムであり、アポトーシスの阻害は、形質転換突然変異の蓄積に有利な細胞のライフスパンを延長することにより、癌の形成に関与する重要なメカニズムであることが示唆されている（７）。スルビビンはアポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）のファミリーの最近同定されたメンバーである。約４００００００の転写物の世界的な遺伝子発現分析において、スルビビンは多くの種類の癌において常に増加調節されるが、正常組織においては増加調節されないトップ遺伝子の一つとして同定された。スルビビンを過剰発現する充実性悪性腫瘍は、肺、結腸、乳房、膵臓、および前立腺ならびに造血性悪性腫瘍を包含する（９）。さらに、一連の黒色腫および非黒色腫皮膚癌は常にスルビビン陽性であることが報告されている（１０、１１）。ほとんどのヒトの癌におけるスルビビンの過剰発現は、腫瘍進行におけるアポトーシス阻害の一般的役割を示唆し、これは結腸直腸および膀胱癌、ならびに神経芽種の場合において、スルビビンの発現は望ましくない予後と関連するという観察により実証される概念である。対照的に、スルビビンは正常な成人組織において検出不可能である。これらの特徴は、スルビビンを診断および治療目的の両方について適当なＴＡＡとして適格とする。

従って、この１０年で、主要組織適合性複合体（ＭＨＣ）に限定された方法でＣＴＬにより認識される多くのＴＡＡが同定された。スルビビンはほとんどのヒト癌において過剰発現され、その機能を阻害するとアポトーシスが増大するので、このタンパク質は治療ＣＴＬ応答の標的としての働きをする。スルビビンタンパク質およびその有効な診断および治療的使用は、（８）および米国特許第６２４５５２３号に開示されており、これらは出典明示により本発明の一部として参照される。スルビビンは、１つのＢＩＲおよび高度に荷電したカルボキシ末端コイル化領域をＲＩＮＧフィンガーの代わりに含有する１６．５ｋＤａ細胞質タンパク質であり、Ｂ細胞前駆体中に移された場合に、これは成長因子（ＩＬ−３）離脱により誘発されたアポトーシスを阻害する。スルビビンをコード化する遺伝子は、エフェクター細胞プロテアーゼレセプター−１（ＥＰＲ−１）の配列とほぼ同一であるが、反対方向に配向し、このことは、相対した配置において複製された２つの別個の遺伝子の存在を示唆する。従って、スルビビンはアンチセンスＥＰＲ−１産物として記載することができる。機能的に、その天然のアンチセンスＥＰＲ−１転写物を増加調節することによりスルビビン発現を阻害すると、大規模なアポトーシスが起こり、細胞成長が減少する。

米国特許第６２４５５２３号は、精製されたスルビビンの単離を開示し、これはスルビビンタンパク質をコード化する核酸分子、ならびにスルビビンと結合する抗体および他の分子を提供する。米国特許第６２４５５２３号はまた、スルビビンタンパク質の抗アポトーシス的に活性なフラグメントおよびその変異体を開示し、ここにおいて、アミノ酸残基が開示されたスルビビン配列のＮ−またはＣ−末端または配列内に挿入されている。かかるペプチドはアポトーシスに必要とされる重要な機能的残基、すなわち、６７位にＴｒｐ、７３位にＰｒｏおよび８４位にＣｙｓを含有することが特に開示されている。
本発明は、ＭＨＣクラスＩ限定ペプチドが、スルビビンタンパク質から誘導できるという知見に基づき、これはＭＨＣクラスＩＨＬＡ分子と結合することができ、これにより広範囲におよぶ癌疾患にかかっている患者において、エクスビボおよびインサイチュＣＴＬ免疫反応の両方を惹起する。これらの知見は、細胞により処理されて、ＴＲＡ機能を有するペプチドになるＴＲＡＰ分子としてスルビビンが作用することを強力に示唆する。明らかに、これらの知見は、スルビビンが腫瘍細胞により一般的に発現されるようであるという事実のために、一般的に癌疾患の抑制に適用可能である新規治療および診断法を可能にする。

国際公開第９２／２０３５６号パンフレット国際公開第９４／０５３０４号パンフレット米国特許第６２４５５２３号明細書

（発明の開示）
従って、本発明はその第一の態様において、スルビビンから誘導されるＭＨＣクラスＩ限定エピトープペプチドに関し、前記エピトープは以下の特徴の少なくとも１つを有する：
（ｉ）これがクラスＩＨＬＡ分子の最大の半分まで回復できるペプチドの量により測定される親和力（Ｃ_５０値）（本明細書に記載するようなアセンブリー結合検定により測定すると最大５０μＭである）で限定されるクラスＩＨＬＡ分子と結合できる、
（ｉｉ）癌患者のＰＢＬ集団においてＥＬＩＳＰＯＴアッセイで測定すると少なくとも１／１０^４ＰＢＬの頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を惹起できる、および／または
（ｉｉｉ）エピトープペプチドと反応するＣＴＬの腫瘍組織においてインサイチュ検出が可能である。

好ましくは、本発明のペプチドはこれらの３つの特性のうち少なくとも２つ、最も好ましくは全てを有する。
本発明のさらに別の態様は、医薬組成物およびＰＢＬ中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性細胞の癌患者における存在のエクスビボまたはインサイチュ診断のための組成物であって、前記定義のペプチドを含む組成物を提供する。
さらに別の態様において、本発明は、ＰＢＬ中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性Ｔ細胞の癌患者における存在のエクスビボまたはインサイチュ診断のための診断キットであって、本発明のペプチド、およびかかるペプチドとクラスＩＨＬＡ分子またはかかる分子のフラグメントの複合体を含むキットに関する。

もう一つ別の態様において、癌患者においてスルビビン反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法であって、腫瘍組織または血液サンプルを前記定義の複合体と接触させ、該複合体の該組織または該血液細胞との結合を検出することを含む方法も提供される。
さらに別の態様において、本発明は、本発明のペプチド、例えば抗体またはそのフラグメント、およびかかる分子の結合をブロックできる分子と特異的に結合できる分子に関する。
本発明の重要な態様は、癌の治療用医薬を調製するための本発明のペプチドの使用に関する。さらに別の態様は、前記の組成物または分子の、癌の治療用医薬の調製のための使用に関する。
さらに別の態様は、独立して、哺乳動物、例えばヒトにおける癌を治療する方法であって、疾患にかかっている患者に有効量の本発明のペプチド、組成物または分子を投与することを含む方法に関する。

患者ＣＬＬ１におけるＥＬＩＳＰＯＴにおいて測定される、ペプチドなし、Ｓｕｒ１（ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号１０）ペプチドおよびＳｕｒ９（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号３）ペプチドに対するＴ細胞応答を示す。ペプチドなし、ペプチド類似体Ｓｕｒ１Ｌ２（ＬＬＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号４）、およびペプチド類似体Ｓｕｒ１Ｍ２（ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号５）に対する患者ＣＬＬ１におけるＥＬＩＳＰＯＴにおいて測定されるＴ細胞応答を示す。ペプチドなし（黒）、Ｓｕｒ１（ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号１０）ペプチド（灰色）、Ｓｕｒ９（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号３）ペプチド（白）、類似ペプチドＳｕｒ１Ｌ２（ＬＬＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号４）（淡灰色）、および類似ペプチドＳｕｒ１Ｍ２（ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号５）（暗灰色）に対する患者ＣＬＬ２およびＣＬＬ３におけるＥＬＩＳＰＯＴにおいて測定される応答を示す。インビトロで一度刺激し、ペプチドなし（黒）、ペプチドＳｕｒ１（ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号１０）（灰色）およびＳｕｒ９（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号３）（白）に対する応答についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて分析された患者Ｍｅｌ１、Ｍｅｌ２、およびＭｅｌ３からの腫瘍浸潤リンパ節から単離されたＴ細胞を表す。スルビビン特異性ＣＴＬの機能的活性を示す。乳ガン患者からのＢＰＬにおけるスルビビン反応性ＣＴＬの頻度を示す。スルビビン誘導ペプチドのＨＬＡ−３５結合およびスルビビン誘導ペプチドによるＨＬＡ−Ｂ３５分子のペプチドによる回復の分析である。癌患者からのＰＢＬにおいて観察される自発的Ｔ細胞応答を示す。Ａ）患者ＣＬＬ５（１０^５細胞／ウェル）、ＨＥＭ１２（１０^５細胞／ウェル）、およびＨＥＭ８（５×１０^４細胞／ウェル）からのインビトロで刺激されたＰＢＬ中、ペプチド無し（白）、ｓｕｒ５１−１９（黒）またはｓｕｒ４６−５４（灰色）を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて測定されたＩＦＮγスポット形成細胞の数。Ｂ）ペプチドパルス化成熟自己樹状細胞とともに１０日間培養された、ＨＥＭ１２からの１．７×１０^５ＰＢＬ中のスポット形成細胞の数。黒色腫患者における天然および修飾スルビビンペプチドに対する自発的Ｔ細胞応答を表す。Ａ）ＰＢＬ（４×１０^３細胞／ウェル）およびＴＩＬ（７×１０^４細胞／ウェル）中患者ＦＭ２５からのｓｕｒ５１−５９およびｓｕｒ５１Ｙ９ならびにＦＭ４５（１０^４細胞／ウェル）からのＴＩＬに対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて測定されるスポット形成細胞の数。ＨＬＡ−Ａ１に対するスルビビン誘導ペプチドの結合親和力を示す。ＨＬＡ−Ａ１限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ＨＬＡ−Ａ１１限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ＨＬＡ−Ａ３限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ＨＬＡ−Ａ２限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的Ｔ細胞応答を表す。４人の患者（▲ＲＷ、●ＫＮ、−ＷＷＥ、■ＧＢ）のワクチン治療後のＬＤＨ、コリンエステラーゼ、クレアチニン。ヘモグロビン、白血球および血小板の安定な検出の実験値を示す。ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価されるスルビビンペプチドの免疫性の動態分析を示す。

（発明の詳細な記載）
本発明の新規ＭＨＣクラスＩ限定ペプチドは、いくつかの特徴のうちの少なくとも１つを有することにより特徴づけられ、その一つは、本明細書において記載されるようなアセンブリーアッセイにおいてクラスＩＨＬＡ分子の最大の半分を回復することができるペプチドの量（Ｃ_５０値）により測定される場合、最大で５０μＭの親和力に限定されるクラスＩＨＬＡ分子と結合できる能力である。このアセンブリーアッセイは、既に記載されているようにして行われ（１２、１３）、ペプチドをペプチドトランスポーター欠損細胞系Ｔ２にロードした後のＨＬＡ分子の安定化に基づく。その後、正しく折り畳まれた安定なＨＬＡ重鎖を、構造依存性抗体を用いて免疫沈降させ、ペプチド結合を定量化する。
このアッセイは、前記親和性で所定のＨＬＡ対立分子と結合するその能力について候補ペプチドをスクリーニングするための簡単な手段を提供する。好ましい具体例において、本発明のペプチドは、最高３０μＭのＣ_５０値を有するもの、例えば、最高１０μＭ、最高５μＭ、最高２μＭを包含する、最高２０μＭであるＣ_５０値を有するものである。

前記のように、ＨＬＡ系は、ヒト主要組織適合（ＭＨＣ）系を表す。一般に、ＭＨＣ系は一連の特徴：移植抗原、胸腺依存性免疫応答、ある種の相補因子およびある疾患の素因を制御する。さらに詳細には、ＭＨＣは、ＭＨＣのさらに一般的な特徴を決定する３種の異なる種類の分子、すなわち、クラスＩ、ＩＩおよびＩＩＩ分子をコード化する。これらの分子のうち、クラスＩ分子は、ほとんどの有核細胞および血小板の表面上に提示されるいわゆるＨＬＡ−Ａ、ＨＬＡ−ＢおよびＨＬＡ−Ｃ分子である。
本発明のペプチドは、特定のＭＨＣクラスＨＬＡＩ分子と結合する（限定される）その能力により特徴づけられる。従って、一具体例において、ペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ９、ＨＬＡ−Ａ１０、ＨＬＡ−Ａ１１、ＨＬＡ−Ａｗ１９、ＨＬＡ−Ａ２３（９）、ＨＬＡ−Ａ２４（９）、ＨＬＡ−Ａ２５（１０）、ＨＬＡ−Ａ２６（１０）、ＨＬＡ−Ａ２８、ＨＬＡ−Ａ２９（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３０（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３１（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａ３２（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３３（ｗ１９）、ＨＬＡ−Ａｗ３４（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ３６、ＨＬＡ−Ａｗ４３、ＨＬＡ−Ａｗ６６（１０）、ＨＬＡ−Ａｗ６８（２８）、ＨＬＡ−Ａ６９（２８）をはじめとするＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ａ分子に限定されるものである。文書全体にわたってさらに簡単な記号表示も用いられ、ここにおいて、主に数字の標記、例えばＨＬＡ−Ａ１９またはＨＬＡ−Ａ２４がそれぞれＨＬＡ−Ａｗ１９およびＨＬＡ−Ａ２４（９）の代わりに使用される。特定の具体例において、本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＨＬＡ種に限定される。

本発明のペプチドは、スルビビンの既知の配列、例えば米国特許第６２４５５２３号に開示されている配列から誘導される。特定のＨＬＡ分子と結合する能力を潜在的に有するペプチドの選択は、特定のＨＬＡ分子と結合する既知の配列の整列により行うことができ、これによりいくつかの関連するアミノ酸のペプチドにおける特定の位置での優位性が明らかになる。このような優勢アミノ酸残基は、本明細書において「アンカー残基」または「アンカー残基モチーフ」とも称する。アクセス可能なデータベースにおいて見いだすことができる既知の配列データに基づくこのような比較的簡単な手順にしたがって、ペプチドを特定のＨＬＡ分子と結合しそうなスルビビンタンパク質分子から誘導することができる。一連のＨＬＡ分子についてのこのような分析の代表例を以下の表に示す：

このように、例として、ＨＬＡ−Ａ１と結合する能力を潜在的に有するノナペプチドは以下の配列のうちの一つを有する：Ｘａａ−Ｔ−Ｄ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌ−Ｘａａ−Ｙ、Ｘａａ−Ｔ−Ｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌ−Ｘａａ−Ｙ；Ｘａａ−Ｓ−Ｄ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌ−Ｘａａ−ＹまたはＸａａ−Ｓ−Ｅ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｘａａ−Ｌ−Ｘａａ−Ｙ（Ｘａａは任意のアミノ酸残基を示す）。同様に、任意の他のＨＬＡ分子と結合する能力を潜在的に有する配列を設計することができる。
当業者は、所定のＨＬＡ分子のさらに別の「アンカー残基モチーフ」を同定することができるであろうと理解される。
従って、有用な具体例において、本発明のペプチドは、その配列が表中に示す特定のＨＬＡ対立遺伝子のそれぞれについて、表中に示すようなアミノ酸残基の任意のものを含むペプチドを包含する。

従って、本発明のペプチドを同定するための簡単な方法は：特定のＨＬＡ分子、例えば所定の集団中に高い割合で存在するものを選択し、スルビビンタンパク質において「アンカー残基モチーフ」を同定するために前記の様な配列分析を行い、１以上の同定されたアンカー残基を含む適当なサイズのペプチドを単離または構築し、得られるペプチドを（ｉ）本明細書において既に記載したようなアセンブリーアッセイを用いて特定のＨＬＡ分子と結合する能力、（ｉｉ）本明細書において既に記載したようなＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定すると少なくとも１／１０^４ＰＢＬの頻度で癌患者のＰＢＬ集団においてＩＮＦ−γ産生細胞を惹起するペプチドの能力、および／または（ｉｉｉ）試験されるエピトープペプチドと反応性である腫瘍組織ＣＴＬにおいてインサイチュで検出されるペプチドの能力について試験する工程を含む。

特定の具体例において、本発明のペプチドは、次から選択される配列を有するＨＬＡ−Ａ２限定スルビビン誘導ペプチドである：ＦＬＫＬＤＲＥＲＡ（ｓｕｒｖｉｖｉｎ_{１０１−１０９}）（配列番号１）、ＴＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（スルビビン_５−１４）（配列番号２）、ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（スルビビン_{９５−１０４}）（配列番号３）、ＬＬＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号４）およびＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号５）。（かっこ内の表示は、米国特許第６２４５５２３号に開示されているようなスルビビンにおける残基の位置を示す）。ＬＬＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号４）は、ペプチドの２位における「Ｔ」を「Ｌ」と置換することにより得られるスルビビン_{９６−１０４}から誘導される配列であり、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号５）は、２位の「Ｔ」を「Ｍ」で置換することによりスルビビン_{９６−１０４}から誘導される。

さらに別の有用な具体例において、本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ｂ５、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１２、ＨＬＡ−Ｂ１３、ＨＬＡ−Ｂ１４、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ１６、ＨＬＡ−Ｂ１７、ＨＬＡ−Ｂ１８、ＨＬＡ−Ｂ２１、ＨＬＡ−Ｂｗ２２、ＨＬＡ−Ｂ２７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ３７、ＨＬＡ−Ｂ３８、ＨＬＡ−Ｂ３９、ＨＬＡ−Ｂ４０、ＨＬＡ−Ｂｗ４１、ＨＬＡ−Ｂｗ４２、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ４５、ＨＬＡ−Ｂｗ４６およびＨＬＡ−Ｂｗ４７の任意のものを包含するＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ｂ分子により限定されるペプチドである。特定の具体例において、本発明のペプチドが結合できるＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ｂ種は、ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７およびＨＬＡ−Ｂ５１から選択される。

特定の具体例において、本発明のペプチドは：ＣＰＴＥＮＥＰＤＬ（スルビビン_{４６−５４}）（配列番号６）、ＥＰＤＬＡＱＣＦＦ（スルビビン_{５１−５９}）（配列番号７）、ＣＰＴＥＮＥＰＤＹ（配列番号８）およびＥＰＤＬＡＱＣＦＹ（配列番号９）から選択される配列を有するＨＬＡ−Ｂ３５限定スルビビン誘導ペプチドである（かっこ内の標記は米国特許第６２４５５２３号に開示されているスルビビンタンパク質における残基の位置を示す）。ＣＰＴＥＮＥＰＤＹ（配列番号８）はペプチドのＣ末端における「Ｌ」を「Ｙ」で置換することによりスルビビン_{４６−５４}から誘導され、ＥＰＤＬＡＱＣＦＹ（配列番号９）はＣ末端２における「Ｆ」残基を「Ｙ」で置換することによりスルビビン_{５１−５９}から誘導される。

さらに別の具体例において、本発明のペプチドは、スルビビン_{３８−４６}（Ｓｕｒ３８Ｙ９）（Ｐ９でＣがＹに変化、ＭＡＥＡＧＦＩＨＹ）（配列番号３８）、スルビビン_{４７−５６}（Ｓｕｒ４７Ｙ１０）（Ｐ１０でＱがＹに変化、ＰＴＥＮＥＰＤＬＡＹ（配列番号３９））、スルビビン_{９２−１０１}（Ｓｕｒ９２−１０１）（ＱＦＥＥＬＴＬＧＥＦ）（配列番号２７）、およびスルビビン_{９３−１０１}（Ｓｕｒ９３Ｔ２（Ｐ２でＥがＹに変化、ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ（配列番号３６））から選択される配列を有するＨＬＡ−Ａ１限定ペプチドである。本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ａ３限定ペプチド、例えば、スルビビン_{１８−２４}（Ｓｕｒ１８Ｋ１０）（Ｐ１０でＦがＫに変化、ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ（配列番号５７）および／またはＨＬＡ−Ａ１１限定ペプチド、例えば、スルビビン_{５３−６２}（Ｓｕｒ５３−６２）（ＤＬＡＱＣＦＦＣＦＫ）（配列番号４５）および／またはＨＬＡ−Ａ２限定ペプチド、例えば、スルビビン_{１８−２８}（Ｓｕｒ１８−２８）（ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＦＬ）（配列番号６６）であってもよい。

さらに別の有用な具体例において、本発明のペプチドは、ＨＬＡ−Ｃｗ１、ＨＬＡ−Ｃｗ２、ＨＬＡ−Ｃｗ３、ＨＬＡ−Ｃｗ４、ＨＬＡ−Ｃｗ５、ＨＬＡ−Ｃｗ６、ＨＬＡ−Ｃｗ７およびＨＬＡ−Ｃｗ１６の任意のものを包含するＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ｃ分子に限定されるペプチドである。
好ましくは、本発明のペプチドは、５０未満のアミノ酸残基、さらに好ましくは最高２０のアミノ酸残基、例えば、最高１０のアミノ酸残基を含む。特定の具体例において、ペプチドは、ヘプタペプチド、オクトペプチド、ノナペプチド、デカペプチドまたはウンデカペプチドである。

本発明のペプチドは、前記のように、スルビビンタンパク質またはそのフラグメントから誘導される。そこからペプチドを誘導できるスルビビンタンパク質は、タンパク質が発現される任意の動物種からのスルビビンタンパク質である。好ましい具体例において、スルビビン出発タンパク質は、齧歯類、ウサギおよび霊長類、例えば人間をはじめとする哺乳動物種から得られる。選択されたスルビビンタンパク質の配列に基づいて、本発明のペプチドはスルビビン出発物質の任意の適当な化学処理または酵素処理により誘導され、その結果、前記のような適当なサイズのペプチドが得られるか、または当業者が精通している任意の慣用のペプチド合成法により合成することができる。

本発明のペプチドは、誘導されるスルビビンタンパク質の天然の配列である配列を有し得る。しかしながら、所定のＨＬＡ分子に対してより高い親和性を有するペプチドは、例えば前記の手順に基づいた少なくとも１つのアミノ酸残基の置換、欠失または付加により配列を修飾することにより、かかる天然の配列から誘導することができ、これにより所定のＨＬＡ分子に関する別のアンカー残基モチーフが同定される。
従って、スルビビン誘導ペプチドの免疫原性を増大させるための、アミノ酸置換をアンカー位置に導入することができるが、ＴＣＲ接触残基では導入できず、ＨＬＡクラスＩ分子とのペプチドの結合が増大する。この結果、より免疫原性のエピトープが得られる。例えば、これは癌反応性ＣＴＬを誘発する能力を向上させ、臨床的に意義のあるＣＴＬ応答の誘発にさらに適当であることが示されている。しかしながら、重要なことには、標的癌細胞は細胞表面上で天然のスルビビン誘導ペプチドを発現し、提示するのみである。この点において、修飾されたスルビビン誘導ペプチドについて特異的な治療誘発ＣＴＬが天然の類似体と交差反応することは、非常に重要である。

本発明はさらに、本明細書において開示されているスルビビン誘導ペプチドの変異体および機能的等価物も包含する。本発明に関連して用いられる場合、「機能的等価物」とは、問題の配列のあらかじめ決められたフラグメントの対応する官能基を参照することにより立証される。機能的等価物は、例えば、ＨＬＡクラスＩ分子との類似の結合親和力、またはＥＬＩＳＰＯＡＴアッセイにより示される同様の効力により立証される。
本明細書に記載のスルビビン誘導ペプチドの機能的等価物および変異体は、挿入、欠失および同類置換を含む置換の数ならびに範囲が拡大した場合に、好ましい所定の配列と徐々に異なっているアミノ酸配列を示すものと理解されよう。この違いは好ましい所定の配列とスルビビン誘導変異体またはスルビビン誘導機能的等価物の間の相同性の減少として測定される。
アミノ酸配列間の相同性は、当該分野において周知のアルゴリズムを用いて計算することができる。連続したスルビビン誘導アミノ酸残基を含むかまたは該アミノ酸残基からなるフラグメントと相同性を共有するフラグメントは、あらかじめ決められたスルビビン誘導ペプチドと、好ましくは少なくとも約９０％相同性、例えば少なくとも９４％相同性（９５％、９６％、９７％、９８％または９９％相同性を包含する）を有する場合に、本発明の範囲内に含まれると考えられる。

さらに、本発明のペプチドの翻訳後修飾を行うことが有利である場合もある。乳ガンＭＣＦ−７または子宮頸癌Ｈｅｌａ細胞を、アドリアマイシン、タキソール、またはＵＶＢをはじめとする抗ガン剤に暴露すると、スルビビンの発現が４〜５倍増大することが判明した。抗ガン剤治療後のスルビビンレベルにおける変化は、スルビビンｍＲＮＡ発現の調節を含まず、新規遺伝子転写と独立していた。反対に、サイクリン依存性キナーゼ阻害剤フラボピリドールによるＴｈｒ^３４上のスルビビンリン酸化の阻害の結果、スルビビン発現が失われ、非リン酸化可能なスルビビンＴｈｒ^３４→Ａｌａは野生型スルビビンと比べて加速されたクリアランスを示した。Ｔｈｒ^３４上のスルビビンリン酸化の逐次除去は、ｐ５３と独立して抗ガン剤により誘発される腫瘍細胞アポトーシスを向上させ、インビボでの乳ガン異種移植片モデルにおいて毒性なしに腫瘍増殖を抑制した。これらのデータは、Ｔｈｒ^３４リン酸化は腫瘍細胞におけるスルビビンレベルを高度に制御し、ｐ３４^ｃｄｃ２キナーゼ活性の逐次除去はスルビビン生存性チェックポイントを除去し、腫瘍細胞におけるアポトーシスを向上させることができることを示唆する。

従って、本発明のスルビビン誘導ペプチドはリン酸化ペプチドを含むと考えられる。天然のスルビビンホスホペプチド抗原は、リン酸化部位Ｔｈｒ３４のまわりのＭＨＣペプチド結合モチーフの存在についてスキャンすることにより同定することができる。従って、可能なスルビビン誘導ホスホペプチド配列は、ＴＰＥＲＭＡＥＡＧＦ、推定ＨＬＡ−Ｂ３５−および／またはＨＬＡ−Ｂ７７−および／またはＨＬＡ−Ｂ５１−限定ペプチド抗原を包含する。本発明に含まれるさらなる天然のホスホペプチドは：ＨＬＡ−Ａ２：ＣＡＣＴＰＥＲＭＡおよびＣＴＰＥＲＭＡＥＡ；ＨＬＡ−Ａ３：ＦＬＥＧＣＡＴＰ；ＨＬＡ−Ｂ７／ＨＬＡ−Ｂ３５／ＨＬＡ−Ｂ５１：ＷＰＦＬＥＧＣＡＣＴ（リン酸化Ｔｈｒ残基を太字でマークした）を包含する。

本発明のペプチドの重要な特徴は、ＩＮＦ−γ産生レスポンダーＴ細胞、すなわち癌患者のＰＢＬ集団または腫瘍細胞（標的細胞）における特定のペプチドを特異的に認識する細胞毒性Ｔ細胞（ＣＴＬ）を認識または惹起できることである。この活性は、患者から得られるＰＢＬまたは腫瘍細胞を文献（１６）および以下の実施例において記載されているＥＬＩＳＰＯＴアッセイに付すことにより容易に決定される。アッセイ前に、分析されるＰＢＬ集団または腫瘍細胞を試験されるペプチドと接触させることにより刺激するのが有利である。好ましくは、ペプチドは本明細書において用いられるＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより決定すると少なくとも１／１０^４ＰＢＬの頻度でＩＮＦ−γ産生Ｔ細胞を惹起または認識できる。さらに好ましくは、頻度は少なくとも５／１０^４ＰＢＬであり、最も好ましくは少なくとも１０／１０^４ＰＢＬ、たとえば少なくとも５０または１００／１０^４ＰＢＬである。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、スルビビンペプチド特異性Ｔ細胞応答をモニターするための強力な手段の代表である。しかしながら、ほとんどの場合におけるＥＬＩＳＰＯＴ反応性は、標的細胞を溶解させるためのＣＬＬの能力と相関するが、この概念の決定的証拠は直接に得られるのみである。ＨＬＡ／ペプチド複合体により単離されたスルビビン反応性細胞が標的細胞を溶解させる機能的能力を有することが示されるので、本発明においてこのような直接的証拠が得られる。さらに、本発明のペプチドを特異的に認識する単離されたＣＴＬは、例えば黒色腫および乳ガンなどの異なる起源のＨＬＡ適合腫瘍細胞を溶解させることができる。この知見は、癌細胞が一般に同じ内因性スルビビンペプチドを処理し、提示することを強く示唆する。従って、本発明における知見の主な意味することは、本発明のペプチドは異なる組織学的起源の様々な細胞上で発現され、ＨＬＡ分子と複合体形成することである。このことにより、これらの癌細胞はＣＴＬによる破壊を受けやすくなり、異なる新生腫瘍の成長を制御するためのスルビビン免疫化の潜在的有用性が強調される。３種の関連しない癌、すなわち、乳ガン、黒色腫およびＣＬＬにかかっている患者から得られるＨＬＡ限定スルビビン誘導ペプチドエピトープに対するＰＢＬおよび腫瘍細胞における自発性ＣＴＬ応答の存在は、さらにこの腫瘍抗原の普遍的免疫治療可能性を実証する。

従って、別の好ましい具体例において、本発明のペプチドは、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌を包含する、スルビビンが発現される癌疾患を有する患者のＰＢＬ集団においてＩＮＦ−γ産生細胞を惹起できる。特に、本発明のペプチドは、乳ガン細胞系ＭＣＦ−７および黒色腫細胞系ＦＭ３から選択される細胞系を包含する癌細胞系のスルビビン発現細胞に対して細胞傷害効果を有するＴ細胞の形態において免疫応答を惹起できる。
ＰＢＬ集団およびガン細胞系において免疫応答を惹起するその能力に加えて、本発明のペプチドはインサイチュで、すなわち充実性腫瘍組織において細胞溶解性免疫応答を惹起できることが証明された。これは、例えばマルチマー化され、検出可能な標識を備えたＨＬＡ−ペプチド複合体を提供し、本発明のエピトープペプチドと反応性である腫瘍組織ＣＴＬにおいて検出するために免疫組織化学的染色のためにかかる複合体を使用することにより証明された。従って、本発明のペプチドのさらに別の重要な特徴は、これがエピトープペプチドと反応性であるＣＴＬの腫瘍組織においてインサイチュ検出が可能であることである。

本発明のペプチドは、ＨＬＡ分子と結合し、その結果、細胞表面上のＨＬＡおよびペプチドの複合体であって、次に細胞毒性Ｔ細胞のエピトープまたは標的としての働きをする複合体を提示するその能力に加えて、他の種類の免疫応答、例えばＢ細胞応答を惹起し、その結果、複合体に対する抗体の産生および／または遅延型過敏性（ＤＴＨ）反応が生じると考えられる。後者のタイプの免疫応答は、本発明のペプチドの注射部位での赤みおよび触診可能な硬結として定義される。
異なるＨＬＡ分子は、主なヒト集団において異なる有病率を有することはよく知られている。従って、本発明の方法にしたがって治療できる患者の集団を拡張するため、いくつかのＨＬＡクラスＩ分子に限定されたペプチドエピトープを同定するために要件が存在する。異なるＨＬＡ制限エレメントを有する複数のスルビビンエピトープのキャラクタライゼーションにより、２つの重要な方法でこの標的抗原の臨床的可能性が拡大される。すなわち、（ｉ）スルビビン誘導ペプチドに基づく免疫療法に適した患者の数を増大させる。ＨＬＡ−Ａ２抗原は、白人およびアジア人種の約５０％により発現され、ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ３抗原はどちらも白人の２５％およびアジア人の５％により発現され、一方、ＨＬＡ−Ａ１１抗原は白人の約１５％およびアジア人の３０％により発現される。これらの数は同時発現のために合計することができなくても、これらの多様性により限定されるペプチドの組み合わせはほとんどの癌患者を確実に包含する。（ｉｉ）各患者におけるいくつかの制限エレメントの全体的ターゲティングはＨＬＡ−対立遺伝子損失による免疫回避の危険性を減少させるであろう。一つのＨＬＡ−対立遺伝子の損失は癌細胞により表されるＭＨＣ変更の重要な成分であり、クラスＩ発現の全体的な損失は滅多に起こらない事象である。従って、異なるＨＬＡ対立遺伝子に限定されるスルビビンエピトープの同定で、対立遺伝子重複を有する患者において１以上のＨＬＡ分子を同時に標的とすることが可能である。

従って、本発明の開示に基づいて、当業者は高度に免疫原性であるマルチエピトープワクチンを開発することができる。好ましくは、かかるワクチンは最もふさわしいスルビビン誘導ペプチドの、所望により以下に記載するような他の適当なペプチドおよび／またはアジュバントとの組み合わせにおける同時送達を促進するために設計するべきである。
さらに、既に記載されているように、腫瘍は一般にクラスＩＩＭＨＣを発現しないという事実にかかわらず、腫瘍特異性Ｔヘルパー細胞免疫性の惹起、すなわち、クラスＩＩ−ＭＨＣ限定エピトープでのワクチン接種に対する関心が増大している。これは、多くの場合におけるワクチン誘発性抗腫瘍応答の誘発および有効性が腫瘍特異性ＣＤ４陽性Ｔ_ｈ細胞の連携を必要とするという最近の知見に基づく。従って、さらに複雑な組成を有するワクチンの開発を行う重要な因子は、例えば慎重に選択されたＣＴＬおよびＴ_ｈ細胞エピトープの集合を含むかまたはコード化するワクチンを設計することにより複数の腫瘍抗原を標的にすることへの要望である。

明らかに、多エピトープワクチンは、潜在的に有害なタンパク質、例えば癌タンパク質の導入（遺伝子エンコーディング）を必要とせずに、いくつかの異なる抗原から誘導されるエピトープに対する免疫性を惹起する有効な方法を構成する。このようなワクチンはまた、亜優占種潜在的Ｔ細胞エピトープに対する免疫性の選択的誘発を可能にし、これは正常組織において顕著に提示されるエピトープに対して寛容性が存在する、腫瘍関連自己抗原の場合において特に重要である。さらに、抗原提示細胞のイムノプロテアソームとほとんどの腫瘍細胞において存在する「構成的」プロテアソーム間の機能的相違のために、腫瘍細胞上で発現されるある種のエピトープを提示できない可能性がある。ペプチドベースのワクチンの場合、このようなエピトープは、宿主抗原提示細胞による抗原摂取およびプロセッシングと独立した外因性ローディングによる提示を可能にする「ＭＨＣ可能な」形態において投与することができる。
本発明の知見は、スルビビン誘導ペプチドの治療的ならびに診断的用途の基礎を提供することは明らかである。
従って、本発明の重要な態様は組成物に関する。

従って、さらに別の態様において、本発明は、本発明の１以上のペプチドを単独または他のタンパク質またはペプチドフラグメントとの組み合わせにおいて含む医薬組成物を提供する。具体例において、このような他のタンパク質またはペプチドフラグメントは、細胞アポトーシスの制御に関連するタンパク質またはそのペプチドフラグメントを包含するが、これらに限定されるわけではない。このようなタンパク質の適当な例は、Ｂｃｌ−２タンパク質ファミリー、例えばＢｃｌ−２タンパク質、Ｂｃｌ−ｗタンパク質、Ｍｃｌ−１タンパク質、Ｂｃｌ−Ｘ_Ｌタンパク質、および該タンパク質の任意のものから誘導されるペプチドフラグメントから選択することができる。他の公知アポトーシス阻害剤としては、アポトーシスタンパク質の阻害剤（ＩＡＰ）ファミリーのメンバー、例えばＸ−ＩＡＰ、Ｃ−ＩＡＰ１およびＣ−ＩＡＰが挙げられる。これらのタンパク質はすべて比較的偏在的に発現されるが、アポトーシスポリペプチドの阻害剤ＭＬ−ＩＡＰはかなり選択的な発現を有し、黒色腫において主に検出される。従って、特異的Ｔ細胞応答、すなわち細胞毒性Ｔ細胞応答またはヘルパーＴ細胞応答を惹起できるＭＬ−ＩＡＰのフラグメントは、所望により本発明の組成物中に含めることができる。ＭＬ−ＩＡＰの有用なペプチドフラグメントは、ＭＬ−ＩＡＰ_２４５（ＲＬＱＥＥＲＴＣＫＶ）（配列番号７５）、ＭＬ−ＩＡＰ_２８０（ＱＬＣＰＩＣＲＡＰＶ）（配列番号７６）、ＭＬ−ＩＡＰ_９０（ＲＬＡＳＦＹＤＷＰＬ）（配列番号７７）、ＭＬ−ＩＡＰ_１５４（ＬＬＲＳＫＧＲＤＦＶ）（配列番号７８）、ＭＬ−ＩＡＰ_２３０（ＶＬＥＰＰＧＡＲＤＶ）（配列番号７９）、ＭＬ−ＩＡＰ_９８（ＰＬＴＡＥＶＰＰＥＬ）（配列番号８０）、ＭＬ−ＩＡＰ_３４（ＳＬＧＳＰＶＬＧＬ）（配列番号８１）、ＭＬ−ＩＡＰ_５４（ＱＩＬＧＱＬＲＰＬ）（配列番号８２）、ＭＬ−ＩＡＰ_９９（ＬＴＡＥＶＰＰＥＬ）（配列番号８３）、ＭＬ−ＩＡＰ_８３（ＧＭＧＳＥＥＬＲＬ）（配列番号８４）およびＭＬ−ＩＡＰ_２００（ＥＬＰＴＰＲＲＥＶ）（配列番号８５）を包含する。

さらに、本発明の組成物は、本明細書において既に定義されたクラスＩ限定エピトープおよび／またはクラスＩＩ限定エピトープを含むマルチエピトープワクチンとして提供することができる。
現在好ましいマルチエピトープワクチンの例としては、例えばＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、およびＨＬＡ−Ｂ３５表現型を有する患者などの所定の患者の組織タイプに依存するスルビビン誘導ペプチドエピトープの「オーダーメード」組み合わせを含み、ｓｕｒ１Ｍ２、ｓｕｒ９、ｓｕｒ１８Ｋ１０、ｓｕｒ４６Ｙ９、ｓｕｒ５１Ｙ９を含むワクチンと共にワクチン接種することができる。さらに、本発明の医薬組成物は、少なくとも１種の、スルビビンタンパク質に属するか、またはこれから誘導されるタンパク質またはペプチドフラグメントから選択されるさらに別の免疫原性タンパク質またはそのペプチドフラグメントを含むのが有利である。特別な具体例において、免疫原性タンパク質またはそのペプチドフラグメントは、本明細書において既に記載したようなＢｃｌ−２タンパク質ファミリーから誘導される。さらに別の免疫原性Ｂｃｌ−２誘導ペプチドは、Ｂｃｌ_１７２、Ｂｃｌ_１８０、Ｂｃｌ_２０８、およびＢｃｌ_２１４から選択される配列を有するＨＬＡ−Ａ２限定ペプチドである。

本発明のペプチドは比較的小さな分子であるので、ワクチン、免疫原性組成物などを製造するために、このような組成物において様々な物質、例えばアジュバントとペプチドを組み合わせる必要がある場合もある。広義のアジュバントは、免疫応答を促進する物質である。しばしば、一般に好まれるアジュバントは、フロインドの完全または不完全アジュバント、または死菌ビー・ペルツッシス（Ｂ．ｐｅｒｔｕｓｓｉｓ）であって、例えばａｌｕｍ沈降抗原との組み合わせにおいて用いられる。アジュバントの一般的議論は、Ｇｏｄｉｎｇ、モノクローナル抗体（ＭｏｎｏｃｌｏｎａｌＡｎｔｉｂｏｄｉｅｓ：Ｐｒｉｎｃｉｐｌｅｓ＆Ｐｒａｃｔｉｃｅ（第２版、１９８６）、６１−６３ページに記載されている。しかしながら、Ｇｏｄｉｎｇは、興味のある抗原が低分子量のものであるかまたは免疫原性が不十分である場合、免疫原性キャリアとのカップリングが推奨されると記載している。かかるキャリア分子の例としては、キーホールリンペットヘモシアニン、ウシ血清アルブミン、卵アルブミンおよびニワトリイムノグロブリンが挙げられる。様々なサポニン抽出物も免疫原性組成物におけるアジュバントとして有用であると示唆されている。最近、周知のサイトカインである顆粒球−マクロファージコロニー刺激因子（ＧＭ−ＣＳＦ）のアジュバントとしての使用が提案されている（ＷＯ９７／２８８１６）。

従って、本発明は、任意の前記のものまたはその組み合わせをはじめとする任意のアジュバント物質をさらに含む治療組成物を包含する。抗原、すなわち本発明のペプチドおよびアジュバントは任意の適当な順序で別々の投与することができると考えられる。
本発明の医薬組成物における抗原の選択は、当業者により決定できるパラメータに依存する。既に記載したように、本発明の異なるペプチドのそれぞれは、特定のＨＬＡ分子により細胞表上に提示される。従って、治療される患者がＨＬＡ表現型に関連して分類されるならば、特定のＨＬＡ分子に結合することが知られているペプチドが選択される。
あるいは、興味のある抗原は所定の集団における様々なＨＬＡ表現型の優勢に基づいて選択される。一例として、ＨＬＡ−Ａ２は白色人種集団における最も優勢な表現型であるので、ＨＬＡ−Ａ２と結合するスルビビン誘導ペプチドを含有する組成物はこの集団の大部分において活性であろう。しかしながら、本発明の組成物は、２以上のスルビビン誘導ペプチドの組み合わせを含有し得、それぞれが異なるＨＬＡ分子と特異的に相互作用して、標的集団の大部分におよぶ。従って、例として、医薬組成物は、例えばＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ｂ３５などの標的集団におけるＨＬＡ表現型の優勢に対応するＨＬＡ−ＡおよびＨＬＡ−Ｂ分子を包含する、ＨＬＡ−Ａ分子に限定されるペプチドとＨＬＡ−Ｂ分子に限定されるペプチドの組み合わせを含有することができる。さらに、組成物はＨＬＡ−Ｃ分子に限定されるペプチドを含むことができる。

本発明の有用な免疫原性組成物は、本明細書において定義されるスルビビン誘導ペプチドに加えて、免疫学的に有効な量の本明細書において定義されるスルビビンタンパク質またはその免疫原性フラグメントを含んでもよいと考えられる。
医薬組成物における本発明の免疫原性ペプチドの量は、特定の用途に応じて変わる。しかしながら、免疫原の単一量は好ましくは約１０μｇ〜約５０００μｇ、さらに好ましくは約５０μｇ〜約２５００μｇ、例えば約１００μｇ〜約１０００μｇである。投与様式としては、皮内、皮下および静脈内投与、徐放性処方の形態における埋め込みなどが挙げられる。当該分野において公知のありとあらゆる投与形態が本発明に含まれる。また、凍結乾燥形態および溶液、懸濁液またはエマルジョン形態（所望により、慣用の医薬的に許容される担体、希釈剤、保存料、アジュバント、緩衝剤成分などを含んでもよい）などの注射可能な免疫原性ペプチド組成物の処方に適当であることが当該分野において知られている慣用の投与形態も含まれる。

本発明の組成物の免疫保護効果は、いくつかの方法を用いて決定することができる。その例は、以下の実施例において記載される。免疫原性組成物により誘発されるＣＴＬ応答をどのようにして決定するかについてのさらに別の例は、前出のＷＯ９７／２８８１６に記載されている。有効な免疫応答は、免疫化および／またはワクチン組成物のペプチドを特異的に認識する抗体の検出後のＤＴＨ反応の発生によっても決定することができる。
好ましい具体例において、本発明の医薬組成物は、癌疾患に対する免疫応答を惹起できる免疫原性組成物またはワクチンである。本明細書において用いられる場合、「免疫原性組成物またはワクチン」なる表現は、癌細胞に対して少なくとも１種の免疫応答を惹起する組成物を意味する。従って、かかる免疫応答は前記のタイプの任意のものである：細胞溶解の原因である細胞表面上に提示されたＨＬＡ／ペプチド複合体を認識できるＣＴＬが生成するＣＴＬ応答、すなわち、ワクチン接種された患者において癌細胞に対する細胞傷害効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を惹起するワクチン；抗癌抗体を産生させるＢ細胞応答；および／またはＤＴＨタイプの免疫応答。

有用な具体例において、ＭＨＣクラスＩ分子を患者からの抗原提示細胞（ＡＰＣ）上にロードするか、患者からＰＢＬを単離し、細胞を患者に注入により戻す前に細胞をペプチドとともにインキュベートするか、または患者から前駆体ＡＰＣを単離し、細胞を患者に注入により戻す前にサイトカインおよび抗原を使用して細胞をプロフェッショナルＡＰＣに分化させるかのいずれかにより、本発明のペプチドを投与することにより、癌疾患に対する免疫原性応答が惹起される。従って、本発明の一具体例において、癌患者を治療する方法は、エクスビボでペプチドを患者の抗原提示細胞（ＡＰＣ）に提示し、続いてこのように処理されたＡＰＣを患者に注入により戻すことによりペプチドが投与されるものである。これを行うのに少なくとも２つの代替法がある。一つの代替法は、癌患者からＡＰＣを単離し、ＭＨＣクラスＩ分子をペプチドとともにインキュベート（ロード）することである。ＭＨＣクラスＩ分子のローディングとは、ＡＰＣをペプチドと共にインキュベートして、ペプチドに対して特異的なＭＨＣクラスＩ分子を有するＡＰＣがペプチドと結合し、その後、これを細胞に提示できることを意味する。その後、ＡＰＣを患者に再注入する。もう一つの代替法は、樹状細胞生物学の分野においてなされた最近の発見に依存する。この場合において、単球（樹状細胞前駆体である）が患者から単離され、サイトカインおよび抗原の使用によりインビトロで分化されてプロフェッショナルＡＰＣになる。これは、実施例３および５に記載され、ここにおいて、接着ＰＢＬ（主に単球である）はＧＭ−ＣＳＦ、ＩＬ−４およびＴＮＦ−αと共にインビトロで培養される。その後、インビトロで生成したＤＣはペプチドでパルスされ、患者に注入される。

スルビビンがほとんどの癌形態において発現されるらしいという事実により、本発明のワクチンを、スルビビンが発現される任意のタイプの癌疾患を制御するために提供することができる。従って、例として、本発明のワクチン組成物は、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳ガン、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌に対して免疫学的に活性である。
前記載事項から、当業者は本発明のペプチドが癌診断手段として有用であり、特にペプチドがあらゆる種類の癌において発現されるスルビビンから誘導される場合に有用である。従って、本発明のペプチドは癌疾患について広く適用できる診断および予後判定法を開発するための基礎を提供する。他の有用な具体例において、本発明の組成物は、例えばＰＢＬ中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性Ｔ細胞の検出に基づいた癌患者における存在のエクスビボまたはインサイチュ診断用組成物である。

従って、さらに別の態様において、ＰＢＬ中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性Ｔ細胞の存在のエクスビボまたはインサイチュ診断用診断キットであって、１以上の本発明のペプチドを含む診断キット、および癌患者においてスルビビン反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法であって、腫瘍組織または血液サンプルを本発明のペプチドとクラスＩＨＬＡ分子またはかかる分子のフラグメントの複合体と接触させ、該複合体の該組織または該血液細胞との結合を検出することを含む方法が提供される。
もう一つ別の有用な診断または予後判定法は、異種動物種における抗体、例えばその後、ペプチドを提示する癌細胞の存在について診断するために使用できる本発明のヒトスルビビン誘導ペプチドに対するネズミ抗体の生成に基づく。このような免疫化の目的のために、ペプチドの量は例えば前記のようなインビボ療法の間に用いられるものより少なくてもよい。一般に、好ましい用量は約１μｇ〜約７５０μｇのペプチドの範囲である。本発明のペプチドでの免疫化に基づいてモノクローナル抗体を生成することもできる。従って、本発明は、本発明のペプチドと特異的に結合できる分子、特にモノクローナル抗体またはポリクローナル抗体（そのフラグメントを包含する）、および、例えば本発明のペプチドに対するモノクローナルまたはポリクローナル抗体に対して生成された抗体などの、かかる結合をブロックすることができる分子に関する。

一態様において、本発明は、本発明のペプチドとクラスＩＨＬＡ分子またはかかる分子のフラグメントとの複合体を提供し、これは前記のように診断試薬として有用である。複合体は、次の実施例において記載されるようなものをはじめとする任意の慣用の手段により調製される。かかる複合体はモノマーであっても、マルチマーであってもよい。
本発明は、癌疾患を緩和または治癒するための手段を提供する。従って、本発明のさらに別の態様は、癌の治療用医薬を調製するための前記定義のようなペプチドの使用である。本発明のさらに別の態様は、癌の治療用医薬を調製するための前記定義の分子または組成物の使用に関する。好ましくは、癌疾患は：慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳ガン、子宮頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌を例として包含するスルビビンの発現と関連する。使用は、疾患にかかっている患者に有効量の本発明の医薬組成物、本発明のペプチドに特異的に結合できる分子および／またはかかる分子の結合をブロックできる分子を投与することを含む。
場合によっては、本発明の使用を放射線療法または化学療法などの慣用の癌治療法と組み合わせるのが適当である。

本発明を以下の非制限的実施例および図においてさらに詳細に説明する。
図中、
図１は、患者ＣＬＬ１におけるＥＬＩＳＰＯＴにおいて測定される、ペプチドなし、Ｓｕｒ１（ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号１０）ペプチドおよびＳｕｒ９（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号３）ペプチドに対するＴ細胞応答を示す。ＰＢＬを重複試験において６×１０^５細胞／ウェルでプレートする前に一度ペプチドで刺激した。ＣＣＤスキャニング装置およびコンピューターシステムを用いてペプチドあたりのスポットの平均数を計算した。
図２は、ペプチドなし、ペプチド類似体Ｓｕｒ１Ｌ２（ＬＬＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号４）、およびペプチド類似体Ｓｕｒ１Ｍ２（ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号５）に対する患者ＣＬＬ１におけるＥＬＩＳＰＯＴにおいて測定されるＴ細胞応答を示す。ＰＢＬを重複試験において１０^４細胞／ウェルでプレートする前に一度ペプチドで刺激した。ＣＣＤスキャニング装置およびコンピューターシステムを用いてペプチドあたりのスポットの平均数を計算した。

図３は、ペプチドなし（黒）、Ｓｕｒ１（ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号１０）ペプチド（灰色）、Ｓｕｒ９（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号３）ペプチド（白）、類似ペプチドＳｕｒ１Ｌ２（ＬＬＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号４）（淡灰色）、および類似ペプチドＳｕｒ１Ｍ２（ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号５）（暗灰色）に対する患者ＣＬＬ２およびＣＬＬ３におけるＥＬＩＳＰＯＴにおいて測定される応答を示す。各実験は重複試験において１０^５細胞／ウェルで行い、ペプチドあたりのスポットの平均数を計算した。
図４は、インビトロで一度刺激し、ペプチドなし（黒）、ペプチドＳｕｒ１（ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号１０）（灰色）およびＳｕｒ９（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号３）（白）に対する応答についてのＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて分析された患者Ｍｅｌ１、Ｍｅｌ２、およびＭｅｌ３からの腫瘍浸潤リンパ節から単離されたＴ細胞を表す。各実験は重複試験においてウェルあたり１０^５細胞で行った。各実験において、ペプチドを添加していない２つのウェルも含めた。ペプチドあたりの平均数を各患者について計算した。
図５は、スルビビン特異性ＣＴＬの機能的活性を示す。スルビビンコートされた磁気ビーズを用いて黒色腫浸潤リンパ節からＣＴＬを単離した。（Ａ）黒色腫細胞系；ＨＬＡ−Ａ２陽性ＦＭ３（三角）およびＨＬＡ−Ａ２陰性ＦＭ４５（四角）の特異的溶解。（Ｂ）乳ガン細胞系；ＨＬＡ−Ａ２陽性ＭＣＦ−７（三角）およびＨＬＡ−Ａ２陰性ＢＴ−２０（四角）の特異的溶解。

図６は、乳ガン患者からのＢＰＬにおけるスルビビン反応性ＣＴＬの頻度を示す。反応性をＥＬＩＳＰＯＴにより３人の乳ガン患者（それぞれ上、中、下）において調べた。各患者について、アッセイをペプチドの不在下、ｓｕｒ１ペプチドの存在下、ｓｕｒ９の存在下、および修飾ｓｕｒ１Ｍ２ペプチドの存在下で行った。ウェルあたり１×１０^４エフェクター細胞を使用した。グラフは、反応性細胞の定量化を表し；灰色の柱状グラフはＩＦＮ−γ産生細胞の平均数を表す。
図７は、スルビビン誘導ペプチドのＨＬＡ−３５結合およびスルビビン誘導ペプチドによるＨＬＡ−Ｂ３５分子のペプチドによる回復の分析である。代謝的に標識されたＴ２−Ｂ３５細胞の溶解産物を、５０、５、０．５、０．０５および０．００５ｍＭのペプチドの存在下、４℃でインキュベートした。ＨＬＡ−３５の回復をアセンブリーアッセイにおいて分析し、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅホスホルイメージャーソフトウェア（富士写真フィルム株式会社、日本）を用いてＩＥＦ−ゲル電気泳動後に定量化した。Ｃ_５０値はＨＬＡ−Ｂ３５との最大結合の半分に必要なペプチドの濃度である。
図８は、癌患者からのＰＢＬにおいて観察される自発的Ｔ細胞応答を示す。Ａ）患者ＣＬＬ５（１０^５細胞／ウェル）、ＨＥＭ１２（１０^５細胞／ウェル）、およびＨＥＭ８（５×１０^４細胞／ウェル）からのインビトロで刺激されたＰＢＬ中、ペプチド無し（白）、ｓｕｒ５１−１９（黒）またはｓｕｒ４６−５４（灰色）を用いてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて測定されたＩＦＮγスポット形成細胞の数。Ｂ）ペプチドパルス化成熟自己樹状細胞とともに１０日間培養された、ＨＥＭ１２からの１．７×１０^５ＰＢＬ中のスポット形成細胞の数。柱状グラフは２回の測定値の平均を表す。

図９は、黒色腫患者における天然および修飾スルビビンペプチドに対する自発的Ｔ細胞応答を表す。Ａ）ＰＢＬ（４×１０^３細胞／ウェル）およびＴＩＬ（７×１０^４細胞／ウェル）中患者ＦＭ２５からのｓｕｒ５１−５９およびｓｕｒ５１Ｙ９ならびにＦＭ４５（１０^４細胞／ウェル）からのＴＩＬに対するＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて測定されるスポット形成細胞の数。柱状グラフは非特異性ＩＦＮγ放出を差し引いた２回の測定値の平均を表す。
図１０は、ＨＬＡ−Ａ１に対するスルビビン誘導ペプチドの結合親和力を示す。クラスＩＭＨＣ重鎖はホスホルイメージャーで定量化した。安定化されたＨＬＡ−Ａ１重鎖のマウントは、添加されたペプチドの結合親和力と直接関連する。４０、４、０．４、０．０４μＭのＳｕｒ９３−１０１（線）、Ｓｕｒ９３Ｔ２（四角）、Ｓｕｒ４９−５８（円）またはインフルエンザＡ、ＰＢ１５９１−５９９（三角）により誘発されるＨＬＡ−Ａ１のペプチドによる回復（任意単位）。
図１１は、ＨＬＡ−Ａ１限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的Ｔ細胞応答。黒色腫患者からの５×１０^４インビトロ刺激ＰＢＬまたはＴＩＬ中Ｓｕｒ９２−１０１、Ｓｕｒ３８Ｙ９、Ｓｕｒ４７Ｙ１０、およびＳｕｒ９３Ｔ２に応答して形成されるペプチド特異性ＩＦＮγスポットの平均数。示されるペプチド特異性応答は黒色腫（Ｍｅｌ）患者からの６ＰＢＬサンプルおよび３ＴＩＬサンプルの分析中観察された。非特異性ＩＦＮγスポットを差し引く。バー：重複試験の範囲。

図１２はＨＬＡ−Ａ１１限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的Ｔ細胞応答。癌患者からの５×１０^４インビトロ刺激ＰＢＬまたはＴＩＬ中Ｓｕｒ５３−６２に応答して形成されるペプチド特異性ＩＦＮγスポットの平均数。ペプチド特異性応答は、５人の黒色腫（Ｍｅｌ）患者（５ＰＢＬ、１ＴＩＬ）および２人のＣＬＬ（ＣＬＬ）患者（ＰＢＬ）の分析において観察された。非特異性ＩＦＮγスポットを差し引く。バー：重複試験の範囲。
図１３は、ＨＬＡ−Ａ３限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的Ｔ細胞応答。黒色腫患者からの５×１０^４インビトロ刺激ＰＢＬまたはＴＩＬ中Ｓｕｒ１８ＬＫ１０に応答して形成されるペプチド特異性ＩＦＮγスポットの平均数。示されるペプチド特異性応答は、黒色腫（Ｍｅｌ）患者からの２３ＰＢＬサンプルおよび４ＴＩＬサンプルの分析中観察された。非特異性ＩＦＮγスポットを差し引く。バー：重複試験の範囲。
図１４は、ＨＬＡ−Ａ２限定ペプチドに対する自発的応答を示す。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的Ｔ細胞応答。癌患者からの５×１０^４インビトロ刺激ＰＢＬ中１１ｍｅｒペプチド、Ｓｕｒ１８−２８に応答して形成されるペプチド特異性ＩＦＮγスポットの平均数。示されるペプチド特異性応答は、２人の黒色腫（Ｍｅｌ）患者、６人のＣＬＬ（ＣＬＬ）患者、および２人の乳ガン（ＭＣ）患者からの１０ＰＢＬサンプルの分析において観察された。非特異性ＩＦＮγスポットを差し引く。バー：重複試験の範囲。

図１５は、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定されるスルビビン誘導ペプチドに対する自発的Ｔ細胞応答を表す。５人の黒色腫患者（ｍｅｌ２５、ｍｅｌ２６、ｍｅｌ３、ｍｅｌ６、ｍｅｌ３９）、２人のＣＬＬ患者（ＣＬＬ１、ＣＬＬ５４）および２人の乳ガン患者（ｂｒｅａｓｔ１１、ｂｒｅａｓｔ１５）からの１０^５インビトロ刺激ＰＢＬ中ｓｕｒ６−１４（ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ）に応答して形成されたペプチド特異的ＩＦＮγスポットの平均数。非特異的ＩＦＮγスポットを差し引く。
図１６は、４人の患者（▲ＲＷ、●ＫＮ、−ＷＷＥ、■ＧＢ）のワクチン治療後のＬＤＨ、コリンエステラーゼ、クレアチニン、ヘモグロビン、白血球および血小板の安定な検出の実験値を示す。
図１７は、ＩＦＮγＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより評価されるスルビビンペプチドの免疫性の動態分析を示す。初回ＤＣワクチン接種前およびその後３ヶ月にＰＢＭＣを得た。バックグラウンドを越えるＩＦＮγスポット形成細胞の数を図示する。

次の表において、本発明において用いられるペプチドのアミノ酸配列およびそのそれぞれの配列番号を記載する：

実施例１
癌患者におけるアポトーシス阻害タンパク質スルビビンに対する細胞毒性Ｔリンパ球応答の同定
概要
スルビビンから誘導されるＣＴＬエピトープを使用して、ＥＬＩＳＰＯＴ分析により、慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者からの末梢血および黒色腫患者からの腫瘍浸潤リンパ節におけるかかる抗原に対する特異的Ｔ細胞反応性を検討した。スルビビン誘導ペプチドエピトープに対するＣＴＬ応答は、６人の黒色腫患者のうちの３人、および４人のＣＬＬ患者のうちの３人において検出された。６人の健常対照からのＰＢＬにおいてＴ細胞反応性は検出されなかった。従って、スルビビン誘導ペプチドは、抗ガン免疫療法の重要かつ広範囲に適用可能な標的としての働きをする。
はじめに
スルビビンタンパク質を、ＨＬＡ−Ａ＊０２０１（ＨＬＡ−Ａ２）結合ペプチドモチーフの存在に関してスキャンし、首尾良く同定した後、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより白血病および黒色腫患者において特異的Ｔ細胞反応性について試験するためにペプチドを使用した。両患者において、２つのスルビビン誘導ペプチドエピトープに対するコホートＣＴＬ応答が検出され、一方、健常対照においてＴ細胞反応性は検出できなかった。これらのデータは、スルビビンが自己Ｔ細胞により認識される広範囲に発現された腫瘍抗原を代表することを示唆する。

物質および方法
患者および健常対照
ＣＬＬと診断された４人の患者（ＣＬＬ１−４と表示）からの末梢静脈血サンプルおよび６人の健常者からの血液サンプルをヘパリン化試験管中に集めた。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離を用いてＰＢＬを単離し、１０％ジメチルスルホキシドを含むウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中凍結させた。さらに、腫瘍浸潤リンパ節からのリンパ球を６人の黒色腫患者（ｍｅｌ１−６と表示）から得た。新たに切除されたリンパ節を細かく刻んで小片にし、粉砕して細胞を培養物中に放出させ、低温保存した。ＰＢＬは黒色腫患者のうち４人から得られた。包含される全ての個体は、ＨＬＡ−Ａ２特異的抗体ＢＢ７．２を用いたＦＡＣＳ分析により決定されるようにＨＬＡ−Ａ２陽性であった。抗体をハイブリドーマ上清から精製した。州立大学病院（Ｈｅｒｌｅｖ、デンマーク）から患者サンプルを入手した。これらの測定の前に患者からインフォームドコンセントを得た。

スルビビン誘導ペプチド
全てのペプチドは、ＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ（ハンツビル、ＡＬ、ＵＳＡ）から入手し、ＨＰＬＣおよびＭＣ分析により実証されるように＞９０％の純度で提供された。使用したペプチドを表１に記載する。

^ａ下付き文字で示した値の範囲は、米国特許第６２４５５２３号に開示されるようなスルビビン配列におけるペプチドの位置を示す。
^ｂＣ_５０値は、以下に記載するようにして決定されるＨＬＡ−Ａ２との最大結合の半分に必要なペプチドの濃度である。

クラスＩＭＨＣ分子とのペプチド結合についてのアセンブリーアッセイ
合成ペプチドの［３５Ｓ］―メチオニンで代謝的に標識されたクラスＩＭＨＣ分子に対する結合についてのアセンブリーアッセイを記載されているようにして行った（１２、１３）。アセンブリーアッセイは、ペプチドをペプチドトランスポーター欠損細胞系Ｔ２にロードした後のクラスＩ分子の安定化に基づく。その後、構造依存性抗体を用いて適切に折り畳まれた安定ＨＭＣ重鎖を免疫沈降させた。ＩＥＦ電気泳動後、ゲルをホスホルイメージャースクリーンに暴露し、Ｉｍａｇｅｑｕａｎｔホスホルイメージャープログラム（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＤｙｎａｍｉｃｓ、サニーベール、ＣＡ）を用いてペプチド結合を定量化した。

ＰＢＬの抗原刺激
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの感度を拡大するために、分析前にＰＢＬを一度インビトロで刺激した（１４、１５）。新しい、あらかじめ凍結させたＰＢＬによりＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて同様の結果が得られた。０日に、ＰＢＬまたは粉砕されたリンパ節を解凍し、ＡＩＭＶ培地（ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｗ、ロスキレ、デンマーク）、５％熱不活化ヒト血清および２ｍＭのＬ−グルタミン中、１０μＭのペプチドの存在下で２４穴プレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）中、２×１０６細胞の濃度で２ｍｌ／ウェルでプレートした。各実験において、ペプチドを含まないウェルを含めた。２日後、３００ＩＵ／ｍｌの組み換えインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｃｈｉｒｏｎ、ラーティンゲン、ドイツ）を培養物に添加した。培養された細胞を１２日にＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて反応性について試験した。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ペプチドエピトープ特異性インターフェロン−γ−放出エフェクター細胞を定量化するために用いられるＥＬＩＳＰＯＴアッセイを（１６）におけるのと同様に行った。簡単に説明すると、ニトロセルロース底の９６穴プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＭＡＩＰＮ４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｈｅｄｅｈｕｓｅｎｅ、デンマーク）を抗ＩＮＦ−γ抗体（１−Ｄ１Ｋ、Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｎａｃｋａ、スウェーデン）でコートした。ウェルをＡＩＭＶ培地により洗浄し、ブロックし、細胞を異なる細胞濃度で重複試験において添加した。ペプチドを次いで各ウェルに添加し、プレートを一夜インキュベートした。翌日、培地を捨て、ビオチニル化二次抗体（７−Ｂ６−１−Ｂｉｏｔｉｎ、Ｍａｂｔｅｃｈ）の添加の前にウェルを洗浄した。プレートを２時間インキュベートし、洗浄し、アビジン−酵素接合体（ＡＰ−Ａｖｉｄｉｎ、Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、酵素基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（Ｇｉｂｃｏ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ）を各ウェルに添加し、室温で５〜１０分間インキュベートした。暗紫色スポットが出現したら水道水で洗浄することにより反応を停止させた。ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ、サンリアンドロ、ＣＡ．ＵＳＡ）を用いてスポットをカウントし、ペプチド特異性ＣＴＬ頻度をスポット形成細胞の数から計算することができた。アッセイはすべて各ペプチド抗原について重複試験で行った。

結果
ＨＬＡ−Ａ２に対するスルビビン誘導ペプチドの結合
主ＨＬＡ−Ａ２特異性アンカー残基（１７）を用いて、スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を最もありそうなＨＬＡ−Ａ２ノナマーおよびデカマーペプチドエピトープについてスクリーンした。１０のスルビビン誘導ペプチドを合成し、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合について調べた。ＨＩＶ−１ｐｏｌ４７６−４８４（ＩＬＫＥＰＶＨＧＶ、配列番号１１）（表１）からのエピトープを正の対照として使用した。クラスＩＭＨＣの最大回復の半分に必要なペプチド濃度（Ｃ_５０値）は正の対照について０．７μＭであった。対照的に、Ｓｕｒ９と表されるペプチド（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号３）はＣ_５０＝１０μＭの親和力で結合した。Ｓｕｒ６（ＦＬＫＬＤＲＥＲＡ、配列番号１）およびＳｕｒ８（ＴＬＰＰＡＷＱＰＦＬ、配列番号２）と表されるペプチドはそれぞれＨＬＡ−Ａ２とＣ_５０＝３０μＭで結合するが、Ｓｕｒ１（ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号１０）およびＳｕｒ３（ＫＶＲＲＡＩＥＱＬ、配列番号１３）はさらに弱く結合した（Ｃ_５０＞１００μＭ）。試験した１０のペプチドのうち５つ（Ｓｕｒ２、Ｓｕｒ４、Ｓｕｒ５、Ｓｕｒ７、およびＳｕｒ１０）はＨＬＡ−Ａ２と結合しなかった。
Ｓｕｒ１は弱いＨＬＡ−Ａ２バインダーであるので、より良好なアンカー残基（ロイシンまたはメチオニン）が２位で天然のスレオニンと置換されているＳｕｒ１Ｌ２およびＳｕｒ１Ｍ２でそれぞれ表される２種のペプチド類似体を合成した。これらのペプチドはどちらも正の対照とほとんど同様の高さの親和力でＨＬＡ−Ａ２と結合する（Ｃ_５０＝１μＭ）。

ＣＬＬ患者におけるスルビビンに対するＣＴＬ応答
５人のＨＬＡ−Ａ２陽性ＣＬＬ患者からのＰＢＬをＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける実験の前に一度インビトロで刺激した。この手続きは、ＥＬＩＳＰＯＴの感度を拡大するために選択された。前記１０種のスルビビン誘導ペプチドの全てを実験の第一ラインに含めた。Ｓｕｒ１およびＳｕｒ９に対する応答が検出され、これらのペプチドのデータのみを図に示す。図１は、患者ＣＬＬ１において決定されるＳｕｒ１およびＳｕｒ９に対するＣＴＬ反応性を示す。各スポットは、ペプチド反応性ＩＮＦ−γ産生細胞を表す。ペプチドあたりのスポットの平均数を、ＣＤＤスキャニング装置およびコンピューターシステムを用いて計算した。６×１０^５あたり５２のＳｕｒ９ペプチド特異性スポット（ペプチドが添加されていないスポットを差し引いた後）がＣＬＬ１患者において検出された（図１）。弱ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチドＳｕｒ１に対して反応は検出されなかったが、患者は強ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド類似体Ｓｕｒ１Ｍ２に対して強力に反応した（１０^４細胞あたり３５のペプチド特異性スポット）（図２）。この患者において他の強ＨＬＡ−Ａ２結合ペプチド類似体Ｓｕｒ１Ｌ２に対して反応は検出されなかった。患者ＣＬＬ２はＳｕｒ９に対して強力に反応し（１０^５細胞あたり１２８のペプチド特異性スポット）、Ｓｕｒ１に対しては弱く反応した（１０^５細胞あたり２２のペプチド特異性スポット）（図３）。Ｓｕｒ１Ｌ２類似体に対する応答は、天然のエピトープと比較して若干増大しただけであったが、患者はデカマーペプチドＳｕｒ９に関してはＳｕｒ１Ｍ２ペプチドに対して同様に強力に応答した。患者ＣＬＬ３において、Ｓｕｒ９に対する弱い応答が観察された（図３）。Ｓｕｒ１または修飾Ｓｕｒ１ペプチドに対して該患者においてはスルビビン応答は観察されなかった（データは省略）。スルビビンに対する応答が健康な個人において検出できるかどうかを調べるために、６人の健康なＨＬＡ−Ａ２陽性対照からのＰＢＬを分析した。どの対照においても任意のスルビビン誘導ペプチドに対する応答は観察されなかった。

黒色腫患者におけるスルビビンに対するＣＴＬ応答
ＨＬＡ−Ａ２陽性黒色腫患者からの腫瘍浸潤リンパ節から単離されたＴリンパ球を試験した。新たに切除されたリンパ節を細かく刻んで小フラグメントにし、粉砕して、細胞を培養物中に放出させた。細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける試験前に一度インビトロでペプチドで刺激した。スルビビン特異性Ｔ細胞は分析した６人の患者のうち３人において検出された。患者Ｍｅｌ２およびＭｅｌ３において強力なＳｕｒ９応答が検出された。Ｓｕｒ１ペプチドに対するより弱い応答もこれらの患者において検出された（図４）。Ｍｅｌ１において、弱く結合したペプチドＳｕｒ１に対する応答は、より強力なＨＬＡ−Ａ２バインダーＳｕｒ９に対する応答よりも強力であった（図４）。先の３人の黒色腫患者（Ｍｅｌ４〜６）からの腫瘍浸潤リンパ節において応答は検出されなかった。スルビビン反応性患者の２人（Ｍｅｌ１およびＭｅｌ２）から、および非反応患者の２人（Ｍｅｌ４およびＭｅｌ５）からのＰＢＬを試験した。これらの患者のいずれかからのＰＢＬにおいてＳｕｒ９またはＳｕｒ１のいずれかに対する応答は検出できなかった（データは省略）。

実施例２
癌患者におけるインビボおよびエクスビボのスルビビン誘導ＭＨＣクラスＩ限定Ｔ細胞エピトープに対する自発性細胞毒性Ｔ細胞応答
概要
スルビビン誘導ＭＨＣクラスＩ限定Ｔ細胞エピトープに対する自発性細胞毒性Ｔ細胞応答は、乳ガン、白血病、および黒色腫患者においてインサイチュならびにエクスビボで示された。さらに、ＭＨＣ／ペプチド複合体でコートされた磁気ビーズにより単離されたスルビビン反応性Ｔ細胞は、異なる組織タイプのＨＬＡ適合腫瘍に対して細胞毒性であった。普遍的腫瘍抗原であるので、スルビビンは抗ガン免疫療法の広範囲に適用可能な標的としての働きをすることができる。

材料および方法
Ｔ細胞染色およびＴ細胞選別のためのＨＬＡペプチド複合体の構築
ＨＬＡＡ＊０２０１の細胞外ドメイン（残基１〜２７５）の５’末端との融合物においてビオチンタンパク質リガーゼ（ＢｉｒＡ）を用いた酵素ビオチニル化の認識部位は、イー・コリＢＬ２１（ＤＥ３）において発現された。組み換えタンパク質を、８Ｍ尿素中可溶化させた封入体から、サイズ（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）およびイオン交換（ｍｏｎｏ−Ｑ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーにより精製した。修飾スルビビンペプチドＳｕｒ１Ｍ２（ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ、配列番号５）またはＭＡＡペプチドｇｐ１００１５４−１６３の存在下で希釈によりＨＬＡＡ＊０２０１をインビトロで折り畳み、その後、既に記載されているようにしてビオチニル化した（３５、３６）。ＰｈａｒｍａｃｉａＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム上でゲル濾過して未結合ビオチンを除去した後、タンパク質をストレプトアビジン−ＦＩＴＣ接合デキストラン分子（Ｌ．Ｗｉｎｔｈｅｒ（ＤＡＫＯ、デンマーク）の好意により提供された）でマルチマー化して、免疫組織化学用多価ＨＬＡ−デキストラン化合物を生成させた。ＨＬＡＡ^＊０２０１構築物はＭａｒｋＭ．Ｄａｖｉｓ博士（スタンフォード大学微生物学および免疫学科（パロ・アルト、ＣＡ）の好意により贈呈された。細胞分離は、既に記載されているようにして行った（３７）。簡単に説明すると、５×１０^６ストレプトアビジン接合磁気ビーズ（Ｄｙｎａｌ、オスロ、ノルウェー）を２回２００μｌの冷ＰＢＳ中で洗浄し、０．５μｇのペプチド／Ａ＊０２０１モノマーを添加し、混合物を１５分間室温でインキュベートした。２回洗浄した後、これらのビーズをＰＢＬと１：１０の割合で混合し、その後、１時間インキュベートし、続いて磁場中ビーズ結合細胞を沈降させた。沈降工程を１回繰り返した。

免疫組織化学的染色
ＦＩＴＣ接合マルチマーペプチド／ＭＨＣ複合体で染色するために、組織片を一夜乾燥し、その後冷アセトン中５分間固定した。全てのインキュベーション工程は室温、暗所で：（ｉ）一次抗体（１：１００希釈）を４５分、（ｉｉ）Ｃｙｓ３−接合ヤギ抗マウス（１：５００希釈；コード１１５−１６５−１００、ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｉａｎｏｖａ（ハンブルグ、ドイツ）から入手）を４５分間、および（ｉｉｉ）最後にマルチマーを７５分間で行った。各工程間にスライドを１０分間ＰＢＳ／ＢＳＡ０．１％中で２回洗浄した。スライドをベクタシールド中でマウントし、共焦点顕微鏡下で観察するまで冷蔵庫中で保存した。

細胞毒性アッセイ
ＣＴＬによる細胞毒性の慣用の［５１Ｃｒ］アッセイを（１３）に記載されているようにして行った。標的細胞は自己ＥＢＶ−形質転換Ｂ細胞系、ＨＬＡ−Ａ２陽性乳ガン細胞系ＭＣＦ−７（ＡＴＣＣで入手可能）、ＨＬＡ−Ａ２陽性黒色腫細胞系ＦＭ３（３８）、ＨＬＡ−Ａ２陰性乳ガン細胞系ＢＴ−２０（ＡＴＣＣで入手可能）およびＨＬＡ−Ａ２陰性黒色腫細胞系ＦＭ４５（３８）であった。全てのガン細胞系はＲＴ−ＰＣＲにより調べるとスルビビンを発現した（データは省略）。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
ペプチドエピトープ特異性ＩＦＮ−γ放出エフェクター細胞を定量化するためにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用し、これはすでに記載されている（３９）。簡単に説明すると、ニトロセルロース底の９６穴プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＭＡＩＰＮ４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ）を抗ＩＦＮ−γ抗体（１−Ｄ１Ｋ、Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）でコートし、ＡＩＭＶ（ＧｉｂｃｏＢＲＬ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓＩｎｃ．、ガイサーズバーグ、ＭＤ、ＵＳＡ）を用いて非特異性結合をブロックした。リンパ球を異なる細胞濃度で、特異性ペプチドおよびＴ２細胞と共に添加し、一夜３７℃でインキュベートした。２回洗浄後、ビオチニル化検出抗体（７−Ｂ６−１−ビオチン、Ｍａｂｔｅｃｈ）を添加した。アルカリホスファターゼ−アビジンをそれぞれの基質（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と共に用いて特異性結合を可視化した。暗紫色スポットが出現したら反応を停止させ、ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ、サンリアンドロ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いてこれを定量化した。ＥＬＩＳＰＯＴに使用したペプチドは、実施例１に記載されるようなＳｕｒ１、Ｓｕｒ９およびＳｕｒ１類似ペプチドＳｕｒ１Ｍ２であった。

結果
ＨＬＡ−Ａ２／スルビビン反応性Ｔ細胞のインサイチュ染色
実施例１において、白血病および黒色腫におけるＴ細胞により認識される２種のスルビビン誘導ペプチドエピトープ、すなわちＳｕｒ１が同定された。ＨＬＡ−Ａ２に対するＳｕｒ１の弱い結合親和力は、２位のスレオニンをさらに良好なアンカー残基（メチオニン；Ｓｕｒ１Ｍ２）で置換することにより実質的に向上された。この測定は、安定なＨＬＡ−Ａ２／ペプチド複合体の構築を可能にする。これらの複合体は、デキストラン分子を用いてマルチマー化され、これをストレプトアビジンおよびＦＩＴＣと接合させた。マルチマー化されたＭＨＣ−複合体を、アセトン固定された凍結物質を染色するために使用した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて、Ｓｕｒ１Ｍ２／ＨＬＡ−Ａ^＊０２０１反応性ＣＴＬは腫瘍微小環境においてインサイチュで容易に検出することができた。本発明者らは、一次腫瘍およびＩＩＩ期の黒色腫患者の症徴リンパ節ならびに一次乳ガン病巣においてかかる細胞を表した。染色の特異性を確実にするために、一連の負の対照を行った。ペプチド／ＨＬＡ−デキストランマルチマーと同じ腫瘍上の黒色腫分化抗原ｇｐ１００から誘導されるペプチドの使用も、Ｓｕｒ１Ｍ２／ＨＬＡ−デキストランマルチマーの使用も、ＨＬＡ−Ａ２陰性ドナーから得られる腫瘍サンプルの場合、陽性染色をもたらさなかった。

単離されたスルビビン反応性ＣＴＬは異なる起源の腫瘍細胞系を溶解する
スルビビン反応性ＣＴＬの機能的容量を特徴づけるために、ＨＬＡ−Ａ２／Ｓｕｒ１Ｍ２−複合体（３６）でコートされた磁気ビーズによりこれらの細胞を単離した。新たに切除された黒色腫浸潤リンパ節を細かく刻んで小フラグメントにし、粉砕して、細胞を培養物中に放出させた。細胞を単離前にインビトロでペプチドで一度刺激した。単離後１日で、ＩＬ−２を添加し、５日でこれらの細胞が腫瘍細胞を殺す能力をＥＬＩＳＰＯＴまたは標準的５１Ｃｒ放出アッセイのいずれかにより試験した。まず、ＥＬＩＳＰＯＴ分析により、修飾Ｓｕｒ１Ｍ２／ＨＬＡ−Ａ２複合体を用いて単離されたＣＴＬが天然のＳｕｒ１ペプチドに対しても応答することを立証することができた（データは省略）。第二に、ＨＬＡ−Ａ２陽性黒色腫細胞系ＦＭ３（図５Ａ）およびＨＬＡ−Ａ２陽性乳ガン細胞系ＭＣＦ−７（図５Ｂ）に対するスルビビン反応性の細胞毒性を試験した。単離されたＴ細胞は、両ＨＬＡ−Ａ＊０２０１細胞系を有効に溶解させた。対照的に、ＨＬＡ−Ａ２陰性黒色腫細胞系ＦＭ４５（図５Ａ）またはＨＬＡ−Ａ２陰性乳ガン細胞系ＢＴ−２０（図５Ｂ）に対して細胞毒性は観察されなかった。

ＥＬＩＳＰＯＴによりＰＢＬにおいて測定されるスルビビン反応性
１０人のＨＬＡ−Ａ２陽性乳ガン患者からのスルビビン反応性Ｔ細胞の存在をＥＬＩＳＰＯＴにより試験した。分析前に、ＰＢＬを一度インビトロで刺激して、アッセイの感度を拡大した。次のスルビビンペプチド：Ｓｕｒ１、Ｓｕｒ９およびＳｕｒ１Ｍ２に対する反応性を試験した。スルビビン特異性Ｔ細胞は１０人のＨＬＡ−Ａ２陽性乳ガン患者のうちの６人において検出された。代表例を図６に示す。２人の患者からのＰＢＬにおいて、Ｓｕｒ１および修飾された類似体Ｓｕｒ１Ｍ２に対してであるが、Ｓｕｒ９（図６、上、中）に対してはない応答が検出され、３人の患者において、Ｓｕｒ９に対する応答が検出されたが、Ｓｕｒ１またはＳｕｒ１Ｍ２に対しては検出されず（図６、下）、１人の患者がＳｕｒ１Ｍ２にのみ反応した。対照的に、２０人の健康なＨＬＡ−Ａ２陽性ドナーからのＰＢＬにおいてはスルビビン応答は検出されなかった。同様に、１４人のＨＬＡ−Ａ２陽性黒色腫患者からのＰＢＬを試験した。スルビビン応答はこれらの患者のうちの７人において存在した（表２）。２人の患者がＳｕｒ９ペプチドに対して応答し、２人がＳｕｒ１Ｍ２ペプチドに対して応答し、１人がＳｕｒ１とＳｕｒＭ２の両方に対して応答し、１人が３つのペプチド全てに対して応答した。実施例１において、３人の慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）患者におけるスルビビンに対するＴ細胞応答を試験した（表２：ＣＬＬ１、ＣＬＬ２、ＣＬＬ３）。３人のさらに別のＣＬＬ患者からのＰＢＬを使用してこれらの実験をさらに拡大した。明らかに、全ての患者は少なくとも１つのスルビビンエピトープに対してＴ細胞応答をもたらした（表２；ＣＬＬ５、ＣＬＬ６、ＣＬＬ７）。加えて、慢性骨髄性白血病（ＣＭＬ）にかかっている１人の患者からのＰＢＬを試験した。この患者において、３つのペプチド全てに対する応答が同定された（データは省略）。データを表２にまとめる。

ａ）１０^４あたりの反応性細胞の出現率；１４人の患者を試験した。
ｂ）１０^４あたりの反応性細胞の出現率；１０人の患者を試験した。
ｃ）１０^５あたりの反応性細胞の出現率；７人の患者を試験した。

実施例３
癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するＨＬＡ−Ｂ３５限定免疫応答
概要
この実験において、ＨＬＡ−Ｂ３５に限定される２種のスルビビン誘導エピトープを同定し、特徴づけた。これらのエピトープの両方に対する特異性Ｔ細胞反応性は、異なる造血性悪性腫瘍および黒色腫を有する患者からの末梢血において存在した。Ｃ末端アンカー残基の置換は、黒色腫患者からの腫瘍浸潤リンパ球による認識を向上させた。さらに、一次黒色腫病巣におけるインサイチュのスルビビンに対する自発性細胞毒性Ｔ細胞応答が示された。これらのエピトープは関連する患者の悪性腫瘍ならびにＨＬＡ特性に関連してスルビビンペプチドに基づく将来のワクチン法の適用可能性を拡大する。
実施例１および２において、ＨＬＡ−Ａ２限定スルビビン誘導Ｔ細胞エピトープを試験した。ＨＬＡ−Ａ２は白色人種集団の約３０％においてのみ発現され（６３）、治療できる患者の割合を拡大するために他のＨＬＡクラスＩ分子に限定されるペプチドエピトープを同定する必要がある。この研究において、白色人種集団の９％において発現される（６３）ＨＬＡ−Ｂ３５に限定されるスルビビンからの２種の新規Ｔ細胞エピトープを同定し、これらのスルビビンペプチドに対する自発的免疫応答は、異なる造血性悪性腫瘍および黒色腫を有する患者において検出された。

材料および方法
患者
癌患者からの末梢静脈血を集め、Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離を用いてＰＢＬを単離し、ＨＬＡ分類し（大学病院臨床免疫学科、コペンハーゲン）、１０％ＤＭＳＯを含むＦＣＳ中で凍結させた。さらに分析するために１０人のＨＬＡ−Ｂ３５陽性患者を選択した。これらの患者はそれぞれ、黒色腫、ＣＬＬ、濾胞性リンパ腫（ＦＬ）、肥満性大細胞型Ｂ細胞リンパ腫（ＤＬＢＣＬ）および多発性骨髄腫（ＭＭ）にかかっていた。血液サンプルを集めた時点で、患者はそれ以前の４ヶ月以内に医学的治療を受けていなかった。さらに、リンパ節から単離された腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を３人の黒色腫患者から集め、１０％ＤＭＳＯを含むＦＣＳ中で凍結させた。

ペプチド
７種の合成スルビビン誘導ペプチド：Ｓｕｒ６−１４、Ｓｕｒ１１−１９、Ｓｕｒ３４−４３、Ｓｕｒ４６−５４、Ｓｕｒ５１−５９、Ｓｕｒ４６Ｙ９、Ｓｕｒ５１Ｙ９、およびＥＢＶ誘導ペプチドの一つであるＥＢＮＡ３Ａ４５７−４６６（６３）をこの研究において使用した。全てのペプチドはＲｅｓｅａｒｃｈＧｅｎｅｔｉｃｓ（ハンツビル、ＡＬ）から入手し、ＨＰＬＣおよびＭＣ分析により確認されるように＞９０％の純度で提供された。ペプチドを次の表３に示す。

ＭＨＣクラスＩ分子に対するペプチド結合のアセンブリーアッセイ
合成ペプチドの［３５Ｓ］メチオニンで代謝的に標識されたＨＬＡ−Ｂ３５分子に対する結合親和力を測定するために実施例１および２に記載されるアセンブリーアッセイを使用した。簡単に説明すると、アッセイは、ＨＬＡ−Ｂ３５（Ｊ．Ｈａｕｒｕｍ博士の好意により提供されたもの、ＳｙｍｐｈｏｇｅｎＡｐＳ、Ｌｙｎｇｂｙ、デンマーク）で安定にトランスフェクトされたＴＡＰ欠損細胞系Ｔ２から細胞溶解により放出される空ＨＬＡ分子のペプチドによる安定化に基づく。安定に折り畳まれたＨＬＡ分子を、構造依存性ｍＡｂＷ６／３２を用いて免疫沈降させた。ＨＬＡ分子をＩＥＦ電気泳動により分離し、ゲルをホスホルイメージャースクリーン（Ｉｍａｇｉｎｇｐｌａｔｅ、富士写真フィルム株式会社、日本）に暴露し、分析し、適切に折り畳まれたＨＬＡ分子の量を、ＩｍａｇｅＧａｕｇｅホスホルイメージャーソフトウェア（富士写真フィルム株式会社、日本）を用いて定量化した。

ＰＢＬの抗原刺激
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの感度を拡張するために、リンパ球を分析前にペプチドでインビトロで一度刺激した（１４、１５）。ＰＢＬまたはＴＩＬを解凍し、９６穴プレート中５０μＭの個々のペプチドエピトープで２時間２６℃で刺激し（ペプチドあたり５×１０^５〜１０^６細胞）、さらに１０日間３７℃で５％ヒト血清（ＨＳ）を含むｘ−ｖｉｖｏ中２４穴プレート（Ｎｕｎｃ、ロスキレ、デンマーク）中、２×１０^６細胞／ウェルで培養するためにプールした。インキュベーションの第２日に、４０μｇ／ｍｌのＩＬ−２（ＡｐｏｄａｎＡ／Ｓ、デンマーク）を添加した。１０日に、培養された細胞をＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおける反応性について試験した。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
癌患者から集められたＰＢＬまたはＴＩＬにおけるペプチド特異性ＩＦＮ−γ放出エフェクター細胞を定量化するために使用されたＥＬＩＳＰＯＴアッセイは、実施例１に記載されるようにして行った。簡単に説明すると、ニトロセルロース底の９６穴プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＭＡＩＰＮ４５；Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｈｅｄｅｈｕｓｅｎｅ、デンマーク）をヒトＩＦＮ−γに対するｍＡｂ、７．５μｇ／ｍｌ（１−Ｄ１Ｋ；Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｎａｃｋａ、スウェーデン）でコートした。ウェルを洗浄し、ｘ−ｖｉｖｏ（ｘ−ｖｉｖｏ１５ＴＭＢｉｏＷｈｉｔｔａｃｋｅｒ、ＭｏｌｅｃｕｌａｒＡｐｐｌｉｃａｔｉｏｓＡＰＳ、デンマーク）中でブロックし、細胞を重複試験において異なる濃度で添加した。抗原提示のために、１０^４Ｔ２−Ｂ３５細胞（１０μＭペプチドを含むか含まない）を各ウェルに添加した。プレートを一夜インキュベートし、細胞を捨て、ビオチニル化二次抗体（７−Ｂ６−１−ビオチン；Ｍａｂｔｅｃｈ）を添加する前にウェルを洗浄した。プレートを２時間室温でインキュベートし、洗浄し、アビジン−アルカリホスファターゼ接合体を添加した（ＡＰ−Ａｖｉｄｉｎ；Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．）。１時間室温でインキュベーションした後、酵素基質ニトロブルーテトラゾリウム／５−ブロモ−４−クロロ−３−インドリルホスフェート（コード番号Ｋ０５９８、ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎＮｏｒｄｅｎＡ／Ｓ）を添加し、暗紫色スポットが３〜７分で出現した。水道水で洗浄することにより反応を停止させた。ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ、サンリアンドロ、ＣＡ）を用いてスポットをカウントし、ペプチド特異性Ｔ細胞の出現率をスポット形成細胞の数から計算した。
全てのアッセイは、各ペプチド抗原について重複試験において行い、同じウェルにおいて培養されたリンパ球を同じ細胞数で、ペプチドと共にまたはペプチド無しで試験して、培養物中のペプチド特異性細胞の数を測定した。

樹状細胞（ＤＣ）の成熟化
接着細胞を培養の２時間後にＰＢＬから単離した。これらをさらに１０日間、１０％ＦＣＳを含むＲＰＭＩ１６４０（ＧｉｂｃｏＴＭＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、ＵＫ）において培養した。８００ｎｇ／ｍｌのＧＭ−ＣＦＳ（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ、ロンドン、ＵＫ）および４０ｎｇ／ｍｌのＩＬ−４（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ）を３日おきに添加した。１０日に、５０ｎｇ／ｍｌのＴＮＦ−α（ＰｒｅｐｒｏＴｅｃｈ）を添加することによりＤＣを２４時間成熟化させた。成熟化後、ＤＣを放出させ、３μｇ／ｍｌのβ２−ミクログロブリンの存在下、２０μＭペプチドで２時間、２６℃でパルスした。

ペプチド特異性Ｔ細胞の単離
実施例２において記載されたｓｕｒ５１Ｙ９／ＨＬＡ−Ｂ３５コートされた磁気ビーズを用いて抗体特異性細胞を単離した。２．５μｇのモノマーを５×１０^６ビーズと共に４０μｌのＰＢＳ中２０分間室温でインキュベートすることにより、ＨＬＡ−Ｂ３５とｓｕｒ５１Ｙ９のビオチニル化モノマー（ＰｒｏＩｍｍｕｎｅ、オックスフォード、ＵＫから入手）をストレプトアビジンコートされた磁気ビーズ（ＤｙｎａｂｅａｄｓＭ−２８０、ＤｙｎａｌＡ／Ｓ、オスロ、ノルウェー）とカップリングさせた。磁気装置（ＤｙｎａｌＡ／Ｓ、オスロ、ノルウェー）を用いて磁気複合体を３回ＰＢＳ中で洗浄し、その後、５％ＢＳＡを含むＰＢＳ中１：１０の割合でＰＢＬと混合し、非常に穏やかに１時間回転させた。磁気複合体と結合する抗原特異性ＣＤ８^＋細胞を２または３回穏やかに洗浄した。単離された細胞を、５％ヒト血清で補足されたｘ−ｖｉｖｏ中に数回再懸濁させ、２時間インキュベートした後、磁気ビーズを放出させ、細胞懸濁液から除去した。天然のペプチドと修飾されたペプチド間の交差反応性を分析するために、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにおいて単離された抗原特異性ＣＤ８^＋Ｔ細胞を使用した。

変性勾配ゲル電気泳動（ＤＧＧＥ）によるＴＣＲクローン型マッピング
ヒトＴＣＲＢＶ領域１〜２４のＤＧＧＥクローン型マッピングは、（６６）に詳細に記載されている。簡単に説明すると、Ｐｕｒｅｓｃｒｉｐｔ単離キット（ＧｅｎｔｒａＳｙｓｔｅｍｓＩｎｃ．ＭＮ）を用いてＲＮＡを単離し、共通の定常領域プライマーとともにＴＣＲベータ鎖の可変領域のプライマーを用いたＰＣＲにより転写されたｃＤＮＡを増幅した。コンピュータープログラムＭＥＬＴ８７を使用して、５０ｂｐのＧＣリッチな配列（ＧＣ−ｃｌａｍｐ）が定常領域プライマーの５’末端に結合すると仮定すると、増幅されたＤＮＡ分子がＤＧＧＥ分析に適することが確認された。ＤＧＧＥ分析を、２０％から８０％の尿素とホルムアミドの勾配を含有する６％ポリアクリルアミドゲル中で行った。電気泳動を１６０Ｖで４．５時間、１×ＴＡＥ緩衝液中、５４℃の一定温度で行った。

免疫組織化学的染色
実施例２に記載された手順を用いて、癌患者の腫瘍病巣において抗原特異性Ｔ細胞をインサイチュで同定するためにマルチマー化ペプチド／ＨＬＡ複合体を使用した。ビオチニル化ｓｕｒ５１Ｙ９／ＨＬＡ−Ｂ３５モノマーはＰｒｏｉｍｍｕｎｅｌｉｍｉｔｅｄ、オックスフォード、ＵＫから供給された。ｓｕｒ５１Ｙ９／ＨＬＡ−Ｂ３５のビオチニル化されたモノマーは、ストレプトアビジン−ＦＩＴＣ接合デキストラン分子（Ｌ．Ｗｉｎｔｅｒ博士（ＤＡＫＯ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）の好意により提供されたもの）でマルチマー化し、免疫組織化学のために多価ＨＬＡ−デキストラン化合物を生成させた。組織片を一夜乾燥し、続いて冷アセトン中５分間固定した。全てのインキュベーション工程は、暗所、室温で行った：（ａ）４５分の一次抗体（１：１００希釈）（ｂ）Ｃｙ３−接合ヤギ抗マウス抗体（１：５００希釈；コード１５５−１６５−１００；ＪａｃｋｓｏｎＩｍｍｕｎｏＲｅｓｅａｒｃｈ、Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ、ドイツから入手）を４５分間；最後に（ｃ）マルチマーを７５分間。各工程間で、スライドをＰＢＳ／ＢＳＡ０．１％中１０分間２回洗浄した。スライドをベクタシールド中でマウントし、共焦点顕微鏡（Ｌｅｉｃａ）下で観察するまで冷蔵庫中に入れた。

結果
ＨＬＡ−Ｂ３５結合スルビビン誘導ペプチドの同定
スルビビンのアミノ酸配列を、アンカー残基を有するノナマーおよびデカマーペプチドについて、ＨＬＡ−Ｂ３５のペプチド結合モチーフにしたがってスクリーニングした（６７）。２位にＮ末端アンカーとしてプロリンを、Ｃ末端アンカー残基としてフェニルアラニン、ロイシン、イソロイシンまたはチロシンを含有する５種のペプチドを選択した（表３）アセンブリーアッセイにより、ＨＬＡ−Ｂ３５を有効に安定化させることができる２種のペプチド、ｓｕｒ５１−５９（ＥＰＤＬＡＱＣＦＦ、配列番号７）およびｓｕｒ４６−５４（ＣＰＴＥＮＥＰＤＬ、配列番号６）が明らかになった。さらに、２種のペプチド、ｓｕｒ３４−４３（ＴＰＥＲＭＡＥＡＧＦ、配列番号２０）およびｓｕｒ６−１４（ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ、配列番号１８）は弱い安定化を示すが、残りのペプチドはＨＬＡ−Ｂ３５を全く安定化しなかった。ＨＬＡ−Ｂ３５の最大回復の半分に必要なペプチド濃度（Ｃ５０）は、ｓｕｒ５１−５９について１３μＭ、ｓｕｒ４６−５４について２０μＭと推定される。比較として、ＥＢＮＡ３Ａ４５８−４６６（ＹＰＬＨＥＱＨＱＭ、配列番号２１）からの陽性対照−エピトープＣ２４は０．８μＭの推定Ｃ_５０値を有していた。
ｓｕｒ４６−５４およびｓｕｒ５１−５９の結合親和力を向上させるために、Ｃ末端アミノ酸を、さらに良好なアンカー残基であるチロシンと置換した（６７）。修飾ペプチドによるＨＬＡ−Ｂ３５の回復をアセンブリーアッセイにおいて分析し、Ｃ_５０値はｓｕｒ５１Ｙ９について１．５μＭ、ｓｕｒ４６Ｙ９について４μＭと推定された（図７）。

天然のペプチドエピトープに対する自発性免疫応答
最初に、５人の患者を４種の天然のＨＬＡ−Ｂ３５結合ペプチドｓｕｒ５１−５９、ｓｕｒ４６−５４、ｓｕｒ３４−４３およびｓｕｒ６−１４に対する自発性免疫応答について分析した。これらの５人の患者は異なる造血性悪性腫瘍を有していた：ＨＥＭ８およびＨＥＭ１８はＭＭにかかり、ＨＥＭ１２はＦＬ、ＨＥＭ９はＤＬＢＣＬ、ＣＬＬ５はＣＬＬにかかっていた。
ペプチド前駆体ＣＴＬを検出するために１０日のインビトロ刺激後、ＰＢＬに関してＩＮＦ−γＥＬＩＳＰＯＴアッセイを行った。自発性免疫応答が天然のＨＬＡ−Ｂ３５結合ペプチドのうちの２つ、ｓｕｒ５１−５９およびｓｕｒ４６−５４に対して検出された。２人の患者、ＨＥＭ１２およびＣＬＬ５は、ｓｕｒ５１−５９およびｓｕｒ４６−５４の両方に対して応答を示したが、ＨＥＭ８はｓｕｒ５１−５９に対してのみ応答を示した（図８ＡおよびＢ）。２人の残りの患者、ＨＥＭ９およびＨＥＭ１８において応答は検出できず、任意の患者において弱く結合したペプチドｓｕｒ３４−４６およびｓｕｒ６−１４に対する応答は検出できなかった。
インビトロ刺激に対する別の方法を患者ＨＥＭ１２において使用した。すなわち、ＰＢＬを、ｓｕｒ５１−５９でパルスされた成熟自己樹状細胞と同時培養して、インビトロのＣＴＬ応答を刺激した。この培養物から得られるＰＢＬはＥＬＩＳＰＯＴにおいてｓｕｒ５１−５９に対して強い反応性を示した（図８Ｂ）。

修飾ペプチドの増大した認識
前記のように、ＨＬＡ−Ｂ３５親和力を増大するためのペプチド修飾の結果、天然のペプチドと比較してＨＬＡ−Ｂ３５について５〜１０倍の高い親和力が得られた。５人の黒色腫患者のグループを、ＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより天然および修飾ペプチドの両方に対する自発性免疫応答について分析した。ＰＢＬサンプルはインビトロ刺激後に分析し、ＴＩＬサンプルは直接分析した。自発性免疫応答は、５人の患者のうち３人からのＰＢＬまたはＴＩＬのいずれかにおいて観察された。ＦＭ２５はＰＢＬおよびＴＩＬサンプルの両方においてｓｕｒ５１−５９およびｓｕｒ−５１Ｙ９に対して反応性を示した（図９Ａ）。ＦＭ４５は修飾ペプチドｓｕｒ５１Ｙ９に対してのみ応答し、強力な応答がＴＩＬにおいて検出可能であった。ＰＢＬはこの患者からは得られなかった（図９Ａ）。ＦＭ７４はＴＩＬにおいてｓｕｒ４６Ｙ９に対して強い応答を示したが、天然のペプチドに対する応答は検出できなかった（図９Ｂ）。ｓｕｒ４６Ｙ９に対する弱い応答がＦＭ７４からのＰＢＬにおいても観察された（データは省略）。

天然および修飾ペプチド間の交差反応性
ｓｕｒ５１Ｙ９のＨＬＡ−Ｂ３５に対する高い親和力は、ｓｕｒ５１Ｙ９を有するＨＬＡ−Ｂ３５の安定なモノマーの産生を可能にする。異なる癌患者から得られる腫瘍浸潤リンパ節およびＰＢＬにおけるスルビビン反応性Ｔリンパ球の存在を確認して、磁気ビーズをかかるＨＬＡ−Ｂ３５／Ｓｕｒ５１Ｙ９複合体でコートし、スルビビンペプチド反応性Ｔリンパ球を患者ＣＬＬ５から得られるＰＢＬから単離するためにこれらを使用した。この患者は、ｓｕｒ５１−５９に対して強力な応答を示した。顕微鏡で可視化されるようにビーズは特定的細胞の細胞表面上にしっかりと結合し（データは省略）、磁場による抗原特異性細胞の沈降を可能にする。単離されたｓｕｒ５１Ｙ９特異性細胞はｓｕｒ５１−５９に対して強力に応答することができ（図９）、残りのＰＢＬにおいては応答は検出できなかった（データは省略）。単離は、ＲＴ−ＰＣＲ／ＤＧＧＥに基づくＴＣＲクローン型マッピングにより分析した。この技術により、ごく少数の細胞しか利用可能でない場合でも、複合細胞集団におけるＴ細胞クローン分析が可能になる。これらの分析は、８の異なるクローンが単離されたことを示した（データは省略）。

黒色腫病巣においてインサイチュで存在する抗原特異性Ｔ細胞
ストレプトアビジンおよびＦＩＴＣと接合したデキストラン分子を用いてｓｕｒ５１Ｙ９／ＨＬＡ−Ｂ３５モノマーをマルチマー化した。マルチマー化されたＭＨＣ複合体を使用して、実施例２に記載された手順を用いてアセトン固定された凍結物質を染色した。共焦点レーザー顕微鏡を用いて抗原特異性細胞を可視化した。３人の患者から得られる一次黒色腫の断片を分析し、Ｓｕｒ５１Ｙ９／ＨＬＡ−３５反応性ＣＴＬは患者の一人における腫瘍微小環境においてインサイチュで容易に検出できた。グランザイムＢに対するｍＡｂでの同時染色により、これらのスルビビン特異性ＣＴＬはグランザイムＢを放出し、細胞毒性活性を発揮することが示され、ＨＬＡ−Ｂ３５陰性黒色腫患者を対照として使用した（データは省略）。

実施例４
異なるＨＬＡ−Ａ限定特性を有する新規スルビビン誘導ＣＴＬエピトープの同定
概要
新規ＨＬＡ−Ａ１−、ＨＬＡ−Ａ２−、ＨＬＡ−Ａ３−およびＨＬＡ−Ａ１１−限定スルビビンエピトープを癌患者におけるＣＴＬ応答に基づいて特徴づけた。これらのエピトープは明らかにスルビビン誘導ペプチドに基づく免疫療法に適した患者の数を増大させた。さらに、いくつかの限定エレメントの全体的ターゲティングはＨＬＡ−対立遺伝子損失による免疫回避の危険性を減少させる。

材料および方法
患者
患者サンプルはＷｕｒｚｂｕｒｇ大学（ドイツ）およびＨｅｒｌｅｖ（デンマーク）の大学病院から受け取った。これらの測定の前に患者からインフォームドコンセントを得た。組織タイピングは大学病院の臨床免疫学科（コペンハーゲン、デンマーク）で行った。Ｌｙｍｐｈｏｐｒｅｐ分離を用いて黒色腫、乳ガン、および慢性リンパ性白血病（ＣＬＬ）の癌患者から得られる末梢血リンパ球（ＰＢＬ）を単離し、１０％ジメチルスルホキシドを含むウシ胎仔血清（ＦＣＳ）中で凍結させた。さらに、黒色腫患者からの一次病巣および組織浸潤リンパ節からのＴリンパ球を得た。新たに切除された腫瘍組織を細か刻んで小フラグメントにし、粉砕して低温保存するために腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）を放出させた。
ペプチド
全てのペプチドはＩｎｖｉｔｒｏｇｅｎ（カールズバッド、ＣＡ，ＵＳＡ）から購入し、ＨＰＬＣおよびＭＳ分析により確かめられるように＞８０％の純度で提供された。使用した全てのペプチドを以下の表４および実施例５に記載する。

細胞系
ヒトＴ細胞系はＢ−ＬＣＬ．１７４およびＬＣＬＣＥＭ細胞のＴＡＰ１およびＴＡＰ２欠損ハイブリッドであり、従って低レベルのＨＬＡクラスＩ分子（ＨＬＡ−Ａ＊０２０１およびＨＬＡ−Ｂ＊５１０１）を細胞表面で発現するだけである。ＨＬＡ−Ａ＊０３０１でトランスフェクトされたＴ２細胞はＡＭｃＭｉｃｈｅａｅｌ博士（ＩＭＭ、ジョン・ラドクリフ病院、オックスフォード）の好意により提供された。ＨＬＡ−Ａ＊１１０１でトランスフェクトされたＴ２細胞はＭＭａｓｕｃｃｉ博士（ＭＴＣ、カロリンスカ協会、ストックホルム、スウェーデン）の好意により提供された。ＢＭ３６．１細胞系もＴＡＰ機能が欠損し、表面でＨＬＡクラスＩ（ＨＬＡ−Ａ＊０１０１、ＨＬＡ−Ｂ＊３５０１）の低発現を有するＴ２と同様の表現型を有する。ＢＭ３６．１細胞はＡＺｉｅｇｌｅｒ博士（フンボルト大学、ベルリン、ドイツ）の好意により提供された。

ＭＨＣクラスＩ分子に対するペプチド結合についてのアセンブリーアッセイ
［^３５Ｓ］−メチオニンで代謝的に標識された合成ペプチド（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ、カールズバッド、ＣＡ、ＵＳＡ）のＨＬＡ−Ａ１、−Ａ２、−Ａ３、または−Ａ１１に対する結合親和力を既に記載されているようにして（１２）アセンブリーアッセイにおいて測定した。アッセイは、ＴＡＰ欠損細胞系から細胞溶解により放出された空ＨＬＡ分子のペプチドによる安定化に基づく。ＨＬＡクラスＩ特異性構造依存性ｍＡｂＷ６／３２を用いて安定に折り畳まれたＨＬＡ分子を免疫沈降させ、等電点（ＩＥＦ）ゲル電気泳動法により分離した。ＩｍａｇｅＧａｕｇｅホスホルイメージャープログラム（フジ写真フイルム株式会社、カロルトン、Ｔｘ、ＵＳＡ）を用いてＭＨＣ重鎖バンドを定量化した。バンドの強度はアッセイ中に回収されるペプチド結合クラスＩＭＨＣ複合体の量に比例する。次に、ＨＬＡ分子の安定化の程度は添加されたペプチドの結合親和力と直接関連する。ＨＬＡ分子の回収を分析するために使用されるペプチド濃度は、ＨＬＡ−Ａ１およびＨＬＡ−Ａ１１については４０、４、０．４、０．０４μＭ、ＨＬＡ−Ａ２およびＨＬＡ−Ａ３については１００、１０、１、０．１、０．０１μＭであった。Ｃ_５０値を次に各ペプチドについて最大安定化の半分に必要なペプチド濃度として計算した。

ＰＢＬの抗原刺激
ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの感度を拡大するために、ＰＢＬを分析前に一度インビトロで刺激した。０日に、ＰＢＬまたは粉砕されたリンパ節を解凍し、ｘ−ｖｉｖｏ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド）、５％熱不活化ヒト血清、および２ｍＭのＬ−グルタミン中、１０μＭのペプチドの存在下で、２４穴プレート（Ｎｕｎｃ、ロスキレ、デンマーク）中、２ｍｌ／ウェルで２×１０^６細胞としてプレートした。２日後、２０ＩＵ／ｍｌの組み換えインターロイキン−２（ＩＬ−２）（Ｃｈｉｒｏｎ、ラーティンゲン、ドイツ）を培養物に添加した。培養された細胞を１０日にＥＬＩＳＰＯＴにおいて反応性について試験した。

ＥＬＩＳＰＯＴアッセイ
既に記載されているようにして（１６）、ペプチドエピトープ特異性インターフェロン−γ放出エフェクター細胞を定量化するためにＥＬＩＳＰＯＴアッセイを使用した。簡単に説明すると、ニトロセルロース底の９６穴プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＭＡＩＰＮ４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｈｅｄｅｈｕｓｅｎｅ、デンマーク）を抗ＩＦＮ−γ抗体（１−Ｄ１Ｋ、Ｍａｂｔｅｃｈ、Ｎａｃｋａ、スウェーデン）でコートした。ウェルを洗浄し、ｘ−ｖｉｖｏ培地によりブロックし、細胞を重複試験において異なる細胞濃度で添加した。ペプチドをついで各ウェルに添加し、プレートを一夜インキュベートした。翌日、培地を捨て、ビオチニル化二次抗体（７−Ｂ６−１―ビオチン、Ｍａｂｔｅｃｈ）の添加前にウェルを洗浄した。プレートを２時間インキュベートし、洗浄し、アビジン−アルカリホスファターゼ接合体（Ｃａｌｂｉｏｃｈｅｍ、ＬｉｆｅＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｉｎｃ．サンディエゴ、ＣＡ、ＵＳＡ）を各ウェルに添加した。プレートを室温で１時間インキュベートし、洗浄し、酵素基質ＮＢＴ／ＢＣＩＰ（ＤａｋｏＣｙｔｏｍａｔｉｏｎ、ＮｏｒｄｅｎＡ／Ｓ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を各ウェルに添加し、室温で５〜１０分間インキュベートした。暗紫色スポットが出現したら、水道水で洗浄することにより反応を停止させた。ＩｍｍｕｎｏＳｐｏｔシリーズ２．０アナライザー（ＣＴＬＡｎａｌｙｚｅｒｓ、ＬＬＣ、クリーブランド、ＵＳ）を用いてスポットをカウントし、スポット形成細胞の数からペプチド特異性ＣＴＬ出現率を計算できた。全てのアッセイは各ペプチド抗原について重複試験において行った。

結果
ＨＬＡ−Ａ１限定スルビビンエピトープの同定
ＨＬＡ−Ａ１に対するスルビビン誘導ペプチドの結合
主ＨＬＡ−Ａ１特異性アンカー残基、３位のアスパラギン酸（Ｄ）、グルタミン酸（Ｅ）およびＣ末端のチロシン（Ｙ）、フェニルアラニン（Ｆ）を用いて、スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を最もありそうなＨＬＡ−Ａ１ノナマーおよびデカマーペプチドエピトープについてスクリーンした。その結果、６のスルビビン誘導ペプチドが合成され、ＨＬＡ−Ａ１に対する結合について調べた（表４）。さらに、２つのペプチドＳｕｒ３８−４６（ＭＡＥＡＧＦＩＨＣ）（配列番号２３）およびＳｕｒ４７−５６（ＰＴＥＮＥＰＤＬＡＱ）（配列番号２５）は両方ともＲａｍｍｅｎｓｅｅら（ｈｔｔｐ：／／ｓｙｆｐｅｉｔｈｉ．ｂｍｉ−ｈｅｉｄｅｌｂｅｒｇ．ｃｏｍ／で入手可能）による予想アルゴリズムにより可能な良好なバインダーとして同定されたので、主なアンカーの一つを含有するのみであるにもかかわらず、含まれていた。Ｃ_５０値は各ペプチドについて、ＨＬＡ−Ａ１の最大回復の半分に必要なペプチド濃度として推定された（表４）。しかしながら、これらのペプチドの一つＳｕｒ９２−１０１（ＱＦＥＥＬＴＬＧＥＦ）（配列番号２７）のみがインフルエンザＡタンパク質からの公知の正の対照エピトープ、図１０に例示されるような塩基性ポリメラーゼ１（ＰＢ１）（ＶＳＤＧＧＰＮＬＹ）とほとんど同様の高い親和力で結合する。Ｓｕｒ９３−１０１（ＦＥＥＬＴＬＧＥＦ）（配列番号２４）はＨＬＡ−Ａ１に対して低い結合親和力を有し、一方、分析された他のペプチドはどれもＨＬＡ−Ａ１と結合しなかった（表４）。従って、本発明者らは、良好なアンカー残基が天然のペプチドと置換された多くの類似ペプチドを合成した。本発明者らは、Ｃ末端でそれぞれシステイン（Ｃ）またはグルタミン（Ｑ）の代わりにチロシン（Ｙ）を導入して２種のペプチド、Ｓｕｒ３８−４６（ＭＡＥＡＧＦＩＨＣ）（配列番号２３）およびＳｕｒ４７−５６（ＰＴＥＮＥＰＤＬＡＱ）（配列番号２５）を修飾した。修飾されたペプチドはいずれもＨＬＡ−Ａ１と強力に結合した（表４）。さらに、本発明者らは、２つのペプチドＳｕｒ９２−１０１およびＳｕｒ９３−１０１において２位のアミノ酸を補助アンカースレオニン（Ｔ）またはセリン（Ｓ）で置換した。これらの修飾はＳｕｒ９２−１０１のＨＬＡ−Ａ１に対する結合の正の影響を有していなかった。対照的にＳｕｒ９３Ｔ２（ＦＴＥＬＴＬＧＥＦ）（配列番号３６）はＨＬＡ−Ａ１と高い親和力で結合した（表４）。図１０は、天然の低親和力ペプチドＳｕｒ９３−１０１、高親和力修飾ペプチドＳｕｒ９３Ｔ２および非結合ペプチドＳｕｒ４９−５８の、インフルエンザから得られる正の対照エピトープと比較しての結合を示す。最後に、本発明者らは、Ｓｕｒ１４−２２、Ｓｕｒ３４−４３、Ｓｕｒ４９−５８、Ｓｕｒ５１−５９、Ｓｕｒ９２−１０１、およびＳｕｒ９３−１０１をＣ末端でチロシン（Ｙ）で修飾したが、これはこれらのペプチドのいずれについてもＨＬＡ−Ａ１に対する結合親和力を向上させなかった（データは省略）。

癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ１限定ＣＴＬ応答
６人の黒色腫患者から得られるＰＢＬおよび３人の黒色腫患者から得られるＴＩＬを、ＥＬＩＳＰＯＴにより、４種の高親和力スルビビン推定ペプチドＳｕｒ３８Ｙ９、Ｓｕｒ４７Ｙ１０、Ｓｕｒ９２−１０１、およびＳｕｒ９３Ｔ２のいずれかに対するＣＴＬ特異性の存在について分析した。スルビビン誘導ペプチドの少なくとも一つに対するＴ細胞反応性は、分析された９人の患者の全部からの３種のＰＢＬサンプルおよび１種のＴＩＬサンプルにおいて観察された。図１１において見られるように、１人の患者Ｍｅｌ．Ａ１−３からのＰＢＬは４種のペプチド、Ｓｕｒ３８Ｙ９、Ｓｕｒ４７Ｙ１０、Ｓｕｒ９２−１０１、およびＳｕｒ９３Ｔ２に対するＴ細胞応答を有していた。Ｍｅｌ．Ａ１−２は、Ｓｕｒ４７Ｙ１０、Ｓｕｒ９２−１０１およびＳｕｒ９３Ｔ２に対して応答を示したが、Ｍｅｌ．Ａ１−１／ＴＩＬおよびＭｅｌ．Ａ１−４／ＰＢＬ応答はそれぞれＳｕｒ４７Ｙ１０およびＳｕｒ９３Ｔ２に対して観察された（図１１）。
加えて、１０人の黒色腫患者をＥＬＩＳＰＯＴにより天然のペプチドＳｕｒ９３−１０１、Ｓｕｒ３８−４６およびＳｕｒ４７−５６に対する免疫反応性について試験したが、これらの患者のいずれにおいてもペプチド特異性応答は検出されなかった（データは省略）。

ＨＬＡ−Ａ１１限定スルビビンエピトープの同定
スルビビン誘導ペプチドのＨＬＡ−Ａ１１に対する結合
スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を、ＨＬＡ−Ａ３およびＨＬＡ−Ａ１１を包含するＨＬＡ−Ａ３超科のものに対応する結合モチーフを有するノナマーまたはデカマーペプチドについてスクリーンした。主要アンカー残基、２位にロイシン（Ｌ）およびＣ末端にリシン（Ｋ）を有するペプチド配列を、Ｒａｍｍｅｎｓｅｅらによる予想アルゴリズムにしたがってこれらの位置に関連するアミノ酸を有するペプチド配列と共に選択した（表４）。
１３種のペプチドをスルビビンのタンパク質配列から予想し、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ３との結合にいて分析した。これらのペプチドのうちの３つ、Ｓｕｒ５３−６２（ＤＬＡＱＣＦＦＣＦＫ）（配列番号４７）、Ｓｕｒ５４−６２（ＬＡＱＣＦＦＣＦＫ）（配列番号４２）およびＳｕｒ１１２−１２０（ＫＩＡＫＥＴＮＮＫ）（配列番号４４）は、ＥＢＶ核抗原４からのウイルスエピトープ（ＡＶＦＤＲＫＳＤＡＫ）（配列番号６３）に匹敵する高い親和力でＨＬＡ−Ａ１１と結合した。加えて、１つのペプチド、Ｓｕｒ１１２−１２１（ＫＩＡＫＥＴＮＮＫＫ）（配列番号５１）はＨＬＡ−Ａ１１と弱く結合した（表４）。

癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ１１限定ＣＴＬ応答
５人の黒色腫患者および２人のＣＬＬ患者からのＰＢＬを、４種のＨＬＡ−Ａ１１結合ペプチド、Ｓｕｒ５３−６２；Ｓｕｒ５４−６２、Ｓｕｒ１１２−１２０、およびＳｕｒ１１２−１２１に対するＴ細胞反応性について試験した。本発明者らは、２人の黒色腫患者Ｍｅｌ．Ａ１１−１、Ｍｅｌ．Ａ１１−２からのＰＢＬにおいてＥＬＩＳＰＯＴによりスルビビン誘導ペプチドＳｕｒ５３−６２に対する応答を検出することができた（図１２）。さらに、本発明者らは、患者Ｍｅｌ．Ａ１１−２において腫瘍浸潤リンパ節からの腫瘍浸潤リンパ球（ＴＩＬ）中Ｓｕｒ５３−６２特異性Ｔ細胞を検出した（図１２）。患者Ｍｅｌ．Ａ１１−１において、スルビビンペプチドＳｕｒ５３−６２に対する強力な免疫応答が２年の期間にわたって採取された５種の異なるサンプルにおいて観察された（データは省略）。

ＨＬＡ−Ａ３限定スルビビンエピトープの同定
ＨＬＡ−Ａ３に対するスルビビン誘導ペプチドの結合
ＨＬＡ−Ａ３超科に対する結合について予想されるスルビビン誘導ペプチドをＨＬＡ−Ａ３に対する結合についてさらに分析した。２つのペプチドＳｕｒ１１２−１２０（ＫＩＡＫＥＴＮＮＫ）（配列番号４４）およびＳｕｒ１１２−１２１（ＫＩＡＫＥＴＮＮＫＫ）（配列番号５７）のみが、ウイルスエピトープ、インフルエンザＡ核タンパク質２６５−２７３（ＩＬＲＧＳＶＡＨＫ）（配列番号７４）と同様に、ＨＬＡ−Ａ３と高い親和力で結合した（表４）。さらに、２つのペプチドＳｕｒ５３−６２（ＤＬＡＱＣＦＦＣＦＫ）（配列番号４７）およびＳｕｒ９５−１０３（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫ）（配列番号４３）はＨＬＡ−Ａ３と弱く結合した。

ＨＬＡ−Ａ３についての結合親和力を増大させるために検出可能な結合を有さないペプチドのいくつかを修飾した。かくして、本発明者らは、さらに良好なアンカー残基ロイシン（Ｌ）が２位の天然のアラニン（Ａ）と置換されているＳｕｒ５４−６２およびＳｕｒ１１３−１２２の２つの類似ペプチドを合成した。Ｓｕｒ５４Ｌ２（ＬＬＱＣＦＦＣＦＫ）（配列番号５６）はＨＬＡ−Ａ３と高い親和力で結合するが、Ｓｕｒ１１３Ｌ２（ＩＬＫＥＴＮＮＫＫＫ）（配列番号５９）は弱くしか結合しなかった（表４）。加えて、本発明者らは、Ｃ末端の天然のフェニルアラニン（Ｆ）がさらに良好なアンカー残基リシン（Ｋ）で置換されたＳｕｒ５−１３、Ｓｕｒ１３−２２、Ｓｕｒ１８−２７、およびＳｕｒ５３−６１の４つの類似ペプチドを合成した。Ｓｕｒ５Ｋ９（ＴＬＰＰＡＷＱＰＫ）（配列番号５４）およびＳｕｒ１８Ｋ１０（ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＫ）（配列番号５８）はＨＬＡ−Ａ３と高い親和力で結合するが、置換は天然の類似体と比較して、Ｓｕｒ１３Ｋ９（ＦＬＫＤＨＲＩＳＴＫ）（配列番号５７）およびＳｕｒ５３Ｋ９（ＤＬＡＱＣＦＦＣＫ）（配列番号５５）に対する結合に関して検出可能な影響を及ぼさなかった。

癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ３限定ＣＴＬ応答
黒色腫患者からの９サンプル（５ＰＢｌおよび４ＴＩＬ）を、２つの天然の高親和力ＨＬＡ−Ａ３結合ペプチドＳｕｒ１１２−１２０およびＳｕｒ１１２−１２１、ならびに２つの天然の弱結合ペプチドＳｕｒ５３−６２およびＳｕｒ９５−１０３に対する免疫反応性について分析した。しかしながら、これらのペプチドに対する免疫応答はどの患者においてもＥＬＩＳＰＯＴにおいて検出できなかった。したがって、同じ患者を３つの高親和性修飾スルビビン誘導ペプチドＳｕｒ５Ｋ９、Ｓｕｒ１８Ｋ１０、およびＳｕｒ５４Ｌ２に対する自発性免疫反応性について分析した。ＣＴＬ反応性は、３人の患者、Ｍｅｌ．Ａ３−１、Ｍｅｌ．Ａ３−２、Ｍｅｌ．Ａ３−３からのＴＩＬサンプルにおけるＳｕｒ１８Ｋに対して検出された（図１３）。２つの他のペプチド、Ｓｕｒ５Ｋ９およびＳｕｒ５４Ｌ２に対する応答は検出されなかった。これらの応答をさらに確認するために、さらに１８人の黒色腫患者からのＰＢＬをＳｕｒ１８Ｋ１０に対するＣＴＬ反応性について分析した。３人の応答する患者、Ｍｅｌ．Ａ３−４、Ｍｅｌ．Ａ３−５、およびＭｅｌ．Ａ３−６がこれらのなかから見いだされ、その結果、２７人の分析された患者のうち合計６人の患者が応答した（図１３）。

新規ＨＬＡ−Ａ２限定スルビビンエピトープの同定
ＨＬＡ−Ａ２に対する１１−ｍｅｒスルビビン誘導ペプチドの結合
スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を、主要ＨＬＡ−Ａ２特異性アンカー残基を用いて最も可能性の高いＨＬＡ−Ａ２１１−ｍｅｒペプチドエピトープについてスクリーンした。６種のスルビビン推定ペプチドを合成し、ＨＬＡ−Ａ２に対する結合について調べた。調べたペプチドはどれも、Ｅｐｔｅｉｎ−ＢａｒｒウイルスＢＭＬＦ_{２８０−２８８}ペプチド（ＧＬＣＴＬＶＡＭＬ）（配列番号７２）からの公知の正対照エピトープと同様の高い親和力では結合しなかった（表４）。ＨＬＡ−Ａ２の最大回復の半分に必要なペプチド濃度（Ｃ_５０値）は正の対照について０．９μＭであった。比較として、ペプチドＳｕｒ１８−２８（ＲＩＳＴＦＫＮＷＰＦＬ）（配列番号６７）およびＳｕｒ８６−９６（ＦＬＳＶＫＫＱＦＥＥＬ）（配列番号６９）はＨＬＡ−Ａ２と弱く結合した（Ｃ_５０はそれぞれ６９μＭおよび７２μＭ）。しかしながら、公知のＨＬＡ−Ａ２限定スルビビンエピトープはＨＬＡ−Ａ２と同様に弱く結合し；Ｓｕｒ９５−１０４（ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ）（配列番号４３）は中くらいの親和力で結合し（Ｃ_５０＝１０μＭ）、Ｓｕｒ９６−１０４（ＬＴＬＧＥＦＬＫＬ）（配列番号１０）は弱くしか結合しなかった（Ｃ_５０＞１００μＭ）。試験した残りの４つの１１−ｍｅｒペプチド、（Ｓｕｒ４−１４（ＰＴＬＰＰＡＷＱＰＦＬ）（配列番号６６）、Ｓｕｒ５４−６４（ＬＡＱＣＦＦＣＦＫＥＬ）（配列番号６８）、Ｓｕｒ８８−９８（ＳＶＫＫＱＦＥＥＬＴＬ）（配列番号７０）、およびＳｕｒ１０３−１１３（ＫＬＤＲＥＲＡＫＮＫＩ）（配列番号７４）はＨＬＡ−Ａ２と結合しなかった。

癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するＨＬＡ−Ａ２限定ＣＴＬ応答
２種の弱結合１１ｍｅｒペプチド、Ｓｕｒ１８−２８およびＳｕｒ８６−９６がＨＬＡ−Ａ２により提示され、癌患者の免疫系により認識されるかどうかを調べるために、１０人の癌患者（２人の黒色腫（Ｍｅｌ）、６人のＣＬＬ（ＣＬＬ）、および２人の乳ガン（ＭＣ）患者）をまず分析した。Ｓｕｒ１８−２８に対するＣＴＬ応答が、分析された１０人の患者のうちの２人（ＣＬＬ−１、ＣＬＬ−２、図１４）からのＰＢＬにおいて見いだされ、一方、Ｓｕｒ８６−９６に対して応答は検出されなかった（データは省略）。これらのＳｕｒ１８−２８特異性応答を確認するために、さらに１２人の患者（７人の黒色腫、１人のＣＬＬ、および４人の乳ガン患者）からのＰＢＬをこのペプチドに対するＣＴＬ反応性に関して分析した。これらのうち、４人の患者（ＣＬＬ−３、ＭＣ−１、ＭＣ−２、Ｍｅｌ．Ａ２−１）がＥＬＩＳＰＯＴにより検出可能なＳｕｒ１８−２８特異性免疫活性を有していた（図１４）。従って、分析された２２人の患者のうち６人のＰＢＬはＳｕｒ１８−２８に対するＣＴＬ応答を有していた。

ＨＬＡ−Ｂ７限定スルビビンエピトープの同定
ＨＬＡ−Ｂ７に対するスルビビン誘導ペプチドの結合
スルビビンタンパク質のアミノ酸配列を、ＨＬＡ−Ｂ７のペプチド結合モチーフのアンカー残基を有する９〜１０のアミノ酸のペプチドについてスクリーンした。５つのペプチドを選択し、アセンブリーアッセイにおいてＨＬＡ−Ｂ７を安定化させるその能力について分析した。Ｃ_５０値を各ペプチドについてＨＬＡ−Ｂ７の最大安定化の半分に必要なペプチド濃度として推定した（表４）。２つのスルビビン誘導ペプチドｓｕｒ６−１４（ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ）（配列番号１８）およびｓｕｒ１１−１９（ＱＰＦＬＫＤＨＲＩ）（配列番号１９）はＨＬＡ−Ｂ７を若干安定化させ、Ｃ_５０値は１００μＭ以上であり；ｓｕｒ４６−５４（ＣＰＴＥＮＥＰＤＬ）（配列番号６）、ｓｕｒ５１−５９（ＥＰＤＬＡＱＣＦＦ）（配列番号７）、およびｓｕｒ３４−４３（ＴＰＥＲＭＡＥＡＧＦ）（配列番号２０）はＨＬＡ−Ｂ７と結合しなかった（表４）。

癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するＨＬＡ−Ｂ７限定ＣＴＬ応答
５人の黒色腫患者（ｍｅｌ２５、ｍｅｌ２６、ｍｅｌ３、ｍｅｌ６、ｍｅｌ３９）、２人のＣＬＬ患者（ＣＬＬ１、ＣＬＬ５４）および２人の乳ガン患者（ｂｒｅａｓｔ１１、ｂｒｅａｓｔ１５）から得られるＨＬＡ−Ｂ７陽性ＰＢＬを弱ＨＬＡ−Ｂ７結合ペプチドｓｕｒ６−１４（ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ）（配列番号１８）およびｓｕｒ１１−１９（ＱＰＦＬＫＤＨＲＩ）（配列番号１９）に対するＴ細胞反応性について試験した。本発明者らは、ＣＬＬ患者および乳ガン患者におけるスルビビン誘導ペプチドｓｕｒ６−１４に対して強力な自発的ＣＴＬ応答を検出ることができた（図１５）。さらに、本発明者らは、黒色腫患者ｍｅｌ３においてこのペプチドに対する弱い応答を検出することができた（図１５）。

癌患者におけるスルビビン誘導ペプチドに対するＨＬＡ対立遺伝子限定免疫応答の概要
前記実施例において記載されたＭＨＣクラスＩ分子に対するペプチド結合についてのアセンブリーアッセイを用いて、９〜１１のアミノ酸残基を含む一連のスルビビン誘導ペプチドを次のＨＬＡ対立遺伝子との結合について試験した：ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ｂ７。加えて、ペプチドのいくつかを、これも前記のＥＬＩＳＰＯＴを用いてＣＴＬ免疫応答を惹起するその能力について試験した。
前記実施例において得た結果を含む結果のまとめを以下の表４に示す。

^ｉＥＬＩＳＰＯＴにより１人のリンパ腫患者（ＨＥＭ３４）においてペプチドＳｕｒ１１２−１２０に対する応答が観察された。^ｉｉＥＬＩＳＰＯＴにより３人のリンパ腫患者（ＨＥＭ９、１１、３４）においてペプチドＳｕｒ５３−６２に対して応答が検出された。^ｉｖＥＬＩＳＰＯＴにより黒色腫患者（ＦＭ−ＴＩＬ９５）において弱い応答が観察された。^ｖｉｉ黒色腫患者（ＰＭ６）においてＳｕｒ１１２−１２１に対する応答が観察され、転移性リンパ節懸濁液において最も顕著であり、ＥＬＩＳＰＯＴにより一次腫瘍からのＴＩＬおよびＰＢＬにおいてはさらに弱かった。
^ｖｉｉｉＣＬＬ患者（ＣＬＬ９）においてペプチドＳｕｒ６−１４に対する応答が観察され、ｅｌｉｓｐｏｔによりリンパ腫患者（ＨＥＭ２１）においてさらに弱い応答が観察された（データは省略）。

実施例５
免疫原としてスルビビン誘導体を用いた治療試験法
概要
５人のよく前治療されたＩＶ期の黒色腫患者に、修飾されたＨＬＡ−Ａ２限定スルビビンエピトープ、すなわち、例外的使用設定において自己樹状細胞により提示されたｓｕｒ１Ｍ２ペプチドをワクチン接種した。患者のうち４人はこのエピトープに対してＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定すると強力なＴ細胞応答を示した。さらに、インサイチュペプチド／ＨＬＡ−Ａ２マルチマー染色により、スルビビン反応性細胞の内臓組織および軟組織転移中への浸潤が明らかになった。明らかに、毒性を伴うワクチン接種は観察されなかった。データから、後期黒色腫患者においてもスルビビンに対するＴ細胞応答を惹起でき、これらのワクチン接種は良好な耐用性を有することが示された。

材料および方法
患者の適格基準および治療計画
全ての臨床手順は、ヘルシンキ宣言に従い、すべての患者は治療前にインフォームドコンセントを受けた。ＩＶ期の皮膚またはぶどう膜黒色腫患者は、少なくとも２種の異なる化学、免疫、または化学免疫療法にもかかわらず疾患が進行している場合に適格であった。加えて、患者は１８歳以上であり、ＨＬＡＡ＊０２０１を発現し、頭蓋、胸郭および腹部コンピューター断層撮影法により確認される測定可能な疾患にかかっていなければならなかった。患者のクラノフスキー指数は６０％以上でなければならなかった。全身的化学および／または免疫療法を、ワクチン接種前４週間以内に行わなかった。重要な除外基準は、ＣＮＳ転移、活性自己免疫または感染性疾患、妊娠および授乳、ならびに重大な精神異常の徴候であった。ペプチドパルス化樹状細胞は既に記載されているように生成された（８２）。簡単に説明すると、白血球除去輸血から得られるＰＢＭＣをＬｙｍｐｈｏｐｒｅｐＴＭ（ＮｙｃｏｍｅｄＰｈａｒｍａ）で単離し、アリコートに分けて凍結し、液体窒素中で貯蔵した。ワクチン接種の１週間前に、ＰＢＭＣを解凍し、洗浄し、ゲンタマイシン、グルタミンおよび熱不活化自己血漿を含有する培地中で培養した。１日および５日に、ＩＬ−４およびＧＭ−ＣＳＦを添加した。成熟ＤＣを分化させるために、ＴＮＦ−γおよびプロスタグランジンＥ２を６日に添加した。７日に、成熟ＤＣの表現型および形態的特徴、すなわち不明瞭な外観および＝７５％ＣＤ８３発現を示す細胞を修飾スルビビン誘導ＨＬＡ−Ａ２限定スルビビン_{９６−１０４}エピトープ、ＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号１０）（Ｃｌｉｎａｌｆａ、スイス）１４でパルス化した。１日および５日に培養物から採取されたサンプルの微生物試験が無菌であると証明される場合にのみ細胞をワクチン接種に使用した。

最初の２回のワクチン接種については７日間隔、続いてさらなるワクチン接種について２８日間隔で患者にワクチン接種した。合計１０〜２０×１０６の成熟スルビビン_{９６−１０４}パルス化ＤＣを、１％ヒト血清アルブミンを含有するＰＢＳ中に再懸濁させ、局所リンパ節に近い大腿部の腹側正中領域において、注射部位ごとに１．５×１０６ＤＣのアリコートで皮内注射した。排液リンパ節が除去および／または照射された肢節を排除した。患者の健康状態の重大な悪化またはＣＮＳ転移の発生の不在下で、５回のワクチン接種後に白血球除去輸血を繰り返した。

臨床および免疫学的応答の測定
ワクチン接種前、およびその後３ヶ月ごとまたは疾患の進行の重大な臨床的徴候が見られた場合に、ＣＴスキャンを行った。３ヶ月ごとに得られるＰＢＭＣを用いて免疫学的応答をＥＬＩＳＰＯＴアッセイによりモニターして、スルビビン_{９６−１０４}特異性ＩＦＮ−γ放出を検出した。ＥＬＩＳＰＯＴアッセイの感度を拡大するために、ＰＢＭＣを、５％熱不活化ヒト血清および２ｍＭのＬ−グルタミンで補足されたｘ−ｖｉｖｏ培地（ＢｉｏＷｈｉｔｔａｋｅｒ、Ｗａｌｋｅｒｓｖｉｌｌｅ、メリーランド）中、１０μＭのペプチドの存在下で、２４穴プレート（Ｎｕｎｃ、デンマーク）中１×１０^６細胞／ｍｌの濃度でインビトロで１回刺激した。２日後、４０ＩＵ／ｍｌの組み換えインターロイキン−２（Ｉｌ−２）（Ｃｈｉｒｏｎ、ラーティンゲン、ドイツ）を添加した。１０日後、細胞を反応性について試験した。この目的のために、ニトロセルロース底の９６穴プレート（ＭｕｌｔｉＳｃｒｅｅｎＭＡＩＰＮ４５、Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｇｌｏｓｔｒｕｐ、デンマーク）を抗ＩＮＦ−γ抗体（１−Ｄ１Ｋ、Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）でコートした。リンパ球を、ウェルごとに２００μｌのｘ−ｖｉｖｏ培地中１０^４〜１０^５細胞で１０^４Ｔ２細胞および当該ペプチドと共に最終濃度２μＭで添加した。３７℃で一夜インキュベーションし、２回洗浄した後、ビオチニル化検出抗体（７−Ｂ６−１−ビオチン、Ｍａｂｔｅｃｈ、スウェーデン）を添加し；アルカリホスファターゼ−アビジンをそれぞれの基質（ＧｉｂｃｏＢＲＬ）と共に使用して、その特異的結合を可視化した。暗紫色（ＡｌｐｈａＩｍａｇｅｒＳｙｓｔｅｍ（ＡｌｐｈａＩｎｎｏｔｅｃｈ、サンリアンドロ、ＣＡ、ＵＳＡ）を用いて定量化した）が出現したら反応を停止させた。

スルビビン_{９６−１０４}／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１反応性ＣＤ８＋Ｔリンパ球を、マルチマースルビビン_{９６−１０４}／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１複合体により、ワクチン接種部位ならびに内臓、軟組織、または皮膚転移の両方でインサイチュで追跡した。ワクチン接種部位を全ての患者において皮内注射後２４時間で切除し、一方、転移病巣は、容易にアクセス可能である選択された患者（患者ＫＮおよびＧＢ）においてのみ除去するか、または治癒目的で除去した（患者ＷＷ）。マルチマーペプチド／ＭＨＣ複合体の染色法は既に記載されている（６８）。ＨＬＡ−Ａ＊０２０１の細胞外領域（残基１−２７５）の５’末端で酵素ビオチニル化の認識部位を導入することにより、マルチマースルビビン_{９６−１０４}／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１複合体を生成させた。組み換えタンパク質をサイズ排除（ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５、Ｐｈａｒｍａｃｉａ、エルランゲン、ドイツ）およびイオン交換（ｍｏｎｏ−Ｑ、Ｐｈａｒｍａｃｉａ）クロマトグラフィーにより精製し、それぞれのペプチドおよびβ２−ミクログロブリンの存在下での希釈によりインビトロで折り畳んだ。ＳｅｐｈａｄｅｘＧ２５カラム上でのゲル濾過後、タンパク質をデキストラン分子と接合させたストレプトアビジン−ＦＩＴＣ（Ｌ．Ｗｉｎｔｅｒ博士（ＤＡＫＯ、コペンハーゲン、デンマーク）の好意により提供されたもの）でマルチマー化して、多価ＨＬＡ−デキストラン複合体を生成させた。それぞれのサンプルの低温保存断片を一夜乾燥し、続いて冷アセトン中で５分間固定した。全てのインキュベーション工程を暗所、室温で次のように行った：（ｉ）抗体−ＣＤ８抗体（１：１００、クローンＨＩＴ８ａ、Ｐｈａｒｍｉｎｇｅｎ、サンディエゴ、ＣＡ）を４５分間、（ｉｉ）Ｃｙ３−接合ヤギ抗マウス（１：５００希釈；コード１１５−１６５−１００、Ｄｉａｎｏｖａ、ハンブルグ、ドイツ）を４５分間、最後に（ｉｉｉ）マルチマーを７５分間。各工程間で、スライドをＰＢＳ／ＢＳＡ０．１％中１０分間２回洗浄した。最後に、スライドをベクタシールド中でマウントし、Ｌｅｉｃａ共焦点顕微鏡（ＴＣＳ４Ｄ、Ｌｅｉｃａ、マンハイム、ドイツ）下で観察した。

結果
患者の特徴、毒性および臨床経過
５人のかなり進行したＩＶ期黒色腫患者を登録させた。２人はぶどう膜黒色腫にかかっており、１人は軟組織黒色腫にかかっており、残りの１人は皮膚黒色腫にかかっていた。症候性脳転移の徴候のために、１人の患者は２回だけワクチン接種した後治療をやめた。他の４人の患者は１５回までのワクチン接種を受けた。１人の患者は残存する転移を外科的に切除した後、腫瘍のない状態で心不全により死亡した。もう一人の患者は内臓転移（ＲＷ）の出現のために１０回のワクチン接種後に治療をやめた。１人の患者は１５回のワクチン接種後も実験を続けた。詳細な患者の特徴、薬歴、ワクチン接種回数および生存状況を表５にまとめる。

重大な毒性は起こらなかった。従って、ヘモグロビン、白血球および血小板、ならびに乳酸脱水酵素、クレアチニンおよびコリンエステラーゼはワクチン接種療法により影響を受けなかった（図１６）。全身性または局所毒性の徴候は注射部位で観察されなかった。さらに、傷の治癒の低下、出血性障害、心不全、脈管炎または炎症性腸管疾患は検出されなかった。１人の患者（ＷＷ）において、既存の肝臓転移はワクチン接種療法下で安定化されたが、新しい副腎転移が起こった。残念なことに、この患者は治療的手術後に腫瘍がなかったが心不全のために死亡した。脳転移が患者ＰＢにおいてワクチン接種開始後わずか４週間で検出された。従って、この患者は２回のみＤＣ注射した後さらなるワクチン接種から排除しなければならなかった。他の３人の患者はその全般的な健康状態が実質的に損なわれることなく転移性疾患のゆっくりした進行を示した。際だって、患者ＫＮに関して、ワクチン開始時での重度の転移および疾患の進行が速かったにもかかわらず、１３ヶ月（ワクチン開始から死亡まで）の全体的な生存が達成された。患者ＧＢはスルビビン−ペプチドパルス化ＤＣでのワクチン接種の開始後１４ヶ月でプロトコルを続けていた。しかしながら、両患者（ＲＷおよびＧＢ）は腫瘍抑制のために、皮下腫瘍の照射（ＲＷ）または局所化学療法（ＧＢ）のいずれかの追加の局所治療を受けていたことに注目すべきである。

スルビビン特異性ＣＤ８＋Ｔ細胞応答
細胞毒性Ｔ細胞応答の反応速度をモニターするために、ワクチン接種前および３ヶ月後に得られたＰＢＭＣを、ＩＦＮ−γについてのＥＬＩＳＰＯＴにより修飾スルビビン_{９６−１０４}エピトープに対する反応性について試験した。分析前に、このアッセイの感度を拡大するためにＰＢＭＣを一度インビトロで刺激した。試験した４人の患者全てにおいて、スルビビン_{９６−１０４}反応性Ｔ細胞の誘発が顕著であった（図１７）。他のＨＬＡ−Ａ＊０２０１限定スルビビンペプチド、すなわち非修飾スルビビン_{９６−１０４}および隣接するＳｕｒ９エピトープに対する反応性についての分析は、患者のうちの２人（ＫＮおよびＲＷ）においてこれらのペプチドに対してＴ細胞応答を示した（データは省略）。

末梢血における腫瘍特異性Ｔ細胞応答の測定の予後および臨床値は繰り返し問題として取り上げられてきた；従って、本発明者らはペプチド／ＭＨＣマルチマー染色によるインサイチュ腫瘍浸潤リンパ球中、スルビビン_{９６−１０４}／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１反応性ＣＤ８＋Ｔリンパ球の存在についても試験した。この方法を有効にするために、本発明者らはまず２４時間以内にワクチン接種部位で発生する遅延型過敏性反応からの組織サンプルを分析した。この分析により、ペプチドパルス化ＤＣの皮内注射は強力なペプチド特異性炎症性Ｔ細胞浸潤を誘発するという先の観察が確認された。次に、ペプチド／ＭＨＣマルチマー染色法を軟組織および内臓転移に適用し、これによりＣＤ８＋浸潤物中スルビビン_{９６−１０４}／ＨＬＡ−Ａ＊０２０１反応性細胞の存在が明らかになった。この観察により、ワクチン接種は所望の特異性を有するＴ細胞を誘発するだけでなく、これらに必要なホーミング能力を付与することが示唆される。

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78. Jager, E., Ringhoffer, M., Altmannsberger, M., Arand, M., Karbach, J., Jager, D., Oesch, F., and Knuth, A. Immunoselection in vivo: independent loss of MHC class I and melanocyte differentiation antigen expression in metastatic melanoma. Int.J.Cancer, 71: 142-147, 1997.

79. Thurner, B., Haendle, I., Roder, C., Dieckmann, D., Keikavoussi, P., Jonuleit, H., Bender, A., Maczek, C., Schreiner, D., von den, D. P., Brocker, E. B., Steinman, R. M., Enk, A., Kampgen, E., and Schuler, G. Vaccination with mage-3A1 peptide-pulsed mature, monocyte-derived dendritic cells expands specific cytotoxic T cells and induces regression of some metastases in advanced stage IV melanoma. J.Exp.Med., 190: 1669-1678, 1999.

80. Yee, C., Thompson, J. A., Roche, P., Byrd, D. R., Lee, P. P., Piepkorn, M., Kenyon, K., Davis, M. M., Riddell, S. R., and Greenberg, P. D. Melanocyte destruction after antigen-specific immunotherapy of melanoma: direct evidence of t cell-mediated vitiligo. J.Exp.Med., 192: 1637-1644, 2000.

81. Simon, R. M., Steinberg, S. M., Hamilton, M., Hildesheim, A., Khleif, S., Kwak, L. W., Mackall, C. L., Schlom, J., Topalian, S. L., and Berzofsky, J. A. Clinical trial designs for the early clinical development of therapeutic cancer vaccines. J.Clin.Oncol., 19: 1848-1854, 2001.

Claims

スルビビンから誘導されるＭＨＣクラスＩ限定エピトープペプチドであって、以下の特性：
（ｉ）クラスＩＨＬＡ分子を最大半分まで回復できるペプチドの量により測定される親和力（Ｃ_５０値）（本明細書に記載するようなアセンブリー結合検定により測定すると最大５０μＭである）で限定されるクラスＩＨＬＡ分子との結合能；
（ｉｉ）癌患者のＰＢＬ集団においてＥＬＩＳＰＯＴアッセイにより測定すると少なくとも１／１０^４ＰＢＬの頻度でＩＮＦ−γ産生細胞を惹起する能力；および／または
（ｉｉｉ）エピトープペプチドと反応するＣＴＬの腫瘍組織におけるインサイチュ検出能；のうちの少なくとも一つを有する、エピトープペプチド。
最大３０μＭであるＣ_５０値を有する請求項１記載のペプチド。
最大２０μＭであるＣ_５０値を有する請求項１〜２のいずれか１項に記載のペプチド。
ＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ａ分子により限定される請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
ＨＬＡ−Ａ１、ＨＬＡ−Ａ２、ＨＬＡ−Ａ３、ＨＬＡ−Ａ１１およびＨＬＡ−Ａ２４からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＨＬＡ種により限定される請求項４記載のペプチド。
ＨＬＡ−Ａ２により限定される請求項４または５のいずれか１項に記載のペプチド。
ＦＬＫＬＤＲＥＲＡ（配列番号１）、ＴＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号２）、ＥＬＴＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号３）、ＬＬＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号４）およびＬＭＬＧＥＦＬＫＬ（配列番号５）からなる群から選択される請求項４〜６のいずれか１項に記載のペプチド。
ＭＨＣクラスＩクラスＩＨＬＡ−Ｂ分子により限定される請求項１〜３のいずれか１項に記載のペプチド。
ＨＬＡ−Ｂ７、ＨＬＡ−Ｂ３５、ＨＬＡ−Ｂ４４、ＨＬＡ−Ｂ８、ＨＬＡ−Ｂ１５、ＨＬＡ−Ｂ２７およびＨＬＡ−Ｂ５１からなる群から選択されるＭＨＣクラスＩＨＬＡ−Ｂ種により限定される請求項８記載のペプチド。
ＨＬＡ−Ｂ３５またはＨＬＡ−Ｂ７により限定される請求項８または９のいずれか１項に記載のペプチド。
ＣＰＴＥＮＥＰＤＬ（配列番号６）、ＥＰＤＬＡＱＣＦＦ（配列番号７）、ＣＰＴＥＮＥＰＤＹ（配列番号８）、ＥＰＤＬＡＱＣＦＹ（配列番号９）、ＬＰＰＡＷＱＰＦＬ（配列番号１８）およびＱＰＦＬＫＤＨＲＩ（配列番号１９）からなる群から選択される請求項８〜１０のいずれか１項に記載のペプチド。
最大２０個のアミン酸残基を含む前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
最大１０個のアミノ酸残基を含む請求項１２記載のペプチド。
ノナペプチドまたはデカペプチドである前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
哺乳動物種のスルビビンの天然の配列である前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
ヒトスルビビンから誘導される請求項１５記載のペプチド。
少なくとも１個のアミノ酸残基の置換、欠失または付加によりスルビビンの天然の配列から誘導される前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
リン酸化される前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
米国特許第６．２４５．５２３号において開示されている天然のスルビビンのＴｈｒ３４を含む請求項１８記載のペプチド。
各特異性ＨＬＡ対立遺伝子に関して次の表に示すようなアミン酸残基のいずれかを含む前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド：
癌患者のＰＢＬ集団においてＩＮＦ−γ産生細胞を少なくとも１０／１０^４ＰＢＬの頻度で惹起する能力を有する前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
スルビビンが発現される癌疾患を有する患者のＰＢＬ集団においてＩＮＦ−γ産生細胞を惹起する能力を有する前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
癌疾患が、慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌からなる群から選択される請求項２２記載のペプチド。
癌疾患を有する患者のＰＢＬ集団において、乳癌細胞系ＭＣＦ−７および黒色腫細胞系ＦＭ３からなる群から選択される細胞系を包含する癌細胞系のスルビビン発現細胞に対して細胞傷害効果を有するＩＮＦ−γ産生細胞を惹起する能力を有する前記請求項のいずれか１項に記載のペプチド。
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のペプチドを含む医薬組成物。
請求項４記載のペプチドを請求項８記載のペプチドとの組み合わせにおいて含む請求項２５記載の組成物。
請求項６記載のペプチドを請求項１０記載のペプチドとの組み合わせにおいて含む請求項２６記載の組成物。
癌疾患に対して免疫応答を惹起する能力を有するワクチンである請求項２５〜２７のいずれか１項に記載の組成物。
スルビビンタンパク質ファミリーに属さないかまたはこれから誘導されないタンパク質またはペプチドフラグメントから選択される免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントをさらに含む請求項２５〜２８のいずれか１項に記載の組成物。
スルビビンタンパク質ファミリーに属さないかまたはこれから誘導されないタンパク質またはペプチドフラグメントが細胞アポトーシスの制御に関与するタンパク質またはそのペプチドフラグメントである請求項２９記載の組成物。
スルビビンタンパク質ファミリーに属さないかまたはこれから誘導されないタンパク質またはそのペプチドフラグメントから選択される免疫原性タンパク質またはペプチドフラグメントがＢｃｌ−２またはそのペプチドフラグメントである請求項２９記載の組成物。
マルチエピトープワクチンである請求項２５〜３１のいずれか１項に記載の組成物。
ワクチンがスルビビンが発現される癌疾患に対して免疫応答の惹起能を有する請求項３２記載の組成物。
癌疾患が慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌からなる群から選択される請求項３３記載の組成物。
ワクチンがワクチン接種された対象において癌細胞に対して細胞傷害効果を有するエフェクターＴ細胞の産生を惹起する請求項３３または３４に記載の組成物。
ＰＢＬ中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性Ｔ細胞の存在のエクスビボまたはインサイチュ診断のための組成物であって、請求項１記載のペプチドを含む組成物。
ＰＢＬ中または腫瘍組織におけるスルビビン反応性Ｔ細胞の存在のエクスビボまたはインサイチュ診断のための診断キットであって、請求項１〜２４のいずれか１項に記載のペプチドを含む診断キット。
請求項１記載のペプチドおよびクラスＩＨＬＡ分子またはかかかる分子のフラグメントの複合体。
モノマーである請求項３８記載の複合体。
マルチマーである請求項３８記載の複合体。
スルビビン反応性Ｔ細胞の存在を検出する方法であって、腫瘍組織または血液サンプルを請求項３８記載の複合体と接触させ、該複合体と該組織または該血液細胞との結合を検出することを含む方法。
請求項１〜２４のいずれか１項に記載のペプチドに対して特異的結合能を有する分子。
抗体またはそのフラグメントである請求項４２記載の分子。
請求項４２または４３記載の分子の結合の遮断能を有する分子。
癌の治療用医薬を調製するための請求項１〜２４のいずれか１項において定義されるペプチドの使用。
癌の治療用医薬を調製するための、請求項２５記載の組成物、請求項４２記載の分子または請求項４４記載の分子の使用。
治療される疾患がスルビビンが発現される癌疾患である請求項４５または４６のいずれか１項記載の使用。
癌疾患が慢性リンパ性白血病および慢性骨髄性白血病を含む造血性悪性腫瘍、黒色腫、乳癌、頚癌、卵巣癌、肺癌、結腸癌、膵臓癌および前立腺癌からなる群から選択される請求項４６記載の使用。
さらに別の治療と組み合わせられる請求項４５〜４８のいずれか１項に記載の使用。
さらに別の治療が放射線治療または化学療法である請求項４９記載の使用。