PT2005966E

PT2005966E - Péptidos derivados de survivina e a sua utilização

Info

Publication number: PT2005966E
Application number: PT08163405T
Authority: PT
Inventors: Eivind Per Thor Straten; Mads Hald Andersen
Original assignee: Survac Aps
Priority date: 2003-01-30
Filing date: 2004-01-30
Publication date: 2010-03-08
Also published as: EP2092938B1; PT2092938E; US7892559B2; ATE506962T1; EP2857034A1; USRE48522E1; MXPA05008128A; WO2004067023A3; CN101906148A; NO20053999L; DE602004016287D1; EA008026B1; ATE454159T1; PT1587532E; US20130115216A1; ATE406906T1; JP5121143B2; AU2004208469B2; EP2857034B1; DE602004032483D1

Description

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DESCRIÇÃO "PÉPTIDOS DERIVADOS DE SURVIVINA E A SUA UTILIZAÇÃO"

CAMPO DA INVENÇÃO A presente invenção diz respeito a novos péptidos derivados de survivina e à sua utilização com fins diagnósticos e terapêuticos, nomeadamente no caso do cancro. Os novos péptidos são, em particular, epitopos reconhecidos por células T restritos ao HLA-Al do MHC classe I que são capazes de desencadear respostas de células τ citotóxicas em doentes oncológicos, incluindo respostas in situ e ex vivo. Estes novos péptidos derivam, mais especificamente, da proteína inibidora da apoptose, a survivina, um conhecido antigénio associado a tumores (TAA).

ANTECEDENTES TÉCNICOS E TÉCNICA ANTERIOR 0 processo pelo qual o sistema imunitário dos mamíferos reconhece e reage a materiais exteriores ou estranhos é muito complexo. Uma faceta importante do sistema é a resposta de células T. Esta resposta exige que as células T reconheçam e interajam com complexos de moléculas de superfície celular designados por antigénios leucocitários humanos (HLA), que constituem o complexo major de histocompatibilidade (MHC), e com péptidos. Os péptidos derivam de moléculas maiores, que são processadas pelas células, que também apresentam a molécula HLA/MHC. A interacção das células T e dos complexos de HLA/péptido é restrita, exigindo uma célula T que seja específica para uma determinada combinação de uma molécula HLA e de um péptido. Se não estiver presente uma célula T específica, 2 não ocorre nenhuma resposta de células T, mesmo se o seu complexo associado estiver presente. De igual modo, não ocorre resposta se não houver complexo específico, mas a célula T estiver presente. 0 mecanismo pelo qual as células T reconhecem as anomalias celulares também foi relacionado com o cancro. Por exemplo, no documento WO 92/20356, descreve-se uma família de genes que são processados para originar péptidos que, por sua vez, são expressos na superfície das células e podem conduzir à lise das células tumorais por CTLs específicos. Chama-se a estes genes família MAGE e diz-se que codificam «precursores de antigénio de rejeição tumoral» ou moléculas «TRAP», e os péptidos que deles derivam chamam-se «antigénios de rejeição tumoral» ou «TRAs».

No documento WO 94/05304, descrevem-se nonapéptidos que se ligam à molécula HLA-Al. A referência descreve que, dada a conhecida especificidade de determinados péptidos para determinadas moléculas HLA, se presume que um péptido particular se ligue a uma só molécula HLA, mas não a outras. Este é um facto significativo, porque indivíduos diferentes possuem fenótipos de HLA diferentes. Como resultado, embora a identificação de um determinado péptido como associado a uma molécula HLA específica tenha ramificações diagnósticas e terapêuticas, estas só são relevantes para os indivíduos com um determinado fenótipo HLA.

Caracterizaram-se vários péptidos apresentados por moléculas do MHC e descobriu-se que alguns deles possuem modificações pós-traducionais que terão, possivelmente, um impacto na funcionalidade do complexo HLA-péptido. Assim, existem variados estudos que associaram alterações no padrão de fosforilação a uma transformação maligna. Além do 3 mais, demonstrou-se que a fosforilação poderá ter um efeito neutro, negativo ou mesmo positivo na ligação do péptido ao MHC classe I e que se poderão gerar CTL específicos para fosfopéptidos, que distinguem entre as versões fosforiladas e não-fosforiladas do péptido, o que mostra que esses CTL fazem, muito provavelmente, parte do conjunto de CTL restritos ao MHC classe I. Recentemente, mostrou-se que os péptidos fosforilados são de facto processados naturalmente e apresentados por moléculas MHC classe I in vivo. Além disso, demonstrou-se a presença de péptidos fosforilados em extractos de moléculas de classe I isoladas de diferentes células B transformadas por EBV.

Por conseguinte, está mais do que demonstrado que epítopos peptídicos derivados de antigénios associados a tumores (TAAs) podem ser reconhecidos como antigénios por linfócitos T citotóxicos (CTLs), no contexto de moléculas do MHC (1) . Todavia, embora seja em geral aceite que a maioria, senão todos, os tumores são antigénicos, apenas alguns são de facto imunogénicos no sentido em que a progressão do tumor é prontamente controlada pelo sistema imunitário.

Para ultrapassar esta limitação, iniciaram-se vários testes imunoterapêuticos, como, por exemplo, vacinações com péptidos derivados de TAA. No que diz respeito ao melanoma, o tumor para o qual se caracterizou um maior número de TAAs determinados por CTL, induziram-se respostas fortes de CTL contra antigénios, através de vacinação e alguns doentes conseguiram uma remissão completa da doença (2, 3). Contudo, a maioria dos epítopos peptídicos utilizados nestes testes de vacinação é específica para melanócitos, e esses péptidos não podem ser aplicados para tumores de origem não melanocítica. Além do mais, a expressão desses 4 TAAs é heterogénea entre os tumores de diferentes doentes e pode até variar entre as metástases obtidas a partir de um único doente. Contudo, nos últimos anos, identificaram-se alguns antigénios peptídicos específicos para tumores, como o HER-2 (4), o Muc-1 (5) e a telomerase (6), que são expressos em vários tipos de cancro.

Demonstrou-se igualmente que, por meio de manipulação adequada, os antigénios tumorais presentes nos tumores podem ser expostos ao sistema imunitário. Estudos demonstraram que o componente CTL CD8+ da resposta imunitária, individualmente ou em combinação com células Th CD4+, constitui o principal componente efector antitumoral da resposta imunitária adaptativa. Até hoje, o foco tem-se concentrado maioritariamente no componente CTL da resposta imunitária. Todavia, torna-se cada vez mais claro que a resposta das células T CD4 desempenha um papel essencial na rejeição do tumor, especialmente na fase de indução ou na extensão de uma resposta CTL in vivo. Consequentemente, a incorporação de antigénios tumorais restritos à classe II nos protocolos de vacinação tumorais eficazes poderá aumentar a eficácia das vacinas. A apoptose é uma programação genética de suicídio celular e tem-se sugerido que a inibição da apoptose seria um importante mecanismo envolvido no desenvolvimento do cancro, ao prolongar o tempo de vida das células, favorecendo a acumulação de mutações transformadoras (7). A survivina é um membro recentemente identificado da família dos inibidores das proteínas da apoptose (lAPs). Numa análise global da expressão génica de cerca de 4 milhões de transcritos, identificou-se a survivina como um dos principais genes cuja expressão está invariavelmente sobre-regulada em muitos tipos de cancro mas não em tecidos 5 normais (8). Entre as neoplasias malignas sólidas que sobre-expressam a survivina incluem-se o cancro do pulmão, do cólon, da mama, do pâncreas e da próstata, assim como neoplasias hematopoiéticas malignas (9) . Além disso, verificou-se que há vários cancros da pele melanociticos e não-melanociticos que são invariavelmente positivos no que concerne à survivina (10, 11) . A sobreexpressão de survivina na maioria dos cancros humanos sugere um papel determinante da inibição da apoptose na progressão tumoral, uma noção substanciada pela observação de que, no caso dos cancros colorrectal e da bexiga, assim como no neuroblastoma, a expressão de survivina está associada a um prognóstico desfavorável. Em contraste, a survivina não é passivel de ser detectada em tecidos normais de adultos. Estas caracteristicas qualificam a survivina como um TAA adequado quer para objectivos de diagnóstico quer para objectivos terapêuticos. Por conseguinte, durante a última década, identificou-se um grande número de TAAs, que são reconhecidos por CTLs de um modo restrito ao complexo major de histocompatibilidade (MHC). Dado que a survivina é sobreexpressa na maioria dos cancros humanos e que a inibição da sua função resulta num aumento da apoptose, esta proteina poderá servir como alvo para respostas terapêuticas de CTL. A proteina survivina e a sua potencial utilização no diagnóstico e na terapêutica são descritas na (8) e na patente US 6.245.523. A survivina é uma proteina citoplasmática de 16,5 kDa que contém um único bir e uma região enrolada (coiled) carboxi-terminal altamente carregada ao invés de um RING finger, o que inibe a apoptose induzida pela remoção do factor de crescimento (IL—3) quando transferida em precursores de células B. 0 gene que codifica a survivina é quase idêntico à sequência do receptor-1 da protease de célula efectora (EPR-1), mas 6 orientado em sentido contrário, sugerindo assim a existência de dois genes separados duplicados numa configuração head-to-head. Em consequência, a survivina pode ser descrita como um produto epr-1 antisense («em sentido contrário»). Funcionalmente, a inibição da expressão da survivina através da regulação positiva do seu transcrito EPR-1 antinsense natural, resulta numa apoptose em massa e numa diminuição do crescimento celular. A patente US 6.245.523 descreve o isolamento de survivina purificada e fornece moléculas de ácido nucleico que codificam a proteína survivina, anticorpos e outras moléculas que se ligam à survivina. A patente US 6.245.523 também descreve fragmentos activos anti-apoptóticos da proteína survivina e suas variantes em que um resíduo de aminoácidos foi inserido na parte N- ou C-terminal, ou no interior da sequência de survivina descrita. É especificamente descrito que esses péptidos deverão conter resíduos funcionais importantes, necessários para a apoptose, isto é, Trp na posição 67, Pro na posição 73 e Cys na posição 84.

Andersen et al. CÂNCER RESEARCH, vol. 61, n.° 3 (2001) 869-872 descrevem péptidos de survivina específicos de HLA-A2: Surl-SurlO, Surl L2 e Surl M2. Andersen et al. também descrevem respostas de CTL específicas contra os referidos péptidos, valores de afinidade para a ligação dos referidos péptidos às moléculas HLA classe I e sugerem a utilização dos péptidos na vacinação, na terapêutica oncológica e no diagnóstico oncológico.

Andersen et al. CÂNCER RESEARCH, vol. 61, n.° 16 (2001) 5964-68 descrevem péptidos de survivina que se ligam a HLA: Surl (LTLGEFLKL), Sur9 (ELTLGEFLKL) e SurlM2 e a geração de respostas de CTL pelos referidos péptidos. O documento 7 também descreve complexos de MHC classe I/péptido, que foram multimerizados, e a sua utilidade na detecção de células reactivas à survivina em tecidos tumorais. Andersen et al. sugerem utilizações desses péptidos de survivina para vacinas contra o cancro baseadas em péptidos, em combinação com terapêutica oncológica convencional.

Schmitz et al. CÂNCER RESEARCH, vol. 60, n.° 17 (2000) 4845-49 descrevem o péptido ELTLGEFLKL que se liga a HLA. O estudo demonstra a geração de respostas de CTL pelo referido péptido e sugere a utilização do péptido em vacinas contra o cancro.

Hirohashi et al. CLINICAL CÂNCER RESEARCH: AN OFFICIAL JOURNAL OF THE AMERICAN ASSOCIATION FOR CÂNCER RESEARCH, vol. 8, n.° 6 (2002) 1731-39 descrevem um epítopo de CTL restrito a HLA-A24 de survivina-2B (variante de splicing encontrada em tumores). O trabalho também descreve outros péptidos de survivina, por exemplo, AFLSVKKQF e QFEELTLGEF.

Fortugno et al. JOURNAL OF CELL SCIENCE, vol. 115, n.° 3 (2002) 575-85 descrevem anticorpos policlonais contra os epitopos de survivina Ala3-Ilel9, Met38-Thr48, Pro47-Phe58 e Cys57-Trp67.

Nenhum dos documentos da técnica anterior descreve o epitopo restrito ao MHC classe 1 da presente invenção compreendendo a sequência FTELTLGEF. Além do mais, a técnica anterior só descreve a ligação de epitopos de CTL de survivina ao alelo HLA-A2. Todavia, de modo a desenvolver programas de vacinação baseados em péptidos eficazes, também é necessário visar diferentes moléculas HLA, incluindo alelos HLA-A3, HLA-B e HLA-C. Em última análise, será desejável um conjunto de múltiplos epitopos peptidicoss de survivina para utilização nessas vacinas, em que cada péptido interaja especificamente com uma molécula HLA diferente. A presente invenção baseia-se na descoberta de que os péptidos restritos ao MHC classe I podem ser derivados da proteína survivina, sendo estes capazes de se ligar a moléculas HLA de MHC classe I e assim desencadear respostas imunitárias de CTL, quer ex vivo quer in situ, em doentes que sofram de uma vasta variedade de doenças oncológicas. Estas descobertas sugerem fortemente que a survivina actua como molécula TRAP, que é processada por células em péptidos que têm funcionalidade TRA. Como é evidente, estas descobertas abrem o caminho para novas abordagens terapêuticas e de diagnóstico, que, devido ao facto de a survivina parecer ser expressa universalmente por células tumorais, são aplicáveis ao controlo das doenças oncológicas em geral.

RESUMO DA INVENÇÃO

Por conseguinte, a invenção diz respeito, num primeiro aspecto, a um epítopo peptídico restrito ao MHC classe I derivado de survivina, tendo o dito epítopo a sequência FTELTLGEF, como especificado na SEQ ID NO:36, e pelo menos uma das seguintes características: (i) capacidade de ligação à molécula HLA classe I à qual está restrito numa afinidade que é medida pela quantidade de péptido necessária para alcançar metade da recuperação máxima da molécula HLA classe I (valor de C50), que é no máximo 50 μΜ, tal como determinado por um teste de estabilização de HLA; (ii) capacidade de estimular células produtoras de lNF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico a uma frequência de pelo menos 1 em cada 104 PBLs, como determinado por um teste ELISPOT, e/ou; 9 (iii) capacidade de detectar in situ num tecido tumoral CTLs que reajam com o epitopo peptidico.

De preferência, o péptido da invenção tem pelo menos duas ou, preferencialmente, estas três caracteristicas.

Noutro aspecto, a invenção fornece uma composição farmacológica compreendendo o péptido definido acima e uma composição para diagnóstico ex vivo ou in situ da presença, num doente oncológico, de células T reactivas à survivina entre PBLs ou em tecido tumoral, composição essa que compreende um péptido como o definido acima.

Um aspecto importante da invenção diz respeito à utilização do péptido definido acima para a preparação de um medicamento para o tratamento do cancro. Finalmente, a invenção oferece uma vacina de múltiplos epítopos, compreendendo um epitopo restrito ao MHC classe I de acordo com a invenção.

DESCRIÇÃO PORMENORIZADA DA PRESENTE INVENÇÃO 0 novo péptido restrito ao MHC classe I da invenção distingue-se por ter pelo menos uma entre várias caracteristicas, sendo uma das quais a sua capacidade de se ligar à molécula HLA-Al classe I, à qual está restrito numa afinidade que, quando medida pela quantidade de péptido necessária para alcançar metade da recuperação máxima da molécula HLA classe I (valor de o (_n o ), num teste de estabilização de HLA, é, no máximo, 50 μΜ. Este teste de estabilização de HLA é realizado da forma previamente descrita (12, 13), e baseia-se na estabilização da molécula HLA, depois de carregar o péptido na linhagem celular T2 deficiente em transportadores peptidicos. Subsequentemente, as cadeias pesadas de HLA estáveis correctamente enroladas 10 são imunoprecipitadas utilizando anticorpos dependentes de conformação e a ligação do péptido é quantificada.

Este ensaio proporciona um meio simples de rastrear péptidos candidatos quanto à sua capacidade de ligação a uma dada molécula de um alelo HLA, na afinidade acima referida. Em modos de realização preferidos, o péptido da invenção tem o valor de C5o, que é no máximo 30 μΜ, como um valor C50 que é no máximo 20 μΜ.

Como já se referiu, o sistema HLA representa 0 sistema major de histocompatibilidade humano (MHC). Em geral, os sistemas MHC controlam uma grande variedade de características: antigénios de transplante, respostas imunitárias dependentes do timo, certos factores do complemento e predisposição para certas doenças. O MHC codifica, mais especificamente, três tipos de moléculas diferentes, isto é, moléculas de classes I, II e III, que determinam as características mais gerais do MHC. Entre estas moléculas, as moléculas de classe I chamam-se moléculas HLA-A, HLA-B e HLA-C, que estão presentes na superfície da maior parte das células nucleadas e dos trombócitos.

Os péptidos da invenção derivam da sequência conhecida da survivina, por exemplo, a sequência apresentada na patente US 6.245.523.

Assim, uma abordagem simples para a identificação de péptidos da invenção inclui os seguintes passos: seleccionar uma determinada molécula HLA, por exemplo, uma que ocorra numa taxa elevada numa dada população; levar a cabo uma análise de alinhamento como a que se descreveu acima para identificar «padrões de resíduos de ancoragem» na proteína survivina; isolar ou construir péptidos de tamanho adequado que compreendam um ou mais dos resíduos de 11 ancoragem identificados; e testar os péptidos resultantes no que diz respeito à (i) capacidade de se ligarem à molécula HLA em particular, utilizando o teste de estabilidade de hla, tal como aqui se descreve; (ii) a capacidade dos péptidos em estimular células produtoras de lNF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico, numa frequência de pelo menos 1 em cada 104 PBLs, como determinado pelo teste ELISPOT aqui descrito; e/ou (iii) a capacidade dos péptidos em detectar in situ num tecido tumoral CTLs que sejam reactivos aos epitopos peptidicos a ser testados.

Em concretizações especificas, o péptido da invenção é um péptido restrito HLA-A1 com a sequência FTELTLGEF (SEQ ID NO:36)).

Preferencialmente, o péptido da invenção compreende no máximo 20 resíduos de aminoácidos, como por exemplo no máximo 10 resíduos de aminoácidos. Em modos de realização específicos, o péptido é um nonapéptido, um decapéptido ou um undecapéptido. O péptido da invenção deriva, tal como se mencionou acima, de uma proteína survivina ou de um fragmento desta. A proteína survivina da qual o péptido pode derivar é uma proteína survivina de qualquer espécie animal em que a proteína seja expressa. Em modos de realização preferenciais, a proteína inicial de survivina provém de uma espécie mamífera incluindo uma espécie roedora, leporídea ou uma espécie primata, como a espécie humana. Com base na sequência da proteína survivina seleccionada, o péptido da invenção deriva, por qualquer tratamento químico ou enzimático apropriado, do material inicial de survivina que resulta num péptido de tamanho adequado, como acima indicado, ou pode ser sintetizado por qualquer um dos procedimentos convencionais de síntese 12 peptídica, que serão familiares a qualquer pessoa com experiência na arte.

Uma caracteristica significativa do péptido da invenção é a sua capacidade para estimular células T responder produtoras de INF-γ, isto é, células T citotóxicas (CTLs) que reconhecem especificamente o péptido particular numa população de PBLs ou células tumorais de um doente oncológico (células-alvo). Esta actividade é prontamente determinada submetendo PBLs ou células tumorais de um doente a um teste ELISPOT, como se descreve na referência (16) e nos exemplos que se seguem. Antes do teste, poderá ser vantajoso estimular a população de PBLs ou as células tumorais a ser analisadas estabelecendo o contacto das células com o péptido a ser testado. Preferencialmente, o péptido tem capacidade de estimular ou reconhecer células T produtoras de INF-γ a uma frequência de pelo menos 1 em cada 104 PBLs, como determinado por um teste ELISPOT, tal como é aqui utilizado. 0 teste ELISPOT representa uma poderosa ferramenta para monitorizar respostas especificas de células T ao péptido survivina. Contudo, embora se tenha demonstrado que a reactividade ao ELISPOT se correlaciona, na maioria dos casos, com a capacidade dos CLLs em lisar as células-alvo, as provas conclusivas para esta noção só podem ser dadas de forma directa. Aqui fornece-se essa prova, pois demonstrou-se (ver Exemplo 2) que as células reactivas à survivina isoladas por meio de complexos HLA/péptido possuem a capacidade funcional de lisar células-alvo. Além disso, demonstrou-se que os CTLs isolados que reconheciam especificamente um péptido da invenção foram capazes de lisar células tumorais de hla compatível de diferentes origens, por exemplo, de melanomas e de cancro da mama. 13

Esta descoberta sugere que as células cancerosas em geral processam e apresentam o mesmo péptido de survivina endógeno. Assim sendo, uma implicação importante das descobertas aqui apresentadas é que os péptidos da invenção são expressos e complexados com moléculas HLA numa variedade de células cancerosas de diferentes origens histológicas. Isto torna estas células cancerosas susceptiveis à destruição por CTLs e sublinha a potencial utilidade da imunização contra a survivina para controlar o crescimento de diferentes neoplasias. A presença de respostas espontâneas de CTLs em PBLs e células tumorais para epitopos peptidicos derivados de survivina restritos ao HLA de doentes que padecem com três tipos de cancro não relacionados, isto é, cancro da mama, melanoma e CLL, confirma ainda mais o potencial imunoterapêutico universal deste antigénio tumoral.

Assim sendo, noutro modo de realização preferido, o péptido da invenção é capaz de estimular células produtoras de INF-γ numa população de PBLs de um doente com uma doença oncológica em que a survivina é expressa, incluindo uma neoplasia hematopoiética incluindo leucemia linfática crónica e leucemia mielóide crónica, melanoma, cancro da mama, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do pâncreas e cancro da próstata. Em especial, o péptido da invenção é capaz de desencadear uma resposta imunitária sob a forma de uma célula T tendo um efeito citotóxico contra células que expressam survivina de uma linhagem de células cancerosas, incluindo uma linhagem celular seleccionada de entre a linhagem celular MCF-7 de cancro da mama e a linhagem celular FM3 de melanoma. 14

Além da sua capacidade para desencadear respostas imunitárias em populações de PBL e linhagens celulares cancerosas, demonstrou-se que os péptidos da invenção também são capazes de desencadear respostas imunitárias citoliticas in situ, isto é, em tecidos de tumores sólidos. Isto demonstrou-se pela disponibilização de complexos HLA-péptido, sendo, por exemplo, multimerizados e guarnecidos com um marcador detectável, e utilizando esses complexos para colorações imunohistoquimicas para detectar, num tecido tumoral, CTLs reactivos ao epitopo peptidico da invenção. Assim sendo, outra caracteristica importante do péptido da invenção é a sua capacidade de detectar in situ, num tecido tumoral, CTLs que são reactivos ao epitopo peptidico.

Prevê-se que os péptidos da invenção, além da sua capacidade de ligação a moléculas HL A, que resulta na apresentação de complexos de HLA e péptidos em superfícies celulares, complexos esses que, por sua vez, actuam como epítopos ou alvos para células T citoliticas, possam desencadear outros tipos de respostas imunitárias, como respostas de células B, o que resulta na produção de anticorpos contra os complexos e/ou uma reacção de hipersensibilidade retardada (DTH). Este último tipo de resposta imunitária define-se por uma ruborização e um endurecimento palpável no local da injecção do péptido da invenção. Sabe-se que as diferentes moléculas HLA têm diferente prevalência nas principais populações humanas. Por conseguinte, há um requisito de identificação de epítopos peptídicos restritos a várias moléculas HLA classe I para ampliar o grupo de doentes que pode ser tratado de acordo com os métodos da presente invenção. A caracterização de múltiplos epítopos de survivina com 15 diferentes elementos de restrição ao HLA alarga o potencial clinico deste antigénio-alvo de duas importantes maneiras: (i) aumenta o número de doentes elegíveis para imunoterapia baseada em péptidos derivados de survivina. 0 antigénio HLA-A2 é expresso por cerca de 50 % das populações caucasianas e asiáticas, os antigénios HLA-A1 e HLA-A3 são ambos expressos por cerca de 25 % dos caucasianos e 5 % dos asiáticos, ao passo que o antigénio HLA-AI1 é expresso por cerca de 15 % dos caucasianos e 30 % dos asiáticos; Embora estes números não possam ser somados devido à co-expressão, uma combinação de péptidos restritos por uma multiplicidade destes abrangeria certamente a maioria dos doentes oncológicos; (ii) ter como objectivo colectivo vários elementos de restrição em cada doente diminuirá, provavelmente, o risco de escape imune por perda de alelos HLA. A perda de um único alelo HLA é um componente significativo de alterações MHC descritas para as células cancerosas, ao passo que a perda total da expressão da classe I é um evento algo raro. Assim sendo, com a identificação de epitopos de survivina restritos a diferentes alelos HLA, é agora possível ter como objectivo mais do que uma molécula HLA em doentes com sobreposição de alelos.

Por conseguinte, com base na descrição da presente invenção, qualquer pessoa com experiência na arte será capaz de desenvolver vacinas de múltiplos epitopos altamente imunogénicas. Preferencialmente, essas vacinas deverão ser concebidas de forma a facilitarem uma administração simultânea dos péptidos derivados de survivina mais adequados, opcionalmente em combinação com outros péptidos adequados e/ou adjuvantes, tal como aqui descrito. 16

Uma vacina de múltiplos epitopos compreendendo um epitopo peptidico restrito ao MHC classe I derivado de survivina, tendo esse epitopo a sequência FTELTLGEF conforme especificado pela SEQ ID NO: 36 e pelo menos uma das seguintes caracteristicas: (i) capacidade de ligação à molécula HLA-Al classe I à qual está restrito numa afinidade medida pela quantidade do péptido necessária para alcançar metade da recuperação máxima da molécula HLA classe I (valor de C50), que é no máximo 50 μΜ, como determinado por um teste de estabilidade de HLA; (ii) capacidade de estimular células produtoras de iNF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico a uma frequência de pelo menos 1 em cada 104 PBLs, como determinado por um teste ELISPOT, e/ou; (iii) capacidade de detectar in sítu num tecido tumoral CTLs que reajam com o epitopo peptidico.

Em modos de realização preferenciais, a vacina de múltiplos epitopos inclui uma combinação de epitopos peptidicos derivados de survivina, dependendo do tipo de tecido do doente em questão. A selecção de péptidos que têm potencialmente a capacidade de ligação a uma determinada molécula HLA pode ser feita pelo alinhamento de sequências conhecidas que se ligam a uma dada molécula HLA, para assim revelar a predominância de alguns aminoácidos relacionados em posições particulares nos péptidos. Esses resíduos de aminoácidos predominantes também são aqui referidos como «resíduos de ancoragem» ou «padrões de resíduos de ancoragem». Seguindo esse procedimento relativamente simples baseado em dados de sequências conhecidos que podem ser encontrados em bases de dados acessíveis, podem-se 17 derivar da molécula da proteína survivina péptidos que se ligarão, com toda a probabilidade, à molécula HLA em particular. No quadro abaixo, fornecem-se exemplos representativos dessas análises para uma variedade de moléculas HLA.

Alelo HLA Posição 1 Posição 2 Posição 3 Posição 5 Posição 6 Posição 7 C-terminal HLA-A1 T, S D, E L Y HLA-A2 L,M V L, V HLA-A3 L, V, M F,Y K,Y,F HLA-A11 V,I,F,Y m,l,f,y, I K, R HLA-A23 W, I HLA-A24 Y I,V F I, L, F HLA-A25 Μ, A, T I W HLA-A26 E, D V,T,I,L,F I,L,V Y,F HLA-A28 E, D V,A, L A, R HLA-A29 E Y,L HLA-A30 Y,L,F,V Y HLA-A31 l,m,f,y R HLA-A32 I,L W HLA-A33 Y,I,L,V R HLA-A34 V, L R HLA-A66 E, D T,V R, K HLA-A68 E, D T,V R, K HLA-A69 V,T,A V, L 18

Alelo HLA Posição 1 Posição 2 Posição 3 Posição 5 Posição 6 Posição 7 C-terminal HLA-A74 T V, L HLA-B5 A,P F,Y I,L HLA-B7 P L,F HLA-B8 K K, R L HLA-B14 R,K L, V HLA-B15 Q,L,K,P,H f F, Y,W (B62) V,I,M,S,T HLA-B17 L, V HLA-B27 R Y,K,F,L HLA-B35 P I,L,M,Y HLA-B37 D,E I/ L, M HLA-B38 H D, E F,L HLA-B39 R,H L,F HLA-B40 E F, I,V L, V, A, W, M, T, R (B60,61) T, R HLA-B42 L,P Y,L HLA-B44 E F, Y,W HLA-B46 Μ, I,L,V Y,F HLA-B48 Q,k L HLA-B51 A,P,G > 1—1 >* Pm 19

Alelo HLA Posição 1 Posição 2 Posição 3 Posição 5 Posição 6 Posição 7 C-terminal HLA-B52 Q F,Y I,V HLA-B53 P W, F, L HLA-B54 P HLA-B55 P A, V HLA-B56 P A, V HLA-B57 A,T,S F, W, Y HLA-B58 A,T,S F, W, Y HLA-B67 P L HLA-B73 R P HLA-Cwl A, L L HLA-Cw2 A, L F, Y HLA-Cw3 A, L L,M HLA-Cw4 Y,P,F L, M, F, Y HLA-Cw6 Y L,Y,F,Y HLA-Cw8 Y L, I HLA-Cwl6 A, L L, V

Assim sendo, e como exemplo, nonapéptidos que têm potencialmente a capacidade de ligação ao HLA-Al teriam uma das seguintes sequências: Xaa-T-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y, Xaa-T-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y; Xaa-S-D-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y ou Xaa-S-E-Xaa-Xaa-Xaa-L-Xaa-Y (Xaa indica qualquer residuo de aminoácido). De modo semelhante, podem-se conceber sequências que tenham potencialmente a capacidade de ligação a qualquer outra molécula HLA. 20

Além do mais, tal como se descreveu anteriormente, tem havido um grande interesse quanto à estimulação da imunidade de células T auxiliares específicas para tumor, isto é, vacinar com epítopos restritos ao mhc classe li, apesar do facto dos tumores geralmente não expressarem MHC classe II. Isto tem como base a recente descoberta de que a indução e eficácia da resposta antitumoral induzida por vacina requerem, em muitos casos, a cooperação de células Th CD4 positivas específicas para tumor. Logo, um factor importante que leva ao desenvolvimento de vacinas com uma composição mais complexa é o desejo de atingir múltiplos antigénios tumorais, por exemplo, desenvolvendo vacinas compreendendo ou codificando uma compilação de epítopos de células Th e CTL cuidadosamente seleccionados.

Como é óbvio, as vacinas de múltiplos epítopos constituem uma forma eficaz de aumentar a imunidade contra epítopos derivados de vários antigénios diferentes sem a necessidade de introduzir (genes que codificam) proteínas potencialmente nocivas como as oncoproteínas. Essas vacinas permitem induzir selectivamente imunidade contra epítopos de células T subdominantes e crípticos, que podem ser especialmente importantes no caso de auto-antigénios associados a tumores para os quais poderá existir tolerância para os epítopos que estão proeminentemente presentes em tecidos normais. Além disso, as células apresentadoras de antigénio podem não apresentar certos epítopos que são expressos em células tumorais devido a diferenças funcionais entre os imunoproteossomas das células apresentadoras de antigénio e os proteossomas «constitutivos» na maioria das células tumorais. No caso de vacinas baseadas em péptidos, esses epítopos podem ser administrados numa forma «MHC-pronta», que permite a 21 apresentação através de carregamento exógeno independentemente da absorção e do processamento de antigénios pelas células apresentadoras de antigénio do hospedeiro. É evidente que as descobertas da presente invenção proporcionam a base para aplicações terapêuticas assim como diagnósticas dos péptidos derivados de survivina.

Assim, um aspecto importante da invenção proporciona uma composição farmacológica compreendendo um epitopo peptidico restrito ao MHC classe I derivado de survivina, tendo o dito epitopo a sequência FTELTLGEF, como especificado pela SEQ ID NO: 36 e pelo menos uma das seguintes características: (i) capacidade de ligação à molécula HLA-Al classe I à qual está restrito numa afinidade medida pela quantidade do péptido necessária para alcançar metade da recuperação máxima da molécula HLA classe I (valor de C50), que é no máximo 50 μΜ, como determinado por um teste de estabilidade de HLA; (ii) capacidade de estimular células produtoras de lNF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico a uma frequência de pelo menos 1 em cada 104 PBLs, como determinado por um teste ELISPOT, e/ou; (iii) capacidade de detectar in situ num tecido tumoral CTLs que reajam com o epitopo peptidico.

Noutro aspecto, a presente invenção proporciona uma composição farmacológica compreendendo um ou mais dos péptidos da invenção, isolado ou em combinação adequada com outras proteínas ou fragmentos peptidicos.

Em particular, a invenção fornece uma composição farmacológica compreendendo, além do epitopo com a 22 sequência FTELTLGEF, uma combinação de dois ou mais epitopos peptidicos restritos ao MHC classe I derivados de survivina, cada um interagindo especificamente com uma molécula HLA diferente e tendo pelo menos uma das seguintes caracteristicas: (i) capacidade de ligação à molécula HLA classe I à qual está restrito numa afinidade medida pela quantidade do péptido necessária para alcançar metade da recuperação máxima da molécula HLA classe I (valor de C50), que é no máximo 50 μΜ, como determinado por um teste de estabilidade de HLA; (ii) capacidade de estimular células produtoras de iNF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico a uma frequência de pelo menos 1 em cada 104 PBLs, como determinado por um teste ELISPOT, e/ou; (iii) capacidade de detectar in situ num tecido tumoral CTLs que reajam com o epitopo peptidico.

Em modos de realização particulares, cada epitopo peptidico da composição farmacológica interage especificamente com uma molécula hla-a MHC classe I, uma molécula HLA-B MHC classe I ou uma molécula HLA-C MHC classe I. Noutros modos de realização, a referida molécula HLA-A MHC classe I é uma molécula HLA-Al, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-A10, HLA-All, HLA-AW19, HLA-A23(9), HLA-A24(9), HLA-A25(10), HLA-A26(10), HLA-A2 8, HLA-A2 9(wl9), HLA-A30(wl9), HLA-A31(wl9), HLA-A32(wl9), HLA-Aw33(wl9), HLA-Aw34 (10), HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66(10), HLA-Aw68 (28) ou HLA-A69(28).

Noutros modos de realização, a referida molécula HLA-B MHC classe I inclui qualquer uma das seguintes: HLA-B5, HLAB7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-Bl6, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, 23 HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-Bw42, HLA-B44, HLA-B4 5, HLA-Bw4 6 e HLA-Bw4 7.

Noutros modos de realização, a referida molécula HLA-C MHC classe I inclui qualquer uma das seguintes: HLA-Cwl, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-Cw7 e HLA-Cwl 6 .

Segundo alguns modos de realização, a composição farmacológica compreende um epítopo peptídico, que é uma sequência nativa de survivina de uma espécie mamífera.

Ainda noutros modos de realização, a composição farmacológica compreende um epítopo peptídico seleccionado de entre o seguinte grupo: SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 27, SEQ ID NO: 45 e SEQ ID NO: 66. Noutros modos de realização, a composição farmacológica compreende um epítopo peptídico seleccionado de entre o seguinte grupo: SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO: 36, SEQ ID NO: 38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 58.

Em modos de realização preferidos os epítopos peptídicos referidos são capazes de estimular células produtoras de INF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico numa frequência de pelo menos 10 em cada 104 PBLs. Noutros modos de realização preferidos, esses epítopos peptídicos são capazes de estimular células produtoras de INF-γ numa população de PBLs de um doente com doença oncológica em que a survivina seja expressa.

Além disso, poderá ser vantajoso levar a cabo alterações pós-translacionais nos péptidos da invenção. Tem sido demonstrado que a exposição de células MCF-7 de carcinoma da mama ou de células HeLa de carcinoma cervical a agentes anticancerosos incluindo Adriamycin, Taxol, ou UVB resultou 24 num aumento de 4 a 5 vezes da expressão de survivina. As alterações nos níveis de survivina após tratamento anticanceroso não envolveram a modulação da expressão de ARNm de survivina e foram independentes da transcrição génica de novo. Reciprocamente, a inibição da fosforilação da survivina em Thr34 pelo flavopiridol, um inibidor da quinase dependente de ciclina, resultou na perda de expressão de survivina, e a survivina não fosforilável Thr34->Ala exibiu uma eliminação acelerada em comparação com a survivina de tipo selvagem. A ablação sequencial da fosforilação da survivina em Thr aumentou a apoptose das células tumorais induzida pelos agentes anticancerosos independentemente do p53 e suprimiu o crescimento tumoral sem toxicidade num modelo de xenotransplante do cancro da mama in vivo. Estes dados sugerem que a fosforilação Thr34 regula decisivamente os níveis de survivina em células tumorais e que a ablação sequencial da actividade da quinase p34cdc2 poderá remover o ponto de controlo da viabilidade da survivina e aumentar a apoptose em células tumorais. Da mesma maneira, prevê-se que os péptidos derivados de survivina da invenção abranjam péptidos fosforilados. Podem-se identificar antigénios fosfopeptídicos de survivina nativos fazendo um rastreio da presença de padrões de ligação de péptidos do MHC ao redor do sítio de fosforilação Thr34. Assim sendo, sequências de fosfopéptidos derivados de survivina incluem TPERMAEAGF, um putativo antigénio peptídico restrito a HLA-B35 e/ou HLA-B7 e/ou HLA-B51. Outros fosfopéptidos nativos aqui abrangidos incluem: HLA-A2: CACTPERMA e CTPERMAE A; HLA-A3: FLEGCACT P; HLA-B7/HLA-B35/HLA-B51: WP FL EGCACT (resíduo de Thr fosforilado assinalado a negrito). 25

Outros modos de realização da invenção fornecem composições farmacológicas compreendendo ainda uma proteína imunogénica ou um fragmento peptídico seleccionado de entre uma proteína ou fragmento peptídico que não pertença ou seja derivado da família da proteína survivina.

Em modos de realização específicos, entre essas outras proteínas ou fragmentos peptídicos estão, entre outros, as proteínas envolvidas na regulação da apoptose celular ou fragmentos peptídicos derivados. Exemplos adequados dessas proteínas podem ser seleccionados a partir da família de proteínas Bcl-2, por exemplo, a proteína Bcl-2, a proteína Bcl-w, a proteína Mcl-1, a proteína Bcl-XL, e fragmentos peptídicos derivados de qualquer uma das proteínas. Outros inibidores da apoptose conhecidos incluem membros da família de proteínas inibidoras da apoptose (IAP) como a X-IAP, C-IAP1 e C-IAP2. Estas proteínas são todas em geral ubiquamente expressas, enquanto o polipéptido ML-IAP, inibidor da apoptose tem uma expressão de algo selectiva, e é detectado predominantemente em melanomas. Por conseguinte, os fragmentos de ML-IAP capazes de desencadear uma resposta de células T específica, isto é, uma resposta de células T citotóxicas ou uma resposta de células T auxiliares podem ser opcionalmente incluídos na composição da presente invenção. Fragmentos peptídicos úteis de ML-IAP incluem ML-IAP245 (RLQEERTCKV) (SEQ ID NO:75), ML-IAP28o (QLCPICRAPV) (SEQ ID NO: 76), ML-IAPgo (RLASFYDWPL) (SEQ ID NO: 77), ML-IAP154 (LLRSKGRDFV) (SEQ ID NO: 78), ML-IAP23o (VLEPPGARDV) (SEQ ID NO:79), ML-IAP98 (PLTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 80), ML-IAP34, (SLGSPVLGL) (SEQ ID NO: 81), ML-IAP54 (QILGQLRPL) (SEQ ID NO:82), ML-IAP99 (LTAEVPPEL) (SEQ ID NO: 83), ML-IAP83 (GMGSEELRL) (SEQ ID NO: 84) e ML-IAP20o (ELPTPRREV) (SEQ ID NO:85). 26

Adicionalmente, a composição de acordo com a presente invenção pode ser fornecida como uma vacina de múltiplos epitopos compreendendo epitopos restritos à classe I e/ou epitopos restritos à classe II, conforme definido anteriormente.

Exemplos de uma vacina de múltiplos epitopos actualmente preferida incluem combinações «feitas à medida» de epitopos peptidicos derivados de survivina dependendo do tipo de tecido de determinado doente, por exemplo, um indivíduo que possua fenótipos HLA-A2, HLA-A3 e HLA-B35 poderia ser vacinado com uma vacina compreendendo surlM2, sur9, surl8KlO, sur46Y9, sur5lY9. Adicionalmente, a composição farmacológica da invenção pode compreender vantajosamente pelo menos uma outra proteína imunogénica ou um fragmento peptídico derivado seleccionado de uma proteína ou de um fragmento peptídico que não pertença ou seja derivado da proteína survivina. Em modos de realização específicos, a proteína imunogénica ou o fragmento peptídico desta é derivado a partir da família de proteínas Bcl-2, conforme descrito anteriormente. Um outro péptido imunogénico derivado de Bcl-2 é um péptido restrito aos HLA-A2 que possui uma sequência seleccionada de entre as seguintes: Bcl 172, Bcli80/ BCI2O8 Θ BCI214 ·

Dado que os péptidos da invenção são moléculas relativamente pequenas, poderá ser necessário combinar nessas composições os péptidos com diferentes materiais como adjuvantes para produzir vacinas, composições imunogénicas, etc. Adjuvantes são, em termos gerais, substâncias que promovem respostas imunitárias. Frequentemente, o adjuvante de eleição é o adjuvante de Freund completo ou incompleto, ou organismos de B. pertussis mortos, utilizados, por exemplo, em combinação 27 com antigénios precipitados com alume. Goding fornece uma análise geral sobre adjuvantes em Monoclonal Antibodíes: Principies & Practice (2.a edição, 1986), nas páginas 61-63. Goding descreve, porém, que, se o antigénio em questão for de baixo peso molecular ou for pouco imunogénico, é recomendado que o seu acoplamento a um transportador imunogénico. Exemplos dessas moléculas transportadoras incluem hemocianina de búzio, albumina de soro bovino, ovalbumina e imunoglobulina de galinha. Também se sugeriu a utilidade de vários extractos de saponina como adjuvantes em composições imunogénicas. Propôs-se recentemente a utilização do factor estimulador de colónias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF), uma citocina conhecida, como um adjuvante (WO 97/28816).

Consequentemente, a invenção abrange uma composição terapêutica compreendendo ainda qualquer substância adjuvante incluindo qualquer uma das acima referidas ou suas combinações. Também se prevê que o antigénio, isto é, o péptido da invenção e o adjuvante possam ser administrados separadamente em qualquer sequência apropriada. A escolha do antigénio na composição farmacológica da invenção dependerá de parâmetros determináveis por qualquer pessoa com experiência na arte. Conforme mencionado, cada um dos diferentes péptidos da invenção é apresentado nas superfícies celulares por uma determinada molécula HLA. Sendo assim, se o indivíduo a ser tratado for tipado em relação ao fenótipo HLA, será(ão) seleccionado(s) um ou vários péptidos que são conhecidos por se ligarem a essa molécula HLA em particular.

Em alternativa, o antigénio em causa é seleccionado com base na prevalência dos vários fenótipos HLA numa dada 28 população. Por exemplo, o HLA-A2 é o fenótipo mais prevalente na população caucasiana, e, por conseguinte, uma composição que contenha um péptido derivado de survivina que se liga ao HLA-A2 será activa numa grande parte dessa população. Contudo, a composição da invenção também poderá conter uma combinação de dois ou mais péptidos derivados de survivina, interagindo cada um especificamente com uma molécula HLA diferente, de modo a cobrir uma parte maior da população-alvo. Assim, como exemplo, a composição farmacológica poderá conter uma combinação de um péptido restrito a uma molécula HLA-A e um péptido restrito a uma molécula HLA-B, incluindo, por exemplo, as moléculas HLA-A e HLA-B que correspondem à prevalência de fenótipos HLA na população-alvo, como por exemplo HLA-A2 e HLA-B35. Adicionalmente, a composição pode compreender um péptido restrito a uma molécula HLA-C.

Prevê-se que as composições imunogénicas úteis das invenções possam compreender, além de um péptido derivado de survivina conforme aqui definido, uma quantidade imunologicamente eficaz da proteína survivina conforme aqui definido ou um fragmento imunogénico derivado. A quantidade de péptido imunogénico da invenção na composição farmacológica pode variar, dependendo da utilização em particular. Contudo, uma dose única do imunogénio está preferencialmente entre os tn 2- o \—1 e os 5000 pg, mais preferencialmente entre 50 pg e 2500 pg, como entre 100 pg e 1000 pg. Os modos de administração incluem a administração intradérmica, subcutânea e intravenosa, a implantação sob a forma de uma formulação de libertação prolongada, etc. Aqui se abrangem todas as formas de administração conhecidas na arte. Também estão abrangidas todas as formas de dosagem convencionais conhecidas na 29 técnica por serem apropriadas para formular composições peptídicas imunogénicas injectáveis, como formas liofilizadas e soluções, suspensões ou emulsões contendo, se necessário, componentes excipientes, diluentes, conservantes, adjuvantes, tampões, etc. convencionais farmacologicamente aceitáveis. 0 efeito imunoprotector da composição da invenção pode ser determinado utilizando várias abordagens. Nos exemplos que se seguem, fornecem-se exemplos dessas abordagens. Um outro exemplo de como determinar uma resposta de CTL provocada pela composição imunogénica é fornecido em WO 97/28816, supra. Também se pode determinar uma resposta imunitária bem-sucedida pela ocorrência de reacções DTH após a imunização e/ou a detecção de anticorpos que reconhecem especificamente o(s) péptido(s) da composição de vacina.

Em modos de realização preferidos, a composição farmacológica da invenção é uma composição imunogénica ou uma vacina capaz de desencadear uma resposta imunitária contra uma doença oncológica. A expressão «composição imunogénica ou vacina», tal como é aqui utilizada, refere-se a uma composição que desencadeia pelo menos um tipo de resposta imunitária dirigida contra células cancerosas. Assim sendo, uma resposta imunitária desse tipo pode ser qualquer uma das mencionadas anteriormente: Uma resposta de CTL em que são gerados CTLs com capacidade de reconhecer o complexo HLA/péptido apresentado nas superfícies celulares resultando na lise celular, isto é, a vacina desencadeia no indivíduo vacinado a produção de células T efectoras que têm um efeito citotóxico contra as células cancerosas; uma resposta de células B que dá origem à produção de anticorpos antineoplásicos; e/ou uma resposta imunitária do tipo DTH. 30

Em modos de realização úteis, desencadeia-se uma resposta imunogénica dirigida contra uma doença oncológica através da administração do péptido da invenção, quer carregando moléculas MHC classe I em células apresentadoras de antigénio (APCs) do doente, isolando PBLs do doente e incubando as células com o péptido antes de injectar as células novamente no doente, quer isolando as APCs precursoras do doente e diferenciando as células em APCs profissionais utilizando citocinas e antigénio antes de injectar as células novamente no doente. Por conseguinte, num dos modos de realização da presente invenção, um método para tratar doentes oncológicos é um método em que o péptido é administrado através da apresentação do péptido às células apresentadoras de antigénio do doente (APCs) ex vivo, seguida da injecção das APCs assim tratadas novamente no doente. Há pelo menos dois métodos alternativos de realizar este modo de realização. Uma alternativa consiste em isolar APCs do doente oncológico e incubar (carregar) as moléculas MHC classe I com o péptido. Carregar as moléculas MHC classe I significa incubar as APCs com o péptido de modo a que as APCs com as moléculas MHC classe I especificas para o péptido se liguem ao péptido e tenham, por conseguinte, capacidade de o apresentar às células T. Subsequentemente, as APCs são novamente injectadas no doente. Uma outra alternativa baseia-se nas recentes descobertas no campo da biologia das células dendriticas. Neste caso, os monócitos (sendo precursores de células dendriticas) são isolados do doente e diferenciados in vitro em APCs profissionais (ou células dendriticas) através da utilização de citocinas e antigénios. Este processo é descrito nos Exemplos 3 e 5, em que PBLs aderentes (sendo na maioria monócitos) são cultivados in vitro juntamente com GM-CSF, IL-4 e THF-a. 31

Subsequentemente, as DCs geradas in vitro são pulsadas com o péptido e injectadas no doente.

Devido ao facto de a survivina ser expressa aparentemente na maioria das formas de cancro, é muito provável que as vacinas da invenção possam ser utilizadas para controlar qualquer tipo de doença oncológica em que a survivina seja expressa. Assim sendo, como exemplos, a composição de vacina da invenção é imunologicamente activa contra uma neoplasia hematopoiética incluindo leucemia linfática crónica e leucemia mielóide crónica, melanoma, cancro da mama, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do pâncreas e cancro da próstata. A partir da anterior descrição, o especialista reconhecerá prontamente que os péptidos da invenção são úteis como ferramentas de diagnóstico oncológico, em particular por os péptidos serem derivados da survivina expressa em todos os tipos de cancro. Assim sendo, os péptidos da invenção fornecem a base para desenvolver procedimentos de diagnóstico e de prognóstico universalmente aplicáveis em relação a doenças cancerosas. Por conseguinte, noutros modos de realização úteis da composição da invenção, existe uma composição para o diagnóstico ex vivo ou in situ da presença destas doenças cancerosas, num doente oncológico, por exemplo, com base na detecção de células T reactivas à survivina entre os PBLs ou em tecidos tumorais.

Num aspecto, a invenção fornece um complexo de um péptido da invenção e uma molécula HLA classe I ou um fragmento de uma dessas moléculas útil como reagente diagnóstico conforme acima descrito. 0 complexo é produzido através que quaisquer meios convencionais, incluindo os descritos nos 32 exemplos que se seguem. Esse complexo poderá ser quer monomérico quer multimérico. A presente invenção fornece um meio para aliviar ou curar uma doença oncológica. Consequentemente, um aspecto adicional da invenção é a utilização dos péptidos da forma definida anteriormente para a preparação de um medicamento para o tratamento de cancro. Um aspecto importante da invenção diz respeito à utilização do péptido definido acima para a preparação de um medicamento para o tratamento do cancro. De preferência, uma doença oncológica associada à expressão da survivina, incluindo como exemplos: uma neoplasia hematopoiética incluindo leucemia linfática crónica e leucemia mielóide crónica, melanoma, cancro da mama, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do pâncreas e cancro da próstata. A utilização compreende a administração a um doente que sofra da doença de uma quantidade eficaz da composição farmacológica de acordo com a invenção, uma molécula com capacidade de se ligar especificamente a um péptido da invenção e/ou uma molécula com capacidade de bloquear a ligação de uma molécula desse tipo.

Em alguns casos, será apropriado combinar a utilização da invenção com um tratamento de cancro convencional, como a radioterapia ou a quimioterapia. A invenção será agora descrita em mais pormenor, não sendo limitada pelos exemplos e as figuras, em que: A Fig. 1 ilustra a resposta de células T, conforme medida num teste ELISPOT no doente CLLl, a nenhum péptido, ao péptido Surl (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) e ao péptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO:3). Estimularam-se PBLs uma vez com o péptido antes de se colocarem 6 x 105 células por poço em 33 duplicado. Calculou-se o número médio de manchas por péptido utilizando uma câmara CCD e um sistema informático; A Fig. 2 ilustra a resposta de células T, conforme medida num teste ELISPOT no doente CLLl, a nenhum péptido, ao péptido análogo SurlL2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO:4), e ao péptido análogo SurlM2 (lmlgeflkl, seq id no:5). Estimularam-se PBLs uma vez com o péptido antes de se colocarem 104 células por poço em duplicado. Calculou-se o número médio de manchas por péptido utilizando uma câmara CCD e um sistema informático; A Fig. 3 mostra as respostas, conforme medidas num teste ELISPOT nos doentes CLL2 e CLL3, a nenhum péptido (barra preta), ao péptido Surl (LTLGEFLKL, SEQ ID NO:10) (barra cinzenta), ao péptido Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO:3) (barra branca), ao péptido análogo SurlL2 (LLLGEFLKL, SEQ ID NO:4) (barra cinzenta-clara), e ao péptido análogo SurlM2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO:5) (barra cinzenta-escura). Cada experiência foi realizada com 105 células por poço em duplicado e calculou-se o número médio de manchas; A Fig. 4 representa células T que foram isoladas a partir de nódulos linfáticos infiltrados por tumor dos doentes Mell, Mel2 e Mel3, que foram estimuladas uma vez in vitro e analisadas num teste ELISPOT quanto à resposta a nenhum péptido (barra preta), aos péptidos Surl (LTLGEFLKL, SEQ ID NO:10) (barra cinzenta) e Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO:3) (barra branca). Cada experiência foi realizada em duplicado com 105 células por poço. Em cada experiência incluiram-se também dois poços sem nenhuma adição de péptido. Calculou-se o número médio de manchas por péptido para cada doente; A Fig. 5 mostra a actividade funcional de CTLs específicos para survivina. Os CTLs foram isolados a partir de um nódulo linfático infiltrado por melanoma utilizando 34 microesferas magnéticas revestidas por survivina. (A) Lise especifica de linhagens celulares de melanoma; a FM3 HLA-A2 positiva (triângulo) e a FM45 HLA-A2 negativa (quadrado). (B) Lise especifica de linhagens celulares de cancro da mama; a MCF-7 HLA-A2 positiva (triângulo) e a BT-20 HLA-A2 negativa (quadrado); A Fig. 6 mostra a frequência de CTLs reactivos à survivina em PBL de doentes com cancro da mama. Examinou-se a reactividade em três doentes com cancro da mama (primeiro, segundo e terceiro gráficos, respectivamente) através do teste ELISPOT. Para cada um dos doentes, os ensaios foram realizados na ausência de péptido, na presença do péptido surl, na presença do péptido sur9, e na presença do péptido surlM2 modificado. Utilizaram-se 1 χ 104 células efectoras por poço. 0 gráfico representa a quantidade das células reactivas; as colunas cinzentas representam o número médio de células produtoras de INF-γ; A Fig. 7 ilustra a ligação de HLA-35 de péptidos derivados de survivina e a análise da recuperação mediada por péptidos de moléculas HLA-B35 por parte de péptidos derivados de survivina. Incubaram-se a 4 °C lisados de células T2-B35 marcadas metabolicamente na presença de 50, 5, 0,5, 0,05 e 0,005 mM de péptido. Analisou-se a recuperação de HLA-B35 num teste de aglomeração e quantificou-se subsequentemente com electroforese em gel IEF, utilizando o software imageGauge Phosphorimager (FUJI photo film Co., LTD., Japão). O valor C5o é a concentração do péptido necessária para alcançar metade da ligação máxima ao HLA-B35; A Fig. 8 mostra as respostas de células T espontâneas observadas em PBLs de doentes oncológicos. A) O número de células produtoras de manchas de lFN-γ medido com o teste 35 ELISPOT sem péptido (barras brancas), com sur51-59 (barras pretas) ou sur46-54 (barras cinzentas), entre os PBLs estimulados in vitro dos doentes CLL5 (105 células/poço), HEM12 (105 células/poço) e HEM8 (5 x 104 células/poço). B) 0 número de células produtoras de manchas de entre 1,7 x 105 PBLs do HEM12, cultivadas durante 10 dias com células dendriticas autólogas maduras pulsadas com péptido. As colunas representam a média das duas medições; A Fig. 9 demonstra respostas de células T espontâneas contra péptidos de survivina nativos e modificados em doentes com melanoma. A) O número de células produtoras de manchas medido num teste ELISPOT em relação aos sur51-59 e sur5lY9 do doente FM25 em PBLs (4 x 103 células/poço) e TlLs (7 x 104 células/poço), bem como TiLs do FM45 (104 células/poço). B) O número de células produtoras de manchas medido num teste ELISPOT em relação aos sur46 e sur46Y9 medido em TlLs do FM47 (5 x 103 células/poço) . As colunas representam a média das duas medições com a subtracção da libertação de IFN-γ não especifica; A Fig. 10 ilustra a afinidade de ligação de péptidos derivados de survivina ao HLA-Al. Quantificaram-se as bandas de cadeias pesadas de MHC classe I num Phosphorimager. A quantidade de cadeia pesada de HLA-Al estabilizada está directamente relacionada com a afinidade de ligação do péptido adicionado. A recuperação mediada por péptido de HLA-Al (unidades arbitrárias) induzida por 40, 4, 0,4, 0,04 μΜ de Sur93-101 (linha), Sur93T2 (quadrado), Sur49-58 (círculo) ou Influenza A, PB1 591-599 (triângulo); A Fig. 11 mostra respostas espontâneas contra péptidos restritos ao HLA-Al. As respostas de células T espontâneas contra péptidos derivados de survivina conforme medidas através do teste ELISPOT. O número médio de manchas de IFN- 36 γ específicas para os péptidos produzido em resposta ao Sur92-101, Sur38Y9, Sur47YlO, e Sur93T2 de entre 5 x 104 PBL ou TIL estimulados in vitro de doentes com melanoma. As respostas específicas para os péptidos apresentadas foram observadas entre as análises de 6 amostras de PBL e 3 mostras de TIL de doentes com melanoma (Mel). Subtraíram-se as manchas de IFN-γ não específicas. Barras: intervalo dos duplicados; A Fig. 12 mostra respostas espontâneas contra péptidos restritos ao HLA-All. As respostas de células T espontâneas contra péptidos derivados de survivina conforme medidas através do teste ELISPOT. 0 número médio de manchas de IFN-γ específicas para os péptidos produzido em resposta ao Sur53-62 de entre 5 x 104 PBL ou TIL estimulados in vitro de doentes oncológicos. As respostas específicas para os péptidos apresentadas foram observadas entre as análises de 5 doentes com melanoma (Mel) (5 PBL, 1 TIL) e 2 doentes com CLL (CLL) (PBL). Subtraíram-se as manchas de IFN-γ não específicas. Barras: intervalo dos duplicados; A Fig. 13 ilustra respostas espontâneas contra péptidos restritos ao HLA-A3. As respostas de células T espontâneas contra péptidos derivados de survivina conforme medidas através do teste ELISPOT. 0 número médio de manchas de IFN-γ específicas para os péptidos produzido em resposta ao Surl8K10 de entre 5 x 104 PBL ou TIL estimulados in vitro de doentes com melanoma. As respostas específicas para os péptidos apresentadas foram observadas entre as análises de 23 amostras de PBL e 4 amostras de TIL de doentes com melanoma (Mel). Subtraíram-se as manchas de IFN-γ não específicas. Barras: intervalo dos duplicados; A Fig. 14 ilustra respostas espontâneas contra péptidos restritos ao HLA-A2. As respostas de células T espontâneas 37 contra péptidos derivados de survivina conforme medidas através do teste ELISPOT. 0 número médio de manchas de IFN-γ especificas para os péptidos produzido em resposta ao péptido llmer, Surl8-28 de entre 5 x 104 PBL estimulados in vitro de doentes oncológicos. As respostas especificas para os péptidos apresentadas foram observadas entre as análises de 10 amostras de PBL de 2 doentes com melanoma (Mel), 6 doentes com CLL (CLL) e 2 doentes com carcinoma da mama (MC). Subtrairam-se as manchas de IFN-γ não especificas. Barras: intervalo dos duplicados; A Fig. 15 ilustra respostas espontâneas de células T contra péptidos derivados de survivina conforme medidas através do teste ELISPOT. O número médio de manchas de IFN-γ especificas para os péptidos produzidas em resposta ao sur6-14 (LPPAWQPFL) entre 105 PBL estimulados in vitro de cinco doentes com melanoma (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), dois doente com CLL (CLLl, CLL54) e dois doentes com cancro da mama (mamai1, mamai5). Subtraíram-se as manchas de IFN-γ não específicas; A Fig. 16 ilustra os valores laboratoriais da detecção estável de LDH, colinesterase, creatinina, hemoglobina, leucócitos e trombócitos após terapêutica de vacinação de quatro doentes (A RW, · KN, — WWE, GB) ; e A Fig. 17 demonstra a análise cinética da imunidade para péptidos de survivina determinada através de INF-γ ELISPOT. Obtiveram-se PBMCs antes da primeira vacinação de DC e três meses depois. Representam-se os números de células produtoras de manchas de IFN-γ acima do valor basal.

No seguinte quadro enumeram-se as sequências de aminoácidos para os péptidos aqui utilizados e os seus respectivos SEQ ID NOs: 38

SEQUÊNCIA SEQ ID NO: DESIGNAÇÃO 1 Sur6 FLKLDRERA 2 Sur8 TLPPAWQPFL 3 Sur9 ELTLGEFLKL 4 SurlL2 LLLGEFLKL 5 SurlM2 LMLGEFLKL 6 Sur 46-54 CPTENEPDL 7 Sur51-59 EPDLAQCFF 8 Sur46Y9 CPTENEPDY 9 sur5lY9 EPDLAQCFY 10 Surl LTLGEFLKL 11 Cl ILKEPVHGV 12 Sur2 RAIEQLAAM 13 Sur3 KVRRAIEQL 14 Sur4 STFKNWPFL 15 Sur5 SVKKQFEEL 16 Sur7 TAKKVRRAI 17 SurlO ETAKKVRRAI 18 Sur 6-14 19 Sur 11-19 QPFLKDHRI 39

SEQUÊNCIA SEQ ID NO: DESIGNAÇÃO 20 Sur34-43 TPERMAEAGF 21 C24 22 Surl4-22 LKDHRISTF 23 Sur38-46 MAEAGFIHC 24 Sur93-101 FEELTLGEF 25 Sur47-56 PTENEPDLAQ 26 Sur4 9-58 ENEPDLAQCF 27 Sur92-101 FEELTLGEF 28 Cl VSDGGPNLY 29 surl4Y9 LKDHRISTY 30 sur93Y9 FEELTLGEY 31 sur92Y9 QFEELTLGEY 32 sur34Y9 TPERMAEAGY 33 sur4 9Y9 ENEPDLAQCY 34 Sur92T2 QTEELTLGEF 35 Sur92S2 QSEELTLGEF 36 Sur93T2 FTELTLGEF 37 Sur93S2 FSELTLGEF 38 Sur38Y9 MAEAGFIHY 40

SEQUÊNCIA SEQ ID NO: DESIGNAÇÃO 39 Sur4 7Y10 PTENEPDLAY 40 Sur5-13 TLPPAWQPF 41 Sur 53-61 DLAQCFFCF 42 Sur 54-62 DLAQCFFCFK 43 Sur 95-103 ELTLGEFLK 44 Sur 112-120 KIAKETNNK 45 Sur 13-22 FLKDHRISTF 47 Sur 53-62 DLAQCFFCFK 50 Sur 103-112 KLDRERAKNK 51 Sur 112-121 KIAKETNNKK 52 Sur 113-122 IAKETNNKKK 53 C3 ILRGSVAHK 54 Sur5K9 TLPPAWQPK 55 Sur53K9 DLAQCFFCK 56 Sur54L2 LLQCFFCFK 57 Surl3K9 FLKDHRISTK 58 Surl8KlO RISTFKNWPK 59 Surll3L2 ILKETNNKKK 60 SurEx3-A3-l TIRRKNLRK 41

SEQUÊNCIA SEQ ID NO: DESIGNAÇÃO 61 SurEx3-A3-2 PTIRRKNLRK 62 Sur2b-A3-1 RITREEHKK 63 C4 AVFDRKSDAK 64 C6 QPRAPIRPI 65 Cl RPPIFIRRL 66 Sur4-14 PTLPPAWQPFL 67 Surl8-28 RISTFKNWPF 68 Sur54-64 LAQCFFCFKEL 69 Sur86-96 FLSVKKQFEEL 70 Sur88-98 SVKKQFEELTL 71 Surl03-113 KLDRERAKNKI 72 Ebv. BMLF1 GLCTLVAML 73 Hiv. Pol ILKEPVHGV 74 Influenza A, nucleoproteína265-273 ILRGSVAHK EXEMPLO 1

Identificação de uma resposta de linfócitos T citotóxicos à proteína inibidora da apoptose, a survivina, em doentes oncológicos Resumo

Utilizando epítopos de CTL derivados de survivina, estudou-se a reactividade específica das células T contra esses 42 antigénios no sangue periférico de doentes com leucemia linfática crónica (CLL) e em nódulos linfáticos infiltrados com tumor de doentes com melanoma, através de teste ELISPOT. Detectaram-se respostas de CTL aos epitopos de péptidos derivados de survivina em três dos seis doentes com melanoma e em três dos quatro doentes com CLL. Não se detectou nenhuma reactividade das células T nos PBLs de seis controlos saudáveis. Assim sendo, os péptidos derivados de survivina poderão servir como alvos importantes e amplamente aplicáveis para estratégias imunoterapêuticas contra o cancro.

Introdução A proteina survivina foi rastreada quanto à presença de padrões de ligação de péptidos HLA-A*0201 (HLA-A2) e, depois de identificados, os péptidos foram utilizados para testar a reactividade especifica de células T em doentes com leucemia e melanoma através do teste ELISPOT. Detectaram-se, em ambos os grupos de doentes, respostas de CTL a dois epitopos de péptidos derivados de survivina, ao passo que não se encontrou nenhuma reactividade de células T nos controlos saudáveis. Estes dados sugerem que a survivina representa um antigénio tumoral amplamente expresso reconhecido por células T autólogas. Materiais e métodos

Doentes e controlos normais

Recolheram-se para tubos heparinizados amostras de sangue venoso periférico de 4 doentes diagnosticados com CLL (designados por CLL1-4) e amostras sanguíneas de 6 indivíduos normais. Isolaram-se PBLs, utilizando separação 43

Lymphoprep, e depois congelaram-se em soro fetal bovino (FCS) com 10% de dimetilsulfóxido. Adicionalmente, obtiveram-se linfócitos T de nódulos linfáticos infiltrados com tumor a partir de 6 doentes com melanoma (designados por mell-6). Picaram-se nódulos linfáticos acabados de ressecar em fragmentos pequenos, sendo depois esmagados para libertar células para cultura e depois criopreservados. Havia disponíveis PBLs de 4 doentes com melanoma. Todos os indivíduos incluídos eram HLA-A2 positivos, como se determinou por análise FACS utilizando o anticorpo BB7.2 especifico para o HLA-A2. O anticorpo foi purificado a partir do sobrenadante de hibridoma. As amostras dos doentes foram obtidas no State University Hospital, Herlev, na Dinamarca. Obteve-se o consentimento informado dos doentes antes de qualquer destes procedimentos. Péptidos derivados de survivina

Todos os péptidos foram obtidos na Research Genetics (Huntsville, AL, EUA) e fornecidos com um grau de pureza >90%, como se verificou por HPLC e análise MS. No Quadro 1 apresentam-se os péptidos utilizados.

Quadro 1. Péptidos analisados neste estudo e a sua afinidade de ligação ao HLA-A2

Nome Proteína5 Sequência SEQ ID NO: 05ο(μΜ)" Cl HIV-1 POI476-484 ILKEPVHGV 11 0.7 Surl Survivina96-io4 LTLGEFLKL 10 >100 44

Sur2 Survivinai33-i4i RAIEQLAAM 12 Sem ligação Sur3 Survivinai3o-i38 KVRRAIEQL 13 >100 Sur4 Survivina2o-28 STFKNWPFL 14 Sem ligação Sur5 Survivina88-96 SVKKQFEEL 15 Sem ligação Sur6 Survivinaioi-109 FLKLDRERA 1 30 Sur7 Survivinai27-i35 TAKKVRRAI 16 Sem ligação Sur8 Survivina5_i4 TLPPAWQPFL 2 30 Sur9 Survivina95-io4 ELTLGEFLKL 3 10 SurlO Survivinai26-i35 ETAKKVRRAI 17 Sem ligação SurlL2 LLLGEFLKL 4 1 SurlM2 LMLGEFLKL 5 1 a0 intervalo de valores apresentado em subscrito indica a posição do péptido na sequência de survivina, tal como descrito na patente US 6.245.523 b0 valor C5o é a concentração do péptido necessária para alcançar metade da ligação máxima ao HLA-A2 determinado da forma descrita abaixo.

Teste de aglomeração para a ligação de péptidos a moléculas MHC classe I

Conduziram-se testes de aglomeração para a ligação dos péptidos sintéticos a moléculas MHC classe I metabolicamente marcadas com [35S]-metionina da forma descrita (12, 13) . 0 teste de aglomeração baseia-se na 45 estabilização das moléculas classe I depois de carregamento do péptido na linhagem celular T2 deficiente em transportadores peptidicos Subsequentemente, são imunoprecipitadas cadeias pesadas mhc estáveis correctamente enroladas utilizando anticorpos dependentes de conformação. Depois da electroforese IEF, foram expostos géis a telas Phosphorlmager, e quantificou-se a ligação de péptidos utilizando o programa Imagequant Phosphorlmager (Molecular Dynamics, Sunnyvale, CA).

Estimulação antigénica de PBLs

Para alargar a sensibilidade do teste ELISPOT, estimularam-se PBLs uma vez in vitro antes da análise (14, 15) . PBLs frescos e previamente congelados apresentaram resultados semelhantes no teste ELISPOT. No dia 0, os PBLs ou nódulos linfáticos esmagados foram descongelados e colocados a 2 ml/poço numa concentração de 2xl06 células em placas de 24 poços (Nunc, Dinamarca), num meio AIM V (Life Technologies, Roskilde, Dinamarca), 5% de soro humano inactivado pelo calor e 2 mM de L-glutamina, na presença de 10 μΜ de péptido. Em cada experiência, incluiu-se um poço sem péptido. Dois dias depois, adicionaram-se às culturas 300 Ul/ml de interleucina-2 recombinante (IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemanha). Testaram-se as células cultivadas quanto à sua reactividade no teste ELISPOT, no dia 12.

Teste ELISPOT 0 teste ELISPOT utilizado para quantificar células efectoras libertadoras de interferão-γ específicas para o epítopo peptídico foi realizado como em (16). Em resumo, revestiram-se placas de 96 poços com fundo de nitrocelulose 46 (MultiScreen ΜΑΙΡ N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) com anticorpos anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suécia). Os poços foram lavados, bloqueados por um meio AIM V, e as células foram adicionadas em duplicado em diferentes concentrações celulares. Depois, adicionaram-se péptidos a cada poço e as placas foram incubadas de um dia para o outro. No dia seguinte, o meio foi descartado e os poços foram lavados antes da adição do anticorpo secundário biotinilado (7-B6-l-Biotin, Mabtech). As placas foram incubadas durante 2 horas, lavadas e adicionou-se conjugado enzimático Avidin (AP-Avidin, Calbiochem, Life Technologies) a cada poço. As placas foram incubadas a TA durante 1 hora e o substracto enzimático NBT/BCIP (Gibco, Life Technologies) foi adicionado a cada poço e incubado a temperatura ambiente durante 5-10 minutos. A reacção foi terminada lavando com água corrente depois do aparecimento de manchas púrpuras-escuras. As manchas foram contadas utilizando o Sistema Alphalmager (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA) e a frequência de CTLs específicos para o péptido pôde ser calculada a partir do número de células que formaram manchas. Os testes foram todos realizados em duplicado para cada antigénio peptídico.

Resultados

Ligação de péptidos derivados de survivina a HLA-A2 A sequência de aminoácidos da proteína survivina foi rastreada quanto aos epítopos peptídicos nona e decaméricos HLA-A2 mais prováveis, utilizando os principais resíduos de ancoragem específicos para o HLA-A2 (17). Dez péptidos derivados de survivina foram sintetizados e analisados quanto à ligação ao HLA-A2. Um epítopo de HIV-1 pol476-484 (ILKEPVHGV, SEQ ID NO:11) (Tabela 1) foi utilizado como 47 controlo positivo. A concentração de péptidos necessária para alcançar metade da recuperação máxima do MHC classe I (valor C50) foi 0,7 μΜ para o controlo positivo. Em comparação, o péptido designado por Sur9 (ELTLGEFLKL, SEQ ID NO: 3) ligou-se com uma afinidade de C50 = 10 μΜ. Os péptidos designados por Sur6 (FLKLDRERA, SEQ ID NO:l) e Sur8 (TLPPAWQPFL, SEQ ID NO:2) ligaram-se, respectivamente, ao HLA-A2 com C50 = 30 μΜ, ao passo que Surl (LTLGEFLKL, SEQ ID NO: 10) e Sur3 (KVRRAIEQL, SEQ ID NO: 13) se ligaram de forma mais fraca (C50 >100 μΜ) . Cinco dos péptidos analisados (Sur2, Sur4, Sur5, Sur7 e SurlO) não se ligaram ao HLA-A2.

Dado que Surl realiza uma ligação fraca ao HLA-A2, sintetizaram-se dois péptidos análogos designados por SurlL2 e SurlM2, respectivamente, em que um resíduo de ancoragem melhor (leucina ou metionina) substituiu a treonina nativa na posição 2. Ambos os péptidos se ligam ao HLA-A2 com uma afinidade elevada muito semelhante ao controlo positivo (C5o = 1 μΜ) .

Resposta de CTL à survivina em doentes com CLL

Estimularam-se PBLs de quatro doentes com CLL HLA-A2 positivos uma vez in vitro antes de análise no teste ELISPOT. Escolheu-se este procedimento para alargar a sensibilidade do ELISPOT. Incluíram-se os 10 péptidos derivados de survivina acima referidos no primeiro grupo de experiência. Detectaram-se respostas ao Surl e ao Sur9 e só para estes péptidos se apresentam dados nas figuras. A Fig. 1 apresenta a reactividade dos CTL ao Surl e ao Sur9, como determinado no doente CLLl. Cada mancha representa uma célula produtora de iNF-γ reactiva ao péptido. O número 48 médio de manchas por péptido foi calculado utilizando uma câmara CCD e um sistema informático. No doente CLLl (Fig. 1), detectaram-se 52 manchas especificas para o péptido Sur9 (depois de subtrair as manchas sem adição de péptido) em cada 6 x 105 células. Não se detectou nenhuma resposta ao péptido Surl com ligação fraca ao HLA-A2, contudo, o doente demonstrou uma resposta forte ao análogo peptidico SurlM2 com ligação forte ao HLA-A2 (35 manchas especificas para o péptido em cada 104 células) (Fig. 2) . Não se detectou nenhuma resposta ao outro análogo peptidico SurlL2 com ligação forte ao HLA-A2 neste doente (Fig. 2) . 0 doente CLL2 teve uma resposta forte ao Sur9 (128 manchas especificas para o péptido em cada 105 células) e uma resposta fraca ao Surl (22 manchas especificas para o péptido em cada 105 células) (Fig. 3) . A resposta ao análogo SurlL2 foi apenas ligeiramente superior em relação ao epitopo natural, ao passo que o doente respondeu de forma igualmente forte ao péptido SurlM2 e ao péptido decamérico Sur9. No doente CLL3, observou-se uma resposta fraca ao Sur9 (Fig. 3). Não se observou nenhuma resposta no doente ao Surl ou aos péptidos Surl modificados. Não se detectaram nenhumas respostas à survivina no último doente, CLL4 (dados não apresentados). Analisaram-se PBLs de 6 controlos saudáveis HLA-A2 positivos para investigar se se podia detectar uma resposta à survivina em indivíduos saudáveis. Não se observou nenhuma resposta em nenhum dos controlos a nenhum dos péptidos derivados de survivina.

Resposta de CTLs à survivina em doentes com melanoma

Analisaram-se linfócitos T isolados de nódulos linfáticos infiltrados por tumor de doentes com melanoma HLA-A2 positivos. Picou-se o nódulo linfático acabado de ressecar 49 em fragmentos pequenos e esmagou-se para libertar células para cultura. As células foram estimuladas uma vez com péptido in vitro antes de análise no teste ELISPOT. Detectaram-se células τ específicas para survivina em três dos seis doentes analisados. Detectou-se uma resposta forte ao Sur9 nos doentes Mel2 e Mel3. Detectou-se uma resposta mais fraca ao péptido Surl nestes doentes (Fig. 4) . No Mell, a resposta ao péptido Surl de ligação mais fraca foi mais forte do que a resposta ao Sur9 que se liga mais fortemente ao HLA-A2 (Fig. 4) . Não se detectou nenhuma resposta nos nódulos linfáticos infiltrados com tumor por parte dos últimos três doentes com melanoma (Mel4-6). Analisaram-se PBLs de dois dos doentes reactivos à survivina, Mell e Mel2, e de dois dos doentes não reactivos, Mel4 e Mel5. Não se detectou nenhuma resposta nem ao Sur9 nem ao Surl em PBLs de nenhum destes doentes (dados não apresentados). EXEMPLO 2

Respostas espontâneas de células T citotóxicas aos epítopos de células T restritos ao MHC classe I derivados de survivina in situ e ex vivo em doentes oncológicos

Resumo

Foram verificadas respostas espontâneas de células T citotóxicas aos epítopos de células T restritos ao MHC classe I derivados de survivina in situ, assim como ex vivo em doentes com cancro da mama, leucemia e melanoma. Além disso, constatou-se que as células T reactivas à survivina isoladas por microesferas magnéticas revestidas com complexos MHC/péptido eram citotóxicas para os tumores HLA 50 compatíveis de diferentes tipos de tecidos. Sendo um antigénio tumoral universal, a survivina pode servir como alvo amplamente aplicável para imunoterapia antineoplásica.

Materiais e métodos

Construção de complexos HLA-péptido para coloração de células T e separação de células T

Expressou-se na E. coli BL21 (DE3) um sítio de reconhecimento para a biotinilação enzimática utilizando ligase de proteína biotina (BirA) em fusão com a extremidade 5' dos domínios extracelulares do HLA A*0201 (resíduos 1-275) . A proteína recombinante foi purificada por cromatografia de exclusão por tamanho (Sephadex G25, Pharmacia) e de troca iónica (mono-Q, Pharmacia) de corpos de inclusão solubilizados em 8 M de ureia. O HLA A*0201 foi enrolado (folded) in vitro através de diluição na presença do péptido de survivina modificado SurlM2 (LMLGEFLKL, SEQ ID NO:5) ou do péptido MAA gpl00154-163, e subsequentemente biotinilado como descrito anteriormente (35, 36).

Depois de filtração em gel numa coluna Pharmacia Sephadex G25 para remover biotina não ligada, a proteína foi multimerizada com moléculas de dextrano conjugadas com estreptavidina-FITC (gentilmente fornecidas por L. Winther, DAKO, Dinamarca) para gerar compostos de HLA-dextrano multivalentes para imunohistoquímica. A construção de HLA A*0201 foi uma gentil oferta do Dr. Mark M. Davis (Dep. de Microbiologia e Imunologia, Stanford University, Paio Alto, CA, EUA) . A separação celular foi levada a cabo como anteriormente descrito (37). Resumidamente, lavaram-se duas vezes 5 x 106 microesferas magnéticas conjugadas com estreptavidina (Dynal, Oslo, Noruega) em 200 μΐ de PBS 51 frio, adicionou-se 0,5 pg de monómeros de péptido/A*0201 e incubou-se a mistura durante 15 min. a temperatura ambiente. Depois de duas lavagens, essas microesferas foram misturadas com PBLs numa razão de 1:10 e subsequentemente incubadas durante 1 hora, a que se seguiu uma precipitação de células ligadas a microesferas num campo magnético. O passo de precipitação foi repetido uma vez.

Colorações imuno-histoquímicas

Para corar com complexos MHC/péptido multiméricos conjugados com FITC, secaram-se secções de tecido de um dia para o outro, e subsequentemente fixaram-se em acetona fria durante 5 min. Todos os passos de incubação foram realizados à temperatura ambiente e no escuro: (i) 45 min. do anticorpo primário (diluição de 1:100), (ii) anticorpo de cabra anti-rato Cy 3-conjugado (diluição de 1:500; código 115-165-100, Jackson ImmunoResearch, obtido a partir de Dianova, Hamburgo, Alemanha) durante 45 min. e finalmente (iii) os multimeros durante 75 min. Entre cada passo, as lâminas foram lavadas duas vezes durante 10 min. em PBS/BSA a 0,1%. As lâminas foram colocadas em Vectashield e mantidas no frigorifico até serem observadas ao microscópio confocal.

Teste de citotoxicidade

Realizaram-se testes de libertação [51Cr] convencionais para a citotoxicidade mediada por CTL da forma descrita em (13) . As células-alvo foram as linhagens de células T autólogas transformadas por EBV, a linhagem celular MCF-7 de cancro da mama HLA-A2 positiva (disponível pela ATCC), a linhagem celular FM3 de melanoma HLA-A2 positiva (38), a 52 linhagem celular BT-20 de cancro da mama HLA-A2 negativa (disponível pela ATCC) e a linhagem celular FM45 de melanoma HLA-A2 negativa (38) . Todas as linhagens celulares cancerosas expressaram survivina, tal como analisado por RT-PCR (dados não apresentados).

Teste ELISPOT 0 teste ELISPOT foi utilizado para quantificar células efectoras libertadoras de IFV-γ específicas para o epítopo peptídico e foi já anteriormente descrito (39) . Resumidamente, revestiram-se placas de 96 poços com fundo em nitrocelulose (MultiScreen MAIP N45, Millipore) com um anticorpo anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Suécia) e bloqueou-se a ligação não-específica utilizando AIM V (GibcoBRL, Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD, EUA). Adicionaram-se linfócitos em diferentes concentrações celulares juntamente com péptidos específicos e células T2 e incubaram-se de um dia para o outro a 37°C. Depois de duas lavagens, adicionou-se o anticorpo de detecção biotinilado (7-B6-1-Biotin, Mabtech) . Visualizou-se a ligação específica utilizando fosfatase alcalina-avidina juntamente com o respectivo substrato (GibcoBRL). A reacção foi terminada depois do surgimento de manchas púrpuras-escuras, que foram quantificadas utilizando o Alphalmager System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA). Os péptidos utilizados para o teste ELISPOT foram Surl, Sur9 e o péptido análogo de Surl, o SurlM2, como descrito no Exemplo 1.

Resultados

Coloração in situ de células T reactivas a HLA-A2/survivina 53

No Exemplo 1, identificaram-se dois epítopos de péptido derivados de survivina reconhecidos por células T na leucemia e melanoma, isto é, Surl. A fraca afinidade de ligação do Surl ao HLA-A2 foi melhorada substancialmente, substituindo a treonina na posição 2 com um melhor resíduo de ancoragem (metionina; SurlM2). Esta medida permitiu a construção de complexos HLA-A2/péptido estáveis. Estes complexos foram multimerizados utilizando moléculas de dextrano, que foram conjugadas com estreptavidina e FITC. Utilizaram-se complexos MHC multimerizados para corar material congelado e fixado em acetona. Utilizando um microscópio confocal a laser, puderam-se detectar prontamente CTLs reactivos a SurlM2/HLA-A*0201 in situ no microambiente tumoral. Marcámos essas células no tumor primário e no nódulo linfático sentinela de um doente com melanoma em estádio III, assim como numa lesão primária de cancro da mama. Para assegurar a especificidade da coloração, levou-se a cabo uma série de controlos negativos. Nem a utilização de multímeros de péptido/HLA-dextrano com péptidos derivados a partir do antigénio de diferenciação de melanoma gplOO no mesmo tumor, nem os multímeros de SurlM2/HLA-dextrano no caso de uma amostra de tumor obtida a partir de um dador HLA-A2 negativo resultaram numa coloração positiva. CTLs isolados reactivos a survivina lisam linhagens de células tumorais de origem diferente

Para caracterizar a capacidade funcional de CTLs reactivos a survivina, isolaram-se estas células por meio de microesferas magnéticas revestidas com complexos HLA-A2/SurlM2 (36). Um nódulo linfático infiltrado por melanoma acabado de ressecar foi picado em fragmentos pequenos e 54 esmagado para libertar células para cultura. As células foram estimuladas uma vez com péptido in vitro antes do isolamento. Um dia depois do isolamento, adicionou-se IL-2 e no dia 5 a capacidade destas células no que diz respeito a matar células tumorais foi testada ou por ELISPOT ou em testes-padrão de libertação de 51Cr. Primeiro, por meio de um teste ELISPOT, foi possível estabelecer que CTLs isolados utilizando o complexo SurlM2/HLA-A2 modificado também responderam ao péptido Surl nativo (dados não apresentados). Em segundo lugar, testou-se a citotoxicidade de CTLs reactivos a survivina contra a linhagem celular FM3 de melanoma HLA-A2 positiva (Fig. 5 A) e a linhagem celular MCF-7 de cancro da mama HLA-A2 positiva (Fig. 5 B) . As células T isoladas lisaram eficazmente ambas as linhagens celulares HLA-A*0201. Em contraste, não se observou nenhuma citotoxicidade contra a linhagem celular FM45 de melanoma HLA-A2 negativa (Fig. 5 A) nem contra a linhagem de celular BT-20 de cancro da mama HLA-A2 negativa (Fig. 5 B).

Reactividade à survivina medida em PBLs por ELISPOT

Analisou-se a presença de células T reactivas à survivina em PBLs de dez doentes com cancro da mama HLA-A2 positivos através de ELISPOT. Antes da análise, estimularam-se PBLs uma vez in vitro para aumentar a sensibilidade da análise. Testou-se a reactividade dos seguintes péptidos de survivina: Surl, Sur9 e SurlM2. Detectaram-se células T específicas para survivina em seis dos dez doentes com cancro da mama HLA-A2 positivos. Na Fig. 6., apresentam-se exemplos representativos. Em PBLs de dois doentes, detectou-se uma resposta contra Surl e o análogo modificado SurlM2, mas não contra Sur9 (Fig. 6, em cima, ao centro), em três doentes detectou-se uma resposta a Sur9, mas não a 55

Surl ou SurlM2 (Fig. 6, em baixo), e um doente respondeu apenas a SurlM2. Em contraste, não se detectaram respostas à survivina em PBLs de 20 dadores saudáveis HLA-A2 positivos. Da mesma forma, analisaram-se PBLs de 14 doentes com melanoma HLA-A2 positivos. Verificou-se resposta à survivina em sete destes doentes (Quadro 2). Dois doentes responderam ao péptido Sur9, três ao péptido SurlM2, um ao Surl e ao SurM2, e um aos três péptidos. No Exemplo 1, testou-se a resposta de células T à survivina em três doentes com leucemia linfática crónica (CLL) (Tabela 2; CLLl, CLL2, CLL3). Estes estudos foram alargados utilizando PBLs de mais três doentes com CLL. Significativamente, todos os doentes produziram uma resposta de células T a pelo menos um epitopo de survivina (Tabela 2; CLL5, CLL6, CLL7).

Além disso, analisaram-se PBLs de um doente que sofria de leucemia mielóide crónica (CML). Neste doente, identificou-se uma resposta aos três péptidos (dados não apresentados). Os dados são resumidos no Quadro 2.

Quadro 2. Doentes com linfócitos T específicos para o péptido de survivina em PBLs, conforme medido por ELISPOT

Melanoma a) Doente Surl Sur9 SurlM2 P 4 - - 97 Pll - - 112 P13 - - 71 56 Ρ15 61 - 101 Ρ17 - 172 - Ρ39 - 127 - Ρ 64 112 70 128 Cancro da mama b) Doente Surl Sur9 SurlM2 BI 122 - 208 B2 67 - 72 B3 - 54 - B4 - 45 - B5 - 19 - B6 - - 24 CLL c) Doente Surl Sur9 SurlM2 CLLl - 27 320 CLL2 - 39 - CLL3 23 127 122 CLL5 - 100 124 CLL6 - 121 360 57 CLL7 68 132 174 a) Frequência de células reactivas por cada 104 ; 14 doentes examinados b) Frequência de células reactivas por cada 104 10 doentes examinados c) Frequência de células reactivas por cada 10 5; i doentes examinados EXEMPLO 3

Respostas imunitárias restritas ao HLA-B35 aos péptidos derivados de survivina em doentes oncológicos

Resumo

Neste estudo, identificaram-se e caracterizaram-se dois epítopos derivados de survivina, que são restritos ao HLA-B35. Verificou-se a presença de reactividade específica de células T contra estes dois epítopos no sangue periférico em doentes com diferentes neoplasias hematopoiéticas e melanoma. As substituições do resíduo de ancoragem c- terminal melhoraram o reconhecimento por parte de linfócitos que infiltram o tumor de doentes com melanoma. Além disso, demonstraram-se respostas espontâneas de células τ citotóxicas à survivina in situ numa lesão primária de melanoma. Estes epítopos alargam a aplicabilidade de futuras estratégias de vacinação baseadas em péptidos de survivina, no que diz respeito a neoplasias, assim como o perfil HLA dos doentes envolvidos. 58

Nos Exemplos 1 e 2, estudaram-se epítopos de células T derivados de survivina restritos ao HLA-A2. Dado que o HLA-A2 só é expresso em cerca de 30% da população caucasiana (63), é preciso identificar os epítopos peptídicos restritos a outras moléculas HLA classe I para alargar a fracção de doentes que podem ser tratados. Neste estudo, identificaram-se dois novos epítopos de células T de survivina restritos ao HLA-B35, que é expresso em 9% da população caucasiana (63), e detectaram-se respostas imunitárias espontâneas a estes péptidos de survivina em doentes com diferentes neoplasias hematopoiéticas e melanoma.

Materiais e métodos

Doentes

Recolheram-se amostras de sangue venoso periférico de doentes oncológicos, isolaram-se PBLs utilizando a separação Lymphoprep, tipados quanto ao HLA (Departamento de Imunologia Clínica, University Hospital, Copenhaga) e congelaram-se em FCS com 10% de DMSO. Seleccionaram-se dez doentes HLA-B35 positivos para mais análise. Esses doentes sofriam de melanoma, CLL, linfoma folicular (FL), linfomas difusos de grandes células B (DLBCL) e mieloma múltiplo (MM), respectivamente. Na altura em que se recolheram as amostras de sangue, os doentes não tinham sido medicados nos quatro meses anteriores. Além disso, recolheram-se linfócitos infiltrados no tumor (TIL) que foram isolados de nódulos linfáticos de três doentes com melanoma e congelaram-se em FCS com 10% de DMSO. 59 Péptidos

Utilizaram-se sete péptidos derivados de survivina sintéticos neste estudo: Sur6-14, Surll-19, Sur34-43, Sur46-54, Sur51-59, Sur46Y9, Sur5lY9 e um péptido derivado de EBV, EBNA3A 457-466 (63). Todos os péptidos foram obtidos a partir de Research Genetics (Huntsville, al) e fornecidos com um grau de pureza > 90%, tal como se verificou nas análises HPLC e MC. Os péptidos estão listados no Quadro 3, seguinte.

Quadro 3. Ligação HLA-B35 de péptidos derivados de survivina

Nome Proteína e posição Sequência SEQ ID NO: C50 (μΜ) Sur6-14 Survivina6-i4 LPPAWQPFL 18 >100 Surll-19 Survivinan-i9 QPFLKDHRI 19 Sem ligação Sur34-43 Survivina34-43 TPERMAEAGF 20 >100 Sur 46-54 Survivina46-54 CPTENEPDL 6 20 Sur51-59 Survivina5i-59 EPDLAQCFF 7 13 Sur46Y9 Péptido modificado CPTENEPDY 8 4 Sur5lY9 Péptido modificado EPDLAQCFY 9 1.5 C24 EBNA3A458-466 YPLHEQHQM 21 O co Teste de aglomeração para a ligação de péptidos a moléculas MHC classe I O teste de aglomeração descrito nos Exemplos 1 e 2 foi utilizado para avaliar a afinidade de ligação dos péptidos sintéticos a moléculas HLA-B35 metabolicamente marcadas com 60 [S35]metionina. Resumidamente, o teste baseia-se na estabilização mediada por péptidos de moléculas HLA vazias libertadas na lise celular, da linhagem celular T2 deficiente em TAP, estavelmente transfectada com HLA-B35 (gentilmente fornecida pelo Dr. J. Haurum, Symphogen ApS, Lyngby, Dinamarca) . Imunoprecipitaram-se moléculas HLA enroladas (folded) utilizando o mAb W6/32 dependente da conformação. As moléculas HLA foram separadas por electroforese IEF, expuseram-se os géis a telas de Phosphorimager (Placa de imagem, FUJI photo film Co., LTD., Japão), sendo depois analisados, e contou-se a quantidade das moléculas HLA correctamente enroladas utilizando o software de Phosphorimager ImageGauge (FUJI photo film Co., LTD., Japão) .

Estimulação antigénica de PBLs

Para alargar a sensibilidade do teste ELISPOT, estimularam-se linfócitos uma vez in vitro com péptidos antes da análise (14, 15). Descongelaram-se e estimularam-se PBLs ou TILs com 50 μΜ dos epitopos peptídicos individuais em placas de 96 poços, durante 2 horas a 26°C (5 x 105-106 células por péptido), e recolheram-se para mais 10 dias de cultura a 37°C em x-vivo com 5% de soro humano (HS), em placas de 24 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca), com 2 x 106 células por poço. No segundo dia de incubação, adicionaram-se 40 pg/ml de IL-2 (Apodan A/S, Dinamarca). No dia 10, as células cultivadas foram testadas quanto à sua reactividade no teste ELISPOT.

O teste ELISPOT 61 0 teste ELISPOT utilizado para quantificar células efectoras libertadoras de iFN-γ especificas para o péptido em PBLs ou TILs recolhidos de doentes oncológicos foi levado a cabo da forma descrita no Exemplo 1. Resumindo, revestiram-se placas de 96 poços com fundo em nitrocelulose (Multi-Screen MAIP N45; Millipore, Hedehusene, Dinamarca) com AcM contra IFN-γ humano, 7,5 μς/πύ. (1-DlK; Mabtech, Nacka, Suécia) . Os poços foram lavados e bloqueados em x-vivo (x-vivo 15TM BioWhittacker, Molecular Applications Aps, Dinamarca) e adicionaram-se células em duplicado em diferentes concentrações. Para a apresentação de antigénios, adicionaram-se, por poço, 104 células T2-B35, com e sem 10 μΜ de péptido. As placas foram incubadas de um dia para o outro, as células descartadas e os poços lavados antes da adição de anticorpo secundário biotinilado (7—B6— 1-Biotin; Mabtech). As placas foram incubadas 2 h a temperatura ambiente, depois lavadas e adicionou-se conjugado de avidina-fosfatase alcalina (AP-Avidin; Calbiochem, Life Technologies, Inc.). Depois de 1 h de incubação a temperatura ambiente, adicionou-se o substrato enzimático azul de nitrotetrazólio/5-bromo-4-cloro-3-indolilfosfato (Código No. K0598, DakoCytomation Norden A/S), e emergiram manchas púrpuras-escuras em 3-7 min. A reacção foi terminada através de lavagem com água corrente. As manchas foram contadas utilizando o Alpha Imager System (Alpha Innotech, San Leandro, CA) , e a frequência das células T especificas para o péptido foi calculada a partir do número de células que formaram manchas.

Todos os testes foram conduzidos em duplicado para cada antigénio peptidico, e testaram-se os linfócitos cultivados no mesmo poço em igual número de células com e sem péptido, 62 para determinar o número de células especificas para o péptido na cultura.

Maturação de células dendriticas (DCs)

As células aderentes foram isoladas a partir de PBLs depois de 2 h de cultura. Estas foram cultivadas durante mais 10 dias, em RPMI 1640 (GibcoTM Invitrogen Corporation, Reino Unido) com 10% de FCS. Adicionaram-se 800 ng/ml de GM-CSF (PreproTech, Londres, Reino Unido) e 40 ng/ml de IL-4 (PreproTech) a cada três dias. No dia 10, as DCs foram amadurecidas durante 24 horas, acrescentando 50 ng/ml de TNF-α (PreproTech). Depois da maturação, as DCs foram libertadas e pulsadas com 20 μΜ de péptido na presença de 3 pg/ml de P2-microglobulina durante 2 h, a 26°C.

Isolamento de células T especificas para o péptido

Isolaram-se células especificas de antigénio utilizando microesferas magnéticas revestidas com sur51Y9/HLA-B35, tal como descrito no Exemplo 2. Monómeros biotinilados de HLA-B35 com sur5lY9 (obtidos a partir de Prolmmune, Oxford, Reino Unido) foram acoplados a microesferas magnéticas revestidas com estreptavidina (Dynabeads M-280, Dynal A/S, Oslo, Noruega), através da incubação de 2,5 pg de monómeros com 5 x 106 microesferas em 40 μΐ de PBS durante 20 min., a temperatura ambiente. Os complexos magnéticos foram lavados três vezes em PBS, utilizando um dispositivo magnético (Dynal A/S, Oslo, Noruega) e subsequentemente misturados com PBLs numa razão de 1: 10, em PBS com 5% de BSA, e agitadas muito suavemente durante 1 h. Lavaram-se cuidadosamente duas ou três vezes as células T CD8+ especificas para o antigénio associadas aos complexos 63 magnéticos. As células isoladas foram re-suspensas várias vezes em x-vivo suplementado com 5% de soro humano e incubadas durante 2 horas antes de as microesferas magnéticas serem libertadas e removidas da suspensão celular. As células T CD8+ especificas para o antigénio isoladas foram utilizadas em teste ELISPOT para analisar a reactividade cruzada entre o péptido nativo e o péptido modificado.

Mapeamento do clonótipo TCR através de electroforese em gel de gradiente desnaturante (DGGE) 0 mapeamento do clonótipo através de DGGE das regiões TCR BV humanas 1-24 foi descrito em pormenor (66). Resumindo, isolou-se ARN utilizando o Purescript Isolation Kit (Gentra Systems Inc. MN) e o ADNc transcrito foi amplificado por PCR utilizando sequências iniciadoras (primers) para as regiões variáveis das cadeias beta TCR em conjunto com um iniciador comum para a região constante. O programa informático MELT87 foi utilizado para assegurar que as moléculas de ADN amplificadas eram adequadas para análise por DGGE, desde que houvesse uma sequência rica em GC de 50 pb (grampo de GC) ligada à extremidade 5' do iniciador da região constante. A análise DGGE foi feita em géis de poliacrilamida a 6% contendo um gradiente de ureia e formamida entre 20% e 80%. A electroforese foi levada a cabo a 160 v durante 4,5 horas em tampão lx TAE a uma temperatura constante de 54°C.

Colorações imuno-histoquímicas

Utilizaram-se complexos péptido/HLA multimerizados para identificar células T especificas para antigénio in situ em lesões tumorais de doentes oncológicos utilizando o 64 procedimento descrito no Exemplo 2. 0 monómero sur51Y9/HLA-B35 biotinilado foi fornecido por Proimmune limited, Oxford, Reino Unido. Os monómeros biotinilados de sur5lY9/HLA-B35 foram multimerizados com moléculas de dextrano conjugadas com estreptavidina-FITC (gentilmente fornecidas por L. Winther, DAKO, Glostrup, Dinamarca), para gerar compostos HLA-dextrano multivalentes para imunohistoquimica. Secaram-se secções de tecido de um dia para o outro e subsequentemente fixaram-se em acetona fria durante 5 min. Todos os passos de incubação foram conduzidos no escuro a temperatura ambiente: (a) 45 min. do anticorpo primário (diluição a 1:100); (b) anticorpo de cabra anti-rato Cy 3-conjugado (diluição a 1:500; código 115-165-100; Jackson ImmunoResearch, obtido a partir de Dianova, Hamburgo, Alemanha) durante 45 min; e finalmente (c) os multimeros durante 75 min. Entre cada passo, as lâminas foram lavadas duas vezes durante 10 minutos em PBS/BSA a 0,1%. As lâminas foram colocadas em Vectashield e mantidas no frigorifico até observação com o microscópio confocal (Leica).

Resultados

Identificação de péptidos derivados de survivina que se ligam ao HLA-B35 A sequência de aminoácidos de survivina foi rastreada para péptidos nonaméricos e decaméricos com resíduos de ancoragem, de acordo com padrão de ligação de péptido do HLA-B35 (67) . Seleccionaram-se cinco péptidos contendo prolina como resíduo de ancoragem N-terminal na posição 2 e fenilalanina, leucina, isoleucina ou tirosina como resíduos de ancoragem C-terminais (Quadro 3). O teste de aglomeração revelou dois péptidos, sur51-59 (EPDLAQCFF, SEQ ID NO:7) e 65 sur46-54 (CPTENEPDL, SEQ ID NO:6) que foram capazes de estabilizar HLA-B35 com eficácia. Além disso, dois péptidos, SUr34-43 (TPERMAEAGF, SEQ ID NO:20) e SUr6-14 (LPPAWQPFL, SEQ ID NO:18) mostraram uma estabilização fraca, ao passo que o péptido restante não estabilizou de todo o HLA-B35. A concentração peptidica necessária para alcançar metade da recuperação máxima de HLA-B35 (C50) foi estimada em 13 μΜ para sur51-59 e 20 μΜ para sur46-54. Em comparação, o epitopo de controlo positivo C24 de EBNA3A458-466 (YPLHEQHQM, SEQ ID NO:21) apresentou um valor C50 estimado de 0,8 μΜ.

Para melhorar a afinidade de ligação de sur46-54 e sur51-59, o aminoácido C-terminal foi substituído por tirosina, um resíduo de ancoragem melhor (67). A recuperação de HLA-B35 mediada pelos péptidos modificados foi analisada no teste de aglomeração e os valores C50 foram estimados em 1,5 μΜ para sur5lY9 e 4 μΜ para sur46Y9 (Fig. 7).

Respostas imunitárias espontâneas contra epítopos peptídicos nativos

No início, analisaram-se cinco doentes no que diz respeito às respostas imunitárias espontâneas aos quatro péptidos de ligação de HLA-B35 nativos sur51-59, sur46-54, sur34-43 e sur6-14. Estes cinco doentes apresentavam diferentes neoplasias hematopoiéticas: HEM8 e HEM18 sofriam de MM, HEM12 de FL, HEM9 tinha DLBCL, e CLL5 tinha CLL. OS testes ELISPOT INF-γ foram levados a cabo em PBLs após 10 dias de estimulação in vitro para detectar CTLs precursores de péptidos. Detectaram-se respostas imunitárias espontâneas contra dois dos péptidos de ligação HLA-B35 nativos, sur51-59 e sur46-54. Dois doentes, HEM12 e 66 CLL5, responderam tanto ao sur51-59, como ao sur46-54, ao passo que HEM8 só respondeu ao sur51-59 (figuras 8A e B) . Não se detectou nenhuma resposta nos dois restantes doentes, HEM9 e HEM18, e não se detectou nenhuma resposta aos péptidos de ligação fraca sur34-46 e sur6-14 em nenhum doente. Uma abordagem alternativa à estimulação in vitro foi utilizada no doente HEM12, isto é, foram cultivados PBLs juntamente com células dendríticas autólogas maduras pulsadas com sur51-59 para estimular uma resposta de CTL in vitro. Os PBLs desta cultura mostraram uma reactividade forte ao sur51-59 no ELISPOT (Figura 8B).

Reconhecimento aumentado dos péptidos modificados

Tal como descrito acima, as modificações de péptido para melhorar a afinidade de HLA-B35 resultaram numa afinidade 5 a 10 vezes mais alta para HLA-B35 em relação aos péptidos nativos. Analisou-se um grupo de cinco doentes com melanoma quanto às respostas imunitárias espontâneas quer para os péptidos nativos quer para os péptidos modificados por meio de um teste ELISPOT. As amostras de PBL foram analisadas depois de estimulação in vitro, ao passo que as amostras de til foram analisadas directamente. Observaram-se respostas imunitárias espontâneas quer nos PBLs quer nos TlLs em três dos cinco doentes. O FM25 mostrou reactividade contra sur51-59 e sur5lY9 quer nas amostras de PBL quer nas TIL (Fig. 9A). O FM45 respondeu apenas ao péptido modificado sur5lY9, detectando-se uma resposta forte nos TILs. Não havia PBLs disponíveis para este doente (Fig. 9A) . O FM74 mostrou uma resposta forte ao sur4 6Y9 em TIL, mas não se conseguiu detectar nenhuma resposta ao péptido nativo (Fig. 9B) . Observou-se também uma resposta fraca ao sur4 6Y9 em PBLs do FM74 (dados não apresentados). 67

Reactividade cruzada entre os péptidos nativos e péptidos modificados A elevada afinidade de sur5lY9 ao HLA-B35 permite a produção de monómeros estáveis de HLA-B35 com sur5lY9. Uma vez estabelecida a presença de linfócitos T reactivos à survivina em nódulos linfáticos infiltrados com tumor e PBLs de diferentes doentes oncológicos, revestiram-se microesferas magnéticas com esses complexos HLA-B35/Sur5lY9 e estes foram utilizados para isolar linfócitos T reactivos ao péptido survivina a partir de pbl do doente CLL5. Este doente apresentou uma resposta forte ao sur51-59. As microesferas foram fortemente ligadas à superfície celular das células especificas, tal como visualizado por microscópio (dados não apresentados), permitindo a precipitação de células especificas de antigénio por um campo magnético. As células especificas sur5lY9 isoladas responderam fortemente ao sur51-59 (Fig. 9), ao passo que não se detectou resposta nos restantes PBLs (dados não apresentados). 0 isolamento foi analisado através do mapeamento de clonótipo TCR baseado em RT-PCR/DGGE. Esta técnica permite a análise de clonalidade de células T em populações celulares complexas, mesmo que só estejam disponíveis pequenos números de células. Estas análises mostraram que se isolaram 8 clones distintos (dados não apresentados). Células T específicas de antigénio presentes in situ em lesões de melanoma

Multimerizaram-se monómeros sur5lY9/HLA-B35 utilizando moléculas de dextrano conjugadas com estreptavidina e FITC. Utilizaram-se complexos MHC multimerizados para corar material congelado, fixado em acetona, utilizando o 68 procedimento descrito no Exemplo 2. Visualizaram-se as células especificas de antigénio utilizando um microscópio confocal a laser. Analisaram-se secções de melanoma primário de três doentes, e conseguiu-se detectar prontamente CTLs reactivos a sur51Y9/HLA-B35 in situ no microambiente tumoral, num dos doentes. A coloração conjunta com um mAb contra granzima B mostrou que estes CTLs específicos para survivina libertaram granzima B, exercendo uma actividade citotóxica; utilizaram-se doentes com melanoma HLA-B35 negativos como controlo (dados não apresentados). EXEMPLO 4

Identificação de novos epítopos de CTL derivados de

survivina com diferentes perfis de restrição de HLA-A

Caracterizaram-se novos epítopos de survivina restritos ao HLA-Al, HLA-A2, HLA-A3 e HLA-All com base nas respostas dos CTLs em doentes oncológicos. Esses epítopos aumentaram significativamente o número de doentes eligíveis para imunoterapia baseada em péptidos derivados de survivina. Além disso, ter como objectivo vários elementos de restrição em simultâneo provavelmente diminuirá o risco de escape imune por perda de alelo HLA.

Materiais e métodos

Doentes

Receberam-se amostras de doentes da Universidade de Wurzburg, na Alemanha, e do University Hospital em Herlev, na Dinamarca. Obteve-se o consentimento informado dos doentes antes de qualquer dos procedimentos. A tipagem dos 69 tecidos foi conduzida no Departamento de Imunologia Clinica, University Hospital, Copenhaga, Dinamarca. Isolaram-se linfócitos do sangue periférico (PBL) de doentes oncológicos com melanoma, carcinoma da mama e leucemia linfocitica crónica (CLL), utilizando separação Lymphoprep e estes foram congelados em soro fetal bovino (FCS) com 10% de dimetilsulfóxido. Além disso, obtiveram-se linfócitos T de lesões primárias e de nódulos linfáticos infiltrados por tumor de doentes com melanoma. Picou-se tecido tumoral acabado de ressecar em fragmentos pequenos, e esmagou-se para libertar linfócitos infiltrados no tumor (TIL) para criopreservação. Péptidos

Todos os péptidos foram adquiridos na Invitrogen (Carlsbad, CA, EUA) e fornecidos num grau de pureza >80%, como verificado por análise HPLC e MS. Todos os péptidos utilizados estão listados no Quadro 4, no Exemplo 5 abaixo.

Linhagens celulares

A linhagem celular T2 humana é um híbrido deficiente em TAP1 e TAP2 das células B-LCL.174 e T-LCL CEM e portanto só expressa níveis baixos de moléculas HLA classe I (HLA-A*0201 e HLA-B*5101) na superfície celular. As células T2 transfectadas com HLA-A*0301 foram gentilmente fornecidas pelo Dr. A. McMichael, IMM, John Radcliffe Hospital, Oxford. As células T2 transfectadas com HLA-A*1101 foram gentilmente fornecidas pelo Dr. M. Masucci, MTC, Instituto Karolinska, Estocolmo, Suécia. A linhagem celular BM36.1 também é deficiente na função TAP e tem um fenótipo semelhante à T2 com expressão reduzida do HLA classe I 70 (HLA-A*0101, HLA-B*3501) na superfície. As células BM36.1 foram gentilmente fornecidas pelo Dr. A. Ziegler, Universidade Humboldt, Berlim, Alemanha.

Teste de aglomeração para a ligação de péptidos a moléculas MHC classe I

Avaliou-se a afinidade de ligação de péptidos sintéticos (Invitrogen, Carlsbad, CA, EUA) às moléculas HLA-Al, -A2, -A3, ou -All marcadas metabolicamente com [35S]-metionina no teste de aglomeração, tal como descrito previamente (12). O teste teve como base a estabilização mediada por péptidos de moléculas HLA vazias libertadas, após a lise celular, de linhagens celulares deficientes em TAP. As moléculas HLA enroladas de forma estável foram imunoprecipitadas utilizando o mAbM W6/32 dependente de conformação, específico ao HLA classe I, e separadas por electroforese de gel com focagem isoeléctrica (IEF). As bandas de cadeia pesadas de MHC foram quantificadas utilizando o programa ImageGauge Phosphorimager (FUJI photo film Co., Carrollton, TX, EUA). A intensidade da banda é proporcional à quantidade de complexo de MHC classe I ligado ao péptido recuperado durante o teste. Subsequentemente, o grau de estabilização da molécula HLA está directamente relacionado com a afinidade de ligação do péptido adicionado. A concentração de péptido utilizada para analisar a recuperação das moléculas HLA foi 40, 4, 0,4, 0,04 μΜ para HLA-Al e HLA-Al1, e 100, 10, 1, 0,1, 0,01 μΜ para HLA-A2 e HLA-A3. O valor C50 foi subsequentemente calculado para cada péptido como a concentração de péptido necessária para alcançar metade da estabilização máxima. 71

Estimulação antigénica de PBL

Para alargar a sensibilidade do teste ELISPOT, os PBLs foram estimulados uma vez in vitro antes da análise. No dia 0, PBLs ou nódulos linfáticos esmagados foram descongelados e colocados sob a forma de 2 x 106 células, a uma quantidade de 2 ml/poço em placas com 24 poços (Nunc, Roskilde, Dinamarca) num meio x-vivo (Bio Whittaker,

Walkersville, Maryland), 5% de soro humano inactivado pelo calor, e 2 mM de L-glutamina na presença de 10 μΜ de péptido. Dois dias depois, adicionaram-se às culturas 20 Ul/ml de interleucina-2 recombinante (IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemanha). As células cultivadas foram testadas por ELISPOT no que respeita à reactividade no dia 10.

Teste ELISPOT O teste ELISPOT foi utilizado para quantificar células efectoras libertadoras de interferão-γ específicas do epítopo peptídico, como previamente descrito (16).

Resumindo, revestiram-se placas de 96 poços com fundo em nitrocelulose (MultiScreen MAIP N45, Millipore, Hedehusene, Dinamarca) com anticorpo anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Nacka, Suécia). Os poços foram lavados, bloqueados por um meio x-vivo, e as células foram adicionadas em duplicado a diferentes concentrações celulares. Os péptidos foram depois adicionados a cada poço e as placas foram incubadas de um dia para o outro. No dia seguinte, os meios foram descartados e os poços lavados antes de se adicionar o anticorpo secundário biotinilado (7-B6-l-Biotin, Mabtech). As placas foram incubadas durante 2 horas, lavadas, e adicionou-se a cada poço conjugado de avidina-fosfatase alcalina (Calbiochem, Life Technologies, Inc. San Diego, CA, EUA). As placas foram incubadas a temperatura ambiente 72 durante uma hora, lavadas, e adicionou-se o substrato enzimático NBT/BCIP (DakoCytomation Norden A/S, Glostrup, Dinamarca) a cada poço e incubou-se a temperatura ambiente durante 5-10 min. A reacção foi terminada depois da emergência de manchas púrpuras-escuras, lavando com água corrente. As manchas foram contadas utilizando ImmunoSpot® Series 2.0 Analyzer (CTL Analyzers, LLC, Cleveland, EUA) e pôde-se calcular a frequência de CTLs específicos de péptido a partir do número de células formadoras de manchas. Todos os testes foram conduzidos em duplicado para cada antigénio peptídico.

Resultados

Identificação de epítopos de survivina restritos ao HLA-Al

Ligação de péptidos derivados de survivina ao HLA-Al A sequência de aminoácidos da proteína survivina foi rastreada quanto aos epítopos peptídicos nonaméricos ou decaméricos HLA-Al mais prováveis, utilizando os principais resíduos de ancoragem HLA-Al, ácido aspártico (D), ácido glutâmico (E) na posição 3 e tirosina (Y), fenilalanina (F) na extremidade C-terminal. Da mesma maneira, sintetizaram-se e analisaram-se seis péptidos derivados de survivina quanto à ligação ao HLA-Al (Quadro 4). Além disso, os dois péptidos Sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID NO:23) e Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO:25) foram incluídos, apesar de só conterem um dos principais resíduos de ancoragem, dado que ambos foram identificados como fazendo uma boa ligação pelo algoritmo preditivo por Rammensee et al.r disponível em http://syfpeithi.bmiheidelberg.com. Os valores C50 foram estimados para cada péptido como a concentração de péptido necessária para alcançar metade da estabilização máxima do 73 HLA-Al (Tabela 4). Todavia, só um desses péptidos Sur92-101 (QFEELTLGEF) (SEQ ID NO:27) se ligou com uma afinidade elevada semelhante a um conhecido epítopo de controlo positivo da proteína do Influenza A, polimerase básica 1 (PBl) (VSDGGPNLY), como se exemplifica na Figura 10. O Sur93-101 (FEELTLGEF) (SEQ ID NO:24) demonstrou uma baixa afinidade de ligação ao HLA-Al, ao passo que nenhum dos outros péptidos analisados se ligou ao HLA-Al (Tabela 4). Em consequência, sintetizámos alguns péptidos análogos em que melhores resíduos de ancoragem substituíram os aminoácidos naturais. Modificámos os dois péptidos Sur38-46 (MAEAGFIHC) (SEQ ID NO:23) e Sur47-56 (PTENEPDLAQ) (SEQ ID NO:25), introduzindo a tirosina (Y) ao invés da cisteína (C) ou glutamina (Q), respectivamente na extremidade C-terminal. Ambos os péptidos modificados se ligaram fortemente ao HLA-Al (Quadro 4). Adicionalmente, substituímos os aminoácidos na posição 2 com os resíduos de ancoragem auxiliares treonina (T) ou serina (S) nos dois péptidos Sur92-101 e Sur93-101. Estas alterações não tiveram um efeito positivo de ligação do Sur92-101 ao HLA-Al. Em contraste, o Sur93T2 (FTELTLGEF) (SEQ ID NO:36) ligou-se com afinidade elevada ao HLA-Al (Tabela 4) . A Figura 10 ilustra a ligação do péptido de afinidade baixa Sur93-101, o péptido modificado de afinidade alta Sur93T2 e o péptido que não se liga Sur49-58, quando comparados ao epítopo de controlo positivo do influenza. Finalmente, alterámos os Surl4-22, Sur34-43, Sur49-58, Sur51-59, Sur92-101 e Sur93-101 com tirosina (Y) na extremidade C-terminal, contudo, isto não melhorou a afinidade de ligação ao HLA-Al de nenhum desses péptidos (dados não apresentados).

Respostas dos CTLs restritos ao HLA-Al contra péptidos derivados de survivina em doentes oncológicos 74

Analisaram-se PBLs de seis doentes com melanoma e TILs de três doentes com melanoma no que respeita à presença de CTLs específicos contra qualquer um dos quatro péptidos de elevada afinidade derivados de survivina Sur38Y9, Sur47YlO, Sur92-101 e Sur93T2, por meio de ELISPOT. Observou-se reactividade das células T contra pelo menos um dos péptidos derivados de survivina em três amostras de PBL e numa amostra de TIL no total de nove doentes analisados. Como se observa na Figura 11, os PBLs de um doente, Mel.Al-3, apresentaram uma resposta de células T contra os quatro péptidos, Sur38Y9, Sur47YlO, Sur92-101, e Sur93T2. Mel.Al-2 apresentou respostas aos Sur47Y10, Sur92-101 e Sur93T2, ao passo que Mel.Al-l/TIL e Mel.Al-4/PBL responderam aos Sur47YlO e Sur93T2, respectivamente (Figura 11).

Além disso, testaram-se dez doentes com melanoma quanto a reactividade imunitária contra os péptidos nativos Sur93-101, Sur38-46 e Sur47-56, por meio de ELISPOT; todavia, não se detectaram respostas específicas a péptidos em nenhum desses doentes (dados não apresentados).

Identificação de epítopos de survivina restritos ao HLA-All

Ligação de péptidos derivados de survivina ao HLA-All A sequência de aminoácidos da proteína survivina foi rastreada quanto a péptidos nonaméricos ou decaméricos com padrões de ligação correspondentes aos da superfamília HLA-A3, incluindo HLA-A3 e HLA-All. Escolheram-se sequências peptídicas com os principais resíduos de ancoragem leucina (L), na posição 2 e lisina (K) na extremidade C-terminal, juntamente com sequências peptídicas que têm aminoácidos 75 relacionados nessas posições, segundo o algoritmo preditivo de Rammensee et al. (Quadro 4).

Foram previstos treze péptidos da sequência proteica da survivina e analisaram-se quanto à ligação aos HLA-All e HLAA3. Três destes péptidos, Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO:4 7), Sur54-62 (LAQCFFCFK) (SEQ ID NO:42) e Surll2-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO:44) ligaram-se ao HLA-All com elevada afinidade, comparável ao epitopo virai do antigénio nuclear 4 de EBV (AVFDRKSDAK) (SEQ ID NO: 63) . Além disso, um péptido, Surll2-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO:51), demonstrou uma ligação fraca ao HLA-All (Quadro 4).

Respostas de CTLs restritos ao HL4-A11 contra péptidos derivados de survivina em doentes oncológicos

Testaram-se PBLs de cinco doentes com melanoma e dois doentes com CLL para atestar a reactividade das células T em relação aos quatro péptidos que se ligam ao HLA-All Sur53-62, Sur54-62, Surll2-120 e Surll2-121. Conseguimos detectar respostas contra o péptido derivado de survivina Sur53-62 em PBLs de dois dos doentes com melanoma, Mel.All- 1 e Mel.All-2, por meio de ELISPOT (Figura 12). Além disso, conseguimos detectar células T especificas de Sur53-62 entre os linfócitos infiltrados no tumor (TIL) a partir de um nódulo linfático infiltrado por tumor no doente Mel.All- 2 (Figura 12). No doente Mel.All-1, observou-se uma resposta imunitária forte contra o péptido de survivina Sur53-62 em cinco amostras de sangue diferentes colhidas ao longo de um período de dois anos (dados não apresentados).

Identificação de epítopos de survivina restritos ao HLA-A3 76

Ligação de péptidos derivados de survivina ao HLA-A3

Os péptidos derivados de survivina que se previa ligarem-se à superfamilia HLA-A3 foram ainda analisados quanto à ligação ao HLA-A3. Só dois desses péptidos Surll2-120 (KIAKETNNK) (SEQ ID NO:44) e Surll2-121 (KIAKETNNKK) (SEQ ID NO:57) se ligaram ao HLA-A3 com afinidade elevada, semelhante ao epítopo virai, nucleoproteina265-273 de Influenza A (ILRGSVAHK) (SEQ ID NO:74) (Quadro 4). Além disso, dois péptidos Sur53-62 (DLAQCFFCFK) (SEQ ID NO:47) e Sur95-103 (ELTLGEFLK) (SEQ ID NO:43) revelaram uma ligação fraca ao HLA-A3.

Alguns dos péptidos que não demonstraram ligação detectável foram modificados numa tentativa de aumentar a afinidade de ligação ao HLA-A3. Por conseguinte, sintetizámos dois péptidos análogos de Sur54-62 e Surll3-122 em que um melhor residuo de ancoragem, leucina (L), substituiu a alanina natural (A) na posição 2. O Sur54L2 (LLQCFFCFK) (SEQ ID NO:56) ligou-se ao HLA-A3 com afinidade elevada, ao passo que o Surll3L2 (ILKETNNKKK) (SEQ ID NO: 59) só teve uma ligação fraca (Quadro 4). Além disso, sintetizámos quatro péptidos análogos de Sur5-13, Surl3-22, Surl8-27 e Sur53-61, em que o melhor residuo de ancoragem, lisina (K), substituiu a fenilalanina natural (F) na extremidade C-terminal. 0 Sur5K9 (TLPPAWQPK) (SEQ ID NO: 54) e o Surl8KlO (RISTFKNWPK) (SEQ ID NO:58) ligaram-se ao HLA-A3 com afinidade elevada, ao passo que as substituições não mostraram efeito detectável na ligação ao HLA-A3 de Surl3K9 (FLKDHRISTK) (SEQ ID NO:57) e Sur53K9 (DLAQCFFCK) (SEQ ID NO:55), em comparação aos análogos nativos. 77

Respostas de CTLs restritos ao HLA-A3 contra os péptidos derivados de survivina em doentes oncológicos

Analisaram-se nove amostras de doentes com melanoma (cinco PBL e quatro TIL) para atestar a reactividade imunitária aos dois péptidos nativos que se ligam ao HLA-A3 com afinidade elevada, Surll2-120 e Surll2-121, assim como aos dois péptidos nativos de ligação fraca, Sur53-62 e Sur95-103. Todavia, não se conseguiram detectar respostas imunitárias contra estes péptidos por ELISPOT em nenhum dos doentes. Subsequentemente, analisaram-se os mesmos doentes quanto à reactividade imunitária espontânea contra os três péptidos derivados de survivina modificados com afinidade elevada, Sur5K9, Surl8KlO e Sur54L2. Detectou-se reactividade de CTLs ao Surl8KlO nas amostras de TIL de três doentes, Mel.A3-l, Mel.A3-2 e Mel.A3-3 (Figura 13). Não se detectaram respostas aos dois outros péptidos, Sur5K9 e Sur54L2. Para verificar mais exaustivamente estas respostas, analisaram-se PBLs de mais dezoito doentes com melanoma quanto a reactividade de CTLs ao Surl8KlO. Descobriu-se que três desses doentes respondiam, Mel.A3-4, Mel.A3-5 e Mel.A3-6, o que resultou num total de seis doentes que respondiam, entre os vinte e sete doentes analisados (Figura 13).

Identificação de um novo epitopo de survivina restrito ao HLA-A2

Ligação de péptidos 11-mer derivados de survivina ao HLA-A2 A sequência de aminoácidos da proteína survivina foi rastreada quanto aos epítopos peptídicos 11-mer HLA-A2 mais prováveis, utilizando os principais resíduos de ancoragem 78 específicos ao HLA-A2. Sintetizaram-se e analisaram-se seis péptidos derivados de survivina para ligação ao HLA-A2. Nenhum dos péptidos analisados se ligou com uma afinidade elevada semelhante à do conhecido epítopo de controlo positivo do péptido BMLF28o-288 do vírus Epstein-Barr (GLCTLVAML) (SEQ ID NO:72) (Quadro 4). A concentração peptídica necessária para alcançar metade da recuperação máxima de HLA-A2 (valor C50) foi 0,9 μΜ para o controlo positivo. Em comparação, os péptidos Surl8-28 (RISTFKNWPFL) (SEQ ID NO:67) e Sur86-96 (FLSVKKQFEEL) (SEQ ID NO:69) tiveram ligação fraca ao HLA-A2 (C50 = 69 μΜ e 72 μΜ respectivamente). Todavia, os dois conhecidos epítopos de survivina restritos ao HLA-A2 ligaram-se de um modo igualmente fraco ao HLA-A2; o Sur95-104 (ELTLGEFLKL) (SEQ ID NO:43) ligou-se com afinidade intermédia (C50 = 10 μΜ) , ao passo que o Sur96-104 (LTLGEFLKL) (SEQ ID NO:10) se ligou apenas de modo fraco (C50 >100 μΜ). Os quatro restantes péptidos 11-mer analisados [Sur4-14 (PTLPPAWQPFL) (SEQ ID NO:66), Sur54-64 (LAQCFFCFKEL) (SEQ ID NO:68),

Sur88-98 (SVKKQFEELTL) (SEQ ID NO:70) e Surl03-113 (KLDRERAKNKI) (SEQ ID NO:74)] não se ligaram ao HLA-A2.

Respostas de CTLs restritos ao HLA-A2 contra péptidos derivados de survivina em doentes oncológicos

Analisaram-se inicialmente PBLs de dez doentes oncológicos (dois doentes com melanoma (Mel), seis com CLL (CLL) e dois com carcinoma da mama (MC)) para averiguar se os dois péptidos 11-mer de ligação fraca, Surl8-28 e Sur86-96, eram apresentados pelo HLA-A2 e reconhecidos pelo sistema imunitário dos doentes oncológicos. Verificaram-se respostas de CTLs ao Surl8-28 em PBLs de dois dos dez doentes analisados (CLL-1, CLL-2, Figura 14), ao passo que 79 não se detectaram respostas ao Sur86-96 (dados não apresentados) . Para verificar mais exaustivamente estas respostas especificas ao Surl8-28, analisaram-se PBLs de mais doze doentes (sete doentes com melanoma, um com CLL e quatro com carcinoma da mama), para atestar a reactividade de CTL a este péptido. Entre estes, quatro doentes (CLL-3, MC-1, MC-2, Mel.A2-l) demonstraram actividade imunitária específica ao Surl8-28 detectável por ELISPOT (Figura 14) . Por conseguinte, no total, PBLs de seis dos 22 doentes analisados demonstraram resposta de CTLs ao Surl8-28.

Identificação de epítopos de survivina restritos ao HLA-B7

Ligação de péptidos derivados de survivina ao HLA-B7 A sequência de aminoácidos da proteína survivina foi rastreada quanto a péptidos de nove a dez aminoácidos, com resíduos de ancoragem, de acordo com o padrão de ligação de péptidos do HLA-B7. Seleccionaram-se e analisaram-se cinco péptidos quanto à sua capacidade de estabilizar HLA-B7 no teste de aglomeração. Os valores C50 foram estimados para cada péptido como a concentração de péptidos necessária para alcançar metade da estabilização máxima de HLA-B7 (Quadro 4) . Dois péptidos derivados de survivina, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO:18) e surll-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID N0:19), estabilizaram de forma fraca o HLA-B7, com valores C50 acima dos 100 μΜ, ao passo que o sur4 6-54 (CPTENEPDL) (SEQ ID NO:6), sur51-59 (EPDLAQCFF) (SEQ ID N0:7) e sur34-43 (TPERMAEAGF) (SEQ ID NO:20) não se ligaram ao HLA-B7 (Quadro 4). 80

Respostas de CTLs restritos ao HLA-B7 contra péptidos derivados de survivina em doentes oncológicos

Testaram-se PBLs HLA-B7 positivos de cinco doentes com melanoma (mel25, mel26, mel3, mel6, mel39), dois doentes com CLL (CLL1, CLL54) e dois doentes com cancro da mama (mamai1, mamal5) quanto à reactividade das células τ contra os péptidos de ligação fraca ao HLA-B7, sur6-14 (LPPAWQPFL) (SEQ ID NO:18) e surll-19 (QPFLKDHRI) (SEQ ID NO:19). Conseguimos detectar uma resposta forte de CTLs espontânea ao péptido derivado de survivina sur6-14 em PBL num doente com CLL e num doente com cancro da mama (Figura 15) . Adicionalmente, conseguimos detectar uma resposta fraca contra este péptido no doente com melanoma mel3 (Figura 15) .

Resumo de respostas imunitárias restritas a alelos de HLA a péptidos derivados de survivina em doentes oncológicos

Testou-se uma variedade de péptidos derivados de survivina compreendendo 9-11 resíduos de aminoácidos quanto à ligação aos seguintes alelos de hla: hla-a1, hla-a3, hla-aII e hla-B7, utilizando o teste de aglomeração para ligação de péptidos a moléculas MHC classe I descrito nos exemplos precedentes. Além disso, testaram-se vários dos péptidos quanto à sua capacidade de desencadear uma resposta imunitária de CTLs utilizando o teste ELISPOT, tal como também já se descreveu acima.

No Quadro 4 abaixo, apresenta-se um resumo dos resultados, incluindo os resultados obtidos nos exemplos anteriores:

Quadro 4. Dados de C50 e ELISPOT para péptidos derivados de survivina seleccionados 81

Alelo HLA Tamanho do péptido Posição Sequência C50 (μΜ) Observações SEQ ID NO: Notas de rodapé HLA-A1 9mer Sur14-22 LKDHRISTF NB 22 Sur51-59 EPDLAQCFF NB 7 Sur38-4 6 MAEAGFIHC NB 23 Sur93-101 FEELTLGEF > 100 24 lOmer Sur34-43 TPERMAEAGF NB 20 Sur47-56 PTENEPDLAQ NB 25 Sur49-58 ENEPDLAQCF NB 26 Sur92-101 QFEELTLGEF 2 27 Péptido de controlo Cl VSDGGPNLY 0.8 28 Péptido modificado sur14Y9 LKDHRISTY NB 29 sur51Y9 EPDLAQCFY ligação fraca 9 sur93Y9 FEELTLGEY NB 30 sur92Y9 QFEELTLGEY NB 31 sur34Y9 TPERMAEAGY NB 32 sur49Y9 ENEPDLAQCY NB 33 Sur92T2 QTEELTLGEF 2 34 Sur92S2 QSEELTLGEF 100 35 Sur93T2 FTELTLGEF 1 36 82

Sur93S2 FSELTLGEF 30 37 Sur38Y9 MAEAGFIHY 0.8 38 Sur47Y10 PTENEPDLAY 0.4 39 HLA-A2 Sur4-14 PTLPPAWQPFL NB 66 Surl8-28 RISTFKNWPFL 69 67 Sur54-64 LAQCFFCFKEL NB 68 Sur86-96 FLSVKKQFEEL 72 69 Sur88-98 SVKKQFEELTL NB 70 Surl03-113 KLDRERAKNKI NB 71 Péptido de controlo EBV,BMLF1 GLCTLVAML 3 72 HIV, Pol ILKEPVHGV 0.2 73 HLA-A3 9mer Sur5-13 TLPPAWQPF NB 40 Sur53-61 DLAQCFFCF NB 41 Sur54-62 LAQCFFCFK NB 42 Sur 95-103 ELTLGEFLK > 100 43 Sur 112-120 KIAKETNNK 2 44 i lOmer Sur 13-22 FLKDHRISTF NB 45 Sur 18-27 RISTFKNWPF NB 46 Sur 53-62 DLAQCFFCFK 100 47 ii Sur 84-93 CAFLSVKKQF NB 48 Sur 101-110 FLKLDRERAK NB 49 Sur 103-112 KLDRERAKNK NB 50 83

Sur 112-121 KIAKETNNKK 1 51 Sur 113-122 IAKETNNKKK NB 52 Péptido de controlo C3 ILRGSVAHK 0.ΙΟ .3 53 Pépt ido modificado Sur5K9 TLPPAWQPK 2 54 Sur53K9 DLAQCFFCK NB 55 Sur54L2 LLQCFFCFK 1 56 Sur13K9 FLKDHRISTK NB 57 Surl8K10 RISTFKNWPK 0.02 58 Surll3L2 ILKETNNKKK >100 59 SurEx3-A3-l TIRRKNLRK 0.5 60 iii SurEx3-A3-2 PTIRRKNLRK NB 61 Sur2b-A3-1 RITREEHKK NB 62 Péptido de controlo Influenza A, nucleoproteína 265-273 ILRGSVAHK 0.1 74 HLA-AI1 9mer Sur 5-13 TLPPAWQPF NB 40 Sur53-61 DLAQCFFCF NB 41 Sur 54-62 LAQCFFCFK 0.4 42 Sur 95-103 ELTLGEFLK NB 43 Sur 112-120 KIAKETNNK 1 44 lOmer Sur 13-22 FLKDHRISTF NB 45 Sur 18-27 RISTFKNWPF NB 46 84

Sur 53-62 DLAQCFFCFK 5 47 Sur 84-93 CAFLSVKKQF NB 48 Sur 101-110 FLKLDRERAK NB 49 Sur 103-112 KLDRERAKNK NB 50 Sur 112-121 KIAKETNNKK >100 51 iv Sur 113-122 IAKETNNKKK NB 52 Péptido de controlo C4 AVFDRKSDAK 0.2 63 HLA-B7 9mer Sur 6-14 LPPAWQPFL >100 18 V Sur 11-19 QPFLKDHRI > 100 19 Sur46-54 CPTENEPDL NB 6 Sur51-59 EPDLAQCFF NB 7 lOmer Sur34-43 TPERMAEAGF NB 20 Control peptides C6 QPRAPIRPI 0.1 64 C7 RPPIFIRRL 0.5 65 1 Observou-se uma resposta ao péptido Surll2-120 num doente com linfoma (HEM34), por meio de ELISPOT. 11 Detectaram-se respostas ao péptido Sur53-62 em três doentes com linfoma (HEM9, 11, 34), por meio de ELISPOT. lv Observou-se uma resposta fraca num doente com melanoma (FM-TIL95), por meio de ELISPOT. V11 Observou-se uma resposta ao Surll2-121 num doente com melanoma (PM6), mais evidente numa suspensão de nódulo linfático metastizado, e mais fraca nos TILs do tumor primário e nos PBLs, por meio de ELISPOT. ν111 Observou-se uma resposta ao péptido Sur6-14, num doente (CLL9), e uma resposta mais fraca num doente com linfoma, por ELISPOT (HEM 21) (dados não apresentados). com CLL meio de 85 EXEMPLO 5

Procedimentos experimentais terapêuticos utilizando péptidos derivados de survivina como imunogénios

Vacinaram-se cinco doentes com melanoma em estádio IV já pré-tratados intensamente com o epítopo de survivina restrito ao HLA-A2 modificado, nomeadamente o péptido SurlM2, apresentado por células dendriticas autólogas, num contexto de utilização humanitária. Quatro dos doentes desenvolveram fortes respostas de células T a este epitopo, conforte avaliado por teste ELISPOT. Além disso, a coloração in situ do multimero péptido/HLA-A2 revelou a infiltração de células reactivas à survivina tanto em metástases viscerais como em metástases de tecidos moles. De notar que não se observou a toxicidade associada à vacinação. Os dados demonstraram que é possível induzir resposta de células T à survivina, mesmo em doentes com melanoma em estádios avançados e que estas vacinas são bem toleradas.

Materiais e métodos

Critérios de eligibilidade dos doentes e regime de tratamento

Todos os procedimentos clínicos foram conduzidos de acordo com a Declaração de Helsínquia e todos os doentes deram consentimento informado antes da terapêutica. Os doentes com melanoma cutâneo ou da úvea em estádio IV foram eligíveis quando a sua doença progredia apesar de terem feito dois tipos diferentes de quimio, imuno ou quimioimunoterapia. Além de tudo, os doentes tinham de ter 18 anos ou mais, expressar HLAA*0201, e sofrer de doença que pudesse ser validade por tomografias axiais 86 computadorizadas cranianas, torácicas e abdominais. 0 indice de Karnofsky dos doentes tinha de ser 60% ou superior. Não foi permitida quimio e/ou imunoterapia sistémica nas quatro semanas que antecederam a vacinação. Definiram-se como critérios importantes de exclusão as metástases do SNC, doenças auto-imunes ou infecciosas activas, gravidez e lactação, assim como distúrbios psiquiátricos significativos. Geraram-se células dendríticas pulsadas com péptidos da forma anteriormente descrita (82). Resumindo, isolaram-se PBMCs por leucaferese por LymphoprepTM (Nycomed Pharma), que foram depois congelados em alíquotas e armazenados em azoto líquido. Uma semana antes da vacinação, os PBMCs foram descongelados, lavados e cultivados num meio contendo gentamicina, glutamina e plasma autólogo inactivado pelo calor. Nos dias 1 e 5, adicionaram-se IL-4 e GM-CSF. Para diferenciar as DCs maduras, adicionaram-se TNF-γ e prostaglandina E2 no dia 6. No dia 7, as células que apresentavam características fenotípicas e morfológicas de DCs maduras, isto é, uma aparência velada e expressão = 75% de CD83, foram pulsadas com um epítopo de survivina96_io4 restrito ao HLA-A2 derivado de survivina modificado, LMLGEFLKL (SEQ ID NO: 10) (Clinalfa, Suíça) 14. As células só foram utilizadas na vacinação quando as amostras dos testes microbianos retiradas de culturas nos dias 1 e 5 se revelaram estéreis.

Os doentes foram vacinados em intervalos de 7 dias no que respeita às duas primeiras vacinações, seguidos de intervalos de 28 dias para mais vacinações. Ressuspendeu-se em PBS um total de 10-20 χ 106 de DCs maduras pulsadas com survivina96-io4, contendo 1% de albumina de soro humano, e estas foram injectadas intradermicamente em alíquotas de 87 1,5 χ 106 DCs por local de injecção na região ventromedial das coxas, junto aos nódulos linfáticos regionais. Excluiram-se os membros em que nódulos linfáticos de drenagem haviam sido removidos e/ou irradiados. Repetiu-se a leucaferese depois de 5 vacinações na ausência de deterioração grave do estado de saúde dos doentes ou ocorrência de metástases do SNC.

Avaliação de respostas clinicas e imunológicas

Realizaram-se TACs antes da vacinação e a cada três meses a partir desta, ou em caso de sinais clínicos graves de progressão da doença. As respostas imunológicas foram monitoradas pelo teste ELISPOT, utilizando PBMCs obtidas a cada três meses, para detectar libertação de lFN-γ específica à survivina96-io4 · Para alargar a sensibilidade do teste ELISPOT, estimularam-se PBMCs uma vez in vitro a uma concentração de 1 χ 106 células por ml em placas de 24 poços (Nunc, Dinamarca) num meio x-vivo (Bio Whittaker, Walkersville, Maryland), suplementado com 5% de soro humano inactivado pelo calor e 2 mM de L-glutamina na presença de 10 μΜ de péptidos. Dois dias mais tarde, adicionaram-se 40 Ul/ml de interleucina-2 recombinante (IL-2) (Chiron, Ratingen, Alemanha). Passados 10 dias, testou-se a reactividade das células. Para este propósito, revestiram-se placas de 96 poços com fundo de nitrocelulose (MultiScreen ΜΑΙΡ N45, Millipore, Glostrup, Dinamarca) com um anticorpo anti-IFN-γ (1-D1K, Mabtech, Suécia). Adicionaram-se linfócitos a 104 - 105 células em 200 μΐ num meio x-vivo por poço, juntamente com 104 de células T2 e os péptidos relevantes a uma concentração final de 2 μΜ. Depois de uma incubação de um dia para o outro a 37°C e duas lavagens, adicionou-se o anticorpo de detecção 88 biotinilado (7-B6-l-Biotina, Mabtech, Suécia); a sua ligação especifica foi visualizada utilizando fosfatase alcalina-avidina juntamente com o substrato respectivo (GibcoBRL). A reacção foi terminada depois do surgimento de manchas púrpuras-escuras, que foram quantificadas utilizando o Alphalmager System (Alpha Innotech, San Leandro, CA, EUA).

Também se detectaram linfócitos T CD8+ reactivos a survivina96-io4/HLA-A*0201 in situ tanto nos sitios de vacinação como nas metástases viscerais de tecidos moles ou cutâneas, por meio de complexos survivina96_io4/HLA-A*0201 multiméricos. Os locais de vacinação foram excisados 24 h depois de ter sido administrada uma injecção intradérmica a todos os doentes, ao passo que as lesões metastáticas só foram removidas em alguns doentes, quando facilmente acessíveis (doentes KN e GB), ou retiradas durante uma tentativa de cura (doente WW). 0 procedimento de coloração para complexos péptido/MHC multiméricos foi recentemente descrito (68) . Os complexos survivina96-io4/HLA-A*0201 multiméricos foram gerados por introdução de um local de reconhecimento para biotinilação enzimática na extremidade 5' dos domínios extracelulares de HLA-A*0201 (resíduos 1-275) . A proteína recombinante foi purificada por cromatografia de exclusão por tamanho (Sephadex G25, Pharmacia, Erlangen, Alemanha) e de troca iónica (mono-Q, Pharmacia) e enrolada in vitro por diluição na presença dos péptidos respectivos e p2-microglobulina. Depois de filtração em gel numa coluna Sephadex G25, a proteína foi multimerizada com estreptavidina-FITC conjugada com moléculas de dextrano (gentilmente fornecidas por L. Winther, DAKO, Copenhaga, Dinamarca) para gerar complexos HLA-dextrano multivalentes. Secaram-se de um dia para o 89 outro secções criopreservadas das respectivas amostras, que foram subsequentemente fixadas em acetona fria durante 5 min. Todos os passos de incubação foram levados a cabo num ambiente escuro a temperatura ambiente, da seguinte maneira: (i) 45 min de um anticorpo anti-CD8 (diluição de 1:100, clone HIT8a, Pharmingen, San Diego, CA); (ii) anticorpo de cabra anti-rato Cy3-conjugado (diluição de 1:500; código 115-165-100, Dianova, Hamburgo, Alemanha) durante 45 min; e finalmente (iii) os multimeros durante 75 min. Entre cada passo, as lâminas foram lavadas duas vezes durante 10 min em PBS/BSA a 0,1%. Por fim, as lâminas foram colocadas em Vectashield e observadas sob um microscópio confocal Leica (TCS 4D, Leica, Mannheim, Alemanha).

Resultados

Caracteristicas dos doentes, toxicidade e evolução clinica

Escolheram-se cinco doentes com melanoma em estádio IV num estado avançado, sofrendo dois deles de melanoma da úvea, um de melanoma dos tecidos moles e os dois restantes de melanoma cutâneo. Devido à manifestação de metástases cerebrais sintomáticas, um doente foi retirado da terapia depois de apenas duas vacinações. Os outros quatro doentes receberam até 15 vacinas. Um doente morreu de paragem cardíaca e sem tumores depois de ressecção cirúrgica das restantes metástases. Outro doente foi retirado da terapêutica depois de 10 vacinas devido ao surgimento de metástases viscerais (RW). Um doente permaneceu no estudo após 15 vacinas. No Quadro 5, apresentam-se em pormenor as caracteristicas dos doentes, terapêuticas anteriores, número de vacinas e informação de sobrevivência. 90 Não ocorreram grandes casos de toxicidade. Por conseguinte, a hemoglobina, os leucócitos e trombócitos, assim como a desidrogenase láctica, a creatinina e a colinesterase não foram influenciadas pela terapêutica de vacinação (Fig. 16) . Não se observaram sinais de toxicidade sistémica ou local nos locais de injecção. Além disso, não se detectaram alterações na cicatrização, distúrbios hemorrágicos, disfunção cardíaca, vasculite ou doença intestinal inflamatória.

Num doente (ww), conseguiu-se estabilizar metástases hepáticas pré-existentes com a terapêutica de vacinação, mas ocorreu ainda assim uma nova metástase da glândula supra-renal. Infelizmente, este doente morreu devido a paragem cardiaca, ainda que estivesse livre de tumores depois da cirurgia curativa. Detectou-se uma metástase cerebral no doente PB apenas 4 semanas depois de se ter iniciado a vacinação. Assim, este doente teve de ser excluído de mais vacinações depois de apenas duas injecções de DC. Os outros três doentes revelaram progressos lentos de doença metastática sem deterioração substancial no seu estado de saúde. Significativamente, para o doente KN, conseguiu-se uma sobrevivência total de 13 meses (desde o inicio da vacinação até à morte), apesar da sua forte carga metastática e de rápida progressão da doença no inicio da vacinação. O doente GB continuou no protocolo 14 meses depois do inicio da vacinação com DCs pulsadas com péptido de survivina. Note-se, porém, que ambos os doentes (RW e GB) receberam tratamentos localizados adicionais para controlo tumoral, quer por radiação de tumores subcutâneos (RW) quer por quimioterapia local (GB).

Respostas de células T CD8+ especificas à survivina 91

Para monitorar a cinética das respostas de células T citotóxicas, testaram-se PBMCs obtidas antes e três meses depois da vacinação para determinar a reactividade ao epitopo survivina96-io4 modificado por ELISPOT para lFN-γ. Antes da análise, estimularam-se PBMCs uma vez in vitro para alargar a sensibilidade deste teste. Nos quatro doentes testados, constatou-se uma evidente indução de células T reactivas à survivinag6-io4 (Fig. 17) . A análise à reactividade de outros péptidos de survivina restritos ao HLA-A*0201, isto é, ao epitopo de survivina96-io4 não-modificado e ao epitopo Sur9 adjacente, demonstrou uma resposta das células T a estes péptidos em dois dos doentes (KN e RW) (dados não apresentados). 0 valor clinico e prognóstico das avaliações de respostas das células T especificas de tumores no sangue periférico tem sido repetidamente questionado; assim sendo, também testámos a presença de linfócitos T CD8+ reactivos à survivina96-io4/HLA-A*0201 entre linfócitos infiltrados no tumor in situ, por meio de coloração de multimero péptido/MHC. Para validar o método, analisámos primeiro amostras tecidulares de reacções de hipersensibilidade retardada que ocorreram no local da vacinação nas 24 seguintes. Este teste confirmou observações anteriores de que as injecções intradérmicas de DC pulsadas com péptidos induzem um forte infiltrado inflamatório de células T especificas ao péptido. Subsequentemente, aplicou-se o procedimento de coloração de multimero péptido/MHC em tecidos moles e metástases viscerais, que revelou a presença de células reactivas à survivina96-i04/HLA-A*0201 entre o infiltrado CD8+. Esta observação sugere que a vacinação não só induz células T com a desejada 92 especificidade, mas também as dota da necessária capacidade de endereçamento (homing) .

Quadro 5. Resumo dos testes de vacinação: caracteristicas dos doentes 93 ID do Paciente Idade/ /Sexo Tempo decorrido entre tumor primário e a fase IV Terapêutica anterior Doença mensurável Resultado clínico N.° de vacinas Sobrevivência após a primeira vacina* GB 40/fem 4 anos e 8 meses LITT, fotemustina/IL-21FNa, treossulfano/gemcitabina fígado PD (crescimento lento de lesões pré-existentes e novas lesões hepáticas, novas metástases pancreáticas e pleurais) 15 +14 meses KN 53/masc 11 anos IL-2IFNa,histamina, fotemustina, treossulfano/gemcitabina fígado, rim, tecidos moles, osso PD (crescimento lento de lesões pré-existentes, novas lesões nos nódulos linfáticos, mediastínicas e pleurais) 13 13 meses ID do Idade/ Tempo Terapêutica anterior Doença Resultado clínico N.° de após a 94

Paciente / Sexo Tempo decorrido entre tumor primário e a fase IV mensurável vacinas primeira vacina* WW 73/masc 14 meses cirurgia, vacinação DC, decarbazina fígado PD (metástases hepáticas estáveis, mas novas metástases supra-renais) 12 12 meses devido a um enfarte pós-cirúrgico RW 72/masc 16 anos cirurgia, radioterapia, adriblastina/fosfamida, ixoteno, dacarbazina, TNF/melfalano tecidos moles PD (crescimento de metástases pré-existentes e de novas nos tecidos moles; detecção de metástases no coração, pulmão e músculos depois de 12 vacinações) 12 +12 meses PB 52/masc 2 anos e 3 meses radioterapia pulmão, fígado PD (metástases novas no cérebro e na pele) 2 4 meses 98

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LISTA DE SEQUÊNCIAS <110> Straten, Eivind Per Thor Andersen, Mads Hald <120> PÉPTIDOS DERIVADOS DE SURVIVINA E SUA UTILIZAÇÃO <130> 31757EP01 <150> US 60/352,284 111 <151> 2003-01-30 <160> 85

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<210> 82 <211> 9 <212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido Sur53K9 <400> 82

Gin Ile Leu Gly Gin Leu Arg Pro Leu 1 5 <210> 83 <211> 9

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> 141 <223> Péptido Sur53K9 <400> 83

Leu Thr Ala Glu Vai Pro Pro Glu Leu 1 5 <210> 84 <211> 9

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido Sur53K9 <400> 84

Gly Met Gly Ser Glu Glu Leu Arg Leu 1 5 <210> 85 <211> 9

<212> PRT <213> Sequência artificial <220> <223> Péptido Sur53K9 <400> 85

Glu Leu Pro Thr Pro Arg Arg Glu Vai 5 1 142

REFERÊNCIAS CITADAS NA DESCRIÇÃO

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Lisboa, 2/03/2010

Claims

1 REIVINDICAÇÕES 1. Epítopo peptídico restrito ao MHC classe I derivado de survivina, tendo o referido epítopo a sequência FTELTLGEF, como especificado na SEQ ID NO:36, e pelo menos uma das seguintes características: (i) capacidade de ligação à molécula HLA-A1 classe I numa afinidade medida pela quantidade de péptido necessária para alcançar metade da recuperação máxima da molécula HLA classe I (valor de C50), que é no máximo 50 μΜ, tal conforme determinado por um teste de estabilização de HLA; (ii) capacidade de estimular células produtoras de INF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico numa frequência de pelo menos 1 em cada 104 PBLs, tal como determinado por um teste ELISPOT, e/ou; (iii) capacidade de detectar in situ num tecido tumoral CTLs que reajam com o epítopo peptídico.

2. Péptido de acordo com a reivindicação 1 tendo um valor de C50 que é no máximo 30 μΜ.

3. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 2 tendo um valor de C50 que é no máximo 20 μΜ.

4. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes compreendendo no máximo 20 resíduos de aminoácidos.

5. Péptido de acordo com a reivindicação 4 que compreende no máximo 10 resíduos de aminoácidos. 2

6. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes que é capaz de estimular células produtoras de IFN-γ numa população de PBLs de um doente oncológico numa frequência de pelo menos 10 em cada 104 PBLs.

7. Péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações precedentes que é capaz de estimular células produtoras de IFN-γ numa população de PBLs de um doente que tenha uma doença oncológica em que seja expressa survivina.

8. Péptido de acordo com a reivindicação 7, em que a doença oncológica é seleccionada de entre o grupo que consiste numa neoplasia hematopoiética maligna incluindo leucemia linfática crónica e leucemia mielóide crónica, melanoma, cancro da mama, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do pâncreas e cancro da próstata.

9. Péptido de acordo com qualquer uma da reivindicações precedentes que é capaz de estimular células produtoras de IFN-γ numa população de PBLs num doente que sofre de uma doença oncológica, tendo essas células produtoras de IFN-γ um efeito citotóxico contra células que expressam survivina de uma linhagem de células cancerosas, incluindo uma linhagem celular seleccionada de entre o grupo que consiste na linhagem celular MCF-7 de cancro da mama e a linhagem celular FM3 de melanoma.

10. Composição farmacêutica compreendendo o péptido de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a 9.

11. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 10, compreendendo essa composição uma combinação de 3 dois ou mais epítopos peptídicos derivados de survivina restritos ao MHC classe I, interagindo cada um especificamente com uma molécula HLA diferente e tendo pelo menos uma das seguintes caracteristicas: (i) capacidade de ligação à molécula HLA classe I à qual está restrito numa afinidade medida pela quantidade do péptido necessária para alcançar metade da recuperação máxima da molécula HLA classe I (valor de C50), que é no máximo 50 μΜ, conforme determinado por um teste de estabilização de HLA; (ii) capacidade de estimular células produtoras de INF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico a uma frequência de pelo menos 1 em cada 104 PBLs, conforme determinado por um teste ELISPOT, e/ou; (iii) capacidade de detectar in situ num tecido tumoral CTLs que reajam com o epítopo peptídico.

12. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11, em que cada epitopo peptídico interage especificamente com uma molécula HLA-A do MHC classe I, uma molécula HLA-B do MHC classe I ou uma molécula HLA-C do MHC classe I.

13. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 11 ou 12, em que a referida molécula HLA-A do MHC classe I inclui uma molécula HLA-Al, HLA-A2, HLA-A3, HLA-A9, HLA-Al0, HLA-Al1, HLA-Awl9, HLA-A23(9), HLA-A24(9), HLA-A25 (10), HLA-A26(10), HLA-A28, HLA- A29(wl9), HLA-A30(wl9), HLA-A31(wl9), HLA-A32(wl9), HLA-AW33 (wl9), HLA-Aw34 (10) , HLA-Aw36, HLA-Aw43, HLA-Aw66 (10), HLA-Aw68 (28), HLA-A69(28). 4

14. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 13, em que a referida molécula HLA-B do MHC classe I inclui qualquer uma das seguintes: HLA-B5, HLA-B7, HLA-B8, HLA-B12, HLA-B13, HLA-B14, HLA-B15, HLA-B16, HLA-B17, HLA-B18, HLA-B21, HLA-Bw22, HLA-B27, HLA-B35, HLA-B37, HLA-B38, HLA-B39, HLA-B40, HLA-Bw41, HLA-BW42, HLA-B44, HLA-B45, HLA-Bw46 e HLA-Bw47.

15. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 12 a 14, em que a referida molécula HLA-C do MHC classe I inclui qualquer uma das seguintes: HLA-Cwl, HLA-Cw2, HLA-Cw3, HLA-Cw4, HLA-Cw5, HLA-Cw6, HLA-Cw7 e HLA-Cwl6.

16. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 15 compreendendo um epítopo peptidico que é uma sequência nativa de survivina de uma espécie mamifera.

17. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 16, compreendendo um epitopo peptidico seleccionado de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: : 6, SEQ ID NO: 7, SEQ ID NO: 27, , SEQ ID NO: : 45 e SEQ ID NO: 66.

18. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 ou 12, compreendendo um epitopo peptidico seleccionado de entre o grupo que consiste em SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 8, SEQ ID NO: 9, SEQ ID NO:38, SEQ ID NO: 39, SEQ ID NO: 58. 5

19. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 18, em que os referidos epitopos peptidicos têm capacidade de estimular células produtoras de iNF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico numa frequência de pelo menos 10 em cada 104 PBLs.

20. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 11 a 19, em que os referidos epitopos peptidicos têm capacidade de estimular células produtoras de INF-γ numa população de PBLs de um doente com uma doença oncológica em que seja expressa survivina.

21. Composição farmacêutica de acordo com a reivindicação 20 em que a doença oncológica é seleccionada de entre o grupo que consiste numa neoplasia hematopoiética maligna incluindo leucemia linfática crónica e leucemia mielóide crónica, melanoma, cancro da mama, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do pâncreas e cancro da próstata.

22. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 21 compreendendo um epítopo peptidico que sofre modificações pós-traducionais.

23. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 22 compreendendo um péptido fosforilado.

24. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 23, compreendendo um adjuvante. 6

25. Composição farmacêutica de acordo com qualquer uma das reivindicações 10 a 24, que é uma composição para diagnóstico ex vivo ou in sítu da presença de células T reactivas à survivina entre os PBLs ou em tecidos tumorais.

26. Vacina de múltiplos epitopos compreendendo um epitopo peptidico restrito ao MHC classe I derivado de survivina, tendo esse epitopo a sequência FTELTLGEF conforme especificado pela SEQ ID NO: 36 e pelo menos uma das seguintes caracteristicas: (i) capacidade de ligação à molécula HLA-A1 classe I à qual está restrito numa afinidade medida pela quantidade do péptido necessária para alcançar metade da recuperação máxima da molécula HLA classe I (valor de C50), que é no máximo 50 μΜ, conforme determinado por um teste de estabilização de HLA; (ii) capacidade de estimular células produtoras de iNF-γ numa população de PBLs de um doente oncológico a uma frequência de pelo menos 1 em cada 104 PBLs, conforme determinado por um teste ELISPOT, e/ou; (iii) capacidade de detectar in sítu num tecido tumoral CTLs que reajam com o epitopo peptidico.

27. Vacina de múltiplos epitopos de acordo com a reivindicação 26, que inclui uma combinação de epitopos peptídicos derivados de survivina dependendo do tipo de tecido do doente em questão.

28. Vacina de múltiplos epitopos de acordo com a reivindicação 26 ou 27, em que a vacina é capaz de 7 desencadear uma resposta imunitária contra uma doença oncológica em que seja expressa survivina.

29. Vacina de múltiplos epítopos de acordo com a reivindicação 28, em que a doença oncológica é seleccionada de entre o grupo que consiste numa neoplasia hematopoiética maligna incluindo leucemia linfática crónica e leucemia mielóide crónica, melanoma, cancro da mama, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do pâncreas e cancro da próstata.

30. Vacina de múltiplos epítopos de acordo com qualquer uma das reivindicações 26 a 29, em que a vacina estimula a produção no indivíduo vacinado de células T efectoras que têm um efeito citotóxico contra as células cancerosas.

31. Utilização de um péptido de acordo com o definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a preparação de um medicamento destinado ao tratamento do cancro.

32. Utilização de acordo com a reivindicação 31, em que a doença oncológica é seleccionada de entre o grupo que consiste numa neoplasia hematopoiética maligna incluindo leucemia linfática crónica e leucemia mielóide crónica, melanoma, cancro da mama, cancro do colo do útero, cancro do ovário, cancro do pulmão, cancro do cólon, cancro do pâncreas e cancro da próstata.

33. Utilização de um péptido de acordo com o definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 9 para a preparação 8 8 do cancro em convencionais, de um medicamento para o tratamento combinação com tratamentos oncológicos como a radioterapia e a quimioterapia. Lisboa, 2/03/2010