ES2339193T3 - Peptidos derivados de survivina y uso de los mismos. - Google Patents
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Abstract
Un péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina, dicho epítopo tiene la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes características: (i)es capaz de unirse a la molécula HLA-A1 de clase I con una afinidad medida mediante la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C50) que es como máximo de 50 μM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA (ii)es capaz de inducir células productoras de IFN-γ en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 104 PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o (iii)es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que reaccionan con el péptido epítopo.
Description
Péptidos derivados de survivina y uso de los
mismos.
La presente invención se refiere a nuevos
péptidos derivados de survivina, y a su uso para propósitos
diagnósticos y terapéuticos, específicamente en cáncer. En
particular, los péptidos nuevos son epítopos de células T
restringidos a HLA-A1 de MHC de clase I que son
capaces de provocar respuestas de células T citotóxicas en pacientes
de cáncer, incluyendo respuestas in situ y ex vivo.
De una manera específica, tales péptidos nuevos derivan de la
proteína inhibidora de apoptosis survivina, un reconocido antígeno
asociado a tumor (TAA).
El proceso mediante el cual el sistema inmune de
mamíferos reconoce y reacciona a los materiales extraños o ajenos
es complejo. Una faceta importante del sistema es la respuesta de
células T. Esta respuesta requiere que las células T reconozcan e
interaccionen con complejos de moléculas de la superficie celular
denominados antígenos leucocitarios humanos (HLA), que constituyen
el complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano, y péptidos.
Los péptidos derivan de moléculas más grandes, que son procesadas
por las células, que también presentan la molécula HLA/MHC. La
interacción de las células T y complejos HLA/péptido está
restringida, requiriendo una célula T que es específica para una
combinación particular de una molécula de HLA y un péptido. Si no
está presente una célula T específica, no hay respuesta de células
T, incluso si está presente su complejo asociado. De una manera
similar, no hay respuesta si el complejo específico está ausente,
pero la célula T está presente.
El mecanismo mediante el cual las células T
reconocen las anormalidades celulares también se ha implicado en
cáncer. Por ejemplo, en WO 92/20356, se da a conocer una familia de
genes que se procesan a péptidos, que a su vez se expresan en las
superficies celulares, y pueden producir lisis de las células
tumorales por CTL específicos. Estos genes se denominan la familia
MAGE, y se dice que codifican para "precursores de antígeno de
rechazo tumoral" o moléculas
"TRAP", y los péptidos derivados de los mismos se denominan "antígenos de rechazo tumoral" o moléculas "TRA".
"TRAP", y los péptidos derivados de los mismos se denominan "antígenos de rechazo tumoral" o moléculas "TRA".
En WO 94/05304, se dan a conocer nonapéptidos
que se unen a la molécula HLA-A1. La referencia da a
conocer que dada la especificidad conocida de péptidos particulares
para moléculas de HLA particulares, se debe esperar que un péptido
particular se una a una molécula de HLA, pero no a otras. Esto es
significativo, porque diferentes individuos poseen diferentes
fenotipos de HLA. Como resultado, aunque la identificación de un
péptido particular como que es un asociado para una molécula de HLA
específica tiene ramificaciones diagnósticas y terapéuticas, éstas
solamente son pertinentes para los individuos con ese fenotipo de
HLA particular.
Se han caracterizado varios péptidos presentados
por las moléculas de MHC, y se ha encontrado que algunos de éstos
pueden llevar modificaciones postraduccionales que posiblemente
tengan un impacto sobre la funcionalidad del complejo
HLA-péptido. De esta manera, un número de estudios
han asociado las alteraciones en el patrón de fosforilación con la
transformación maligna. Además, se ha mostrado que la fosforilación
podría tener un efecto neutro, negativo, o incluso positivo, sobre
la unión del péptido al MHC de clase I, y que se podrían generar
CTL específicos de fosfopéptido, que discriminarían entre las
versiones fosforilada y no fosforilada del péptido, mostrando que
tales CTL lo más probablemente sean parte del repertorio de CTL
restringidos a MHC de clase I. Recientemente, se ha mostrado que
los péptidos fosforilados realmente son procesados de una forma
natural y presentados por las moléculas de MHC de clase I in
vivo. Adicionalmente, se ha establecido la presencia de
péptidos fosforilados en extractos de moléculas de clase I aisladas
de varias células B transformadas por diferentes EBV.
De esta manera, está bien establecido que los
epítopos peptídicos derivados de antígenos asociados a tumor (TAA)
pueden ser reconocidos como antígenos por los linfocitos T
citotóxicos (CTL) en el contexto de las moléculas de MHC (1). Sin
embargo, aunque en general se acepta que la mayoría de, si no todos,
los tumores son antigénicos, solamente unos cuantos son en realidad
inmunogénicos en el sentido de que la evolución del tumor la
controla fácilmente el sistema inmune.
Para superar esta limitación, se han iniciado
varios ensayos inmunoterapéuticos, por ejemplo vacunaciones con
péptidos derivados de TAA. Para melanoma, el tumor para el que se ha
caracterizado el mayor número de TAA definidos por CTL, se han
inducido poderosas respuestas de CTL contra los antígenos mediante
vacunación y algunos pacientes experimentaron una remisión completa
de su enfermedad (2,3). Sin embargo, la mayoría de los epítopos
peptídicos utilizados en estos ensayos de vacunación son específicos
del melanocito, y estos péptidos no se pueden aplicar para tumores
de origen no melanocítico. Además, la expresión de estos TAA es
heterogénea entre tumores de diferentes pacientes, e incluso puede
variar entre las metástasis obtenidas de un paciente. Sin embargo,
durante el último par de años, se han identificado un número de
antígenos peptídicos específicos de tumores, que se expresan en un
número de cánceres diferentes, es decir, HER-2 (4),
Muc-1 (5) y telomerasa (6).
También se ha mostrado que mediante la
manipulación apropiada los antígenos tumorales presentes en los
tumores se pueden exponer al sistema inmune. Estudios han mostrado
que el brazo CTL CD8+ de la respuesta inmune, solo o en combinación
con las células T_{h} CD4+, constituye el brazo efector
anti-tumoral primario de la respuesta inmune
adaptativa. Hasta ahora, el enfoque ha estado principalmente sobre
el brazo CTL de la respuesta inmune. Sin embargo, cada vez está más
claro que la respuesta de células T CD4 desempeña un papel esencial
en el rechazo del tumor, en especial en la fase de inducción o en
la extensión de una respuesta de CTL in vivo. Por
consiguiente, la incorporación de antígenos tumorales restringidos a
la clase II en protocolos de vacunación de tumores eficaces, podría
aumentar la eficacia de las vacunas.
La apoptosis es un programa genético de suicidio
celular, y se ha sugerido que la inhibición de la apoptosis es un
mecanismo importante involucrado en la formación de cáncer mediante
la extensión del lapso de vida de las células, que favorece la
acumulación de mutaciones transformantes (7). La survivina es un
miembro recientemente identificado de la familia de inhibidores de
las proteínas de apoptosis (IAP). En un análisis de expresión
genética global de aproximadamente 4 millones de transcritos, se
identificó la survivina como uno de los genes principales
invariablemente aumentados en muchos tipos de cáncer, pero no en
tejido normal (8). Los tumores malignos sólidos que sobreexpresan
survivina incluyen cáncer de pulmón, colon, mama, páncreas y
próstata, así como tumores malignos hematopoyéticos (9).
Adicionalmente, se han descrito series de melanomas y cánceres de
piel no melanoma como invariablemente positivos para survivina (10,
11). La sobreexpresión de survivina en la mayoría de los cánceres
humanos sugiere un papel general de inhibición de la apoptosis en la
evolución del tumor, una noción sustanciada por la observación de
que en el caso del cáncer colorrectal y de vejiga, así como en
neuroblastoma, la expresión de survivina estaba asociada con un
pronóstico desfavorable. Por el contrario, la survivina es
indetectable en tejidos adultos normales. Estas características
califican a la survivina como un TAA adecuado tanto para fines
diagnósticos como terapéuticos.
Por consiguiente, durante la última década se
han identificado un gran número de TAA que son reconocidos por CTL
de una forma restringida al complejo mayor de histocompatibilidad
(MHC). Debido a que la survivina se sobreexpresa en la mayoría de
los cánceres humanos y la inhibición de su función produce un
aumento de la apoptosis, esta proteína puede servir como una diana
para las respuestas terapéuticas de CTL. La proteína survivina y el
potencial uso diagnóstico y terapéutico de la misma se dan a conocer
en (8) y en US 6245523. La survivina es una proteína citoplásmica
de 16,5 kDa que contiene un único BIR y una región
carboxi-terminal enrollada altamente cargada en
lugar de un dedo RING, que inhibe la apoptosis inducida por la
retirada de factor de crecimiento (IL-3) cuando se
transfiere a precursores de células B. El gen que codifica la
survivina es casi idéntico a la secuencia del receptor de proteasa
de células efectoras-1 (EPR-1), pero
está orientado en la dirección opuesta, sugiriendo de esta manera
la existencia de dos genes separados duplicados en una
configuración cabeza con cabeza. Según esto, la survivina se puede
describir como un producto anti-sentido de
EPR-1. Funcionalmente, la inhibición de la expresión
de survivina mediante
el aumento de su transcrito anti-sentido natural EPR-1, produce apoptosis masiva y crecimiento celular reducido.
el aumento de su transcrito anti-sentido natural EPR-1, produce apoptosis masiva y crecimiento celular reducido.
US 6245523 da a conocer el aislamiento de la
survivina purificada y proporciona moléculas de ácidos nucleicos
que codifican la proteína survivina y anticuerpos y otras moléculas
que se unen a survivina. US 6245523 también da a conocer fragmentos
anti-apoptóticamente activos de la proteína
survivina y variantes de los mismos en donde se ha insertado un
resto de aminoácido N- ó C-terminal a, o dentro de,
la secuencia de survivina divulgada. Se da a conocer
específicamente que tales péptidos deben contener restos funcionales
claves para la apoptosis, es decir, Trp en la posición 67, Pro en
la posición 73 y Cys en la posición 84.
Andersen et al. CANCER RESEARCH, Vol. 61,
no. 3 (2001) 869-872 divulgan péptidos de survivina
específicos de HLA-A2: Sur1-Sur10,
Sur1L2 y Sur1M2. Andersen y col. también divulgan respuestas de CTL
específicas contra dichos péptidos, valores de afinidad para la
unión de dichos péptidos a moléculas de HLA de clase I y sugiere el
uso de los péptidos en vacunación, terapia contra el cáncer y
diagnóstico de cáncer.
Andersen et al. CANCER RESEARCH, Vol. 61,
no. 16 (2001) 5964-68 divulgan péptidos de survivina
que se unen a HLA: Sur1 (LTLGEFLKL), Sur9 (ELTLGEFLKL) y Sur1M2 y
la generación de respuestas de CTL por dichos péptidos. El
documento también divulga complejos MHC de clase I/péptidos que se
multimerizaron, y su uso en la detección de células reactivas a
survivina en tejido tumoral. Andersen y col. sugieren el uso de
tales péptidos de survivina para vacunas anticáncer basadas en
péptidos en combinación con terapia convencional contra el
cáncer.
Schmitz et al. CANCER RESEARCH, Vol. 60,
no. 17 (2000) 4845-49 divulga el péptido de unión a
HLA ELTLGEFLKL. El artículo demuestra la generación de respuestas
de CTL por dicho péptido y sugiere el uso del péptido en vacunas
anticáncer.
Hirohashi et al. CLINICAL CANCER
RESEARCH: AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CANCER
RESEARCH, Vol. 8, no. 6 (2002) 1731-39 divulga un
epítopo CTL restringido a HLA-A24 de
survivina-2B (variante de ayuste encontrada en
tumores). El artículo también divulga otros péptidos de survivina,
por ejemplo, AFLSVKKQF y QFEELTLGEF.
Fortugno et al. JOURNAL OF CELL SCIENCE,
Vol. 115, no. 3 (2002) 575-85 divulga anticuerpos
policlonales contra epítopos de survivina
Ala3-Ile19, Met38-Thr48,
Pro47-Phe58 y Cys57-Trp67.
Ninguno de los documentos de la técnica anterior
divulga el epítopo restringido a MHC de clase I de la presente
invención, que comprende la secuencia FTELTLGEF. Además, la técnica
anterior solo da a conocer la unión de epítopos CTL de survivina al
alelo HLA-A2. Sin embargo, para desarrollar
programas de vacunas eficaces basados en péptidos, también es
necesario ser capaz de tener como objetivo diferentes moléculas HLA,
incluyendo los alelos HLA-A3, HLA-B
y HLA-C. Por último, es deseable una serie de
múltiples péptidos de epítopos de survivina para su uso en tales
vacunas, en donde cada péptido interaccione específicamente con una
molécula de HLA diferente.
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La presente invención se basa en el
descubrimiento de que se pueden derivar péptidos restringidos a MHC
de clase I de la proteína survivina, que son capaces de unirse a
las moléculas de HLA de MHC de clase I y de esta manera provocan
respuestas inmunes de CTL tanto ex vivo como in situ
en los pacientes que padecen un amplio rango de enfermedades
cancerosas. Estos descubrimientos sugieren fuertemente que la
survivina actúa como una molécula TRAP, que es procesada por las
células a péptidos que tienen funcionalidad TRA. Evidentemente,
estos descubrimientos abren el camino para planteamientos
terapéuticos y diagnósticos nuevos que, debido al hecho de que la
survivina parece estar expresada universalmente por las células
tumorales, en general son aplicables en el control de enfermedades
cancerosas.
Según esto, la invención concierne en un primer
aspecto a un péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado
de survivina, dicho epítopo tiene la secuencia FTELTLGEF, como se
especifica mediante SEQ ID NO: 36, y al menos una de las siguientes
características:
(i) es capaz de unirse a la molécula HLA de
clase I a la que está restringido con una afinidad medida por la
cantidad del péptido que es capaz de tener una recuperación
semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor
C_{50}) que es como máximo de 50 \muM, determinada mediante un
ensayo de estabilización de HLA,
(ii) es capaz de inducir células productoras de
IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente
de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL
determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o
(iii) es capaz de detección in situ en un
tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido epítopo.
Preferiblemente, el péptido de la invención
tiene al menos dos, más preferiblemente todas esas tres
características.
En aspectos adicionales, la invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende el péptido
como se ha definido anteriormente y una composición para el
diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un
paciente de cáncer de células T que reaccionan con survivina entre
PBL o en el tejido tumoral, composición que comprende un péptido
como se definió anteriormente.
Un aspecto importante de la invención se refiere
al uso del péptido definido anteriormente para la preparación de un
medicamento para el tratamiento de cáncer. Por último, la invención
proporciona una vacuna multi-epítopo que comprende
un epítopo restringido a MHC de clase I según la invención.
El nuevo péptido restringido a MHC de clase I de
la invención se caracteriza por tener al menos una de varias
características, una de las cuales es la capacidad para unirse a la
molécula de HLA-A1 de clase I a la cual está
restringido con una afinidad, que cuando se mide por la cantidad de
péptido que es capaz de tener una recuperación
semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor
C_{50}) en un ensayo de estabilización de HLA, es como máximo de
50 \muM. Este ensayo de estabilización de HLA se lleva a cabo como
se ha descrito previamente (12, 13), y se basa en la estabilización
de la molécula de HLA después de cargar el péptido en la línea
celular deficiente en transportador de péptidos T2. Posteriormente,
se inmunoprecipitan las cadenas pesadas de HLA estables
correctamente plegadas utilizando anticuerpos dependientes de la
conformación, y se cuantifica la unión del péptido.
Este ensayo proporciona un medio sencillo para
cribar péptidos candidatos por su capacidad para unirse a una
molécula determinada de un alelo de HLA con la afinidad anterior. En
formas de realización preferidas, el péptido de la invención es uno
que tiene un valor C_{50}, que es como máximo de 30 \muM, tal
como un valor C_{50} que es como máximo de 20 \muM.
Como se mencionó anteriormente, el sistema de
HLA representa el sistema mayor de histocompatibilidad (MHC)
humano. En general, los sistemas de MHC controlan ciertas
características: antígenos de trasplante, respuestas inmunes
dependientes del timo, ciertos factores del complemento y
predisposición para ciertas enfermedades. Más específicamente, el
MHC codifica tres tipos diferentes de moléculas, es decir, moléculas
de clase I, II y III, que determinan las características más
generales del MHC. De estas moléculas, las moléculas de clase I se
denominan moléculas HLA-A, HLA-B y
HLA-C que se presentan en la superficie de la
mayoría de las células nucleadas y de los trombocitos.
Los péptidos de la invención derivan de
secuencias conocidas de survivina, por ejemplo, la secuencia
divulgada en US 6245523.
De esta manera, un planteamiento sencillo para
identificar los péptidos de la invención incluye los siguientes
pasos: seleccionar una molécula HLA particular, por ejemplo una que
se da con un alto índice en una población determinada, llevar a
cabo un análisis de alineamiento como se describe anteriormente para
identificar los "motivos de restos de anclaje" en la proteína
survivina, aislar o construir péptidos de un tamaño adecuado que
comprendan uno o más de los restos de anclaje identificados, y
probar los péptidos resultantes para determinar (i) su capacidad
para unirse a la molécula de HLA particular utilizando el ensayo de
estabilización de HLA descrito en la presente, (ii) la capacidad de
los péptidos para inducir células productoras de
IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente
de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBLs
determinado mediante un ensayo ELISPOT como se describe en la
presente, y/o (iii) la capacidad de los péptidos para detectar
in situ en un tejido tumoral los CTL que reaccionan con los
péptidos epítopos que se están probando.
En formas de realización específicas, el péptido
de la invención es un péptido restringido a HLA-A1
que tiene la secuencia FTELTLGEF (SEQ ID NO: 36).
Preferiblemente, el péptido de la invención
comprende como máximo 20 restos de aminoácidos, tal como un máximo
de 10 restos de aminoácidos. En formas de realización específicas,
el péptido es un nonapéptido, un decapéptido o un
undecapéptido.
El péptido de la invención, como se mencionó
anteriormente, deriva de una proteína survivina o de un fragmento
de la misma. La proteína survivina de la que puede derivar el
péptido, es la proteína survivina de cualquier especie animal en la
se expresa la proteína. En formas de realización preferidas, la
proteína de partida survivina es de una especie de mamífero
incluyendo una especie de roedor, conejo, y una especie de primate,
tal como seres humanos. Basándose en la secuencia de la proteína
survivina seleccionada, el péptido de la invención se deriva
mediante cualquier tratamiento químico o enzimático apropiado del
material de partida de survivina que produzca un péptido de un
tamaño adecuado como se indica anteriormente, o se puede sintetizar
mediante cualquier procedimiento convencional de síntesis de
péptidos con los que esté familiarizado el experto en la
materia.
Una característica significativa del péptido de
la invención es su capacidad para reconocer o inducir células T
respondedoras productoras de IFN-\gamma, es decir,
células T citotóxicas (CTL) que reconocen de una manera específica
el péptido particular en una población de PBL o células tumorales de
un paciente de cáncer (células diana). Esta actividad se determina
fácilmente sometiendo los PBL o células tumorales de un paciente a
un ensayo ELISPOT como se describe en la referencia (16) y en los
ejemplos siguientes. Antes del ensayo, puede ser conveniente
estimular la población de PBL o las células tumorales que se vayan a
ensayar poniendo en contacto las células con el péptido que se va a
probar. Preferiblemente, el péptido es capaz de inducir o reconocer
células T productoras de IFN-\gamma a una
frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL como se determina mediante
un ensayo ELISPOT como se utiliza en la presente.
El ensayo ELISPOT representa una herramienta
consistente para seguir las respuestas de células T específicas del
péptido de survivina. Sin embargo, aunque se ha demostrado que la
reactividad de ELISPOT en la mayoría de los casos se correlaciona
con la capacidad de los CLL para lisar células diana, la evidencia
conclusiva para esta noción solamente se puede dar de una manera
directa. Tal evidencia directa se proporciona en la presente, ya
que se demostró (véase el ejemplo 2) que las células que reaccionan
con survivina aisladas por medio de complejos HLA/péptido poseen la
capacidad funcional para lisar células diana. Además, se demostró
que los CTL aislados que reconocen específicamente un péptido de la
invención, eran capaces de lisar las células tumorales con HLA
coincidente de diferente origen, por ejemplo melanomas y cáncer de
mama. Este descubrimiento sugiere fuertemente que las células de
cáncer en general procesan y presentan el mismo péptido de survivina
endógeno. Por consiguiente, una implicación principal de los
descubrimientos de la presente es que los péptidos de la invención
se expresan y forman complejos con las moléculas de HLA en una
variedad de células de cáncer de diferentes orígenes histológicos.
Esto hace que estas células de cáncer sean susceptibles a la
destrucción por los CTL y enfatiza la utilidad potencial de la
inmunización con survivina para controlar el crecimiento de
diferentes neoplasias. La presencia de respuestas espontáneas de CTL
en PBL y células tumorales a epítopos peptídicos derivados de
survivina restringidos a HLA de los pacientes que padecen tres tipos
de cáncer no relacionados, es decir, cáncer de mama, melanoma y
LLC, sustancia además el potencial inmunoterapéutico universal de
este antígeno tumoral.
Según esto, en otra forma de realización
preferida el péptido de la invención es capaz de inducir células
productoras de IFN-\gamma en una población de PBL
de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa
la survivina incluyendo un tumor maligno hematopoyético, incluyendo
leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma,
cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón,
cáncer de colon, cáncer de páncreas, y cáncer de próstata. De una
manera específica, el péptido de la invención es capaz de provocar
una respuesta inmune en forma de células T que tienen un efecto
citotóxico contra las células que expresan survivina de una línea
celular de cáncer, incluyendo una línea celular seleccionada de la
línea celular de cáncer de mama MCF-7 y la línea
celular de melanoma FM3.
Además de su capacidad para provocar respuestas
inmunes en poblaciones de PBL y en líneas celulares de cáncer, se
demostró que los péptidos de la invención también son capaces de
provocar respuestas inmunes citolíticas in situ, es decir,
en tejidos tumorales sólidos. Esto se demostró al suministrar
complejos HLA-péptido, por ejemplo, que se
multimerizan y que están provistos de un marcador detectable, y
utilizando estos complejos para tinciones de inmunohistoquímica
para detectar en un tejido tumoral CTL que son reactivos con el
péptido epítopo de la invención. Según esto, una característica
significativa adicional del péptido de la invención es que es capaz
de detectar in situ en un tejido tumoral los CTL que son
reactivos con el péptido epítopo.
Se contempla que los péptidos de la invención,
además de su capacidad para unirse a moléculas de HLA que produce
la presentación de complejos de HLA y péptidos en las superficies
celulares, complejos que a su vez actúan como epítopos o dianas
para células T citolíticas, pueden provocar otros tipos de
respuestas inmunes, tales como respuestas de células B que den como
resultado la producción de anticuerpos contra los complejos y/o una
reacción de hipersensibilidad de tipo retrasado (DTH). El último
tipo de respuesta inmune se define como un enrojecimiento y
endurecimiento palpable en el sitio de la inyección del péptido de
la invención.
\global\parskip1.000000\baselineskip
Es bien sabido que las diferentes moléculas de
HLA, son de una prevalencia diferente en las poblaciones humanas
principales. Según esto, existe un requerimiento para identificar
los epítopos de péptidos restringidos a varias moléculas de HLA de
clase I para extender la cohorte de pacientes que se puedan tratar
según los métodos de la presente invención. La caracterización de
múltiples epítopos de survivina con diferentes elementos de
restricción de HLA amplía el potencial clínico de este antígeno
diana de dos maneras importantes: (i) aumenta el número de
pacientes elegibles para inmunoterapia basada en los péptidos
derivados de survivina. El antígeno HLA-A2 se
expresa en alrededor del 50% de las poblaciones blanca y asiática,
los antígenos HLA-A1 y HLA-A3 se
expresan ambos en alrededor del 25% de blancos y el 5% de asiáticos,
mientras que el antígeno HLA-A11 se expresa en
alrededor del 15% de blancos y el 30% de asiáticos. Aún cuando estos
números no se puedan sumar debido a la coexpresión, una combinación
de péptidos restringidos por una multiplicidad de éstos ciertamente
abarcaría a la mayoría de los pacientes de cáncer, (ii) el
direccionamiento colectivo de varios elementos de restricción en
cada paciente probablemente reduzca el riesgo del escape inmune por
la pérdida del alelo de HLA. La pérdida de un solo alelo de HLA es
un componente significativo de las alteraciones del MHC descritas
para las células de cáncer, mientras que la pérdida total de la
expresión de la clase I es un suceso más bien infrecuente. Por
consiguiente, con la identificación de los epítopos de survivina
restringidos a diferentes alelos de HLA, ahora es posible atacar
más de una molécula de HLA simultáneamente en pacientes con
solapamiento alélico.
Según esto, basado en la divulgación de la
presente invención, el experto en la materia sería capaz de
desarrollar vacunas multiepítopo muy inmunogénicas.
Preferiblemente, tales vacunas se deben diseñar para facilitar una
administración simultánea de los péptidos derivados de survivina más
adecuados opcionalmente en combinación con otros péptidos y/o
adyuvantes adecuados como se describen posteriormente en la
presente.
Otro aspecto de la invención proporciona así una
vacuna multiepítopo que comprende un péptido de un epítopo
restringido a MHC de clase I derivado de survivina, dicho epítopo
tiene la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ ID NO: 36 y
al menos una de las siguientes características:
- (i)
- es capaz de unirse a la molécula HLA-A1 de clase I a la que está restringido con una afinidad medida mediante la cantidad de péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA,
- (ii)
- es capaz de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PLB de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL determinado mediante ensayo de ELISPOT, y/o
- (iii)
- es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido del epítopo.
En formas de realización preferidas la vacuna
multiepítopo incluye una combinación de epítopos de péptidos
derivados de survivina dependiendo del tipo de tejido del paciente
determinado. La selección de péptidos que potencialmente tienen la
capacidad de unirse a una molécula de HLA particular se puede hacer
mediante alineamiento de secuencias que se sabe que se unen a una
molécula de HLA particular determinada para revelar en las mismas
la predominancia de unos pocos aminoácidos relacionados en
posiciones particulares en los péptidos. A tales restos
predominantes de aminoácidos también se les denomina aquí "restos
de anclaje" o "motivos de restos de anclaje". Siguiendo tal
procedimiento relativamente sencillo basado en datos de secuencias
conocidas que se pueden encontrar en bases de datos accesibles, se
pueden derivar péptidos de la molécula de la proteína survivina que
probablemente se unan a la molécula de HLA particular. Se dan
ejemplos representativos de tales análisis para un intervalo de
moléculas de HLA en la tabla siguiente:
\vskip1.000000\baselineskip
Por consiguiente, como ejemplo, los nonapéptidos
que potencialmente tienen la capacidad para unirse a
HLA-A1 tendrían una de las siguientes secuencias:
Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y,
Xaa-T-E-Xaa-XaaXaa-L-Xaa-Y;
Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y
o
Xaa-S-E-XaaXaa-Xaa-L-Xaa-Y
(Xaa indica cualquier resto de aminoácido). De una manera similar,
se pueden diseñar secuencias que tengan potencialmente la capacidad
para unirse a cualquier otra molécula de HLA.
Además, como se ha descrito anteriormente, ha
habido un enfoque aumentado sobre la provocación de la inmunidad de
células T auxiliares específicas de tumor, es decir, vacunar con
epítopos restringidos a MHC de clase II a pesar del hecho de que
los tumores en general no expresan MHC de clase II. Esto se basa en
el descubrimiento reciente de que la inducción y la eficacia de la
respuesta anti-tumoral inducida por vacunas en
muchos casos requiere la cooperación de células T_{h} CD4
positivas específicas de tumor. Por lo tanto, un factor importante
que impulsa el desarrollo de vacunas que tengan una composición más
compleja es el deseo de atacar múltiples antígenos tumorales, por
ejemplo mediante el diseño de vacunas que comprendan o codifiquen
una colección de epítopos de células CTL y T_{h} cuidadosamente
seleccionados.
Obviamente, las vacunas multiepítopo constituyen
una manera eficiente de provocar la inmunidad contra los epítopos
derivados de varios antígenos diferentes sin la necesidad de
introducir (genes que codifiquen) proteínas potencialmente
peligrosas, tales como oncoproteínas. Tales vacunas también permiten
la inducción selectiva de inmunidad contra los epítopos de células
T subdominantes y crípticos, que pueden ser especialmente
importantes en el caso de los autoantígenos asociados a tumor, para
los que puede existir tolerancia para los epítopos que se presentan
prominentemente en tejidos normales. Además, las células
presentadoras de antígeno pueden fracasar al presentar ciertos
epítopos que se expresan en células tumorales debido a diferencias
funcionales entre los inmunoproteasomas de las células
presentadoras de antígeno y los proteasomas "constitutivos"
presentes en la mayoría de las células tumorales. En el caso de
vacunas basadas en péptidos, tales epítopos se pueden administrar
en una forma "lista para MHC", que permite la presentación a
través de una carga exógena independientemente de la captación y el
procesamiento del antígeno por las células huéspedes presentadoras
de antígeno.
Es evidente que los descubrimientos de la
presente invención proporcionan la base para las aplicaciones
terapéuticas así como diagnósticas de los péptidos derivados de
survivina.
\newpage
De esta manera, un aspecto importante de la
invención proporciona una composición farmacéutica que comprende un
péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina,
dicho epítopo tiene la secuencia FTELTLGEF como se especifica en
SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes características:
- (i)
- es capaz de unirse a la molécula HLA-A1 de clase I a la que está restringido con una afinidad medida mediante la cantidad de péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA,
- (ii)
- es capaz de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL determinado mediante ensayo de ELISPOT, y/o
- (iii)
- es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTL que son reactivos con el péptido de epítopo.
\vskip1.000000\baselineskip
En un aspecto adicional la presente invención
proporciona una composición farmacéutica que comprende uno o más de
los péptidos de la invención solos o en una combinación adecuada con
otras proteínas o fragmentos de péptidos. En particular la
invención proporciona una composición farmacéutica que comprende
además del epítopo que tiene la secuencia FTELTLGEF, una
combinación de dos o más péptidos epítopos restringidos a MHC de
clase I derivados de survivina, que interaccionan cada uno
específicamente con una molécula de HLA diferente y que tiene al
menos una de las siguientes características:
- (i)
- es capaz de unirse a la molécula HLA de clase I a la que está restringido con una afinidad medida mediante la cantidad de péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA,
- (ii)
- es capaz de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL determinado mediante ensayo de ELISPOT, y/o
- (iii)
- es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que son reactivos con el péptido de epítopo.
\vskip1.000000\baselineskip
En formas de realización particulares la
composición farmacéutica es una, en donde cada péptido de epítopo
interacciona específicamente con una molécula HLA-A
de MHC de clase I, una molécula HLA-B de MHC de
clase I o una molécula HLA-C de MHC de clase I.
En formas de realización adicionales dicha
molécula HLA-A de MHC de clase I es una molécula
HLA-Al, HLA-A2,
HLA-A3, HLA-A9,
HLA-A10, HLA-A11,
HLA-Aw19, HLA-A23(9),
HLA-A24(9),
HLA-A25(10),
HLA-A26(10), HLA-A28,
HLA-A29(w19),
HLA-A30(w19),
HLA-A31(w19),
HLA-A32(w19),
HLA-Aw33(w19),
HLA-Aw34(10), HLA-Aw36,
HLA-Aw43, HLA-Aw66(10),
HLA-Aw68(28) o
HLA-A69(28).
En formas de realización aún adicionales, dicha
molécula HLA-B de MHC de clase I incluye cualquiera
de las siguientes: HLA-B5, HLA-B7,
HLA-B8, HLA-B12,
HLA-B13, HLA-B14,
HLA-B15, HLA-B16,
HLA-B17, HLA-B18,
HLA-B21, HLA-Bw22,
HLA-B27, HLA-B35,
HLA-B37, HLA-B38,
HLA-B39, HLA-B40,
HLA-Bw41, HLA-Bw42,
HLA-B44, HLA-B45,
HLA-Bw46 y HLA-Bw47.
En otras formas de realización dicha molécula
HLA-C de MHC de clase I incluye cualquiera de las
siguientes: HLA-Cw1, HLA-Cw2,
HLA-Cw3, HLA-Cw4,
HLA-Cw5, HLA-Cw6,
HLA-Cw7 y HLA-Cw16.
Según algunas formas de realización la
composición farmacéutica comprende un péptido epítopo, que es una
secuencia nativa de survivina de una especie de mamífero.
En formas de realización adicionales la
composición farmacéutica comprende un péptido epítopo seleccionado
del grupo que consiste en SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3,
SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID
NO: 66. En otras formas de realización la composición farmacéutica
comprende un péptido epítopo seleccionado del grupo que consiste en
SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:
36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 58.
En formas de realización preferidas dichos
péptidos epítopos son capaces de inducir células productoras de
IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente
de cáncer a una frecuencia de al menos 10 por 10^{4} PBL. En
formas de realización preferidas adicionales dichos péptidos
epítopos son capaces de inducir células productoras de
IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente
que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa survivina.
Además, puede ser conveniente llevar a cabo
modificaciones postraduccionales de los péptidos de la invención.
Se ha demostrado que la exposición de células de carcinoma de mama
MCF-7 o de carcinoma cervical HeLa a agentes contra
el cáncer, incluyendo adriamicina, taxol o UVB produjo una expresión
de survivina aumentada 4-5 veces. Los cambios en
los niveles de survivina después del tratamiento anticáncer no
implicaban modulación de la expresión del ARNm de survivina y eran
independientes de la transcripción génica de novo. Por el
contrario, la inhibición de la fosforilación de survivina en
Thr^{34} por el inhibidor de quinasa dependiente de ciclina
flavopiridol produjo una pérdida de la expresión de survivina, y la
survivina no fosforilable Thr^{34}\rightarrowAla exhibió una
depuración acelerada comparada con la survivina natural. La ablación
secuencial de la fosforilación de survivina en Thr^{34} potenció
la apoptosis de células tumorales inducida por agentes anticáncer
independientemente de p53 y suprimió el crecimiento tumoral sin
toxicidad en un modelo de xenoinjerto de cáncer de mama in
vivo. Estos datos sugieren que la fosforilación en Thr^{34}
regula de una manera crítica los niveles de survivina en células
tumorales y que la ablación secuencial de la actividad quinasa de
p34^{cdc2} puede eliminar el punto de control de la viabilidad de
la survivina y potenciar la apoptosis en células tumorales. Según
esto, se contempla que los péptidos derivados de survivina de la
invención abarquen péptidos fosforilados. Los antígenos de
fosfopéptido de survivina nativos se pueden identificar mediante el
barrido para determinar la presencia de motivos de unión de péptido
a MHC alrededor del sitio de fosforilación Thr34. Por lo tanto, las
posibles secuencias de fosfopéptidos derivados de survivina incluyen
TPERMAEAGF, un antígeno de péptido supuesto restringido a
HLA-B35 y/o HLA-B7 y/o
HLA-B51. Los fosfopéptidos nativos adicionales
abarcados en la presente incluyen: HLA-A2:
CACTPERMA y CTPERMAEA; HLA-A3:
FLEGCACTP;
HLA-B7/HLA-B35/HLAB51:
WPFLEGCACT (resto de Thr fosforilado está marcado en
negrita).
Formas de realización adicionales de la
invención proporcionan composiciones farmacéuticas que comprenden
además una proteína o fragmento peptídico inmunogénico seleccionado
de una proteína o fragmento peptídico que no pertenece a ni deriva
de de la familia de proteínas de survivina.
En formas de realización específicas tales otras
proteínas o fragmentos peptídicos incluyen pero no se limitan a,
proteínas involucradas en la regulación de la apoptosis celular o
fragmentos peptídicos de las mismas. Los ejemplos adecuados de
tales proteínas se pueden seleccionar de la familia de proteínas
Bcl-2, por ejemplo la proteína
Bcl-2, la proteína Bcl-w, la
proteína Mcl-1, la proteína
Bcl-X_{L}, y fragmentos peptídicos derivados de
cualquiera de las proteínas. Otros inhibidores de apoptosis
conocidos incluyen los miembros de la familia de proteínas
inhibidoras de apoptosis (IAP), tales como X-IAP,
C-IAP1 y C-IAP2 estas proteínas se
expresan todas de una manera relativamente ubicua mientras que el
polipéptido inhibidor de apoptosis ML-IAP tiene una
expresión más bien selectiva, y se detecta predominantemente en
melanomas. Por consiguiente, los fragmentos de
ML-IAP capaces de provocar una respuesta de células
T específica, es decir, una respuesta de células T citotóxicas o
una respuesta de células T auxiliares, opcionalmente se pueden
incluir en la composición de la presente invención. Los fragmentos
peptídicos útiles de ML-IAP incluyen
ML-IAP_{245} (RLQEERTCKV) (SEQ ID NO: 75),
ML-IAP_{280} (QLCPICRAPV) (SEQ ID NO: 76),
ML-IAP_{90} (RLASFYDWPL) (SEQ ID NO: 77),
ML-IAP_{154} (LLRSKGRDFV) (SEQ ID NO: 78),
ML-IAP_{230} (VLEPPGARDV) (SEQ ID NO: 79),
ML-IAP_{98} (PLTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 80),
ML-IAP_{34} (SLGSPVLGL) (SEQ ID NO: 81),
ML-IAP_{54} (QILGQLRPL) (SEQ ID NO: 82),
ML-IAP_{99} (LTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 83),
ML-IAP_{83} (GMGSEELRL) (SEQ ID NO: 84) y
ML-IAP_{200} (ELPTPRREV) (SEQ ID NO: 85).
Adicionalmente, la composición según la presente
invención se puede proporcionar como una vacuna multiepítopo que
comprende epítopo restringido a clase I y/o epítopos restringidos a
clase II, como se definen anteriormente en la presente.
Los ejemplos de vacunas multiepítopos preferidas
actualmente incluyen combinaciones "hechas a medida" de
epítopos peptídicos derivados de survivina que dependen del tipo de
tejido del paciente determinado, por ejemplo, un sujeto portador de
fenotipos HLA-A2, HLA-A3 y
HLA-B35 se podría vacunar con una vacuna que
comprenda sur1M2, sur9, sur18K10, sur46Y9, sur51Y9. Adicionalmente,
la composición farmacéutica de la invención puede comprender de una
manera conveniente al menos una proteína inmunogénica adicional o un
fragmento peptídico de la misma seleccionada de una proteína o
fragmento peptídico que no pertenezca a, ni derive de, la proteína
survivina. En formas de realización específicas, la proteína
inmunogénica o el fragmento peptídico de la misma deriva de la
familia de proteínas Bcl-2 como se ha descrito aquí
anteriormente. Un péptido inmunogénico adicional derivado de
Bcl-2 es un péptido restringido a
HLA-A2, que tiene una secuencia seleccionada de las
siguientes: Bcl_{172}, Bcl_{180}, Bcl_{208,} y
Bcl_{214}.
Como los péptidos de la invención son moléculas
relativamente pequeñas se puede requerir en tales composiciones
combinar los péptidos con diferentes materiales tales como
adyuvantes, para producir vacunas, composiciones inmunogénicas,
etc. Los adyuvantes, ampliamente definidos, son sustancias que
fomentan las respuestas inmunes. Con frecuencia, el adyuvante de
elección es un adyuvante completo o incompleto de Freund, u
organismos muertos de B. pertussis, utilizados por ejemplo
en combinación con un antígeno precipitado en alumbre. Se
proporciona una discusión general de los adyuvantes en Goding,
Monoclonal Antibodies: Principles & Practice (2ª Edición, 1986)
en las páginas 61-63. Sin embargo, Goding observa
que, cuando el antígeno de interés es de bajo peso molecular o es
poco inmunogénico, se recomienda el acoplamiento con un soporte
inmunogénico. Los ejemplos de tales moléculas soporte incluyen
hemocianina de lapa californiana, seroalbúmina bovina, ovoalbúmina e
inmunoglobulina de aves. También se ha sugerido que diferentes
extractos de saponina son útiles como adyuvantes en las
composiciones inmunogénicas. Recientemente, se ha propuesto
utilizar el factor estimulante de colonias de
granulocitos-macrófagos (GM-CSF),
una citoquina bien conocida, como un adyuvante (WO 97/28816).
Según esto, la invención abarca una composición
terapéutica que además comprende cualquier sustancia adyuvante
incluyendo cualquiera de las anteriores o combinaciones de las
mismas. También se contempla que el antígeno, es decir, el péptido
de la invención y el adyuvante se puedan administrar por separado en
cualquier secuencia apro-
piada.
piada.
La elección del antígeno en la composición
farmacéutica de la invención, dependerá de parámetros que puede
determinar el experto en la materia. Como se ha mencionado, cada uno
de los diferentes péptidos de la invención se presenta en las
superficies celulares por una molécula de HLA particular. Como tal,
si un sujeto que se vaya a tratar se tipifica con respecto al
fenotipo de HLA, se selecciona(n) un péptido/péptidos que se
sepa que se une(n) a esa molécula de HLA particular.
De forma alternativa, el antígeno de interés se
selecciona basándose en la prevalencia de los diferentes fenotipos
de HLA en una población determinada. Como ejemplo,
HLA-A2 es el fenotipo más prevalente en la población
blanca y, por consiguiente, una composición que contenga un péptido
derivado de survivina que se une a HLA-A2 será
activo en una gran proporción de esa población. Sin embargo, la
composición de la invención también puede contener una combinación
de dos o más péptidos derivados de survivina, que interacciona cada
uno de una manera específica con una molécula HLA diferente de modo
que se cubra una mayor proporción de la población diana. Por lo
tanto, como ejemplos, la composición farmacéutica puede contener una
combinación de un péptido restringido a una molécula
HLA-A y un péptido restringido a una molécula
HLA-B, por ejemplo incluyendo las moléculas
HLA-A y HLA-B que corresponden a la
prevalencia de los fenotipos de HLA en la población diana, tales
como, por ejemplo, HLA-A2 y
HLA-B35. Además, la composición puede comprender un
péptido restringido a una molécula
HLA-C.
HLA-C.
Se contempla que las composiciones inmunogénicas
útiles de las invenciones además de un péptido derivado de
survivina como se define en la presente pueden comprender una
cantidad inmunológicamente eficaz de la proteína survivina tal como
se define en la presente o un fragmento inmunogénico de la
misma.
La cantidad del péptido inmunogénico de la
invención en la composición farmacéutica puede variar, dependiendo
de la aplicación particular. Sin embargo, una dosis individual del
inmunógeno está preferiblemente en cualquier zona desde
aproximadamente 10 \mug hasta aproximadamente 5000 \mug, más
preferiblemente desde aproximadamente 50 \mug hasta
aproximadamente 2500 \mug tal como de aproximadamente 100 \mug a
aproximadamente 1000 \mug. Los modos de administración incluyen
la administración intradérmica, subcutánea e intravenosa,
implantación en forma de una formulación de liberación con el
tiempo, etc. En la presente se abarcan cualquiera y todas las
formas de administración conocidas en la técnica. También se abarcan
cualquiera y todas las formas farmacéuticas convencionales que se
conozcan en la técnica como apropiadas para formular composiciones
peptídicas inmunogénicas inyectables, tales como formas
liofilizadas y formas en solución, suspensión o emulsión que
contengan, si se requiere, vehículos, diluyentes, conservantes,
adyuvantes, componentes reguladores del pH, etc., convencionales
farmacéuticamente-
aceptables.
aceptables.
El efecto inmunoprotector de la composición de
la invención se puede determinar empleando varios planteamientos.
En los siguientes ejemplos se proporcionan ejemplos de los mismos.
Un ejemplo adicional sobre cómo determinar una respuesta de CTL
provocada por la composición inmunogénica se proporciona en WO
97/28816, supra. También se puede determinar una respuesta
inmune de éxito por la presencia de reacciones de DTH después de la
inmunización y/o la detección de anticuerpos que reconozcan
específicamente el/los péptido(s) de la composición de
vacuna.
En formas de realización preferidas, la
composición farmacéutica de la invención es una composición
inmunogénica o vacuna capaz de provocar una respuesta inmune a una
enfermedad cancerosa. Como se utiliza en la presente, la expresión
"composición inmunogénica o vacuna" se refiere a una
composición que provoca al menos un tipo de respuesta inmune
dirigida contra las células cancerosas. Por consiguiente, tal
respuesta inmune puede ser cualquiera de los tipos mencionados
anteriormente: una respuesta de CTL donde se generan CTL que son
capaces de reconocer el complejo HLA/péptido presentado en las
superficies celulares que produce la lisis celular, es decir, la
vacuna provoca la producción en el sujeto vacunado de células T
efectoras que tienen un efecto citotóxico contra las células
cancerosas; una respuesta de células B que da lugar a la producción
de anticuerpos contra el cáncer; y/o una respuesta inmune de tipo
DHT.
En formas de realización útiles se provoca una
respuesta inmunogénica dirigida contra una enfermedad cancerosa
mediante la administración del péptido de la invención ya sea
mediante la carga de moléculas de MHC de clase I en células
presentadoras de antígeno (CPA) del paciente, mediante el
aislamiento de PBL del paciente e incubación de las células con el
péptido antes de inyectar las células de nuevo al paciente o
mediante el aislamiento de CPA precursoras del paciente y la
diferenciación de las células a CPA profesionales utilizando
citoquinas y antígeno antes de inyectar las células de nuevo al
paciente. Por lo tanto, en una forma de realización de la presente
invención, un método para tratar a pacientes de cáncer es uno en
donde el péptido se administra mediante la presentación del péptido
a células presentadoras de antígeno (CPA) del paciente ex
vivo seguido por inyección de las CPA así tratadas de nuevo al
paciente. Existen al menos dos maneras alternativas de llevar esto
a cabo. Una alternativa es aislar las CPA del paciente de cáncer e
incubar (cargar) las moléculas de MHC de clase I con el péptido. La
carga de las moléculas de MHC de clase I significa incubar las CPA
con el péptido de tal manera que las CPA con las moléculas de MHC
de clase I específicas para el péptido se unirán al péptido y por
consiguiente serán capaces de presentarlo ante las células T.
Posteriormente, las CPA se vuelven a inyectar en el paciente. Otra
manera alternativa se apoya en los descubrimientos recientes hechos
en el campo de la biología celular dendrítica. En este caso, se
aíslan monocitos (que son precursores de células dendríticas) del
paciente y se diferencian in vitro a CPA profesionales (o
células dendríticas) mediante el uso de citoquinas y antígeno. Esto
se describe en los ejemplos 3 y 5, donde se cultivan PBL adherentes
(que son principalmente monocitos) in vitro, junto con
GM-CSF, IL-4, y
TNF-\alpha. Posteriormente, se pulsan las CD
generadas in vitro con el péptido y se inyectan en el
paciente.
Debido al hecho de que parece que la survivina
se expresa en la mayoría de las formas de cáncer, es muy probable
que se puedan proporcionar las vacunas de la invención para
controlar cualquier tipo de enfermedad cancerosa donde se exprese
survivina. Por consiguiente, como ejemplos, la composición de vacuna
de la invención es inmunológicamente activa contra un tumor maligno
hematopoyético, incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia
mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer
de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas, y
cáncer de próstata.
De la descripción anterior, el experto se dará
cuenta fácilmente de que los péptidos de la invención son útiles
como herramientas de diagnóstico de cáncer, en particular porque los
péptidos se derivan de survivina expresada en todos los tipos de
cáncer. Por consiguiente, los péptidos de la invención proporcionan
la base para desarrollar procedimientos diagnósticos y pronóstico
universalmente aplicables con respecto a las enfermedades
cancerosas. De esta manera, en otras formas de realización útiles
la composición de la invención es una composición para el
diagnóstico ex vivo o in situ de la presencia en un
paciente de cáncer, por ejemplo basado en la detección de las
células T que reaccionan con survivina entre los PBL o en el tejido
tumoral.
En un aspecto, la invención proporciona un
complejo de un péptido de la invención y una molécula de HLA de
clase I o un fragmento de tal molécula, que es útil como un reactivo
de diagnóstico, tal como se ha descrito anteriormente. El complejo
se hace por cualquier medio convencional incluyendo los descritos en
los siguientes ejemplos. Tal complejo puede ser monomérico o
multimérico.
La presente invención proporciona el medio para
aliviar o curar una enfermedad cancerosa. Según esto, es un aspecto
adicional de la invención utilizar los péptidos como se han definido
anteriormente en la presente para la preparación de un medicamento
para el tratamiento del cáncer. Un aspecto todavía adicional de la
presente invención se refiere al uso de un péptido como se ha
definido aquí anteriormente la preparación de un medicamento para
el tratamiento del cáncer. Preferiblemente, una enfermedad cancerosa
asociada con la expresión de survivina, incluyendo como ejemplos:
un tumor maligno hematopoyético, incluyendo leucemia linfática
crónica y leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama,
cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de
colon, cáncer de páncreas y cáncer de próstata. El uso comprende
administrar a un paciente que padece la enfermedad, una cantidad
eficaz de la composición farmacéutica según la invención, una
molécula que es capaz de unirse de forma específica a un péptido de
la invención y/o una molécula que es capaz de bloquear la unión de
tal molécula.
En algunos casos, será apropiado combinar el uso
de la invención con un tratamiento convencional contra el cáncer
tal como radioterapia o quimioterapia.
Ahora se describirá la invención con mayor
detalle en los siguientes ejemplos no limitantes y en las figuras,
en las cuales:
La figura 1 ilustra la respuesta de células T
medida en un ELISPOT en el paciente LLC1 a sin péptido, al péptido
Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) y al péptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ
ID NO: 3). Los PBL se estimularon una vez con el péptido antes de
sembrarse a 6x10^{5} células por pocillo en duplicado. Se calculó
el número medio de manchas por péptido utilizando un dispositivo de
barrido CCD y un sistema de ordenador,
La figura 2 ilustra la respuesta de células T
medida en un ELISPOT en el paciente LLC1 a sin péptido, al análogo
de péptido Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO: 4) y al análogo de péptido
Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5). Los PBL se estimularon una vez
con el péptido antes de sembrarse a 10^{4} células por pocillo en
duplicado. Se calculó el número medio de manchas por péptido
utilizando un dispositivo de barrido CCD y un sistema de
orde-
nador,
nador,
La figura 3 muestra las respuestas medidas en un
ELISPOT en los pacientes LLC2 y LLC3 a ningún péptido (barra
negra), al péptido Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) (barra gris), al
péptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) (barra blanca), al análogo
de péptido Sur1L2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO: 4) (barra gris clara) y al
análogo de péptido Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5) (barra gris
oscura). Cada experimento se llevó a cabo con 10^{5} células por
pocillo en duplicado, y se calculó el número medio de manchas,
La figura 4 representa células T que se aislaron
de los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor de los
pacientes Mel1, Mel2 y Mel3, estimulados una vez in vitro y
analizados en un ensayo ELISPOT para determinar la respuesta a sin
péptido (barra negra), los péptidos Sur1 (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10)
(barra gris) y Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) (barra blanca). Cada
experimento se llevó a cabo por duplicado con 10^{5} células por
pocillo. En cada experimento también se incluyeron dos pocillos sin
adición de péptido. Se calculó el número medio de manchas por
péptido para cada paciente,
La figura 5 muestra la actividad funcional de
CTL específicos de survivina. Los CTL se aislaron de un ganglio
linfático infiltrado por melanoma usando bolas magnéticas
recubiertas con survivina. (A) Lisis específica de líneas celulares
de melanoma: FM3 positiva para HLA-A2 (triángulo) y
FM45 negativa para HLA-A2 (cuadrado). (B) Lisis
específica de líneas celulares de cáncer de mama:
MCF-7 positiva para HLA-A2
(triángulo) y BT-20 negativa para
HLA-A2 (cuadrado),
\newpage
La figura 6 muestra la frecuencia de CTL que
reaccionan con survivina en PBL de pacientes de cáncer de mama. La
reactividad se examinó en tres pacientes de cáncer de mama
(superior, media e inferior, respectivamente) mediante ELISPOT.
Para cada paciente los ensayos se llevaron a cabo en ausencia de
péptido, en presencia de péptido sur1, en presencia de péptido sur9
y en presencia del péptido modificado sur1M2. Se utilizaron
1x10^{4} células efectoras por pocillo. La gráfica representa la
cuantificación de células reactivas; las columnas grises
representan el número promedio de células productoras de
IFN-\gamma,
La figura 7 ilustra la unión a
HLA-B35 de péptidos derivados de survivina y el
análisis de la recuperación mediada por péptido de las moléculas de
HLA-B35 por los péptidos derivados de survivina. Se
incubaron lisados de células T2-B35 metabólicamente
marcadas a 4ºC en presencia de péptido 50, 5, 0,5, 0,05, y 0,005 mM.
La recuperación de HLA-B35 se analizó en un ensayo
de ensamblaje y se cuantificó posteriormente a electroforesis IEF
en gel, usando el software de Phosphorimager ImageGauge (FUJI photo
film Co., LTD., Japón). El valor C_{50} es la concentración del
péptido requerida para la unión semi-máxima a
HLA-B35,
La figura 8 muestra respuestas espontáneas de
células T observadas en PBL de pacientes de cáncer. A) El número de
células formadoras de mancha de IFN\gamma medidas en el ensayo
ELISPOT sin péptido (barras blancas), con sur51-59
(barras negras) o sur46-54 (barras grises), entre
PBL estimulados in vitro de los pacientes LLC5 (10^{5}
células/pocillo), HEM12 (10^{5} células/pocillo) y HEM8
(5x10^{4} células/pocillo). B) El número de células formadoras de
mancha entre 1,7x10^{5} PBL de HEM12, cultivadas durante 10 días
con células dendríticas autólogas maduradas por pulsos con
péptidos. Las columnas representan la media de dos medidas,
La figura 9 demuestra las respuestas espontáneas
de células T contra péptidos de survivina nativos y modificados en
pacientes de melanoma. A) El número de células formadoras de manchas
medidas en el ensayo ELISPOT contra sur51-59 y
sur51Y9 del paciente FM25 en PBL (4x10^{3} células/pocillo) y TIL
(7x10^{4} células/pocillo), así como TIL de FM45 (10^{5}
células/pocillo). B) El número de células formadoras de manchas
medidas en el ensayo ELISPOT contra sur46 y sur46Y9 medidas en TIL
de FM74 (5x10^{3} células/pocillo). Las columnas representan la
media de dos medidas con la liberación no específica de IFN\gamma
restada,
La figura 10 ilustra la afinidad de unión de los
péptidos derivados de survivina a HLA-A1. Se
cuantificaron las bandas de cadena pesada de MHC de clase I en un
Phosphorimager. La cantidad de cadena pesada de
HLA-A1 estabilizada está directamente relacionada
con la afinidad de unión del péptido añadido. La recuperación de
HLA-Al mediada por péptido (unidades arbitrarias) se
indujo por 40, 4, 0,4, 0,04 \muM de Sur93-10l
(línea), Sur93T2 (cuadrado), Sur49-58
(círculo) o virus de la gripe A, PB1 591-599
(triángulo),
La figura 11 muestra las respuestas espontáneas
contra los péptidos restringidos a HLA-A1.
Respuestas espontáneas de células T contra péptidos derivados de
survivina medidas mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de
manchas de IFN\gamma específicas del péptido formadas en respuesta
a Sur92-101, Sur38Y9, Sur47Y10 y Sur93T2 entre
5x10^{4} PBL o TIL de pacientes de melanoma estimulados in
vitro. Las respuestas específicas de péptidos mostradas se
observaron entre los análisis de seis muestras de PBL y tres
muestras de TIL de pacientes de melanoma (Mel). Se restan las
manchas de IFN\gamma no específicas. Barras: rango de
duplicados,
La figura 12 muestra las respuestas espontáneas
contra los péptidos restringidos a HLA-A11.
Respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados
de survivina medidas mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de
manchas de IFN\gamma específicas de péptidos formadas en respuesta
a Sur53-62 entre 5x10^{4} PBL o TIL de pacientes
de cáncer estimulados in vitro. Las respuestas específicas de
péptidos mostradas se observaron entre los análisis de cinco
pacientes de melanoma (Mel) (5 PBL, 1 TIL), y dos pacientes de LLC
(LLC) (PBL). Se restan las manchas no específicas de IFN\gamma.
Barras: rango de duplicados,
La figura 13 ilustra las respuestas espontáneas
contra los péptidos restringidos a HLA-A3.
Respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados
de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de
manchas de IFN\gamma específicas de péptidos formadas en respuesta
a Surl8Kl0 entre 5x10^{4} PBLs o TILs de pacientes de melanoma
estimulados in vitro. Las respuestas específicas de péptidos
mostradas se observaron entre los análisis de 23 muestras de PBL y
cuatro muestras de TIL de pacientes de melanoma (Mel). Se sustraen
las manchas no específicas de IFN\gamma. Barras: rango de
duplicados,
La figura 14 ilustra las respuestas espontáneas
contra los péptidos restringidos a HLA-A2.
Respuestas espontáneas de células T contra los péptidos derivados
de survivina medidos mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de
manchas de IFN\gamma específicas de péptidos formados en respuesta
al péptido 11-mero, Surl8-28, entre
5x10^{4} PBL de pacientes de cáncer estimulados in vitro.
Las respuestas específicas de péptidos mostradas se observaron
entre los análisis de 10 muestras de PBL de 2 pacientes de melanoma
(Mel), 6 de LLC (LLC) y 2 de carcinoma de mama (CM). Se restan las
manchas no específicas de IFN\gamma. Barras: rango de
duplicados,
La figura 15 ilustra las respuestas espontáneas
de células T contra los péptidos derivados de survivina medidos
mediante el ensayo ELISPOT. El número medio de manchas de
IFN\gamma específicas de péptidos formadas en respuesta a
sur6-14 (LPPAWQPFL) entre 10^{5} PBL estimulados
in vitro de 5 pacientes de melanoma (mel25, mel26, mel3,
mel6, mel39), dos pacientes de LLC (LLC1, LLC54) y 2 pacientes de
cáncer de mama (mama11, mama15). Se restan las manchas no
específicas de IFN\gamma,
La figura 16 ilustra los valores analíticos de
la detección estable de LDH, colinesterasa, creatinina, hemoglobina,
leucocitos, y trombocitos tras la terapia de vacunación de cuatro
pacientes (\ding{115} RW, \medbullet KN, -- WWE, \blacksquare
GB), y
La figura 17 demuestra el análisis cinético de
la inmunidad a péptidos de survivina evaluado mediante ELISPOT de
IFN\gamma. Se obtuvieron PBMC antes de la primera vacunación con
CD y tres meses después de la misma. Se muestran los números de
células formadoras de manchas de IFN\gamma por encima del
fondo.
En la siguiente tabla, se enumeran las
secuencias de aminoácidos para los péptidos utilizados en la
presente y sus respectivas SEQ ID NOs:
\vskip1.000000\baselineskip
Utilizando epítopos de CTL derivados de
survivina, se ha estudiado la reactividad de células T específicas
contra estos antígenos en sangre periférica de pacientes de leucemia
linfática crónica (LLC) y en los ganglios linfáticos infiltrados
por el tumor de pacientes de melanoma, mediante análisis ELISPOT.
Las respuestas de CTL a los epítopos de péptidos derivados de
survivina se detectaron en tres de seis pacientes de melanoma y en
tres de cuatro pacientes de LLC. No se detectó reactividad de
células T en PBL de 6 controles sanos. Por consiguiente, los
péptidos derivados de survivina pueden servir como dianas
importantes y ampliamente aplicables para las estrategias
inmunoterapéuticas contra el cáncer.
La proteína survivina se barrió para determinar
la presencia de motivos HLA-A*0201
(HLA-A2) de unión a péptido y después de una
identificación de éxito, los péptidos se utilizaron para probar la
reactividad de células T específicas en pacientes de leucemia y
melanoma mediante ensayo ELISPOT. En ambas cohortes de pacientes se
detectaron respuestas de CTL a dos epítopos de péptidos derivados de
survivina, mientras que no se pudo detectar reactividad alguna de
células T en los controles sanos. Estos datos sugieren que la
survivina representa un antígeno tumoral ampliamente expresado
reconocido por las células T autólogas.
Se recogieron muestras de sangre de vena
periférica de 4 pacientes diagnosticados con LLC (designados como
LLC1-4) y muestras de sangre de 6 individuos
normales en tubos heparinizados. Se aislaron los PBL utilizando
separación por Limphoprep y se congelaron en suero fetal de ternera
(SFT) con dimetilsulfóxido al 10%. Además, se obtuvieron linfocitos
T de los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor de 6 pacientes
de melanoma (designados como mel1-6). Los ganglios
linfáticos recién cortados se trocearon en pequeños fragmentos, se
trituraron para liberar las células al cultivo y se crioconservaron.
Los PBL de 4 pacientes de melanoma estuvieron disponibles. Todos
los individuos incluidos eran positivos para HLA-A2
determinado mediante análisis por FACS utilizando el anticuerpo
BB7.2 específico de HLA-A2. El anticuerpo se
purificó a partir del sobrenadante del hibridoma. Las muestras de
los pacientes se obtuvieron del Hospital de la Universidad del
Estado, Herlev, Dinamarca. Se obtuvo el consentimiento informado de
los pacientes antes de cualquiera de estas medidas.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Todos los péptidos se obtuvieron de Research
Genetics (Huntsville, AL, EE. UU.) y se suministraron a una pureza
>90% verificado mediante análisis por HPLC y MS. Los péptidos
utilizados se enumeran en la Tabla 1.
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
Se llevaron a cabo los ensayos de ensamblaje
para la unión de los péptidos sintéticos a las moléculas MHC de
clase I metabólicamente marcadas con
[35S]-metionina, como se describe (12, 13). El
ensayo de ensamblaje se basa en la estabilización de las moléculas
de clase I después de cargar el péptido en la línea celular T2,
deficiente en transportador peptídico. Posteriormente, se
inmunoprecipitan las cadenas pesadas de MHC estables correctamente
plegadas utilizando anticuerpos dependientes de la conformación.
Después de la electroforesis IEF, los geles se expusieron a
pantallas de phosphorimager, y se cuantificó la unión del péptido
utilizando el programa Imagequant PhosphorImager (Molecular
Dynamics, Sunnyvale, CA).
Con el fin de aumentar la sensibilidad del
ensayo ELISPOT, se estimularon los PBL una vez in vitro antes
del análisis (14, 15). Los PBL frescos y los previamente congelados
dieron resultados similares en el ensayo ELISPOT. En el día 0, se
descongelaron los PBL o ganglios linfáticos triturados y se
sembraron en 2 ml/pocillo a una concentración de 2x106 células, en
placas de 24 pocillos (Nunc, Dinamarca), en medio AIM V (Life
Technologies, Roskilde, Dinamarca), suero humano inactivado por
calor al 5% y L-glutamina 2 mM en presencia de
péptido 10 \muM. En cada experimento, se incluyó un pocillo sin
péptido. Dos días después, se añadieron 300 UI/ml de
interleuquina-2 recombinante (IL-2)
(Chiron, Ratingen, Alemania) a los cultivos. Las células cultivadas
se probaron para determinar su reactividad en el ensayo ELISPOT en
el día 12.
El ensayo ELISPOT utilizado para cuantificar las
células efectoras liberadoras de interferón-\gamma
específicas del epítopo del péptido se llevó a cabo como en (16).
Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos de fondo de
nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene,
Dinamarca) con anticuerpo
anti-IFN-\gamma
(1-D1K, Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se
lavaron, se bloquearon con medio AIM V, y se añadieron las células
en duplicados a diferentes concentraciones celulares. Luego se
añadieron los péptidos a cada pocillo y las placas se incubaron
durante la noche. Al día siguiente, se desechó el medio y los
pocillos se lavaron antes de añadir el anticuerpo secundario
biotinilado
(7-B6-1-Biotina
Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas, se lavaron y se
añadió el conjugado avidina-enzima
(AP-Avidina, Calbiochem, Life Technologies) a cada
pocillo. Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante 1
hora y se añadió el sustrato enzimático NBT/BCIP (Gibco, Life
Technologies) a cada pocillo y se incubaron a temperatura ambiente
durante 5-10 minutos. La reacción se terminó
lavando con agua del grifo hasta que surgieron manchas púrpura
oscuro. Las manchas se contaron utilizando un Sistema AlphaImager
(Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE. UU.) y se pudo calcular la
frecuencia de CTL específica del péptido a partir de los números de
células formadoras de manchas. Los ensayos se llevaron a cabo todos
por duplicado para cada antígeno peptídico.
La secuencia de aminoácidos de la proteína
survivina se rastreó para determinar los epítopos de péptidos nona-
y decaméricos de HLA-A2 más probables, utilizando
los principales restos de anclaje específicos de
HLA-A2 (17). Se sintetizaron diez péptidos
derivados de survivina y se examinó su unión a
HLA-A2. Se utilizó un epítopo de
VIH-1 pol476-484 (ILKEPVHGV, SEQ ID
NO: 11) (Tabla 1) como control positivo. La concentración de péptido
requerida para la recuperación semi-máxima de MHC
de clase I (valor C_{50}) fue de 0,7 \muM para el control
positivo. En comparación, el péptido designado Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ
ID NO: 3) se unió con una afinidad de C_{50} = 10 \muM. Los
péptidos designados Sur6 (FLKLDRERA, SEQ ID NO: 1) y Sur8
(TLPPAWQPFL, SEQ ID NO: 2) se unieron respectivamente a
HLA-A2 a una C_{50} = 30 \muM, mientras que Sur1
(LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) y Sur3 (KVRRAIEQL, SEQ ID NO: 13) se
unieron más débilmente (C_{50} >100 \muM). Cinco de los
péptidos examinados (Sur2, Sur4, Sur5, Sur7, y Sur1O) no se unieron
a HLA-A2.
Puesto que Sur1 se une de forma débil a
HLA-A2, se sintetizaron dos péptidos análogos
designados Sur1L2 y Sur1M2, respectivamente, en los que un resto de
anclaje mejor (leucina o metionina) reemplazó a la treonina nativa
en la posición 2. Ambos péptidos se unen a HLA-A2
con alta afinidad casi similar a la del control positivo (C_{50}
= 1 \muM).
Los PBL de cuatro pacientes de LLC positivos
para HLA-A2 se estimularon una vez in vitro
antes de examinarse en el ensayo ELISPOT. Este procedimiento se
seleccionó para aumentar la sensibilidad del ELISPOT. Se incluyeron
los 10 péptidos derivados de survivina anteriores en la primera
línea de los experimentos. Se detectaron respuestas a Sur1 y Sur9 y
en las figuras solamente se dan los datos para estos péptidos. La
figura 1 muestra la reactividad de CTL a Sur1 y Sur9 determinada en
el paciente LLC1. Cada mancha representa una célula productora de
IFN-\gamma que reacciona con el péptido. El
número medio de manchas por péptido se calculó utilizando un
dispositivo de barrido CCD y un sistema de ordenador. Se detectaron
52 manchas específicas del péptido Sur9 (después de la sustracción
de las manchas sin el péptido añadido) por 6x10^{5} en el paciente
LLC1 (Fig. 1). No se detectó respuesta alguna al péptido Sur1 de
unión débil a HLA-A2, sin embargo el paciente
respondió fuertemente al análogo de péptido Sur1M2 de unión fuerte
a HLA-A2 (35 manchas específicas del péptido por
10^{4} células) (Fig. 2). No se detectó respuesta alguna al otro
análogo de péptido Sur1L2 de fuerte unión a HLA-A2
en este paciente (Fig. 2). El paciente LLC2 respondió fuertemente a
Sur9 (128 manchas específicas del péptido por 10^{5} células) y
débilmente a Sur1 (22 manchas específicas del péptido por 10^{5}
células) (Fig. 3). La respuesta al análogo Sur1L2 se incrementó
sólo ligeramente en relación con el epítopo natural, mientras que
el paciente respondió fuertemente de una manera similar al péptido
Sur1M2 que al péptido decamérico Sur9. En el paciente LLC3 se
observó una respuesta débil a Sur9 (Fig. 3). No se observó respuesta
alguna a Sur1 o a los péptidos modificados de Sur1 en el paciente.
No se detectaron respuestas de survivina en el último paciente CLL4
(datos no mostrados). Se analizaron los PBL de seis controles
positivos sanos para HLA-A2 con el fin de
investigar si se podría detectar una respuesta a la survivina en los
individuos sanos. No se observó respuesta alguna en ninguno de los
controles a cualquiera de los péptidos derivados de survivina.
Se examinaron linfocitos T aislados de ganglios
linfáticos infiltrados por tumor de pacientes de melanoma positivos
para HLA-A2. El ganglio linfático recién cortado se
troceó en pequeños fragmentos y se aplastó para liberar las células
al cultivo. Las células se estimularon una vez con el péptido in
vitro antes de examinarse en el ensayo ELISPOT. Se detectaron
células T específicas de survivina en tres de los seis pacientes
analizados. Se detectó una fuerte respuesta a Sur9 en los pacientes
Mel2 y Mel3. También se detectó una respuesta más débil al péptido
Sur1 en estos pacientes (Fig. 4). En Mel1 la respuesta al péptido de
unión débil Sur1 fue más fuerte que la respuesta a Sur9 de unión
más fuerte a HLA-A2 (Fig. 4). No se detectó
respuesta alguna en los ganglios linfáticos infiltrados por tumor
de los últimos tres pacientes de melanoma (Mel4-6).
Se examinaron los PBL de dos de los pacientes que reaccionaron a
survivina, Mel1 y Mel2, y de dos de los pacientes que no
reaccionaron, Mel4 y Mel5. No se pudo detectar respuesta alguna a
Sur9 o Sur1 en los PBL de ninguno de estos pacientes (datos no
mostrados).
Se demostraron respuestas espontáneas de células
T citotóxicas a los epítopos de células T restringidos a MHC de
clase I derivados de survivina in situ así como ex
vivo en pacientes de cáncer de mama, leucemia y melanoma.
Además, las células T que reaccionan con survivina aisladas mediante
bolas magnéticas recubiertas con complejos MHC/péptido eran
citotóxicas a tumores con HLA coincidentes de diferentes tipos de
tejido. Al ser un antígeno tumoral universal, la survivina puede
servir como diana ampliamente aplicable para la inmunoterapia
contra el cáncer.
Se expresó un sitio de reconocimiento para la
biotinilación enzimática utilizando ligasa de proteína biotina
(BirA) en fusión con el extremo 5' de los dominios extracelulares de
HLA A*0201 (restos 1-275) en E. coli BL21
(DE3). La proteína recombinante se purificó mediante cromatografía
por tamaño (Sephadex G25, Pharmacia) y de intercambio iónico
(mono-Q, Pharmacia) a partir de cuerpos de inclusión
solubilizados en urea 8 M. HLA A*0201 se plegó in vitro
mediante dilución en presencia del péptido modificado de survivina
Sur1M2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO: 5) o del péptido MAA
gp100154-163, y posteriormente se biotiniló como se
ha descrito anteriormente (35, 36).
Después de la filtración en gel en una columna
de Sephadex G25 de Pharmacia para eliminar la biotina no unida, la
proteína se multimerizó con moléculas de dextrano conjugadas con
estreptavidina-FITC (amablemente proporcionadas por
L. Winther, DAKO, Dinamarca) con el fin de generar compuestos
multivalentes HLA-dextrano para la
inmunohistoquímica. La construcción HLA A*0201 fue un amable
obsequio del Dr. Mark M. Davis (Departamento de Microbiología e
Inmunología, Universidad de Stanford, Palo Alto, CA). La separación
celular se llevó a cabo como se ha descrito anteriormente (37).
Brevemente, se lavaron 5x10^{6} bolas magnéticas conjugadas con
estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega) dos veces en 200 \mul de
PBS frío, se añadieron 0,5 \mug de monómeros de péptido/A*0201 y
la mezcla se incubó durante 15 minutos a temperatura ambiente.
Después de dos lavados estas bolas se mezclaron con PBL en una
proporción de 1:10 y posteriormente se incubaron durante 1 hora
seguido por una precipitación de las células unidas a las bolas en
un campo magnético. El paso de precipitación se repitió una vez.
Para teñir con los complejos péptido/MHC
multiméricos conjugados con FITC, las secciones de tejido se secaron
durante la noche y posteriormente se fijaron en acetona fría
durante 5 minutos. Todos los pasos de incubación se llevaron a cabo
a temperatura ambiente y en la oscuridad: (i) 45 minutos del
anticuerpo primario (diluido 1:100), (ii) anticuerpo de cabra
anti-ratón conjugado con Cy 3 (diluido 1:500; código
115-165-100, Jackson
ImmunoResearch, obtenido de Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45
minutos, y finalmente (iii) los multímeros durante 75 minutos.
Entre cada paso los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10
minutos en PBS/BSA al 0,1%. Los portaobjetos se montaron en
Vectashield y se mantuvieron en la nevera hasta que se observaron
con el microscopio confocal.
Se llevaron a cabo ensayos convencionales de
liberación de [51Cr] para determinar la citotoxicidad mediada por
CTL como se describe en (13). Las células diana eran líneas de
células B autólogas transformadas por EBV, la línea celular de
cáncer de mama MCF-7 positiva para
HLA-A2 (disponible en ATCC), la línea celular de
melanoma FM3 positiva para HLA-A2 (38), la línea
celular de cáncer de mama BT-20 negativa para
HLA-A2 (disponible en ATCC) y la línea celular de
melanoma FM45 negativa para HLA-A2 (38). Todas las
líneas celulares de cáncer expresaban survivina examinadas por
RT-PCR (datos no mostrados).
Se utilizó el ensayo ELISPOT para cuantificar
las células efectoras liberadoras de IFN-\gamma
específicas del epítopo del péptido y se ha descrito anteriormente
(39). Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de
nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45, Millipore) con anticuerpo
anti-IFN-\gamma
(1-D1K, Mabtech, Suecia) y se bloqueó la unión no
específica utilizando AIM V (GibcoBRL, Life Technologies, Inc.,
Gaithersburg, MD, EE. UU.). Se añadieron linfocitos a diferentes
concentraciones celulares junto con los péptidos específicos y
células T2 y se incubaron durante la noche a 37ºC. Tras dos lavados,
se añadió el anticuerpo de detección biotinilado
(7-B6-1-Biotina
Mabtech). La unión específica se visualizó utilizando fosfatasa
alcalina-avidina junto con el sustrato respectivo
(GibcoBRL). La reacción se terminó tras la aparición de manchas
púrpura oscuro, que se cuantificaron utilizando el Sistema
AlphaImager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE. UU.). Los péptidos
utilizados para el ELISPOT fueron Sur1, Sur9 y el péptido análogo
de Sur1 Sur1M2, como se describe en el Ejemplo 1.
En el Ejemplo 1 se identificaron dos epítopos
peptídicos derivados de survivina reconocidos por las células T en
leucemia y melanoma, es decir, Sur1. La afinidad débil de unión de
Sur1 a HLA-A2 mejoró sustancialmente mediante el
reemplazo de la treonina en la posición 2 con un resto de anclaje
mejor (metionina; Sur1M2). Esta medida permitió la construcción de
complejos HLA-A2/péptido estables. Estos complejos
se multimerizaron utilizando moléculas de dextrano, que se
conjugaron con estreptavidina y FITC. Se utilizaron complejos de MHC
multimerizados para teñir el material congelado fijado con acetona.
Utilizando un microscopio láser confocal se pudieron detectar
fácilmente los CTL que reaccionan con
Sur1M2/HLA-A*0201 in situ en el microentorno
tumoral. Se representan estas células en el tumor primario y en el
ganglio linfático centinela de un paciente de melanoma en etapa III
así como en una lesión de cáncer de mama primario. Con el fin de
asegurar la especificidad de la tinción, se llevaron a cabo una
serie de controles negativos. Ni el uso de los multímeros
péptido/HLA-dextrano con péptidos derivados del
antígeno de diferenciación de melanoma gp100 en el mismo tumor, ni
los multímeros Sur1M2/HLA-dextrano en el caso de
una muestra tumoral obtenida de un donante negativo para
HLA-A2, produjeron una tinción positiva.
Con el fin de caracterizar la capacidad
funcional de los CTL que reaccionan con survivina, estas células se
aislaron por medio de bolas magnéticas recubiertas con complejos
HLA-A2/Sur1M2 (36). Un ganglio linfático infiltrado
por melanoma recién cortado se troceó en pequeños fragmentos y se
aplastó para liberar las células al cultivo. Las células se
estimularon una vez con el péptido in vitro antes del
aislamiento. Un día después del aislamiento se añadió
IL-2 y en el día 5 se probó la capacidad de estas
células para aniquilar células tumorales, ya sea mediante ELISPOT o
en un ensayo estándar de liberación de 51Cr. Primero, por medio del
análisis ELISPOT fue posible establecer que los CTL aislados
utilizando el complejo modificado Sur1M2/HLA-A2
también respondían al péptido Sur1 nativo (datos no mostrados).
Segundo, se probó la citotoxicidad de los CTL que reaccionan con
survivina contra la línea celular de melanoma FM3 positiva para
HLA-A2 (Fig. 5A) y la línea celular de cáncer de
mama MCF-7 positiva para HLA-A2
(Fig. 5B). Las células T aisladas lisaron de una manera eficaz
ambas líneas celulares de HLA-A*0201. En contraste,
no se observó citotoxicidad alguna contra la línea celular de
melanoma FM45 negativa para HLA-A2 (Fig. 5A) o la
línea celular de cáncer de mama BT-20 negativa para
HLA-A2 (Fig. 5B).
Se examinó la presencia de células T que
reaccionan con survivina en PBL de 10 pacientes de cáncer de mama
positivos para HLA-A2 mediante el ELISPOT. Antes del
análisis, los PBL se estimularon una vez in vitro para
aumentar la sensibilidad del ensayo. Se examinó la reactividad a los
siguientes péptidos de survivina: Sur1, Sur9 y Sur1M2. Se
detectaron células T específicas de survivina en seis de los diez
pacientes de cáncer de mama positivos para HLA-A2.
Se dan ejemplos representativos en la Figura 6. En los PBL de dos
pacientes se detectó una respuesta contra Sur1 y el análogo
modificado Sur1M2, pero no contra Sur9 (Fig. 6, parte superior,
media), en tres pacientes se detectó una respuesta a Sur9, pero no a
Sur1 o Sur1M2 (Fig. 6, parte inferior) y un paciente respondió
solamente a Sur1M2. En contraste, no se detectaron respuestas a
survivina en los PBL de 20 donantes sanos positivos para
HLA-A2. De una manera similar, se examinaron los PBL
de 14 pacientes de melanoma positivos para HLA-A2.
Hubo respuestas a survivina presentes en siete de estos pacientes
(Tabla 2). Dos pacientes respondieron al péptido Sur9, tres al
péptido Sur1M2, uno tanto a Sur1 como a SurM2 y uno a los tres
péptidos. En el ejemplo 1, se probó la respuesta de células T a
survivina en tres pacientes de leucemia linfática crónica (LLC)
(Tabla 2; LLC1, LLC2, LLC3). Estos estudios se extendieron
utilizando PBL de tres pacientes adicionales de LLC. Notablemente,
todos los pacientes produjeron una respuesta de células T a al
menos un epítopo de survivina (Tabla 2; LLC5, LLC6, LLC7). Además,
se examinaron los PBL de un paciente que padecía leucemia mieloide
crónica (LMC). En este paciente, se identificó una respuesta a los
tres péptidos (datos no mostrados). Los datos se resumen en la
Tabla 2.
En este estudio, se identificaron y
caracterizaron dos epítopos derivados de survivina, que están
restringidos a HLA-B35. La reactividad de células T
específica contra ambos epítopos estaba presente en la sangre
periférica de los pacientes con diferentes tumores malignos
hematopoyéticos y melanoma. Las sustituciones del resto de anclaje
C-terminal mejoró el reconocimiento por parte de los
linfocitos infiltrantes en el tumor de los pacientes de melanoma.
Además, se demostraron respuestas espontáneas de células T
citotóxicas a survivina in situ en una lesión de melanoma
primario. Estos epítopos extienden la aplicabilidad de futuras
estrategias de vacuna basada en los péptidos de survivina en
relación con los tumores malignos así como el perfil de HLA de los
pacientes involucrados.
En los ejemplos 1 y 2, se estudiaron los
epítopos de células T derivados de survivina restringidos a
HLA-A2. Debido a que HLA-A2
solamente se expresa en aproximadamente el 30% de la población
blanca (63), se necesita identificar los epítopos de péptidos
restringidos a otras moléculas de HLA de clase I para extender la
fracción de pacientes que se podrían tratar. En este estudio, se
identificaron dos epítopos nuevos de células T de survivina
restringidos a HLA-B35, que se expresan en el 9% de
la población blanca (63), y se detectaron respuestas inmunes
espontáneas a estos péptidos de survivina en pacientes con
diferentes tumores malignos hematopoyéticos y melanoma.
Se recogieron muestras de sangre de vena
periférica de los pacientes de cáncer, se aislaron los PBL
utilizando separación por Lymphoprep, se tipificó el HLA
(Departamento de Inmunología Clínica, Hospital de la Universidad,
Copenhague) y se congelaron en SFT con DMSO al 10%. Se seleccionaron
10 pacientes positivos para HLA-B35 para un
análisis adicional. Estos pacientes padecían melanoma, LLC, linfoma
folicular (LF), linfomas difusos de células B grandes (DLBCL) y
mieloma múltiple (MM), respectivamente. En el momento en que se
recogieron las muestras de sangre los pacientes no habían sido
tratados médicamente en los cuatro meses anteriores. Adicionalmente,
se recogieron linfocitos infiltrantes de tumor (TIL) aislados de
ganglios linfáticos de tres de los pacientes de melanoma, y se
congelaron en SFT con DMSO al 10%.
Se utilizaron siete péptidos sintéticos
derivados de survivina en este estudio: Sur6-14,
Sur11-19, Sur34-43,
Sur46-54, Sur51-59, Sur46Y9, Sur51Y9
y un péptido derivado de EBV, EBNA3A 457-466 (63).
Todos los péptidos se obtuvieron de Research Genetics (Huntsville,
AL) y se suministraron a una pureza >90%, verificado mediante
análisis de HPLC y MC. Los péptidos se enumeran en la siguiente
tabla 3.
Se utilizó el ensayo de ensamblaje descrito en
los ejemplos 1 y 2 para medir la afinidad de unión de los péptidos
sintéticos a las moléculas HLA-B35 metabólicamente
marcadas con [S35]metionina. Brevemente, el ensayo se basa
en la estabilización mediada por el péptido de las moléculas de HLA
vacías liberadas, después de la lisis celular, de la línea celular
T2 deficiente en TAP, establemente transfectada con
HLA-B35 (amablemente proporcionada por el Dr. J.
Haurum, Symphogen ApS, Lyngby, Dinamarca). Las moléculas de HLA
establemente plegadas se inmunoprecipitaron utilizando el mAb W6/32
dependiente de la conformación. Las moléculas de HLA se separaron
mediante electroforesis IEF, los geles se expusieron a pantallas de
phosphorimager (Imaging plate, FUJI film Co., LTD., Japón), se
analizaron y se cuantificó la cantidad de moléculas de HLA
correctamente plegadas, utilizando el software de phosphorimager
ImageGauge (FUJI photo film Co., LTD., Japón).
Con el fin de aumentar la sensibilidad del
ensayo ELISPOT, los linfocitos se estimularon una vez in
vitro con el péptido antes del análisis (14, 15). Los PBL o TIL
se descongelaron y se estimularon con 50 \muM de los epítopos de
péptidos individuales en placas de 96 pocillos durante 2 horas a
26ºC (5x10^{5}-10^{6} células por péptido) y se
juntaron durante 10 días adicionales de cultivo a 37ºC en
x-vivo con suero humano (SH) al 5%, en
placas de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca), a 2x10^{6}
células por pocillo. Al segundo día de la incubación se añadió
IL-2 40 \mug/ml (Apodan A/S, Dinamarca). En el día
10, las células cultivadas se probaron para determinar su
reactividad en el ensayo
ELISPOT.
ELISPOT.
El ensayo ELISPOT utilizado para cuantificar las
células efectoras liberadoras de IFN-\gamma
específicas del péptido en PBL o TIL recogidos de pacientes de
cáncer se llevó a cabo como se describe en el ejemplo 1.
Brevemente, se recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de
nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45; Millipore, Hedehusene,
Dinamarca) con el mAb contra IFN-\gamma humano,
7,5 \mug/ml (1-D1K; Mabtech, Nacka, Suecia). Los
pocillos se lavaron y se bloquearon con
x-vivo (x-vivo ISTM
BioWhittacker, Molecular Applications Aps, Dinamarca) y las células
se añadieron en duplicados a diferentes concentraciones. Para la
presentación del antígeno, se añadieron 10^{4} células
T2-B35, con y sin el péptido 10 \muM, por pocillo.
Las placas se incubaron durante la noche, las células se desecharon
y los pocillos se lavaron antes de añadir el anticuerpo secundario
biotinilado
(7-B6-1-Biotina;
Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas a temperatura
ambiente, se lavaron y se añadió el conjugado
avidina-fosfatasa alcalina
(AP-Avidina; Calbiochem, Life Technologies, Inc.).
Después de 1 hora de incubación a temperatura ambiente, se añadió el
sustrato enzimático nitroazul de tetrazolio/fosfato de
5-bromo-4-cloro-3-indolilo
(Código No. K0598, DakoCytomation Norden A/S) y surgieron manchas
púrpura oscuro en 3-7 minutos. La reacción se
terminó lavando con agua del grifo. Las manchas se contaron
utilizando el Sistema Alpha Imager (Alpha Innotech, San Leandro, CA)
y se calculó la frecuencia de células T específicas del péptido a
partir del número de células formadoras de manchas.
Todos los ensayos se llevaron a cabo en
duplicado para cada antígeno peptídico y los linfocitos cultivados
en el mismo pocillo se probaron en números celulares iguales con y
sin péptido, para medir el número de células específicas del
péptido en el cultivo.
Se aislaron células adherentes a partir de PBL
después de 2 horas de cultivo. Estas se cultivaron durante 10 días
adicionales en RPMI 1640 (GibcoTM Invitrogen Corporation, RU) con
SFT al 10%. Se añadieron GM-CSF 800 ng/ml
(PreproTech, Londres, RU) e IL-4 40 ng/ml
(PreproTech) cada tres días. En el día 10, las CD se hicieron
madurar durante 24 horas mediante la adición de
TNF-\alpha 50 ng/ml (PreproTech). Después de la
maduración, las CD se liberaron y se pulsaron con el péptido 20
\muM en presencia de \beta2-microglobulina 3
\mug/ml durante 2 horas a
26ºC.
26ºC.
Se aislaron células específicas del antígeno
utilizando bolas magnéticas recubiertas con
sur51Y9/HLA-B35, como se describe en el ejemplo 2.
Los monómeros biotinilados de HLA-B35 con sur51Y9
(obtenidos de ProImmune, Oxford, RU) se acoplaron a bolas
magnéticas recubiertas con estreptavidina (Dynabeads
M-280, Dynal A/S, Oslo, Noruega), mediante
incubación de 2,5 \mug de monómeros con 5x10^{6} bolas en 40
\mul de PBS durante 20 minutos a temperatura ambiente. Los
complejos magnéticos se lavaron tres veces en PBS, utilizando un
dispositivo magnético (Dynal A/S, Oslo, Noruega) y posteriormente
se mezclaron con los PBL en una proporción de 1:10 en PBS con BSA
al 5% y se rotaron muy suavemente durante 1 hora. Las células T
CD8^{+} específicas del antígeno que se asociaron con los
complejos magnéticos, se lavaron suavemente dos o tres veces. Las
células aisladas se resuspendieron varias veces en
x-vivo suplementado con suero humano al 5% y
se incubaron durante 2 horas antes de que se liberaran las bolas
magnéticas y se eliminaran de la suspensión celular. Las células T
CD8^{+} específicas del antígeno aisladas se utilizaron en el
ensayo ELISPOT, para analizar la reactividad cruzada entre el
péptido nativo y modificado.
El mapeo del clonotipo por DGGE de las regiones
1-24 de TCR BV humanas se ha descrito con detalle
(66). Brevemente, se aisló el ARN utilizando el kit de Aislamiento
Purescript (Gentra Systems Inc. MN) y se amplificó el ADNc
transcrito mediante PCR utilizando cebadores para las regiones
variables de las cadenas beta de TCR junto con un cebador común de
la región constante. Se utilizó el programa de ordenador MELT87 para
asegurar que las moléculas de ADN amplificadas fueran adecuadas
para el análisis por DGGE, siempre que se uniera una secuencia rica
en GC de 50 pb (pinza-GC) al extremo 5' del cebador
de la región constante. El análisis por DGGE se hizo en geles de
poliacrilamida al 6% que contenían un gradiente de urea y formamida
del 20% al 80%. La electroforesis se llevó a cabo a 160 V durante
4,5 horas en tampón TAE 1x a una temperatura constante de 54ºC.
Se utilizaron complejos péptido/HLA
multimerizados para identificar las células T específicas del
antígeno in situ en lesiones tumorales de pacientes de
cáncer empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 2. El
monómero sur5lY9/HLA-B35 biotinilado fue
suministrado por Proimmune Limited, Oxford, RU. Los monómeros
biotinilados sur51Y9/HLA-B35 se multimerizaron con
moléculas de dextrano conjugadas con
estreptavidina-FITC (amablemente proporcionadas por
L. Winther, DAKO, Glostrup, Dinamarca), para generar compuestos
multivalentes HLA-dextrano para la
inmunohistoquímica. Las secciones de tejido se secaron durante la
noche y posteriormente se fijaron en acetona fría durante 5
minutos. Todos los pasos de incubación se llevaron a cabo en la
oscuridad a temperatura ambiente: (a) 45 minutos del anticuerpo
primario (diluido 1:100) (b) anticuerpo de cabra
anti-ratón conjugado con Cy 3 (diluido 1:500;
código 115-165-100; Jackson
ImmunoResearch, obtenido en Dianova, Hamburgo, Alemania) durante 45
minutos; y finalmente (c) los multímeros durante 75 minutos. Entre
cada paso, los portaobjetos se lavaron dos veces durante 10 minutos
en PBS/BSA al 0,1%. Los portaobjetos se montaron en Vectashield y
se mantuvieron en la nevera hasta que se observaron con el
microscopio confocal (Leica).
Se rastreó la secuencia de aminoácidos de
survivina para determinar los péptidos nonaméricos y decaméricos
con restos de anclaje, según el motivo de unión a péptido de
HLA-B35 (67). Se seleccionaron cinco péptidos que
contenían prolina como el anclaje N-terminal en la
posición 2, y fenilalanina, leucina, isoleucina o tirosina como
restos de anclaje C-terminales (Tabla 3). El ensayo
de ensamblaje reveló que dos péptidos, sur51-59
(EPDLAQCFF, SEQ ID NO: 7) y sur46-54 (CPTENEPDL,
SEQ ID NO: 6) fueron capaces de estabilizar HLA-B35
de una manera eficaz. Además, dos péptidos,
sur34-43 (TPERMAEAGF, SEQ ID NO: 20) y
sur6-14 (LPPAWQPFL, SEQ ID NO: 18) mostraron una
estabilización débil, mientras que el péptido restante no estabilizó
HLA-B35 en absoluto. La concentración del péptido
requerida para la recuperación semi-máxima de
HLA-B35 (C50) se estimó en 13 \muM para
sur51-59 y en 20 \muM para
sur46-54. En comparación, el epítopo del control
positivo C24 de EBNA3A458-466 (YPLHEQHQM, SEQ ID
NO: 21) tuvo un valor C_{50} estimado de 0,8 \muM.
Con el fin de mejorar la afinidad de unión de
sur46-54 y sur51-59 el aminoácido
C-terminal fue reemplazado con tirosina, un resto
de anclaje mejor (67). Se analizó la recuperación de
HLA-B35 mediada por los péptidos modificados en el
ensayo de ensamblaje, y se estimaron los valores C_{50} en 1,5
\muM para sur51Y9 y en 4 \muM para sur46Y9 (Fig. 7).
Inicialmente, se analizaron cinco pacientes para
determinar las respuestas inmunes espontáneas a los cuatro péptidos
de unión a HLA-B35 nativos,
sur51-59, sur46-54,
sur34-43 y sur6-14. Estos cinco
pacientes tenían diferentes tumores malignos hematopoyéticos: HEM8
y HEM18 padecían MM, HEM12 padecía LF, HEM9 tenía DLBCL y LLC5
tenía LLC.
Se llevaron a cabo los ensayos ELISPOT de
IFN-\gamma sobre los PBL después de 10 días de
estimulación in vitro para detectar los CTL precursores del
péptido. Se detectaron respuestas inmunes espontáneas contra dos de
los péptidos nativos de unión a HLA-B35,
sur51-59 y sur46-54. Dos pacientes,
HEM12 y LLC5 mostraron respuesta tanto a sur51-59
como a sur46-54, mientras que HEM8 solamente mostró
respuesta a sur51-59 (Figura 8A y B). No se pudo
detectar respuesta alguna en los dos pacientes restantes, HEM9 y
HEM18, y no se pudo detectar respuesta alguna a los péptidos de
unión mala sur34-46 y sur6-14 en
ninguno de los pacientes.
Se utilizó un planteamiento alternativo a la
estimulación in vitro en el paciente HEM12, es decir, los
PBL se cocultivaron con células dendríticas autólogas maduras
pulsadas con sur51-59 para estimular una respuesta
de CTL in vitro. Los PBL de este cultivo mostraron una fuerte
reactividad hacia sur51-59 en el ELISPOT (Figura
8B).
Como se ha descrito anteriormente, las
modificaciones de péptidos para mejorar la afinidad a
HLA-B35 produjeron una afinidad
5-10 veces más alta para HLA-B35 en
relación con los péptidos nativos. Se analizó un grupo de cinco
pacientes de melanoma para determinar las respuestas inmunes
espontáneas tanto a los péptidos nativos como modificados, por
medio del ensayo ELISPOT. Las muestras de PBL se analizaron después
de la estimulación in vitro, mientras que las muestras de
TIL se analizaron directamente. Se observaron respuestas inmunes
espontáneas ya sea en los PBL o en los TIL de tres de los cinco
pacientes. FM25 mostró reactividad contra sur51-59
y sur51Y9 tanto en muestras de PBL como de TIL (Fig. 9A). FM45
respondió solamente al péptido modificado sur51Y9, con una fuerte
respuesta detectable en los TIL. No hubo PBL disponibles de este
paciente (Fig. 9A). FM74 mostró una fuerte respuesta a sur46Y9 en
TIL, pero no fue detectable respuesta alguna al péptido nativo
(Fig. 9B). También se observó una respuesta débil a sur46Y9 en los
PBL de FM74 (datos no mostrados).
La alta afinidad de sur51Y9 por
HLA-B35 hace posible la producción de monómeros
estables de HLA-B35 con sur51Y9. Habiéndose
establecido la presencia de los linfocitos T que reaccionan con
survivina en los ganglios linfáticos infiltrados por el tumor y en
PBL de diferentes pacientes de cáncer, se recubrieron bolas
magnéticas con estos complejos HLA-B35/sur51Y9 y se
utilizaron para aislar linfocitos T que reaccionan con el péptido de
survivina a partir de PBL del paciente LLC5. Este paciente mostró
una fuerte respuesta a sur51-59. Las bolas estaban
fuertemente unidas a la superficie celular de las células
específicas, como se visualizó mediante microscopía (datos no
mostrados), permitiendo la precipitación de las células específicas
de antígeno mediante un campo magnético. Las células específicas de
sur51Y9 aisladas respondieron fuertemente a sur51-59
(Figura 9), mientras que no se pudo detectar respuesta alguna en
los PBL restantes (datos no mostrados). El aislamiento se analizó
mediante el mapeo de clonotipo de TCR basado en
RT-PCR/DGGE. Esta técnica permite hacer el análisis
de la clonalidad de células T en poblaciones celulares complejas,
incluso cuando solamente están disponibles pequeños números de
células. Estos análisis mostraron que se aislaron 8 clones distintos
(datos no mostrados).
Los monómeros sur51Y9/HLA-B35 se
multimerizaron utilizando moléculas de dextrano conjugadas con
estreptavidina y FITC. Los complejos de MHC multimerizados se
utilizaron para teñir el material congelado y fijado con acetona,
empleando el procedimiento descrito en el ejemplo 2. Las células
específicas de antígeno se visualizaron utilizando un microscopio
láser confocal. Se analizaron secciones de melanoma primario de tres
pacientes y se pudieron detectar fácilmente los CTL que reaccionan
con sur5lY9/HLA-B35 in situ, en el
microentorno tumoral en uno de los pacientes. La cotinción con un
mAb contra la granzima B mostró que estos CTL específicos de
survivina liberaban granzima B, ejerciendo una actividad
citotóxica, se utilizaron los pacientes de melanoma negativos para
HLA-B35 como controles (datos no mostrados).
Se caracterizaron nuevos epítopos de survivina
restringidos a HLA-A1, HLA-A2,
HLA-A3 y HLA-A11 en base en las
respuestas de CTL en los pacientes de cáncer. Estos epítopos
aumentan de manera significativa el número de pacientes elegibles
para la inmunoterapia basada en los péptidos derivados de survivina.
Además, es probable que el direccionamiento colectivo a varios
elementos de restricción reduzca el riesgo de escape inmune por
pérdida del alelo HLA.
Las muestras de pacientes se recibieron de la
Universidad de Würzburg, Alemania, y del Hospital de la
Universidad en Herlev, Dinamarca. Se obtuvo el consentimiento
informado de los pacientes antes de cualquiera de estas medidas. La
tipificación del tejido se realizó en el Departamento de Inmunología
Clínica, Hospital de la Universidad, Copenhague, Dinamarca. Se
aislaron linfocitos de sangre periférica (PBL) de los pacientes de
cáncer con melanoma, carcinoma de mama y leucemia linfocítica
crónica (LLC), utilizando separación por Lymphoprep y se congelaron
en suero fetal de ternera (SFT) con dimetilsulfóxido al 10%. Además,
se obtuvieron linfocitos T de lesiones primarias y de ganglios
linfáticos infiltrados por tumor de los pacientes de melanoma. El
tejido tumoral recién cortado se troceó en pequeños fragmentos y se
aplastó para liberar los linfocitos infiltrantes del tumor (TIL)
para la crioconservación.
Todos los péptidos se adquirieron de Invitrogen
(Carlsbad, CA, EE. UU.) y se suministraron a una pureza de >80%
verificado mediante análisis por HPLC y MS. Todos los péptidos
utilizados se enumeran en la Tabla 4, en el ejemplo 5 más
adelante.
\newpage
La línea celular humana T2 es un híbrido
deficiente en TAP1 y TAP2 de las células B-LCL.174 y
T-LCL CEM, y por lo tanto, solamente expresa bajos
niveles de moléculas de HLA de clase I (HLA-A*0201 y
HLA-B*5101) en la superficie celular. Las células
T2 transfectadas con HLAA*0301 fueron amablemente proporcionadas por
el Dr. A. McMicheael, IMM, Hospital John Radcliffe, Oxford. Las
células T2 transfectadas con HLA-A*1101 fueron
amablemente proporcionadas por el Dr. M. Masucci, MTC, Instituto
Karolinska, Estocolmo, Suecia. La línea celular BM36.1 también es
deficiente para la función TAP y tiene un fenotipo similar a T2 con
una baja expresión de HLA de clase I (HLA-A*0101,
HLA-B*3501) en la superficie. Las células BM36.1
fueron amablemente proporcionadas por el Dr. A. Ziegler,
Universidad Humboldt, Berlín, Alemania.
La afinidad de unión de los péptidos sintéticos
(Invitrogen, Carlsbad, CA, EE. UU.) a las moléculas
HLA-A1, -A2, -A3 o -A11 metabólicamente marcadas
con [^{35}S]- metionina, se midió en el ensayo de ensamblaje, como
se ha descrito anteriormente (12). El ensayo se basa en la
estabilización mediada por péptido de las moléculas de HLA vacías
liberadas después de la lisis celular, de las líneas celulares
deficientes en TAP. Las moléculas de HLA establemente plegadas se
inmunoprecipitaron utilizando el mAb W6/32 dependiente de la
conformación, específico de HLA de clase I y se separaron mediante
electroforesis en gel con isoelectroenfoque (IEF). Las bandas de
cadena pesada del MHC se cuantificaron utilizando el programa
ImageGauge PhosphorImager (FUJI photo film Co., Carrollton, TX, EE.
UU.). La intensidad de la banda es proporcional a la cantidad de
complejo de MHC de clase I unido al péptido recuperado durante el
ensayo. Posteriormente, el nivel de la estabilización de la
molécula de HLA está directamente relacionado con la afinidad de
unión del péptido añadido. La concentración del péptido utilizada
para analizar la recuperación de las moléculas HLA fue de 40, 4,
0,4, 0,04 \muM para HLA-A1 y
HLA-A11, y de 100, 10, 1, 0,1, 0,01 \muM para
HLA-A2 y HLA-A3. Posteriormente se
calculó el valor C_{50} para cada péptido como la concentración
de péptido suficiente para una estabilización
semi-máxima.
Con el fin de aumentar la sensibilidad del
ensayo ELISPOT, se estimularon los PBL una vez in vitro antes
del análisis. En el día 0, se descongelaron los PBL o ganglios
linfáticos aplastados y se sembraron como 2x10^{6} células en 2
ml/pocillo en placas de 24 pocillos (Nunc, Roskilde, Dinamarca) en
un medio x-vivo (Bio Whittaker,
Walkersville, Maryland), suero humano inactivado por calor al 5%, y
L-glutamina 2 mM en presencia de 10 \muM del
péptido. Dos días después, se añadieron a los cultivos
interleuquina-2 recombinante 20 UI/ml
(IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemania). Se probó la
reactividad de las células cultivadas en el ELISPOT en el día
10.
El ensayo ELISPOT se utilizó para cuantificar
las células efectoras liberadoras de
interferón-\gamma específicas del epítopo
peptídico, como se ha descrito anteriormente (16). Brevemente, se
recubrieron placas de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa
(MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) con
anticuerpo anti-IFN-\gamma
(1-D1K, Mabtech, Nacka, Suecia). Los pocillos se
lavaron, se bloquearon con el medio x-vivo y
las células se añadieron en duplicados a diferentes concentraciones
celulares. Luego se añadieron los péptidos a cada pocillo y las
placas se incubaron durante la noche. Al día siguiente, se eliminó
el medio y los pocillos se lavaron antes de añadir el anticuerpo
secundario biotinilado
(7-B6-1-Biotina,
Mabtech). Las placas se incubaron durante 2 horas, se lavaron y se
añadió a cada pocillo el conjugado avidina-fosfatasa
alcalina (Calbiochem, Life Technologies, Inc. San Diego, CA, EE.
UU.). Las placas se incubaron a temperatura ambiente durante una
hora, se lavaron y se añadió el sustrato enzimático NBT/BCIP
(DakoCytomation Norden A/S, Glostrup, Dinamarca) a cada pocillo y
se incubaron a temperatura ambiente durante 5-10
minutos. Tras el surgimiento de manchas púrpura oscuro, se terminó
la reacción lavando con agua del grifo. Las manchas se contaron
utilizando el Analizador ImmunoSpot® Serie 2.0 (CTL Analyzers, LLC,
Cleveland, EE. UU.) y se pudo calcular la frecuencia de CTL
específicos de péptido a partir de los números de células
formadoras de manchas. Todos los ensayos se llevaron a cabo por
duplicado para cada antígeno peptídico.
Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la
proteína survivina para los epítopos de péptidos nonaméricos o
decaméricos de HLA-A1 más probables, utilizando los
principales restos de anclaje de HLA-A1, ácido
aspártico (D), ácido glutámico (E) en la posición 3 y tirosina (Y),
fenilalanina (F) en el extremo C. Según esto, se sintetizaron seis
péptidos derivados de survivina y se examinaron para determinar la
unión a HLA-A1 (Tabla 4). Adicionalmente, se
incluyeron los dos péptidos sur38-46 (MAEAGFIHC)
(SEQ ID NO: 23) y Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO:
25), a pesar de que solamente contenían uno de los anclajes
principales, debido a que ambos se identificaron como posibles
buenos unidores mediante el algoritmo predictivo de Rammensee y col.
disponible en http://syfpeithi.bmiheidelberg.com/. Se
estimaron los valores C_{50} para cada péptido como la
concentración de péptido necesaria para la estabilización
semi-máxima de HLA-A1 (Tabla 4). Sin
embargo, solamente uno de estos péptidos, sur92-101
(GFEELTLGEF) (SEQ ID NO: 27) se unió con una afinidad alta casi
similar a la del epítopo del control positivo conocido de la
proteína del virus de la gripe A, polimerasa básica 1 (PB1)
(VSDGGPNLY), como se ejemplifica en la Figura 10.
Sur93-101 (FEELTLGEF) (SEQ ID NO: 24) tuvo una baja
afinidad de unión a HLA-A1, mientras que ninguno de
los otros péptidos analizados se unió a HLA-A1
(Tabla 4). En consecuencia, se sintetizaron un número de péptidos
análogos en los que mejores restos de anclaje reemplazaron a los
aminoácidos naturales. Se modificaron los dos péptidos
Sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID NO: 23) y
Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO: 25),
introduciendo tirosina (Y) en lugar de cisteína (C) o glutamina (Q),
respectivamente, en el extremo C. Ambos péptidos modificados se
unieron fuertemente a HLA-A1 (Tabla 4).
Adicionalmente, se sustituyeron los aminoácidos en la posición 2
con los anclajes auxiliares de treonina (T) o serina (S) en los dos
péptidos Sur92-101 y Sur93-101.
Estas modificaciones no tuvieron un efecto positivo en la unión de
Sur92-101 a HLA-A1. En contraste,
Sur93T2 (FTELTLGEF) (SEQ ID NO: 36) se unió con una alta afinidad a
HLA-A1 (Tabla 4). La Figura 10 ilustra la unión del
péptido nativo de baja afinidad Sur93-101, del
péptido modificado de alta afinidad Sur93T2 y del péptido que no se
une Sur49-58, comparados con el epítopo del control
positivo del virus de la gripe. Finalmente, se modificaron
Sur14-22, Sur34-43,
Sur49-58, Sur51-59,
Sur92-101 y Sur93-101 con tirosina
(Y) en el extremo C, sin embargo esto no mejoró la afinidad de unión
a HLA-A1 para ninguno de estos péptidos (datos no
mostrados).
Se analizaron los PBL de seis pacientes de
melanoma, y los TIL de tres pacientes de melanoma, para determinar
la presencia de CTL específicos contra cualquiera de los cuatro
péptidos de alta afinidad deducidos de survivina Sur38Y9, Sur47Y10,
Sur92-101 y Sur93T2 por medio de ELISPOT. Se observó
reactividad de células T contra al menos uno de los péptidos
derivados de survivina en tres muestras de PBL y una muestra de TIL
del total de nueve pacientes analizados. Como se ve en la Figura
11, los PBL de un paciente, Mel.A1-3, alojaron una
respuesta de células T contra los cuatro péptidos, Sur38Y9,
Sur47Y10, Sur92-101 y Sur93T2.
Mel.A1-2 mostró respuestas contra Sur47Y10,
Sur92-10 y Sur93T2, mientras que en
Mel.A1-1/TIL y Mel.A1-4/PBL, se
observaron respuestas contra Sur47Y10 y Sur93T2, respectivamente
(Figura 11).
Además, se probó la reactividad inmune de diez
pacientes de melanoma contra los péptidos nativos
Sur93-101, Sur38-46 y
Sur47-56, por medio de ELISPOT; sin embargo, no se
detectaron respuestas específicas de péptido en ninguno de estos
pacientes (datos no mostrados).
Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la
proteína survivina para determinar los péptidos nonaméricos o
decaméricos con motivos de unión correspondientes al de la
superfamilia de HLA-A3, incluyendo
HLA-A3 y HLA-A11. Se seleccionaron
las secuencias de péptidos con los restos de anclaje principales,
leucina (L) en la posición 2 y lisina (K) en el extremo C, junto a
las secuencias peptídicas que tuvieran aminoácidos relacionados en
estas posiciones, según el algoritmo predictivo de Rammensee y
colaboradores (Tabla 4).
Se predijeron trece péptidos a partir de la
secuencia de proteína de survivina y se analizaron para determinar
la unión a HLA-A11 y HLA-A3. Tres de
estos péptidos, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO:
47), Sur54-62 (LAQCFFCFK) (SEQ ID NO: 42) y
Sur112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO: 44) se unieron a
HLA-A11 con alta afinidad, comparable con el
epítopo vírico del antígeno nuclear 4 de EBV (AVFDRKSDAK) (SEQ ID
NO: 63). Además, un péptido, Sur112-121
(KIAKETNNKK) (SEQ ID NO: 51) se unió débilmente a
HLA-A11 (Tabla 4).
Se probaron los PBL de cinco pacientes de
melanoma y dos pacientes de LLC, para determinar la reactividad de
células T contra los cuatro péptidos de unión a
HLA-A11, Sur53-62,
Sur54-62, Sur112-120 y
Sur112-121. Se pudieron detectar respuestas contra
el péptido derivado de survivina Sur53-62 en los PBL
de dos de los pacientes de melanoma, Mel.A11-1,
Mel.A11-2, por medio de ELISPOT (Figura 12).
Adicionalmente, se pudieron detectar células T específicas de
Sur53-62 entre los linfocitos infiltrantes de tumor
(TIL) de un ganglio linfático infiltrado por tumor en el paciente
Mel.A11-2 (Figura 12). En el paciente
Mel.A11-1 se observó una fuerte respuesta inmune
contra el péptido de survivina Sur53-62 en cinco
muestras diferentes de sangre tomadas durante un período de 2 años
(datos no mostrados).
Los péptidos derivados de survivina predichos
para la unión a la superfamilia de HLA-A3 se
analizaron adicionalmente para determinar la unión a
HLA-A3. Solamente dos de los péptidos,
Sur112-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO: 44) y
Sur112-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO: 57) se unieron a
HLA-A3 con alta afinidad, similar a la del epítopo
vírico, la nucleoproteína del virus de la gripe A
265-273 (ILRGSVAHK) (SEQ ID NO: 74) (Tabla 4).
Además, dos péptidos, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID
NO: 47) y Sur95-103 (ELTLGEFLK) (SEQ ID NO: 43), se
unieron débilmente a HLA-A3.
Algunos de los péptidos sin unión detectable se
modificaron en un intento por aumentar la afinidad de unión a
HLA-A3. Por consiguiente, se sintetizaron dos
péptidos análogos de Sur54-62 y
Sur113-122, en los que un mejor resto de anclaje,
leucina (L), reemplazó a la alanina natural (A) en la posición 2.
Sur54L2 (LLQCFFCFK) (SEQ ID NO: 56) se unió a
HLA-A3 con alta afinidad, mientras que Sur113L2
(ILKETNNKKK) (SEQ ID NO: 59) solamente se unió débilmente
(Tabla 4). Además, se sintetizaron cuatro péptidos análogos de
Sur5-13, Sur13-22,
Sur18-27 y Sur53-61, en donde el
resto de anclaje mejor lisina (K) reemplazó a la fenilalanina
natural (F) en el extremo C. Sur5K9 (TLPPAWQPK) (SEQ ID NO:
54) y Sur18K10 (RISTFKNWPK) (SEQ ID NO: 58) se unieron a
HLA-A3 con alta afinidad, mientras que las
sustituciones no tuvieron un efecto detectable sobre la unión a
HLA-A3 de Sur13K9 (FLKDHRISTK) (SEQ ID NO:
57) y Sur53K9 (DLAQCFFCK) (SEQ ID NO: 55), comparados con los
análogos nativos.
Se analizaron nueve muestras de pacientes de
melanoma (cinco de PBL y cuatro de TIL) para determinar la
reactividad inmune contra los dos péptidos nativos de unión a
HLA-A3 de alta afinidad Sur112-120 y
Sur112-121, así como contra los dos péptidos
nativos de unión débil Sur53-62 y
Sur95-103. Sin embargo, no se pudieron detectar
respuestas inmunes contra estos péptidos mediante ELISPOT en ninguno
de los pacientes. Posteriormente, los mismos pacientes se
analizaron para determinar la reactividad inmune espontánea contra
los tres péptidos modificados derivados de survivina, de alta
afinidad, Sur5K9, Sur18K10 y Sur54L2. Se detectó reactividad de CTL
contra Sur18K10 en muestras de TIL de tres pacientes,
Mel.A3-1, Mel.A3-2,
Mel.A3-3 (Figura 13). No se detectaron respuestas
contra los otros dos péptidos, Sur5K9 y Sur54L2. Con el fin de
verificar adicionalmente estas respuestas, se analizaron PBL de 18
pacientes adicionales de melanoma para determinar la reactividad de
CTL contra Sur18K10. Entre éstos, se encontraron tres pacientes que
respondieron, Mel.A3-4, Mel.A3-5 y
Mel.A3-6, produciendo un total de seis pacientes
que respondieron, entre los veintisiete pacientes analizados (Figura
13).
Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la
proteína survivina para detectar los epítopos peptídicos
11-meros de HLA-A2 más probables,
utilizando los principales restos de anclaje específicos de
HLA-A2. Se sintetizaron seis péptidos deducidos de
survivina, y se examinaron para determinar la unión a
HLA-A2. Ninguno de los péptidos examinados se unió
con alta afinidad similar a la de un epítopo del control positivo
conocido del péptido BMLF_{280-288} del virus
Epstein-Barr (GLCTLVAML) (SEQ ID NO: 72) (Tabla 4).
La concentración de péptido requerida para la recuperación
semi-máxima de HLA-A2 (valor
C_{50}) fue de 0,9 \muM para el control positivo. En
comparación, los péptidos Sur18-28 (RISTFKNWPFL)
(SEQ ID NO: 67) y Sur86-96 (FLSVKKQFEEL) (SEQ ID NO:
69), se unieron débilmente a HLA-A2 (C_{50} = 69
\muM y 72 \muM, respectivamente). Sin embargo, los dos epítopos
de survivina restringidos a HLA-A2 conocidos se
unieron de manera similar débilmente a HLA-A2;
Sur95-104 (ELTLGEFLKL) (SEQ ID N0: 43) se unió con
una afinidad intermedia (C_{50} = 10 \muM), mientras que
Sur96-104 (LTLGEFLKL) (SEQ ID NO: 10) se unió sólo
débilmente (C_{50} >100 \muM). Los cuatro péptidos
11-meros restantes examinados
(Sur4-14 (PTLPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 66),
Sur54-64 (LAQCFFCFKEL) (SEQ ID NO: 68),
Sur88-98 (SVKKQFEELTL) (SEQ ID NO: 70), y
Sur103-113 (KLDRERAKNKI) (SEQ ID NO: 74)), no se
unieron a HLA-A2.
Los PBL de diez pacientes de cáncer (dos
pacientes de melanoma (Mel), seis de LLC (LLC), y dos de carcinoma
de mama (CM)), se analizaron inicialmente para investigar si los dos
péptidos 11-meros de unión débil,
Sur18-28 y Sur86-96, eran
presentados por HLA-A2 y reconocidos por el sistema
inmune de los pacientes con cáncer. Se encontraron respuestas de
CTL contra Sur18-28 en PBL de dos de los diez
pacientes analizados (LLC-1, LLC-2,
figura 14), mientras que no se pudieron detectar respuestas contra
Sur86-96 (datos no mostrados). Con el fin de
verificar adicionalmente estas respuestas específicas de
Sur18-28, se analizaron PBL de doce pacientes
adicionales (siete pacientes de melanoma, uno de LLC y cuatro de
carcinoma de mama) para determinar la reactividad de CTL contra
este péptido. Entre éstos, cuatro pacientes (LLC-3,
CM-1, CM-2,
Mel.A2-1) tenían una actividad inmune específica de
Sur18-28 detectable mediante ELISPOT (Figura 14).
Por consiguiente, en conjunto, los PBL de seis de veintidós
pacientes analizados, alojaban una respuesta de CTL contra
Sur18-28.
Se rastreó la secuencia de aminoácidos de la
proteína survivina para determinar los péptidos de nueve a diez
aminoácidos, con restos de anclaje según el motivo de unión de
péptido a HLA-B7. Se seleccionaron cinco péptidos y
se analizaron para determinar su capacidad para estabilizar
HLA-B7 en el ensayo de ensamblaje. Se estimaron los
valores C_{50} para cada péptido como la concentración de péptido
necesaria para la estabilización semi-máxima de
HLA-B7 (Tabla 4). Dos péptidos derivados de
survivina, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO: 18) y
sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19) estabilizaron
HLA-B7 débilmente, con valores C_{50} por encima
de 100 \muM; mientras que sur46-54 (CPTENEPDL)
(SEQ ID NO: 6), sur51-59 (EPDLAQCFF) (SEQ ID N0: 7),
y sur34-43 (TPERMAEAGF) (SEQ ID NO: 20), no se
unieron a HLA-B7 (Tabla 4).
Se probaron PBL positivos para
HLA-B7 de cinco pacientes de melanoma (mel25, mel26,
mel3, mel6, mel39), dos pacientes de LLC (LLC1, LLC54) y dos
pacientes de cáncer de mama (mama11, mama15), para determinar la
reactividad de células T contra los péptidos de unión débil a
HLA-B7, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID
NO: 18) y sur11-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO: 19). Se
pudo detectar una fuerte respuesta espontánea de CTL contra el
péptido derivado de survivina sur6-14 en PBL de un
paciente de LLC y en un paciente de cáncer de mama (Figura 15).
Adicionalmente, se pudo detectar una débil respuesta contra este
péptido en el paciente de melanoma mel3 (Figura 15).
Se probaron un número de péptidos derivados de
survivina que comprendían de 9 a 11 restos de aminoácidos, para
determinar la unión a los siguientes alelos de HLA:
HLA-A1, HLA-A3,
HLA-A11, y HLA-B7, utilizando el
ensayo de ensamblaje para la unión del péptido a las moléculas de
MHC de clase I descritas en los ejemplos anteriores. Además, se
probaron varios de los péptidos para determinar su capacidad para
provocar una respuesta inmune de CTL utilizando el ensayo ELISPOT,
también como se describe en lo anterior.
En la siguiente Tabla 4, se da un resumen de los
resultados, incluyendo los resultados obtenidos en los ejemplos
anteriores:
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Se vacunaron cinco pacientes de melanoma en fase
IV que habían sido previamente muy tratados, con el epítopo de
survivina restringido a HLA-A2 modificado, es decir,
el péptido Sur1M2, presentado por células dendríticas autólogas en
un marco de uso compasivo. Cuatro de los pacientes produjeron una
fuerte respuesta de células T a este epítopo, medido mediante el
ensayo ELISPOT. Además, la tinción in situ con multímero
péptido/HLA-A2 reveló la infiltración de células
que reaccionaban con survivina tanto en las metástasis viscerales
como en las de tejido blando. Notoriamente, no se observó toxicidad
asociada con la vacunación. Los datos demuestran que es factible
inducir una respuesta de células T contra survivina incluso en
pacientes de melanoma en etapa tardía, y que estas vacunaciones se
toleran bien.
Todos los procedimientos clínicos estuvieron de
acuerdo con la Declaración de Helsinki y todos los pacientes
proporcionaron el consentimiento informado antes de la terapia. Los
pacientes de melanoma cutáneo o uveal en fase IV fueron elegibles
cuando su enfermedad era progresiva a pesar de al menos dos ciclos
de quimio-, inmuno-, o quimioinmuno-terapia
diferentes. Además, los pacientes debían tener 18 años de edad o
más, expresar HLAA*0201 y padecer una enfermedad medible validada
mediante exploraciones de tomografía computarizada craneal,
torácica y abdominal. El índice de Karnofsky de los pacientes tenía
que ser del 60% o mejor. No se permitió quimio- y/o inmunoterapia
sistémica en las cuatro semanas antes de la vacunación. Los
criterios de exclusión importantes fueron la evidencia de
metástasis al SNC, enfermedades autoinmunes o infecciosas activas,
embarazo y lactancia, así como anormalidad psiquiátrica
significativa. Se generaron células dendríticas pulsadas con
péptidos como se ha descrito anteriormente (82). Brevemente, se
aislaron PBMC por leucaféresis con Lymphoprep^{TM} (Mycomed
Pharma), se congelaron en alícuotas y se almacenaron en nitrógeno
líquido. Una semana antes de la vacunación, las PBMC se
descongelaron, se lavaron y se cultivaron en un medio que contenía
gentamicina, glutamina y plasma autólogo inactivado por calor. En
los días 1 y 5, se añadieron IL-4 y
GM-CSF. Con el fin de diferenciar CD maduras, se
añadieron TNF-\gamma y prostaglandina E2 en el día
6. En el día 7, las células que exhibían características
fenotípicas y morfológicas de CD maduras, es decir, apariencia en
velo y expresión de CD83 = 75%, se pulsaron con un epítopo
modificado derivado de survivina restringido a
HLA-A2 de survivina_{96-104},
LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 10) (Clinalfa, Suiza) 14. Las células
solamente se utilizaron para la vacunación si las pruebas
microbiológicas de las muestras tomadas de los cultivos en los días
1 y 5 demostraron que eran estériles.
Los pacientes se vacunaron a intervalos de 7
días para las primeras dos vacunaciones, seguidos por intervalos de
28 días para las vacunaciones adicionales. Se resuspendieron un
total de 10-20x106 CD maduras, pulsadas con
survivina_{96-104} en PBS, que contenía
seroalbúmina humana al 1% y se inyectaron intradérmicamente en
alícuotas de 1,5x106 CD por sitio de inyección en las regiones
ventromediales de los muslos cerca de los ganglios linfáticos
regionales. Se excluyeron los miembros donde se hubieran eliminado
y/o irradiado los ganglios linfáticos de drenaje. Se repitió la
leucaféresis después de 5 vacunaciones en ausencia de un deterioro
grave del estado de salud del paciente o de la presentación de
metástasis en el SNC.
Se llevaron a cabo exploraciones por tomografía
computarizada (TAC) antes de la vacunación y cada tres meses
posteriormente o en el caso de signos clínicos graves de evolución
de la enfermedad. Las respuestas inmunológicas se siguieron
mediante el ensayo ELISPOT, utilizando las PBMC obtenidas cada tres
meses, para detectar la liberación de IFN-\gamma
específico de survivina_{96-104}. Con el fin de
aumentar la sensibilidad del ensayo ELISPOT, las PBMC se
estimularon una vez in vitro a una concentración de
1x10^{6} células por ml en placas de 24 pocillos (Nunc,
Dinamarca) en medio x-vivo (Bio Whittaker,
Walkersville, Maryland), suplementado con suero humano inactivado
por calor al 5% y L-glutamina 2 mM en presencia de
péptido10 \muM. Dos días después, se añadieron
interleuquina-2 recombinante (IL-2)
40 UI/ml (Chiron, Ratingen, Alemania). Después de 10 días se probó
la reactividad de las células. Para este fin, se recubrieron placas
de 96 pocillos con fondo de nitrocelulosa (MultiScreen MAIP N45,
Millipore, Glostrup, Dinamarca) con anticuerpo
anti-IFN-\gamma
(1-D1K, Mabtech, Suecia). Se añadieron linfocitos a
10^{4}-10^{5} células en 200 \mul de medio
x-vivo por pocillo junto con 10^{4}
células T2 y los péptidos relevantes a una concentración final de 2
\muM. Después de una incubación durante la noche a 37ºC y de dos
lavados, se añadió el anticuerpo de detección biotinilado
(7-B6-1-Biotina,
Mabtech, Suecia); su unión específica se visualizó utilizando
fosfatasa alcalina-avidina junto con el sustrato
respectivo (GibcoBRL). La reacción se terminó tras la aparición de
manchas púrpura oscuro, que se cuantificaron utilizando el Sistema
AlphaImager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EE. UU.).
También se siguieron in situ los
linfocitos T CD8+ que reaccionan con
survivina_{96-104}/HLA-A*0201,
tanto en los sitios de vacunación como en las metástasis viscerales,
de tejido blando o cutáneas, por medio de complejos multiméricos
survivina_{96-104}/HLA-A*0201. Los
sitios de vacunación se cortaron 24 horas después de la inyección
intradérmica en todos los pacientes, mientras que las lesiones
metastásicas solamente se retiraron en pacientes seleccionados, si
eran fácilmente accesibles (pacientes KN y GB) o se retiraron
durante un intento curativo (paciente WW). El procedimiento de
tinción para los complejos multiméricos péptido/MHC se ha descrito
recientemente (68). Los complejos multiméricos
survivina_{96-104}/HLA-A*0201 se
generaron mediante la introducción de un sitio de reconocimiento
para la biotinilación enzimática en el extremo 5' de los dominios
extracelulares de HLA-A*0201 (restos
1-275). La proteína recombinante se purificó
mediante cromatografía de exclusión molecular (Sephadex G25,
Pharmacia, Erlangen, Alemania) y de intercambio iónico
(mono-Q, Pharmacia) y se plegó in vitro
mediante dilución en presencia de los péptidos respectivos y
\beta2-microglobulina. Después de la filtración
en gel en una columna de Sephadex G25, la proteína se multimerizó
con estreptavidina-FITC conjugada con moléculas de
dextrano (amablemente proporcionadas por L. Winther, DAKO,
Copenhague, Dinamarca) para generar complejos multivalentes
HLA-dextrano. Las secciones crioconservadas de las
muestras respectivas se secaron durante la noche y posteriormente
se fijaron en acetona fría durante 5 minutos. Todos los pasos de
incubación se llevaron a cabo en la oscuridad a temperatura
ambiente como sigue: (i) 45 minutos de un anticuerpo
anti-CD8 (1:100, clon HIT8a, Pharmingen, San Diego,
CA), (ii) anticuerpo de cabra anti-ratón conjugado
con Cy 3 (diluido 1:500; código
115-165-100, Dianova, Hamburgo,
Alemania) durante 45 minutos, y finalmente (iii) los multímeros
durante 75 minutos. Entre cada paso los portaobjetos se lavaron dos
veces durante 10 minutos en PBS/BSA al 0,1%. Finalmente, los
portaobjetos se montaron en Vectashield y se observaron con un
Microscopio Confocal Leica (TCS 4D, Leica, Mannheim, Alemania).
\newpage
Se inscribieron cinco pacientes de melanoma en
etapa IV muy avanzado, dos que padecían melanoma uveal, uno
melanoma de tejido blando y los dos restantes melanoma cutáneo.
Debido a la manifestación de metástasis cerebrales sintomáticas un
paciente se sacó de la terapia después de solamente dos
vacunaciones. Los otros cuatro pacientes recibieron hasta 15
vacunaciones. Un paciente murió de paro cardíaco en un estado libre
de tumor después de la resección quirúrgica de las metástasis
restantes. Otro paciente se sacó de la terapia después de 10
vacunaciones debido a la aparición de metástasis viscerales (RW).
Un paciente permaneció en el estudio después de 15 vacunaciones.
Las características detalladas de los pacientes, la terapia previa,
el número de vacunaciones y el estado de supervivencia, se resumen
en la Tabla 5.
No se presentaron toxicidades importantes. Por
consiguiente, la hemoglobina, leucocitos y trombocitos, así como
lactato-deshidrogenasa, creatinina y colinesterasa,
no estuvieron influenciados por la terapia de vacunación (Fig. 16).
No se observaron signos de toxicidad sistémica o local en los sitios
de inyección. Además, no hubo detección de deterioro en la
cicatrización, trastornos hemorrágicos, disfunción cardíaca,
vasculitis o enfermedad inflamatoria del intestino. En un paciente
(WW), se pudieron estabilizar las metástasis de hígado previamente
existentes con la terapia de vacunación, pero todavía se presentó
una nueva metástasis suprarrenal. Desafortunadamente, este paciente
murió debido a paro cardíaco, incluso aunque estaba libre del tumor
después de la cirugía curativa. Se detectó una metástasis de
cerebro en el paciente PB solamente cuatro semanas después de
iniciarse la vacunación. Por consiguiente, este paciente se tuvo
que excluir de vacunaciones adicionales después de solamente dos
inyecciones con CD. Los otros tres pacientes demostraron una
evolución lenta de la enfermedad metastásica sin un deterioro
sustancial en su estado general de salud. Notoriamente, para el
paciente KN se pudo alcanzar una supervivencia global de 13 meses
(desde el inicio de la vacunación hasta el fallecimiento) a pesar de
una pesada carga metastásica y una rápida evolución de la
enfermedad al principio de la vacunación. El paciente GB permaneció
en el protocolo 14 meses después de iniciarse la vacunación con CD
pulsadas con el péptido de survivina. Sin embargo, se debe observar
que ambos pacientes (RW y GB) recibieron un tratamiento localizado
adicional para el control del tumor, ya sea radiación de tumores
subcutáneos (RW) o quimioterapia local (GB).
Con el fin de seguir la cinética de las
respuestas de células T citotóxicas, se probaron PBMC obtenidas
antes de y tres meses después de la vacunación para determinar su
reactividad al epítopo modificado de
survivina_{96-104} mediante ELISPOT para
IFN-\gamma. Antes del análisis, las PBMC se
estimularon una vez in vitro para aumentar la sensibilidad
de este ensayo. En los cuatro pacientes ensayados, fue evidente una
inducción de células T reactivas con
survivina_{96-104} (Fig. 17). El análisis de la
reactividad a otros péptidos de survivina restringidos a
HLA-A*0201, es decir,
survivina_{96-104} no modificado y el epítopo Sur9
adyacente, demostró una respuesta de células T contra estos
péptidos en dos de los pacientes (KN y RW) (datos no mostrados).
Se ha cuestionado repetidamente el valor de
pronóstico y clínico de las mediciones de las respuestas de células
T específicas de tumor en sangre periférica; por lo tanto, también
se probó la presencia de linfocitos T CD8+ reactivos con
survivina_{96- 104}/HLA-A*0201 entre los
linfocitos infiltrantes de tumor in situ, mediante tinción
con multímero péptido/MHC. Con el fin de validar este método,
primero se analizaron muestras de tejido de reacciones de
hipersensibilidad de tipo retardado que se presentaron en el sitio
de la vacunación en 24 horas. Este análisis confirmó las
observaciones anteriores de que las inyecciones intradérmicas de CDs
pulsadas con péptido inducen un fuerte infiltrado de células T
inflamatorias específicas del péptido. Posteriormente, se aplicó el
procedimiento de tinción con multímero péptido/MHC en metástasis de
tejido blando y viscerales, que reveló la presencia de células
reactivas con
survivina_{96-104}/HLA-A*0201
entre el infiltrado de CD8+. Esta observación sugiere que la
vacunación no solamente induce células T con la especificidad
deseada, sino que también las dota con la capacidad necesaria de
migración dirigida.
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USO DE LOS MISMOS
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<220>
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<223> Péptido Sur53K9
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<220>
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\hskip1cm
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<220>
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<211> 10
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<220>
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\newpage
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<212> PRT
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<220>
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<220>
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<212> PRT
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<220>
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<223> Péptido Sur53K9
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<220>
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\newpage
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\hskip1cm
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 52
\hskip1cm
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
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<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
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\vskip0.400000\baselineskip
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
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\hskip1cm
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
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\vskip0.400000\baselineskip
<400> 58
\hskip1cm
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<211> 10
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 60
\hskip1cm
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<212> PRT
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 61
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
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<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
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\hskip1cm
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<210> 64
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 64
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 65
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
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<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
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<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 65
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 66
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 66
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
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\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 67
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 68
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 68
\hskip1cm
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<210> 69
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
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<400> 69
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 70
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 70
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 71
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 11
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 71
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 72
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 72
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 73
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 8
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\newpage
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 73
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 74
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 74
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 75
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 75
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 76
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 76
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 77
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 77
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 78
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 78
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 79
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 80
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 10
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 80
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 81
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 81
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 82
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 82
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 83
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 83
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 84
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 84
\hskip1cm
\vskip0.400000\baselineskip
<210> 85
\vskip0.400000\baselineskip
<211> 9
\vskip0.400000\baselineskip
<212> PRT
\vskip0.400000\baselineskip
<213> Secuencia artificial
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<220>
\vskip0.400000\baselineskip
<223> Péptido Sur53K9
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip0.400000\baselineskip
<400> 85
\hskip1cm
Claims (33)
1. Un péptido epítopo restringido a MHC de clase
I derivado de survivina, dicho epítopo tiene la secuencia FTELTLGEF
como se especifica en SEQ ID NO: 36 y al menos una de las siguientes
características:
- (i)
- es capaz de unirse a la molécula HLA-A1 de clase I con una afinidad medida mediante la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo de 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA
- (ii)
- es capaz de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o
- (iii)
- es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que reaccionan con el péptido epítopo.
\vskip1.000000\baselineskip
2. Un péptido según la reivindicación 1 que
tiene un valor C_{50}, que es como máximo de 30 \muM.
3. Un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones 1-2 que tiene un valor C_{50},
que es como máximo de 20 \muM.
4. Un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que comprende como máximo 20 restos de
aminoácidos.
5. Un péptido según la reivindicación 4 que
comprende como máximo 10 restos de aminoácidos.
6. Un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes que es capaz de inducir células
productoras de IFN-\gamma en una población de PBL
de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 10 por
10^{4} PBL.
7. Un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que es capaz de inducir células
productoras de IFN-\gamma en una población de PBL
de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa
survivina.
8. Un péptido según la reivindicación 7 donde la
enfermedad cancerosa se selecciona del grupo que consiste en un
tumor maligno hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y
leucemia mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer
cervical, cáncer de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de cólon,
cáncer de páncreas y cáncer de próstata.
9. Un péptido según cualquiera de las
reivindicaciones precedentes, que es capaz de inducir células
productoras de IFN-\gamma en una población de PBL
de un paciente que tiene una enfermedad cancerosa, dichas células
productoras de IFN-\gamma tienen efecto citotóxico
contra células que expresan survivina de una línea celular de
cáncer, incluyendo una línea celular seleccionada del grupo que
consiste en la línea celular de cáncer de mama
MCF-7 y la línea celular de melanoma FM3.
10. Una composición farmacéutica que comprende
el péptido según cualquiera de las reivindicaciones
1-9.
11. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 10, dicha composición comprende una combinación de
dos o más péptidos epítopos restringidos a MHC de clase I derivados
de survivina, que interacciona cada uno de forma específica con una
molécula de HLA diferente y que tienen al menos una de las
siguientes características:
- (i)
- es capaz de unirse a la molécula de HLA de clase I a la que está restringida con una afinidad medida mediante la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo de 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA
- (ii)
- es capaz de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o
- (iii)
- es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que reaccionan con el péptido epítopo.
\vskip1.000000\baselineskip
12. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 11, en donde cada péptido epítopo interacciona de
forma específica con una molécula HLA-A de MHC de
clase I, una molécula HLA-B de MHC de clase I o una
molécula HLA-C de MHC de clase I.
13. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 12, en donde dicha molécula HLA-A de
MHC de clase I incluye HLA-A1,
HLA-A2, HLA-A3,
HLA-A9, HLA-A10,
HLA-A11, HLA-Aw19,
HLA-A23(9),
HLA-A24(9),
HLA-A25(10),
HLA-A26(10), HLA-A28,
HLA-A29(w19),
HLA-A30(w19),
HLA-A31(w19),
HLA-A32(w19),
HLA-Aw33(w19),
HLA-Aw34(10), HLA-Aw36,
HLA-Aw43, HLA-Aw66(10),
HLA-Aw68(28),
HLA-A69(28).
14. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 12-13, en donde
dicha molécula HLA-B de MHC de clase I incluye
cualquiera de las siguientes: HLA-B5,
HLA-B7, HLA-B8,
HLA-B12, HLA-B13,
HLA-B14, HLA-B15,
HLA-B16, HLA-B17,
HLA-B18, HLA-B21,
HLA-Bw22, HLA-B27,
HLA-B35, HLA-B37,
HLA-B38, HLA-B39,
HLA-B40, HLA-Bw41,
HLA-Bw42, HLA-B44,
HLA-B45, HLA-Bw46 y
HLA-Bw47.
15. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 12-14, en donde
dicha molécula HLA-C de MHC de clase I incluye
cualquiera de las siguientes: HLA-Cw1,
HLA-Cw2, HLA-Cw3,
HLA-Cw4, HLA-Cw5,
HLA-Cw6, HLA-Cw7 y
HLA-Cw16.
16. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 11-15 que
comprende un péptido epítopo, que es una secuencia nativa de
survivina de una especie de mamífero.
17. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 10-16, que
comprende un péptido epítopo seleccionado del grupo que consiste en
SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO:
7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 45 y SEQ ID NO: 66.
18. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 11 ó 12, que comprende un péptido
epítopo seleccionado del grupo que consiste en SEQ ID NO: 4, SEQ ID
NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39,
SEQ ID NO: 58.
19. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 11-18, en donde
los dichos péptidos epítopo son capaces de inducir células
productoras de IFN-\gamma en una población de PBL
de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 10 por
10^{4} PBL.
20. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 11-19, en donde
dichos péptidos epítopos son capaces de inducir células productoras
de IFN-\gamma en una población de PBL de un
paciente que tiene una enfermedad cancerosa donde se expresa
survivina.
21. Una composición farmacéutica según la
reivindicación 20, en donde la enfermedad cancerosa se selecciona
del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético
incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica,
melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer
de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de
próstata.
22. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 10-21, que
comprende un péptido epítopo que está modificado
postraduccionalmente.
23. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 10-22, que
comprende un péptido fosforilado.
24. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 10-23 que
comprende un adyuvante.
25. Una composición farmacéutica según
cualquiera de las reivindicaciones 10-24, que es una
composición para el diagnóstico ex vivo o in situ de
la presencia de células T que reaccionan con survivina entre PBL o
en tejido tumoral.
26. Una vacuna multiepítopo que comprende un
péptido epítopo restringido a MHC de clase I derivado de survivina,
dicho epítopo tiene la secuencia FTELTLGEF como se especifica en SEQ
ID NO: 36 y al menos una de las siguientes características:
- (i)
- es capaz de unirse a una molécula HLA-A1 de clase I a la que está restringido con una afinidad medida mediante la cantidad del péptido que es capaz de recuperación semi-máxima de la molécula de HLA de clase I (valor C_{50}) que es como máximo de 50 \muM determinado mediante un ensayo de estabilización de HLA,
- (ii)
- es capaz de inducir células productoras de IFN-\gamma en una población de PBL de un paciente de cáncer a una frecuencia de al menos 1 por 10^{4} PBL determinado mediante un ensayo ELISPOT, y/o
- (iii)
- es capaz de detección in situ en un tejido tumoral de CTLs que reaccionan con el péptido epítopo.
27. Una vacuna multiepítopo según la
reivindicación 26, que incluye una combinación de epítopos
peptídicos derivados de survivina que dependen del tipo de tejido
del paciente determinado.
28. Una vacuna multiepítopo según la
reivindicación 26 ó 27, en donde la vacuna es capaz de provocar una
respuesta inmune contra una enfermedad cancerosa donde se expresa
survivina.
29. Una vacuna multiepítopo según la
reivindicación 28, en donde la enfermedad cancerosa se selecciona
del grupo que consiste en un tumor maligno hematopoyético
incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia mieloide crónica,
melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer de ovario, cáncer
de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y cáncer de
próstata.
30. Una vacuna multiepítopo según cualquiera de
las reivindicaciones 26 a 29, en donde la vacuna provoca la
producción en el sujeto vacunado de células T efectoras que tienen
un efecto citotóxico contra las células cancerosas.
31. Uso de un péptido como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer.
32. Uso según la reivindicación 31, en donde el
cáncer se selecciona del grupo que consiste en un tumor maligno
hematopoyético incluyendo leucemia linfática crónica y leucemia
mieloide crónica, melanoma, cáncer de mama, cáncer cervical, cáncer
de ovario, cáncer de pulmón, cáncer de colon, cáncer de páncreas y
cáncer de próstata.
33. Uso de un péptido como se define en
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 para la preparación de un
medicamento para el tratamiento del cáncer en combinación con
tratamiento convencional contra el cáncer tal como radioterapia o
quimioterapia.
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