ES2365673T3 - Péptidos derivados de survivina y uso de los mismos. - Google Patents

Abstract

Un péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, siendo dicho péptido epítopo un nona-péptido que tiene la secuencia LPPAWQPFL como se muestra en SEQ ID NO: 18 y al menos una de las siguientes características: (i) es capaz de unirse a la molécula de HLA de clase I a la que está restringido con una afinidad medida por la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C50) que es como máximo de 50 γM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA (ii) es capaz de inducir células productoras de IFN-γ en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10 4 PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o (iii) es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTL que reaccionan con el péptido epítopo.

Description

Campo de la invención

La presente invención se refiere a nuevos péptidos derivados de survivina, y a su uso para fines diagnósticos y terapéuticos, específicamente en cáncer. En particular, los nuevos péptidos son epítopos de células T restringidos a HLA-B7 de MHC de clase I que son capaces de provocar respuestas de células T citotóxicas en pacientes de cáncer, incluyendo respuestas in situ y ex vivo. De una manera específica, tales péptidos nuevos derivan de la proteína inhibidora de apoptosis survivina, un reconocido antígeno asociado a tumor (TAA, por sus siglas en inglés).

Antecedentes técnicos y técnica anterior

El proceso mediante el cual el sistema inmune de mamíferos reconoce y reacciona a los materiales extraños o ajenos es complejo. Una faceta importante del sistema es la respuesta de células T. Esta respuesta requiere que las células T reconozcan e interaccionen con complejos de moléculas de la superficie celular denominados antígenos leucocitarios humanos (HLA), que constituyen el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, y péptidos. Los péptidos derivan de moléculas más grandes, que son procesadas por las células, que también presentan la molécula HLA/MHC. La interacción de las células T y complejos HLA/péptido está restringida, requiriendo una célula T que sea específica para una combinación particular de una molécula de HLA y un péptido. Si no está presente una célula T específica, no hay respuesta de células T, incluso si está presente su complejo asociado. De una manera similar, no hay respuesta si el complejo específico está ausente, pero la célula T está presente.

El mecanismo mediante el cual las células T reconocen las anormalidades celulares también se ha implicado en cáncer. Por ejemplo, en el documento WO 92/20356, se da a conocer una familia de genes que se procesan a péptidos, que a su vez se expresan en las superficies celulares, y pueden producir lisis de las células tumorales por CTL específicos. Estos genes se denominan la familia MAGE, y se dice que codifican para “precursores de antígeno de rechazo tumoral” o moléculas “TRAP”, y los péptidos derivados de los mismos se denominan “antígenos de rechazo tumoral” o moléculas “TRA”.

En el documento WO 94/05304, se dan a conocer nonapéptidos que se unen a la molécula HLA-A1. La referencia da a conocer que dada la especificidad conocida de péptidos particulares para moléculas de HLA particulares, se debe esperar que un péptido particular se una a una molécula de HLA, pero no a otras. Esto es significativo, porque diferentes individuos poseen diferentes fenotipos de HLA. Como resultado, aunque la identificación de un péptido particular como que es un asociado para una molécula de HLA específica tiene ramificaciones diagnósticas y terapéuticas, éstas solamente son pertinentes para los individuos con ese fenotipo de HLA particular.

Se han caracterizado varios péptidos presentados por las moléculas de MHC, y se ha encontrado que algunos de éstos pueden llevar modificaciones postraduccionales que posiblemente tengan un impacto sobre la funcionalidad del complejo HLA-péptido. De esta manera, un número de estudios han asociado las alteraciones en el patrón de fosforilación con la transformación maligna. Además, se ha mostrado que la fosforilación podría tener un efecto neutro, negativo, o incluso positivo, sobre la unión del péptido al MHC de clase I, y que se podrían generar CTL específicos de fosfopéptido, que discriminarían entre las versiones fosforilada y no fosforilada del péptido, mostrando que tales CTL lo más probablemente sean parte del repertorio de CTL restringidos a MHC de clase I. Recientemente, se ha mostrado que los péptidos fosforilados realmente son procesados de una forma natural y presentados por las moléculas de MHC de clase I in vivo. Adicionalmente, se ha establecido la presencia de péptidos fosforilados en extractos de moléculas de clase I aisladas de varias células B transformadas por diferentes EBV.

De esta manera, está bien establecido que los epítopos peptídicos derivados de antígenos asociados a tumor (TAA) pueden ser reconocidos como antígenos por los linfocitos T citotóxicos (CTL) en el contexto de las moléculas de MHC (1). Sin embargo, aunque en general se acepta que la mayoría de, si no todos, los tumores son antigénicos, solamente unos cuantos son en realidad inmunogénicos en el sentido de que la evolución del tumor la controla fácilmente el sistema inmune.

Para superar esta limitación, se han iniciado varios ensayos inmunoterapéuticos, por ejemplo vacunaciones con péptidos derivados de TAA. Para melanoma, el tumor para el que se ha caracterizado el mayor número de TAA definidos por CTL, se han inducido poderosas respuestas de CTL contra los antígenos mediante vacunación y algunos pacientes experimentaron una remisión completa de su enfermedad (2,3). Sin embargo, la mayoría de los epítopos peptídicos utilizados en estos ensayos de vacunación son específicos del melanocito, y estos péptidos no se pueden aplicar para tumores de origen no melanocítico. Además, la expresión de estos TAA es heterogénea entre tumores de diferentes pacientes, e incluso puede variar entre las metástasis obtenidas de un paciente. Sin embargo, durante el último par de años, se han identificado un número de antígenos peptídicos específicos de tumores, que se expresan en un número de cánceres diferentes, es decir, HER-2 (4), Muc-1 (5) y telomerasa (6).

También se ha mostrado que mediante la manipulación apropiada los antígenos tumorales presentes en los tumores se pueden exponer al sistema inmune. Hay estudios que han mostrado que el brazo CTL CD8+ de la respuesta inmune, solo o en combinación con células Th CD4+, constituye el brazo efector anti-tumoral primario de la respuesta inmune adaptativa. Hasta ahora, el enfoque ha estado principalmente sobre el brazo CTL de la respuesta inmune. Sin embargo, cada vez está más claro que la respuesta de células T CD4 desempeña un papel esencial en el rechazo del tumor, en especial en la fase de inducción o en la extensión de una respuesta de CTL in vivo. Por consiguiente, la incorporación de antígenos tumorales restringidos a la clase II en protocolos de vacunación de tumores eficaces, podría aumentar la eficacia de las vacunas.

La apoptosis es un programa genético de suicidio celular, y se ha sugerido que la inhibición de la apoptosis es un mecanismo importante involucrado en la formación de cáncer mediante la extensión del lapso de vida de las células, que favorece la acumulación de mutaciones transformantes (7). La survivina es un miembro recientemente identificado de la familia de inhibidores de las proteínas de apoptosis (IAP). En un análisis de expresión genética global de aproximadamente 4 millones de transcritos, se identificó la survivina como uno de los genes principales invariablemente aumentados en muchos tipos de cáncer, pero no en tejido normal (8). Los tumores malignos sólidos que sobreexpresan survivina incluyen cáncer de pulmón, colon, mama, páncreas y próstata, así como tumores malignos hematopoyéticos (9). Adicionalmente, se han descrito series de melanomas y cánceres de piel no melanoma como invariablemente positivos para survivina (10, 11). La sobreexpresión de survivina en la mayoría de los cánceres humanos sugiere un papel general de inhibición de la apoptosis en la evolución del tumor, una noción sustanciada por la observación de que en el caso del cáncer colorrectal y de vejiga, así como en neuroblastoma, la expresión de survivina estaba asociada con un pronóstico desfavorable. Por el contrario, la survivina es indetectable en tejidos adultos normales. Estas características califican a la survivina como un TAA adecuado tanto para fines diagnósticos como terapéuticos.

Por consiguiente, durante la última década se han identificado un gran número de TAA que son reconocidos por los CTL de una forma restringida al complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Debido a que la survivina se sobreexpresa en la mayoría de los cánceres humanos y la inhibición de su función produce un aumento de la apoptosis, esta proteína puede servir como una diana para las respuestas terapéuticas de CTL. La proteína survivina y el potencial uso diagnóstico y terapéutico de la misma se dan a conocer en (8) y en el documento US 6.245.523. La survivina es una proteína citoplásmica de 16,5 kDa que contiene un único BIR y una región carboxi-terminal enrollada altamente cargada en lugar de un dedo RING, que inhibe la apoptosis inducida por la retirada de factor de crecimiento (IL-3) cuando se transfiere a precursores de células B. El gen que codifica la survivina es casi idéntico a la secuencia del receptor de proteasa de células efectoras-1 (EPR-1), pero está orientado en la dirección opuesta, lo que sugiere de esta manera la existencia de dos genes separados duplicados en una configuración cabeza con cabeza. Según esto, la survivina se puede describir como un producto anti-sentido de EPR-1. Funcionalmente, la inhibición de la expresión de survivina mediante el aumento de su transcrito anti-sentido natural EPR-1, produce apoptosis masiva y crecimiento celular reducido.

El documento US 6.245.523 da a conocer el aislamiento de la survivina purificada y proporciona moléculas de ácidos nucleicos que codifican la proteína survivina, y anticuerpos y otras moléculas que se unen a survivina. US 6.245.523 también da a conocer fragmentos anti-apoptóticamente activos de la proteína survivina y variantes de los mismos en donde se ha insertado un residuo de aminoácido N- o C-terminal a, o dentro de, la secuencia de survivina divulgada. Se da a conocer específicamente que tales péptidos deben contener residuos funcionales claves para la apoptosis, es decir, Trp en la posición 67, Pro en la posición 73 y Cys en la posición 84.

Andersen et al. CANCER RESEARCH, Vol. 61, no. 3 (2001) 869-872 divulgan péptidos de survivina específicos de HLA-A2: Sur1-Sur10, Sur1L2 y Sur1M2. Andersen y col. también divulgan respuestas de CTL específicas contra dichos péptidos, valores de afinidad para la unión de dichos péptidos a moléculas de HLA de clase I y sugiere el uso de los péptidos en vacunación, terapia contra el cáncer y diagnóstico de cáncer.

Andersen et al. CANCER RESEARCH, Vol. 61, no. 16 (2001) 5964-68 divulgan péptidos de survivina que se unen a HLA: Sur1 (LTLGEFLKL), Sur9 (ELTLGEFLKL) y Sur1M2 y la generación de respuestas de CTL por dichos péptidos. El documento también divulga complejos MHC de clase I/péptidos que se multimerizaron, y su uso en la detección de células reactivas a survivina en tejido tumoral. Andersen y col. sugieren usos de tales péptidos de survivina para vacunas anticáncer basadas en péptidos en combinación con terapia convencional contra el cáncer.

Schmitz et al. CANCER RESEARCH, Vol. 60, no. 17 (2000) 4845-49 divulga el péptido de unión a HLA ELTLGEFLKL. El artículo demuestra la generación de respuestas de CTL por dicho péptido y sugiere el uso del péptido en vacunas anticáncer.

Hirohashi et al. CLINICAL CANCER RESEARCH: AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER RESEARCH, Vol. 8, no. 6 (2002) 1731-39 divulga un epítopo CTL restringido a HLA-A24 de survivina-2B (variante de ayuste encontrada en tumores). El artículo también divulga otros péptidos de survivina, por ejemplo, AFLSVKKQF y QFEELTLGEF.

Fortugno et al. JOURNAL OF CELL SCIENCE, Vol. 115, no. 3 (2002) 575-85 divulga anticuerpos policlonales contra epítopos de survivina Ala3-Ile19, Met38-Thr48, Pro47-Phe58 y Cys57-Trp67.

El documento WO 2005/049073 proporciona proteínas reguladoras de apoptosis aisladas o fragmentos peptídicos de las mismas que son capaces de provocar respuestas inmunes anticancerosas. Proporciona el uso de tales proteínas que pertenecen a la familia Bcl-2 y fragmentos peptídicos inmunogenéticos de las mismas en el tratamiento, diagnóstico y pronóstico de cáncer.

El documento US 6 245 523 divulga survivina como una proteína que inhibe la apoptosis celular, y su modulación. Se divulgan péptidos derivados de survivina; en particular SEQ ID NO: 3 es un péptido que tiene 17 aminoácidos correspondientes a los residuos 3-19 de survivina, que tiene la secuencia APTLPPAWQPFLKRDHRI. Este péptido comprende el péptido mostrado en SEQ ID NO: 18 de la presente solicitud. Se preparó un antisuero policlonal de conejo designado JC700 contra los residuos APTLPPAWQPFLKRDHRI. Sin embargo, el documento US 6 245 523 no divulga péptidos más cortos, tales como nonapéptidos, que comprenden la secuencia de SEQ ID NO: 18 de la presente solicitud. Además no hay referencia en el documento US 6 245 523 a epítopos de unión a HLA o MHC, células T citotóxicas que reconozcan tales epítopos o usos en cáncer.

Ninguno de los documentos de la técnica anterior divulga el epítopo restringido a MHC de clase I de la presente invención, que comprende la secuencia LPPAWQPFL. Además, la técnica anterior solo da a conocer la unión de epítopos CTL de survivina al alelo HLA-A2.

La presente invención se basa en el descubrimiento de que se pueden derivar péptidos restringidos a MHC de clase I de la proteína survivina, que son capaces de unirse a las moléculas de HLA de MHC de clase I y de esta manera provocar respuestas inmunes de CTL tanto ex vivo como in situ en los pacientes que padecen una amplia variedad de enfermedades cancerosas. Estos descubrimientos sugieren fuertemente que la survivina actúa como una molécula TRAP, que es procesada por las células a péptidos que tienen funcionalidad TRA. Evidentemente, estos descubrimientos abren el camino para planteamientos terapéuticos y diagnósticos nuevos que, debido al hecho de que la survivina parece estar expresada universalmente por las células tumorales, en general son aplicables en el control de enfermedades cancerosas.

Compendio de la invención

Según esto, la invención se refiere en un primer aspecto a un péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, dicho péptido de epítopo es un nona péptido que tiene la secuencia LPPAWQPFL como se muestra en SEQ ID NO: 18, y que tiene al menos una de las siguientes características:

(i)

es capaz de unirse a la molécula HLA de clase I a la que está restringido con una afinidad medida por la cantidad del péptido que es capaz de tener una recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C50) que es como máximo de 50 μM, determinada mediante un ensayo de estabilización de HLA,

(ii)

es capaz de inducir células productoras de IFN-γ en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o

(iii) es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido epítopo.

Preferiblemente, el péptido de la invención tiene al menos dos, más preferiblemente todas de esas tres características.

En aspectos adicionales, la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende el péptido como se ha definido anteriormente y una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente de cáncer de células T que reaccionan con survivina entre los PBL o en el tejido tumoral, composición que comprende un péptido como se definió anteriormente.

Un aspecto importante de la invención se refiere al uso del péptido o composición como se ha definido anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento de cáncer. Un aspecto adicional se refiere al uso de la composición o de la molécula como se ha mencionado anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

Por último, la invención proporciona una vacuna multi-epítopo que comprende un péptido epítopo restringido a MHC de clase I según la invención.

Descripción detallada de la invención

El nuevo péptido restringido a MHC de clase I de la invención es un nonapéptido que tiene la secuencia LPPAWQPFL caracterizado por tener al menos una de varias características, una de las cuales es la capacidad para unirse a la molécula de HLA-B7 de clase I a la cual está restringido con una afinidad, que cuando se mide por la cantidad de péptido que es capaz de una recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C50) en un ensayo de estabilización de HLA, es como máximo de 50 μM. Este ensayo de estabilización de HLA se lleva a cabo como se ha descrito previamente (12, 13), y se basa en la estabilización de la molécula de HLA después de cargar el péptido en la línea celular deficiente en transportador de péptidos T2. Posteriormente, se inmunoprecipitan las cadenas pesadas de HLA estables correctamente plegadas utilizando anticuerpos dependientes de la conformación, y se cuantifica la unión del péptido.

Este ensayo proporciona un medio sencillo para cribar péptidos candidatos por su capacidad para unirse a una molécula determinada de un alelo de HLA con la afinidad anterior.

Como se mencionó anteriormente, el sistema de HLA representa el sistema mayor de histocompatibilidad (MHC) humano. En general, los sistemas de MHC controlan ciertas características: antígenos de trasplante, respuestas inmunes dependientes del timo, ciertos factores del complemento y predisposición para ciertas enfermedades. Más específicamente, el MHC codifica tres tipos diferentes de moléculas, es decir, moléculas de clase I, II y III, que determinan las características más generales del MHC. De estas moléculas, las moléculas de clase I se denominan moléculas HLA-A, HLA-B y HLA-C que se presentan en la superficie de la mayoría de las células nucleadas y de los trombocitos.

Los péptidos de la invención derivan de la secuencia conocida de survivina, por ejemplo, la secuencia divulgada en el documento US 6.245.523.

De esta manera, un planteamiento sencillo para identificar los péptidos de la invención incluye los siguientes pasos: seleccionar una molécula HLA particular, por ejemplo una que se da con un alto índice en una población determinada, llevar a cabo un análisis de alineamiento como se describe anteriormente para identificar los “motivos de residuos de anclaje” en la proteína survivina, aislar o construir péptidos de un tamaño adecuado que comprendan uno o más de los residuos de anclaje identificados, y probar los péptidos resultantes para determinar (i) su capacidad para unirse a la molécula de HLA particular utilizando el ensayo de estabilización de HLA descrito en el presente documento, (ii) la capacidad de los péptidos para inducir células productoras de IFN-γ en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT como se describe en el presente documento, y/o (iii) la capacidad de los péptidos para detectar in situ en un tejido tumoral los CTL que reaccionan con los péptidos epítopos que se están probando.

El péptido de la invención, como se mencionó anteriormente, deriva de una proteína survivina o de un fragmento de la misma. La proteína survivina de la que puede derivar el péptido, es la proteína survivina de cualquier especie animal en la se expresa la proteína. En formas de realización preferidas, la proteína de partida survivina es de una especie de mamífero incluyendo una especie de roedor, conejo, y una especie de primate, tal como seres humanos. Basándose en la secuencia de la proteína survivina seleccionada, el péptido de la invención se deriva mediante cualquier tratamiento químico o enzimático apropiado del material de partida de survivina que produzca un péptido de un tamaño adecuado como se indica anteriormente, o se puede sintetizar mediante cualquier procedimiento convencional de síntesis de péptidos con los que esté familiarizado el experto en la materia.

Una característica significativa del péptido de la invención es su capacidad para reconocer o inducir células T respondedoras productoras de IFN-γ, es decir, células T citotóxicas (CTL) que reconocen de una manera específica el péptido particular en una población de PBL o células tumorales de un paciente de cáncer (células diana). Esta actividad se determina fácilmente sometiendo los PBL o células tumorales de un paciente a un ensayo ELISPOT como se describe en la referencia (16) y en los ejemplos siguientes. Antes del ensayo, puede ser conveniente estimular la población de PBL o las células tumorales que se vayan a ensayar poniendo en contacto las células con el péptido que se va a probar. Preferiblemente, el péptido es capaz de inducir o reconocer células T productoras de IFN-γ a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL como se determina mediante un ensayo ELISPOT como se utiliza en el presente documento.

El ensayo ELISPOT representa una herramienta consistente para seguir las respuestas de células T específicas del péptido de survivina. Sin embargo, aunque se ha demostrado que la reactividad de ELISPOT en la mayoría de los casos se correlaciona con la capacidad de los CLL para lisar células diana, la evidencia conclusiva para esta noción solamente se puede dar de una manera directa. Tal evidencia directa se proporciona en el presente documento, ya que se demostró (véase el ejemplo 2) que las células que reaccionan con survivina aisladas por medio de complejos HLA/péptido poseen la capacidad funcional para lisar células diana. Además, se demostró que los CTL aislados que reconocen específicamente un péptido de la invención, eran capaces de lisar las células tumorales con HLA coincidente de diferente origen, por ejemplo melanomas y cáncer de mama. Este descubrimiento sugiere fuertemente que las células cancerosas en general procesan y presentan el mismo péptido de survivina endógeno. Por consiguiente, una implicación principal de los descubrimientos del presente documento es que los péptidos de la invención se expresan y forman complejos con las moléculas de HLA en una variedad de células cancerosas de diferentes orígenes histológicos. Esto hace que estas células de cáncer sean susceptibles a la destrucción por los CTL y enfatiza la utilidad potencial de la inmunización con survivina para controlar el crecimiento de diferentes neoplasias. La presencia de respuestas espontáneas de CTL en PBL y células tumorales a epítopos peptídicos derivados de survivina restringidos a HLA de los pacientes que padecen tres tipos de cáncer no relacionados, es decir, cáncer de mama, melanoma y LLC, sustancia además el potencial inmunoterapéutico universal de este antígeno tumoral.

Según esto, en otra forma de realización preferida el péptido de la invención es capaz de inducir células productoras de IFN-γ en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa la survivina incluyendo un tumor maligno hematopoyético, incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas, y cáncer de próstata. De una manera específica, el péptido de la invención es capaz de provocar una respuesta inmune en forma de células T que tienen un efecto citotóxico contra las células que expresan survivina de una línea celular de cáncer, incluyendo una línea celular seleccionada de la línea celular de cáncer de mama MCF-7 y la línea celular de melanoma FM3.

Además de su capacidad para provocar respuestas inmunes en poblaciones de PBL y en líneas celulares de cáncer, se demostró que los péptidos de la invención también son capaces de provocar respuestas inmunes citolíticas in situ, es decir, en tejidos tumorales sólidos. Esto se demostró al suministrar complejos HLA-péptido, por ejemplo, que se multimerizan y que están provistos de un marcador detectable, y utilizando estos complejos para tinciones inmunohistoquímicas para detectar en un tejido tumoral CTL que reaccionan con el péptido epítopo de la invención. Según esto, una característica significativa adicional del péptido de la invención es que es capaz de detectar in situ en un tejido tumoral los CTL que son reactivos con el péptido epítopo.

Se contempla que los péptidos de la invención, además de su capacidad para unirse a moléculas de HLA que produce la presentación de complejos de HLA y péptidos en las superficies celulares, complejos que a su vez actúan como epítopos o dianas para células T citolíticas, pueden provocar otros tipos de respuestas inmunes, tales como respuestas de células B que den como resultado la producción de anticuerpos contra los complejos y/o una reacción de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH). El último tipo de respuesta inmune se define como un enrojecimiento y endurecimiento palpable en el sitio de la inyección del péptido de la invención.

Se sabe bien que las diferentes moléculas de HLA son de una prevalencia diferente en las poblaciones humanas principales. Según esto, existe un requerimiento para identificar los epítopos peptídicos restringidos a varias moléculas de HLA de clase I para extender la cohorte de pacientes que se puedan tratar según los métodos de la presente invención. La caracterización de múltiples epítopos de survivina con diferentes elementos de restricción de HLA amplía el potencial clínico de este antígeno diana de dos maneras importantes: (i) aumenta el número de pacientes elegibles para inmunoterapia basada en los péptidos derivados de survivina. El antígeno HLA-A2 se expresa en alrededor del 50% de las poblaciones blanca y asiática, los antígenos HLA-A1 y HLA-A3 se expresan ambos en alrededor del 25% de blancos y el 5% de asiáticos, mientras que el antígeno HLA-A11 se expresa en alrededor del 15% de blancos y el 30% de asiáticos. Aún cuando estos números no se puedan sumar debido a la coexpresión, una combinación de péptidos restringidos por una multiplicidad de éstos ciertamente abarcaría a la mayoría de los pacientes de cáncer, (ii) el direccionamiento colectivo de varios elementos de restricción en cada paciente probablemente reduzca el riesgo del escape inmune por la pérdida del alelo de HLA. La pérdida de un solo alelo de HLA es un componente significativo de las alteraciones del MHC descritas para las células cancerosas, mientras que la pérdida total de la expresión de la clase I es un suceso bastante infrecuente. Por consiguiente, con la identificación de los epítopos de survivina restringidos a diferentes alelos de HLA, ahora es posible atacar más de una molécula de HLA simultáneamente en pacientes con solapamiento alélico.

Según esto, basado en la divulgación de la presente invención, el experto en la materia sería capaz de desarrollar vacunas multiepítopo muy inmunogénicas. Preferiblemente, tales vacunas se deben diseñar para facilitar una administración simultánea de los péptidos derivados de survivina más adecuados opcionalmente en combinación con otros péptidos y/o adyuvantes adecuados como se describen posteriormente en el presente documento.

Además, como se ha descrito anteriormente, ha habido un enfoque aumentado sobre la provocación de la inmunidad de células T auxiliares específicas de tumor, es decir, vacunar con epítopos restringidos a MHC de clase II a pesar del hecho de que los tumores en general no expresan MHC de clase II. Esto se basa en el descubrimiento reciente de que la inducción y la eficacia de la respuesta antitumoral inducida por vacunas en muchos casos requieren la cooperación de células Th CD4 positivas específicas de tumor. Por tanto, un factor importante que impulsa el desarrollo de vacunas que tengan una composición más compleja es el deseo de atacar múltiples antígenos tumorales, por ejemplo mediante el diseño de vacunas que comprendan o codifiquen una colección de epítopos de células CTL y Th cuidadosamente seleccionados.

Obviamente, las vacunas multiepítopo constituyen una manera eficiente de inducir la inmunidad contra los epítopos derivados de varios antígenos diferentes sin la necesidad de introducir (genes que codifiquen) proteínas potencialmente peligrosas, tales como oncoproteínas. Tales vacunas también permiten la inducción selectiva de inmunidad contra los epítopos de células T subdominantes y crípticos, que pueden ser especialmente importantes en el caso de los autoantígenos asociados a tumor, para los que puede existir tolerancia para los epítopos que se presentan prominentemente en tejidos normales. Además, las células presentadoras de antígeno pueden fracasar al presentar ciertos epítopos que se expresan en células tumorales debido a diferencias funcionales entre los inmunoproteasomas de las células presentadoras de antígeno y los proteasomas ‘constitutivos’ presentes en la mayoría de las células tumorales. En el caso de vacunas basadas en péptidos, tales epítopos se pueden administrar en una forma ‘lista para MHC’, que permite la presentación a través de una carga exógena independientemente de la captación y el procesamiento del antígeno por las células presentadoras de antígeno del huésped.

Es evidente que los descubrimientos de la presente invención proporcionan la base para aplicaciones terapéuticas así como diagnósticas de los péptidos derivados de survivina.

Según esto, un aspecto importante de la invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un péptido restringido a MHC de clase I como se explicado anteriormente.

En formas de realización particulares la presente invención proporciona una composición farmacéutica que comprende los péptidos de la invención en combinación adecuada con otras proteínas o fragmentos peptídicos. En formas de realización específicas tales otras proteínas o fragmentos peptídicos incluyen pero no se limitan a, proteínas implicadas en la regulación de la apoptosis celular o fragmentos peptídicos de las mismas. Los ejemplos adecuados de tales proteínas se pueden seleccionar de la familia de proteínas Bcl-2, por ejemplo la proteína Bcl-2, la proteína Bcl-w, la proteína Mcl-1, la proteína Bcl-XL, y fragmentos peptídicos derivados de cualquiera de las proteínas. Otros inhibidores de apoptosis conocidos incluyen los miembros de la familia de proteínas inhibidoras de apoptosis (IAP), tales como X-IAP, C-IAP1 y C-IAP2 estas proteínas se expresan todas de una manera relativamente ubicua mientras que el polipéptido inhibidor de apoptosis ML-IAP tiene una expresión bastante selectiva, y se detecta predominantemente en melanomas. Por consiguiente, los fragmentos de ML-IAP capaces de provocar una respuesta de células T específica, es decir, una respuesta de células T citotóxicas o una respuesta de células T auxiliares, opcionalmente se pueden incluir en la composición de la presente invención. Los fragmentos peptídicos útiles de MLIAP incluyen ML-IAP245 (RLQEERTCKV) (SEQ ID NO: 75), ML-IAP280 (QLCPICRAPV) (SEQ ID NO: 76), ML-IAP90 (RLASFYDWPL) (SEQ ID NO: 77), ML-IAP154 (LLRSKGRDFV) (SEQ ID NO: 78), ML-IAP230 (VLEPPGARDV) (SEQ ID NO: 79), ML-IAP98 (PLTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 80), ML-IAP34 (SLGSPVLGL) (SEQ ID NO: 81), ML-IAP54 (QILGQLRPL) (SEQ ID NO: 82), ML-IAP99 (LTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 83), ML-IAP83 (GMGSEELRL) (SEQ ID NO: 84) y ML-IAP200 (ELPTPRREV) (SEQ ID NO: 85).

Adicionalmente, la composición según la presente invención se puede proporcionar como una vacuna multiepítopo que comprende un epítopo restringido a clase I y/o epítopos restringidos a clase II, como se definen anteriormente en el presente documento.

Los ejemplos de vacunas multiepítopos preferidas actualmente incluyen combinaciones “hechas a medida” de epítopos peptídicos derivados de survivina que dependen del tipo de tejido del paciente determinado, por ejemplo, un sujeto portador de fenotipos HLA-A2, HLA-A3 y HLA-B35 se podría vacunar con una vacuna que comprenda sur1M2, sur9, sur18K10, sur46Y9, sur51Y9. Adicionalmente, la composición farmacéutica de la invención puede comprender de una manera conveniente al menos una proteína inmunogénica adicional o un fragmento peptídico de la misma seleccionada de una proteína o fragmento peptídico que no pertenezca a, ni derive de, la proteína survivina. En formas de realización específicas, la proteína inmunogénica o el fragmento peptídico de la misma deriva de la familia de proteínas Bcl-2 como se ha descrito aquí anteriormente. Un péptido inmunogénico adicional derivado de Bcl-2 es un péptido restringido a HLA-A2, que tiene una secuencia seleccionada de las siguientes: Bcl172, Bcl180, Bcl208, y Bcl214.

Como los péptidos de la invención son moléculas relativamente pequeñas se puede requerir en tales composiciones combinar los péptidos con varios materiales tales como adyuvantes, para producir vacunas, composiciones inmunogénicas, etc. Los adyuvantes, ampliamente definidos, son sustancias que fomentan las respuestas inmunes. Con frecuencia, el adyuvante de elección es un adyuvante completo o incompleto de Freund, u organismos muertos de B. pertussis, utilizados por ejemplo en combinación con un antígeno precipitado en alumbre. Se proporciona una discusión general de los adyuvantes en Goding, Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2ª Edición, 1986) en las páginas 61-63. Sin embargo, Goding observa que, cuando el antígeno de interés es de bajo peso molecular o es poco inmunogénico, se recomienda el acoplamiento con un soporte inmunogénico. Los ejemplos de tales moléculas soporte incluyen hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina bovina, ovoalbúmina e inmunoglobulina de aves. También se ha sugerido que diferentes extractos de saponina son útiles como adyuvantes en las composiciones inmunogénicas. Recientemente, se ha propuesto utilizar el factor estimulante de colonias de granulocitosmacrófagos (GM-CSF), una citoquina bien conocida, como un adyuvante (documento WO 97/28816).

Según esto, la invención abarca una composición terapéutica que además comprende cualquier sustancia adyuvante incluyendo cualquiera de las anteriores o combinaciones de las mismas. También se contempla que el antígeno, es decir, el péptido de la invención y el adyuvante se puedan administrar por separado en cualquier secuencia apropiada.

La elección del antígeno en la composición farmacéutica de la invención, dependerá de parámetros que puede determinar el experto en la materia. Como se ha mencionado, cada uno de los diferentes péptidos de la invención se presenta en las superficies celulares por una molécula de HLA particular. Como tal, si un sujeto que se vaya a tratar se tipifica con respecto al fenotipo de HLA, se selecciona(n) un péptido/péptidos que se sepa que se une(n) a esa molécula de HLA particular.

De forma alternativa, el antígeno de interés se selecciona basándose en la prevalencia de los varios fenotipos de HLA en una población determinada. Como ejemplo, HLA-A2 es el fenotipo más prevalente en la población blanca y, por consiguiente, una composición que contenga un péptido derivado de survivina que se une a HLA-A2 será activo en una gran proporción de esa población. Sin embargo, la composición de la invención también puede contener una combinación de dos o más péptidos derivados de survivina, que interacciona cada uno de una manera específica con una molécula HLA diferente de modo que se cubra una mayor proporción de la población diana. Por lo tanto, como ejemplos, la composición farmacéutica puede contener una combinación de un péptido restringido a una molécula HLA-A y un péptido restringido a una molécula HLA-B, por ejemplo incluyendo las moléculas HLA-A y HLAB que corresponden a la prevalencia de los fenotipos de HLA en la población diana, tales como, por ejemplo, HLAA2 y HLA-B35. Además, la composición puede comprender un péptido restringido a una molécula HLA-C.

Se contempla que las composiciones inmunogénicas útiles de las invenciones además de un péptido derivado de survivina como se define en el presente documento puedan comprender una cantidad inmunológicamente eficaz de proteína survivina tal como se define en el presente documento o un fragmento inmunogénico de la misma.

La cantidad del péptido inmunogénico de la invención en la composición farmacéutica puede variar, dependiendo de la aplicación particular. Sin embargo, una dosis individual del inmunógeno está preferiblemente en cualquier zona desde aproximadamente 10 μg hasta aproximadamente 5000 μg, más preferiblemente desde aproximadamente 50 μg hasta aproximadamente 2500 μg tal como de aproximadamente 100 μg a aproximadamente 1000 μg. Los modos de administración incluyen la administración intradérmica, subcutánea e intravenosa, implantación en forma de una formulación de liberación con el tiempo, etc. Aquí se abarcan cualquiera y todas las formas de administración conocidas en la técnica. También se abarcan cualquiera y todas las formas farmacéuticas convencionales que se conozcan en la técnica como apropiadas para formular composiciones peptídicas inmunogénicas inyectables, tales como formas liofilizadas y formas en solución, suspensión o emulsión que contengan, si se requiere, soportes, diluyentes, conservantes, adyuvantes, componentes reguladores del pH, etc., convencionales farmacéuticamente aceptables.

El efecto inmunoprotector de la composición de la invención se puede determinar empleando varios planteamientos. En los siguientes ejemplos se proporcionan ejemplos de los mismos. Un ejemplo adicional sobre cómo determinar una respuesta de CTL provocada por la composición inmunogénica se proporciona en el documento WO 97/28816, supra. También se puede determinar una respuesta inmune de éxito por la presencia de reacciones de DTH después de la inmunización y/o la detección de anticuerpos que reconozcan específicamente el/los péptido(s) de la composición de vacuna.

En formas de realización preferidas, la composición farmacéutica de la invención es una composición inmunogénica

o vacuna capaz de provocar una respuesta inmune a una enfermedad cancerosa. Como se utiliza aquí, la expresión “composición inmunogénica o vacuna” se refiere a una composición que provoca al menos un tipo de respuesta inmune dirigida contra las células cancerosas. Por consiguiente, tal respuesta inmune puede ser cualquiera de los tipos mencionados anteriormente: una respuesta de CTL donde se generan CTL que son capaces de reconocer el complejo HLA/péptido presentado en las superficies celulares que produce la lisis celular, es decir, la vacuna provoca la producción en el sujeto vacunado de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas; una respuesta de células B que da lugar a la producción de anticuerpos anticancerosos; y/o una respuesta inmune de tipo DHT.

En formas de realización útiles se provoca una respuesta inmunogénica dirigida contra una enfermedad cancerosa mediante la administración del péptido de la invención ya sea mediante la carga de moléculas de MHC de clase I en células presentadoras de antígeno (CPA) del paciente, mediante el aislamiento de PBL del paciente e incubación de las células con el péptido antes de inyectar las células de nuevo al paciente o mediante el aislamiento de CPA precursoras del paciente y la diferenciación de las células a CPA profesionales utilizando citoquinas y antígeno antes de inyectar las células de nuevo al paciente. Por lo tanto, en una forma de realización de la presente invención, un método para tratar a pacientes de cáncer es uno en donde el péptido se administra mediante la presentación del péptido a células presentadoras de antígeno (CPA) del paciente ex vivo seguido por inyección de las CPA así tratadas de nuevo al paciente. Existen al menos dos maneras alternativas de llevar esto a cabo. Una alternativa es aislar las CPA del paciente de cáncer e incubar (cargar) las moléculas de MHC de clase I con el péptido. La carga de las moléculas de MHC de clase I significa incubar las CPA con el péptido de tal manera que las CPA con las moléculas de MHC de clase I específicas para el péptido se unirán al péptido y por consiguiente serán capaces de presentarlo ante las células T. Posteriormente, las CPA se vuelven a inyectar en el paciente. Otra manera alternativa se apoya en los descubrimientos recientes hechos en el campo de la biología celular dendrítica. En este caso, se aíslan monocitos (que son precursores de células dendríticas) del paciente y se diferencian in vitro a CPA profesionales (o células dendríticas) mediante el uso de citoquinas y antígeno. Esto se describe en los ejemplos 3 y 5, donde se cultivan PBL adherentes (que son principalmente monocitos) in vitro, junto con GM-CSF, IL-4 y TNF-α. Posteriormente, se pulsan las CD generadas in vitro con el péptido y se inyectan en el paciente.

Debido al hecho de que parece que la survivina se expresa en la mayoría de las formas de cáncer, es muy probable que se puedan proporcionar las vacunas de la invención para controlar cualquier tipo de enfermedad cancerosa donde se exprese survivina. Por consiguiente, como ejemplos, la composición de vacuna de la invención es inmunológicamente activa contra un tumor maligno hematopoyético, incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas, y cáncer de próstata.

De la descripción anterior, el experto se dará cuenta fácilmente de que los péptidos de la invención son útiles como herramientas de diagnóstico de cáncer, en particular porque los péptidos derivan de survivina expresada en todos los tipos de cáncer. Por consiguiente, los péptidos de la invención proporcionan la base para desarrollar procedimientos diagnósticos y pronósticos universalmente aplicables con respecto a las enfermedades cancerosas. De esta manera, en otras formas de realización útiles la composición de la invención es una composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un paciente de cáncer, por ejemplo basado en la detección de las células T que reaccionan con survivina entre los PBL o en el tejido tumoral.

En un aspecto, la invención proporciona un complejo de un péptido de la invención y una molécula de HLA de clase I

o un fragmento de tal molécula, que es útil como un reactivo diagnóstico, tal como se ha descrito anteriormente. El complejo se hace por cualquier medio convencional incluyendo los descritos en los siguientes ejemplos. Tal complejo puede ser monomérico o multimérico.

La presente invención proporciona el medio para aliviar o curar una enfermedad cancerosa. Según esto, es un aspecto adicional de la invención utilizar los péptidos como se han definido anteriormente en la presente para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Un aspecto aún adicional de la presente invención se refiere al uso de un péptido como se ha definido aquí anteriormente para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer. Preferiblemente, una enfermedad cancerosa asociada con la expresión de survivina, incluyendo como ejemplos: un tumor maligno hematopoyético, incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. El uso comprende administrar a un paciente que padece la enfermedad, una cantidad eficaz de la composición farmacéutica según la invención, una molécula que es capaz de unirse de forma específica a un péptido de la invención y/o una molécula que es capaz de bloquear la unión de tal molécula.

En algunos casos, será apropiado combinar el uso de la invención con un tratamiento contra el cáncer convencional tal como radioterapia o quimioterapia.

Ahora se describirá la invención con mayor detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y en las figuras, en las cuales:

La figura 1 ilustra la respuesta de células T medida en un ELISPOT en el paciente LLC1 a sin péptido, al péptido Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) y al péptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3). Los PBL se estimularon una vez con el péptido antes de sembrarse a 6x105 células por pocillo en duplicado. Se calculó el número medio de manchas por péptido utilizando un dispositivo de barrido CCD y un sistema de ordenador,

La figura 2 ilustra la respuesta de células T medida en un ELISPOT en el paciente LLC1 a sin péptido, al análogo de péptido Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO: 4) y al análogo de péptido Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5). Los PBL se estimularon una vez con el péptido antes de sembrarse a 104 células por pocillo en duplicado. Se calculó el número medio de manchas por péptido utilizando un dispositivo de barrido CCD y un sistema de ordenador,

La figura 3 muestra las respuestas medidas en un ELISPOT en los pacientes LLC2 y LLC3 a ningún péptido (barra negra), al péptido Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) (barra gris), al péptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) (barra blanca), al análogo de péptido Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO: 4) (barra gris clara) y al análogo de péptido Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5) (barra gris oscura). Cada experimento se llevó a cabo con 105 células por pocillo en duplicado, y se calculó el número medio de manchas,

La figura 4 representa células T que se aislaron de los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor de los pacientes Mel1, Mel2 y Mel3, estimulados una vez in vitro y analizados en un ensayo ELISPOT para determinar la respuesta a sin péptido (barra negra), los péptidos Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) (barra gris) y Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) (barra blanca). Cada experimento se llevó a cabo por duplicado con 105 células por pocillo. En cada experimento también se incluyeron dos pocillos sin adición de péptido. Se calculó el número medio de manchas por péptido para cada paciente,

La figura 5 muestra la actividad funcional de CTL específicos de survivina. Los CTL se aislaron de un ganglio linfático infiltrado por melanoma usando bolas magnéticas recubiertas con survivina. (A) Lisis específica de líneas celulares de melanoma: FM3 positiva para HLA-A2 (triángulo) y FM45 negativa para HLA-A2 (cuadrado). (B) Lisis específica de líneas celulares de cáncer de mama: MCF-7 positiva para HLA-A2 (triángulo) y BT-20 negativa para HLA-A2 (cuadrado),

La figura 6 muestra la frecuencia de CTL que reaccionan con survivina en PBL de pacientes de cáncer de mama. La reactividad se examinó en tres pacientes de cáncer de mama (superior, media e inferior, respectivamente) mediante ELISPOT. Para cada paciente los ensayos se llevaron a cabo en ausencia de péptido, en presencia de péptido sur1, en presencia de péptido sur9 y en presencia del péptido modificado sur1M2. Se utilizaron 1x104 células efectoras por pocillo. La gráfica representa la cuantificación de células reactivas; las columnas grises representan el número promedio de células productoras de IFN-γ,

La figura 7 ilustra la unión a HLA-B35 de péptidos derivados de survivina y el análisis de la recuperación mediada por péptido de las moléculas de HLA-B35 por los péptidos derivados de survivina. Se incubaron lisados de células T2-B35 metabólicamente marcadas a 4°C en presencia de péptido 50, 5, 0,5, 0,05, y 0,005 mM. La recuperación de HLA-B35 se analizó en un ensayo de ensamblaje y se cuantificó posteriormente a electroforesis IEF en gel, usando el software de Phosphorimager ImageGauge (FUJI photo film Co., LTD., Japón). El valor C50 es la concentración del péptido requerida para la unión semi-máxima a HLA-B35,

La figura 8 muestra respuestas espontáneas de células T observadas en PBL de pacientes de cáncer. A) El número de células formadoras de mancha de IFNγ medidas en el ensayo ELISPOT sin péptido (barras blancas), con sur5159 (barras negras) o sur46-54 (barras grises), entre PBL estimulados in vitro de los pacientes LLC5 (105 células/pocillo), HEM12 (105 células/pocillo) y HEM8 (5x104 células/pocillo). B) El número de células formadoras de mancha entre 1,7x105 PBL de HEM12, cultivadas durante 10 días con células dendríticas autólogas maduradas por pulsos con péptidos. Las columnas representan la media de dos medidas,

La figura 9 demuestra las respuestas espontáneas de células T contra péptidos de survivina nativos y modificados en pacientes de melanoma. A) El número de células formadoras de manchas medidas en el ensayo ELISPOT contra sur51-59 y sur51Y9 del paciente FM25 en PBL (4x103 células/pocillo) y TIL (7x104 células/pocillo), así como TIL de FM45 (105 células/pocillo). B) El número de células formadoras de manchas medidas en el ensayo ELISPOT contra sur46 y sur46Y9 medidas en TIL de FM74 (5x103 células/pocillo). Las columnas representan la media de dos medidas con la liberación no específica de IFNγ restada,

La figura 10 ilustra la afinidad de unión de los péptidos derivados de survivina a HLA-A1. Se cuantificaron las bandas de cadena pesada de MHC de clase I en un Phosphorimager. La cantidad de cadena pesada de HLA-A1 estabilizada está directamente relacionada con la afinidad de unión del péptido añadido. La recuperación de HLA-Al mediada por péptido (unidades arbitrarias) inducida por 40, 4, 0,4, 0,04 μM de Sur93-10l (línea), Sur93T2 (cuadrado), Sur49-58 (círculo) o virus de la gripe A, PB1 591-599 (triángulo),

La figura 11 muestra las respuestas espontáneas contra los péptidos restringidos a HLA-A1. Respuestas espontáneas de células T contra péptidos derivados de survivina medidas mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFNγ específicas del péptido formadas en respuesta a Sur92-101, Sur38Y9, Sur47Y10 y Sur93T2 entre 5x104 PBL o TIL de pacientes de melanoma estimulados in vitro. Las respuestas específicas de péptidos mostradas se observaron entre los análisis de seis muestras de PBL y tres muestras de TIL de pacientes de melanoma (Mel). Se restan las manchas de IFNγ no específicas. Barras: rango de duplicados,

La figura 12 muestra las respuestas espontáneas contra los péptidos restringidos a HLA-A11. Respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados de survivina medidas mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFNγ específicas de péptidos formadas en respuesta a Sur53-62 entre 5x104 PBL o TIL de pacientes de cáncer estimulados in vitro. Las respuestas específicas de péptidos mostradas se observaron entre los análisis de cinco pacientes de melanoma (Mel) (5 PBL, 1 TIL), y dos pacientes de LLC (LLC) (PBL). Se restan las manchas no específicas de IFNγ. Barras: rango de duplicados,

La figura 13 ilustra las respuestas espontáneas contra los péptidos restringidos a HLA-A3. Respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFNγ específicas de péptidos formadas en respuesta a Surl8Kl0 entre 5x104 PBL o TIL de pacientes de melanoma estimulados in vitro. Las respuestas específicas de péptidos mostradas se observaron entre los análisis de 23 muestras de PBL y cuatro muestras de TIL de pacientes de melanoma (Mel). Se sustraen las manchas no específicas de IFNγ. Barras: rango de duplicados,

La figura 14 ilustra las respuestas espontáneas contra los péptidos restringidos a HLA-A2. Respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFNγ específicas de péptidos formados en respuesta al péptido 11-mero, Surl8-28, entre 5x104 PBL de pacientes de cáncer estimulados in vitro. Las respuestas específicas de péptidos mostradas se observaron entre los análisis de 10 muestras de PBL de 2 pacientes de melanoma (Mel), 6 de LLC (LLC) y 2 de carcinoma de mama (CM). Se restan las manchas no específicas de IFNγ. Barras: rango de duplicados,

La figura 15 ilustra las respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de IFNγ específicas de péptidos formadas en respuesta a sur6-14 (LPPAWQPFL) entre 105 PBL estimulados in vitro de 5 pacientes de melanoma (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), dos pacientes de LLC (LLC1, LLC54) y 2 pacientes de cáncer de mama (mama11, mama15). Se restan las manchas no específicas de IFNγ,

La figura 16 ilustra los valores analíticos de la detección estable de LDH, colinesterasa, creatinina, hemoglobina, leucocitos, y trombocitos tras la terapia de vacunación de cuatro pacientes (▲ RW, ● KN, ▬ WWE, ■ GB), y

La figura 17 demuestra el análisis cinético de la inmunidad a péptidos de survivina evaluado mediante ELISPOT de IFNγ. Se obtuvieron PBMC antes de la primera vacunación con CD y tres meses después de la misma. Se muestran los números de células formadoras de manchas de IFNγ por encima del fondo.

En la siguiente tabla, se enumeran las secuencias de aminoácidos para los péptidos utilizados en el presente documento y sus respectivas SEQ ID NOs:

SEQ ID NO:

DESIGNACIÓN SECUENCIA

1

Sur6 FLKLDRERA

2

Sur8 TLPPAWQPFL

3

Sur9 ELTLGEFLKL

4

Sur1L2 LLLGEFLKL

5

Sur1M2 LMLGEFLKL

6

Sur46-54 CPTENEPDL

7

Sur51-59 EPDLAQCFF

8

Sur46Y9 CPTENEPDY

9

sur51Y9 EPDLAQCFY

10

Sur1 LTLGEFLKL

11

C1 ILKEPVHGV

12

Sur2 RAIEQLAAM

13

Sur3 KVRRAIEQL

14

Sur4 STFKNWPFL

15

Sur5 SVKKQFEEL

16

Sur7 TAKKVRRAI

17

Sur10 ETAKKVRRAI

18

Sur6-14 LPPAWQPFL

19

Surll-19 QPFLKDHRI

20

Sur34-43 TPERMAEAGF

21

C24 YPLHEQHQM

22

Sur14-22 LKDHRISTF

23

Sur38-46 MAEAGFIHC

24

Sur93-101 FEELTLGEF

25

Sur47-56 PTENEPDLAQ

26

Sur49-58 ENEPDLAQCF

27

Sur92-101 QFEELTLGEF

28

C1 VSDGGPNLY

29

Sur14Y9 LKDHRISTY

30

sur93Y9 FEELTLGEY

31

sur92Y9 QFEELTLGEY

32

sur34Y9 TPERMAEAGY

33

sur49Y9 ENEPDLAQCY

34

Sur92T2 QTEELTLGEF

35

Sur92S2 QSEELTLGEF

36

Sur93T2 FTELTLGEF

37

Sur93S2 FSELTLGEF

38

Sur38Y9 MAEAGFIHY

39

Sur47Y10 PTENEPDLAY

40

Sur5-13 TLPPAWQPF

41

Sur53-61 DLAQCFFCF

42

Sur54-62 LAQCFFCFK

43

Sur95-103 ELTLGEFLK

44

Sur112-120 KIAKETNNK

45

Surl3-22 FLKDHRISTF

47

Sur53-62 DLAQCFFCFK

50

Sur103-112 KLDRERAKNK

51

Sur112-121 KIAKETNNKK

52

Sur113-122 IAKETNNKKK

53

C3 ILRGSVAHK

54

Sur5K9 TLPPAWQPK

55

Sur53K9 DLAQCFFCK

56

Sur54L2 LLQCFFCFK

57

Sur13K9 FLKDHRISTK

58

Sur18K10 RISTFKNWPK

59

Sur113L2 ILKETNNKKK

60

SurEx3-A3-1 TIRRKNLRK

61

SurEx3-A3-2 PTIRRKNLRK

62

Sur2b-A3-1 RITREEHKK

63

C4 AVFDRKSDAK

64

C6 QPRAPIRPI

65

C7 RPPIFIRRL

66

Sur4-14 PTLPPAWQPFL

67

Sur18-28 RISTFKNWPFL

68

Sur54-64 LAQCFFCFKEL

69

Sur86-96 FLSVKKQFEEL

70

Sur88-98 SVKKQFEELTL

71

Sur103-113 KLDRERAKNKI

72

Ebv,BMLF1 GLCTLVAML

73

Hiv, Pol ILKEPVHGV

74

Gripe A, nucleoproteína 265-273 ILRGSVAHK

Ejemplo 1

Identificación de una respuesta de linfocitos T citotóxicos a la proteína inhibidora de apoptosis survivina en pacientes de cáncer.

Resumen

Utilizando epítopos de CTL derivados de survivina, se ha estudiado la reactividad de células T específicas contra tales antígenos en sangre periférica de pacientes de leucemia linfática crónica (LLC) y en los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor de pacientes de melanoma, mediante análisis ELISPOT. Las respuestas de CTL a los epítopos de péptidos derivados de survivina se detectaron en tres de seis pacientes de melanoma y en tres de cuatro pacientes de LLC. No se detectó reactividad de células T en PBL de seis controles sanos. Por consiguiente, los péptidos derivados de survivina pueden servir como dianas importantes y ampliamente aplicables para las estrategias inmunoterapéuticas contra el cáncer.

Introducción

La proteína survivina se barrió para determinar la presencia de motivos de péptido de unión a HLA-A*0201 (HLA-A2) y después de una identificación con éxito, los péptidos se utilizaron para probar la reactividad de células T específicas en pacientes de leucemia y melanoma mediante ensayo ELISPOT. En ambas cohortes de pacientes se detectaron respuestas de CTL a dos epítopos de péptidos derivados de survivina, mientras que no se pudo detectar reactividad alguna de células T en los controles sanos. Estos datos sugieren que la survivina representa un antígeno tumoral ampliamente expresado reconocido por las células T autólogas.

Materiales y Métodos

Pacientes y controles normales

Se recogieron muestras de sangre de vena periférica de 4 pacientes diagnosticados con LLC (designados como LLC1-4) y muestras de sangre de 6 individuos normales en tubos heparinizados. Se aislaron los PBL utilizando separación por Limphoprep y se congelaron en suero fetal de ternera (SFT) con dimetilsulfóxido al 10%. Además, se obtuvieron linfocitos T de los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor de 6 pacientes de melanoma (designados como mel1-6). Los ganglios linfáticos recién cortados se trocearon en fragmentos pequeños, se trituraron para liberar las células al cultivo y se crioconservaron. Estuvieron disponibles PBL de 4 pacientes de melanoma. Todos los individuos incluidos eran positivos para HLA-A2 determinado mediante análisis por FACS utilizando el anticuerpo BB7.2 específico de HLA-A2. El anticuerpo se purificó a partir del sobrenadante del hibridoma. Las muestras de los pacientes se obtuvieron del Hospital de la Universidad del Estado, Herlev, Dinamarca. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas.

Péptidos derivados de survivina

Todos los péptidos se obtuvieron de Research Genetics (Huntsville, AL, EE UU) y se suministraron a una pureza >90% verificado mediante análisis por HPLC y EM. Los péptidos utilizados se enumeran en la Tabla 1.

5

10

15

20

25

30

35

40

Tabla 1. Péptidos examinados en este estudio y su afinidad de unión a HLA-A2.

Nombre

Proteínaa Secuencia SEQ ID NO: C50 (μM)b

C1

VIH-1 P o l 476-484 ILKEPVHGV 11 0,7

Sur1

Survivina96-104 LTLGEFLKL 10 >100

Sur2

Survivinal33-141 RAIEQLAAM 12 Sin unión

Sur3

Survivina130-138 KVRRAIEQL 13 >100

Sur4

Survivina20-28 STFKNWPFL 14 Sin unión

Sur5

Survivina88-96 SVKKQFEEL 15 Sin unión

Sur6

Survivina101-109 FLKLDRERA 1 30

Sur7

Survivina127-135 TAKKVRRAI 16 Sin unión

Sur8

Survivina5-14 TLPPAWQPFL 2 30

Sur9

Survivina95-104 ELTLGEFLKL 3 10

Sur10

Survivina126-135 ETAKKVRRAI 17 Sin unión

Sur1L2

LLLGEFLKL 4 1

Sur1M2

LMLGEFLKL 5 1

a El intervalo de valores enumerado en los subíndices indica la posición del péptido en la secuencia de survivina como se divulga en el documento US 6.245.523. b El valor C50 es la concentración del péptido requerida para una unión semi-máxima a HLA-A2 determinado como se describe a continuación.

Ensayo de ensamblaje para unión del péptido a las moléculas de MHC de clase I.

Se llevaron a cabo los ensayos de ensamblaje para la unión de los péptidos sintéticos a las moléculas MHC de clase I metabólicamente marcadas con [35S]-metionina, como se ha descrito (12, 13). El ensayo de ensamblaje se basa en la estabilización de las moléculas de clase I después de cargar el péptido en la línea celular deficiente en transportador peptídico T2. Posteriormente, se inmunoprecipitan las cadenas pesadas de MHC estables correctamente plegadas utilizando anticuerpos dependientes de la conformación. Después de la electroforesis IEF, los geles se expusieron a pantallas de phosphorimager, y se cuantificó la unión del péptido utilizando el programa Imagequant PhosphorImager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Estimulación de PBL por antígeno

Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, se estimularon los PBL una vez in vitro antes del análisis (14, 15). Los PBL recientes y los previamente congelados dieron resultados similares en el ensayo ELISPOT. El día 0, se descongelaron los PBL o ganglios linfáticos triturados y se sembraron a 2 ml/pocillo a una concentración de 2x106 células, en placas de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca), en medio AIM V (Life Technologies, Roskilde, Dinamarca), suero humano inactivado por calor al 5% y L-glutamina 2 mM en presencia de péptido 10 μM. En cada experimento, se incluyó un pocillo sin péptido. Dos días después, se añadió interleuquina-2 recombinante (IL-2) 300 UI/ml (Chiron, Ratingen, Alemania) a los cultivos. Se probó la reactividad de las células cultivadas en el ensayo ELISPOT el día 12.

Ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT utilizado para cuantificar las células efectoras liberadoras de interferón-γ específicas del epítopo del péptido se llevó a cabo como en (16). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos de fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) con anticuerpo anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se lavaron, se bloquearon con medio AIM V, y se añadieron las células en duplicados a diferentes concentraciones celulares. Luego se añadieron los péptidos a cada pocillo y las placas se incubaron durante la noche. Al día siguiente, se desechó el medio y los pocillos se lavaron antes de añadir el anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotina Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas, se lavaron y se añadió el conjugado avidina-enzima (AP-Avidina, Calbiochem, Life Technologies) a cada pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1 hora y se añadió el sustrato enzimático NBT/BCIP (Gibco, Life Technologies) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. La reacción se terminó lavando con agua del grifo hasta que surgieron manchas púrpura oscuro. Las manchas se contaron utilizando un Sistema AlphaImager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE UU) y se pudo calcular la frecuencia de CTL específica del péptido a partir de los números de células formadoras de manchas. Todos los ensayos se llevaron a cabo por duplicado para cada antígeno peptídico.

Resultados

Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-A2.

La secuencia de aminoácidos de la proteína survivina se rastreó para determinar los epítopos de péptidos nona- y decaméricos de HLA-A2 más probables, utilizando los principales residuos de anclaje específicos de HLA-A2 (17). Se sintetizaron diez péptidos derivados de survivina y se examinó su unión a HLA-A2. Se utilizó un epítopo de VIH-1 pol476-484 (ILKEPVHGV, SEQ ID NO: 11) (Tabla 1) como control positivo. La concentración de péptido requerida para la recuperación semi-máxima de MHC de clase I (valor C50) fue de 0,7 μM para el control positivo. En comparación, el péptido designado Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) se unió con una afinidad de C50 = 10 μM. Los péptidos designados Sur6 (FLKLDRERA, SEQ ID NO: 1) y Sur8 (TLPPAWQPFL, SEQ ID NO: 2) se unieron respectivamente a HLA-A2 a C50 = 30 μM, mientras que Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) y Sur3 (KVRRAIEQL, SEQ ID NO: 13) se unieron más débilmente (C50 >100 μM). Cinco de los péptidos examinados (Sur2, Sur4, Sur5, Sur7, y Sur1O) no se unieron a HLA-A2.

Puesto que Sur1 se une de forma débil a HLA-A2, se sintetizaron dos péptidos análogos designados Sur1L2 y Sur1M2, respectivamente, en los que un residuo de anclaje mejor (leucina o metionina) reemplazó a la treonina nativa en la posición 2. Ambos péptidos se unen a HLA-A2 con alta afinidad casi similar a la del control positivo (C50 = 1 μM).

Respuesta de CTL a survivina en pacientes de LLC.

Los PBL de cuatro pacientes de LLC positivos para HLA-A2 se estimularon una vez in vitro antes de examinarse en el ensayo ELISPOT. Este procedimiento se seleccionó para aumentar la sensibilidad del ELISPOT. Se incluyeron los 10 péptidos derivados de survivina anteriores en la primera línea de experimentos. Se detectaron respuestas a Sur1 y Sur9 y en las figuras solamente se dan los datos para estos péptidos. La figura 1 muestra la reactividad de CTL a Sur1 y Sur9 determinada en el paciente LLC1. Cada mancha representa una célula productora de IFN-γ que reacciona con el péptido. El número medio de manchas por péptido se calculó utilizando un dispositivo de barrido CCD y un sistema de ordenador. Se detectaron 52 manchas específicas del péptido Sur9 (después de la sustracción de las manchas sin el péptido añadido) por 6x105 en el paciente LLC1 (Fig. 1). No se detectó respuesta alguna al péptido Sur1 de unión débil a HLA-A2, sin embargo el paciente respondió fuertemente al análogo de péptido Sur1M2 de unión fuerte a HLA-A2 (35 manchas específicas del péptido por 104 células) (Fig. 2). No se detectó respuesta alguna al otro análogo de péptido Sur1L2 de fuerte unión a HLA-A2 en este paciente (Fig. 2). El paciente LLC2 respondió fuertemente a Sur9 (128 manchas específicas del péptido por 105 células) y débilmente a Sur1 (22 manchas específicas del péptido por 105 células) (Fig. 3). La respuesta al análogo Sur1L2 se incrementó sólo ligeramente en relación con el epítopo natural, mientras que el paciente respondió fuertemente de una manera similar al péptido Sur1M2 que al péptido decamérico Sur9. En el paciente LLC3 se observó una respuesta débil a Sur9 (Fig. 3). No se observó respuesta alguna a Sur1 o a los péptidos modificados de Sur1 en el paciente. No se detectaron respuestas de survivina en el último paciente CLL4 (datos no mostrados). Se analizaron los PBL de seis controles positivos sanos para HLA-A2 con el fin de investigar si se podría detectar una respuesta a la survivina en los individuos sanos. No se observó respuesta alguna en ninguno de los controles a ninguno de los péptidos derivados de survivina.

Respuesta de CTL a survivina en pacientes de melanoma.

Se examinaron linfocitos T aislados de ganglios linfáticos infiltrados por tumor de pacientes de melanoma positivos para HLA-A2. El ganglio linfático recién cortado se troceó en fragmentos pequeños y se aplastó para liberar las células al cultivo. Las células se estimularon una vez con el péptido in vitro antes de examinarse en el ensayo ELISPOT. Se detectaron células T específicas de survivina en tres de los seis pacientes analizados. Se detectó una fuerte respuesta a Sur9 en los pacientes Mel2 y Mel3. También se detectó una respuesta más débil al péptido Sur1 en estos pacientes (Fig. 4). En Mel1 la respuesta al péptido de unión débil Sur1 fue más fuerte que la respuesta a Sur9 de unión más fuerte a HLA-A2 (Fig. 4). No se detectó respuesta alguna en los ganglios linfáticos infiltrados por tumor de los últimos tres pacientes de melanoma (Mel4-6). Se examinaron los PBL de dos de los pacientes que reaccionaron a survivina, Mel1 y Mel2, y de dos de los pacientes que no reaccionaron, Mel4 y Mel5. No se pudo detectar respuesta alguna a Sur9 o Sur1 en los PBL de ninguno de estos pacientes (datos no mostrados).

Ejemplo 2

Respuestas espontáneas de células T citotóxicas a los epítopos de células T restringidos a MHC de clase I derivados de survivina in situ y ex vivo en pacientes de cáncer.

Resumen

Se demostraron respuestas espontáneas de células T citotóxicas a los epítopos de células T restringidos a MHC de clase I derivados de survivina in situ así como ex vivo en pacientes de cáncer de mama, leucemia y melanoma. Además, las células T que reaccionan con survivina aisladas mediante bolas magnéticas recubiertas con complejos MHC/péptido eran citotóxicas a tumores con HLA coincidente de diferentes tipos de tejido. Al ser un antígeno tumoral universal, la survivina puede servir como diana ampliamente aplicable para la inmunoterapia contra el cáncer.

Materiales y Métodos

Construcción de complejos HLA-péptido para tinción de células T y separación de células T.

Se expresó un sitio de reconocimiento para la biotinilización enzimática utilizando la proteína ligasa de biotina (BirA) en fusión con el extremo 5’ de los dominios extracelulares de HLA A*0201 (residuos 1-275) en E. coli BL21 (DE3). La proteína recombinante se purificó mediante cromatografía por tamaño (Sephadex G25, Pharmacia) y de intercambio iónico (mono-Q, Pharmacia) a partir de cuerpos de inclusión solubilizados en urea 8 M. HLA A*0201 se plegó in vitro mediante dilución en presencia del péptido modificado de survivina Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5) o del péptido MAA gp100154-163, y posteriormente se biotiniló como se ha descrito anteriormente (35, 36).

Después de la filtración en gel en una columna de Sephadex G25 de Pharmacia para eliminar la biotina no unida, la proteína se multimerizó con moléculas de dextrano conjugadas con estreptavidina-FITC (amablemente proporcionado por L. Winther, DAKO, Dinamarca) con el fin de generar compuestos multivalentes HLA-dextrano para la inmunohistoquímica. La construcción HLA A*0201 fue un amable obsequio del Dr. Mark M. Davis (Departamento de Microbiología e Inmunología, Universidad de Stanford, Palo Alto, CA). La separación celular se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente (37). Brevemente, se lavaron 5x106 bolas magnéticas conjugadas con estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega) dos veces en 200 μl de PBS frío, se añadieron 0,5 μg de monómeros de péptido/A*0201 y la mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente. Después de dos lavados estas bolas se mezclaron con PBL en una proporción de 1:10 y posteriormente se incubaron durante 1 hora seguido por una precipitación de las células unidas a las bolas en un campo magnético. El paso de precipitación se repitió una vez.

Tinciones inmunohistoquímicas

Para la tinción con los complejos péptido/MHC multiméricos conjugados con FITC, las secciones de tejido se secaron durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fría durante 5 minutos. Todos los pasos de incubación se llevaron a cabo a temperatura ambiente y en la oscuridad: (i) 45 minutos del anticuerpo primario (diluido 1:100), (ii) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; código 115-165-100, Jackson ImmunoResearch, obtenido de Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45 minutos, y finalmente (iii) los multímeros durante 75 minutos. Entre cada paso los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0,1%. Los portaobjetos se montaron en Vectashield y se mantuvieron en la nevera hasta que se observaron con el microscopio confocal.

Ensayo de citotoxicidad

Se llevaron a cabo ensayos convencionales de liberación de [51Cr] para determinar la citotoxicidad mediada por CTL como se describe en (13). Las células diana eran líneas de células B autólogas transformadas por EBV, la línea celular de cáncer de mama MCF-7 positiva para HLA-A2 (disponible en ATCC), la línea celular de melanoma FM3 positiva para HLA-A2 (38), la línea celular de cáncer de mama BT-20 negativa para HLA-A2 (disponible en ATCC) y la línea celular de melanoma FM45 negativa para HLA-A2 (38). Todas las líneas celulares de cáncer expresaban survivina examinadas por RT-PCR (datos no mostrados).

Ensayo ELISPOT

Se utilizó el ensayo ELISPOT para cuantificar las células efectoras liberadoras de IFN-γ específicas del epítopo del péptido y se ha descrito anteriormente (39). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore) con un anticuerpo anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Suecia) y se bloqueó la unión no específica utilizando AIM V (GibcoBRL, Life Technologies, Inc., Gaithersburg, MD, EE UU). Se añadieron linfocitos a diferentes concentraciones celulares junto con los péptidos específicos y células T2 y se incubaron durante la noche a 37°C. Tras dos lavados, se añadió el anticuerpo de detección biotinilado (7-B6-1-Biotina Mabtech). La unión específica se visualizó utilizando fosfatasa alcalina-avidina junto con el sustrato respectivo (GibcoBRL). La reacción se terminó tras la aparición de manchas púrpura oscuro, que se cuantificaron utilizando el Sistema AlphaImager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE UU). Los péptidos utilizados para el ELISPOT fueron Sur1, Sur9 y el péptido análogo de Sur1 Sur1M2, como se describe en el Ejemplo 1.

Resultados

Tinción in situ de células T que reaccionan con HLAA2/survivina

En el Ejemplo 1 se identificaron dos epítopos peptídicos derivados de survivina reconocidos por las células T en leucemia y melanoma, es decir, Sur1. La débil afinidad de unión de Sur1 a HLA-A2 mejoró sustancialmente mediante el reemplazo de la treonina en la posición 2 con un residuo de anclaje mejor (metionina; Sur1M2). Esta medida permitió la construcción de complejos HLA-A2/péptido estables. Estos complejos se multimerizaron utilizando moléculas de dextrano, que se conjugaron con estreptavidina y FITC. Se utilizaron complejos de MHC multimerizados para teñir material congelado fijado con acetona. Utilizando un microscopio láser confocal se pudieron detectar fácilmente los CTL que reaccionan con Sur1M2/HLA-A*0201 in situ en el microentorno tumoral. Se representan estas células en el tumor primario y en el ganglio linfático centinela de un paciente de melanoma en etapa III así como en una lesión de cáncer de mama primario. Con el fin de asegurar la especificidad de la tinción, se llevaron a cabo una serie de controles negativos. Ni el uso de los multímeros péptido/HLA-dextrano con péptidos derivados del antígeno de diferenciación de melanoma gp100 en el mismo tumor, ni los multímeros Sur1M2/HLAdextrano en el caso de una muestra tumoral obtenida de un donante negativo para HLA-A2, produjeron una tinción positiva.

Los CTL aislados que reaccionan con survivina lisan líneas celulares tumorales de diferente origen

Con el fin de caracterizar la capacidad funcional de los CTL que reaccionan con survivina, estas células se aislaron por medio de bolas magnéticas recubiertas con complejos HLA-A2/Sur1M2 (36). Un ganglio linfático infiltrado por melanoma recién cortado se troceó en fragmentos pequeños y se aplastó para liberar las células al cultivo. Las células se estimularon una vez con el péptido in vitro antes del aislamiento. Un día después del aislamiento se añadió IL-2 y el día 5 se probó la capacidad de estas células para aniquilar células tumorales, ya sea mediante ELISPOT o en un ensayo estándar de liberación de 51Cr. Primero, por medio del análisis ELISPOT fue posible establecer que los CTL aislados utilizando el complejo modificado Sur1M2/HLA-A2 también respondían al péptido Sur1 nativo (datos no mostrados). Segundo, se probó la citotoxicidad de los CTL que reaccionan con survivina contra la línea celular de melanoma FM3 positiva para HLA-A2 (Fig. 5A) y la línea celular de cáncer de mama MCF-7 positiva para HLA-A2 (Fig. 5B). Las células T aisladas lisaron de una manera eficaz ambas líneas celulares de HLAA*0201. En contraste, no se observó citotoxicidad alguna contra la línea celular de melanoma FM45 negativa para HLA-A2 (Fig. 5A) o la línea celular de cáncer de mama BT-20 negativa para HLA-A2 (Fig. 5B).

Reactividad a survivina medida en PBL mediante ELISPOT

Se examinó la presencia de células T que reaccionan con survivina en PBL de diez pacientes de cáncer de mama positivos para HLA-A2 mediante el ELISPOT. Antes del análisis, los PBL se estimularon una vez in vitro para aumentar la sensibilidad del ensayo. Se examinó la reactividad a los siguientes péptidos de survivina: Sur1, Sur9 y Sur1M2. Se detectaron células T específicas de survivina en seis de los diez pacientes de cáncer de mama positivos para HLA-A2. Se dan ejemplos representativos en la Figura 6. En los PBL de dos pacientes se detectó una respuesta contra Sur1 y el análogo modificado Sur1M2, pero no contra Sur9 (Fig. 6, parte superior, media), en tres pacientes se detectó una respuesta a Sur9, pero no a Sur1 o Sur1M2 (Fig. 6, parte inferior) y un paciente respondió solamente a Sur1M2. En contraste, no se detectaron respuestas a survivina en los PBL de 20 donantes sanos positivos para HLA-A2. De una manera similar, se examinaron los PBL de catorce pacientes de melanoma positivos para HLA-A2. Hubo respuestas a survivina presentes en siete de estos pacientes (Tabla 2). Dos pacientes respondieron al péptido Sur9, tres al péptido Sur1M2, uno tanto a Sur1 como a SurM2 y uno a los tres péptidos. En el ejemplo 1, se probó la respuesta de células T a survivina en tres pacientes de leucemia linfática crónica (LLC) (Tabla 2; LLC1, LLC2, LLC3). Estos estudios se extendieron utilizando PBL de tres pacientes adicionales de LLC. Notablemente, todos los pacientes produjeron una respuesta de células T a al menos un epítopo de survivina (Tabla 2; LLC5, LLC6, LLC7). Además, se examinaron los PBL de un paciente que padecía leucemia mieloide crónica (LMC). En este paciente, se identificó una respuesta a los tres péptidos (datos no mostrados). Los datos se resumen en la Tabla 2.

Tabla 2. Pacientes con linfocitos T específicos del péptido survivina en PBL medido mediante ELISPOT

Melanoma a)

Paciente Sur1 Sur9

Sur1M2

P4 --P11 --P13 --P15 61 -P17 -172 P39 -127 P64 112 70

97 112 71 101 --128

Cáncer de Mama b)

Paciente Sur1 Sur9

Sur1M2

B1 122 -B2 67 -B3 -54 B4 -45 B5 -19 B6 --

208 72 ---24

LLC c)

Paciente Sur1 Sur9

Sur1M2

LLC1 -27LLC2 -39 CLL3 23 127 LLC5 -100 LLC6 -121 LLC7 68 132

320 -122 124 360 174

a) Frecuencia de células reactivas por 104; 14 pacientes examinados. 5 b) Frecuencia de células reactivas por 104; 10 pacientes examinados. c) Frecuencia de células reactivas por 105; 7 pacientes examinados.

Ejemplo 3

10 Respuestas inmunes restringidas a HLA-B35 a péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer.

Resumen

En este estudio, se identificaron y caracterizaron dos epítopos derivados de survivina, que están restringidos a HLA

15 B35. La reactividad de células T específica contra ambos epítopos estaba presente en la sangre periférica de los pacientes con diferentes tumores malignos hematopoyéticos y melanoma. Las sustituciones del residuo de anclaje C-terminal mejoraron el reconocimiento por parte de los linfocitos infiltrantes en el tumor de los pacientes de melanoma. Además, se demostraron respuestas espontáneas de células T citotóxicas a survivina in situ en una lesión de melanoma primario. Estos epítopos extienden la aplicabilidad de futuras estrategias de vacuna basada en

20 los péptidos de survivina en relación con los tumores malignos así como el perfil de HLA de los pacientes involucrados.

En los ejemplos 1 y 2, se estudiaron los epítopos de células T derivados de survivina restringidos a HLA-A2. Debido a que HLA-A2 solamente se expresa en aproximadamente el 30% de la población blanca (63), se necesita identificar

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

los epítopos de péptidos restringidos a otras moléculas de HLA de clase I para extender la fracción de pacientes que se podrían tratar. En este estudio, se identificaron dos epítopos nuevos de células T de survivina restringidos a HLAB35, que se expresa en el 9% de la población blanca (63), y se detectaron respuestas inmunes espontáneas a estos péptidos de survivina en pacientes con diferentes tumores malignos hematopoyéticos y melanoma.

Materiales y Métodos

Pacientes

Se recogieron muestras de sangre de vena periférica de pacientes de cáncer, se aislaron los PBL utilizando separación por Lymphoprep, se tipificó el HLA (Departamento de Inmunología Clínica, Hospital de la Universidad, Copenhague) y se congelaron en SFT con DMSO al 10%. Se seleccionaron diez pacientes positivos para HLA-B35 para un análisis adicional. Estos pacientes padecían melanoma, LLC, linfoma folicular (LF), linfomas difusos de células B grandes (DLBCL) y mieloma múltiple (MM), respectivamente. En el momento en que se recogieron las muestras de sangre los pacientes no habían sido tratados médicamente en los cuatro meses anteriores. Adicionalmente, se recogieron linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) aislados de ganglios linfáticos de tres de los pacientes de melanoma, y se congelaron en SFT con DMSO al 10%.

Péptidos

Se utilizaron siete péptidos sintéticos derivados de survivina en este estudio: Sur6-14, Sur11-19, Sur34-43, Sur4654, Sur51-59, Sur46Y9, Sur51Y9 y un péptido derivado de EBV, EBNA3A 457-466 (63). Todos los péptidos se obtuvieron de Research Genetics (Huntsville, AL) y se suministraron a una pureza >90%, verificado mediante análisis de HPLC y MC. Los péptidos se enumeran en la tabla 3 a continuación.

Tabla 3. Unión de los péptidos derivados de survivina a HLA-B35

Nombre

Proteína y posición Secuencia SEQ ID NO: C50 (μM)

Sur6-14

Survivina6-14 LPPAWQPFL 18 >100

Sur11-19

Survivina11-19 QPFLKDHRI 19 Sin unión

Sur34-43

Survivina34-43 TPERMAEAGF 20 >100

Sur46-54

Survivina46-54 CPTENEPDL 6 20

Sur51-59

Survivina51-59 EPDLAQCFF 7 13

Sur46Y9

Péptido modificado CPTENEPDY 8 4

Sur51Y9

Péptido modificado EPDLAQCFY 9 1,5

C24

EBNA3A458-466 YPLHEQHQM 21 0,8

Ensayo de ensamblaje para la unión del péptido a moléculas de MHC de clase I.

Se utilizó el ensayo de ensamblaje descrito en los ejemplos 1 y 2 para medir la afinidad de unión de los péptidos sintéticos a las moléculas HLA-B35 metabólicamente marcadas con [S35]metionina. Brevemente, el ensayo se basa en la estabilización mediada por el péptido de las moléculas de HLA vacías liberadas, después de la lisis celular, de la línea celular T2 deficiente en TAP, establemente transfectada con HLA-B35 (amablemente proporcionada por el Dr. J. Haurum, Symphogen ApS, Lyngby, Dinamarca). Las moléculas de HLA establemente plegadas se inmunoprecipitaron utilizando el Acm W6/32 dependiente de conformación. Las moléculas de HLA se separaron mediante electroforesis IEF, los geles se expusieron a pantallas de phosphorimager (Imaging plate, FUJI film Co., LTD., Japón), se analizaron y se cuantificó la cantidad de moléculas de HLA correctamente plegadas, utilizando el software de phosphorimager ImageGauge (FUJI photo film Co., LTD., Japón).

Estimulación de PBL por antígeno

Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, los linfocitos se estimularon una vez in vitro con el péptido antes del análisis (14, 15). Los PBL o TIL se descongelaron y se estimularon con los epítopos péptidos individuales 50 μM en placas de 96 pocillos durante 2 horas a 26°C (5x105-106 células por péptido) y se juntaron durante 10 días adicionales de cultivo a 37°C en x-vivo con suero humano (SH) al 5%, en placas de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca), con 2x106 células por pocillo. El segundo día de la incubación se añadió IL-2 40 μg/ml (Apodan A/S, Dinamarca). El día 10, se probó la reactividad de las células cultivadas en el ensayo ELISPOT.

El ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT utilizado para cuantificar las células efectoras liberadoras de IFN-γ específicas del péptido en PBL o TIL recogidos de pacientes de cáncer se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1. Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45; Millipore, Hedehusene, Dinamarca) con el Acm contra IFN-γ humano, 7,5 μg/ml (1-D1K; Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se lavaron y se bloquearon con x-vivo (x-vivo 15TM BioWhittacker, Molecular Applications Aps, Dinamarca) y las células se añadieron en duplicados a diferentes concentraciones. Para la presentación del antígeno, se añadieron 104 células T2-B35, con y sin el péptido 10 μM, por pocillo. Las placas se incubaron durante la noche, las células se desecharon y los pocillos se lavaron antes de añadir el anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotina; Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura ambiente, se lavaron y se añadió el conjugado avidinafosfatasa alcalina (AP-Avidina; Calbiochem, Life Technologies, Inc.). Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se añadió el sustrato enzimático nitroazul de tetrazolio/fosfato de 5-bromo-4-cloro-3-indolilo (Código No. K0598, DakoCytomation Norden A/S) y surgieron manchas púrpura oscuro en 3-7 minutos. La reacción se terminó lavando con agua del grifo. Las manchas se contaron utilizando el Sistema Alpha Imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA) y se calculó la frecuencia de células T específicas del péptido a partir del número de células formadoras de manchas.

Todos los ensayos se llevaron a cabo en duplicado para cada antígeno peptídico y los linfocitos cultivados en el mismo pocillo se probaron en números iguales de células con y sin péptido, para medir el número de células específicas del péptido en el cultivo.

Maduración de células dendríticas (CD)

Se aislaron células adherentes a partir de PBL después de 2 horas de cultivo. Estas se cultivaron durante 10 días adicionales en RPMI 1640 (GibcoTM Invitrogen Corporation, UK) con SFT al 10%. Se añadieron GM-CSF 800 ng/ml (PreproTech, Londres, UK) e IL-4 40 ng/ml (PreproTech) cada tres días. El día 10, las CD se hicieron madurar durante 24 horas mediante la adición de TNF-α 50 ng/ml (PreproTech). Después de la maduración, las CD se liberaron y se pulsaron con el péptido 20 μM en presencia de β2-microglobulina 3 μg/ml durante 2 horas a 26°C.

Aislamiento de células T específicas de péptido

Se aislaron células específicas de antígeno utilizando bolas magnéticas recubiertas con sur51Y9/HLA-B35, como se describe en el ejemplo 2. Los monómeros biotinilados de HLA-B35 con sur51Y9 (obtenidos de ProImmune, Oxford, UK) se acoplaron a bolas magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads M-280, Dynal A/S, Oslo, Noruega), mediante incubación de 2,5 μg de monómeros con 5x106 bolas en 40 μl de PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los complejos magnéticos se lavaron tres veces en PBS, utilizando un dispositivo magnético (Dynal A/S, Oslo, Noruega) y posteriormente se mezclaron con los PBL en una proporción de 1:10 en PBS con BSA al 5% y se rotaron muy suavemente durante 1 hora. Las células T CD8+ específicas del antígeno que se asociaron con los complejos magnéticos, se lavaron suavemente dos o tres veces. Las células aisladas se resuspendieron varias veces en x-vivo suplementado con suero humano al 5% y se incubaron durante 2 horas antes de que se liberaran las bolas magnéticas y se eliminaran de la suspensión celular. Las células T CD8+ específicas del antígeno aisladas se utilizaron en el ensayo ELISPOT, para analizar la reactividad cruzada entre el péptido nativo y modificado.

Mapeo de clonotipo de TCR mediante electroforesis en gel en gradiente desnaturalizante (DGGE).

El mapeo del clonotipo por DGGE de las regiones 1-24 de TCR BV humanas se ha descrito con detalle (66). Brevemente, se aisló el ARN utilizando el kit de Aislamiento Purescript (Gentra Systems Inc. MN) y se amplificó el ADNc transcrito mediante PCR utilizando cebadores para las regiones variables de las cadenas beta de TCR junto con un cebador común de la región constante. Se utilizó el programa de ordenador MELT87 para asegurar que las moléculas de ADN amplificadas fueran adecuadas para el análisis por DGGE, siempre que se uniera una secuencia rica en GC de 50 pb (pinza-GC) al extremo 5’ del cebador de la región constante. El análisis por DGGE se hizo en geles de poliacrilamida al 6% que contenían un gradiente de urea y formamida del 20% al 80%. La electroforesis se llevó a cabo a 160 V durante 4,5 horas en tampón TAE 1x a una temperatura constante de 54°C.

Tinciones inmunohistoquímicas

Se utilizaron complejos péptido/HLA multimerizados para identificar las células T específicas del antígeno in situ en lesiones tumorales de pacientes de cáncer empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 2. El monómero sur5lY9/HLA-B35 biotinilado fue suministrado por Proimmune Limited, Oxford, UK. Los monómeros biotinilados de sur51Y9/HLA-B35 se multimerizaron con moléculas de dextrano conjugadas con estreptavidina-FITC (amablemente proporcionado por L. Winther, DAKO, Glostrup, Dinamarca), para generar compuestos multivalentes HLA-dextrano para la inmunohistoquímica. Las secciones de tejido se secaron durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fría durante 5 minutos. Todos los pasos de incubación se llevaron a cabo en la oscuridad a temperatura ambiente: (a) 45 minutos del anticuerpo primario (diluido 1:100) (b) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; código 115-165-100; Jackson ImmunoResearch, obtenido en Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45 minutos; y finalmente (c) los multímeros durante 75 minutos. Entre cada paso, los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0,1%. Los portaobjetos se montaron en Vectashield y se mantuvieron en la nevera hasta que se observaron con el microscopio confocal (Leica).

Resultados

Identificación de los péptidos derivados de survivina que se unen a HLA-B35

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de survivina para determinar los péptidos nonaméricos y decaméricos con residuos de anclaje, según el motivo de unión a péptido de HLA-B35 (67). Se seleccionaron cinco péptidos que contenían prolina como el anclaje N-terminal en la posición 2, y fenilalanina, leucina, isoleucina o tirosina como residuos de anclaje C-terminales (Tabla 3). El ensayo de ensamblaje reveló que dos péptidos, sur51-59 (EPDLAQCFF, SEQ ID NO: 7) y sur46-54 (CPTENEPDL, SEQ ID NO: 6) fueron capaces de estabilizar HLA-B35 de una manera eficaz. Además, dos péptidos, sur34-43 (TPERMAEAGF, SEQ ID NO: 20) y sur6-14 (LPPAWQPFL, SEQ ID NO: 18) mostraron una estabilización débil, mientras que el péptido restante no estabilizó HLA-B35 en absoluto. La concentración del péptido requerida para la recuperación semi-máxima de HLA-B35 (C50) se estimó en 13 μM para sur51-59 y 20 μM para sur46-54. En comparación, el epítopo del control positivo C24 de EBNA3A458466 (YPLHEQHQM, SEQ ID NO: 21) tenía un valor estimado de C50 de 0,8 μM.

Con el fin de mejorar la afinidad de unión de sur46-54 y sur51-59 el aminoácido C-terminal se sustituyó con tirosina, un residuo de anclaje mejor (67). Se analizó la recuperación de HLA-B35 mediada por los péptidos modificados en el ensayo de ensamblaje, y se estimaron los valores C50 en 1,5 μM para sur51Y9 y en 4 μM para sur46Y9 (Fig. 7).

Respuestas inmunes espontáneas contra los epítopos de péptidos nativos.

Inicialmente, se analizaron las respuestas inmunes espontáneas de cinco pacientes a los cuatro péptidos de unión a HLA-B35 nativos, sur51-59, sur46-54, sur34-43 y sur6-14. Estos cinco pacientes tenían diferentes tumores malignos hematopoyéticos: HEM8 y HEM18 padecían MM, HEM12 padecía LF, HEM9 tenía DLBCL y LLC5 tenía LLC.

Se llevaron a cabo los ensayos ELISPOT de IFN-γ sobre los PBL después de 10 días de estimulación in vitro para detectar los CTL precursores del péptido. Se detectaron respuestas inmunes espontáneas contra dos de los péptidos nativos de unión a HLA-B35, sur51-59 y sur46-54. Dos pacientes, HEM12 y LLC5 mostraron respuesta tanto a sur51-59 como a sur46-54, mientras que HEM8 solamente mostró respuesta a sur51-59 (Figura 8A y B). No se pudo detectar respuesta alguna en los dos pacientes restantes, HEM9 y HEM18, y no se pudo detectar respuesta alguna a los péptidos de unión mala sur34-46 y sur6-14 en ninguno de los pacientes.

Se utilizó un planteamiento alternativo a la estimulación in vitro en el paciente HEM12, es decir, los PBL se cocultivaron con células dendríticas autólogas maduras pulsadas con sur51-59 para estimular una respuesta de CTL in vitro. Los PBL de este cultivo mostraron una fuerte reactividad hacia sur51-59 en el ELISPOT (Figura 8B).

Reconocimiento aumentado de los péptidos modificados

Como se ha descrito anteriormente, las modificaciones de péptidos para mejorar la afinidad a HLA-B35 produjeron una afinidad 5-10 veces más alta para HLA-B35 en relación con los péptidos nativos. Se analizó un grupo de cinco pacientes de melanoma para determinar las respuestas inmunes espontáneas tanto a los péptidos nativos como modificados, por medio del ensayo ELISPOT. Las muestras de PBL se analizaron después de la estimulación in vitro, mientras que las muestras de TIL se analizaron directamente. Se observaron respuestas inmunes espontáneas ya sea en los PBL o en los TIL de tres de los cinco pacientes. FM25 mostró reactividad contra sur51-59 y sur51Y9 tanto en muestras de PBL como de TIL (Fig. 9A). FM45 respondió solamente al péptido modificado sur51Y9, con una fuerte respuesta detectable en los TIL. No hubo PBL disponibles de este paciente (Fig. 9A). FM74 mostró una fuerte respuesta a sur46Y9 en TIL, pero no fue detectable respuesta alguna al péptido nativo (Fig. 9B). También se observó una respuesta débil a sur46Y9 en los PBL de FM74 (datos no mostrados).

Reactividad cruzada entre el péptido nativo y el modificado

La alta afinidad de sur51Y9 por HLA-B35 hace posible la producción de monómeros estables de HLA-B35 con sur51Y9. Habiéndose establecido la presencia de linfocitos T que reaccionan con survivina en los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor y los PBL de diferentes pacientes de cáncer, se recubrieron bolas magnéticas con tales complejos HLA-B35/sur51Y9 y estos se utilizaron para aislar linfocitos T que reaccionan con el péptido de survivina a partir de PBL del paciente LLC5. Este paciente mostró una fuerte respuesta a sur51-59. Las bolas estaban fuertemente unidas a la superficie celular de las células específicas, como se visualizó mediante microscopía (datos no mostrados), permitiendo la precipitación de células específicas de antígeno mediante un campo magnético. Las células específicas de sur51Y9 aisladas respondieron fuertemente a sur51-59 (Figura 9), mientras que no se pudo detectar respuesta alguna en los PBL restantes (datos no mostrados). El aislamiento se analizó mediante el mapeo de clonotipo de TCR basado en RT-PCR/DGGE. Esta técnica permite hacer el análisis de la clonalidad de células T en poblaciones celulares complejas, incluso cuando solamente están disponibles pequeños números de células. Estos análisis mostraron que se aislaron 8 clones distintos (datos no mostrados).

Células T específicas de antígeno presentes in situ en lesiones de melanoma

Los monómeros sur51Y9/HLA-B35 se multimerizaron utilizando moléculas de dextrano conjugadas con estreptavidina y FITC. Los complejos de MHC multimerizados se utilizaron para teñir material congelado y fijado con acetona, empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Las células específicas de antígeno se visualizaron utilizando un microscopio láser confocal. Se analizaron secciones de melanoma primario de tres pacientes y se pudieron detectar fácilmente los CTL que reaccionan con sur5lY9/HLA-B35 in situ, en el microentorno tumoral en uno de los pacientes. La cotinción con un Acm contra granzima B mostró que estos CTL específicos de survivina liberaban granzima B, ejerciendo una actividad citotóxica, se utilizaron pacientes de melanoma negativos para HLAB35 como controles (datos no mostrados).

Ejemplo 4

Identificación de nuevos epítopos de CTL derivados de survivina con diferentes perfiles de restricción a HLA-A.

Resumen

Se caracterizaron nuevos epítopos de survivina restringidos a HLA-A1, HLA-A2, HLA-A3 y HLA-A11 en base en las respuestas de CTL en pacientes de cáncer. Estos epítopos aumentan de manera significativa el número de pacientes elegibles para la inmunoterapia basada en los péptidos derivados de survivina. Además, es probable que el direccionamiento colectivo a varios elementos de restricción reduzca el riesgo de escape inmune por pérdida del alelo HLA.

Materiales y Métodos

Pacientes

Las muestras de pacientes se recibieron de la Universidad de Würzburg, Alemania, y del Hospital de la Universidad en Herlev, Dinamarca. Se obtuvo el consentimiento informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas. La tipificación del tejido se realizó en el Departamento de Inmunología Clínica, Hospital de la Universidad, Copenhague, Dinamarca. Se aislaron linfocitos de sangre periférica (PBL) de los pacientes de cáncer con melanoma, carcinoma de mama y leucemia linfocítica crónica (LLC), utilizando separación por Lymphoprep y se congelaron en suero fetal de ternera (SFT) con dimetilsulfóxido al 10%. Además, se obtuvieron linfocitos T de lesiones primarias y de ganglios linfáticos infiltrados por tumor de los pacientes de melanoma. El tejido tumoral recién cortado se troceó en fragmentos pequeños y se aplastó para liberar los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL) para la crioconservación.

Péptidos

Todos los péptidos se adquirieron de Invitrogen (Carlsbad, CA, EE UU) y se suministraron a una pureza de >80% verificado mediante análisis por HPLC y MS. Todos los péptidos utilizados se enumeran en la Tabla 4, en el ejemplo 5 posteriormente.

Líneas celulares

La línea celular humana T2 es un híbrido deficiente en TAP1 y TAP2 de las células B-LCL.174 y T-LCL CEM, y por tanto, solamente expresa niveles bajos de moléculas de HLA de clase I (HLA-A*0201 y HLA-B*5101) en la superficie celular. Las células T2 transfectadas con HLAA*0301 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. A. McMicheael, IMM, Hospital John Radcliffe, Oxford. Las células T2 transfectadas con HLA-A*1101 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. M. Masucci, MTC, Instituto Karolinska, Estocolmo, Suecia. La línea celular BM36.1 también es deficiente para la función TAP y tiene un fenotipo similar a T2 con una baja expresión de HLA de clase I (HLA-A*0101, HLA-B*3501) en la superficie. Las células BM36.1 fueron amablemente proporcionadas por el Dr. A. Ziegler, Universidad Humboldt, Berlín, Alemania.

Ensayo de ensamblaje para la unión de péptido a moléculas de MHC de clase I

La afinidad de unión de los péptidos sintéticos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EE UU) a las moléculas HLA-A1, -A2, -A3 o –A11 metabólicamente marcadas con [35S]-metionina, se midió en el ensayo de ensamblaje, como se ha descrito anteriormente (12). El ensayo se basa en la estabilización mediada por péptido de las moléculas de HLA vacías liberadas después de la lisis celular, de las líneas celulares deficientes en TAP. Las moléculas de HLA establemente plegadas se inmunoprecipitaron utilizando el Acm W6/32 dependiente de conformación, específico de HLA de clase I y se separaron mediante electroforesis en gel por isoelectroenfoque (IEF). Las bandas de cadena pesada del MHC se cuantificaron utilizando el programa ImageGauge PhosphorImager (FUJI photo film Co., Carrollton, TX, EE UU). La intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de complejo de MHC de clase I unido al péptido recuperado durante el ensayo. Posteriormente, el nivel de la estabilización de la molécula de HLA está directamente relacionado con la afinidad de unión del péptido añadido. La concentración del péptido utilizada para analizar la recuperación de las moléculas HLA fue de 40, 4, 0,4, 0,04 μM para HLA-A1 y HLA-A11, y de 100, 10, 1, 0,1, 0,01 μM para HLA-A2 y HLA-A3. Posteriormente se calculó el valor C50 para cada péptido como la concentración de péptido suficiente para una estabilización semi-máxima.

Estimulación de PBL por antígeno

Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, los PBL se estimularon una vez in vitro antes del análisis. El día 0, se descongelaron los PBL o ganglios linfáticos aplastados y se sembraron como 2x106 células en 2 ml/pocillo en placas de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en medio x-vivo (BioWhittaker, Walkersville, Maryland), suero humano inactivado por calor al 5% y L-glutamina 2 mM en presencia de péptido 10 μM. Dos días después, se añadió a los cultivos interleuquina-2 recombinante 20 UI/ml (IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemania). Se probó la reactividad de las células cultivadas en el ELISPOT en el día 10.

Ensayo ELISPOT

El ensayo ELISPOT se utilizó para cuantificar las células efectoras liberadoras de interferón-γ específicas del epítopo peptídico, como se ha descrito anteriormente (16). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) con anticuerpo anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se lavaron, se bloquearon con medio x-vivo y las células se añadieron en duplicados a diferentes concentraciones celulares. Luego se añadieron los péptidos a cada pocillo y las placas se incubaron durante la noche. Al día siguiente, se eliminó el medio y los pocillos se lavaron antes de añadir el anticuerpo secundario biotinilado (7-B6-1-Biotina, Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas, se lavaron y se añadió a cada pocillo el conjugado avidina-fosfatasa alcalina (Calbiochem, Life Technologies, Inc. San Diego, CA, EE UU). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una hora, se lavaron y se añadió el sustrato enzimático NBT/BCIP (DakoCytomation Norden A/S, Glostrup, Dinamarca) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. Tras el surgimiento de manchas púrpura oscuro, se terminó la reacción lavando con agua del grifo. Las manchas se contaron utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EE. UU.) y se pudo calcular la frecuencia de CTL específicos de péptido a partir de los números de células formadoras de manchas. Todos los ensayos se llevaron a cabo por duplicado para cada antígeno peptídico.

Resultados

Identificación de epítopos de survivina restringidos a HLA-A1

Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-A1

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la proteína survivina para los epítopos de péptidos nonaméricos o decaméricos de HLA-A1 más probables, utilizando los principales residuos de anclaje de HLA-A1, ácido aspártico (D), ácido glutámico (E) en la posición 3 y tirosina (Y), fenilalanina (F) en el extremo C. Según esto, se sintetizaron seis péptidos derivados de survivina y se examinó su unión a HLA-A1 (Tabla 4). Adicionalmente, se incluyeron los dos péptidos sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID NO: 23) y Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO: 25), a pesar de que solamente contenían uno de los anclajes principales, debido a que ambos se identificaron como posibles buenos unidores mediante el algoritmo predictivo de Rammensee y col. disponible en http://syfpeithi.bmiheidelberg.com/. Se estimaron los valores C50 para cada péptido como la concentración de péptido necesaria para la estabilización semi-máxima de HLA-A1 (Tabla 4). Sin embargo, solamente uno de estos péptidos, sur92-101 (GFEELTLGEF) (SEQ ID NO: 27) se unió con una afinidad alta casi similar a la del epítopo del control positivo conocido de la proteína del virus de la gripe A, polimerasa básica 1 (PB1) (VSDGGPNLY), como se ejemplifica en la Figura 10. Sur93-101 (FEELTLGEF) (SEQ ID NO: 24) tuvo una baja afinidad de unión a HLA-A1, mientras que ninguno de los otros péptidos analizados se unió a HLA-A1 (Tabla 4). Por consiguiente, se sintetizaron un número de péptidos análogos en los que residuos de anclaje mejores reemplazaron a los aminoácidos naturales. Se modificaron los dos péptidos Sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID NO: 23) y Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO: 25), introduciendo tirosina (Y) en lugar de cisteína (C) o glutamina (Q), respectivamente, en el extremo C. Ambos péptidos modificados se unieron fuertemente a HLA-A1 (Tabla 4). Adicionalmente, se sustituyeron los aminoácidos en la posición 2 con los anclajes auxiliares de treonina (T) o serina (S) en los dos péptidos Sur92-101 y Sur93-101. Estas modificaciones no tuvieron un efecto positivo en la unión de Sur92-101 a HLA-A1. En contraste, Sur93T2 (FTELTLGEF) (SEQ ID NO: 36) se unió con una alta afinidad a HLA-A1 (Tabla 4). La Figura 10 ilustra la unión del péptido nativo de baja afinidad Sur93-101, del péptido modificado de alta afinidad Sur93T2 y del péptido que no se une Sur49-58, comparados con el epítopo del control positivo del virus de la gripe. Finalmente, se modificaron Sur14-22, Sur34-43, Sur49-58, Sur51-59, Sur92-101 y Sur93-101 con tirosina (Y) en el extremo C, sin embargo esto no mejoró la afinidad de unión a HLA-A1 para ninguno de estos péptidos (datos no mostrados).

Respuestas de CTL restringidos a HLA-A1 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Se analizaron los PBL de seis pacientes de melanoma, y los TIL de tres pacientes de melanoma, para determinar la presencia de CTL específicos contra cualquiera de los cuatro péptidos de alta afinidad deducidos de survivina Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101 y Sur93T2 por medio de ELISPOT. Se observó reactividad de células T contra al menos uno de los péptidos derivados de survivina en tres muestras de PBL y una muestra de TIL del total de nueve pacientes analizados. Como se ve en la Figura 11, los PBL de un paciente, Mel.A1-3, alojaron una respuesta de células T contra los cuatro péptidos, Sur38Y9, Sur47Y10, Sur92-101 y Sur93T2. Mel.A1-2 mostró respuestas contra Sur47Y10, Sur92-10 y Sur93T2, mientras que en Mel.A1-1/TIL y Mel.A1-4/PBL, se observaron respuestas contra Sur47Y10 y Sur93T2, respectivamente (Figura 11).

Además, se probó la reactividad inmune de diez pacientes de melanoma contra los péptidos nativos Sur93-101, Sur38-46 y Sur47-56, por medio de ELISPOT; sin embargo, no se detectaron respuestas específicas de péptido en ninguno de estos pacientes (datos no mostrados).

Identificación de los epítopos de survivina restringidos a HLA-A11.

Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-A11

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la proteína survivina para determinar los péptidos nonaméricos o decaméricos con motivos de unión correspondientes al de la superfamilia de HLA-A3, incluyendo HLA-A3 y HLAA11. Se seleccionaron las secuencias de péptidos con los residuos de anclaje principales, leucina (L) en la posición 2 y lisina (K) en el extremo C, junto a las secuencias peptídicas que tuvieran aminoácidos relacionados en estas posiciones, según el algoritmo predictivo de Rammensee y colaboradores (Tabla 4).

Se predijeron trece péptidos a partir de la secuencia de proteína de survivina y se analizó la unión a HLA-A11 y HLAA3. Tres de estos péptidos, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 47), Sur54-62 (LAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 42) y Sur112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO: 44) se unieron a HLA-A11 con alta afinidad, comparable con el epítopo vírico del antígeno nuclear 4 de EBV (AVFDRKSDAK) (SEQ ID NO: 63). Además, un péptido, Sur112-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO: 51) se unió débilmente a HLA-A11 (Tabla 4).

Respuestas de CTL restringidos a HLA-A11 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer.

Se probaron los PBL de cinco pacientes de melanoma y dos pacientes de LLC, para determinar la reactividad de células T contra los cuatro péptidos de unión a HLA-A11, Sur53-62, Sur54-62, Sur112-120 y Sur112-121. Se pudieron detectar respuestas contra el péptido derivado de survivina Sur53-62 en los PBL de dos de los pacientes de melanoma, Mel.A11-1, Mel.A11-2, por medio de ELISPOT (Figura 12). Adicionalmente, se pudieron detectar células T específicas de Sur53-62 entre los linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) de un ganglio linfático infiltrado por tumor en el paciente Mel.A11-2 (Figura 12). En el paciente Mel.A11-1 se observó una fuerte respuesta inmune contra el péptido de survivina Sur53-62 en cinco muestras diferentes de sangre tomadas durante un período de 2 años (datos no mostrados).

Identificación de los epítopos de survivina restringidos a HLA-A3

Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-A3

Los péptidos derivados de survivina predichos para la unión a la superfamilia de HLA-A3 se analizaron adicionalmente para determinar la unión a HLA-A3. Solamente dos de los péptidos, Sur112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO: 44) y Sur112-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO: 57) se unieron a HLA-A3 con alta afinidad, similar a la del epítopo vírico, la nucleoproteína del virus de la gripe A 265-273 (ILRGSVAHK) (SEQ ID NO: 74) (Tabla 4). Además, dos péptidos, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 47) y Sur95-103 (ELTLGEFLK) (SEQ ID NO: 43), se unieron débilmente a HLA-A3.

Algunos de los péptidos sin unión detectable se modificaron en un intento por aumentar la afinidad de unión a HLAA3. Por tanto, se sintetizaron dos péptidos análogos de Sur54-62 y Sur113-122, en los que un mejor residuo de anclaje, leucina (L), reemplazó a la alanina natural (A) en la posición 2. Sur54L2 (LLQCFFCFK) (SEQ ID NO: 56) se unió a HLA-A3 con alta afinidad, mientras que Sur113L2 (ILKETNNKKK) (SEQ ID NO: 59) solo se unió débilmente (Tabla 4). Además, se sintetizaron cuatro péptidos análogos de Sur5-13, Sur13-22, Sur18-27 y Sur53-61, en donde el residuo de anclaje mejor lisina (K) reemplazó a la fenilalanina natural (F) en el extremo C. Sur5K9 (TLPPAWQPK) (SEQ ID NO: 54) y Sur18K10 (RISTFKNWPK) (SEQ ID NO: 58) se unieron a HLA-A3 con alta afinidad, mientras que las sustituciones no tuvieron un efecto detectable sobre la unión a HLA-A3 de Sur13K9 (FLKDHRISTK) (SEQ ID NO: 57) y Sur53K9 (DLAQCFFCK) (SEQ ID NO: 55), comparados con los análogos nativos.

Respuestas de CTL restringidos a HLA-A3 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Se analizaron nueve muestras de pacientes de melanoma (cinco de PBL y cuatro de TIL) para determinar la reactividad inmune contra los dos péptidos nativos de unión a HLA-A3 de alta afinidad Sur112-120 y Sur112-121, así como contra los dos péptidos nativos de unión débil Sur53-62 y Sur95-103. Sin embargo, no se pudieron detectar respuestas inmunes contra estos péptidos mediante ELISPOT en ninguno de los pacientes. Posteriormente, los mismos pacientes se analizaron para determinar la reactividad inmune espontánea contra los tres péptidos modificados derivados de survivina, de alta afinidad, Sur5K9, Sur18K10 y Sur54L2. Se detectó reactividad de CTL contra Sur18K10 en muestras de TIL de tres pacientes, Mel.A3-1, Mel.A3-2, Mel.A3-3 (Figura 13). No se detectaron respuestas contra los otros dos péptidos, Sur5K9 y Sur54L2. Con el fin de verificar adicionalmente estas respuestas, se analizaron PBL de dieciocho pacientes adicionales de melanoma para determinar la reactividad de CTL contra Sur18K10. Entre éstos, se encontraron tres pacientes que respondieron, Mel.A3-4, Mel.A3-5 y Mel.A3-6, produciendo un total de seis pacientes que respondieron, entre los veintisiete pacientes analizados (Figura 13).

Identificación de un epítopo nuevo de survivina restringido a HLA-A2

Unión de péptidos 11-meros derivados de survivina a HLA-A2

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la proteína survivina para detectar los epítopos peptídicos 11-meros de HLA-A2 más probables, utilizando los principales residuos de anclaje específicos de HLA-A2. Se sintetizaron seis péptidos deducidos de survivina, y se examinó su unión a HLA-A2. Ninguno de los péptidos examinados se unió con alta afinidad similar a la de un epítopo del control positivo conocido del péptido BMLF280-288 del virus Epstein-Barr (GLCTLVAML) (SEQ ID NO: 72) (Tabla 4). La concentración de péptido requerida para la recuperación semi-máxima de HLA-A2 (valor C50) fue de 0,9 μM para el control positivo. En comparación, los péptidos Sur18-28 (RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO: 67) y Sur86-96 (FLSVKKQFEEL) (SEQ ID NO: 69), se unieron débilmente a HLA-A2 (C50 = 69 μM y 72 μM, respectivamente). Sin embargo, los dos epítopos de survivina restringidos a HLA-A2 conocidos se unieron de manera similar débilmente a HLA-A2; Sur95-104 (ELTLGEFLKL) (SEQ ID N0: 43) se unió con una afinidad intermedia (C50 = 10 μM), mientras que Sur96-104 (LTLGEFLKL) (SEQ ID NO: 10) se unió sólo débilmente (C50 >100 μM). Los cuatro péptidos 11-meros restantes examinados (Sur4-14 (PTLPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 66), Sur54-64 (LAQCFFCFKEL) (SEQ ID NO: 68), Sur88-98 (SVKKQFEELTL) (SEQ ID NO: 70), y Sur103-113 (KLDRERAKNKI) (SEQ ID NO: 74)), no se unieron a HLA-A2.

Respuestas de CTL restringidos a HLA-A2 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Los PBL de diez pacientes de cáncer (dos pacientes de melanoma (Mel), seis de LLC (LLC), y dos de carcinoma de mama (CM)), se analizaron inicialmente para investigar si los dos péptidos 11-meros de unión débil, Sur18-28 y Sur86-96, eran presentados por HLA-A2 y reconocidos por el sistema inmune de los pacientes con cáncer. Se encontraron respuestas de CTL contra Sur18-28 en PBL de dos de los diez pacientes analizados (LLC-1, LLC-2, figura 14), mientras que no se pudieron detectar respuestas contra Sur86-96 (datos no mostrados). Con el fin de verificar adicionalmente estas respuestas específicas de Sur18-28, se analizaron PBL de doce pacientes adicionales (siete pacientes de melanoma, uno de LLC y cuatro de carcinoma de mama) para determinar la reactividad de CTL contra este péptido. Entre éstos, cuatro pacientes (LLC-3, CM-1, CM-2, Mel.A2-1) tenían una actividad inmune específica de Sur18-28 detectable mediante ELISPOT (Figura 14). Por consiguiente, en conjunto, los PBL de seis de veintidós pacientes analizados, alojaban una respuesta de CTL contra Sur18-28.

Identificación de epítopos de survivina restringidos a HLA-B7.

Unión de péptidos derivados de survivina a HLA-B7

Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la proteína survivina para determinar los péptidos de nueve a diez aminoácidos, con residuos de anclaje según el motivo de unión de péptido a HLA-B7. Se seleccionaron cinco péptidos y se analizó su capacidad para estabilizar HLA-B7 en el ensayo de ensamblaje. Se estimaron los valores C50 para cada péptido como la concentración de péptido necesaria para la estabilización semi-máxima de HLA-B7 (Tabla 4). Dos péptidos derivados de survivina, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 18) y sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19) estabilizaron HLA-B7 débilmente, con valores C50 por encima de 100 μM; mientras que sur46-54 (CPTENEPDL) (SEQ ID NO: 6), sur51-59 (EPDLAQCFF) (SEQ ID N0: 7), y sur34-43 (TPERMAEAGF) (SEQ ID NO: 20), no se unieron a HLA-B7 (Tabla 4).

Respuestas de CTL restringidos a HLA-B7 contra péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer

Se probaron PBL positivos para HLA-B7 de cinco pacientes de melanoma (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), dos pacientes de LLC (LLC1, LLC54) y dos pacientes de cáncer de mama (mama11, mama15), para determinar la reactividad de células T contra los péptidos de unión débil a HLA-B7, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 18) y sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19). Se pudo detectar una fuerte respuesta espontánea de CTL contra el péptido derivado de survivina sur6-14 en PBL de un paciente de LLC y en un paciente de cáncer de mama (Figura 15). Adicionalmente, se pudo detectar una débil respuesta contra este péptido en el paciente de melanoma mel3 (Figura 15).

Resumen de las respuestas inmunes restringidas al alelo de HLA a péptidos derivados de survivina en pacientes de cáncer.

Se probó la unión de una gama de péptidos derivados de survivina que comprendían de 9 a 11 residuos de 5 aminoácidos, a los siguientes alelos de HLA: HLA-A1, HLA-A3, HLA-A11, y HLA-B7, utilizando el ensayo de ensamblaje para la unión del péptido a las moléculas de MHC de clase I descritas en los ejemplos anteriores. Además, se probó la capacidad de varios de los péptidos para provocar una respuesta inmune de CTL utilizando el ensayo ELISPOT, también como se describe en lo anterior.

10 En la siguiente Tabla 4, se da un resumen de los resultados, incluyendo los resultados obtenidos en los ejemplos anteriores:

Tabla 4. Datos de C50 y ELISPOT para péptidos derivados de survivina seleccionados.

Alelo HLA

Longitud del péptido Posición Secuencia C50 (μM) Comentarios SEQ ID NO: Notas

HLA-1

9mero Sur14-22 LKDHRISTF NB 22

Sur51-59

EPDLAQCFF NB 7

Sur38-46

MAEAGFIHC NB 23

Sur93-101

FEELTLGEF >100 24

10mero

Sur34-43 TPERMAEAGF NB 20

Sur47-56

PTENEPDLAQ NB 25

Sur49-58

ENEPDLAQCF NB 26

Sur92-101

QFEELTLGEF 2 27

Péptido control

C1 VSDGGPNLY 0,8 28

Péptidos modificados

Sur14Y9 LKDHRISTY NB 29

sur51Y9

EPDLAQCFY unión débil 9

sur93Y9

FEELTLGEY NB 30

sur92Y9

QFEELTLGEY NB 31

sur34Y9

TPERMAEAGY NB 32

sur49Y9

ENEPDLAQCY NB 33

Sur92T2

QTEELTLGEF 2 34

Sur92S2

QSEELTLGEF 100 35

Sur93T2

FTELTLGEF 1 36

Sur93S2

FSELTLGEF 30 37

Sur38Y9

MAEAGFIHY 0,8 38

Sur47Y10

PTENEPDLAY 0,4 39

HLA-A2

Sur4-14 PTLPPAWQPFL NB 66

Sur18-28

RISTFKNWPFL 69 67

Sur54-64

LAQCFFCFKEL NB 68

Sur86-96

FLSVKKQFEEL 72 69

Sur88-98

SVKKQFEELTL NB 70

Sur103-113

KLDRERAKNKI NB 71

Péptido control

EBV,BMLF1 GLCTLVAML 3 72

VIH, Pol

ILKEPVHGV 0,2 73

HLA-A3

9mero Sur5-13 TLPPAWQPF NB 40

Sur53-61

DLAQCFFCF NB 41

Sur54-62

LAQCFFCFK NB 42

Sur95-103

ELTLGEFLK >100 43

Sur112-120

KIAKETNNK 2 44 i

10mero

Sur13-22 FLKDHRISTF NB 45

Sur18-27

RISTFKNWPF NB 46

Sur53-62

DLAQCFFCFK 100 47 ii

Sur84-93

CAFLSVKKQF NB 48

Sur101-110

FLKLDRERAK NB 49

Sur103-112

KLDRERAKNK NB 50

Sur112-121

KIAKETNNKK 1 51

Sur113-122

IAKETNNKKK NB 52

Péptido control

C3 ILRGSVAHK 0,1-0,3 53

Péptidos modificados

Sur5K9 TLPPAWQPK 2 54

Sur53K9

DLAQCFFCK NB 55

Sur54L2

LLQCFFCFK 1 56

Sur13K9

FLKDHRISTK NB 57

Sur18K10

RISTFKNWPK 0,02 58

Sur113L2

ILKETNNKKK >100 59

SurEx3-A3-1

TIRRKNLRK 0,5 60 iii

SurEx3-A3-2

PTIRRKNLRK NB 61

Sur2b-A3-1

RITREEHKK NB 62

Péptido control

Gripe A, nucleoproteína 265-273 ILRGSVAHK 0,1 74

HLA-A11

9mero Sur5-13 TLPPAWQPF NB 40

Sur53-61

DLAQCFFCF NB 41

Sur54-62

LAQCFFCFK 0,4 42

Sur95-103

ELTLGEFLK NB 43

Sur112-120

KIAKETNNK 1 44

10mero

Sur13-22 FLKDHRISTF NB 45

Sur18-27

RISTFKNWPF NB 46

Sur53-62

DLAQCFFCFK 5 47

Sur84-93

CAFLSVKKQF NB 48

Sur101-110

FLKLDRERAK NB 49

Surl03-112

KLDRERAKNK NB 50

Sur112-121

KIAKETNNKK >100 51 iv

Sur113-122

IAKETNNKKK NB 52

Péptido control

C4 AVFDRKSDAK 0,2 63

HLA-B7

9mero Sur6-14 LPPAWQPFL >100 18 v

Sur11-19

QPFLKDHRI >100 19

Sur46-54

CPTENEPDL NB 6

Sur51-59

EPDLAQCFF NB 7

10mero

Sur34-43 TPERMAEAGF NB 20

Péptidos control

C6 QPRAPIRPI 0,1 64

C7

RPPIFIRRL 0,5 65

5

10

15

20

25

30

35

40

45

50

Se observó una respuesta contra el péptido Sur112-120 en un paciente de linfoma (HEM34) por medio de ELISPOT. ii Se detectaron respuestas contra el péptido Sur53-62 en tres pacientes de linfoma (HEM9, 11, 34) por medio de ELISPOT. iv Se observó una respuesta débil en un paciente de melanoma (FM-TIL95) por medio de ELISPOT. vii Se observó una respuesta contra Sur112-121 en un paciente de melanoma (PM6), más evidente en suspensión de ganglio linfático metastásico, y más débil en los TIL del tumor primario y los PBL por medio de ELISPOT. viii Se observó una respuesta contra el péptido Sur6-14 en un paciente de LLC (LLC9) y se observó una respuesta más débil en un paciente de linfoma por medio de ELISPOT (HEM21) (datos no mostrados).

Ejemplo 5

Procedimientos de ensayo terapéutico utilizando péptidos derivados de survivina como inmunógenos.

Resumen

Se vacunaron cinco pacientes de melanoma en fase IV que habían sido previamente muy tratados, con el epítopo de survivina restringido a HLA-A2 modificado, es decir, el péptido Sur1M2, presentado por células dendríticas autólogas en un marco de uso compasivo. Cuatro de los pacientes produjeron una respuesta fuerte de células T a este epítopo, medido mediante el ensayo ELISPOT. Además, la tinción in situ con multímero péptido/HLA-A2 reveló la infiltración de células que reaccionaban con survivina tanto en las metástasis viscerales como en las de tejido blando. Notoriamente, no se observó toxicidad asociada con la vacunación. Los datos demuestran que es factible inducir una respuesta de células T contra survivina incluso en pacientes de melanoma en fase tardía, y que estas vacunaciones se toleran bien.

Materiales y Métodos

Criterios de elegibilidad de pacientes y pauta de tratamiento

Todos los procedimientos clínicos estuvieron de acuerdo con la Declaración de Helsinki y todos los pacientes proporcionaron el consentimiento informado antes de la terapia. Los pacientes de melanoma cutáneo o uveal en fase IV fueron elegibles cuando su enfermedad era progresiva a pesar de al menos dos ciclos de quimio-, inmuno-, o quimioinmuno-terapia diferentes. Además, los pacientes debían tener 18 años de edad o más, expresar HLAA*0201 y padecer una enfermedad medible validada mediante exploraciones de tomografía computarizada craneal, torácica y abdominal. El índice de Karnofsky de los pacientes tenía que ser del 60% o mejor. No se permitió quimio- y/o inmunoterapia sistémica en las 4 semanas antes de la vacunación. Los criterios de exclusión importantes fueron la evidencia de metástasis al SNC, enfermedades autoinmunes o infecciosas activas, embarazo y lactancia, así como anormalidad psiquiátrica significativa. Se generaron células dendríticas pulsadas con péptidos como se ha descrito anteriormente (82). Brevemente, se aislaron PBMC por leucaféresis con Lymphoprep™ (Mycomed Pharma), se congelaron en alícuotas y se almacenaron en nitrógeno líquido. Una semana antes de la vacunación, las PBMC se descongelaron, se lavaron y se cultivaron en un medio que contenía gentamicina, glutamina y plasma autólogo inactivado por calor. Los días 1 y 5, se añadieron IL-4 y GM-CSF. Con el fin de diferenciar CD maduras, se añadieron TNF-γ y prostaglandina E2 el día 6. El día 7, las células que exhibían características fenotípicas y morfológicas de CD maduras, es decir, apariencia en velo y expresión de CD83 = 75%, se pulsaron con un epítopo modificado derivado de survivina restringido a HLA-A2 de survivina96-104, LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 10) (Clinalfa, Suiza) 14. Las células solamente se utilizaron para la vacunación si las pruebas microbiológicas de las muestras tomadas de los cultivos los días 1 y 5 demostraron que eran estériles.

Los pacientes se vacunaron a intervalos de 7 días para las dos primeras vacunaciones, seguidos por intervalos de 28 días para las vacunaciones adicionales. Se resuspendieron un total de 10-20x106 CD maduras, pulsadas con survivina96-104 en PBS, que contenía seroalbúmina humana al 1% y se inyectaron por vía intradérmica en alícuotas de 1,5x106 CD por sitio de inyección en las regiones ventromediales de los muslos cerca de los ganglios linfáticos regionales. Se excluyeron los miembros donde se hubieran eliminado y/o irradiado los ganglios linfáticos de drenaje. Se repitió la leucaféresis después de 5 vacunaciones en ausencia de un deterioro grave del estado de salud del paciente o de la aparición de metástasis en el SNC.

Medida de las respuestas clínicas e inmunológicas

Se llevaron a cabo exploraciones por TAC antes de la vacunación y cada tres meses posteriormente o en el caso de signos clínicos graves de evolución de la enfermedad. Las respuestas inmunológicas se siguieron mediante el ensayo ELISPOT, utilizando las PBMC obtenidas cada tres meses, para detectar la liberación de IFN-γ específico de survivina96-104. Con el fin de aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, las PBMC se estimularon una vez in vitro a una concentración de 1x106 células por ml en placas de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca) en medio x-vivo (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland), suplementado con suero humano inactivado por calor al 5% y L-glutamina 2 mM en presencia de péptido 10 μM. Dos días después, se añadió interleuquina-2 recombinante (IL-2) 40 UI/ml (Chiron, Ratingen, Alemania). Después de 10 días se probó la reactividad de las células. Para este fin, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Glostrup, Dinamarca) con un anticuerpo anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Suecia). Se añadieron linfocitos a 104-105 células en 200 μl de medio x-vivo por pocillo junto con 104 células T2 y los péptidos relevantes a una concentración final de 2 μM. Después de una incubación durante la noche a 37°C y de dos lavados, se añadió el anticuerpo de detección biotinilado (7-B6-1-Biotina, Mabtech, Suecia); su unión específica se visualizó utilizando fosfatasa alcalina-avidina junto con el sustrato respectivo (GibcoBRL). La reacción se terminó tras la aparición de manchas púrpura oscuro, que se cuantificaron utilizando el Sistema AlphaImager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE UU).

También se siguieron in situ los linfocitos T CD8+ que reaccionan con survivina96-104/HLA-A*0201, tanto en los sitios de vacunación como en las metástasis viscerales, de tejido blando o cutáneas, por medio de complejos multiméricos survivina96-104/HLA-A*0201. Los sitios de vacunación se cortaron 24 horas después de la inyección intradérmica en todos los pacientes, mientras que las lesiones metastásicas solamente se retiraron en pacientes seleccionados, si eran fácilmente accesibles (pacientes KN y GB) o se retiraron durante un intento curativo (paciente WW). El procedimiento de tinción para los complejos multiméricos péptido/MHC se ha descrito recientemente (68). Los complejos multiméricos survivina96-104/HLA-A*0201 se generaron mediante la introducción de un sitio de reconocimiento para la biotinilación enzimática en el extremo 5’ de los dominios extracelulares de HLA-A*0201 (residuos 1-275). La proteína recombinante se purificó mediante cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G25, Pharmacia, Erlangen, Alemania) y de intercambio iónico (mono-Q, Pharmacia) y se plegó in vitro mediante dilución en presencia de los péptidos respectivos y β2-microglobulina. Después de la filtración en gel en una columna de Sephadex G25, la proteína se multimerizó con estreptavidina-FITC conjugada con moléculas de dextrano (amablemente proporcionadas por L. Winther, DAKO, Copenhague, Dinamarca) para generar complejos multivalentes HLA-dextrano. Las secciones crioconservadas de las muestras respectivas se secaron durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fría durante 5 minutos. Todos los pasos de incubación se llevaron a cabo en la oscuridad a temperatura ambiente como sigue: (i) 45 minutos de un anticuerpo anti-CD8 (1:100, clon HIT8a, Pharmingen, San Diego, CA), (ii) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; código 115-165-100, Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45 minutos, y finalmente (iii) los multímeros durante 75 minutos. Entre cada paso los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0,1%. Finalmente, los portaobjetos se montaron en Vectashield y se observaron con un Microscopio Confocal Leica (TCS 4D, Leica, Mannheim, Alemania).

Resultados

Características de los pacientes, toxicidad y evolución clínica

Se inscribieron cinco pacientes de melanoma en fase IV muy avanzada, dos que padecían melanoma uveal, uno melanoma de tejido blando y los dos restantes melanoma cutáneo. Debido a la manifestación de metástasis cerebrales sintomáticas un paciente se retiró de la terapia después de solo dos vacunaciones. Los otros cuatro pacientes recibieron hasta 15 vacunaciones. Un paciente murió de paro cardíaco en un estado libre de tumor después de la resección quirúrgica de las metástasis restantes. Otro paciente se retiró de la terapia después de 10 vacunaciones debido a la aparición de metástasis viscerales (RW). Un paciente permaneció en el estudio después de 15 vacunaciones. Las características detalladas de los pacientes, la terapia previa, el número de vacunaciones y el estado de supervivencia, se resumen en la Tabla 5.

No se presentaron toxicidades importantes. Por tanto, la hemoglobina, leucocitos y trombocitos, así como lactatodeshidrogenasa, creatinina y colinesterasa, no estuvieron influenciados por la terapia de vacunación (Fig. 16). No se observaron signos de toxicidad sistémica o local en los sitios de inyección. Además, no hubo detección de deterioro en la cicatrización, trastornos hemorrágicos, disfunción cardíaca, vasculitis o enfermedad inflamatoria del intestino. En un paciente (WW), se pudieron estabilizar las metástasis de hígado previamente existentes con la terapia de vacunación, pero aún se presentó una nueva metástasis suprarrenal. Desafortunadamente, este paciente murió debido a paro cardíaco, incluso aunque estaba libre del tumor después de la cirugía curativa. Se detectó una metástasis de cerebro en el paciente PB solo cuatro semanas después de iniciarse la vacunación. Por consiguiente, este paciente se tuvo que excluir de vacunaciones adicionales después de solamente dos inyecciones con CD. Los otros tres pacientes demostraron una evolución lenta de la enfermedad metastásica sin un deterioro sustancial en su estado general de salud. Notoriamente, para el paciente KN se pudo alcanzar una supervivencia global de 13 meses (desde el inicio de la vacunación hasta el fallecimiento) a pesar de una pesada carga metastásica y una rápida evolución de la enfermedad al principio de la vacunación. El paciente GB permaneció en el protocolo 14 meses después de iniciarse la vacunación con CD pulsadas con el péptido de survivina. Sin embargo, se debe observar que ambos pacientes (RW y GB) recibieron un tratamiento localizado adicional para el control del tumor, ya sea radiación de tumores subcutáneos (RW) o quimioterapia local (GB).

Respuestas de células T CD8+ específicas de survivina

Con el fin de seguir la cinética de las respuestas de células T citotóxicas, se probaron PBMC obtenidas antes de y tres meses después de la vacunación para determinar su reactividad al epítopo modificado de survivina96-104 mediante ELISPOT para IFN-γ. Antes del análisis, las PBMC se estimularon una vez in vitro para aumentar la sensibilidad de este ensayo. En los cuatro pacientes ensayados, fue evidente una inducción de células T reactivas con survivina96-104 (Fig. 17). El análisis de la reactividad a otros péptidos de survivina restringidos a HLA-A*0201, es decir, survivina96-104 no modificado y el epítopo adyacente Sur9, demostró una respuesta de células T contra estos péptidos en dos de los pacientes (KN y RW) (datos no mostrados).

Se ha cuestionado repetidamente el valor pronóstico y clínico de las mediciones de las respuestas de células T específicas de tumor en sangre periférica; por lo tanto, también se probó la presencia de linfocitos T CD8+ reactivos con survivina96- 104/HLA-A*0201 entre los linfocitos infiltrantes de tumor in situ, mediante tinción con multímero péptido/MHC. Con el fin de validar el método, primero se analizaron muestras de tejido de reacciones de hipersensibilidad de tipo retardado que se presentaron en el sitio de la vacunación en 24 horas. Este análisis confirmó las observaciones anteriores de que las inyecciones intradérmicas de CD pulsadas con péptido inducen un fuerte infiltrado de células T inflamatorias específicas del péptido. Posteriormente, se aplicó el procedimiento de tinción con multímero péptido/MHC en metástasis de tejido blando y viscerales, que reveló la presencia de células reactivas con survivina96-104/HLA-A*0201 entre el infiltrado de CD8+. Esta observación sugiere que la vacunación no solo induce células T con la especificidad deseada, sino que también las dota con la capacidad necesaria de migración dirigida.

Tabla 5.Resumen de ensayos de vacunación: características de los pacientes

Paciente

Edad/sexo Tiempo desde eltumor primario a fase IV Terapia previa Enfermedadmedible Desenlace clínico No. devacunaciones Supervivenciatras la primera vacunación*

GB

40/mujer 4 años, 8meses LITT, fotemusina/IL2IFNα, treosulfano/ gemcitabina hígado PD (crecimiento lento delesiones hepáticas previas y nuevas, nuevas metástasis a páncreas y pleurales) 15 + 14 meses

KN

53/hombre 11 años IL-2IFNα/histamina,fotemustina,treosulfano/ gemcitabina hígado, riñón, tejidoblando, hueso PD (crecimiento lento delesiones previas, nuevaslesiones en ganglios linfáticos, pleurales ymediastinales) 13 13 meses

WW

73/hombre 14 meses cirugía, vacunación con CD, decarbazina hígado PD (metástasis hepáticaestable, pero suprarrenales nuevas) 12 12 mesesdebido a emboliaposquirúrgica

RW

72/hombre 16 años cirugía, radioterapia, adriblastina/ifosfamida, ixoteno, decarbazina,TNF/melfalán tejidoblando PD (crecimiento demetástasis anteriores ynuevas en tejido blando; detección de metástasis de corazón, pulmón y músculotras 12 vacunaciones) 12 + 12 meses

PB

52/hombre 2 años, 3meses radioterapia pulmón, riñón PD (nuevas metástasis depiel y cerebro) 2 4 meses

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LISTA DE SECUENCIAS

<110> Straten, Eivind Per Thor Andersen, Mads Hald

<120> PÉPTIDOS DERIVADOS DE SURVIVINA Y USO DE LOS MISMOS

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Claims (26)

1. REIVINDICACIONES

   1. Un péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, siendo dicho péptido epítopo un nona-péptido que tiene la secuencia LPPAWQPFL como se muestra en SEQ ID NO: 18 y al menos una de las siguientes características:

   (i)

   es capaz de unirse a la molécula de HLA de clase I a la que está restringido con una afinidad medida por la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C50) que es como máximo de 50 μM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA

   (ii)

   es capaz de inducir células productoras de IFN-γ en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o

   (iii) es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTL que reaccionan con el péptido epítopo.

2. 2.

   Un péptido según la reivindicación 1 que es capaz de inducir células productoras de IFN-γ en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 10 por 104 PBL.

3. 3.

   Un péptido según la reivindicación 1 o 2, que es capaz de inducir células productoras de IFN-γ en una población de PBL de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

4. 4.

   Un péptido según la reivindicación 3, en donde la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

5. 5.

   Una composición farmacéutica que comprende el péptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. 6.

   La composición farmacéutica según la reivindicación 5, que es una vacuna capaz de provocar una respuesta inmune contra una enfermedad cancerosa.

7. 7.

   La composición farmacéutica según la reivindicación 6, que es una vacuna multiepítopo.

8. 8.

   Una composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 5-7, dicha composición comprende una combinación de dos o más péptidos epítopos restringidos a MHC de clase I derivados de survivina, cada uno de los cuales interacciona específicamente con una molécula de HLA diferente.

9. 9.

   La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 5-8, dicha composición comprende una combinación de un péptido restringido a una molécula de HLA-A y un péptido restringido a una molécula de HLA-B.

10. 10.

    La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 5-9, dicha composición comprende un péptido restringido a una molécula de HLA-C.

11. 11.

    La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 5-10, que comprende además un proteína o fragmento peptídico inmunogénica seleccionado de una proteína o fragmento peptídico que no pertenece a o deriva de la familia de proteínas de survivina.

12. 12.

    La composición farmacéutica según la reivindicación 11, en donde la proteína o fragmento peptídico que no pertenece a o deriva de la familia de proteínas de survivina es una proteína,

    o fragmento peptídico de la misma, implicada en regulación de apoptosis celular.

13. 13.

    La composición farmacéutica según la reivindicación 11, en donde la proteína o fragmento peptídico inmunogénico seleccionado de una proteína o fragmento peptídico de la misma que no pertenece a o deriva de la familia de proteína de survivina es Bcl-2 o un fragmento peptídico de la misma.

14. 14.

    La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 5-13 que comprende un adyuvante.

15. 15.

    La composición farmacéutica según la reivindicación 14, en donde dicho adyuvante se selecciona del grupo que consiste en adyuvante completo de Freund, adyuvante incompleto de Freund, organismos de B. pertussis muertos y factor estimulante de colonias de granulocitos-macrófagos.

16. 16.

    La composición farmacéutica según cualquiera de las reivindicaciones 5-15 que comprende un vehículo inmunogénico.

17. 17.

    La composición farmacéutica según la reivindicación 16, en donde dicho vehículo inmunogénico se selecciona del grupo que consiste en hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina bovina, ovoalbúmina e inmunoglobulina de aves.

18. 18.

    Una composición según cualquiera de las reivindicaciones 5-17, en donde la vacuna es capaz de provocar una respuesta inmune contra una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

19. 19.

    Una composición farmacéutica según la reivindicación 18, en donde la enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

20. 20.

    Una composición farmacéutica según las reivindicaciones 18 o 19, en donde la vacuna provoca la producción en el sujeto vacunado de células T efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células cancerosas.

21. 21.

    Uso de un péptido como se ha definido en cualquiera de las reivindicaciones 1-4, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

22. 22.

    Uso de una composición según cualquiera de las reivindicaciones 5-20, para la preparación de un medicamento para el tratamiento del cáncer.

23. 23.

    El uso según cualquiera de las reivindicaciones 21 o 22, en donde la enfermedad que se va a tratar es una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.

24. 24.

    Uso según la reivindicación 23, en donde el cáncer se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata.

25. 25.

    El uso de cualquiera de las reivindicaciones 21-24, que se combina con un tratamiento adicional.

26. 26.

    El uso según la reivindicación 25, en donde el tratamiento adicional es radioterapia o quimioterapia.