ES2536465T3 - Composición de péptidos tumor-asociados y relacionados con la vacuna contra el cáncer para el tratamiento de glioblastoma (GBM) y otros cánceres - Google Patents

Abstract

Composición farmacéutica, que comprende un péptido consistente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.º 2, y un péptido consistente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.º 3, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable.

Description

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y las terapias combinadas. No obstante, el índice combinado de supervivencia a 5 años para todos los estadios es tan solo del 16%. El índice de supervivencia es del 49% en los casos que son detectados cuando la enfermedad aún está localizada. Pero solo el 16% de los cánceres de pulmón se diagnostica en este estadio inicial.

Tabla 1: Estimación de los nuevos casos de cáncer y fallecimientos según el sexo en Estados Unidos en 2007 (American Cancer Society. Cancer Facts & Figures, 2007. Atlanta: American Cancer Society, 2007.) Cancer Facts & Figures 2007. Atlanta: American Cancer Society; 2007.)

Localización

Estimación de nuevos casos Estimación de fallecimientos

Ambos sexos

Varones Mujeres Ambos sexos Varones Mujeres

Glioma y cerebro

20.500 11.170 9.330 12.740 7.150 5.590

Mama

180.510 2.030 178.480 40.910 450 40.460

Próstata

218.890 218.890 27.050 27.050

Esófago

15.560 12.130 3.430 13.940 10.900 3.040

Colon

112.340 55.290 57.050 52.180 26.000 26.180

Riñón

51.190 31.590 19.600 12.890 8.080 4.810

Páncreas

37.170 18.830 18.340 33.370 16.840 16.530

Carcinomas escamocelulares; neoplasias queratinocíticas cutáneo

1.000.000 sin datos sin datos sin datos sin datos sin datos

Leucemia

44.240 24.800 19.440 21.790 12.320 9.470

Pulmón

213.380 114.760 98.620 160.390 89.510 70.880

Linfoma no hodgkiniano

63.190 34.210 28.990 18.660 9.600 9.060

Ovarios

22.430 22.430 15.280 15.280

Melanoma

59.940 33.910 26.030 8.110 5.220 2.890

El documento WO 02/074237 describe la proteína entera de la SEQ ID N. º 2 (FABP7), pero no revela respuestas de linfocitos T contra la proteína.

10 Así pues, sigue existiendo necesidad de nuevas opciones de tratamiento eficaz y seguro para el glioblastoma, tumor de próstata, cáncer de mama, cáncer de esófago, cáncer colorrectal, carcinoma de células claras de células renales, cáncer de pulmón, del SNC, cáncer de ovarios, melanoma, cáncer de páncreas, carcinomas escamocelulares, leucemia y meduloblastoma, así como para otros tumores que muestran una sobreexpresión de survivina, de forma que se mejore el bienestar de los pacientes sin utilizar quimioterapia u otros fármacos que puedan provocar efectos

15 secundarios graves.

Descripción detallada de la invención

Todos los términos utilizados en la presente memoria se definen del modo indicado a continuación a menos que se indique lo contrario. El término «péptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes.

20 Los péptidos tienen preferiblemente 9 aminoácidos de longitud, pero pueden tener solo 8 aminoácidos de longitud, pero también hasta 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16, 17 o 18 aminoácidos de longitud.

El término «oligopéptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantenga el epítopo o epítopos adecuados. Los

25 oligopéptidos suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoácidos y mayor de 14, aproximadamente.

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DR7

24,8% 19,2% 13,4% 20,2%

DR8

5,7% 12,1% 12,7% 18,6%

DR9

2,1% 5,8% 18,6% 2,1%

Por tanto, a efectos terapéuticos y de diagnóstico sería muy deseable contar con un péptido que se uniese, con la afinidad adecuada, a varios receptores HLA de clase II distintos. Todo péptido que se une a varias moléculas HLA de clase II distintas recibe el nombre de ligando promiscuo.

5 En la presente memoria, la referencia a una secuencia de ADN incluye tanto ADN monocatenario como bicatenario. Por lo tanto, la secuencia específica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, a la doble cadena formada por dicha secuencia con su complementaria (ADN bicatenario) y a la cadena complementaria de dicha secuencia. El término «región codificante» hace referencia a la porción de un gen que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresión de dicho gen en su ambiente genómico

10 natural, por ejemplo, la región que codifica in vivo el producto de expresión natural del gen.

La región codificante puede formar parte de un gen normal, mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizada íntegramente en el laboratorio con métodos bien conocidos para los expertos en la síntesis de ADN.

El término «secuencia nucleotídica» hace referencia a un heteropolímero de desoxirribonucleótidos.

15 La secuencia nucleotídica que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintética. Generalmente, los segmentos de ADN que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de la presente invención se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y de oligonucleótidos cortos de enlace, o a partir de una serie de oligonucleótidos, con el fin de proporcionar un gen sintético capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un

20 operón microbiano o vírico.

El término «producto de expresión» define al polipéptido o a la proteína que es el producto natural de la traducción del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por tanto, que codifican el mismo aminoácido o aminoácidos.

El término «fragmento”, cuando se refiere a una secuencia de codificación, define una porción de ADN que no

25 comprende la región codificante completa, cuyo producto de expresión retiene esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante completa.

El término «segmento de ADN» hace referencia a un polímero de ADN, en la forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, sin materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que 30 permite la identificación, la manipulación y la recuperación del segmento y de sus secuencias nucleotídicas constituyentes mediante métodos bioquímicos estándar como, por ejemplo, mediante un vector de clonación. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes en dirección 3' (downstream) desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la

35 manipulación o la expresión de las regiones codificantes.

El término «cebador» define una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede aparearse con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3'OH libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.

El término «promotor» define una región de ADN implicada en la unión de la polimerasa de ARN para iniciar la 40 transcripción.

El término «marco de lectura abierto (ORF)»designa una serie de tripletes que codifican aminoácidos sin ningún codón de terminación y que forman una secuencia (potencialmente) traducible en proteína.

El término «aislado» define el material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, 45 pero ese mismo polinucleótido o polipéptido lo estará si queda separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Dichos polinucleótidos pueden formar parte de un vector y/o tales polinucleótidos

o polipéptidos pueden formar parte de una composición y seguir estando aislados en el sentido de que dicho vector

o composición no es parte de su entorno natural.

Los polinucleótidos, y los polipéptidos recombinantes o inmunógenos, descritos de conformidad con la presente 50 invención también pueden presentarse en forma «purificada». El término «purificado» no implica pureza absoluta;

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citosólicas o nucleares, DRIPS y péptidos grandes. No obstante, los péptidos derivados de compartimentos endosómicos o de fuentes exógenas también se encuentran con frecuencia ligados a moléculas de MHC de clase I. Esta vía no clásica de presentación por la clase I se denomina presentación cruzada en la bibliografía. Las moléculas de MHC de clase II, presentes mayoritariamente en las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, presentan predominantemente péptidos de proteínas exógenas que son captadas por las APC mediante endocitosis y después son procesadas por las mismas. Al igual que en la clase I, en las moléculas de MHC de clase II se han descrito otras vías alternativas para el procesamiento de antígenos que permiten a los péptidos procedentes de fuentes endógenas ser presentados por ellas (p. ej., autofagocitosis). Los complejos formados por un péptido y una molécula de MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos portadores del TCR apropiado y, por su parte, los complejos formados por un péptido y una molécula de MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T cooperadores CD4-positivos portadores del TCR apropiado.

Los linfocitos T cooperadores CD4+ cumplen un importante papel en la organización de las funciones efectoras de las respuestas antitumorales de los linfocitos T y, por esta razón, la identificación de los epítopos derivados de antígenos asociados a tumor (AAT) que reconocen los linfocitos T CD4+ puede ser de gran importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos que desencadenen respuestas inmunitarias antitumorales (Kobayashi,H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. Clin. Cancer Res. 2002, 8:3219-3225, Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N. K. Altorki, R. G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y. T. Chen, A. Knuth, and L. J. Old. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 2003, 100(15):8862-7). Los linfocitos TCD4+ pueden dar lugar a aumentos locales del IFNgamma (Qin Z, Schwartzkopff J, Pradera F, Kammertoens T, Seliger B, Pircher H, Blankenstein T; A critical requirement of interferon gammamediated angiostasis for tumor rejection by CD8+ T cells; J Cancer Res; 2003, 63(14):4095-4100).

En modelos de mamífero como el ratón se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden inhibir la manifestación de los tumores sin el concurso de las células efectoras CTL (los linfocitos T CD8-positivos) a través de la inhibición de la angiogénesis mediante la secreción de interferón gamma (IFN-γ) (Qin, Z. and T. Blankenstein. CD4+ T-cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells. Immunity. 2000, 12:677-686). Además, se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden contrarrestar la progresión tumoral mediante la inducción de respuestas de anticuerpos al reconocer péptidos de antígenos asociados a tumor presentados por moléculas HLA de clase II (Kennedy, R. C., M.

H. Shearer, A. M. Watts, and R. K. Bright. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. Cancer Res. Res. 2003, 63:1040-1045). A diferencia de lo que sucede con los péptidos asociados a tumor reconocidos por moléculas HLA de clase I, hasta la fecha el número descrito de ligandos de clase II derivados de antígenos asociados a tumor (AAT) es pequeño (www. cancerimmunity. org, www. syfpeithi. de).

Puesto que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II solo se da normalmente en las células inmunitarias (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 1996, 14:301-331), se creía imposible aislar péptidos de clase II directamente de los tumores primarios. Sin embargo, los inventores han logrado identificar con éxito cierto número de epítopos de MHC de clase II directamente de los tumores (EP 1642905, EP 1760088; Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Müller M, Krämer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanović S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170).

En ausencia de inflamación, la expresión de las moléculas MHC de clase II se circunscribe principalmente a las células del sistema inmunitario, en concreto a las células presentadoras de antígeno (APC), como, por ejemplo, monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos y células dendríticas. En pacientes oncológicos se ha descubierto con sorpresa que algunas células tumorales expresan moléculas MHC de clase II (Dengjel J, Nastke MD, Gouttefangeas C, Gitsioudis G, Schoor O, Altenberend F, Müller M, Krämer B, Missiou A, Sauter M, Hennenlotter J, Wernet D, Stenzl A, Rammensee HG, Klingel K, Stevanović S.; Unexpected abundance of HLA class II presented peptides in primary renal cell carcinomas; Clin Cancer Res. 2006; 12:4163-4170).

Para que un péptido desencadene una respuesta inmunitaria celular, debe unirse a una molécula de MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula de MHC y de los polimorfismos específicos de la secuencia de aminoácidos del péptido. Los péptidos que se unen a las MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 10 residuos de aminoácidos y suelen contener dos residuos conservados (“anclaje”) en su secuencia que interactúan con la hendidura de unión correspondiente de la molécula de MHC. De este modo, cada alelo del MHC tiene un «motivo de unión» que determina qué péptidos pueden unirse específicamente a la hendidura de unión (Rammensee HG, Bachmann J, Stevanovic S. MHC ligands and peptide motifs, Landes Bioscience, USA, 1997).

En la reacción inmunitaria dependiente de MHC, los péptidos no sólo tienen que ser capaces de unirse a ciertas moléculas de MHC expresadas por las células tumorales, sino que también deben ser reconocidos por linfocitos T portadores de receptores de linfocitos T específicos (TCR).

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han descrito efectos adversos graves o autoinmunidad severa. Se han descrito formas leves de vitíligo en algunos pacientes que habían sido tratados con péptidos asociados a melanoma.

Sin embargo, la sensibilización de un tipo de CTL no suele bastar para erradicar todas las células tumorales. Los tumores mutan mucho y, por tanto, son capaces de responder rápidamente a los ataques de los CTL cambiando su patrón de proteínas para no ser reconocidos por estos. A fin de contrarrestar los mecanismos de evasión tumoral, en la vacunación se emplean diversos péptidos específicos. De este modo se puede desplegar un amplio ataque simultáneo contra el tumor por parte de varios clones de CTL a la vez. Así se puede reducir la posibilidad de que el tumor eluda la respuesta inmunitaria. Esta hipótesis ha sido confirmada recientemente en un estudio clínico que trataba a pacientes con melanoma avanzado. Con pocas excepciones, los pacientes que presentaban al menos tres respuestas de linfocitos T distintas, manifestaron respuestas clínicas objetivas o enfermedad estable (Banchereau et al., 2001) así como un aumento de la supervivencia (comunicación personal de J. Banchereau), mientras que a la inmensa mayoría de los pacientes con menos de tres respuestas de los linfocitos T se les diagnosticó enfermedad en progresión.

En un estudio de los solicitantes se observaron efectos semejantes en pacientes aquejados por carcinoma de células renales que fueron tratados con una vacuna compuesta de 13 péptidos distintos (H. Singh-Jasuja, S. Walter,

T. Weinschenk, A. Mayer, P. Y. Dietrich, M. Staehler, A. Stenzl, S. Stevanovic, H. Rammensee, J. Frisch; Correlation of T-cell response, clinical activity and regulatory T-cell levels in renal cell carcinoma patients treated with IMA901, a novel multi-peptide vaccine; Reunión de ASCO 2007 Póster n.º 3017; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen,

A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, Reunión de ASCO 2007; Póster n.º 3017).

La tarea más importante en el desarrollo de una vacuna antitumoral no sólo consiste en identificar y caracterizar nuevos antígenos asociados a tumores y los epítopos inmunogénicos para los linfocitos T cooperadores derivados de los mismos, sino también en combinar diferentes epítopos para aumentar las probabilidades de obtener una respuesta contra más de un epítopo en cada paciente. Por consiguiente, uno de los objetos de la presente invención consiste en ofrecer combinaciones de secuencias de aminoácidos de péptidos que tengan la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) de clase I (HLA de clase I). Otro objeto de la presente invención consiste en ofrecer una vacuna antitumoral eficaz que esté basada en una combinación de los péptidos.

En la presente invención, los inventores aislaron directamente de tumores de mamífero y después caracterizaron péptidos que se unen a moléculas HLA de clase I o II, es decir, muestras primarias procedentes principalmente de pacientes con glioblastoma, pero también muestras de tejido primario de cáncer colorrectal, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón, cáncer de páncreas, melanoma maligno y cáncer de estómago.

La presente descripción proporciona péptidos que proceden de antígenos asociados con la oncogénesis, y que tienen la capacidad de unirse lo suficiente a moléculas de MHC (HLA) de clase II para desencadenar una respuesta inmunitaria por parte de los leucocitos humanos, especialmente de los linfocitos, especialmente de los linfocitos T, especialmente de los linfocitos T CD4-positivos, y especialmente de los linfocitos T CD4-positivos que median en las respuestas inmunitarias de tipo TH1.

La presente invención proporciona péptidos que proceden de antígenos asociados con la oncogénesis, y que tienen la capacidad de unirse lo suficiente a moléculas de MHC (HLA) de clase I para desencadenar una respuesta inmunitaria por parte de los leucocitos humanos, especialmente de los linfocitos, especialmente de los linfocitos T, especialmente de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos, así como combinaciones de los dos que sean especialmente útiles para la vacunación de pacientes aquejados de cáncer.

De acuerdo con la presente invención, el objeto se resuelve proporcionando una composición farmacéutica que comprende un péptido consistente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º 2, y un péptido consistente en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º 3, así como un vehículo farmacéuticamente aceptable. Las composiciones farmacéuticas de la presente invención también pueden comprender, además, como mínimo otro péptido adicional constituido por una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID N. º 1 y las SEQ ID N. º 4 a SEQ ID N. º 12. Los péptidos también pueden tener enlaces no peptídicos.

Tal y como se describe en la presenta memoria más adelante, se ha comprobado que, con la excepción de MET005, todos los péptidos que forman la base de la presente invención son presentados por células portadoras de MHC de clase I. Así pues, estos péptidos concretos, así como otros péptidos que contengan la secuencia (péptidos derivados), desencadenan una respuesta de linfocitos T específicos, aunque la magnitud de esa respuesta puede variar según el péptido de que se trate y según el paciente. Las diferencias, entre otras razones, podrían deberse a mutaciones en los péptidos. La persona versada en la materia conoce bien los métodos aplicables para determinar la magnitud de la respuesta que desata un péptido concreto, en particularsi consulta los ejemplos expuestos en la presente memoria y en la bibliografía correspondiente.

Los péptidos proceden de antígenos asociados a tumores, especialmente de antígenos asociados a tumores que intervienen en procesos como, por ejemplo, la proteólisis, angiogénesis, crecimiento celular, regulación del ciclo celular, división celular, regulación de la transcripción, regulación de la traducción, invasión de tejidos, etc. La Tabla 3 expone los péptidos y la función de la proteína de la cual derivan.

Tabla 3: Péptidos (2 y 3 de conformidad con la presente invención) y función de la proteína original

SEQ ID N. º

ID del péptido Secuencia Símbolo del gen Función Se une a MHC

1

CSP-001 TMLARLASA CSPG4 Proteoglucano transmembrana implicado en la neovascularización HLA-A*02

2

FABP7-001 LTFGDVVAV FABP7 Proteína de unión a ácidos grasos específica del SNC HLA-A*02

3

NLGN4X001 NLDTLMTYV NLGN4X Molécula de adhesión celular HLA-A*02

4

TNC-001 AMTQLLAGV TNC Proteína de matriz extracelular HLA-A*02

5

NRCAM-001 GLWHHQTEV NRCAM Molécula de adhesión a células neuronales HLA-A*02

6

IGF2BP3001 KIQEILTQV IGF2BP3 Proteína de unión a ARNm HLA-A*02

7

BCA-002 ALWAWPSEL BCAN Proteoglucano HLA-A*02

8

MET-005 TFSYVDPVITSISPKYG MET Receptor de factor de crecimiento TUMAP de HLA de clase I elongado

5

Proteoglucano de sulfato de condroitina 4 (CSPG4)

El CSPG4 (proteoglucano de sulfato de condroitina) representa un proteoglucano de sulfato de condroitina integrado en la membrana. Es conocido por ser un marcador superficial de progresión precoz del melanoma, implicado en la estimulación de la proliferación, la migración y la invasión de las células tumorales. El CSPG4 se expresa

10 intensamente en >90% de las lesiones de melanoma humano. Aunque el CSPG4 no es estrictamente específico de tumor, las respuestas de los linfocitos T CD4+ reactivos a tumores en pacientes con melanoma y en individuos sanos reconocen el CSPG4693-709 en células de melanoma que expresan el HLA-DR11 en ausencia de autoinmunidad (Erfurt et al., 2007).

La expresión del CSPG4 potencia la diseminación de las células mediada por integrinas, la fosforilación de FAK

15 (cinasa de adhesión focal) y la activación de ERK1/2 (cinasa regulada por señal extracelular) (Yang et al., 2004). Asimismo, existen cada vez más indicios procedentes de datos in vitro de que el CSPG4 desempeña un importante papel en la angiogénesis tumoral. Así pues, en los tumores positivos para CSPG4 se ha observado una tasa de neovascularización y volúmenes vasculares notablemente elevados, y se ha comprobado que el CSPG4 secuestra la angiostatina, cosa que normalmente inhibe la proliferación de las células endoteliales y la angiogénesis. Los vasos

20 inmaduros también contienen pericitos positivos para CSPG4, lo cual apunta a la intervención de esta población celular en la modulación de la proliferación de las células endoteliales por medio del bloqueo de los efectos inhibitorios de la angiostatina durante el desarrollo de los vasos (Chekenya et al., 2002b).

La expresión de CSPG4 también ha sido descrita en algunos tejidos normales aparte de en los pericitos activados en las células endoteliales, condrocitos, células musculares lisas, ciertos queratinocitos basales de la epidermis, así

25 como en células del folículo piloso (Campoli et al., 2004).

En el curso de la angiogénesis y como respuesta a patologías del SNC, las células de alta motilidad que expresan el CSPG4 sufren rápidos cambios morfológicos y son reclutadas en puntos donde está teniendo lugar crecimiento y reparación vascular. El CSPG4 se sobreexpresa tanto en las células tumorales como en los pericitos de los vasos sanguíneos de tumores cerebrales malignos (Chekenya and Pilkington, 2002). Con la implantación de células 30 procedentes de una línea celular humana de glioma positiva para CSPG4 en cerebros de ratas atímicas inmunodeficientes se pudo demostrar que estos tumores presentan una densidad microvascular superior a la de las ratas control, lo cual implica que la expresión del CSPG4 regula tanto la función como la estructura de la vasculatura

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Las mutaciones del gen NLGN4 ligado a X son una causa potencial de trastornos del espectro autista y se han descrito mutaciones en varios pacientes con autismo, síndrome de Asperger y retraso mental (Jamain et al., 2003; Laumonnier et al., 2004; Lawson-Yuen et al., 2008).

Se han descrito algunas asociaciones del NLGN4X con el cáncer: En tumores estromales gastrointestinales se ha observado sobreexpresión del NLGN4X en pacientes pediátricos y adultos jóvenes respecto a los adultos de edad más avanzada (Prakash et al., 2005).

Tenascina C (hexabraquión) (IMA-TNC-001)

La matriz extracelular que rodea las células tumorales es distinta de la matriz extracelular de los tejidos normales. La tenascina C (TNC) es una proteína de la matriz extracelular que experimenta una regulación al alza muy acusada en procesos estrechamente vinculados con la actividad migratoria como son el desarrollo embrionario (Bartsch et al., 1992), la cicatrización de heridas (Mackie et al., 1988) y los procesos neoplásicos (Chiquet-Ehrismann, 1993; Chiquet-Ehrismann and Chiquet, 2003). Además, la TNC aparece sobreexpresada en vasos tumorales que muestran un elevado índice proliferativo, lo cual indica su implicación en la angiogénesis neoplásica (Kim et al., 2000). En el tejido humano normal la expresión de la TNC solo se detecta en raras ocasiones, mientras que en los gliomas presenta elevados niveles de expresión (Bourdon et al., 1983). La hipoxia puede estimular la expresión de la TNC (Lal et al., 2001), bien a través del TGFbeta1, lo cual proporciona un mecanismo para la invasión del parénquima sano por los gliomas de alto grado (Hau et al., 2006), bien a través de la gastrina, que modula significativamente la migración de las células de GBM humanas (Kucharczak et al., 2001). La TNC regula a la baja la tropomiosina1 y por ello desestabiliza las fibras de estrés de actina. Además, causa la regulación a la baja del inhibidor de la ruta de Wnt Dickkopf1. Dado que el descenso de la expresión de la tropomiosina1 y el aumento de la vía de señalización de las Wnt están vinculados estrechamente con la transformación y la oncogénesis, la TNC modula específicamente estas vías de señalización potenciando la proliferación de las células de glioma (Ruiz et al., 2004).

En los tejidos de GBM se observa tinción perivascular de TNC alrededor de los vasos sanguíneos que irrigan el tumor, mientras que ésta es menos frecuente en los gliomas de grado II y III de la OMS, lo cual indica que la intensidad de la tinción de TNC está correlacionada con el grado del tumor y que cuanto más intensa es, peor es el pronóstico (Herold-Mende et al., 2002). La TNC también contribuye a generar un nicho de citoblastos dentro de la zona subventricular (ZSV), interviniendo en la organización de la señalización de los factores de crecimiento para acelerar el desarrollo de los neurocitoblastos. El efecto predominante de la TNC sobre las células situadas en la ZSV consiste en la regulación de la progresión del desarrollo (Garcion et al., 2004). La TNC es el inductor más potente de la migración dirigida de los neurocitoblastos humanos. Así, la matriz extracelular producida por el tumor ofrece un entorno permisivo para el tropismo de los neurocitoblastos en células tumorales diseminadas (Ziu et al., 2006).

Molécula de adhesión celular neuronal (IMA-NRCAM-001)

La NRCAM (molécula de adhesión celular neuronal) es una molécula de adhesión celular trasmembrana de neuronas que contiene varios dominios de tipo C2 similares a inmunoglobulina y dominios de fibronectina de tipo III. Interviene en la guía, desarrollo de ramificaciones y la fasciculación de las neuronas (Grumet et al., 1991; Morales et al., 1993; Stoeckli and Landmesser, 1995; Perrin et al., 2001; Sakurai et al., 2001)mediante la formación de interacciones homofílicas y heterofílicas con otras IgCAM (Volkmer et al., 1996; Sakurai et al., 1997; Zacharias et al., 1999). La NRCAM unida a anquirina (Davis and Bennett, 1994) está regulada al alza en las células endoteliales que forman tubos, lo que sugiere su posible intervención en la formación de los tubos y en la angiogénesis (Aitkenhead et al., 2002).

La NRCAM es un gen diana de la ß-catenina y del complejo de plakoglobina-LEF/TCF que contribuye a la oncogénesis (Conacci-Sorrell et al., 2002). El dominio exterior de NRCAM se puede desprender de la superficie celular por actividades similares a las de las metaloproteasas. Este dominio desprendido es capaz de activar varias vías de señalización, potenciar la motilidad celular y desatar la oncogénesis en ratones (Conacci-Sorrell et al., 2005).

La NRCAM aparece regulada al alza en astrocitomas anaplásicos y en tejidos de GBM en comparación con el cerebro normal, y las concentraciones elevadas están correlacionadas con el comportamiento invasivo (Sehgal et al., 1998). El ARN antisentido dirigido contra la NRCAM reduce la capacidad oncogénica de las células de GBM humanas (Sehgal et al., 1999).

Proteína de unión 3 al ARNm del factor de crecimiento insulinoide 2 (IMA-IGF2BP3-001)

La IGF2BP3 pertenece a la familia de las proteínas de unión al ARNm del factor de crecimiento insulinoide-II, implicada en la localización, recambio y control traduccional del ARNm. La proteína contiene varios dominios KH (homólogo con K), que son importantes para la unión al ARN, y se sabe que intervienen en la síntesis y el metabolismo del ARN. La expresión ocurre principalmente en el desarrollo embrionario y ha sido descrita en algunos tumores. Por ello, la IGF2BP3 se considera una proteína oncofetal (Liao et al., 2005). La presencia de altas concentraciones del transcrito de IGF2BP3 en numerosos tejidos tumorales en comparación con tejidos de control indica que dicha proteína podría desempeñar una función en las células transformadas en proliferación. Esta hipótesis está avalada por el hallazgo de que el único tejido humano no canceroso que expresa el transcrito de la IGF2BP3 es la placenta, tejido caracterizado por el crecimiento y la proliferación celular (Mueller-Pillasch et al.,

1997).

La bibliografía científica no contiene información específica sobre la expresión de la IGF2BP3 en el GBM, pero se ha descrito su sobreexpresión en otros tipos de cáncer.

Por ejemplo, la IGF2BP3 se expresa en muestras de carcinoma renal de células claras y su expresión está asociada con un estadio y un grado avanzado de los tumores primarios. Además, su expresión positiva está asociada con un aumento de entre 5 y 10 veces en el riesgo de metástasis a distancia y con un aumento del riesgo de muerte por carcinoma renal del 42% al 50% (Hoffmann et al., 2008; Jiang et al., 2006; Jiang et al., 2008). La expresión de la IGF2BP3 también se ha detectado en el melanoma en comparación con nevus benignos, en los que no se detectó expresión aún en presencia de rasgos displásicos (Pryor et al., 2008). En los pacientes aquejados de carcinoma epidermoide de esófago se pueden observar linfocitos T específicos para un epítopo peptídico restringido al HLAA*2402 derivado de la IGF2BP3 entre los linfocitos infiltrados en el tumor (TIL), los linfocitos de los ganglios linfáticos regionales y los linfocitos de sangre periférica en el 40% de los casos (Mizukami et al., 2008).

La IGF2BP3 también presenta un elevado nivel de expresión en los carcinomas pancreáticos. En dos estudios >90% de las muestras de tejido tumoral pancreático presentaron expresión de la IGF2BP3 revelada por inmunotinción, mientras que en los tejidos pancreáticos no neoplásicos dieron negativo. Asimismo, la expresión aumentó progresivamente con el estadio tumoral (Yantiss et al., 2005; Yantiss et al., 2008).

También se ha hallado una elevación significativa de la expresión de la IGF2BP3 en tumores uroteliales de alto grado, si bien en general no se expresa en el urotelio benigno ni en los tumores uroteliales de bajo grado. Asimismo, los pacientes con tumores IGF2BP3-positivos presentan unas tasas de supervivencia sin progresión y de supervivencia sin enfermedad mucho menores que los afectados por tumores IGF2BP3-negativos (Li et al., 2008; Sitnikova et al., 2008; Zheng et al., 2008).

BCAN - Brevicán (IMA-BCA-002)

El brevicán (BCAN) es un miembro específico del cerebro de la familia de proteoglucanos de sulfato de condroitina del lecticán. Se han descrito dos isoformas de BCAN: una isoforma entera que se segrega en la matriz extracelular y otra más corta con una secuencia que predice un anclaje de glucofosfatidilinositol (GPI). La isoforma segregada se expresa mucho desde el nacimiento hasta los 8 años de edad y queda regulada a la baja alrededor de los 20 años, manteniéndose en niveles bajos en la corteza adulta normal. La isoforma con GPI se expresa en niveles uniformemente bajos a lo largo del desarrollo (Gary et al., 2000). El BCAN pertenece a una familia de proteoglucanos que suelen ser descritos como moléculas de barrera que impiden la motilidad de las células y de las neuritas en el sistema nervioso adulto (Viapiano and Matthews, 2006). En condiciones in vivo, el BCAN se expresa alrededor de los límites del torrente migratorio rostral (Jaworski and Fager, 2000) y es un componente importante regulado al alza de las cicatrices gliales que aparecen a raíz de lesiones neurales (Jaworski et al., 1999).

El BCAN muestra una espectacular regulación al alza en los gliomas, pues la expresión se multiplica aproximadamente por siete respecto a los niveles normales (Gary et al., 2000; Gary et al., 1998). La expresión es detectable en los márgenes invasivos de tumores inducidos experimentalmente (Glass et al., 2005) y está elevada en tumores con perfiles infiltrativos elevados (Phillips et al., 2006). Desde el punto de vista clínico, la regulación al alza del BCAN conlleva una menor supervivencia en los pacientes con gliomas de alto grado (Liang et al., 2005). Además de la regulación al alza del BCAN en el glioma, es posible que el procesamiento proteolítico de la proteína entera también contribuya a la invasión (Gary et al., 1998; Nutt et al., 2001). La escisión del BCAN por metaloproteasas de la familia ADAMTS es un paso necesario para que tenga lugar su efecto favorecedor de la invasividad en el glioma. Generando una forma mutante específica de sitio que es resistente a la escisión por ADMATS se ha demostrado que este BCAN «indegradable» es capaz de potenciar la invasión de las células in vitro y la progresión tumoral in vivo en el marco del glioma (Zhang et al., 1998; Viapiano et al., 2008). A escala molecular, el BCAN promueve la activación del EGFR, aumenta la expresión de moléculas de adhesión celular y promueve la secreción de fibronectina (Hu et al., 2008).

El ARNm del BCAN no se ha detectado en muestras de corteza adulta humana procedentes de fallecidos sin complicaciones neurológicas. En marcado contraste, su ARNm sí se ha detectado en las 27 muestras quirúrgicas de glioma humano que componían una serie, lo cual sitúa al BCAN como un posible marcador único y selectivo del glioma (Jaworski et al., 1996).

La regulación al alza del BCAN en el glioma no sólo conduce en general al aumento de la expresión sino también a la expresión de isoformas glucosiladas diferencialmente específica del glioma. A este respecto, B/b∆g es un producto entero del ARNm del BCAN que surge como resultado de la glucosilación incompleta o reducida de la proteína central. B/b∆g se expresa muy poco durante la segunda mitad del desarrollo prenatal y los primeros días del desarrollo postnatal, desaparece al primer año de vida y no se encuentra en el cerebro normal adulto, pero sí en muestras de glioma de alto grado. Un estudio demostró que B/b∆g estaba presente en todas las muestras de glioma de alto grado (grados 3 y 4) y que representaba la mitad de la sobreexpresión total por encima de los niveles del control del BCAN no escindido. Las muestras negativas para B/b∆g correspondían a los pacientes diagnosticados con tumores de bajo grado (Viapiano et al., 2005). Esta expresión específica del glioma de alto grado podría

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de clase I. La unión de un péptido a un complejo de MHC puede ser analizada mediante métodos conocidos en la técnica como, por ejemplo, los descritos más adelante en los ejemplos ofrecidos en la presente invención o los descritos en la bibliografía para diferentes alelos de MHC de clase II (p. ej., Vogt AB, Kropshofer H, Kalbacher H, Kalbus M, Rammensee HG, Coligan JE, Martin R; Ligand motifs of HLA-DRB5*0101 and DRB1*1501 molecules delineated from self-peptides; J Immunol. 1994; 153(4):1665-1673; Malcherek G, Gnau V, Stevanovic S, Rammensee HG, Jung G, Melms A; Analysis of allele-specific contact sites of natural HLA-DR17 ligands; J Immunol. 1994; 153(3):1141-1149; Manici S, Sturniolo T, Imro MA, Hammer J, Sinigaglia F, Noppen C, Spagnoli G, Mazzi B, Bellone M, Dellabona P, Protti MP; Melanoma cells present a MAGE-3 epitope to CD4(+) cytotoxic T cells in association with histocompatibility leukocyte antigen DR11; J Exp Med. 1999; 189(5): 871-876; Hammer J, Gallazzi F, Bono E, Karr RW, Guenot J, Valsasnini P, Nagy ZA, Sinigaglia F; Peptide binding specificity of HLA-DR4 molecules: correlation with rheumatoid arthritis association; J Exp Med. 1995 181(5):1847-1855; Tompkins SM, Rota PA, Moore JC, Jensen PE; A europium fluoro-immunoassay for measuring binding of antigen to class II MHC glycoproteins; J Immunol Methods. 1993;163(2): 209-216; Boyton RJ, Lohmann T, Londei M, Kalbacher H, Halder T, Frater AJ, Douek DC, Leslie DG, Flavell RA, Altmann DM; Glutamic acid decarboxylase T lymphocyte responses associated with susceptibility or resistance to type I diabetes: analysis in disease discordant human twins, non-obese diabetic mice and HLA-DQ transgenic mice; Int Immunol. 1998 (12):1765-1776).

Otros segmentos de aminoácidos localizados en las regiones N-y/o C-terminal que no forman necesariamente parte del péptido que actúa como epítopo real para las moléculas de MHC podrían, no obstante, ser importantes para conseguir introducir con eficiencia en las células el péptido conforme a la presente invención. Se describe el péptido de la presente invención como parte de una proteína de fusión que comprende, por ejemplo, los 80 aminoácidos Nterminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo «Ii”) como la derivada del NCBI, número de acceso de GenBank X00497 (Strubin, M., Mach, B. and Long, E. O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)).

Además, el péptido puede ser modificado aún más para mejorar la estabilidad y/o la unión a las moléculas de MHC con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria más potente. Los métodos para conseguir esa optimización de una secuencia peptídica son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la introducción de enlaces peptídicos inversos o enlaces no peptídicos.

Así pues, de acuerdo con otro aspecto la invención proporciona una composición farmacéutica, en la que al menos un péptido incluye enlaces no peptídicos.

En un enlace peptídico inverso los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino que el enlace peptídico está invertido. Estos peptidomiméticos retro-inversos pueden sintetizarse con métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo los descritos por Meziere et al. (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, y que se incorporan en la presente memoria como referencia. Esta estrategia implica la síntesis de seudopéptidos que contengan cambios en la estructura principal, pero no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere et al. (1997) demuestran que estos seudopéptidos resultan útiles para las respuestas de MHC y de los linfocitos T cooperadores. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteolisis.

Enlaces no peptídicos son, por ejemplo: -CH2-NH, -CH2S-, -CH2CH2-, -CH=CH-, -COCH2-, -CH(OH)CH2- y -CH2SO-. La patente de Estados Unidos 4. 897. 445 proporciona un método para la síntesis en fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH2-NH) en cadenas polipeptídicas que implica la obtención de polipéptidos con procedimientos estándar y la síntesis del enlace no peptídico mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido en presencia de NaCNBH3.

Péptidos que comprenden las secuencias de la invención descritas arriba pueden ser sintetizados con otros grupos químicos añadidos en los extremos amino y/o carboxi, con el fin de mejorar, por ejemplo, la estabilidad, biodisponibilidad y/o afinidad de los péptidos. Por ejemplo, grupos hidrófobos como los grupos carbobenzoxilo, dansilo, o t-butiloxicarbonilo pueden añadirse a los extremos amino de los péptidos. De manera similar, se puede colocar un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo en los extremos amino de los péptidos. Asimismo, p. ej., el grupo hidrófobo t-butiloxicarbonilo, o un grupo amido pueden ser añadidos en los extremos carboxi de los péptidos.

Adicionalmente, todos los péptidos de la invención pueden ser sintetizados para alterar su configuración estérica. Por ejemplo, puede utilizarse el isómero D de uno o más de los residuos de aminoácidos del péptido en lugar del isómero L habitual.

De manera similar, un péptido de la invención puede ser modificado químicamente mediante la reacción con aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. Ejemplos de tales modificaciones son bien conocidos en la técnica y aparecen resumidos por ejemplo en R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, que se incorpora en la presente memoria como referencia. La modificación química de aminoácidos incluye, sin ánimo limitativo, la modificación por acilación, amidación, piridoxilación de lisina, alquilación reductora, trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), transformación de grupos carboxilo en grupos amida y oxidación del grupo sulfhidrilo con ácido perfórmico para convertir la cisteína en ácido cisteico, formación de derivados mercuriales, formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol, reacción con maleimida, carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida y carbamoilación con cianato a pH alcalino, aunque sin limitación a ello. A este respecto, se remite a las personas versadas en la técnica al Capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Sons NY 1995-2000), donde hallarán una metodología más extensa relacionada con la modificación química de proteínas.

La modificación de proteínas y péptidos terapéuticos con PEG se asocia a menudo con una prolongación de la semivida en circulación, mientras que la unión por entrecruzamiento de proteínas con glutaraldehído, diacrilato de polietilenglicol y formaldehído se emplea en la preparación de hidrogeles. La modificación química de alérgenos con fines de inmunoterapia se consigue a menudo mediante la carbamilación con cianato potásico.

En general, los péptidos (al menos aquellos que contienen enlaces peptídicos entre los residuos de aminoácidos) pueden ser sintetizados, p. ej., utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida por el método de Fmoc-poliamida, como muestra Lu et al. (1981) J. Org. Chem. 46, 3433 y las referencias que aparecen en el mismo.

La purificación puede llevarse a cabo mediante una sola o una combinación de técnicas como la recristalización, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por interacción hidrófoba, y (normalmente) cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa utilizando, p. ej., separación con gradiente de acetonitrilo/agua.

El análisis de los péptidos puede efectuarse utilizando cromatografía en capa fina, electroforesis, en particular electroforesis capilar, extracción en fase sólida (CSPE), cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa, análisis de aminoácidos tras hidrólisis ácida y análisis con espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (FAB), así como análisis con espectrometría de masas MALDI y ESI-Q-TOF.

Se describe un ácido nucleico (p. ej. un polinucleótido) que codifica un péptido de la invención. El polinucleótido puede ser, p. ej., ADN, ADNc, ANP, ANC o ARN, ya sea monocatenario y/o bicatenario, o formas nativas o estabilizadas de polinucleótidos, como, p. ej., polinucleótidos con una estructura de fosforotioato, o combinaciones de los mismos, y puede contener intrones siempre que codifique el péptido. Por supuesto, sólo los péptidos que contengan residuos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídicos naturales pueden ser codificados por un polinucleótido. Se describe un vector de expresión capaz de expresar un péptido conforme a la invención. En la técnica se conocen bien vectores de expresión para diferentes tipos de células que pueden ser seleccionados sin demasiada experimentación.

En general, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación apropiada y el marco de lectura correcto para asegurar la expresión. Si es necesario, el ADN se puede enlazar con secuencias nucleotídicas de control que regulan la transcripción o la traducción y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque en general tales controles ya suelen estar incluidos en el propio vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en el hospedador mediante técnicas estándar. Se pueden hallar indicaciones, p. ej., en Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY.

En una forma de realización especialmente preferida de la invención, la composición farmacéutica comprende un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º 2, y en un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º 3.

La cantidad óptima de cada péptido que ha de incluirse en la vacuna y la pauta posológica óptima pueden ser determinadas por una persona versada en la técnica sin demasiada experimentación. Por ejemplo, el péptido o su variante pueden ser preparados para la inyección por vía intravenosa (i. v.), subcutánea (s. c.), intradérmica (i. d.), intraperitoneal (i. p.) o intramuscular (i. m.). Los métodos preferidos para la inyección del péptido son s. c., i. d., i. p.,

i. m. e i. v. Los métodos preferidos para la inyección del ADN son i. d., i. m., s. c., i. p. e i. v. Según el péptido o ADN de que se trate se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 1 y 500 mg, 50 µg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 µg a 500 µg de péptido o ADN. Dosis de este rango se han utilizado con éxito en varios ensayos (Brunsvig PF, Aamdal S, Gjertsen MK, Kvalheim G, Markowski-Grimsrud CJ, Sve I, Dyrhaug M, Trachsel S, Møller M, Eriksen JA, Gaudernack G. Telomerase peptide vaccination: a phase I/II study in patients with non-small cell lung cancer; Cancer Immunol Immunother. 2006; 55(12):1553-1564; M. Staehler, A. Stenzl, P. Y. Dietrich, T. Eisen, A. Haferkamp, J. Beck, A. Mayer, S. Walter, H. Singh, J. Frisch, C. G. Stief; An open label study to evaluate the safety and immunogenicity of the peptide based cancer vaccine IMA901, Reunión de ASCO 2007; Resumen N. º 3017).

La composición farmacéutica de la invención puede elaborarse de modo que la selección, el número y/o cantidad de péptidos presentes en la composición sea/sean específicos de tejido, de cáncer y/o de paciente. Por ejemplo, la selección exacta de los péptidos puede estar guiada por los patrones de expresión de las proteínas originales en un tejido dado para evitar efectos secundarios. La selección puede depender del tipo específico de cáncer que el paciente padece, así como del curso de la enfermedad, los regímenes terapéuticos previos, el estado inmunitario del paciente y, por supuesto, de su haplotipo HLA. Además, la vacuna conforme a la invención puede contener componentes individualizados, de acuerdo con las necesidades personales del paciente en cuestión. Ejemplos de

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administrarse durante el mismo ciclo de tratamiento pero en días distintos y/o en ciclos de tratamiento distintos.

Se describe un método para tratar o prevenir el cáncer en un paciente, comprendiendo dicho método la administración de una cantidad terapéuticamente eficaz de cualquiera de las composiciones farmacéuticas de la invención.

Una cantidad terapéuticamente eficaz será una cantidad suficiente para inducir una respuesta inmunitaria, en particular una activación de una subpoblación de CTL. Una persona versada en la técnica puede determinar fácilmente si una cantidad es eficaz utilizando métodos inmunológicos estándar, como los facilitados en los ejemplos de las presentes especificaciones. Otra forma de monitorizar el efecto de cierta cantidad de la composición farmacéutica consiste en observar el crecimiento del tumor tratado y/o su recurrencia.

En una forma de realización especialmente preferida de la presente invención, la composición farmacéutica se utiliza como una vacuna contra el cáncer.

La composición que contiene péptidos también puede constituir una vacuna antitumoral o contra el cáncer. La vacuna puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o por vía sistémica, o aplicarse ex vivo a células derivadas del paciente o a una línea celular humana que después se administra al paciente, o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias derivadas del paciente que después se le vuelven a administrar.

La composición de la invención se puede utilizar en un método para tratar o ser utilizada como una vacuna contra el cáncer. El cáncer puede ser de la cavidad bucal o la faringe, cáncer del tubo digestivo, cáncer de colon, recto o ano, cáncer de las vías respiratorias, cáncer de mama, cáncer de cuello de útero, vagina o vulva, cáncer del cuerpo uterino y de ovario, cancer de las vías genitales masculinas,cáncer de las vías urinarias, cáncer de hueso y tejido blando, sarcoma de Kaposi, melanoma cutáneo, melanoma ocular, y cáncer ocular no melanómico, cáncer de cerebro y del sistema nervioso central, cáncer de tiroides y de otras glándulas endocrinas, linfoma de Hodgkin, linfoma no hodgkiniano o mieloma, preferentemente cáncer renal, cáncer colorrectal, cáncer de pulmón, cáncer de mama, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, cáncer de estómago, cáncer cerebral, GIST o glioblastoma, preferentemente tumores cerebrales y aún más preferentemente glioblastomas.

En la forma de realización más preferida del método de tratamiento o vacuna conforme a la invención, la vacuna es una vacuna antitumoral multipeptídica para el tratamiento del GBM. La vacuna comprende un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º 2, y un péptido que consta de la secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N. º 3 y opcionalmente al menos un péptido adicional consistente en una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID N. º 1 y las SEQ ID N. º 4 a SEQ ID N. º 12 que están localizados y han sido identificados en células de glioblastoma primario. Este conjunto incluye péptidos de HLA de clase I y clase

II. El conjunto de péptidos también puede contener al menos un péptido, como el antígeno central del VHB, a modo de péptido de control positivo que actúe como marcador inmunitario para verificar la eficacia de la administración intradérmica. En una forma de realización particular, la vacuna consiste en 14 péptidos individuales (conformes a las SEQ ID N. º 1 a SEQ ID N. º 12), con entre aproximadamente 1500 µg a aproximadamente 75 µg, preferentemente entre aproximadamente 1000 µg a aproximadamente 750 µg, y más preferentemente entre aproximadamente 500 µg y aproximadamente 600 µg, y la más preferida aproximadamente 578 µg de cada péptido, todos los cuales se pueden purificar con HPLC y cromatografía de intercambio iónico y presentar un aspecto de polvo blanco o casi blanco. El liofilizado se disuelve preferentemente en hidrogenocarbonato de sodio, y se usa para la inyección intradérmica en los 30 minutos posteriores a su reconstitución a temperatura ambiente. De acuerdo con la presente invención, las cantidades preferidas de péptidos pueden oscilar entre aproximadamente 0,1 y 100 mg, preferentemente entre aproximadamente 0,1 y 1 mg, y aún más preferentemente entre aproximadamente 300 µg y 800 µg por 500 µl de solución. En la presente memoria, el término «aproximadamente» significa +/- 10 por ciento del valor dado, si no se indica otra cosa distinta. La persona versada en la técnica será capaz de ajustar la cantidad real de péptido que debe utilizarse en función de varios factores, como, por ejemplo, el estado inmunitario del paciente y/o la cantidad de TUMAP que presenta un tipo particular de cáncer. Los péptidos de la presente invención pueden proporcionarse en otras formas adecuadas (soluciones estériles, etc. ) en lugar de liofilizados.

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender los péptidos en forma libre o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, «una sal farmacéuticamente aceptable» se refiere a un derivado de los péptidos descritos en el que el péptido es modificado para obtener sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (normalmente la forma neutra del fármaco posee un grupo –NH2 neutro) haciéndola reaccionar con un ácido adecuado. Ácidos adecuados para la preparación de sales ácidas incluyen tanto ácidos orgánicos, p. ej., ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico y similares, como ácidos inorgánicos, como, por ejemplo, ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. A la inversa, la preparación de sales básicas a partir de grupos ácidos que pueden estar presentes en un péptido se lleva a cabo con una base farmacéuticamente aceptable como

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un control pasa/no pasa(ligando relativamente débil). Como control positivo se incluye un ligando de HLA-DR fuerte y promiscuo. Los valores indican el porcentaje de unión de cada péptido con las moléculas de HLA-DR respecto al control de pasa/no pasa. Como la tecnología REVEALestá limitada a 15-ámeros, se analizaron dos 15-ámeros solapados (posiciones 2-16; 6-20) en lugar del MET-005 entero.

5 Las Figuras 4a y 4b muestran la presencia de linfocitos T CD4+ que segregan IFNγ específico contra PSMA y survivina en células mononucleares de sangre periférica (PBMC) en varios intervalos de tiempo tras la vacunación del paciente, análisis realizado con EliSpot de IFNγ. Intervalos de tiempo: antes de la vacunación (a) y después de 3 (b), 6 (c), 7 (d), 8. (e), 9 (f), 10 (g) y 11 (h) vacunaciones.

La Figura 5 muestra la presencia de linfocitos T CD4+ que segregan IFNγ, IL-5, IL-10 y TNFα específicamente contra

10 la survivina en PBMC en tres intervalos de tiempo distintos tras la vacunación del paciente, analizados con un ensayo de tinción intracelular (ICS). Intervalos de tiempo: después de 1 (a), 3 (b) y 7 (c) vacunaciones.

Ejemplos

1. Síntesis

Los péptidos se sintetizaron con métodos convencionales y conocidos de síntesis en fase sólida basados en la

15 química del Fmoc. Después de la purificación con HPLC preparativa, se aplicó un procedimiento de intercambio iónico para incorporar contraiones fisiológicamente compatibles (por ejemplo acetato, amonio o cloruro). Por último, se los sometió a liofilización y se obtuvo una sustancia sólida blanca o casi blanca. Todos los TUMAP se administran preferentemente en forma de sales de acetato, aunque también es posible hacerlo en forma de otras sales.

Es importante tener presente que la identidad y la pureza de los péptidos se pueden determinar fácilmente y con

20 mucha exactitud con espectrometría de masas, análisis de aminoácidos y HPLC analítica. Según los resultados analíticos, todos los péptidos utilizados en la vacuna IMA950 presentan la estructura correcta con purezas  95%.

Tabla 5: Características fisicoquímicas de los péptidos de IMA950

Longitud del péptido

N. º ID del péptido Tipo de sal Forma física Higroscopicidad

(n. º de aminoácidos)

1

CSP-001 9 acetato Liofilizado blanco o casi blanco Almacenado como polvo liofilizado. Los péptidos liofilizados en general tienen propiedades higroscópicas.

2

FABP7-001 9 acetato

3

NLGN4X-001 9 acetato

4

TNC-001 9 acetato

5

NRCAM-001 9 acetato

6

IGF2BP3-001 9 acetato

7

BCA-002 9 acetato

8

MET-005 17 acetato

9

PTP-003 9 acetato/amonio

10

PTP-005 9 acetato

11

CHI-001 9 acetato

12

BIR-002 15 acetato

13

(HBV-001) 10 acetato

25 2. Componentes de la composición farmacéutica de ejemplo de IMA950

IMA950 está compuesta de un cóctel de péptidos sintéticos asociados a tumores (TUMAP), de los que la mayoría han sido identificados en células primarias de cáncer colorrectal. Los TUMAP incluyen 10 péptidos de unión a HLA de clase I con capacidad para activar linfocitos T citotóxicos (linfocitos T CD8+), un péptido de unión a HLA de clase II con capacidad para activar linfocitos T cooperadores (linfocitos T CD4+), y otro péptido de unión a HLA de clase I elongado dotado con ambas capacidades. Los linfocitos T cooperadores desempeñan un papel esencial porque facilitan la función de los linfocitos T citotóxicos liberando citocinas que potencian la acción citocida de los linfocitos T CD8+ y también podrían actuar directamente contra las células tumorales (Knutson and Disis, 2005). Además de

5 esos doce TUMAP, IMA950 contienen un péptido de control de origen vírico.

Las muestras se extrajeron quirúrgicamente de tejido canceroso y normal de pacientes con GBM y de la sangre de donantes sanos, siendo analizadas de forma escalonada como se indica a continuación:

En primer lugar, se sometieron a un análisis hologenómico de la expresión de ARNm con micromatrices para descubrir los genes sobreexpresados en el tejido maligno en comparación con una gama de órganos y tejidos

10 normales. En segundo lugar, se identificaron con espectrometría de masas los ligandos HLA del material canceroso. A continuación, los ligandos HLA identificados se compararon con los datos de expresión génica. Los péptidos codificados por los genes sobreexpresados o expresados selectivamente que habían sido detectados en el primer paso se consideraron TUMAP candidatos para la vacuna multipeptídica.

Se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica para hallar datos adicionales que avalaran la relevancia de los péptidos 15 identificados como TUMAP.

Por último, se analizó la reactividad de los linfocitos T CD8+ periféricos de individuos sanos contra los ligandos HLA asociados a tumores en el curso de varios inmunoensayos (ensayos de linfocitos T in vitro).

Tabla 3: Composición de los TUMAP de IMA950.

IMA950 contiene diez péptidos de unión a HLA-A*02 (clase I), un péptido de unión a HLA-DR (clase II) y otro péptido 20 a HLA-A*02 elongado. Además, contiene el péptido marcador viral HBV-001 que no se cita aquí.

Tabla 6: Funciones de las proteínas de las que derivan los TUMAP 3. Presentación de los péptidos asociados a tumor (TUMAP) contenidos en IMA950 en muestras tumorales.

ID del TUMAP

Denominación Función / Comentarios

TUMAP de HLA-A*02

BCA-002

Brevicán Molécula de la matriz extracelular específica del cerebro que interviene en la invasión; se sobreexpresa y es desglucosilada específicamente en el glioma; asociada a nicho de citoblastos.

CHI-001

Quitinasa 3-like 2 Proteína extracelular de función poco clara; muy sobreexpresada en el glioblastoma.

CSP-001

Proteoglucano de sulfato de condroitina 4 Proteoglucano transmembrana implicado en la neovascularización; sobreexpresado por células tumorales y pericitos en los vasos sanguíneos de los tumores cerebrales malignos.

FABP7-001

Proteína de unión a ácidos grasos 7, cerebro Proteína citoplasmática implicada en el metabolismo de los ácidos grasos; asociada con el aumento de la motilidad de las células de GBM en el tejido circundante y con una supervivencia corta; muy sobreexpresada en el GBM.

IGF2BP3-001

Proteína de unión 3 al ARNm del factor de crecimiento insulinoide 2 Interviene en el recambio y el control traduccional del ARNm; proteína oncofetal; descrita como sobreexpresada en varios tipos de cáncer donde está asociada con una supervivencia corta.

NLGN4X-001

Neuroligina 4, ligada al cromosoma X Molécula de adhesión celular; escasa bibliografía; muy inmunógena; elevada sobreexpresión en el GBM y el GIST; interviene en la invasión y la oncogénesis.

NRCAM-001

Molécula de adhesión celular neuronal Implicada en la vía de señalización de la beta-catenina; papel importante en la invasión, crecimiento tumoral y oncogénesis; altos niveles de expresión correlacionados con supervivencia breve.

PTP-003

Proteína-tirosina-fosfatasa, receptor, polipéptido Z 1 tipo Proteína transmembrana de tipo I; muy sobreexpresada en glioblastoma, oligodendroglioma y otros tumores; papel funcional en la oncogénesis; con frecuencia experimenta amplificación génica en el GBM y en otros tipos de tumor.

PTP-005

TNC-001

Tenascina C Papel en la angiogénesis; actor importante en varias vías implicadas en la transformación y la proliferación tumoral; sobreexpresada en los vasos sanguíneos que irrigan el tumor; asociada a nicho de citoblastos cancerosos.

TUMAP de HLA-DR

BIR-002

Survivina Antígeno de supervivencia del tumor implicado en la regulación de la apoptosis y la proliferación; la sobreexpresión en gliomas y en otros tipos de tumor está asociada con un mal pronóstico.

TUMAP de HLA-A*02 elongado

MET-005

Protooncogén met Receptor del factor de crecimiento de hepatocitos; implicado en la transformación, la invasividad y la angiogénesis tumorales; descrito como asociado con nicho de GBM.

Muestras de tejido

Las muestras de tejido tumoral fueron facilitadas por el Hôpital Cantonal Universitaire de Genève (Oncología Médica,

5 Laboratorio de inmunología tumoral) y la Neurochirurgische Universitäts-Klinik de Heidelberg (Laboratorio de biología molecular). Los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito antes de la intervención quirúrgica. Los tejidos se criogenizaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y permanecieron a -80ºC hasta el aislamiento de los TUMAP.

Aislamiento de los péptidos HLA de las muestras de tejido

10 Las mezclas de péptidos HLA de las muestras de tejido criogenizadas se obtuvieron por inmunoprecipitación de los tejidos sólidos siguiendo un protocolo ligeramente modificado (Falk, K., 1991; Seeger, F. H. T., 1999) con el anticuerpo específico de HLA-A*02 BB7. 2, el anticuerpo específico de HLA-A, B y C W6/32, sefarosa activada con CNBr, tratamiento con ácido y ultrafiltración.

Detección de los TUMAP mediante cromatografía de líquidos acoplada a espectrometría de masas con ESI (ESI15 LCMS)

Método uno:

Las mezclas de péptidos HLA obtenidas se separaron en función de su hidrofobicidad con cromatografía de fase inversa (CapLC, Waters) y los péptidos eluidos se analizaron con un espectrómetro de masas en tándem híbrido con analizadores cuadrupolar y de tiempo de vuelo con aceleración ortogonal (Q-TOF Ultima, Waters) equipado con una 20 fuente de ESI. Las mezclas de péptidos se cargaron en una precolumna de C18 para proceder a la concentración y la desalación. Una vez cargada, la precolumna se colocó en línea para la separación con una columna microcapilar de sílice fundido (75 µm de d. i. x 250 mm) rellena con material de fase inversa C18 de 5 µm (Dionex). El solvente A era acetato de amonio 4 mM/agua. El solvente B era acetato de amonio 2 mM en acetonitrilo al 80%/agua. El pH de los dos solventes se ajustó a 3,0 con ácido fórmico. Se aplicó un gradiente binario del 15% al 60% de B en 90 25 minutos, con un caudal de 5 µl/min reducido aproximadamente a 200 nl/min por un sistema fraccionamiento. Para la introducción en la fuente micro-ESI se empleó un capilar de vidrio recubierto de oro (PicoTip, New Objective). El tiempo de integración del analizador TOF quedó ajustado en 1,9 s con una pausa entre barridos de 0,1 s. A continuación se reveló la identidad de las secuencias peptídicas mediante espectrometría de masas (ESI-LCMS/MS) con disociación inducida por colisión (CID). La secuencia del TUMAP identificada se confirmó comparando el patrón

30 de fragmentación generado por el TUMAP natural con el patrón de fragmentación de un péptido de referencia sintético de secuencia idéntica.

Método dos:

Las mezclas de péptidos HLA se separaron en función de su hidrofobicidad con cromatografía en fase inversa (sistema Acquity UPLC, Waters) y los péptidos eluidos se analizaron con un espectrómetro de masas híbrido LTQ-Orbitrap (ThermoElectron) equipado con una fuente de ESI. Las mezclas de péptidos se cargaron directamente en 5 una columna microcapilar de sílice fundido (75 µm d. i. x 250 mm) rellena con material de fase inversa C18 de 1,7 µm (Waters) aplicando un caudal de 400 nl por minuto. Posteriormente los péptidos se separaron con un gradiente binario de 180 minutos en dos fases con 10% al 33% de B con un caudal de 300 nl por minuto. El gradiente estaba compuesto por solvente A (ácido fórmico al 0,1% en agua) y solvente B (ácido fórmico al 0,1% en acetonitrilo). Para la introducción en la fuente micro-ESI se empleó un capilar de vidrio recubierto de oro (PicoTip, New Objective). El 10 espectrómetro de masas LTQ-Orbitrap se hizo operar en el modo dependiente de datos con el método TOP5. En resumen, se inició un ciclo de barrido con un barrido completo de alta precisión de masa en el orbitrap (R = 30. 000), al que siguieron barridos EM/EM también en el orbitrap (R = 7500) con los 5 iones precursores más abundantes y exclusión dinámica de los iones preseleccionados. Los espectros de masas en tándem se interpretaron con SEQUEST y control manual adicional. El TUMAP identificado se confirmó comparando el patrón de fragmentación

15 generado por el TUMAP natural con el patrón de fragmentación de un péptido de referencia sintético de idéntica secuencia. Las Figuras 1a y b muestran espectros de ejemplo de varios TUMAP asociados a MHC de clase I obtenidos de tejido tumoral.

La Tabla 7 expone los resultados de un análisis de muestras de glioblastoma, la mayoría procedentes de tumores primarios de GBM. Todos los TUMAP de HLA-A*02 se hallaron en tres o más de las 18 muestras analizadas y cinco

20 de los TUMAP se detectaron en más del 50% de las muestras de GBM analizadas.

Tabla 7: Detección de los TUMAP de clase I en muestras de GBM

Solo se incluyeron muestras tumorales en las que se analizaron los ligandos de clase I("–" = TUMAP de clase I de IMA950 no detectado;"+" = TUMAP de clase I de IMA950 detectado)

N. º

Muestra de GBM Estadio tumoral (grado) TUMAP de clase I detectado (+) o no detectado (-) en el análisis por espectrometría de masas

IMA-BCA-002

IMA-CHI-001 IMA-CSP-001 IMA-FABP7-001 IMA-IGF2BP3-001 IMA-NLGN4X-001 IMA-NRCAM-001 IMA-PTP-003 IMA-PTP-005 IMA-TNC-001

1

GB6010T GBM primario (IV) + + + + + + + + + +

2

GB1023T GBM primario (IV) + + + + + + + + + +

3

GB1021T GBM primario (IV) - + + - - - - + - +

4

GB6003T# GBM primario (IV) - + + - - - - + - -

5

GB1020T GBM primario (IV) - + + - - - + + - +

6

GB6027T GBM primario (IV) + + + - - + - + + +

7

GB1014T# GBM secundario (IV) - - + - - - - + - +

8

GB1012T GBM primario (IV) - - - - - - - + + -

9

GB6019T GBM primario (IV) - - + - - - - + + -

10

GB1002T GBM primario (IV) - + + - - - - + + +

11

GB6024T GBM primario (IV) - + + - - - - + + -

12

GB1006T GBM primario (IV) - - - + - - - + + -

13

GB1004T GBM primario (IV) - + + - - - - + - -

imagen18

imagen19

A diferencia de los estudios de vacunación anteriores, el estudio se centró en el tratamiento de pacientes que presentaban una pequeña carga tumoral todavía indetectable con las técnicas de imagen. Todos los pacientes fueron vacunados del mismo modo utilizando conocidas estructuras antigénicas específicas de la próstata para estimular la respuesta inmunitaria contra las células malignas. Se trató a 19 pacientes.

Tabla 9: Características de la población del estudio

Total

% Mediana Rango

Edad

19 63 55 - 77

Tratamiento neo-/adyuvante previo

Ninguno

11 58

Radiación

3 16

Hormonoterapia intermitente

2 11

Rad. + Int. Horm. Int.

2 11

Rad. + Quimioterapia

1 5

Clasificación TNM en el momento de la prostatectomía radical (RPX)

T2a-c R0

6 32

T3a-c R0

6 32

T2a-c R1

3 16

T3a-c R1

3 16

T3aN2 R0

1 5

Escala de Gleason

5 - 7

10 53

8 - 10

3 16

Desconocido

6 32

Meses entre la RPX y la vacunación

41 9 - 124

Primera recidiva postquirúrgica, meses

14 1 - 90

PSA al iniciar la vacunación

0,76 0,14 – 10,8

Plan de tratamiento

Una vez descartadas las lesiones metastásicas manifiestas con la tomografía computarizada y la gammagrafía ósea, la vacuna de péptidos específicos de la próstata se administró por vía subcutánea conforme a las diferentes formas

10 de administración a pacientes con recidiva del PSA que habían sido sometidos a prostatectomía radical (aumento del PSA: elevación del 50% en dos análisis realizados como mínimo con 14 días de diferencia). La vacuna se administró ocho veces los días 0, 7, 14, 28, 42 y 56 (aproximadamente 100 microgramos de cada péptido en cada inyección). Después de cada vacunación y de nuevo el día 70, se midió la concentración de PSA para evaluar la respuesta al tratamiento.

15 Si se detectaba respuesta del tumor (remisión completa [PSA-CR] o remisión parcial [PSA-PR] o estabilización clínica [sin cambio, PSA-NC]), el paciente recibía la vacuna una vez al mes como tratamiento de mantenimiento con la forma de administración seleccionada en cada caso. La respuesta del paciente al tratamiento de vacunación se evaluó detalladamente del modo indicado a continuación:

Remisión completa (PSA-CR):Normalización de la concentración de PSA inicialmente elevada, confirmada por la 20 medición después de un intervalo mínimo de 4 semanas. La normalización se definió como un valor mínimo del PSA < 0,2 ng/ml, que cabría esperar después de la prostatectomía radical con extirpación completa del tumor o de la próstata.

Remisión parcial: a) PSA-PR ≤ 80% (Reducción de un 80% de la concentración de PSA inicialmente elevada, confirmada por la medición después de un intervalo mínimo de 4 semanas); y b) PSA-PR ≤ 50% (Reducción de un 50% de la concentración de PSA inicialmente elevada, confirmada por la medición después de un intervalo mínimo de 4 semanas).

Enfermedad estable (PSA-SD): Ningún cambio significativo durante un período mínimo de cuatro semanas. Esto incluye la estabilización y una reducción inferior al 50% y un aumento inferior al 10%, confirmada por la medición después de un intervalo de al menos 4 semanas.

Progresión (PSA-PD): Aumento de la concentración de PSA superior al 10%. El estudio se daba por concluido para el paciente si aparecía progresión del PSA.

Una vez admitidos los pacientes en el estudio se les administraba la vacuna de epítopos específicos; se tuvieron en cuenta las proteínas que se expresan específicamente en las células epiteliales de la próstata (p. ej. PSMA/PSCA). Además de investigar la eficacia general de la vacuna controlando el crecimiento de las fracciones residuales del tumor mediante la cuantificación regular de las concentraciones de PSA, el estudio investigó los efectos de los diversos métodos de vacunación sobre la modulación del sistema inmunitario. Además de la simple administración subcutánea de los péptidos solos, también se probaron diversas combinaciones con adyuvantes. En concreto se empleó Montanide por la liberación lenta y el efecto adyuvante que consigue en las vacunas peptídicas (Montanide consiste en el clásico adyudante incompleto de Freund adaptado para la administración en humanos), que recientemente ha sido descrito muy favorablemente. Con este fin, antes de la administración se mezclaron 500 µl de la solución de péptidos con 500 µl de Montanide. Así se obtiene una emulsión de agua en aceite que libera lentamente el antígeno contenido en la fase acuosa durante varias semanas. La estabilidad física de la emulsión es muy alta, y a 4 °C se puede conservar durante más de tres meses sin una separación apreciable de las fases. La liberación lenta de Montanide se ha aprovechado en varios ensayos de vacunación con buenos resultados (Oka et al., 2004).

En una rama del estudio se investigó la eficacia de la vacunación con la estimulación simultánea del sistema inmunitario con factores de crecimiento, GM-CSF y solución inyectable Leukine®. El GM-CSF es un adyudante muy habitual en los ensayos de vacunación con péptidos y en varios se ha descrito la potenciación de la respuesta clínica y de los linfocitos T. Inicialmente, el GM-CSF actúa como un factor de reclutamiento y de diferenciación de las células dendríticas que se cree que potencia el número de estas en el punto de inyección de la vacuna. Aunque el GM-CSF no activa por sí solo las células presentadoras de antígeno como las células dendríticas y los macrófagos sí se ha descrito la activación indirecta en condiciones in vivo (Molenkamp et al., 2005).

Otra rama del estudio investigó la eficacia de la vacunación con la activación simultánea de las células dendríticas mediante el uso epicutáneo del imiquimod. El imiquimod se administró en forma de pomada al 5% (Aldara). Ejerce una potente acción inmunoestimuladora a través de su efecto sobre las células TLR7-positivas (p. ej. células dendríticas plasmocitoides, células de Langerhans, células dendríticas dérmicas), que activa la vía dependiente de MyD88. Las APC activadas liberan citocinas inflamatorias y estimuladoras de los linfocitos T, regulan al alza la coestimulación y migran a los ganglios linfáticos invadidos por el tumor. En modelos con animales se ha demostrado la capacidad del imiquimod para estimular la respuesta de los CTL inducida por los péptidos con la mezcla de los antígenos en la pomada o con la aplicación de Aldara sobre el punto de administración por vía s. c. o inyección i. d. de los antígenos.

Otra rama del estudio investigó la eficacia de la vacunación con la activación concomitante de las células dendríticas mediante su mezcla con ARNm de la mucina-1 estabilizado con protaminas para activar los TLR 7/8. El ARNm genera una amplia activación de las poblaciones de células inmunitarias de ratón y humanas. La incorporación a la formulación de la proteína polibásica protamina aumenta la semivida del ARNm y propicia la formación de partículas que probablemente prolongan la liberación. Así pues, este adyuvante combina propiedades de liberación lenta con la activación de las APC.

En resumen, las formas de administración de la vacuna incluyeron las siguientes estrategias:

-

Administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsificada con Montanide

-

Administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsificada en 500 µl de Montanide en combinación con la administración tópica de 225 µl de GM-CSF con el objetivo de lograr una respuesta inmunitaria más potente gracias a la administración simultánea de factores de crecimiento

-

Administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsificada en 500 µl de Montanide en combinación con hipertermia local, esta última con el objetivo de lograr una respuesta inmunitaria más potente por el efecto térmico

-

Administración subcutánea de la vacuna peptídica emulsificada en 500 µl de Montanide en combinación con imiquimod epicutáneo a fin de activar las células dendríticas a través del TLR 7

imagen20

imagen21

imagen22

imagen23

IMA-BIR-002

Alelo DRB1*

0101 0301 0401 0404 0701 1101 1104 1501

Puntuación de SYFPEITHI

28 29 28 24 14 32 24 30

p

6,6% 5,9% 9,6% 6,0% 13,0% 4,4% 2,3% s. d.

Unión predicha

sí sí sí sí no sí sí sí

pmin

34,8%

Frecuencia haplotípica pproyectada

72,8%

Frecuencia genotípica Fproyectada

92,6%

IMA-MET-005

Alelo DRB1*

0101 0301 0401 0404 0701 1101 1104 1501

Puntuación de SYFPEITHI

28 20 26 26 28 20 22 22

p

6,6% 5,9% 9,6% 6,0% 13,0% 4,4% 2,3% s. d.

Unión predicha

sí sí sí sí sí sí sí sí

pmin

47,8%

Frecuencia haplotípica pproyectada

100,0%

Frecuencia genotípica Fproyectada

100,0%

Bibliografía

Reference List

5 Aitkenhead M, Wang SJ, Nakatsu MN, Mestas J, Heard C, Hughes CC (2002). Identification of endothelial cell genes expressed in an in vitro model of angiogenesis: induction of ESM-1, (beta)ig-h3, and NrCAM. Microvasc. Res. 63, 159-171.

Al-Joudi FS, Iskandar ZA, Imran AK (2007). Survivin expression correlates with unfavourable prognoses in invasive ductal carcinoma of the breast. Med J Malaysia 62, 6-8.

10 Altman JD, Moss PA, Goulder PJ, Barouch DH, Heyzer-Williams MG, Bell JI, McMichael AJ, Davis MM (1996). Phenotypic analysis of antigen-specific T lymphocytes. Science 274, 94-96.

Angileri FF, Aguennouz M, Conti A, La TD, Cardali S, Crupi R, Tomasello C, Germano A, Vita G, Tomasello F (2008). Nuclear factor-kappaB activation and differential expression of survivin and Bcl-2 in human grade 2-4 astrocytomas. Cancer.

15 Ariyama T, Hasegawa K, Inazawa J, Mizuno K, Ogimoto M, Katagiri T, Yakura H (1995). Assignment of the human protein tyrosine phosphatase, receptor-type, zeta (PTPRZ) gene to chromosome band 7q31.3. Cytogenet. Cell Genet. 70, 52-54.

Banchereau J, Palucka AK, Dhodapkar M, Burkeholder S, Taquet N, Rolland A, Taquet S, Coquery S, Wittkowski KM, Bhardwaj N, Pineiro L, Steinman R, Fay J (2001). Immune and clinical responses in patients with metastatic

20 melanoma to CD34(+) progenitor-derived dendritic cell vaccine. Cancer Res. 61, 6451-6458.

Barnea G, Silvennoinen O, Shaanan B, Honegger AM, Canoll PD, D'Eustachio P, Morse B, Levy JB, Laforgia S, Huebner K, . (1993). Identification of a carbonic anhydrase-like domain in the extracellular region of RPTP gamma defines a new subfamily of receptor tyrosine phosphatases. Mol. Cell Biol. 13, 1497-1506.

Bartsch S, Bartsch U, Dorries U, Faissner A, Weller A, Ekblom P, Schachner M (1992). Expression of tenascin in the 25 developing and adult cerebellar cortex. J Neurosci. 12, 736-749.

imagen24

301-310.

Chiquet-Ehrismann R, Chiquet M (2003). Tenascins: regulation and putative functions during pathological stress. J Pathol. 200, 488-499.

Conacci-Sorrell M, Kaplan A, Raveh S, Gavert N, Sakurai T, Ben-Ze'ev A (2005). The shed ectodomain of Nr-CAM stimulates cell proliferation and motility, and confers cell transformation. Cancer Res. 65, 11605-11612.

Conacci-Sorrell ME, Ben-Yedidia T, Shtutman M, Feinstein E, Einat P, Ben-Ze'ev A (2002). Nr-CAM is a target gene of the beta-catenin/LEF-1 pathway in melanoma and colon cancer and its expression enhances motility and confers tumorigenesis. Genes Dev. 16, 2058-2072.

Corso S, Migliore C, Ghiso E, De RG, Comoglio PM, Giordano S (2008). Silencing the MET oncogene leads to regression of experimental tumors and metastases. Oncogene 27, 684-693.

Davis JQ, Bennett V (1994). Ankyrin binding activity shared by the neurofascin/L1/NrCAM family of nervous system cell adhesion molecules. J Biol. Chem. 269, 27163-27166.

Dazzi C, Cariello A, Giannini M, Del DM, Giovanis P, Fiorentini G, Leoni M, Rosti G, Turci D, Tienghi A, Vertogen B, Zumaglini F, De GU, Marangolo M (2000). A sequential chemo-radiotherapeutic treatment for patients with malignant gliomas: a phase II pilot study. Anticancer Res. 20, 515-518.

Di Renzo MF, Olivero M, Giacomini A, Porte H, Chastre E, Mirossay L, Nordlinger B, Bretti S, Bottardi S, Giordano S, . (1995). Overexpression and amplification of the met/HGF receptor gene during the progression of colorectal cancer. Clin. Cancer Res. 1, 147-154.

Di Renzo MF, Olivero M, Martone T, Maffe A, Maggiora P, Stefani AD, Valente G, Giordano S, Cortesina G, Comoglio PM (2000). Somatic mutations of the MET oncogene are selected during metastatic spread of human HNSC carcinomas. Oncogene 19, 1547-1555.

Dix AR, Brooks WH, Roszman TL, Morford LA (1999). Immune defects observed in patients with primary malignant brain tumors. J Neuroimmunol. 100, 216-232.

Dong G, Chen Z, Li ZY, Yeh NT, Bancroft CC, Van WC (2001). Hepatocyte growth factor/scatter factor-induced activation of MEK and PI3K signal pathways contributes to expression of proangiogenic cytokines interleukin-8 and vascular endothelial growth factor in head and neck squamous cell carcinoma. Cancer Res. 61, 5911-5918.

Ebert M, Yokoyama M, Friess H, Buchler MW, Korc M (1994). Coexpression of the c-met proto-oncogene and hepatocyte growth factor in human pancreatic cancer. Cancer Res. 54, 5775-5778.

Eckerich C, Zapf S, Fillbrandt R, Loges S, Westphal M, Lamszus K (2007). Hypoxia can induce c-Met expression in glioma cells and enhance SF/HGF-induced cell migration. Int J Cancer 121, 276-283.

Erfurt C, Sun Z, Haendle I, Schuler-Thurner B, Heirman C, Thielemans K, van der BP, Schuler G, Schultz ES (2007). Tumor-reactive CD4+ T cell responses to the melanoma-associated chondroitin sulphate proteoglycan in melanoma patients and healthy individuals in the absence of autoimmunity. J Immunol. 178, 7703-7709.

Feng L, Hatten ME, Heintz N (1994). Brain lipid-binding protein (BLBP): a novel signaling system in the developing mammalian CNS. Neuron 12, 895-908.

Feng L, Heintz N (1995). Differentiating neurons activate transcription of the brain lipid-binding protein gene in radial glia through a novel regulatory element. Development 121, 1719-1730.

Ferracini R, Di Renzo MF, Scotlandi K, Baldini N, Olivero M, Lollini P, Cremona O, Campanacci M, Comoglio PM (1995). The Met/HGF receptor is over-expressed in human osteosarcomas and is activated by either a paracrine or an autocrine circuit. Oncogene 10, 739-749.

Fischer J, Palmedo G, von KR, Bugert P, Prayer-Galetti T, Pagano F, Kovacs G (1998). Duplication and overexpression of the mutant allele of the MET proto-oncogene in multiple hereditary papillary renal cell tumours. Oncogene 17, 733-739.

Furge KA, Kiewlich D, Le P, Vo MN, Faure M, Howlett AR, Lipson KE, Woude GF, Webb CP (2001). Suppression of Ras-mediated tumorigenicity and metastasis through inhibition of the Met receptor tyrosine kinase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 98, 10722-10727.

Furge KA, Zhang YW, Vande Woude GF (2000). Met receptor tyrosine kinase: enhanced signaling through adapter proteins. Oncogene 19, 5582-5589.

Garcion E, Halilagic A, Faissner A, ffrench-Constant C (2004). Generation of an environmental niche for neural stem cell development by the extracellular matrix molecule tenascin C. Development 131, 3423-3432.

Gary SC, Kelly GM, Hockfield S (1998). BEHAB/brevican: a brain-specific lectican implicated in gliomas and glial cell motility. Curr. Opin. Neurobiol. 8, 576-581.

Gary SC, Zerillo CA, Chiang VL, Gaw JU, Gray G, Hockfield S (2000). cDNA cloning, chromosomal localization, and expression analysis of human BEHAB/brevican, a brain specific proteoglycan regulated during cortical development and in glioma. Gene 256, 139-147.

Gebbink MF, van E, I, Hateboer G, Suijkerbuijk R, Beijersbergen RL, Geurts van KA, Moolenaar WH (1991). Cloning, expression and chromosomal localization of a new putative receptor-like protein tyrosine phosphatase. FEBS Lett. 290, 123-130.

Ghosh JC, Dohi T, Kang BH, Altieri DC (2008). Hsp60 regulation of tumor cell apoptosis. J Biol. Chem. 283, 51885194.

Giordano S, Ponzetto C, Di Renzo MF, Cooper CS, Comoglio PM (1989). Tyrosine kinase receptor indistinguishable from the c-met protein. Nature 339, 155-156.

Glass R, Synowitz M, Kronenberg G, Walzlein JH, Markovic DS, Wang LP, Gast D, Kiwit J, Kempermann G, Kettenmann H (2005). Glioblastoma-induced attraction of endogenous neural precursor cells is associated with improved survival. J Neurosci. 25, 2637-2646.

Glatz JF, Luiken JJ, van BM, van d, V (2002). Cellular lipid binding proteins as facilitators and regulators of lipid metabolism. Mol. Cell Biochem. 239, 3-7.

Glatz JF, Storch J (2001). Unravelling the significance of cellular fatty acid-binding proteins. Curr. Opin. Lipidol. 12, 267-274.

Godbout R, Bisgrove DA, Shkolny D, Day RS, III (1998). Correlation of B-FABP and GFAP expression in malignant glioma. Oncogene 16, 1955-1962.

Grumet M, Mauro V, Burgoon MP, Edelman GM, Cunningham BA (1991). Structure of a new nervous system glycoprotein, Nr-CAM, and its relationship to subgroups of neural cell adhesion molecules. J Cell Biol. 113, 13991412.

Grunda JM, Nabors LB, Palmer CA, Chhieng DC, Steg A, Mikkelsen T, Diasio RB, Zhang K, Allison D, Grizzle WE, Wang W, Gillespie GY, Johnson MR (2006). Increased expression of thymidylate synthetase (TS), ubiquitin specific protease 10 (USP10) and survivin is associated with poor survival in glioblastoma multiforme (GBM). J Neurooncol. 80, 261-274.

Gunther HS, Schmidt NO, Phillips HS, Kemming D, Kharbanda S, Soriano R, Modrusan Z, Meissner H, Westphal M, Lamszus K (2008). Glioblastoma-derived stem cell-enriched cultures form distinct subgroups according to molecular and phenotypic criteria. Oncogene 27, 2897-2909.

Harroch S, Furtado GC, Brueck W, Rosenbluth J, Lafaille J, Chao M, Buxbaum JD, Schlessinger J (2002). A critical role for the protein tyrosine phosphatase receptor type Z in functional recovery from demyelinating lesions. Nat. Genet. 32, 411-414.

Hau P, Kunz-Schughart LA, Rummele P, Arslan F, Dorfelt A, Koch H, Lohmeier A, Hirschmann B, Muller A, Bogdahn U, Bosserhoff AK (2006). Tenascin-C protein is induced by transforming growth factor-beta1 but does not correlate with time to tumor progression in high-grade gliomas. J Neurooncol. 77, 1-7.

Heimberger AB, Hussain SF, Aldape K, Sawaya R, Archer GA, Friedman H, Reardon D, Friedman A, Bigner DD, Sampson JH. Tumor-specific peptide vaccination in newly-diagnosed patients with GBM. Journal of Clinical Oncology, 2006 ASCO Annual Meeting Proceedings Part I Vol 24, No. 18S (June 20 Supplement), 2006: 2529. 20-62006.

Herold-Mende C, Mueller MM, Bonsanto MM, Schmitt HP, Kunze S, Steiner HH (2002). Clinical impact and functional aspects of tenascin-C expression during glioma progression. Int. J Cancer 98, 362-369.

Hoffmann NE, Sheinin Y, Lohse CM, Parker AS, Leibovich BC, Jiang Z, Kwon ED (2008). External validation of IMP3 expression as an independent prognostic marker for metastatic progression and death for patients with clear cell renal cell carcinoma. Cancer 112, 1471-1479.

Hu B, Kong LL, Matthews RT, Viapiano MS (2008). The proteoglycan brevican binds to fibronectin after proteolytic cleavage and promotes glioma cell motility. J Biol. Chem.

Huang PH, Cavenee WK, Furnari FB, White FM (2007a). Uncovering therapeutic targets for glioblastoma: a systems biology approach. Cell Cycle 6, 2750-2754.

Huang PH, Mukasa A, Bonavia R, Flynn RA, Brewer ZE, Cavenee WK, Furnari FB, White FM (2007b). Quantitative analysis of EGFRvIII cellular signaling networks reveals a combinatorial therapeutic strategy for glioblastoma. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 104, 12867-12872.

Jamain S, Quach H, Betancur C, Rastam M, Colineaux C, Gillberg IC, Soderstrom H, Giros B, Leboyer M, Gillberg C, Bourgeron T (2003). Mutations of the X-linked genes encoding neuroligins NLGN3 and NLGN4 are associated with autism. Nat. Genet. 34, 27-29.

Jaworski DM, Fager N (2000). Regulation of tissue inhibitor of metalloproteinase-3 (Timp-3) mRNA expression during rat CNS development. J Neurosci. Res. 61, 396-408.

Jaworski DM, Kelly GM, Hockfield S (1999). Intracranial injury acutely induces the expression of the secreted isoform of the CNS-specific hyaluronan-binding protein BEHAB/brevican. Exp. Neurol. 157, 327-337.

Jaworski DM, Kelly GM, Piepmeier JM, Hockfield S (1996). BEHAB (brain enriched hyaluronan binding) is expressed in surgical samples of glioma and in intracranial grafts of invasive glioma cell lines. Cancer Res. 56, 2293-2298.

Jiang Z, Chu PG, Woda BA, Rock KL, Liu Q, Hsieh CC, Li C, Chen W, Duan HO, McDougal S, Wu CL (2006). Analysis of RNA-binding protein IMP3 to predict metastasis and prognosis of renal-cell carcinoma: a retrospective study. Lancet Oncol 7, 556-564.

Jiang Z, Lohse CM, Chu PG, Wu CL, Woda BA, Rock KL, Kwon ED (2008). Oncofetal protein IMP3: a novel molecular marker that predicts metastasis of papillary and chromophobe renal cell carcinomas. Cancer 112, 26762682.

Jung G, Ledbetter JA, Muller-Eberhard HJ (1987). Induction of cytotoxicity in resting human T lymphocytes bound to tumor cells by antibody heteroconjugates. Proc Natl Acad Sci U S A 84, 4611-4615.

Kajiwara Y, Yamasaki F, Hama S, Yahara K, Yoshioka H, Sugiyama K, Arita K, Kurisu K (2003). Expression of survivin in astrocytic tumors: correlation with malignant grade and prognosis. Cancer 97, 1077-1083.

Kaloshi G, Mokhtari K, Carpentier C, Taillibert S, Lejeune J, Marie Y, Delattre JY, Godbout R, Sanson M (2007). FABP7 expression in glioblastomas: relation to prognosis, invasion and EGFR status. J Neurooncol. 84, 245-248.

Kammula US, Kuntz EJ, Francone TD, Zeng Z, Shia J, Landmann RG, Paty PB, Weiser MR (2007). Molecular coexpression of the c-Met oncogene and hepatocyte growth factor in primary colon cancer predicts tumor stage and clinical outcome. Cancer Lett. 248, 219-228.

Kaplan R, Morse B, Huebner K, Croce C, Howk R, Ravera M, Ricca G, Jaye M, Schlessinger J (1990). Cloning of three human tyrosine phosphatases reveals a multigene family of receptor-linked protein-tyrosine-phosphatases expressed in brain. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 87, 7000-7004.

Kendall SE, Najbauer J, Johnston HF, Metz MZ, Li S, Bowers M, Garcia E, Kim SU, Barish ME, Aboody KS, Glackin CA (2008). Neural Stem Cell Targeting of Glioma is Dependent on PI3K Signaling. Stem Cells.

Kim CH, Bak KH, Kim YS, Kim JM, Ko Y, Oh SJ, Kim KM, Hong EK (2000). Expression of tenascin-C in astrocytic tumors: its relevance to proliferation and angiogenesis. Surg Neurol. 54, 235-240.

Knutson KL, Disis ML (2005). Augmenting T helper cell immunity in cancer. Curr. Drug Targets. Immune. Endocr. Metabol. Disord. 5, 365-371.

Koochekpour S, Jeffers M, Rulong S, Taylor G, Klineberg E, Hudson EA, Resau JH, Vande Woude GF (1997). Met and hepatocyte growth factor/scatter factor expression in human gliomas. Cancer Res. 57, 5391-5398.

Kosari F, Parker AS, Kube DM, Lohse CM, Leibovich BC, Blute ML, Cheville JC, Vasmatzis G (2005). Clear cell renal cell carcinoma: gene expression analyses identify a potential signature for tumor aggressiveness. Clin Cancer Res. 11, 5128-5139.

Krueger NX, Streuli M, Saito H (1990). Structural diversity and evolution of human receptor-like protein tyrosine phosphatases. EMBO J 9, 3241-3252.

Kucharczak J, Pannequin J, Camby I, Decaestecker C, Kiss R, Martinez J (2001). Gastrin induces over-expression of genes involved in human U373 glioblastoma cell migration. Oncogene 20, 7021-7028.

Kurtz A, Zimmer A, Schnutgen F, Bruning G, Spener F, Muller T (1994). The expression pattern of a novel gene encoding brain-fatty acid binding protein correlates with neuronal and glial cell development. Development 120, 26372649.

imagen25

imagen26

H, Aozasa K, Noguchi S, Kawase I, Sugiyama H (2004). Induction of WT1 (Wilms' tumor gene)-specific cytotoxic T lymphocytes by WT1 peptide vaccine and the resultant cancer regression. Proc Natl. Acad. Sci. U. S. A 101, 1388513890.

Olivero M, Valente G, Bardelli A, Longati P, Ferrero N, Cracco C, Terrone C, Rocca-Rossetti S, Comoglio PM, Di Renzo MF (1999). Novel mutation in the ATP-binding site of the MET oncogene tyrosine kinase in a HPRCC family. Int. J Cancer 82, 640-643.

Pai R, Nakamura T, Moon WS, Tarnawski AS (2003). Prostaglandins promote colon cancer cell invasion; signaling by cross-talk between two distinct growth factor receptors. FASEB J 17, 1640-1647.

Park M, Dean M, Cooper CS, Schmidt M, O'Brien SJ, Blair DG, Vande Woude GF (1986). Mechanism of met oncogene activation. Cell 45, 895-904.

Park WS, Dong SM, Kim SY, Na EY, Shin MS, Pi JH, Kim BJ, Bae JH, Hong YK, Lee KS, Lee SH, Yoo NJ, Jang JJ, Pack S, Zhuang Z, Schmidt L, Zbar B, Lee JY (1999). Somatic mutations in the kinase domain of the Met/hepatocyte growth factor receptor gene in childhood hepatocellular carcinomas. Cancer Res. 59, 307-310.

Perez-Pinera P, Garcia-Suarez O, Menendez-Rodriguez P, Mortimer J, Chang Y, Astudillo A, Deuel TF (2007). The receptor protein tyrosine phosphatase (RPTP)beta/zeta is expressed in different subtypes of human breast cancer. Biochem. Biophys. Res. Commun. 362, 5-10.

Perrin FE, Rathjen FG, Stoeckli ET (2001). Distinct subpopulations of sensory afferents require F11 or axonin-1 for growth to their target layers within the spinal cord of the chick. Neuron 30, 707-723.

Phillips HS, Kharbanda S, Chen R, Forrest WF, Soriano RH, Wu TD, Misra A, Nigro JM, Colman H, Soroceanu L, Williams PM, Modrusan Z, Feuerstein BG, Aldape K (2006). Molecular subclasses of high-grade glioma predict prognosis, delineate a pattern of disease progression, and resemble stages in neurogenesis. Cancer Cell 9, 157-173.

Piesche M, Hildebrandt Y, Zettl F, Chapuy B, Schmitz M, Wulf G, Trumper L, Schroers R (2007). Identification of a promiscuous HLA DR-restricted T-cell epitope derived from the inhibitor of apoptosis protein survivin. Hum. Immunol. 68, 572-576.

Ponzetto C, Bardelli A, Maina F, Longati P, Panayotou G, Dhand R, Waterfield MD, Comoglio PM (1993). A novel recognition motif for phosphatidylinositol 3-kinase binding mediates its association with the hepatocyte growth factor/scatter factor receptor. Mol. Cell Biol. 13, 4600-4608.

Prados MD, Levin V (2000). Biology and treatment of malignant glioma. Semin. Oncol 27, 1-10.

Prakash S, Sarran L, Socci N, DeMatteo RP, Eisenstat J, Greco AM, Maki RG, Wexler LH, LaQuaglia MP, Besmer P, Antonescu CR (2005). Gastrointestinal stromal tumors in children and young adults: a clinicopathologic, molecular, and genomic study of 15 cases and review of the literature. J Pediatr. Hematol. Oncol 27, 179-187.

Previsani, N. and Lavanchy, D.: Hepatitis B (internal immatics research report)

Pryor JG, Bourne PA, Yang Q, Spaulding BO, Scott GA, Xu H (2008). IMP-3 is a novel progression marker in malignant melanoma. Mod. Pathol. 21, 431-437.

Qian CN, Guo X, Cao B, Kort EJ, Lee CC, Chen J, Wang LM, Mai WY, Min HQ, Hong MH, Vande Woude GF, Resau JH, Teh BT (2002). Met protein expression level correlates with survival in patients with late-stage nasopharyngeal carcinoma. Cancer Res. 62, 589-596.

Rahimi N, Tremblay E, McAdam L, Park M, Schwall R, Elliott B (1996). Identification of a hepatocyte growth factor autocrine loop in a murine mammary carcinoma. Cell Growth Differ. 7, 263-270.

Ramirez R, Hsu D, Patel A, Fenton C, Dinauer C, Tuttle RM, Francis GL (2000). Over-expression of hepatocyte growth factor/scatter factor (HGF/SF) and the HGF/SF receptor (cMET) are associated with a high risk of metastasis and recurrence for children and young adults with papillary thyroid carcinoma. Clin Endocrinol. (Oxf) 53, 635-644.

Rammensee HG, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S (1999). SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs. Immunogenetics 50, 213-219.

Rammensee,H.G., Bachmann,J., and Stevanovic,S. (1997). MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany).

Rammensee HG, Falk K, Rotzschke O (1993). Peptides naturally presented by MHC class I molecules. Annu. Rev. Immunol. 11, 213-244.

Rasola A, Fassetta M, De BF, D'Alessandro L, Gramaglia D, Di Renzo MF, Comoglio PM (2007). A positive feedback

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