UA125277C2

UA125277C2 - Пептид, активований цитотоксичний т-лімфоцит, спосіб одержання антитіла та лікарський засіб для імунотерапії раку

Info

Publication number: UA125277C2
Application number: UAA201500916A
Authority: UA
Inventors: Шор Олівер; Хільф Норберт; Вейншенк Тоні; Вейншенк Тони; Траутвейн Клаудія; Вальтер Штеффен; Сінгх Харпреет
Original assignee: Імматікс Біотекнолоджіс Гмбх; Имматикс Биотекнолоджис Гмбх
Priority date: 2008-10-01
Filing date: 2009-09-28
Publication date: 2022-02-16
Also published as: PT2341927T; PT3132801T; HRP20182151T1; HRP20200722T1; PT2172211E; UA110599C2; ES2788129T8; US10047124B2; SI2341927T1; CY1121258T1; HUE030296T2; US8961985B2; RS53782B1; CA2936887C; EP2172211A1; JP6150859B2; ES2770090T3; US20100158931A1; EP3120869B1; US20210261614A1

Abstract

Винахід стосується пептиду, активованого цитотоксичного T-лімфоциту (CTL), способу одержання антитіла та лікарського засобу для імунотерапії раку.

Description

Цей винахід належить до пептидів, нуклеїнових кислот та клітин для використання в імунотерапевтичних методах. Зокрема, цей винахід стосується імунотерапії раку. Крім того, цей винахід належить до епітопів пухлиноасоційованих пептидів цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ), разом або в поєднанні з іншими пухлиноасоційованими пептидами, котрі служать активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, стимулюючих протипухлинні імунні реакції.

Цей винахід належить до 30 пептидних послідовностей та їхніх варіантів, одержаних з молекул

НГА класу І і ІЇ пухлинних клітин людини, котрі можуть використовуватись в композиціях вакцин для викликання протипухлинних імунних реакцій.

Рівень техніки

Гліоми - це пухлини головного мозку, які мають походження з гліальних клітин у нервовій системі. Гліальні клітини, які зазвичай називаються нейроглія чи просто глія, є ненервовими клітинами, котрі забезпечують підтримку та харчування клітин, утримують гомеостаз, утворюють мієлін та беруть участь в передачі сигналів в нервовій системі. Дві найбільш важливі підгрупи гліом - це астроцитоми та олігодендроцитоми, названі відповідно до типу нормальних гліальних клітин, з яких вони походять (астроцити або олігодендроцити, відповідно)О. Мультиформна гліобластома (далі іменується "гліобластома"), що належить до підгрупи астроцитом, є найбільш типовою злоякісною пухлиною мозку у дорослих людей, що становить приблизно 40 95 усіх злоякісних пухлин мозку та близько 50 95 гліом. Вона агресивно втручається у центральну нервову систему та відзначається найвищим рівнем злоякісності (клас ІМ) серед усіх гліом. Хоча є стабільний прогрес в лікуванні цього захворювання, завдяки досягненням в нейровізуалізації, мікрохірургії, різноманітним варіантам лікування і препаратам, таким як темозоломід та опромінювання, гліобластоми залишаються невиліковними. Смертність від цієї пухлини мозку дуже висока: середня тривалість життя дорівнює від 9 до 12 місяців після першого діагнозу. 5- річна виживаність в період спостерігання з 1986 по 1990 рік становила 8.0 95. На даний час, п'ятирічна виживаність після інвазивного лікування, включаючи повне видалення пухлини, все ж таки менше 10 95. Відповідно, існує велика медична потреба в альтернативному і ефективному терапевтичному методі.

Пухлинні клітини гліобластом є найбільш недиференційованими серед пухлин мозку, отже клітини пухлини мають великий потенціал міграції та проліферації і є високо-інвазивними, що пояснює дуже несприятливий прогноз. Гліобластоми призводять до смерті внаслідок швидкого, агресивного та інфільтративного росту в мозку. Тип інфільтративного росту відповідає за нерезектабельний характер цих пухлин. Гліобластоми також відносно резистентні до опромінювання та хіміотерапії, і тому випадки рецидивів після курсу лікування є частими. Крім того, імунна реакція на неопластичні клітини є достатньо неефективною, з точки зору повного знищення усіх неопластичних клітин після хірургічного видалення та променевої терапії.

Гліобластоми розділяються на первинні гліобластоми (де помо) та вторинні гліобластоми, в залежності від різниці в генному механізмі протягом злоякісної трансформації недиференційованих астроцитів або гліальних прекурсорних клітин. Вторинна гліобластома зустрічається у людей віком до 45 років. Протягом, в середньому, 4-5 років вторинна гліобластома розвивається з астроцитоми більш низької злоякісності в недиференційовану астроцитому. І навпаки, первинна гліобластома, переважно, зустрічається у старших людей, з середнім віком 55 років. В цілому, первинна гліобластома є швидкоплинною гліобластомою, яка характеризується прогресуванням пухлини протягом З місяців з того стану, коли не виявлено ніяких клінічних або патологічних аномалій (РайоІоду апа Сепеїйіс5 ої Ше Мегу/оив бЗузіетв5. 29- 39 (ІАВС Ртгезв, І уоп, Егапсе, 2000)).

Гліобластома мігрує по мієлінованих нервах та широко розповсюджується в центральній нервовій системі. В більшості випадків хірургічне втручання має лише обмежений тривалий терапевтичний ефект. Клітини злоякісної гліоми уникають детекції імунною системою хазяїна, оскільки вони генерують імуносупресивні речовини, що погіршують проліферацію Т-клітин та виробництво імуностимулюючого цитокіну ЇЇ -2.

Внутрішньочерепні неоплазми можуть виникати з будь-яких конструкцій чи типів клітин, присутніх в ЦНС, включаючи мозок, м'які мозкові оболонки, гіпофіз, череп і навіть залишкові ембріональні тканини. Загальна щорічна захворюваність на первинні пухлини мозку в

Сполучених Штатах становить 14 випадків на 100 000 людей. Найбільш типовими первинними пухлинами мозку є менінгіоми, які представляють 27 95 від усіх первинних пухлин мозку, та гліобластоми - 23 95 від усіх первинних пухлин мозку (в той час як гліобластоми нараховують 40 95 злоякісних пухлин мозку у дорослих). Більшість з цих пухлин мають агресивну дію та високу злоякісність. Первинні пухлини мозку - найбільш розповсюджені солідні пухлини у дітей, і вони є второю найчастішою причиною смерті від раку у дітей, після лейкемії.

Пошук ефективних методів лікування гліобластом у пацієнтів все ще триває. Ведуться дослідження в галузі імунотерапії або лікування із залученням імунної системи, у боротьбі з цими неопластичними клітинами. Перші багатообіцяючі результати були отримані компанією

Моппмезі Віоїпегарешісв в імунотерапевтичних дослідженнях у людей, хворих на гліобластому, при використанні препарату "ОСмМах Вгаїп", вакцини на клітинній основі, в якій застосовувалися дендритні клітини пацієнта, завантажені лізатами аутологічних пухлинних клітин, та препарату

СеїІдех, в якому застосовувався пептид з ЕСЕЕМІЇЙЇ, для індукування антигенспецифічних реакцій

СТІ, що, в свою чергу, співвідносилося з тривалою середньою виживаністю, в порівнянні з середньою виживаністю, одержаною при використанні стандартних методів лікування (Неітрегадег еї а!., 2006).

Колоректальна карцинома

Згідно із даними Американського Товариства по Боротьбі з Раком, колоректальний рак (СКС) є третім з найбільш розповсюджених видів раку в США, на який захворюють більш ніж 175 000 нових пацієнтів кожного року. В США, Японії, Франції, Німеччині, Ігалії, Іспанії та

Великобританії він уражає більш ніж 480 000 людей. Колоректальний рак є однією з найчастіших причин смертності від раку в розвинених країнах. Відносна виживаність протягом 1 року та 5 років для осіб з колоректальним раком становить 84 95 та 64 95, відповідно. По закінченні 5 років виживаність продовжує знижуватись - до 57 95 через 10 років після постановки діагнозу. Коли захворювання на колоректальний рак визначаються на ранній, локалізованій стадії, 5-річна виживаність дорівнює 90 95; однак, лише 39 95 випадків колоректального раку діагностується на цьому етапі, переважно, внаслідок недостатнього скринінгу. Після регіонального розповсюдження раку, коли він уражає сусідні органи чи лімфовузли, виживаність протягом п'яти років падає до 68 95. У осіб з віддаленими метастазами 5-річна виживаність становить 10 95.

Дослідження показують ймовірність виникнення колоректального раку як результату взаємодії між успадкованими факторами та впливом зовнішнього середовища. В більшості випадків, попередниками колоректальних пухлин вважаються аденоматозні поліпи; однак, переродження може тривати багато років. Основним фактором ризику колоректального раку є вік, оскільки 90 95 випадків захворювання діагностуються у людей старше 50 років. Інші фактори

Зо ризику колоректального раку, за даними Американського Товариства по Боротьбі з Раком, включають вживання алкоголю, раціон харчування з великим вмістом жирів та/або червоного м'яса і недостатнім вживанням фруктів та овочів. Захворюваність продовжує зростати, зокрема, в таких регіонах, як Японія, де це може бути обумовлено переходом на західний стиль харчування, з надмірною кількістю жирів та м'яса в раціоні та зменшенням вживання харчових волокон. Однак, частота захворювань зростає не настільки швидко, як раніше, і це може бути обумовлено більш активним скринінгом та видаленням поліпів, що запобігає переродженню поліпів на рак.

Як і відносно більшості солідних пухлин, терапією першого ряду є хірургічне втручання, однак, його переваги обмежуються ранніми стадіями захворювання, в той час як у значної частини пацієнтів діагностується запущена стадія. Стандартом лікування прогресуючого колоректального раку є режими хіміотерапії, які базуються на схемах з використанням фторурацилу. Більшість таких режимів - це так звані схеми РОЇ ЕОХ (інфузійне введення 5- фторурацилу/лейковорину плюс оксаліплатин) та ЕОЇ РІКІ (іринотекан, лейковорин, бюлюсне і тривале інфузійне введення 5-ЕМ).

Введення цитотоксичних препаратів третього покоління, таких як іринотекан та оксаліплатин, збільшило надію на значне підвищення ефективності лікування, але прогноз все ще відносно несприятливий, і виживаність, в цілому, залишається на рівні приблизно 20 місяців при наявності метастазів, отже, незадоволені потреби стосовно лікування цієї хвороби поки що є високими.

Останнім часом з'явилося нове покоління медикаментів, що діють цілеспрямовано на молекулярному рівні, таких як АмабвіїпФ (бевакізумаб) та Егойих? (цетуксимаб), і близько 40 сполук знаходяться на завершальному етапі клінічної розробки для різних стадій колоректального раку. Комбінації декількох з цих сполук збільшують кількість потенційних варіантів терапії, які очікуються в майбутньому. Переважна більшість речовин є у фазі 2, причому на ЕСЕК (рецептори епідермального фактора росту) ці сполуки діють частіше, ніж будь-які інші ліки, розроблені для колоректального раку, і це обумовлено фактом, що приблизно у 80 95 хворих на колоректальний рак експресія ЕСЕК підвищується.

Зараз проводяться клінічні дослідження пацієнтів з ІЇ стадією захворювання, з поєднанням хіміотерапії та недавно ухвалених моноклональних антитіл (тАбБ) (цетуксимаб « іринотекан або 60 ЕОЇ ЕОХ4; бевакізумаб як одиночний препарат або разом з РОЇ ЕОХ4). Очікується, що період спостережень для одержання статистично значимих результатів цих досліджень становитиме від трьох до чотирьох років.

Моноклональні антитіла (птАбБ), які на даний час використовуються в онкології, в цілому мають прекрасні шанси щодо їхнього використання без втручання в активну імунотерапію.

Фактично, були одержані доклінічні дані (ЗАВКІСОМІСН 1999) та клінічні докази, які свідчать про те, що зниження експресії МЕСЕ (фактора росту ендотелія судин) (за допомогою бевакизумабу) позитивно впливає на активацію Т-клітин, опосередковану ОС (дендритними клітинами) (О5ада

Т, Споподо 0, Тапвік КЕ, Нопа Т, 5ресіог М, Китаг К, Нигмиїг НІ, Оем І, Міхоп АВ, Гуепу НК, Сіау Т,

Могзе МА. Тне еїесі ої апіі-МЕСЕ Шегару оп іттаїйцге туеїоід сеїЇ апа депатййіс сеї іп сапсег раїйепів. Сапсег Іттипої! ІттипоїНег. 2008 дап 10.).

Рак простати та інші пухлини

Рак простати (рак передміхурової залози) є основною причиною смерті від раку у чоловіків: за наявними оцінками, в 2007 році було зареєстровано 27 050 смертельних випадків від цієї хвороби. Хоча з початку 1990-х років смертність серед білих чоловіків та афроамериканців знижувалася, показники смертності у афроамериканців залишаються більш ніж в два рази вищими, ніж у білих чоловіків. Рак простати - це найчастіше діагностований вид раку у чоловіків.

За невиясненими до цього часу причинами, захворюваність у афроамериканців значно більша, ніж у білих. Показники захворюваності на рак простати значно змінилися за останні 20 років: із швидким збільшенням за період 1988-1992 років, різким спадом в 1992-1995 роках, та помірним ростом з 1995 року. Ці тенденції, значною мірою, відображають покращення скринінгу раку простати з аналізом крові для визначення рівня простато-специфічного антигену (РЗА).

Помірний зріст випадків захворювання за останнє десятиріччя, скоріше за все, пояснюється широко поширеним РБА-скринінгом серед чоловіків, молодших 65 років. Показники частоти захворювання на рак простати вирівнялися у чоловіків віком 65 років і більше. Захворюваність досягла піку у білих чоловіків в 1992 році (237.6 на 100 000 осіб) та афроамериканців у 1993 році (342.8 на 100 000 осіб).

Лікування раку простати може включати пильне спостереження, хірургічне втручання, променеву терапію, терапію Високоіїнтенсивним Фокусованим Ультразвуком /(НІЄ), хіміотерапію, кріохірургію, гормональну терапію або комбінацію деяких з цих методів. Вибір

Зо варіанту лікування залежить від стадії захворювання, індексу Глісона та рівня РБА. Іншими важливими факторами є вік чоловіка, загальний стан його здоров'я та ставлення до потенційного лікування і можливих побічних ефектів. Оскільки будь-яке лікування може мати серйозні побічні ефекти, такі як еректильна дисфункція та нетримання сечі, обговорення методу лікування часто зосереджується на досягненні балансу між задачами терапії та ризиками змін у стилі життя.

Якщо рак поширюється за межі передміхурової залози, варіанти лікування значно змінюються, оскільки більшість лікарів, котрі займаються терапією раку передміхурової залози, використовують різні номограми для прогнозування ймовірності поширення. Лікування пильним спостереженням, НІГ, променевою терапією, кріохірургією та хірургічним втручанням взагалі пропонуються чоловікам, у яких рак залишається в межах передміхурової залози. Гормональна терапія та хіміотерапія часто призначаються у випадку захворювання, котре поширюється за межі передміхурової залози. Однак, є й винятки: променева терапія може використовуватись для деяких запущених пухлин, а гормональна терапія - для певних випадків пухлин на ранній стадії. Кріотерапія, гормональна терапія та хіміотерапія також можуть пропонуватись, якщо первісний варіант лікування не дає результату, і рак прогресує.

У значної кількості пацієнтів, хворих на рак простати, які перенесли радикальну простатектомію внаслідок клінічно очікуваного росту, обмеженого ураженим органом, заключний гістологічний аналіз хірургічної проби показує локальне екстенсивне поширення пухлини за межі органу. У цих пацієнтів відзначається високий ризик ранніх місцевих рецидивів, що, як правило, можуть бути виявлені як підвищений рівень РЗА, тобто, біохімічний рецидив.

Можливі методи лікування в цьому випадку включають дистанційну променеву терапію та гормонпригнічувальну терапію; однак, цінність таких терапевтичних підходів, зокрема, для подовження тривалого виживання пацієнта, не може вважатися доказаним. Крім того, треба враховувати можливі ускладнення, пов'язані з лікуванням, такі як розвиток звуження уретри (променева терапія), втрата лібідо та імпотенція, ризик зменшення солей кальцію в кістках скелету, що проявляється як остеопороз, та помітно збільшений ризик патологічних переломів кісток (при гормонпригнічувальній терапії).

Більш ніж 90 95 усіх випадків раку простати виявляються на локальній та регіонарній стадії; відносний показник 5-річної виживаності для пацієнтів, у яких пухлини діагностувалися на цих 60 стадіях, досягає 100 95. Протягом останніх 25 років, 5-річна виживаність для усіх стадій в сукупності збільшилася з 69 95 приблизно до 90 95. Відповідно до останніх даних, відносна 10- річна виживаність становить 9395, а 15-річна виживаність - 77 965. Значне покращення в показниках виживаності, зокрема, на рівні 5 років, можна частково віднести на рахунок раннього діагностування та удосконалення лікування. Проте, виживаність значно знижується після того, як пухлина поширюється на інші тканини та органи.

Рак легенів

За попередніми оцінками, в 2007 році в США очікується 210 000 нових випадків захворювання на рак легенів, що нараховує приблизно 15 95 діагнозів раку. Захворюваність значно знижувалася у чоловіків, з 102 випадків на 100 000 осіб в 1984 році до 78.5 в 2003 році. У жінок зараз захворюваність залишається на одному й тому ж рівні після тривалого періоду зростання. Рак легенів клінічно класифікується як дрібноклітинний (13 95) або дрібноклітинний (87 Фо) рак, для цілей лікування.

Рак легенів є причиною більшості смертей від ракових захворювань і у чоловіків, і у жінок. За прогнозами в 2007 році очікується 160 390 смертельних випадків від цього захворювання, що становить близько 29 95 усіх смертей від раку. Щорічно, починаючи з 1987 року, від раку легенів вмирало більше жінок, ніж від раку молочної залози. Протягом періоду 1991-2003 років, показники смертності у чоловіків продовжували істотно знижуватися, приблизно на 1.9 95 на рік.

Зріст смертності від раку легенів у жінок припинився після постійного підвищення протягом кількох десятиліть. Ці тенденції в смертності від раку легенів відображають зменшення в кількості курців за останні 30 років.

Методи лікування визначаються типом (дрібноклітинний чи недрібноклітинний) та стадією раку і включають хірургічне втручання, променеву терапію, хіміотерапію та спрямовану біологічну терапію, з використанням, наприклад, бевакізумабу (АмабіїпФ) та ерлотинібу (ТагсемафФ). Для локалізованого раку, хірургічне втручання є зазвичай переважним методом лікування. Недавні дослідження вказують на те, що виживаність у випадку недрібноклітинного раку легенів на ранній стадії покращується завдяки хіміотерапії після проведення операції.

Оскільки захворювання, як правило, вже є поширеним на момент його виявлення, часто використовуються променева терапія та хіміотерапія, іноді в поєднанні з хірургічною операцією.

Хіміотерапія, окремо чи разом з променевою терапією, є взагалі переважним методом лікування

Зо дрібноклітинного раку легенів; при такій схемі лікування у великої кількості пацієнтів спостерігається ремісія, яка є в деяких випадках довготривалою. 1-річна відносна виживаність для раку легенів трохи підвищилася з 37 95 в 1975-1979 роках до 42956 в 2002 році, значною мірою завдяки удосконаленням в хірургічній техніці та комбінованій терапії. Однак, 5-річний рівень виживаності для усіх стадій разом - лише 16 95.

Виживаність становить 49 95 для випадків, визначених, коли захворювання ще локалізоване; однак, лише 16 95 діагнозів раку легенів ставиться на такій ранній стадії.

Отже, існує необхідність в новому ефективному та безпечному методі лікування гліобластоми, пухлини передміхурової залози, раку молочної залози, раку стравоходу, колоректального раку, світло-клітинного раку нирки, раку легенів, ЦНС, раку яєчників, меланоми, раку підшлункової залози, плоскоклітинного раку, лейкемії, медулоб ластоми та інших пухлин, в яких спостерігається надмірна експресія сурвівіну та/або інших білків цього винаходу, для покращення стану пацієнтів без використання хіміотерапевтичних речовин або інших засобів, які можуть призвести до серйозних побічних ефектів.

Стислий опис винаходу

В першому аспекті цей винахід належить до пептиду, що включає послідовність, вибрану з групи послідовностей від ЗЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІО МО: 30 або її варіант, котрий є принаймні на 85 95 гомологічним послідовності ЗЕО ІЮ МО: 1-50 ІЮО МО: 30, або її варіанта, що викликає перехресне реагування Т-клітин із зазначеним варіантом пептиду; де зазначений пептид не є повномірним поліпептидом сурвівіну людини. Переважно, вказаний пептид вибирається з пептиду, який має специфічний НІ А-підтип, такий як НІ А-А"02 або НІ А-ОВ.

У другому аспекті, цей винахід належить до нуклеїнової кислоти, що кодує пептид, відповідно до цього винаходу, або вектор експресії, здатний експресувати таку нуклеїнову кислоту.

В третьому аспекті цей винахід належить до клітини хазяїна, яка вміщує нуклеїнову кислоту або вектор експресії, відповідно до цього винаходу, в якому зазначена клітина хазяїна, переважно, є антигенпрезентуючою клітиною, зокрема дендритною клітиною або антигенпрезентуючою клітиною.

В четвертому аспекті цей винахід належить до методу іп міго для виробництва активованих цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ), який включає контакт СТІ. іп міго з молекулами МНС людини 60 класу 1! з завантаженим антигеном, що експресуються на поверхні належної антигенпрезентуючої клітини або штучної імітації антигенпрезентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації даного СТІ. антигенспецифічним способом, коли цей антиген є пептидом, відповідно до цього винаходу.

В п'ятому аспекті цей винахід належить до використання пептиду, відповідно до цього винаходу, нуклеїнової кислоти або вектора експресії, клітини чи активованого цитотоксичного Т- лімфоциту, виробленого за цим винаходом, для лікування раку чи для виробництва медикаменту проти раку, причому зазначений медикамент переважно є вакциною. Переважно, зазначене ракове захворювання вибирається з наведених нижче: астроцитому, пілоцитна астроцитома, дизембріопластична нейроеєпітеліальна пухлина, олігодендрогліоми, епендімома, мультиформна гліобластома, змішані гліоми, олігоастроцитоми, медулобластома, ретинобластома, нейробластома, гермінома, тератома, гангліогліоми, гангліоцитома, центральна гангліоцитома, примітивні нейроектодермальні пухлини (РМЕТ, наприклад, медулобластома, медулоепітеліома, нейробластома, ретинобластома, епендимобластома), пухлини пінеальної паренхіми (наприклад, пінеоцитома, пінеобластома), епендимальні клітинні пухлини, пухлини хороїдного сплетіння, нейроепітеліальні пухлини неясного походження (гліоматоз головного мозку, астробластома), гліобластома, рак простати, рак молочної залози, рак стравоходу, рак товстої кишки, колоректальний рак, гіпернефрома, світло-клітинний рак нирки, рак легенів, ЦНС, рак яєчників, меланома, рак підшлункової залози, плоскоклітинний рак, лейкемія та медулобластома, а також інші пухлини або види раку, що характеризуються підвищеною експресію сурвівіну та/бо інших білків цього винаходу.

В шостому аспекті цей винахід належить до комплекту у такому складі: (а) контейнер, який вміщує фармацевтичну композицію, що включає пептид, відповідно до цього винаходу, нуклеїнову кислоту чи вектор експресії, відповідно до цього винаходу, клітину, відповідно до цього винаходу, або активований цитотоксичний Т-лімфоцит, відповідно до цього винаходу, в розчині або в ліофілізованій формі; (Б) додатково, другий контейнер, який вміщує розріджувач або відновлюючий розчин для ліофілізованої формуляції; (с) додатково принаймні один пептид, вибраний з групи, яка складається з пептидів, відповідно до послідовності ЗЕО ІЮ МО5 1-30, та (4) додатково, інструкції по використанню розчину та/або відновленню та/або використанню ліофілізованої формуляції. В переважному втіленні, пептид вибирається з групи від 5ЕО ІЮ МО5

Коо) 1 до 5ЕО ІО 24.

В сьомому аспекті цей винахід належить до методу виробництва рекомбінантного антитіла, що специфічно зв'язується з класом І чи ІІ головного комплексу гістосумісності людини (МНС), в комплексі з НІГ А-обмеженим антигеном, який включає: імунізацію клітин нелюдиноподібних ссавців, що розроблені шляхом генної інженерії та експресують зазначений головний комплекс гістосумісності людини (МНС) класу І чи ІІ з розчинною формою молекули МНС класу І чи Ії, в комплексі з зазначеним Ні А-обмеженим антигеном; виділення молекул мРНК з клітин, продукуючих антитіло, зазначеного нелюдиноподібного ссавця; створення бібліотеки фагового дисплея, що демонструє кодування молекул білка зазначеними молекулами мРНК; та виділення принаймні одного фагу з наведеної вище бібліотеки фагового дисплея, причому принаймні один такий фаг буде показувати специфічний зв'язок зазначеного антитіла з вказаним класом | чи ЇЇ головного комплексу гістосумісності людини (МНС), в комплексі з зазначеним НІ А-обмеженим антигеном.

У восьмому аспекті цей винахід належить до антитіла, що специфічно зв'язується з класом І чи ІЇ головного комплексу гістосумісності людини (МНС), в комплексі з НІ А-обмеженим антигеном, причому антитіло є поліклональним антитілом, моноклональним антитілом та/або химерним антитілом.

Стислий опис винаходу

Стислий опис креслень

Фіг. 1 показує мас-спектри рідинної хроматографії з Е5І (іонізацією електророзпиленням), які ідентифікують пухлиноасоційовані пептиди (ТОМАР) ІСЕ2ВРЗ-001 зі зразка гліобластоми

ОВб6010, що представлені за способом, обмеженим МНС класу І.

Фіг. 2 відображає профіль експресії мРНК генів-мішеней винаходу, які експресуються в зразках гліобластоми дуже значною мірою. Експресія цих генів відсутня чи дуже низька в нормальних тканинах і значно підвищена в зразках гліобластоми. Відносні значення експресії

МРНК показані для кількох нормальних тканин і окремих зразків мультиформної гліобластоми (СВМ), які були визначені шляхом використання генних чипів. Значення співвідносяться з рівнями експресії в нормальній нирці (значення завжди довільно встановлюється на 1.0).

Значення для нормальних тканин були генеровані з використанням комерційно доступних пулів

МРНК. Букви в лапках означають "детекційний сигнал", який видає аналітична програма. бо "Детекційний сигнал" вказує, чи був транскрипт специфічно визначений у зразку взагалі, або чи могла спостерігатися якась значна детекція. Він може мати такі значення: "Р" (присутній), "А" (відсутній) або "М" (виявлений незначною мірою).

Фіг. З показує тетрамерний аналіз проліферації С5Р-001 та МІ. МаАхХ-001-специфічних СОВ8 позитивних лімфоцитів з периферичної крові здорового донора з використанням мікросфер. 1х105, збагачених СОв-позитивними РВМС (мононуклеарів периферичної крові) на лунку стимулювалися кожного тижня мікросферами в поєднанні з анти-СО28 плюс пухлинний антиген високої щільності А"0201/С5Р-001 (ліва панель) або анти-СО28 плюс пухлинний антиген високої щільності А"0201/МІ зМ4Х-001 (права панель). Після трьох стимуляцій іп міїго, усі клітини були викрашені антитілом СО8 РІТС, тетрамерами з флуоресцентним маркуванням А"0201/ С5Р-001 та А"0201/ МІ ОМ4Х-001. Клітини обмежуються популяцією СО8-позитивних лімфоцитів; цифри представляють процент клітин в зазначеному квадранті в межах СО8-позитивних лімфоцитів.

Фіг. 4 показує афінність пептидів НІ А класу І цього винаходу до молекули МНС, кодованої алеллю НІ А-А"0201. Константи дисоціації (Ко) НІ А-пептидів ТОМАР класу І з винаходу та контрольного пептиду НВМ-001 (елемент, який потужно зв'язує А"02) були виміряні за допомогою аналізу рефолдингу МНС методом ЕГІЗА.

Детальний опис винаходу

Усі терміни, що використовуються в цьому винаході, мають визначення, наведені нижче, якщо не вказано інше.

Термін "пептид" використовується тут для визначення ряду амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та та карбонільною групами суміжних амінокислот. Зазвичай пептиди мають довжину 9 амінокислот, але можуть мати довжину лише 8 амінокислот чи досягати довжини 16, або 10, 11, 12, 13, 14 чи 15 амінокислот.

Термін "олігопептид" використовується тут для визначення ряду амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та карбонільною групами суміжних амінокислот. Довжина олігопептиду не є критичною для винаходу, якщо в ньому вміщені належний епітоп чи епітопи. Олігопептиди, як правило, за довжиною є меншими ніж приблизно 30 амінокислот, та більшими ніж приблизно 14 амінокислот.

Термін "поліпептид" означає ряд амінокислотних залишків, з'єднаних один з одним, як

Зо правило, пептидними зв'язками між альфа-аміно- та карбонільною групами суміжних амінокислот. Довжина поліпептиду не є критичною для винаходу, якщо він вміщує належні епітопи. На відміну від термінів "пептид" чи "олігопептид", термін "поліпептид" вживається для визначення молекул, які вміщують більш ніж приблизно 30 амінокислотних залишків.

Пептид, олігопептид, білок чи полінуклеотид, що кодує таку молекулу, є "імуногенним" (тобто, "імуногеном" в рамках цього винаходу), якщо він здатний індукувати імунну реакцію. У випадку цього винаходу, імуногенність більш специфічно визначена як здатність індукувати Т- клітинну реакцію. Отже, "імуноген" буде молекулою, здатною індукувати імунну реакцію, та у випадку цього винаходу, - молекулою, здатною індукувати Т-клітинну реакцію.

Т-клітинний "епітоп" є молекулою короткого пептиду, яка зв'язується з рецептором МНС класу І чи ІІ, формуючи потрійний комплекс (альфа-ланцюг МНС класу І, бета-2-мікроглобулін та пептид), здатний розпізнаватися Т-клітиною, яка має відповідний Т-клітинний рецептор, що зв'язується з МНС/пептидним комплексом з належною афінністю. Пептиди, що зв'язуються з

МНС-молекулами класу І, як правило, мають довжину 8-14 амінокислот, і найбільш типовою є довжина 9 амінокислот. Епітопи Т-клітин, що зв'язуються з МНСОС-молекулами класу ЇЇ, як правило, мають довжину 12-30 амінокислот. У випадку пептидів, котрі зв'язуються з молекулами

МНС класу ІІ, один і той самий пептид та відповідний Т-клітинний епітоп можуть займати спільний коровий сегмент, але мати різну загальну довжину, внаслідок того, що бокові послідовності відрізняються за довжиною вище амінокінця ключової послідовності та нижче її карбоксильного кінця, відповідно. Рецептори МНС класу ІЇ мають більш відкриту конформацію, пептиди, зв'язані з рецепторами МНС класу ІїЇ, відповідно, не повністю заглиблені в структуру пептидно-зв'язуючого "кармана" МНОС-молекули класу ІІ, як в пептидно-зв'язуючому "кармані"

МНСОС-молекули класу І. Дивно, але це не належить до пептиду послідовності зЕО ІЮО МО. І, оскільки невеликі варіації в довжині пептиду ведуть до значного зниження активності (див. нижче).

У людей існують три різні генетичні локуси, які кодують МНСОС-молекули класу І (МНО- молекули людини також визначаються як лейкоцитарні антигени людини (НГ А)): НГА-А, НІ А-В та НГА-С. НІ А-А"О1, НІ А-А"О2, і НІ А-А" 11 є прикладами різних алелей МНС класу І, що можуть експресуватися з цих локусів.

В геномі людини є три різні локуси для генів МНС класу Ії: НСА-ОВ, НІГ А-БО та НГА-ОР. бо Рецептори МНС класу ІІ є гетеродимерами, що складаються з альфа- та бета-ланцюга, обидва з яких закріплюються в клітинній мембрані через трансмембранну ділянку. НІ А-ОКВ1704 та

НІГ А-ОВВІ1707 - два приклади різних бета-алелей МНС класу ІІ, котрі, як відомо, кодуються в цих локусах. Алелі класу ЇЇ дуже поліморфні, наприклад описано кілька сот різних НГА-ОВВ1- алелей. Отже, для терапевтичних та діагностичних цілей значною мірою доцільним є пептид, що зв'язується з належною афінністю з кількома різними рецепторами НГА класу ІІ. Пептид, який зв'язується з кількома різними молекулами НІА класу ІІ, називається гетерогенним лігандом.

Посилання на ДНК-послідовність в цьому винаході включає однониткові та двониткові ДНК.

Отже, конкретна послідовність, якщо контекст не передбачає іншого, належить до однониткової

ДНК такої послідовності, дуплексу такої послідовності з її комплементом (двониткова ДНК) та комплементу такої послідовності. Термін "кодуюча ділянка" належить до тієї частини гена, яка природним чи нормальним способом кодує продукт експресії того гена в його природному геномному середовищі, тобто, до ділянки, що кодує іп мімо природний продукт експресії гена.

Кодуюча ділянка може бути з нормального гена, або гена, що мутував чи був змінений, або навіть бути з послідовності ДНК чи гена, повністю синтезованого в лабораторії з використанням методів, добре відомих досвідченим фахівцям в галузі синтезу ДНК.

Термін "нуклеотидна послідовність" належить до гетерополімеру дезоксирибонуклеотидів.

Нуклеотидна послідовність, що кодує конкретний пептид, олігопептид чи поліпептид, може мати природне походження чи створюватися синтетичним шляхом. В цілому, сегменти ДНК, що кодують пептиди, поліпептиди та білки цього винаходу, збираються з фрагментів кКДНК та коротких олігонуклеотидних лінкерів, або з серії олігонуклеотидів для одержання синтетичного гена, здатного експресуватися в рекомбінантній транскрипційній одиниці, яка вміщує регуляторні елементи, одержані з мікробного чи вірусного оперону.

Термін "продукт експресії" означає поліпептид або білок, котрий є природним трансляційним продуктом гена та будь-якої нуклеїново-кислотної послідовності, що кодує еквіваленти, які є результатом деградації генетичного коду, і також кодує ті ж амінокислоти.

Термін "фрагмент", стосовно кодуючої послідовності, означає частину ДНК, яка вміщує менш, ніж повну кодуючу ділянку, і продукт експресії якої зберігає по суті ту ж біологічну функцію чи діяльність, що й продукт експресії повної кодуючої ділянки.

Зо Термін "сегмент ДНК" належить до полімеру ДНК, у формі окремого фрагмента чи як компонент більшої структури ДНК, що одержаний з ДНК, виділеної принаймні один раз по суті в чистій формі, тобто, без забруднюючих ендогенних матеріалів та в кількості чи концентрації, яка дає змогу ідентифікувати, виконувати маніпуляції та відновлювати сегмент і його складові нуклеотидні послідовності за допомогою стандартних біохімічних методів, наприклад, з використанням вектора клонування. Такі сегменти надаються у формі відкритої рамки зчитування, без порушень внутрішніми нетрансльованими послідовностями, чи інтронами, які зазвичай присутні в еукаріотичних генах. Послідовності нетрансльованих ДНК можуть бути присутні по низхідній від відкритої рамки зчитування, де вони не заважають маніпуляціям або експресії кодуючих ділянок.

Термін "праймер" означає коротку нуклеїново-кислотну послідовність, котра може бути спарена з однією ниткою ДНК та надає вільний З'ОН-кінець, на якому ДНК-полімераза розпочинає синтез дезоксирібонуклеотидного ланцюгу.

Термін "промотор" означає ділянку ДНК, включену у зв'язування РНК-полімерази для ініціації транскрипції.

Термін "відкрита рамка зчитування (ОКР) означає серію триплетів, що кодують амінокислоти без будь-яких термінаційних кодонів, та є послідовністю, яка може (потенційно) транслюватися в білок.

Термін "виділений" означає, що матеріал видаляється зі свого первісного середовища (наприклад, природного середовища, якщо він має природне походження). Наприклад, природно існуючий полінуклеотид чи поліпептид, присутній у живих тварин, не є виділеним, але той самий полінуклеотид чи поліпептид, відокремлений від якихось чи всіх співіснуючих матеріалів в природній системі, є виділеним. Такі полінуклеотиди можуть бути часткою вектора, та/або такі полінуклеотиди чи поліпептиди можуть становити частину композиції і продовжувати бути виділеними, якщо такий вектор чи композиція не є частиною свого природного середовища.

Полінуклеотиди та рекомбінантні чи імуногенні поліпептиди, розкриті відповідно до цього винаходу, також можуть бути в "очищеній" формі. Термін "очищений" не вимагає абсолютної чистоти; він має на увазі відносне визначення та може включати препарати високого ступеня очищення або препарати, які тільки частково очищені, в тому сенсі, як спеціалісти в цій галузі бо розуміють такі терміни. Наприклад, окремі клони, виділені з бібліотеки кКДНК, були умовно очищені до електрофорезної однорідності. Очищення вихідного матеріалу чи природного матеріалу принаймні на порядок величини, переважно на два-три порядки, та більш переважно, на чотири-п'ять порядків величини, чітко передбачається в цьому винаході. Крім того, заявлений поліпептид, котрий має чистоту переважно в 99,999 95, або принаймні в 99,99 95 чи 99,9 95; і навіть бажано 99 95 за вагою, чи більше, також чітко пропонується.

Нуклеїнові кислоти та продукти експресії поліпептидів, що розкриваються відповідно до цього винаходу, а також вектори експресії, які вміщують такі нуклеїнові кислоти та/або такі поліпептиди, можуть бути в "збагаченій формі". Термін "збагачений" в тому виді, в якому він використовується тут, означає, що концентрація матеріалу принаймні в 2, 5, 10, 100 або 1000 разів перевищує його природну концентрацію (наприклад), переважно 0,195, за вагою, принаймні переважно приблизно 0,1 956 за вагою. Також передбачаються збагачені препарати приблизно в 0,5, 1, 5, 10 та 20 95 за вагою. Послідовності, структури, вектори, клони та інші матеріали, які складають цей винахід, можуть переважно бути у збагаченій чи виділений формі.

Термін "активний фрагмент" означає фрагмент, що генерує імунну реакцію, тобто, має імуногенну функцію, при введенні (разом чи як додатково з прийнятним ад'ювантом) тварині, наприклад, ссавцю, такому як кролик чи миша, і також включаючи людину. Така імунна реакція має вид стимуляції Т-клітинної реакції у тварини-реципієнта, такої як людина. Альтернативно, "активний фрагмент" також може використовуватись для індукування Т-клітинної реакції іп міго.

В цьому винаході терміни "частка", "сегмент" і "фрагмент", якщо вони використовуються відносно до поліпептидів, означають безперервну послідовність залишків, таких як амінокислотні залишки, причому ця послідовність утворює підгрупу більшої послідовності.

Наприклад, якщо поліпептид був підданий обробці будь-якою з типових ендопептидаз, таких як трипсин або хімотрипсин, олігопептиди, одержані в результаті такої обробки, будуть представляти частки, сегменти чи фрагменти початкового поліпептиду. Це означає, що будь- який такий фрагмент буде обов'язково вміщувати, як частину своєї амінокислотної послідовності, сегмент, фрагмент або частину, яка є по суті ідентичною, якщо не повністю ідентичною, послідовності від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 30, котра відповідає природним або "вихідним" білкам послідовностей від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 30. Якщо такі терміни використовуються стосовно полінуклеотидів, вони означають продукти, одержані після обробки зазначених полінуклеотидів

Зо будь-якою з типових ендонуклеаз.

Відповідно до цього винаходу, термін "процентна ідентичність" або "процент ідентичності", відносно послідовності, означає, що послідовність порівнюється із заявленою або описаною послідовністю після вивірки послідовності, яка порівнюється ("Порівняна Послідовність"), З описаною або заявленою послідовністю ("Контрольна Послідовність"). Процентна ідентичність визначається відповідно до наведеної нижче формули:

Процентна ідентичність - 100(І-(«С/А)|, де С - кількість різниць між Контрольною Послідовністю та Порівняною Послідовністю на довжині вивірки в інтервалі порівняння між Контрольною Послідовністю та Порівняною

Послідовністю, де () кожна основа чи амінокислота в Контрольній Послідовності, котра не має відповідної вивіреної основи чи амінокислоти у Порівняній Послідовності, і (ії) кожній розрив у Контрольній Послідовності та (ії) кожна вивірена основа чи амінокислота у Контрольній Послідовності, яка відрізняється від вивіреної основи чи амінокислоти у Порівняній Послідовності, становить різницю; та К - це кількість основ чи амінокислот в Контрольній Послідовності на довжині вивірки з

Порівняною Послідовністю з будь-яким розривом, утвореним в Контрольній Послідовності, також зарахованим як основа чи амінокислота.

Якщо існує вивірка між Порівняною Послідовністю та Контрольною Послідовністю, для якої процентна ідентичність, розрахована вище, є приблизно рівною чи більшою, ніж зазначена мінімальна Процентна Ідентичність, то Порівняна Послідовність має зазначену мінімальну процентну ідентичність до Контрольної Послідовності, навіть якщо можуть існувати вивірки, в яких розрахована, як описано вище, Процентна Ідентичність менша, ніж зазначена Процентна

Ідентичність.

Первісні пептиди, що розкриваються в цьому винаході, можуть модифікуватися заміщенням одного чи кількох залишків на різних, можливо, селективних, ділянках пептидного ланцюга, якщо не зазначається інше. Такі заміщення можуть бути консервативного характеру, наприклад, коли одна амінокислота замінюється амінокислотою подібної структури та характеристик, тобто, коли гідрофобна амінокислота замінюється іншою гідрофобною амінокислотою. Навіть більш консервативною буде заміна амінокислот такого ж чи подібного розміру та хімічного характеру, 60 наприклад, коли лейцин замінюється ізолейцином. В дослідженнях варіацій послідовностей в сімействах природних гомологічних білків, певні амінокислотні заміщення частіше допускаються, ніж інші, і вони часто демонструють кореляцію зі схожістю в розмірі, заряді, полярності та гідрофобності між первісною амінокислотою та її заміною, і це є основою для визначення "консервативних заміщень".

Консервативні заміщення визначаються тут як заміни в межах однієї з наведених нижче п'яти груп: Група 1 - малі аліфатичні, неполярні чи слабополярні залишки (Аа, 5ег, Тпг, Рго,

Су); Група 2 - полярні, негативно заряджені залишки та їхні аміди (А5р, Азп, СІМ, сіп); Група З - полярні, позитивно заряджені залишки (Ні, Аго, Гуз); Група 4 - великі аліфатичні неполярні залишки (Меї, Г ем, Не, маї, Сувз); та Група 5 - великі ароматичні залишки (Ре, Туг, Тгр).

Менш консервативні заміщення можуть включати заміну однієї амінокислоти іншою, котра має подібні характеристики, але трохи відрізняється за розміром, наприклад, заміна аланіну ізолейциновим залишком. Високонеконсервативні заміни можуть включати заміщення кислотної амінокислоти полярною або навіть такою, що є основною за своїм характером. Такі "радикальні" заміщення не можуть, однак, відхилятись як потенційно неефективні, оскільки їхні хімічні наслідки не є повністю прогнозованими, та радикальні заміщення також можуть несподівано призвести до сприятливих ефектів, які неможливо передбачити за простими хімічними принципами.

Безумовно, такі заміщення можуть включати структури, інші, ніж звичайні І -амінокислоти.

Отже, Ю-амінокислоти можуть заміщуватися І -амінокислотами, котрі зазвичай виявляються в антигенних пептидах винаходу та охоплюються розкриттям в ньому. Крім того, амінокислоти, які мають нестандартні Б-групи (тобто, К-групи, інші, ніж можна знайти в типових 20 амінокислотах природних білківр також можуть використовуватись для заміщення, з метою виробництва імуногенів та імуногенних поліпептидів, відповідно до цього винаходу.

Якщо виявляється, що заміщення в більш ніж одній позиції призводять до утворення пептиду по суті з еквівалентною чи більшою антигенною активністю, як визначено нижче, тоді комбінації цих заміщень будуть досліджуватись з метою визначення, чи мають комбіновані заміщення додатковий чи синергічний вплив на антигенність пептиду. Більшою частиною, не більш ніж 4 позиції в пептиді замінюються одночасно.

Термін "Т-клітинна реакція" означає специфічну проліферацію та активацію ефекторних функцій, індукованих пептидом іп міго чи іп мімол Для СТІ, обмежених МНС класу І, ефекторними функціями можуть бути лізис клітин-мішеней з імпульсно введеним пептидом, пептидним прекурсором чи клітин-мішеней, природно презентуючих пептид, секреція цитокінів, переважно гамма-інтерферону, ТМЕ-альфа або 1-2, індукована пептидом, секреція ефекторних молекул, переважно, гранзимів чи перфоринів, індукована пептидом, або дегрануляція. Для Т- клітин- хелперів, обмежених МНС класу ІІ, ефекторні функції - це, ймовірно, індукована пептидом секреція цитокінів, переважно, ІРМ-гамма, ТМЕ-альфа, 1-4, І 5, 1/-10 або 1І/-2, чи індукована пептидом дегрануляція. Можливі ефекторні функції для СТІ і Т-клітин-хелперів не обмежуються цим переліком.

Переважно, коли СТІ, специфічні для пептиду послідовностей від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 30, перевіряються в порівнянні з заміщеними пептидами, пептидна концентрація, при якій заміщені пептиди досягають половини від максимального зростання в лізисі, відносно вихідних даних, становить не більше ніж приблизно 1 мМ, переважно не більше ніж приблизно 1 мкМ, ще більш переважно не більше близько 1 нМ, і ще більш переважно не більше 100 пМ, та найбільш переважно - не більше ніж приблизно 10 пМ. Також є переважним, щоб заміщений пептид розпізнавався СТІ. від більш ніж однієї людини, принаймні, від двох та, більш переважно, від трьох людей.

Отже, епітопи цього винаходу можуть бути ідентичними природно існуючим пухлиноасоційованим чи пухлиноспецифічним епітопам та можуть включати епітопи, що відрізняються не більш ніж на 4 залишки від контрольного пептиду, за умови, що вони мають по суті ідентичну антигенну активність.

Стимуляція імунної реакції залежить від наявності антигенів, які визнаються імунною системою хазяїна як чужорідні. Виявлення існування пухлиноасоційованих антигенів дало можливість використовувати імунну систему хазяїна для сприяння імунній реакції, котра є специфічною для цільових антигенів, експресованих на поверхні клітин пухлин, що завдяки такому механізму дії здатна призводити до ремісії, затримки чи сповільнення росту пухлини.

Зараз досліджуються різні механізми використання як гуморальних, так і клітинних важелів імунної системи для імунотерапії раку.

Окремі елементи клітинної імунної реакції здатні специфічно розпізнавати та знищувати клітини пухлин. Виділення цитотоксичних Т-лімфоцитів (СТІ) з пухлино-інфільтруючих клітинних бо популяцій чи з периферичної крові наводить на думку, що такі клітини грають важливу роль в природному імунному захисті проти раку (Спеемег еї аї., 1993; 2епй, Ш еї аї., 1999). На основі аналізу 415 зразків, взятих у пацієнтів з колоректальним раком, автори Саїюоп еї аїЇ. змогли продемонструвати, що тип, щільність та локалізація імунних клітин в пухлинній тканині, фактично, є кращим прогностичним фактором виживаності пацієнтів, ніж широко використовувана ТММ-класифікація пухлин (саїоп еї аї., 2006).

МНС класу | презентують пептиди, які є результатом протеолітичного розщеплення, в основному, ендогенних протеїнів, ОКІРЗ (дефектних продуктів рибосом) та більших за розміром пептидів. МНС-молекули класу ІІ, переважно, знаходяться на професійних антигенпрезентуючих клітинах (АРС); вони, в першу чергу, презентують пептиди екзогенних чи трансмембранних білків, що поглинаються АРС в ході ендоцитозу, та проходять подальшу обробку (Сте55угеїЇ, 1994). Комплекси пептиду та МНС-молекули класу І розпізнаються СО8- позитивними цитотоксичними Т-лімфоцитами, які презентують відповідні ТОК (рецептори Т- клітин), а комплекси пептиду і МНС-молекули класу ІЇ розпізнаються СО4-позитивними Т- клітинами-хелперами, що презентують відповідні ТОК. Добре відомим є той факт, що ТОК, пептид і МНС присутні в стехіометричному співвідношенні 1:1:1.

Сра-позитивні Т-клітини-хелпери відіграють важливу роль в індукуванні та підтриманні ефекторних реакцій СО5-позитивними цитотоксичними Т-клітинами (Умапд апа І іміпдеїопе, 2003; Зип апа Вемап, 2003; ЗпеаіосК апа зЗпеп, 2003). Спочатку примування та розповсюдження

СТІ в лімфовузлах підтримується СО4-позитивними Т-клітинами (Зспоепрегдег еї аї., 1998).

Відповідно, одним з механізмів може бути спрямування непідготовлених СБ8-позитивних клітин до місця функціональної взаємодії СО4-Т-клітина - АРС (Сабвіеїйпо еї аї., 2006). Нарешті, утворення функціональних СОВ8-позитивних клітин пам'яті в більшості випадків залежить від допомоги СО4-позитивних Т-клітин (З!ип апа Вемап, 2003; дапв55еп еї аї., 2003). З цієї причини, ідентифікація епітопів СВ4-позитивних Т-клітин, одержаних з пухлиноасоційованих антигенів (ТАА), може мати велике значення для розробки фармацевтичних продуктів для викликання протипухлинних імунних (Кобауаєзпі еї аІ., 2002; Оіп еї аїІ., 2003; Спайс еї аї., 2003). В місці локалізації пухлини, Т-клітини-хелпери підтримують СТІ - сприяюче цитокінне оточення (Оіп апа ВіІапКепвієїп, 2000; Мопага еї аї., 2006) та притягують ефекторні клітини, наприклад, СТІ 5,

МК-клітини, макрофаги, гранулоцити (Ма!г!?7о еї аї., 2000; Нухапо еї аї., 2007).

За відсутності запалення, експресія молекул МНС класу ІІ, переважно, зводиться до клітин імунної системи, зокрема, до професійних антигенпрезентуючих клітин (АРС), наприклад, моноцитів, клітин, що походять з моноцитів, макрофагів, дендритних клітин. При дослідженні пацієнтів з пухлинами було несподівано виявлено, що клітини пухлини експресують МНО- молекули класу ІІ (ЮОепадієї еї аї., 2006).

На моделях ссавців, наприклад мишей, було продемонстровано, що навіть за відсутності ефекторних клітин СТІ (тобто, СО8-позитивних Т-лімфоцитів), СО4-позитивні Т-клітини є достатніми для візуалізації інгібування пухлин шляхом інгібування ангіогенезу завдяки секреції гамма-інтерферону (ІЄМу) (Оїп апа ВіапКепвіеїп, 2000). Крім того, було запропоноване пряме знищення клітин пухлин цитотоксичними СО4-позитивними Т-клітинами за допомогою лімфотоксинів та гранзиму В (Реппа еї а!., 1992; І Шапца еї а!., 1992).

Крім того, було показано, що СБ4-позитивні Т-клітини, які розпізнають пептиди з пухлиноасоційованих антигенів, представлених молекулами НІ А класу ІІ, можуть протидіяти розвитку пухлин за допомогою індукування реакцій антитіл (АБ) (Кеппеау еї аї., 2003).

На відміну від пухлиноасоційованих пептидів, які зв'язуються з молекулами НІА класу І, лише невелика кількість лігандів класу ІЇ пухлиноасоційованих антигенів (ТАА) була описана на даний час.

Оскільки визначальна експресія молекул НІ А класу ІЇ зазвичай обмежується клітинами імунної системи (Масі еї аї., 1996), можливість виділення пептидів класу ІЇ безпосередньо з первинних пухлин не вважалася ймовірною. Однак, автори Оепад)іеї еї аї. за останній час досягли успіху в ідентифікації ряду епітопів МНС класу ІІ безпосередньо з пухлин (МО 2007/028574, ЕР 1760 088 В1; (Оепод)іеї еї а!., 2006).

Антигени, котрі розпізнаються пухлино-специфічними цитотоксичними Т-лімфоцитами, тобто, їхні епітопи, можуть бути молекулами, одержаними з усіх класів білків, таких як ферменти, рецептори, транскрипційні фактори та ін., котрі експресуються та, в порівнянні з незміненими клітинами того ж самого походження, мають підвищену концентрацію в клітинах відповідної пухлини.

Діюча класифікація пухлиноасоційованих антигенів (ТАА) включає наведені нижче основні групи (Момеїїпо еї аї., 2005): 1. Антигени Сапсег-іевіїє: Перші ТАА, що були ідентифіковані, котрі можуть розпізнаватися бо Т-клітинами (мап дег Вгиддеп еї аї., 1991) належать до цього класу, і вони спочатку були названі антигени сапсег-іевіїз (СТ), внаслідок експресії членів цього класу в гістологічно різних пухлинах людини та, серед нормальних тканин, тільки в сперматоцитах/сперматогонії сім'яників та, час від часу, в плаценті. Оскільки клітини сім'яників не експресують молекули НІ А класу І і Ії, ці антигени не можуть розпізнаватися Т-клітинами в нормальних тканинах і тому можуть вважатися імунологічно пухлиноспецифічними. Добре відомі приклади СТ-антигенів - це члени сімейства МАСЕ або МУ-Е5О-1. 2. Диференційовані антигени: Ці ТАА зустрічаються і в пухлинах, і в нормальній тканині, з якої виникає пухлина; більшість з них знаходиться в меланомах та нормальних меланоцитах.

Багато з цих меланоцитних білків, що належать до лінії диференціювання, беруть участь в біосинтезі меланіну і тому не є пухлиноспецифічними, але незважаючи на це широко використовуються для імунотерапії раку. Приклади включають, без обмежень, тирозиназу та

Меїап-А/МАНВТ-1 для меланоми або РЗА для раку простати. 3. Надмірно експресовані ТАА: Гени, що кодують широко експресовані ТАА, були визначені в гістологічно різних типах пухлин, а також в багатьох нормальних тканинах, в цілому, з більш низькими рівнями експресії. Можливо, багато епітопів, що процесуються та потенційно презентуються нормальними тканинами, нижче порогового рівня для розпізнавання Т- клітинами, в той час як їхня надмірна експресія в клітинах пухлин може запускати протиракову реакцію за допомогою порушення раніше встановленої толерантності. Яскравими прикладами цього класу ТАА є Нег-2/пеи, Сурвівін, Теломераза або УМТІ. 4. Пухлиноспецифічні антигени: Ці унікальні ТАА виникають з мутацій нормальних генів (таких як Д-катенін, СОКА, та ін.). Деякі з цих молекулярних змін асоціюються з неопластичною трансформацією та/або прогресуванням. Пухлино-специфічні антигени, в цілому, здатні індукувати сильні імунні реакції без ризику аутоімунних реакцій проти нормальних тканин. З іншого боку, ці ТАА в більшості випадків є релевантними тільки до конкретної пухлини, на якій вони були ідентифіковані, і зазвичай не зустрічаються на великій кількості інших пухлин. 5. ТАА, що виникають з аномальних посттрансляційних модифікацій: Такі ТАА можуть виникати з білків, котрі не є пухлино-специфічними і не експресуються надмірно в пухлинах, але незважаючи на це стають пухлиноасоційованими внаслідок посттрансляційних процесів, активних, перш за все, в пухлинах. Приклади цього класу виникають зі змінених моделей

Зо глікозилювання, котрі ведуть до нових епітопів в пухлинах, як у випадку МОС1 чи сплайсингу білків в ході деструкції, що може чи не може бути пухлино-специфічною (Напада еї аї., 2004;

Мідпетоп еї аї., 2004). 6. Онковірусні білки: Ці ТАА є вірусними білками, котрі можуть відігравати вирішальну роль в онкогенному процесі, та внаслідок того, що ці білки є чужорідними (не людського походження), вони можуть викликати Т-клітинну реакцію. Прикладами таких білків є вірусні білки папіломи типу 16 у людини, Еб та Е7, котрі експресуються в цервікальній карциномі.

Для того, щоб білки розпізнавалися цитотоксичними Т-лімфоцитами як пухлино-специфічні або пухлиноасоційовані антигени, та з метою використання в лікуванні, мають бути дотримані деякі попередні умови. Антиген повинен експресуватися, головним чином, клітинами пухлин, а не нормальними здоровими тканинами, чи бути присутнім в здорових клітинах в порівняно невеликих кількостях. Крім того, бажано, щоб відповідний антиген був не тільки присутнім в будь-якому виді пухлин, але також знаходився у високих концентраціях (наприклад, кількість копій відповідного пептиду на клітину). Пухлино-специфічні та пухлиноасоційовані антигени часто походять з білків, що беруть безпосередню участь у трансформації нормальної клітини в пухлинну клітину внаслідок їхньої функції, наприклад, в контролі клітинного циклу чи в супресії апоптозу. До того ж, наступні мішені цих білків, які Є ОСНОВНОЮ причиною трансформації, можуть мати підвищену експресію і, відповідно, бути непрямим чином асоційованими з пухлинами. Такі непрямо пухлиноасоційовані антигени також можуть бути мішенями у вакцинаційному підході (бБіпой-УЧазціа еї аїЇ., 2004). Істотно важливою в обох випадках є присутність епітопів в амінокислотній послідовності антигену, оскільки такий пептид (імуногенний пептид"), одержаний з пухлиноасоційованого антигену, повинен призводити до Т-клітинної реакції іп міго чи іп мімо.

По суті, будь-який пептид, здатний зв'язувати молекулу МНС, може функціонувати як Т- клітинний епітоп. Передумовою для індукування Т-клітинної реакції іп міго чи іп мімо є наявність

Т-клітини з відповідним рецептором ТОК та відсутність імунологічної толерантності до цього конкретного епітопу.

Отже, ТАА є відправною точкою для розробки протипухлинної вакцини. Методи ідентифікації та характеризації ТАА основані на використанні СТІ, котрі можуть бути виділені у пацієнтів або здорових людей, або вони базуються на генерації різних профілів транскрипції або різних моделей експресії пептидів пухлин і нормальних тканин (Гетютеї еї аї., 2004;

М/еіпзснепк еї аї., 2002).

Однак, ідентифікація генів, надмірно експресованих в тканинах пухлин чи клітинних лініях пухлин людини, або селективно експресованих в таких тканинах чи клітинних лініях, не дає точної інформації щодо використання антигенів, транскрибованих з цих генів, в імунній терапії.

Це можна пояснити тим, що тільки індивідуальна субпопуляція епітопів з цих антигенів є прийнятною для такого застосування, оскільки Т-клітина з відповідним ТОК повинна бути присутньою, а імунологічна толерантність до цього конкретного епітопа має бути відсутньою чи мінімальною. Отже, важливо вибирати тільки ті пептиди з надмірно експресованих чи селективно експресованих білків, котрі презентуються в зв'язку із молекулами МНС, проти яких можна знайти функціональну Т-клітину. Така функціональна Т-клітина визначається як Т- клітина, що після стимуляції специфічним антигеном може клонально розмножуватись і здатна виконувати ефекторні функції ("ефекторна Т-клітина").

Т-клітини-хелпери відіграють важливу роль в регуляції ефекторної функції СТІ! в протипухлинному імунітеті. Епітопи Т-хелперів, які запускають реакцію Т-клітин-хелперів типу

Тні підтримують ефекторні функції СО8в-позитивних Т-клітин-кілерів, котрі включають цитотоксичні функції, спрямовані проти клітин пухлин, що експресують комплекси пухлиноасоційованого пептиду/МнНсС на своїх клітинних поверхнях. Таким чином, епітопи пухлиноасоційованих пептидів Т-хелперів, самостійно чи в комбінації з іншими пухлиноасоційованими пептидами, можуть служити активними фармацевтичними інгредієнтами композицій вакцин, які стимулюють протипухлинні імунні реакції.

Оскільки обидва типи реакцій, залежні від СО8 та СО4, спільно та синергічно роблять свій внесок у протипухлинну дію, для розробки протипухлинних вакцин важливими є ідентифікація та характеристика пухлиноасоційованих антигенів, які розпізнаються СОв-позитивними. СТІ. (ліганд: молекула МНС класу Інпептидний епітоп) чи СО4-позитивними Т-клітинами-хелперами (ліганд: молекула МНС класу ІІ-пептидний епітоп).

Враховуючи серйозні побічні ефекти і витрати, пов'язані з лікуванням, існує гостра необхідність в кращому прогнозуванні раку та удосконаленні методів його діагностики. Отже, треба ідентифікувати інші фактори, які представляють біомаркери для раку в цілому та

Ко) гліобластоми, в особливості. Крім того, необхідно визначити фактори, котрі можна використовувати в лікуванні раку взагалі та, зокрема гліобластоми.

До того ж, не існує загальноприйнятого терапевтичного методу стосовно пацієнтів, хворих на рак простати, з біохімічним рецидивом після радикальної простатектомії, зазвичай викликаним наявністю резидуальної пухлини іп 5йи, в присутності локально прискореного росту пухлини. Потрібні нові терапевтичні підходи, що забезпечують зниження рівня смертності та мають лікувальну ефективність, порівнювану з існуючими терапевтичними підходами.

Цей винахід пропонує пептиди, котрі є прийнятними для лікування гліобластоми, раку простати та інших пухлин, які надмірно експресують сурвівін та/або С5Р, та/або інші пептиди винаходу. За допомогою мас-спектрометричного аналізу, було частково показано, що ці пептиди природно презентуються молекулами НГ А на зразках первинних гліобластом людини (див. Приклад 1 та Фіг. 1), або у випадку ЗЕО ІЮ МО: 26 оцінюються, відповідно до алгоритму прогнозування ЗУЕРЕЇТНІ (Каттепзее еї аї., 1995) як гетерогенні ліганди, що зв'язуються з

НГА-ОВ-алелями НІГ А-ОКВ1701, ОКВ1703, ОК В1704, ОКВ1711 та ОКВ1"15. На основі цих даних і частоти зустрічальності таких ОКВ1-алелей, можна припустити, що 92 95 А"02- позитивних представників білої раси експресують принаймні одну ОКВІ1-алель, що зв'язує пептид, відповідно до послідовності ЗЕО ІЮО МО: 26.

Було показано, що вихідний ген, з якого одержані послідовності від зЕО ІЮ МО: 26 до 30 - сурвівін - значною мірою надмірно експресується в гліобластомі, пухлині простати, у випадках раку молочної залози, раку стравоходу, колоректального раку, світлоклітинного раку нирки, раку легенів, ЦНС, раку яєчників, меланоми (Татт еї аї. 1998), раку підшлункової залози, плоско- клітинного раку, лейкемії та медулобластоми, в порівнянні з нормальними тканинами див.

Приклад 2 і Фіг. 2), що демонструє високий ступінь пухлинної асоціації пептиду, тобто, ці пептиди надмірно презентуються на тканині пухлини, а не на нормальних тканинах. В патенті

УМО 2004/067023 описуються пептиди, обмежені МНС класу І. що були одержані з сурвівіну пухлиноасоційованих антигенів, та мають здатність зв'язуватися з молекулами НГА класу І з високою афінністю.

НГ А-зв'язані пептиди можуть розпізнаватися імунною системою, зокрема, Т-лімфоцитами/т- клітинами. Т-клітини здатні руйнувати клітини, які презентують розпізнаний комплекс

НІГА/пептид, наприклад пухлинні клітини гліобластоми, що презентують похідні пептиди. Т- бо клітини-хелпери, активовані сурвівінпохідними пептидами, можуть інгібувати васкуляризацію пухлини, притягувати ефекторні клітини імунної системи та сприяти СТІ -примуванню, проліферації та тривалій реакції СО8-позитивних Т-клітин.

Було продемонстровано, що усі пептиди цього винаходу здатні стимулювати Т-клітинні реакції (див. Приклад З і Фіг. 3). Отже, пептиди є прийнятними для генерації імунної реакції у пацієнта, за допомогою якої можна руйнувати клітини пухлин. Імунна реакція у пацієнта може бути індукована прямим введенням описаних пептидів чи відповідних прекурсорів (наприклад, подовжених пептидів, білків чи нуклеїнових кислот, що кодують ці пептиди) пацієнту, в ідеалі в комбінації з речовиною, яка посилює імуногенність (тобто, ад'ювантом). Імунна реакція, яка відбувається в результаті такої терапевтичної вакцинації, може вважатись високоспецифічною проти клітин пухлини, оскільки цільові пептиди цього винаходу не презентуються на нормальних тканинах в порівнюваній кількості копій, і це усуває ризик небажаних аутоїмунних реакцій проти нормальних клітин у пацієнта.

Фармацевтичні композиції вміщують пептиди у вільній формі чи у формі фармацевтично прийнятної солі.

Термін "рФрармацевтично прийнятна сіль", в тому виді, в якому він використовується тут, належить до похідної сполуки розкритих пептидів, в якій пептид модифікується шляхом створення кислої чи основної солі речовини. Наприклад, кислі солі готуються з вільної основи (як правило, де нейтральна форма лікарського засобу має нейтральну -МНе-групу), за участі реакції з прийнятною кислотою. Прийнятні кислоти для приготування кислих солей включають органічні кислоти, такі, наприклад, як оцтова кислота, пропанова кислота, гліколева кислота, піровиноградна кислота, щавлева кислота, яблучна кислота, малонова кислота, бурштинова кислота, малеїнова кислота, фумарова кислота, винна кислота, лимонна кислота, бензойна кислота, корична кислота, мигдальна кислота, метансульфокислота, етансульфокислота, р- толуолсульфокислота, саліцилова кислота та ін., а також неорганічні кислоти, наприклад, соляна кислота, бромисто-воднева кислота, сірчана кислота, азотна кислота, фосфорна кислота та ін. І навпаки, приготування основних солей кислотних компонентів, які можуть бути присутні на пептиді, здійснюється з використанням фармацевтично прийнятної основи, такої як гідроксид натрію, гідроксид калію, гідроксид амонію, гідроксид кальцію, триметиламін чи тому подібні.

Зо В особливо переважному втіленні, фармацевтичні композиції вміщують пептиди у виді солей оцтової кислоти (ацетати) або соляної кислоти (хлориди).

На додаток до використання з метою лікування раку, пептиди цього винаходу також є прийнятними як діагностичні реактиви. Оскільки пептиди були генеровані з гліобластоми, і було визначено, що ці пептиди не присутні в нормальних тканинах, дані пептиди можуть використовуватися для діагностування наявності раку.

Присутність заявлених пептидів на біоптатах тканин може допомогти патологоанатому в діагностуванні раку. Визначення окремих пептидів за допомогою антитіл, мас-спектрометрії чи інших методів, відомих у цій галузі, може підказати патологоанатому, що тканина є злоякісною чи запаленою або взагалі ураженою хворобою. Наявність груп пептидів може дозволити проведення класифікації чи суб-класифікації хворих тканин.

Визначення пептидів на зразку хворої тканини може підказати рішення про необхідність терапії із включенням імунної системи, зокрема, якщо відомо або передбачається, що Т- лімфоцити беруть участь в механізм дії. Втрата МНС-експресії є добре описаним механізмом уникнення імунного контролю інфікованими або злоякісними клітинами. Тобто, присутність пептидів показує, що цей механізм не використовується проаналізованими клітинами.

Пептиди могли б використовуватися для аналізу реакцій лімфоцитів проти цих пептидів, таких як Т-клітинні реакції або реакції антитіл проти пептиду, чи пептиду в комплексі з молекулами МНС. Такі лімфоцитарні реакції можуть використовуватися як прогностичні маркери для прийняття рішення щодо подальших етапів лікування. Ці реакції також можна застосовувати як сурогатні маркери в імунотерапевтичних підходах, спрямованих на індукування реакцій лімфоцитів різними засобами, наприклад вакцинацією білком, нуклеїновими кислотами, аутологічними матеріалами, адоптивним переносом лімфоцитів. В генній терапії, реакції лімфоцитів проти пептидів можуть розглядатись в ході оцінки побічних ефектів.

Моніторинг реакцій лімфоцитів також може стати корисним засобом для подальшого обстеження при трансплантаційній терапії, наприклад, для виявлення реакцій "трансплантат проти хазяїна" та "хазяїн проти трансплантата".

Пептиди можуть використовуватися для створення та розробки специфічних антитіл проти комплексів МНС/пептид. Вони можуть використовуватись для терапії, із спрямуванням токсинів чи радіоактивних речовин на тканину, уражену хворобою. Ще одним способом використання бо цих антитіл може бути спрямування радіонуклідів на уражену тканину, в цілях томографії,

наприклад, РЕТ (позитронно-емісійної томографії). Це може допомогти у визначенні початку розвитку метастазів або визначенні розміру і точної локалізації хворих тканин.

Крім того, вони можуть використовуватись для підтвердження діагнозу раку, поставленого патологоанатомом на основі біопсії.

Таблиця 1показує пептиди, відповідно до цього винаходу, їхні номери послідовностей 5ЕО

ІО МО, НІ А-алелі, з якими зв'язуються відповідні пептиди, та вихідні білки, з яких можуть походити ці пептиди. Особливо цікавим є той факт, що пептид відповідно до 5ЕО ІЮ МО: 1 зв'язується з НІ А-ОК, а також НІ А-А"02, тобто, викликає дві різні реакції.

Таблиця 1

Пептиди цього винаходу

Дфреенееенттну илянне ноя ДУ" те послідовності ЕС) Код пептиду Послідовність НІ А-алелі й

Іо МО: (білки) 6 |СНІЗІТ-ото ф(тімомомт. |НА сАТа СНІВ 71.8 фОотМмА-О01 ЇКСООБАУМОМ /(НІААТа (ОМА 7.89 Щ(ЕсбРА-007 |АСАМІЗМУрА //(НААТа //О(БСЕВ З і д'О2

Хондроїтин сульфат протеоглікан 4 (С5РОЯ)

С5РОЯ4 (хондроїтин сульфат протеоглікан) представляє інтегральний мембранний хондроїтин сульфат протеоглікан на незрілих перицитах. Він відіграє функціональну роль в неоваскуляризації (О7егает, 2006). В ході ембріогенезу, протеоглікан С5РО4 експресується на незрілих капілярних судинах, але у міру того, як судини зріють, вони втрачають цю експресію.

Він відомий як ранній маркер розвитку меланоми на поверхні клітин, який бере участь в стимуляції проліферації, міграції та інвазії клітин пухлин. С5РО4 значною мірою експресується більш ніж у 90 95 випадків меланомних уражень у людини. Хоча С5РО4 не є чітко пухлино специфічним, пухлино реактивні СО4-позитивні Т-клітини розпізнають С5РО4в9з3-7оо на НІ А-ОВІЇ- експресуючих клітинах меланоми у пацієнтів, хворих на меланому, а також у здорових людей, за відсутності аутоімунності (Еїпигі еї аї!., 2007).

Експресія С5РО4 стимулює інтегринопосередковане поширення клітин, фосфорилювання

ЕАК (кінази фокальної адгезії) та активацію ЕККТ1/2 (кінази, що регулюється позаклітинними сигналами) (хУапо еї аї., 2004). Крім того, на основі даних іп міго з'являються докази того, що

СРО відіграє важливу роль в ангіогенезі пухлин. Наприклад, як виявилося, С5РО4-позитивні пухлини мають значно збільшений ступінь неоваскуляризації та об'єми судин, і було продемонстровано, що С5Р(З4 блокує ангіостатин, котрий зазвичай інгібує проліферацію та ангіогенез ендотеліальних клітин. Незрілі судини також вміщують СеР(зЗ4-позитивні перицити, що наводить на думку про роль цієї клітинної популяції в модуляції проліферації ендотеліальних клітин шляхом блокування інгібіторних ефектів ангіостатину в ході розвитку судин (СпекКепуа еї а!., 200260).

Також була описана експресія С5Р(О4 в деяких нормальних тканинах, крім активованих перицитів, таких, наприклад, як ендотеліальні клітини, хондроцити, клітини гладких м'язів, окремі базальні кератиноцити в епідермісі, а також клітини у волосяному фолікулі (Сатроїї еї а!., 2004).

При ангіогенезі та у відповідь на патології ЦНС, високорухливі клітини С5РО4 зазнають швидких морфологічних змін та направляються на ділянки, де відбувається ріст та відновлення судин. С5РО4 надмірно експресується як клітинами пухлин, так і перицитами на кровоносних судинах злоякісних пухлин мозку (СпеКепуа апа Ріїкіпоїоп, 2002). Шляхом імплантації клітин з лінії СБРО4-позитивних клітин гліоми людини в мозок імунодефіцитних безтимусних пацюків, було показано, що ці пухлини мають більшу мікросудинну щільність, в порівнянні з пухлинами контрольних тварин, і це означає, що експресія С5РО4 регулює функцію та структуру судинної системи пухлини, одержаної з організму хазяїна (ВгекКе еї аїЇ., 2006). В експерименті з ксенотрансплантатами, де безтимусним пацюкам вводилися сфероїди біоптатів ЗВМ (мультиформної гліобластоми), було виявлено, що С5Р(ОЯ4, переважно, асоціюється у кровоносних судинах як з перицитами, так і компонентами базальної мембрани судин пухлини, та його експресія також зв'язана з ділянками високої клітинної проліферації (СпеКепуа еї аї., 2002а). Крім того, можна провести паралель між експресію С5РО4 та розвитком пухлини в моделі імплантації гліоми (УмМігапомжу5Ка еї аї.,, 2006). Злоякісна прогресія підтримується перехресними зв'язками між пухлиною та її стромою, де активована строма живить

Зо проліферативні та інвазивні неопластичні клітини, надаючи новоутворені судини, компоненти позаклітинного матриксу та стимуляторні фактори росту. В цьому контексті, СРО грає значну роль в активації строми пухлини шляхом змін в клітинній адгезії, міграції, проліферації та судинному морфогенезі (Спекепуа апа Іттегмої!, 2007).

СРО по-різному експресується в гліомах людини - більш висока експресія спостерігається в гліомах з високою злоякісністю, в порівнянні з низькозлоякісними гліомами (Спекепуа еї аї., 1999). Висока експресія С5РО4 корелюється з резистентністю до багатьох лікарських засобів, що опосередковується збільшеною активацією передачі сигналів «ЗрВ1-інтегрин/РІЗК та їхніх мішеней по низхідній, що сприяє виживанню клітин (СпекКепуа еї аї., 2008).

С5Р-001 був виявлений в таких органах/тканинах та видах пухлин:

Мозок: - гліобластома; - вторинна гліобластома (що походить з астроцитоми);

Товста кишка: - аденокарцинома (за винятком муцинозного типу), первинна;

Пряма кишка: - аденокарцинома, метастази;

Шлунок: - аденокарцинома (за винятком персневидно-клітинного типу), первинна;

Нирки: - гіпернефрома, клітинна лінія; - гіпернефрома, світлоклітинний тип, метастази, усі вторинні локалізації; - гіпернефрома, світлоклітинний тип, первинна; - гіпернефрома, первинна;

Легені: - аденокарцинома, первинна; - аденосквамозна карцинома, первинна; - первинний рак; - дрібноклітинний рак, первинний; - плоскоклітинний рак, первинний;

Підшлункова залоза: - аденокарцинома, первинна; - інсулома, злоякісна, метастази;

Простата: - аденокарцинома, первинна;

Шкіра: - метастатична злоякісна меланома, метастази лімфовузлів;

Отже, фармацевтична композиція, яка вміщує пептид, відповідно до послідовності 5Е0 ІЮ

МО: 1, є особливо переважною для лікування таких захворювань:

Пряма кишка: - аденокарцинома, метастази;

Нирки: - гіпернефрома, клітинна лінія; гіпернефрома, світлоклітинний тип, метастази, усі вторинні локалізації; гіпернефрома, світлоклітинний тип, первинна; гіпернефрома, первинна;

Легені: - аденокарцинома, первинна; стадія І, - аденосквамозна карцинома, первинна; - первинний рак; - дрібноклітинний рак, первинний; - плоскоклітинний рак, первинний;

Простата: - аденокарцинома, первинна;

Шкіра: - метастатична злоякісна меланома, метастази лімфовузлів. 1 член сімейства ацил-СоА-синтетази (АСЗВОЇ), що кодується геном Ббибріедит

Білок, що кодується цим геном, має активність довголанцюгової ацил-СодА-синтетази.

Вважається, що він грає в мозку центральну роль в активації метаболізму та мієліногенезу жирних кислот з дуже довгими ланцюгами. Активація жирних кислот шляхом тіо-естерифікації до ацил-СоОА є попередньою умовою більшості реакцій за участі цього класу молекул. Функції чи надмірна експресія цього білка, специфічні для ракових захворювань, поки що не описані а науковій літературі. Профіль експресії АС5ВОЇ в мозку, наднирковій залозі, в сім'яниках і яєчниках та його функція свідчать про роль цього білка в біохімічній патології Х-зв'язаної адренолейкодистрофії (ХАГО). ХАГО - це серйозне, часто навіть смертельне, нейродегенеративне захворювання, що характеризується підвищеними рівнями насичених жирних кислот з дуже великою довжиною ланцюга в плазмі і тканинах (АзвПпешпег еї а!., 2005; Реї еїа!., 2003).

Бревікан (ВСАМ)

Бревікан є білком позаклітинного матриксу, котрий значною мірою експресується з моменту народження до 8-річного віку. На момент досягнення 20 років, експресія білка зменшується до низьких рівнів, котрі утримуються в нормальній корі головного мозку дорослої людини.

Ізоформа ОРІ (глікофосфатидилінозитолу) експресується на рівномірно низьких рівнях протягом всього розвитку (Сагу еї аї.,, 2000). Злоякісні гліоми агресивно вторгаються в оточуючий нормальний мозок, і посередниками в цьому можуть бути тканино- чи пухлиноспецифічні позаклітинні білки. Таким чином, позаклітинний матрикс (ЕСМ) може частково модулювати пермісивність тканини до руху клітин. Відповідно, здатність гліом модифікувати позаклітинний матрикс ЦНС може сприяти інвазивності цих клітин. Однією з молекул ЕСМ, що демонструє різке підвищення експресії в гліомах, є ВСАМ, мозкоспецифічний хондроїтин сульфат протеоглікан. Експресія ВСАМ також підвищується в періоди збільшеної

Зо рухомості гліальних клітин при розвитку мозку та після його травмування. В гліомі можна виявити приблизно в сім разів збільшену експресію, в порівнянні з нормальними рівнями (Сагу ега!., 2000; Сагу еї аї., 1998). На додаток до підвищеної експресії ВСАМ в гліомі, протеолітичний процесинг повномірного білка також може сприяти інвазії (Сагу еї аї., 1998; Мий еї аї., 2001).

Можна продемонструвати, що протеолітичний процесинг ВСАМ металопротеазами сімейства

АРАМТЗ є необхідним етапом в опосередкуванні його проінвазивного ефекту в гліомі. Мутантна "нерозщеплювана" форма ВСАМ не здатна посилювати інвазію клітин гліоми іп міїго і прогресію пухлини іп мімо (Міаріапо еї аЇ.,, 2008). мРНК для ВСАМ не визначається в нормальній корі головного мозку дорослої людини чи в будь-якій пухлині, іншій ніж гліома, отже, ВСАМ вважається унікальним і селективним маркером гліоми (амжог»5кі еї аї., 1996). Крім того, аналіз білка розкрив не тільки підвищену експресію повномірного ВСАМ, а й також присутність додаткових унікальних ізоформ в гліомі. Наприклад, В/бло є повномірним продуктом мРНК

ВСАМ, що одержується шляхом неповного чи скороченого глікозилювання корового білка. В/Ьде відсутній в нормальному мозку дорослої людини, але виявляється у високозлоякісних зразках гліом (Міаріапо еї аї., 2005).

Описана селективна надмірна експресія ВСАМ в типі стовбурових клітин пухлин, одержаних з гліобластоми (Сипіпег еї аїЇ., 2008). Цей підтип стовбурових клітин демонструє найвищу плюрипотентність та онкогенність іп мімо.

Хітиназа 3-подібний білок 1 (хрящовий глікопротеїн-39) (СНІЗІ 1)

СНІЗІ 1, член сімейства "хітиназоподібних білків ссавців", експресується та виділяється декількома видами солідних пухлин. Він виробляється раковими клітинами та пухлиноасоційованими макрофагами, демонструє активність фактора росту для клітин, які беруть участь у процесах ремоделювання тканин та може грати певну роль у проліферації, диференціації, виживанні, інвазивності, метастазуванні ракових клітин, в ангіогенезі та запаленні і ремоделюванні позаклітинного матриксу, що оточує пухлину (допапзеп еї аї., 2006;

Уопапзеп еї аї., 2007; Кіпозпоїї еї аїІ., 2007). Крім того, СНІЗІ1 є ймовірним аутоантигеном в ревматоїдному артриті. СО4 Т-клітинні лінії від здорових донорів, спрямовані проти СНІЗІ 1, експресували СО25, рецептор глюкокортикоїдіндукованого фактора некрозу пухлин та молекули

Еохр3, і були здатні обмежувати антигенспецифічні Т-клітинні реакції. Відповіді у 50 95 людей, хворих на ревматоїдний артрит, показали поляризацію відносно до прозапального фенотипу Т-

хелпера 1, та були значно менш дієві у пригніченні антигенспецифічних вторинних імунних відповідей (мап Віїзеп еї аї!., 2004).

Експресія СНІЗІ 1 підвищується онкостатином М, котрий, як відомо, індукується у нервовій системі в результаті стресу клітин та експресується в більшості пухлин мозку людини і активує шлях передачі сигналів "АК/ЗТАТ (Кгопа еї а!., 2007). Експресія СНІЗІ 1 також була асоційована з експресією р-МАРК, р-тТоКк і р-р7056К в гліобластомі (РеПозкКі еї а!ї., 2006).

В кількох дослідженнях генної експресії було продемонстровано, що СНІЗІ 1 має вищу експресію в гліобластомі, і підвищення експресії варіюється в діапазоні від З до 62 разів більше, ніж рівень в нормальному мозку (Заїаі єї аї!., 2007; Ктоез вї аї!., 2007; Зповіак вї аї., 2003; Тапмаг еї аї.,, 2002). Імуногістохімічні дослідження виявили, що усі клітини з функціонуючим ядром здатні експресувати СНІЗІ 1 в цитоплазмі, але інтенсивність СНІЗІ 1-експресії залежала від клітинної активності. Отже, клітини, відомі своєю високою метаболічною активністю, мали тенденцію до найбільш інтенсивного викрашування цитоплазми (РКіпд5поїї еї аїЇ., 2007). Крім того, за допомогою методів імуногістохімії можна визначити, що гліобластоми демонструють набагато більшу СНІЗІ1-експресію, ніж анапластичні олігодендрогліоми (Мий еї аї., 2005).

Вестерн-блотинг - аналіз рівнів білка СНІЗІ 1 в зразках гліоми показав значне підвищення в 65 95

СВМ та невизначальні рівні в гліомах нижчої злоякісності (ступеня Ії ї І) або в нормальній мозковій тканині (Тапулхаг еї аїІ., 2002) На відміну від пілоцитарної астроцитоми, яка не поширюється та може бути вилікована за допомогою хірургічного втручання, гліобластома експресує СНІЗІ 1 (Соїп еї а!., 2006).

Рівні СНІЗІ1 у сироватці крові підвищені в різних злоякісних новоутвореннях та асоціюються з більш низькою виживаністю. Найвищі рівні СНІЗІ 1 у сироватці були виявлені у пацієнтів, хворих на метастазуючий рак, з найкоротшим безрецидивним інтервалом та найменшою загальною виживаністю. Зокрема, експресія СНІЗІ 1 була підвищеною у хворих на гліобластому (Кіт єї аї., 2007; допапзеп еї аї., 2007; Чдопапзеп еї аї!., 2006; УипКег єї аї., 2005; Тапмаг єї аї., 2002). Пацієнти з активною пухлиною ВМ мають значно вищий рівень СНІЗІ 1, ніж пацієнти без рентгенографічного підтвердження активності пухлини. Крім того, існує помітний зворотний зв'язок між СНІЗІ 1 та виживаністю у випадках СВМ (Ноптідо еї а!., 2006; РеїПозкКі еї аї., 2005).

Крім того, підвищена СНІЗІЛ-експресія може спостерігатися у випадках раку молочної

Зо залози, де вона корелюється з більшим розміром пухлини, слабкішою диференціацією пухлин та меншим періодом ремісії (Кіт еї аї.,, 2007; Соб5Кип еї аІ., 2007). До того ж, у випадках плоскоклітинного раку голови та шиї підвищені рівні СНІЗІ 1 у сироватці були визначені в 53 95 захворювань. У пацієнтів з високим рівнем СНІЗІ 1 у сироватці відзначався коротший період виживаності, ніж у пацієнтів з нормальним рівнем СНІЗІ 1 у сироватці (33 місяці в порівнянні з 84 місяцями) (Козіїпа еї аї.,, 2008). У людей, хворих на рак простати, спостерігалися значно вищі рівні СНІЗІ1 у сироватці крові в порівнянні з пацієнтами з ВРН або здорових людей (Кисиг еї аї., 2008).

Білок-лінкер 2 з доменом САР-аї М (СПІР)

Білок, що кодується геном СІ ІР2, належить до сімейства цитоплазматичних білків-лінкерів, котрі вважаються посередниками взаємодії між специфічними мембранними органелами та мікротрубками. Було виявлено, що СІ ІР2 асоціюється і з мікротрубками, і з органелами, що називаються дендритними ламелярними тілами (загальна інформація взята з веб-сторінки

МОВІ).

СІР2 локалізується на кінцях мікротрубок з високою кількістю тирозину, а не на кінцях мікротрубок без тирозину. Тубулін-тирозинлігаза (ТТ), фермент, що каталізує додання С- термінального тирозинового залишку до альфа-тубуліну в циклі тубулін-тирозинації, бере участь в прогресуванні пухлини та грає дуже важливу роль в нейрональній організації (Регів еї а! 2006). Одно з досліджень геномного ДНК з заморожених часток пухлин в 30 зразках первинних гліобластом за допомогою генних чипів Сепобепзог Агтау 300 дозволило характеризувати генні ампліфікації, генні делеції та одержати повну інформацію про геном.

Гени, що ампліфікувалися часто, включали «СІ ІР2 (63,3 95), ЕСЕВ (53,3 Ос), ІІ 6 (53,3 95), АВСВІ1 (МОВІ) (36,7 95) та РОСЕКА (26,7 95) (Би7икі єї аі!., 2004).

Член 1С1 сімейства розчинних білків-транспортерів органічних аніонів (БІ СО1С1) 5 СО1С1 селективно експресується на гематоенцефалічному бар'єрі (Спи еї аї., 2008). 5 СО1С1 має селективну субстратну преференцію та може грати важливу роль в передачі сигналу тироїдних гормонів у мозку та сім'яниках (Рі;7адаїії еї аІ., 2002). Специфічне визначення 5І СО1С1 методом імунофлуоресценції виявилося неможливим. 5 СОТА2 та 5І СО281 можна було визначити за допомогою методу імунофлуоресцентної мікроскопії в люмінальній мембрані ендотеліальних клітин, що формують гематоенцефалічний бар'єр та бар'єр пухлин бо кровотворної тканини, а не в клітинах гліоми (Вгопдег еї аї., 2005).

Дистробревін, альфа (ОТМА)

Альфа-дистробревін описується, перш за все, як цитоплазматичний компонент дистрофін- глікопротеїнового комплексу в клітинах скелетних м'язів. ІЗоОформи ОТМА демонструють різну локалізацію в клітинах і тканинах; на базолатеральних мембранах в епітеліальних клітинах, дистробревіни виступають посередниками контакту з позаклітинних матриксом, периферичними і трансмембранними білками та актиновими філаментами цитоскелету. Крім виконання структурної ролі, ОТМА вважаються важливими для передачі клітинних сигналів та диференціації клітин і асоціюються зі щільними з'єднаннями протягом реорганізації (530 еї аї., 2005). ОТМА можуть брати участь у формуванні та стабільності синапсів, а також у групуванні нікотинових ацетилхолінових рецепторів.

Рецептор епідермального фактора росту (гомолог онкогена му-егЬ-Ь вірусу ерітробластоми птахів) (ЕСЕК)

Останнім часом приділяється особлива увага рецептору епідермального фактора росту (ЕСЕК), оскіьки його аномалії є однією з найбільш типових молекулярних аберацій в гліобластомі. Зокрема, ЕСЕЕМІИ! (варіант ПІ рецептора епідермального фактора росту) є онкогенною, конститутивно активною мутантною формою ЕСЕК, що зазвичай експресується у гліобластомі (7амгоскі апа Віетаї, 2005). ЕСЕК включається в активацію багатьох шляхів, котрі регулюють фенотип клітин-попередників. Тирозин-кіназна активність активованого ЕСЕК посилює міграцію, проліферацію та виживання нервових стовбурових клітин. Оскільки, як відомо, передача сигналів ЕСЕК також відіграє певну роль у гліобластомі, можна зробити висновок, що гліобластома походить з ракових стовбурових клітин, і що сигнали ЕСЕК зазвичай змінюються в цих прекурсорних клітинах (Уизо-Засідо сеї аї!., 2006).

Первинні гліобластоми виникають де помо у пацієнтів старшого віку і часто експресують

ЕСЕК значною мірою. Надмірну експресію ЕСЕК можна співвіднести із збільшеним ангіогенезом, набряклістю та інвазією (Аодпі еї аї., 2005). Крім того, гліобластоми з ампліфікацією

ЕСЕК є стійкими до опромінювання (Вагкег еї аї., 2001) та частіше рецидивують після лікування (5спіеде! єї аї., 1994).

СВМ є єдиною неепітеліальною пухлиною у людини, в якій надмірна активація ЕСЕК асоціюється з ростом пухлини та виживаністю пацієнтів, і активація ЕСЕК сприяє інфільтрації аВвмМ іп міо (Репаг вї а/!., 1997).

ЕСЕК є протоонкогеном егоВ. Надмірна експресія ЕСЕК може активізувати ріст клітин, завдяки збільшеному формуванню активних комплексів ліганд:рецепторів. Генна ампліфікація є механізмом, який лежить в основі надмірної експресії ЕСЕ-рецепторів в пухлинах ВМ (Тотрзоп апа сії, 1985). Ген ЕСЕК на хромосомі 7, як відомо, часто представлений великою кількістю копій у високозлоякісних гліомах (ОКааа еї а!., 2007). Елімінація ЕСЕК інтерференцією короткої РНК припиняє онкогенез клітин гліобластоми (Ниапоа еї аї., 2007).

Надмірна експресія ЕСЕК визначається в 40-70905 (ВМ, в той час як пілоцитарна, низькозлоякісна чи анапластична астроцитома незмінно є ЕСЕК-негативною. (Адозвії еї а!., 1992; зЗепмжесппеї тег еї а!., 1995; Еррепрегдег апа Миеї!Іег, 1994; Нипснагек апа Киреїпіск, 2000; Пи еї а!.,, 2006ба). Високі рівні ЕСЕК у сироватці крові вказують на зменшену виживаність (Оцагапіа еї аІ., 2007). Крім того, було продемонстровано, що хворі на високозлоякісні астроцитоми з довготривалою виживаністю є ЕСЕКміІІ-негативними (І іапо еї аї., 2008).

Ген Моїсп-1 підвищує експресію ЕСЕК, і можна визначити кореляції між рівнями ЕСЕК та

МРНК Моїсп-1 в первинних високозлоякісних гліомах людини (Ригому еї аї., 2008). ЕСЕК, сам по собі, бере участь в конститутивній активації с-дип МН2-термінальної кінази (МК), котра сприяє проліферації, виживанню та онкогенезу в деяких пухлинах, включая гліоми (Гі еї а!., 2008а).

Хоча ЕСЕКМІІ експресується тільки невеликою кількістю клітин гліоми, більшість клітин демонструють трансформований фенотип. Було показано, що експресія ЕСЕКМІ в повільно зростаючих клітинах гліоми стимулює формування мікропорожнин ліпідного рафту, що містять

ЕСЕРМІЇЇ, що вивільняється в оточуюче середовище клітин та може зливатися з плазмовими мембранами ракових клітин без ЕСЕРЕМІЇІЇ, призводячи до переносу онкогенної активності (АІ-

Медаммі єї а!., 2008).

Білок 7 мозкової тканини, що зв'язує жирні кислоти (ЕАВР7)

Білки, що зв'язують жирні кислоти (ЕАВР), являють собою цитозольні білки з молекулярною масою 14-15 Коба, котрі, як передбачається, беруть участь у накопиченні, транспортуванні та спрямуванні жирних кислот. Вони можуть регулювати концентрацію РЕА і таким чином впливати на функціонування ферментів, мембран, іонних каналів та рецепторів, а також генну експресію, клітинний ріст та диференціацію. Можна виділити дев'ять типів ЕАВР, із специфічним розподілом у тканинах. Незважаючи на 30-70 95-ідентичність амінокислотних послідовностей, ці бо білки мають третинну структуру бета-ковзаючої застібки, в якій зв'язуються жирні кислоти.

Нервова тканина вміщує чотири типи ЕАВР з чітко вираженим просторово-часовим розподілом (Уеегкатр апа 7іттегптап, 2001). ЕАВР7 значною мірою експресується в мозку під час розвитку та в сітківці ока, та його експресія значно зменшується в ЦНС дорослої людини (соадроцші еї аї., 1998). На основі результатів іп міго, була висловлена думка, що БАВР7 є потрібним для формування радіальної гліальної системи в мозку, що розвивається (Міїа еї аї., 2007). В нормальному мозку білок БЕАВР7 визначається на дуже низькому рівні, але демонструє нуклеарну та цитоплазматичну експресію в кількох випадках ВМ, яка варіюється від помірної до значної. РАВР7-трансфековані клітини виявляють в 5 разів більшу міграцію, ніж контрольні клітини. Таким чином, більш короткий загальний період виживання, асоційований з надмірною експресією ЕАВР7, особливо в гліобластомі, може бути обумовлений збільшеною міграцією та інвазією клітин пухлин в оточуючу мозкову паренхіму (Гіапд еї аї.,, 2005). Нуклеарна транслокація ЕАВР7 чітко належить до ампліфікації ЕСЕК та більш інвазивних пухлин (Каїовпі еї аї.,, 2007). Отже, нуклеарний ЕАВР7 може бути індукований активацією ЕСЕК для сприяння міграції пухлинних клітин ВМ (Ііапо еї аї., 2006).

Було визначено, що експресія ЕАВР7 є також маркером гіпернефроми. РАВР7 -експресія може визначатися тільки в тканинах пухлини, на відміну від неракових частин зразків нирки (Тегагапі еї аї.,, 2007). Виявилося, що експресія ЕАВР7 в гіпернефромі в 20 разів перевищує рівень його експресії в тканині нормальної нирки (Ботоїйо еї аї., 2007; Висппег еї а!., 2007). Було також показано, що БАВР7 часто експресується в меланомі, де він може брати участь у проліферації та інвазії клітин (оо еї а!., 2006).

Гліальний фібрилярний кислий білок (ЗЕАР)

СЕБАР кодує один з головних проміжних філаментних білків зрілих астроцитів. Він використовується як маркер для відмежування астроцитів від інших гліальних клітин протягом розвитку. Мутації в цьому гені викликають хворобу Александера, астроцитарний розлад в центральній нервовій системі, що зустрічається дуже рідко. Був описаний додатковий транскриптний варіант, але його повномірна послідовність не визначена. Є інформація про збільшені рівні в аутистичному мозку, причому мозок у людей з сильною депресією продемонстрував знижений рівень СЕАР.

Були проаналізовані зразки мозку приматів, в якому виникли пухлини де помо через десять

Зо років після опромінювання всього мозку. Пухлинні прекурсори продемонстрували клітинну атипію та мітоз і були негативні на пухлиноасоційовані маркери СЕАР, ЕСЕК та роз (І иреп5Ку еїа!., 2006).

В астроцитарних неоплазмах, кількість (ЗЕАР-позитивних клітин та інтенсивність викрашування прямо пропорційно співвідноситься зі ступенем злоякісності. В усіх трьох випадках олігодендрогліоми була показана негативна реакція на СЕАР (Кеуа? еї аї., 2005). Чисті олігодендрогліоми є імунологічно негативними до ЗЕАР (МокКпїагі еї аї., 2005). Рівні СЕАР у сироватці крові пацієнтів з високозлоякісною гліомою показали лінійну кореляцію з об'ємом пухлини (Вготтеїапа еї аї., 2007). Навіть серед пацієнтів з СВ можна було простежити чіткий зв'язок між об'ємом пухлини, ступенем некрозу пухлини та кількістю некротичних СЕАР- позитивних клітин і рівнем СЕАР у сироватці (дипо еї аї., 2007).

Після впливу на клітинні лінії гліобластоми 4-фенілбутирату, інгібітору гістон-деацетилаз, спостерігалися збільшені концентрації нефосфорилованого СЕАР, в той час як фосфориловані ізоформи залишились незмінними (АзКішипа еї аї., 2004).

В клітинній лінії глюобластоми, що пройшла обробку ТоЕ-альфа, генна транскрипція СЕАР, рівень мРНК та синтез специфічного білка зменшилися приблизно на 50 95 (7пйои апа 5кКаїї, 2000).

В технічному сенсі промотор СБАР є часто використовуваним інструментом в експериментах з мишами для індукування експресії бажаних білків специфічно в нервовій системі.

Панкреатичні островки Лангеранса оточені навколо острівцевими клітинами Шванна (рзс), які експресують СЕАР. Аутоїмунне ураження елементів тканини нервів підшлункової залози вважається невід'ємною частиною ранньої стадії діабету типу 1 (М/іпег єї аї., 2003). Ця експресія в підшлунковій залозі не відображена даними іттаїйсз5 чи зовнішніми даними генної експресії з великої кількості тканин. Була опублікована інформація про те, що СЕАР-001 є епітопом, відносно до якого хворі на діабет типу 1, а також їхні родичі без діабету з реакціями антитіл проти аутоантигенів діабету (збільшений ризик захворювання), виявили збільшену реактивність гранзим В-секретуючих СТІ (ех мімо ЕГІ5РОТ) в порівнянні із здоровими донорами (5іапайїйїег еї а!., 2006).

Цікавим є ймовірне існування зворотного зв'язку між проявами аутоїмунних захворювань, зокрема, діабету, та ризиком розвитку гліоми (Агопзоп апа Агопзоп, 1965; Зспіепогег еї аї., 1999;

Вгеппег єї аї!., 2002; Зспугапрацт еї аї., 2003; Зспугапрацт еї аї., 2005).

Рецептор 56, пов'язаний з с-білюом (СРЕК56б)

СРЕБб є атиповим рецептором, пов'язаним з б-білком (ОРСЕК), з незвичайно великою М- термінальною позаклітинною ділянкою, котра вміщує довгу ділянку, багату на Зег/Тйг, яка формує муциноподібний стовбур. Завдяки цій властивості, вважається, що СРК56 грає певну роль у взаємодіях клітина-клітина або клітина-матрикс. Враховуючи високий рівень експресії

МРНК та її широке розповсюдження, цей рецептор, можливо, бере участь у процесах взаємодії між клітинами (Гіши еї аї., 1999). ОРК5б належить до ОРСК сімейства секретину, що відіграє роль у розвитку нейральних прогеніторних клітин (клітин-попередників); крім того, його зв'язують з вадами розвитку мозку людини. Більш висока експресія СРК5Об корелюється з фенотипами клітинної трансформації тканин в кількох видах пухлин, в порівнянні з їхніми нормальними аналогами, що наводить на думку про потенційно онкогенну функцію. Вимикання ОРК56, опосередковане інтерференцією РНК, призводить до індукування апоптозу та зменшеного якірно-незалежного росту ракових клітин шляхом підвищеного аноїкозу. Вимикання сРК5б також знижує адгезію клітин до позаклітинного матриксу (Ке еї аї., 2007). Підвищена експресія

СРКБОб була продемонстрована в мультиформній гліобластомі за допомогою методів функціональної геноміки. Імуногістохімічні дослідження підтвердили експресію СОРК5Бб в більшості зразків пухлин гліобластоми/астроцитоми, з невизначальними рівнями експресії в нормальному мозку дорослої людини (Зпазпіанаг еї аї., 2005). В клітинах пухлини підшлункової залози, МРНК СРК5Б6 експресується на високому рівні, в той час як рівень білка ОРК56б в цих клітинах незначний або не визначальний, тобто, експресія білка ОРК5Б6 пригнічується в клітинах пухлин підшлункової залози у людини (Ниапд сеї аїЇ., 2008). Попередні дослідження метастазування показали помітно знижену експресію ОРК56 у високометастатичних варіантах з клітинної лінії меланоми людини; це може означати, що надмірна експресія ОРК56 уповільнює ріст пухлин та утворення метастазів. Такій супресії росту, ймовірно, сприяє взаємодія ОРК5б з тканинною трансглютаміназою (Т02), широко відомим компонентом тканини і строми, що, як вважається, пригнічує прогресування пухлини (Хи еї аї., 2006; Хи апа Нупез, 2007). Про інший

Зо інгібіторний ефект ОРК5б доповідалося стосовно міграції нейральних прогеніторних клітин (МРС). СРК5БЄ значною мірою експресується в МРС та, ймовірно, бере участь у регуляції руху

МРС по Са|Ірна(12/13)-та Кпо-шляхах передачі сигналів, і це наводить на думку про важливу роль ОРК5Б6 в розвитку центральної нервової системи (Ідиспі еї аї., 2008).

Глутаматний рецептор, іонотропний АМРА 4 (СОКІА4)

Глутаматні рецептори а-аміно-3-гідрокси-5-метил-4-ізоксазол-пропіонатового(АМРА) типу (АМРАК) сприяють швидкій нейротрансмісії в збуджуючих синапсах в ЦНС та складаються з субодиниць, взятих з ряду чотирьох білків, від СІШКІ до СІшК4А (СА |ІА4).

СВІА4-субодиниці повсюдно екпресуються в клітинах гліобластоми людини, функціонуючи як Са»-проникні АМРАК. Перетворення на Са?"-непроникні рецептори інгібує рух клітин та індукує апоптоз, в той час як надмірна експресія Са"-проникних АМРА полегшує міграцію та проліферацію клітин пухлин. Отже, вважається, що Са?-проникні АМРА-рецептори відіграють вирішальну роль у рості гліобластоми (ІзПіциспі еї аї., 2002).

МРНК-зв'язуючий білок З інсуліноподібного фактора росту 2 (ІСЕ2ВРЗ)

ІСЕ2ВРЗ є членом сімейства білків, що зв'язують мРНК інсуліноподібного фактора росту-ЇЇ, який залучений до локалізації, оновлення і трансляційного контролю мРНК. Кодований білок вміщує кілька КН (К-гомологічних)-доменів, які Є важливими в РНК-зв'язуванні, і відомо про те, що вони беруть участь у синтезі та метаболізмі РНК. Експресія відбувається, переважно, в ході розвитку ембріона та була описана для деяких пухлин. Отже, ІСЕ2ВРЗ вважається онкофетальним білком (Гіао еї аїЇ., 2005). В літературі немає конкретної інформації щодо експресії ІСЕ2ВРЗ у гліобластомі, але описано, що ІСЕ2ВРЗ надмірно експресується в кількох інших злоякісних пухлинах. Наприклад, було виявлено, що ІСЕ2ВРЗ експресується в 30 95 з 716 проаналізованих зразків пухлин у випадку світлоклітинного раку нирки. В цьому дослідженні його експресія асоціювалася із запущеною стадією та ступенем первинних пухлин, а також з іншими несприятливими ефектами, такими як коагулятивний некроз пухлини та саркоматоїдна диференціація. Крім того, позитивна експресія ІСЕ2ВРЗ асоціюється з підвищеним в 5-10 разів ризиком віддалених метастазів і на 42 95-50 96 вищим ризиком смерті від раку нирки (КСО), і це наводить на думку, що експресія ІСЕ2ВРЗ є незалежним прогностичним фактором агресивної поведінки пухлини нирки світлоклітинного типу (Ноїтапп еї аї., 2008; діапу еї а!., 2006; Лапа єї аІ., 2008). Експресія ІСЕ2ВРЗ також була визначена в злоякісній меланомі, в порівнянні з бо доброякісною родимкою, де експресія була відсутня, навіть у присутності диспластичних змін

(Ргуог еї аїЇ, 2008). Стосовно раку ендометрія, експресія ІСЗЕБ2ВРЗ тісно зв'язана з ендометріальним раком типу ІЇ та агресивним гістологічним фенотипом серед неопластичних уражень ендометрія (7Ппепод еї аї.,, 2008). У 20 пацієнтів, хворих на плоскоклітинний рак стравоходу, індукування специфічних Т-клітинних реакцій в пухлино-інфільтруючих лімфоцитах (ТУ), лімфоцитах регіонарних лімфовузлів та лімфоцитах периферичної крові до пептиду НЬБА-

А2402-обмеженого епітопу з ІСЕ2ВРЗ можна було спостерігати в 40 95 усіх випадків (Мігикаті еї аІ.,, 2008). ІСР2ВРЗ також значною мірою експресується в карциномах підшлункової залози. В 2 дослідженнях, більше 9095 зразків тканин пухлин підшлункової залози продемонстрували експресію ІСЕ2ВРЗ після імунного викрашування, в той час як тканини підшлункової залози без новоутворень були негативні на ІСЕ2ВРЗ. Крім того, мРНК ІСЕ2ВРЗ була надмірно екпресована в карциномах підшлункової залози, в порівнянні зі зразками тканин без новоутворень, та експресія поступово збільшувалася разом із ступенем пухлини (Уапії55 еї аї., 2005; Мапіів5 еї аї., 2008). Значне підвищення експресії ІЗЕ2ВРЗ також було виявлене у високозлоякісних уротеліальних пухлинах, але він зазвичай не експресується в доброякісному уротелії або низькозлоякісних уротеліальних пухлинах. Більше того, у пацієнтів з (ЗЕ2ВРЗ-позитивнимМи пухлинами набагато нижча виживаність без прогресування та безрецидивна виживаність, ніж у пацієнтів 3 ІЗЕ2 ВРЗ-негативними пухлинами. У ІЗЕ2ВРЗ-позитивних пацієнтів з первісним діагнозом "поверхнева інвазивна уротеліальна карцинома" також починався розвиток метастазів, в той час як ніяких метастазів не було виявлено у ІСЕ2ВРЗ-негативних пацієнтів. До того ж, дані цих досліджень підтверджують ймовірність участі ІСЕ2ВРЗ в прогресуванні уротеліальних пухлин з низького до високого ступеня, як для папілярних ушкоджень, так і для ушкоджень з рівною поверхнею (Гі еї аї., 20086; Зіїпікома еї аї., 2008).

Лейкоенцефалопатія з макроцефалією з субкортикальними кістами 1 (МІ. С1)

Лейкоенцефалопатія з макроцефалією з субкортикальними кістами (МІС) є аутосомно- рецесивним церебральним порушенням, пов'язаним з білою речовиною, у дітей. Причиною МІ С є мутації в гені МІ С1 (Ша Воог еї аї., 2006). Згідно із інформацією, наявною у авторів винаходу, в науковій літературі немає даних про зв'язок МІ С1 з пухлинами мозку.

В одній з робот досліджувався клітинний та регіональний розподіл МІ/С1 в мозку миші (Зсптій еї а!., 2003). Найвища експресія МІ С1 була виявлена протягом пре- і перинатального

Зо періоду в напівфункціональних нейральних прекурсорних клітинах. В мозку дорослої миші мРНК

МІ С1 визначалася виключно в гліальних клітинах. На відміну від астроцитів, що розвиваються, та зрілих астроцитів, олігодендроцити були вільні від експресії МІ. С1.

Нестин (МЕ5)

В ході розвитку плоду, спостерігається значна експресія білка проміжних філаментів нестину в нейроєпітеліальних клітинах у вентрикулярному шарі в термін 11 тижнів після зачаття, в усіх частинах ЦНС, але імунореактивність нестину зменшується протягом другого і третього триместрів вагітності (ТаКапо апа ВесКег, 1997; Гепаанйі еї аї!., 1990; Аттептап еї аї., 1994;

Топуата еї аї., 1992). В ході чи після міграції нестину з проліферативного вентрикулярного шару, його експресія значно знижується в постмітотичних нейронах (Агпоїй апа Тгозапому»кі, 1996). Викрашування тканини мозку без неопластичних змін у дорослої людини специфічно на нестин показало дуже слабке викрашування лише малої кількості ендотеліальних клітин (Оапізігапа еї аї.,, 1992). Нестин може повторно експресуватися під час неопластичної трансформації (Мезеї5Ка еї аї., 2006). В тканинах гліоми, імунореактивність нестину має місце тільки в клітинах пухлин, і кількість продукованого нестину збільшується разом із ростом злоякісності гліоми до гліобластоми. Гліобластоми (зі ступенем злоякісності ІМ) експресують найвищу кількість нестинпозитивних клітин та, в цілому, найвищі рівні викрашування на нестин.

Експресію нестину можна визначити в пухлинних клітинах різних видів первинних пухлин ЦНС, які мають нейроектодермальне походження, але не в клітинах метастазуючої карциноми (Оапівігапа еї а!., 1992; Топуата еї аї., 1992). Нестин практично не експресується в дифузних астроцитомах, варіабельно експресується в анапластичних астроцитомах та значною мірою і нерегулярно експресується в гліобластомах, де його розповсюдження варіюється комплементарно з СЕБАР та Віментином (ЗспШег еї аї.,, 2006). Клінічно, нестиннегативні герміноми ЦНС не демонструють розповсюдження, в той час як усі пухлини, що демонстрували розповсюдження, також значною мірою експресували білок нестин (ЗакКигада еї аї., 2007).

Пухлинні клітини, що значною мірою експресують нестин, часто розташовані близько до кровоносних судин (Бапйівігапа еї аї., 1992), (Кигіпага єї аї., 2000; Зидаучага еї аї., 2002; Ріогепе5 еї а!І., 1994; ЗігоЇпік єї аї., 2007); була висловлена думка, що експресія нестину активованим ендотелієм є маркером ангіогенезу (Тегапівпі еї а!., 2007; Мадегпа еї аї., 2007; Атонй еї аї., 2005;

МокКгуУ еї а!., 2004).

СВМ вміщує трансформовані прекурсори, які мають повний комплекс функціональних характеристик, що очікуються від стовбурових клітин, включаючи здатність до утворення пухлин. Ці клітини можуть утворювати СВМ навіть після серійної трансплантації, отже, вони можуть бути ідентифіковані як нейральні стовбурові клітини пухлин (саїї еї аї., 2004). Ці клітини належать до субпопуляції СО133-позитивних клітин з пухлин мозку людини і ко-експресують

М5С-маркерний нестин, а не маркери нейральної диференціації (Зіпоп еї аї., 20046р; Зіпоп еї аї., 2003; Зіпойп еї аї., 2004а; Мао еї аїІ., 2007). Наявність СО13З-/нестиня популяції в пухлинах мозку наводить на думку, що нормальна нейральна стовбурова клітина може бути клітиною походження для гліом (Зпігаз еї аіІ., 2007). Оскільки передача сигналів МоїсСпй є активною в пухлині мозку та стовбурових клітинах, було показано, що нестин-промотор активується в культурі завдяки дії Моїсйп (піп апа Ноїїіапа, 2006).

Трансфекція клітинної лінії астроцитоми Сб пацюка подвійною 5ікМА нестину виявила ефективний супресивний вплив 5ікМА нестину на ріст культивованих клітин астроцитоми при дозозалежному методі (Муеї еї а!ї., 2008).

Про експресію нестину також доповідалося стосовно ракових стовбурових клітин у простаті (Си еї аї., 2007; Сірр єї аї., 2007), пухлині підшлункової залози (Сагтіеге еї аі., 2007), а також меланомі (КіІеїп еї аї., 2007). Крім того, нестин експресується в таких пухлинах: СІЗТ (Т5цітига еї а!І., 2001; Запото-Кікаїа еї аї., 2002), меланоми (Ріогепез еї аї., 1994; Вгуспома еї аї., 2007), колоректальні карциноми (Тегапівйі еї аїЇ.,, 2007) і пухлини підшлункової залози (Опіке еї аї., 2007; КІверегодег" єї аї., 2007).

Експресію нестину також можна виявити в різних нормальних тканинах. Була одержана інформація про експресію нестину в подоцитах зрілих клубочків нормальної нирки людини. В нормальних умовах, нестин експресується в кількох типах клубочкових клітин на ранніх етапах розвитку і зводиться до подоцитів у зрілих клубочках (ІзПпігакі еї а!., 2006), і це вказує на велике значення нестину для деяких аспектів функції подоцитів. Клубочки (гломерули) нирок дорослих людей виявляють імунореактивність нестину у віментинекспресуючих клітинах з морфологією подоцитів (Вегіеїїї еї а!., 2007). Можливо, завдяки взаємодії з віментином нестин служить для збільшення механічної міцності подоцитів, котрі піддаються значному стресу натягнення при фільтрації гломерул (Регтгу еї аї., 2007). Отже, в нирці людини нестин експресується з перших

Зо етапів гломерулогенезу в межах подоцитів, мезангіальних та ендотеліальних клітин. Ця експресія згодом зводиться до подоцитів, в зрілих клубочках, та не може бути визначена в інших структурах нирки дорослої людини (5и еї аї., 2007). Імуногістохімічні дослідження виявили постійну експресію нестину в нормальній корі надниркових залоз у людини. Нестинекспресуючі клітини, переважно, розташовані в ретикулярній зоні, в той час як пухлини надниркової залози демонструють варіабельну кількість нестинімунореактивних клітин (Тоїї еї аї., 2005).

Також була одержана інформація про експресію нестину інтерстиціальними клітинами

Кахаля (ІСС) в нормальному шлунково-кишковому тракті. Отже, більшість внутрішньом'язових

ЇСС в антрумі та усі міентеричні ІСС в малому кишечнику є нестинімунореактивними, так як і деякі міентеричні ІСС та більшість ІСС в циркулярних м'язах товстої кишки (Мапдегміпаеп еї аї., 2002). В підшлунковій залозі нестинімунореактивні клітини можна виявити в островках та в екзокринній частині. В області великих панкреатичних проток, нестинпозитивні клітини представляють малі капіляри, розсіяні в з'єднувальній тканині, яка оточує епітелій протоки.

Таким чином, нестин експресується ендотеліальними клітинами судин в підшлунковій залозі людини (Кіевїп еї аї., 2003). В самих островках, можна знайти прогеніторні клітини островків, які експресують нестин. Висловлена гіпотеза про те, що ці нестинпозитивні прогеніторні клітини островків є визначеною популяцією клітин, котрі розташовані в межах панкреатичних островків та можуть брати участь у неогенезі ендокринних клітин островка (7цшіем/у5Кі еї аїЇ., 2001). В нормальній печінці дорослої людини можна виділити популяцію стовбурових клітин печінки, котрі є позитивними на віментин та нестин (Неїтега еї аї., 2006). В дослідженнях культури клітин, аналіз цитоскелета і складу матриксу імуновикрашуванням виявив, що клітини, одержані з кісткового мозку дорослої людини та легенів плоду, експресують білки віментин і нестин в проміжних філаментах (Забвбаїйпі еї аїЇ.,, 2005). В молодих постійних зубах нестин виявлений в функціональних одонтобластах. Його експресія зменшується, і нестин відсутній в старіших постійних зубах, але експресія нестину підвищується в каріозних та пошкоджених зубах (Абоцї еїаї.,2000).

Зрілі стовбурові клітини, що експресують нестин, також можна знайти в перилуменальній ділянці зрілої передньої частки гіпофіза та, з використанням генетично-індукованої карти зачатків, було продемонстровано, що вони служать для генерації субпопуляцій усіх шести термінально диференційованих типів ендокринних клітин гіпофіза. Ці стовбурові клітини, хоча й бо не відіграють значної ролі в органогенезі, зазнають постнатального розмноження і починають продукувати диференційоване потомство, що заселяє орган, який спочатку повністю складався з диференційованих клітин, котрі мають походження з ембріональних прекурсорів (СіІеіреппап еїа!., 2008).

Член 1 групи Е підсімейства 2 нуклеарних рецепторів (МК2Е1)

МА2ЕТ (ТІХ) - це транскрипційний фактор, котрий є важливим для проліферації нейральних стовбурових клітин і самопоновлення шляхом спрямування гістон-деацетилаз (НОАС) на його гени-мішені по низхідній для пригнічення їхньої транскрипції що в свою чергу регулює проліферацію нейральних стовбурових клітин. Рекрутинг НОАС веде до пригнічення транскрипції генів-мішеней ТІ Х, інгібітора циклінзалежних кіназ, р21(СІРІЛЛ/АЕ(раг1), та гена- супресора пухлини, РТЕМ (Зип еї аї., 2007). Підсімейство ТІ Х/НОХ11 різних гомеобоксних генів бере участь у різних аспектах ембріогенезу, та у випадку ТІХ1/НОХІ11 і ТІ ХЗ/НОХ1112 вони чітко визначаються як онкогени в Т-клітинній гострій лімфобластній лейкемії у людини (Оіхоп еї аІ.,, 2007). МК2Е1 лежить в основі фундаментальної програми розвитку ретинальної організації та контролює генерацію належної кількості ретинального потомства і розвитку гліальних клітин в ході тривалого періоду ретиногенезу (Міуаугакі еї а!., 2004). Ніякої конкретної інформації по гліобластомі не було одержано.

Нейрональна молекула клітинної адгезії (МКСАМ)

МАСАМ людини (Молекула клітинної адгезії що належить до нейроглії) надмірно експресується в тканині мультифромної гліобластоми (МТ), в порівнянні з тканиною нормального мозку (МВТ). МЕСАМ описується як однопрохідний трансмембранний білок типу Ї, який взаємодіє з анкірином. Антисенсний ПОМКСАМ призводить до зниження експресії нативного

ПМАКСАМ, змін в морфології клітин, зниженого ступеня проліферації клітин та подовження клітинного циклу. Крім того, надмірна експресія антисенсного НМКСАМ в цих клітинах викликає значне зменшення кількості колоній м'якого агару та інвазії через гель позаклітинного матриксу (ЕСМ) іп міго. Підшкірне введення клітин гліобластоми, надмірно екпресуючих антисенсний

ПМЕСАМ, "голим" мишам призвело до повного інгібування формування пухлини, в порівнянні з вектор-трансфекованими клітинами. Внутрішньопухлинне введення плазміди, експресуючої антисенсний НІМКСАМ, також призвело до повільного росту пухлини у "голих" мишей іп мімо (Зеподаї! єї аїІ.,, 1999). Генноспецифічний аналіз КТ-РСК вказує на те, що ЯАІМКСАМ надмірно

Зо експресується у тканинах пухлин високозлоякісних астроцитом, гліом та гліобластом, в порівнянні з нормальними тканинами мозку (Зеподаї! еї аї.,, 1998). МКСАМ, молекула адгезії клітини з клітиною сімейства молекул адгезії імуноглобуліноподібних клітин, відома завдяки своїй функції в нейрональному розростанні та спрямуванні, нещодавно була ідентифікована як ген-мішень бета-катенінового шляху передачі сигналів в клітинах і тканинах меланоми людини та карциноми товстої кишки. Опосередкована ретровірусами трансдукція МЕСАМ у фібробласти індукує рухливість клітин і пухлиногенез (Сопассі-Зоггеїй еї аї., 2005). Індукція МАКСАМ- транскрипції бета-катеніном чи плакоглобуліном відіграє роль у пухлиногенезі меланоми та раку товстої кишки, ймовірно, шляхом сприяння росту і рухливості клітин (Сопассі-5о!теї! єї а!., 2002).

Крім того, підвищується експресія інших мішеней бета-катенінового шляху - таких як МУС (Гіи еї аі., 2008). МгіСАМ надмірно експресується в папілярних карциномах щитовидної залози у людини на рівнях мРНК та білка, незалежно від ступеня пухлини (Согка еї аї!., 2007).

Надмірна експресія мРНК МАСАМ в пухлинах асоціюється з високими індексами проліферації та зв'язана з поганими результатами у випадку епендимом (7апдеп еї а!., 2007).

Подопланін (РОРМ)

РОРМ - це муциноподібний інтегральний мембранний глікопротеїн типу І з різним ступенем поширення в тканинах людини. Він бере участь у міграції, інвазії, метастазуванні і злоякісній прогресії ракових клітин, а також в агрегації тромбоцитів. СГЕС-2 є першим з ідентифікованих патофізіологічних рецепторів подопланіну (Каїо еї аї., 2008). Було досліджено 115 гліобластом, з використанням методів імуногістохімії, за допомогою анти-РОРМ-антитіла. 47 95 гліобластом експресували РОРМ на поверхневих клітинах, зокрема навколо некротичних ділянок та проліферуючих ендотеліальних клітин. Крім того, експресія МРНК РОРМ та білка була помітно більшою в гліобластомі, ніж в анапластичній астроцитомі, отже, експресія РОРМ може бути асоційована із астроцитарною злоякісністю (Мігйпіта еї а!., 2006). Також була показана експресія

РОРМ в 82.9 95 гліобластом (29/35) в інших аналізах (Зпірбапага еї аї., 2006). В дослідженні клітинних ліній гліобластоми, де вивчалася експресія РОРМ та його функції агрегації тромбоцитів, ЇМ319 значною мірою експресувала РОРМ та індукувала агрегацію тромбоцитів.

М2-1, високореактивне анти-РОРМ-антитіло, нейтралізувало агрегацію тромбоцитів І.М319, і це може означати, що РОРМ є основною причиною агрегації тромбоцитів, що індукується (Каїо еї а!., 2006). Рівні генної експресії РОРМ були значно вищими в гліобластомах, в порівнянні з білою бо речовиною без новоутворень, що було підтверджено імуногістохімічними методами (зогідеїї еї аі., 2008). РОРМ специфічно експресується лімфатичними, а не кровоносними судинними ендотеліальними клітинами в культурі і в пухлиноасоційованому лімфангіогенезі. Хоча РОРМ був переважно відсутній в нормальному епідермісі людини, його експресія значною мірою підвищена в 22 з 28 випадках плоскоклітинного раку, говорячи про можливу роль РОРМ в прогресуванні пухлини (5спаснї еї аІ., 2005). РОРМ має підвищену експресію в інвазивному фронті ряду карцином людини. Дослідження експресії РОРМ в культивованих клітинах пухлини молочної залози людини, в мишачій моделі бета-клітинного онкогенезу підшлункової залози та в біоптатах пухлин людини вказують на те, що РОРМ сприяє інвазії клітин пухлин іп міїго та іп мімо. РОРМ індукує колективну міграцію клітин шляхом формування філоподій при зниженій активності малих СТР-аз сімейства Кпо. Таким чином, РОРМ індукує альтернативний шлях інвазії клітин пухлин за відсутності епітеліально-мезенхімального переходу (УмісКі еї аї., 2006).

Рівень експресії РОРМ був підвищений у більшості пацієнтів з колоректальними пухлинами (Каю єї а!., 2003). ТЕ Е-бета вважається фізіологічним регулятором РОРМ в пухлинних клітинах (Зи2иКі еї аїЇ.,, 2008) РОРМ експресується раковими клітинами, які походять зі стравоходу, легенів, печінки, товстої кишки та молочної залози, а також лімфатичних ендотеліальних клітин (Копо еї а!., 2007).

Тенасцин С (гексабрахіон) (ТМС)

Експресія глікопротеїну ТМС позаклітинного матриксу в гліобластомі, а не в нормальному мозку, та його асоціація з базальними мембранами проліферативного ендотелію гліобластоми ще в 1983 році виявила, що ТМС може бути належним маркером гліом (Воигаоп еї аї., 1983). В ході прогресування пухлини, ЕСМ тканин пухлини ре-моделюється і надає середовище, яке більше сприяє прогресуванню пухлини, і в ньому вирішальним фактором є ангіогенез (Сагпетоїйа еї аїІ.,, 1999). ТМС надмірно експресується в судинах пухлин, які мають високий проліферативний індекс, і це вказує на участь ТМС в ангіогенезі новоутворень (Кіт еї аї., 2000).

В пухлинах, ТМС-експресія може бути індукована гіпоксією (Гаї еї аїЇ.,, 2001). Індукція ТМС опосередкована ТОЕ-реїаІ, що забезпечує механізм інвазії високо-злоякісних гліом в здорову паренхиму (Нац еї аї., 2006). Крім того, надмірна експресія ТМС є наслідком специфічної активації промотора тенасцин-С-гена гастрином, котрий, як відомо, значною мірою модулює міграцію клітин гліобластоми людини (Киспагслак еї аїЇ., 2001). Експресія ТМС знижує

Зо тропоміозин-1ї і таким чином дестабілізує актинові стресові волокна. Він додатково знижує експресію МуУпі інгібітору ОБісккорії. Оскільки знижена експресія тропоміозину-1 та збільшена передача сигналів УУпі тісно зв'язані з трансформацією та пухлиногенезом, ТМС специфічно модулює ці шляхи передачі сигналів для посилення проліферації клітин гліоми (Киї; еї аї., 2004).

Периваскулярне прокрашування ТМС навколо кровоносних судин, які забезпечують пухлину, спостерігається в тканинах ОВМ, але рідше зустрічається в гліомах ступенів ПП ії Ш за класифікацією МОЗ, і це означає, що інтенсивність ТМС-прокрашування залежить від ступеня злоякісності пухлини; найсильніше прокрашування вказує на несприятливий прогноз (Негоїа-

Мепаве еї а!., 2002; 2икКієї! еї аІ., 2006). Найвища ТМС-експресія спостерігається в з'єднувальній тканині, що оточує пухлини (Спідое(ї-Епгізтапп апа ТисКег, 2004). ТМС також сприяє генерації ніші стволових клітин в субвентрикулярній зоні (52), організуючи передачу сигналів фактора росту для прискорення розвитку нервових стволових клітин. ТМС є суттєво важливим для своєчасної експресії ЕСЕК в нейральних стовбурових клітинах і посилює передачу сигналів

ЕСЕ2. Домінуючим ефектом ТМС на клітини в 5М2 є регуляція прогресування розвитку (Сагсіоп еї а!І., 2004). ТМО-найсильніший індуктор спрямованої міграції нервових стволових клітин (МЗС) у людини (гаптотаксис). Отже, пухлиногенерований ЕСМ (позаклітинний матрикс) створює сприятливе оточення для тропізму МЗС в розсіяні пухлинні клітини (7іши еї аї., 2006).

Шлях ТМС також грає важливу роль в рості і метастазуванні пухлин молочної залози. Отже, блокада передачі сигналів чи нокаутування ТМС в клітинах МОА-МВ-435 призводить до значного погіршення міграції клітин та якірно незалежної проліферації клітин. Миші, яким вводилися клональні МОА-МВ-435-клітини з меншою експресією ТМС, демонстрували значно знижений рост первинних пухлин, а також зменшення рецидивів після хірургічного видалення первинної пухлини та зниження утворення метастазів у легенях (Саїмо еї аї., 2008).

Сурвівін (ВІКС5)

Експресія ВІКС5 (сурвівіну), члена сімейства білків-інгібіторів апоптозу (АР), підвищена в фетальних тканинах та в різних видах ракових захворювань людини, з набагато зниженою експресією в нормальних диференційованих тканинах дорослої людини, зокрема, якщо їхній індекс проліферації низький. Передбачається, що сурвівін здатний регулювати клітинну проліферацію та загибель апоптотичних клітин. Хоча сурвівін зазвичай знаходиться на бо цитоплазматичній ділянці клітини і асоціюється з несприятливим прогнозом у випадках раку,

також є інформація про його локалізацію в ядрі, що свідчить про сприятливий прогноз (О'Огізсої! еї аї., 2003). Регуляція за допомогою сурвівіну була описана за кількома механізмами. Сурвівін, ймовірно, асоціюється з молекулярним шапероном Нзрбо. Іп мімо, Нербо у великій кількості експресується в первинних пухлинах у людей, в порівнянні з відповідними нормальними тканинами. Гостре пригнічення НербО малими інтерферуючими РНК дестабілізує мітохондріальний пул сурвівіну, викликає мітохондріальну дисфункцію та активує каспазо- залежний апоптоз (Спо5п еї аї., 2008). Більше того, інгібування Ка призводить до відпускання сурвівінового "гальма" щодо апоптозу і до активації мітохондріального апоптотичного шляху. В гліобластомі, зокрема, стійкість до апоптозу може зникнути під впливом інгібітору Каб, що націлений на сурвівін (Вішт еї аїІ., 2006). Також може існувати взаємозв'язок між підвищеною активністю МЕ-карравВ в гліомах та гіперекспресією сурвівіну, одного з генів-мішеней МЕ-Каррав.

Наприклад, МЕ-КарраВ-активовані анті-апоптотичні гени надмірно експресуються в зразках пухлин. Дуже високі рівні експресії сурвівіну можна визначити, зокрема, в гліобластомі (Ападіїегі еї а!., 2008). Існує думка, що надмірна експресія сурвівіну в гліомах мозку може грати важливу роль в злоякісній проліферації, антиапоптозі та ангіогенезі (2пеп еї а!., 2005; Пи еї аї., 200660).

Були проведені декілька аналізів для вивчення експресії сурвівіну та її впливу на виживаність у випадку гліобластоми. Підводячи підсумок, можна сказати, що експресія сурвівіну, зокрема, одночасна експресія в ядрі та цитоплазмі в астроцитарних пухлинах, значною мірою асоціюється зі ступенем злоякісності (з найбільшою експресією сурвівіну в гліобластомі) та більш короткою загальною виживаністю, в порівнянні з пацієнтами з сурвівін-негативними пухлинами (Каїїмага еї а!., 2003; Зайо еї а!., 2007; Оетаїв5и еї а!., 2005; Меїаї еї аї., 2008; Стгипаа еї а!., 2006; Хіє єї аї!., 2006; Зазакі єї а!., 2002; Спакгамапі єї а!., 2002).

Надмірна експресія сурвівіну також описується для інших пухлинних форм. У випадках раку молочної залози, експресія сурвівіну асоціюється з більш високою злоякісністю та меншим показником безрецидивної виживаності (Уатабвніїа еї а!., 2007; АІ-Чоцаї єї а!., 2007; брап еї аї., 2004). Було показано, що в клітинних лініях пухлин стравоходу активність сурвівіну як промотору в 28,5 разу вища, в порівнянні з нормальними тканинами (зай еї аї., 2006). У випадках колоректального раку, експресія сурвівіну також асоціюється з високим ступенем патології та метастазами у лімфовузли (Тап еї а!., 2005). Показано, що агресивність раку нирки

Зо пов'язана з експресією сурвівіну. До того ж, експресія сурвівіну знаходиться в зворотній залежності від виживаності від онкозахворювань (Козагі еї аї., 2005). Експресію сурвівіну можна виявити в ряді кератиноцитних новоутворень та гіперпроліферативних ушкоджень шкіри, а не в нормальній шкірі (Вожмеп еї аї., 2004). В клітинних лініях раку підшлункової залози підвищений рівень сурвівіну спостерігався в 58 95 з перевірених клітинних ліній (Майіатакі еї аї., 2002).

Експресія сурвівіну у випадках плоскоклітинного раку може допомоги в ідентифікації випадків з більш агресивним та інвазивним клінічним фенотипом (Го еї аї., 2001).

Оскільки сурвівін є багатообіцяючим об'єктом вивчення для лікування раку, дослідження з використанням сурвівін-похідних пептидів показали, що сурвівін є імуногенним у пацієнтів з пухлинами, оскільки викликає реакції, опосередковані СО8-позитивними Т-клітинами. До того ж, сурвівін специфічно стимулював реактивність СБ4-позитивних Т-клітин в лімфоцитах периферичної крові у тих самих пацієнтів (Сазаїі еї а!., 2003; Ріезспе еї аї., 2007).

Сурвівін (ЗММ, ВІКС) надмірно експресується в багатьох формах раку. Отже, в цілому, надмірна експресія сурвівіну може асоціюватись із меншою загальною виживаністю та більш високими ступенями злоякісності.

Цей винахід, крім іншого, належить до конкретних білків-маркерів, котрі можуть бути використані в прогнозах щодо гліобластоми. До того ж, цей винахід належить до використання цих нових цільових препаратів для лікування раку.

Як описано в цьому документі, білюи ЗЕАР, ЕАВР7, ЮОТМА, МК2Е1, 5ІСО1С1, СНІЗІ1,

АСЗВИ1, ІСЕ2ВРЗ, М ЯМАХ, МІ С1, МАСАМ, ВСАМ, ЕСЕВ, РОРМ, МЕЗ та СПР2 демонструють дуже високий рівень надмірної експресії в гліобластомах, в порівнянні з нормальним мозком та іншими життєво важливими органами (наприклад, такими як печінка, нирки, серце). Білки

САРБ5б, С5РОЯ4, МАСАМ, ТМС, ВІСЬ, СІІР2, МЕ5, РОРМ, ЕСЕ, ВСАМ, ОКІА4, як було показано, відіграють важливу роль у пухлиногенезі, оскільки вони беруть участь у злоякісній трансформації, рості, проліферації, ангіогенезі або інвазії клітин в нормальні тканини.

Білки МЕ5, ТМС, ВІКС5, ЕСЕК асоціюються з раковими стовбуровими клітинами або нішами стовбурових клітин в гліобластомі. Ракові стовбурові клітини - це популяція пухлинних клітин з потенціалом самопоновлення, який потрібен для стабільного росту пухлин. Ці клітини розташовані в спеціалізованих та високоорганізованих структурах, так званих нішах ракових стовбурових клітин, які необхідні для підтримання потенціалу самопоновлення ракових стовбурових клітин. Було показано, що надмірна експресія білків ВІЕС5, МАЕСАМ, ІСЕ2ВРЗ в пухлинах асоціюється з прогресуючою хворобою та несприятливим прогнозом для пацієнтів.

Виявилося, що ВСА, СПІР2, ОТМА, МОМАХ, МК2ЕТ, МКСАМ та РОРМ грають важливу роль в ремоделюванні тканин, яке є потрібним для росту пухлин у нервовій системі. Отже, експресія

ВСА, СПІР2, ОТМА, М ОМАХ, МА2Е1, МКСАМ та РОРМ може бути використана як маркер для того, щоб відрізнити гліобластому від інших форм раку.

Отже, цей винахід пропонує методи ідентифікації для тварини і, переважно, людини, що ймовірно хворіє на гліобластому. В одному з втілень визначена ймовірність в діапазоні від 80 до 100 95. Один з таких методів включає визначення рівня принаймні одного з білків ВСА, СПІР,

ОТМА, МОМАХ, МК2Е1, МКСАМ їі РОРМ в зразку пухлини досліджуваної тварини. В одному з втілень зразок був одержаний за допомогою радикального хірургічного втручання. Ще в одному втіленні зразок одержано за допомогою пункційної біопсії.

Коли визначається, що рівень ВСА, СІІР2, ЮТМА, МОМАХ, МК2Е1, МКСАМ або РОРМ в клітинах підвищений на 2095 чи більше, в порівнянні з рівнем, визначеним в нормальних епітеліальних клітинах того ж зразка, досліджувана тварина ідентифікується як така, що ймовірно хворіє на гліобластому.

Чим більше підвищена експресія різних білків групи, що включає ВСА, СПІР2, ОТМА,

МІ ОМАХ, МК2Е1, МАКСАМ та РОРМ, тим вище можливість ідентифікації досліджуваної тварини як такої, що ймовірно хворіє на гліобластому.

В одному з втілень, визначення рівня ВСА, СГПІР2, ЮОТМА, М ОМАХ, МК2Е1, МАСАМ або

РОРМ виконується іп зйи. Ще в одному втіленні визначення рівня ВСА, СГІР2, ОТМА, МІ ОМАХ,

МА2Е1, МКСАМ або РОРМ виконується іп міїго. В одному з інших втілень, визначення рівня ВСА,

СПР2, ОТМА, МЕОМАХ, МК2ЕТ, МКСАМ або РОРМ виконують іп мімо. В переважному втіленні винаходу, визначення рівня ВСА, СІІР2, ОТМА, МІСОМАХ, МК2ЕЇ, МКЕСАМ або РОРМ виконується за допомогою лазерної скануючої мікроскопії разом із Вестерн блот-аналізом.

В конкретному втіленні, рівень ВСА, СГІР2, ЮОТМА, МОМАХ, МК2ЕЇ, МКСАМ або РОРМ визначається за допомогою антитіла, специфічного до ВСА, СІІР2, ЮОТМА, МГОМАХ, МК2ЕТ,

МЕСАМ або РОРМ. В іншому втіленні, рівень ВСА, СПІР2, ОТМА, М ОМАХ, МК2Е1, МКСАМ або

РОРМ визначається за допомогою полімеразної ланцюгової реакції (РСК) з використанням праймеру, специфічного до мРНК, що кодує ВСА, СІІР2, ОТМА, МЕСМАХ, МК2Е1, МКСАМ або

РОРМ. Ще в одному втіленні визначення рівня ВСА, СІ ІР2, ОТМА, МЕОМАХ, МК2Е1, МАСАМ або РОРМ виконується нуклеотидним зондом, специфічним до мРНК, що кодує ВСА, СПІР,

ОТМА, МОМАХ, МК2Е1, МКСАМ або РОРМ. В одному з втілень винаходу рівень ВСА, СІ ІР2,

ОТМА, МЯОМАХ, МК2Е1, МКСАМ або РОРМ визначається за методом Нозерн-блотингу. В іншому втіленні визначення рівня ВСА, СГІР2, ЮТМА, МЛОМАХ, МК2Е1Ї, МКСАМ чи РОРМ досягається шляхом аналізу захисту від рибонуклеаз. В інших втіленнях можуть використовуватись імунологічні тести, такі як ферментний імуносорбентний аналіз (ЕГІ5А), радіоїмунологічний аналіз (КІА) та Вестерн- блот-аналіз, з метою детекції поліпептидів ВСА,

СПІР2, ОТМА, МЕОМАХ, МК2ЕЇ, МКСАМ та РОРМ в зразку рідини тіла (наприклад, крові, сироватки, слини, сечі або перитонеальної рідини). Біоптати, зразки тканин і клітин (взятих, наприклад, з яєчників, лімфовузлів, зскрібки з епітеліальних клітин поверхні яєчників, біоптати легенів, печінки та зразки рідини, що вміщують клітини (наприклад, перитонеальної рідини, слини та плеврального випоту) можуть перевірятися шляхом розділення на частини та/або розчинення зразка клітини чи тканини і проведення його імунологічного дослідження для визначення поліпептидів, наприклад, за методом ЕГІ5А, КІА чи Вестерн-блотингу. Такі зразки клітин або тканин також можуть аналізуватися за методами, що базуються на нуклеїнових кислотах, наприклад, ампліфікації в полімеразній ланцюговій реакції зі зворотною транскрипцією (КТ-РСЕК), Нозерн-гібридизації, або слот- чи дот-блотингу. Для візуалізації розподілу клітин пухлини в межах зразку тканини, можуть застосовуватись діагностичні тести, які зберігають структуру тканини зразку, наприклад, імуногістологічне викрашування, гібридизація РНК іп 5йи чи ЕТ-РСЕ іп 5йи, з метою детекції поліпептиду-маркеру гліобластоми чи мРНК, відповідно. Для локалізації пухлинних мас іп мімо, можуть використовуватись візуалізаційні дослідження, такі як магнітно-резонансна томографія (МКІ), шляхом введення суб'єкту антитіла, яке специфічно зв'язується з поліпептидом ВСА, СІІР2, ЮТМА, МІ ОаМАХ,

МА2Е1, МКСАМ або РОРМ (зокрема, поліпептидом, що знаходиться на клітинній поверхні), коли антитіло кон'юговане або інакше поєднане з парамагнітним засобом відстеження (чи іншим складником, що може бути визначений, в залежності від використаного методу візуалізації); як альтернативний варіант, локалізація не міченого антитіла, специфічного до пухлинного маркера, може визначатись за допомогою вторинного антитіла, з'єднаного зі складником, що 60 піддається визначенню.

Крім того, цей винахід пропонує хімерні/гібридні білки/лептиди, що вміщують поліпептиди

ВСА, СПР2, ОТМА, МЕСОМАХ, МК2Е1, МАЕСАМ та/або РОРМ, а також їхні фрагменти, включаючи функціональні, протеолітичні та антигенні фрагменти.

Гібридний партнер або частини гібридної молекули належним чином надають епітопи, що стимулюють СБ4-позитивні Т-клітини. СЮО4 стимулюючі епітопи добре відомі в цій галузі та включають епітопи, ідентифіковані в анатоксині правця. В іншому переважному втіленні пептид

Є гібридним білком, зокрема, що містить М-термінальні амінокислоти НІ А-ОВ- антигенасоційованого інваріантного ланцюга (Ії. В одному з втілень пептид винаходу є укороченим білком людини чи гібридним білком, або фрагментом білка та іншої поліпептидної частини, за умови, що частина, яка включає білок людини, вміщує одну чи декілька амінокислотних послідовностей винаходу.

Антитіла до поліпептидів ВСА, СГІР2, ЮТМА, МЛОМАХ, МЕ2ЕЇ1, МЕСАМ або РОРМ, до хімерних/гібридних білків, що вміщують поліпептиди ВСА, СІІР2, ЮТМА, МОМАХ, МК2Е1,

МАСАМ або РОРМ, а також до фрагментів поліпептидів ВСА, СГ ІР2, ОТМА, МЕОМАХ, МАК2Е1,

МЕСАМ або РОРМ, включаючи протеолітичні та антигенні фрагменти, і до хімерних/гібридних білків/пептидів, котрі вміщують ці фрагменти, також становлять частину цього винаходу. До того ж, методи використання таких антитіл для прогнозування раку та, зокрема, гліобластоми, є частиною цього винаходу.

Антитіла цього винаходу можуть бути поліклональними антитілами, моноклональними антитілами та/або химерними антитілами. Імморталізовані клітинні лінії що продукують моноклональне антитіло цього винаходу, також є частиною винаходу.

Будь-який спеціаліст, який має певний досвід в цій галузі, зрозуміє, що в деяких випадках підвищена експресія ВСА, СІІР2, ЮТМА, МЕОМАХ, МК2Е1, МЕСАМ або РОРМ як маркерного гена пухлини вказуватиме на гірший прогноз для пацієнта з гліобластомою. Наприклад, відносно вищі рівні експресії ВСА, СГІР2, ОТМА, МЕІОМАХ, МК2Е1, МКСАМ або РОРМ можуть вказувати на достатньо велику первинну пухлину, підвищену пухлинну масу (наприклад, більше метастазів) чи більш злоякісний пухлинний фенотип.

Чим більше відрізняється надмірна експресія різних білків групи, яка вміщує ВСА, СПІР,

ОТМА, М ОМАХ, МК2Е1, МЕСАМ та РОРМ, тим більш несприятливим є прогноз для пацієнта.

Діагностичні та прогностичні методи винаходу включають використання відомих методів, наприклад методів, що базуються на антитілах, для детекції поліпептидів ВСА, СГІР2, ОТМА,

МІЛОМАХ, МК2ЕЇ1, МАСАМ та РОРМ, та методи гібридизації та/або ампліфікації нуклеїнових кислот для визначення мРНК ВСА, СІ ІР2, ОТМА, МЕОСМАХ, МЕ2Е1, МЕСАМ та/або РОРМ.

Крім того, оскільки швидке руйнування клітини пухлини часто призводить до генерації аутоантитіл, маркери пухлини гліобластоми винаходу можуть використовуватись в серологічних пробах (наприклад, дослідження ЕГІ5ЗА сироватки пацієнта) для визначення аутоантитіл проти

ВСА, СІІР2, ОТМА, МІОМАХ, МК2ЕЇ, МКСАМ чи РОРМ у пацієнта. Рівні аутоантитіл, специфічних до поліпептидів ВСА, СІ ІР2, ОТМА, МЕСМАХ, МК2Е1, МКСАМ та РОРМ, принаймні в З рази вищі (та переважно принаймні в 5 чи 7 разів, та найбільш переважно принаймні в 10 чи 20 разів вищі), ніж в контрольному зразку, вказують на гліобластому.

Усі розташовані на клітинній поверхні, внутрішньоклітинні або секретовані поліпептиди ВСА,

СПІР2, ОТМА, МГОМАХ, МК2ЕЇ, МКСАМ та РОРМ можуть використовуватись для аналізу біоптатів, наприклад, зразків тканин чи клітин (включаючи клітини, одержані зі зразків рідини, таких як перитонеальна рідина) для ідентифікації біоптату тканини чи клітини, як такого, що містить клітини гліобластоми. Біоптат може бути проаналізований як цільний зразок тканини або клітини, чи зразок тканини/клітини може розділятися на частини та/або розчинюватися, як потрібно для конкретного діагностичного дослідження. Наприклад, біоптати чи зразки можуть піддаватися загальному аналізу всієї тканини чи нинному чи цільноклітинному аналізу рівнів полепептидів ВСА, СІПІР2, ЮТМА, МОМАХ, МК2ЕЇ, МКСАМ та РОРМ або мРНК іп в5іш, використовуючи, наприклад, методи імуногістохімії, гібридизації мРНК іп зйи або КТ-РСЕ іп зіш.

Досвідчений спеціаліст добре знає, як обробляти тканини чи клітини для аналізу рівнів поліпептидів чи мРНК такими імунологічними методами, як ЕЇЇІ5А, імуноблотинг чи еквівалентними методами, або аналізувати рівні мРНК за допомогою аналітичних методів, що базуються на нуклеїнових кислотах (КТ-РСЕ, Нозерн-гібридизація, слот- або дот-блотинг).

Комплекти для вимірювання рівнів експресії ВСА, СГІР2, ОТМА, МІ ОМАХ, МК2Е1, МКСАМ та

РОРМ

Цей винахід пропонує комплекти для визначення збільшеного рівня експресії ВСА, СПІР,

ОТМА, МОМАХ, МК2ЕЇ, МКСАМ та РОРМ як маркерного гена гліобластоми у пацієнта.

Комплект для визначення маркерного поліпептиду гліобластоми переважно включає антитіло, бо що специфічно зв'язує вибраний поліпептид-маркер гліобластоми. Комплект для детекції маркерної мРНК гліобластоми, переважно, включає одну чи кілька нуклеїнових кислот (наприклад, один чи кілька олігонуклеотидних праймерів чи зондів, ДНК-зондів, РНК-зондів чи шаблонів для генерування РНК-зондів), котрі специфічно гібридизуються з мРНК ВСА, СИР,

ОТМА, МОМАХ, МК2Е1, МАКСАМ та РОРМ.

Зокрема, комплект на основі антитіла може використовуватись для визначення наявності та/або вимірювання рівня поліпептиду ВСА, СГІР2, ЮТМА, МОМАХ, МК2Е1, МЕСАМ та/або

РОРМ, що специфічно зв'язується антитілом чи його імунореактивним фрагментом. Комплект може включати антитіло, що реагує з антигеном, і реактив для визначення реакції антитіла з антигеном. Такий комплект може бути комплектом ЕГІЗА, що включає контрольний елемент (наприклад, вказану кількість конкретного маркерного поліпептиду гліобластоми), первинні та вторинні антитіла, якщо доцільно, та будь-які інші необхідні реактиви, такі як складники, що піддаються визначенню, ферментні субстрати та кольорові реактиви, як описано вище.

Діагностичний комплект, альтернативно, може бути комплектом імуноблотингу, що взагалі включає компоненти і реактиви, викладені у винаході.

Комплект на основі нуклеїнової кислоти може використовуватись для детекції та/або вимірювання рівня експресії ВСА, СГІР2, ОТМА, МЕОМАХ, МК2Е1, МКСАМ та РОРМ шляхом визначення та/або вимірювання кількості мРНК ВСА, СГІР2, ОТМА, МЕСОМАХ, МК2Е1, МЕСАМ та

РОРМ у зразку (біоптаті тканини чи клітини). Наприклад, комплект КТ-РСК для визначення підвищеної експресії ВСА, СГІР2, ЮТМА, МОМАХ, МК2Е1Ї, МКСАМ та РОРМ, переважно, включає олігонуклеотидні праймери, достатні для виконання зворотної транскрипції мРНК- маркера гліобластоми в кКДНК та РСЕК-ампліфікації КДНК-маркера гліобластоми, і переважно, також буде вміщувати контрольні РСК-шаблонні молекули та праймери для належного негативного і позитивного контролю, а також внутрішні контрольні елементи для квантування.

Будь-який спеціаліст, який має досвід в цій галузі, зрозуміє, як обрати належні праймери для виконання реакцій зворотної транскрипції та РСК, і провести належні контрольні реакції.

Відповідні інструкції можна знайти, наприклад, в роботі Р. А!5и!Їбеї еї аї., Сцтепі Ргоїосої5 іп

Моїесшіаг Віоіоду, дхопп Уміеу 5 Зоп5, Мем МогК, М.У., 1997. В даній галузі є різні варіації КТ-РСВ.

Цільова доставка імунотоксинів до ВСА, СГІР2, ОТМА, МЕОМАХ, МК2Е1, МКСАМ та РОРМ може використовуватись як терапевтичні мішені для лікування чи попередження гліобластоми.

Зо Наприклад, молекула антитіла, що специфічно зв'язує розташований на клітинній поверхні поліпептид ВСА, СГІР2, ОТМА, МЕСМАХ, МК2Е1, МАСАМ та РОРМ, може бути кон'югована з радіоїзотопом або іншою токсичною сполукою. Кон'югати антитіла вводяться пацієнту таким чином, щоб зв'язування антитіла з його суміжним поліпептидом гліобластоми призводило до спрямованої доставки терапевтичної сполуки до клітин гліобластоми, таким чином лікуючи рак яєчників.

Терапевтичним складником може бути токсин, радіоізотоп, лікарський препарат, хімічна речовина або білок (див., зокрема, роботу Вега еї аї. "Рпаптпасокіпеїйс5 апа апійитог асіміу ог а рімаіепі аїівигіде-віабіїйгей Гм іттипоїюхіп м/йй ітргомейд апіїдеп Біпаіпд о егтоВ2г" Сапсег ВНев. 59:4018-4022 (1999)). Наприклад, антитіло може бути зв'язане чи кон'юговане з бактеріальним токсином (наприклад, токсином дифтерії, реендотопах - екзотоксином А, токсином холери) чи рослинним токсином (наприклад, рициновим токсином) для спрямованої доставки токсину до клітини, що експресує ВСА, СГІР2, ОТМА, МЕОМАХ, МК2Е1, МКСАМ та РОРМ. Цей імунотоксин може доставлятися до клітини та після зв'язування полі пептиду-маркеру гліобластоми, розташованого на клітинній поверхні, токсин, кон'югований з антитілом, специфічним до маркера гліобластоми, надійде до клітини.

Ще один аспект цього винаходу належить до антитіла, що специфічно зв'язується з класом чи ІП головного комплексу гістосумісності людини (МНС) в комплексі з НІ А-обмеженим антигеном (далі також визначається як "комплекс-специфічне антитіло"). юІнший аспект цього винаходу пропонує метод продукування зазначеного антитіла, що специфічно зв'язується з класом І чи ІЇ головного комплексу гістосумісності людини (МНС) в комплексі з НІ А-обмеженим антигеном, котрий включає: імунізацію клітин нелюдиноподібних ссавців, розроблених шляхом генної інженерії та експресуючих зазначений головний комплекс гістосумісності людини (МНС) класу І чи ІЇ з розчинною формою молекули МНС класу І чи ІІ, в комплексі з зазначеним НГА- обмеженим антигеном; виділення молекул мРНК з клітин, продукуючих антитіло, зазначеного нелюдиноподібного ссавця; створення бібліотеки фагового дисплея, що демонструє кодування молекул білка зазначеними молекулами мРНК; та виділення принаймні одного фага з наведеної вище бібліотеки фагового дисплея, що показує специфічний зв'язок зазначеного антитіла з вказаним класом І чи ІЇ головного комплексу гістосумісності людини (МНС), в комплексі з зазначеним НІ А-обмеженим антигеном. Відповідні методи для продукування таких антитіл і бо одноланцюгові головні комплекси гістосумісності класу І, а також інші засоби для продукування цих антитіл, описані в патентах УМО 03/068201, МО 2004/084798, МО 01/72768, МО 03/070752 та в роботах Сопеп СУ, ОепКрегод ОС, І ем А, Ереї! М, Кейег У. Кесотрбіпапі апііродієх м/п МНО- гевігістед, рерііде-з5ресіїїс, Т-сеї! гесеріог-ЇКе зресіїїсйу: пем/ 10015 10 5щшау апіїдеп ргезепіайоп апа

ТОВ-реріїде-МНС іпіегасіоп5. У Мої Кесодпії. 2003 Зер-Осг16(5):324-32.; ОепКрегу С, І ем А,

Еізепрасі І, Вепгаг І, Вейег У. беїІесіїме їагдейпуд ої теіапота апа АРСз5 ивіпу а гесотбіпапі апіроду м/йй ТОСВ-їїКе 5ресіїйсну дігесієд Юуага а теіапота аіНегепііайоп апіїдеп. / Іттипої. 2003 бер І:171(5):2197-207; та Сопеп СУ, Загід О, Матапо У, Тотага , дасобзоп 5, Кейег У.

ОРігесі рпепоїуріс апаїувів ої питап МНО сіазз І апіїдеп ргезепіайоп: мізцаїїгайноп, доапійайоп, апа іп вйш аєїесіюп ої питап міга! еріорез изіпуд рерііде-5ресіїіс, МНО-гевійстей питап гесотбіпапі апібодіє5. У Іттипої. 2003 Арг 15;170(8):4349-61, всі з яких, для цілей винаходу, включені в нього шляхом прямих посилань в усій повноті.

Бажано, щоб антитіло зв'язувалося з афінністю зв'язування нижче 20 наномоль, переважно нижче 10 наномоль, з комплексом, що розглядається як "специфічний" в контексті цього винаходу.

Термін "антитіло" в цьому винаході використовується в широкому сенсі та включає і поліклональні, і моноклональні антитіла. На додаток до інтактних молекул імуноглобуліну, також до терміну "антитіла" включені фрагменти полімерів цих молекул та гуманізовані версії молекул імуноглобуліну, за умови, що вони проявляють будь-які з потрібних властивостей (наприклад, наявність комплексспецифічного антитіла, як зазначено вище, доставка токсину до ракової клітини, що експресує ген онкомаркеру чи переважно гліобластоми на підвищеному рівні, та/або інгібування активності поліпептиду онкомаркера, такого як сурвівін), що описані в цьому винаході.

До того ж, відносно до будь-якого поліпептиду ВСА, СГІР2, ОТМА, МЕОМАХ, МК2Е1Т, МКСАМ та РОРМ, для якого існує специфічний ліганд (тобто, ліганд, що зв'язує білок, який знаходиться на клітинній поверхні), ліганд може використовуватись замість антитіла для спрямування токсичної сполуки на клітину гліобластоми, як описувалося раніше.

Якщо є така можливість, антитіла винаходу можна одержувати з комерційних джерел.

Антитіла винаходу також можуть генеруватись з використанням добре відомих методів.

Досвідчений спеціаліст зрозуміє, що для генерації антитіл винаходу прийнятним є повномірний

Зо поліпептид маркера гліобластоми чи його фрагменти. Поліпептид, використовуваний для створення антитіла винаходу, може бути частково або повністю очищений з природного джерела, або може вироблятись за допомогою технологій рекомбінантних ДНК. Наприклад,

КДНК, що кодує поліпептид ВСА, СГІР2, ЮТМА, МЕОМАХ, МК2Е1, МКСАМ чи РОРМ або його фрагмент, може екпресуватись в прокаріотичних клітинах (наприклад, в бактеріях) чи еукаріотичних клітинах (наприклад, клітинах дріжджів, комах або ссавців), після чого рекомбінантний білок може очищуватись і використовуватись для генерації препарату моноклонального/поліклонального антитіла, що специфічно зв'язує поліпептид маркера гліобластоми, використаний для створення антитіла.

Будь-якому досвідченому фахівцю відомо, що генерація двох чи більше наборів моноклональних чи поліклональних антитіл максимально збільшує ймовірність одержання антитіла зі специфічністю та афінністю, які потрібні для його цільового використання (наприклад, в аналізі ЕГІ5А, імуногістохімії, візуалізації іп мімо, терапії імунотоксинами). Антитіла перевіряються на предмет бажаних властивостей відомими методами, відповідними до цілі використання антитіл (такими як ЕГІЗА, імуногістохімія, імунотерапія та ін.; подальші рекомендації щодо генерації та випробування антитіл можна знайти, наприклад, в роботі Напом/ апа ІГапе, Апіїрбодієв: А Іарогаїогу Мапиаї, Соїй бргіпуд Натог Іарогаїогу Ргевзв, Соїй 5ргіпд

Нагброг, М.У., 1988). Наприклад, антитіла можуть випробуватись за допомогою аналізу ЕГІ5А,

Вестерн-блотингу, імуно-гістохімічного викрашування зразків гліобластом, зафіксованих у формаліні, або заморожених зрізів тканин. Після початкової характеризації іп міго, антитіла, призначені для терапевтичного використання або для діагностики іп мімо, тестуються відповідно до відомих методів клінічних досліджень.

Термін "моноклональне антитіло" в цьому винаході належить до антитіла, одержаного по суті з однорідної популяції антитіл, тобто, окремі антитіла, що утворюють популяцію, є ідентичними, за винятком можливих природних мутацій, які можуть зустрічатися в невеликих кількостях. Моноклональні антитіла цього винаходу, зокрема, включають "химерні" антитіла, в яких частина важкого та/або легкого ланцюга є ідентичною або гомологічною відповідним послідовностям в антитілах, що одержані з конкретних видів або належать до конкретного класу чи підкласу антитіл, в той час як залишок ланцюга (ланцюгів) є ідентичним чи гомологічним відповідним послідовностям в антитілах, що одержані з інших видів або належать до іншого класу чи підкласу антитіл, а також фрагменти таких антитіл, якщо вони демонструють потрібну антагоністичну активність (Патент США Мо 4,816,567).

Моноклональні антитіла винаходу можуть готуватися з використанням методів гібридом.

При використанні методу гібридоми, миші або іншій прийнятній тварині-хазяїну, як правило, вводиться імунізуюча речовина, щоб виділити лімфоцити, які виробляють чи здатні виробляти антитіла, що будуть специфічно зв'язуватись з імунізуючою речовиною. Альтернативно, лімфоцити можуть імунізуватись іп міїго.

Моноклональні антитіла також можуть створюватись за допомогою методів рекомбінантних

ДНК, таких як описані в Патенті США Мо 4,816,567. ДНК, що кодує моноклональні антитіла винаходу, можна легко виділити і секвентувати загальноприйнятими методами (наприклад, використовуючи олігонуклеотидні зонди, здатні специфічно зв'язуватись з генами, кодуючими важкі та легкі ланцюги мишачих антитіл).

Методи іп міго також прийнятні для приготування моновалентних антитіл. Розщеплення антитіл для продукування їхніх фрагментів, зокрема фрагментів Бар, може здійснюватись з використанням звичайних технологій, відомих в цій галузі, наприклад, за допомогою папаїну.

Приклади папаїнового розщеплення описані в патенті УМО 94/29348, опублікованому 22 грудня 1994 р., та патенті США Мо 4,342,566. При папаіновому розщеплені антитіл зазвичай продукуються два ідентичні антигензв'язувальні фрагменти, що називаються фрагменти Еаб, кожний з яких має окрему антигензв'язувальну ділянку, та залишковий Бе-фрагмент. Обробка пепсином дає фрагмент, який має два антигенз'єднувальні сайти та можливість перехресного зшивання антигенів.

Фрагменти антитіл, незалежно від того, чи прикріплені вони до інших послідовностей, також можуть включати вставки, делеції, заміщення або певні інші модифікації конкретних ділянок чи окремих амінокислот, за умови, що активність фрагмента змінюється або послаблюється незначно, в порівнянні з не модифікованим антитілом чи його фрагментом. Такі модифікації можуть надавати додаткові властивості, наприклад, видаляти/додавати амінокислоти з можливістю дисульфідного зв'язку, підвищувати його біодовговічність, змінювати секреторні характеристики та ін. В будь-якому випадку, фрагмент антитіла повинен мати біоактивну властивість, таку як зв'язувальна активність, регулювання зв'язування на домені зв'язування, та

Зо ін. Функціональні або активні ділянки антитіла можуть бути ідентифіковані за допомогою мутагенезу окремої ділянки білка, з подальшою експресію і тестуванням експресованого поліпептиду. Такі методи доступні досвідченому спеціалісту-практику та можуть включати сайтспецифічний мутагенез нуклеїнової кислоти, що кодує фрагмент антитіла.

Антитіла винаходу можуть включати гуманізовані антитіла або антитіла людини.

Гуманізовані форми антитіл, відмінних від антитіл людини (наприклад, мишачих), - це химерні імуноглобуліни, імуноглобулінові ланцюги чи їхні фрагменти (такі як Ем, Раб, Раб' або інші антигензв'язувальні субпослідовності антитіл), які вміщують мінімальну послідовність, одержану з імуноглобуліну нелюдського походження. Гуманізовані антитіла включають імуноглобуліни людини (антитіло реципієнта), в яких залишки від ділянки, що визначає комплементарність (СОК), у реципієнта замінюються залишками від СОК видів, відмінних від людини (антитіло донора), таких як миша, пацюк чи кролик, що мають бажану специфічність, афінність та потенціал. В деяких випадках, залишки ЕРу-каркаса (ЕК) імуноглобуліну людини замінюються відповідними залишками нелюдського походження. Гуманізовані антитіла також можуть вміщувати залишки, котрих немає ні в антитілі реципієнта, ні в імпортованих СОЕ. або каркасних послідовностях. В цілому, гуманізоване антитіло вміщуватиме, по суті, всі з принаймні одного та, зазвичай, двох варіабельних доменів, в яких всі чи майже всі з СОК-ділянок відповідають ділянкам імуноглобуліну нелюдського походження, та всі чи майже всі з ЕК-ділянок - це ділянки узгодженої послідовності імуноглобуліну людини. Оптимально, гуманізоване антитіло також буде включати принаймні частку константної ділянки (Ес) імуноглобуліну, як правило, з імуноглобуліну людини.

Методи гуманізації антитіл, що одержані не від людини, добре відомі в цій галузі. Як правило, гуманізоване антитіло має один чи більше амінокислотних залишків, які вводяться до нього з джерела, відмінного від організму людини. Ці амінокислотні залишки не людського походження часто називаються "імпортованими" залишками, що, як правило, беруться від "імпортного" варіабельного домену. Гуманізація може, по суті, здійснюватись заміщенням ділянок СОК гризунів, чи СОК-послідовностей, відповідними послідовностями антитіла людини.

Відповідно, такі "гуманізовані" антитіла є химерними антитілами (патент США Мо 4,816,567), де менш ніж інтактний варіабельний домен людини заміщений відповідною послідовністю з видів нелюдського походження. На практиці, гуманізовані антитіла - це типово антитіла людини, в

Зо яких певні СОК-залишки та, можливо, деякі з ЕК-залишків заміщуються залишками з аналогічних сайтів в антитілах гризунів.

Можуть використовуватись трансгенні тварини (наприклад, мишії), які здатні після імунізації продукувати повний набір антитіл людини за відсутності продукування ендогенного імуноглобуліну. Наприклад, було описано, що гомозиготна делеція гена ділянки з'єднання важкого ланцюга антитіл в химерних та зародкових лініях мишей-мутантів призводить до повного інгібування виробництва ендогенних антитіл. Перенос матриці гена імуноглобуліну зародкової лінії людини в зародкову лінію миші-мутанта призведе до продукування антитіл людини, після антигенної стимуляції. Антитіла людини також можуть створюватись в бібліотеках фагового дисплея.

Антитіла винаходу, переважно, вводяться пацієнту в фармацевтично прийнятному носії. Як правило, в формуляції використовується відповідна кількість фармацевтично прийнятної солі, щоб формуляція стала ізотонічною. Приклади фармацевтично прийнятного носія включають сольовий розчин, розчин Рінгера та розчин декстрози. Показник рН розчину, переважно, повинен дорівнювати від приблизно 5 до приблизно 8, та більш переважно - від приблизно 7 до приблизно 7.5. Носіями можуть бути препарати пролонгованої дії, такі як напівпроникні матриці твердих гідрофобних полімерів, які вміщують антитіло, і такі матриці можуть бути формованими виробами, наприклад, плівками, чи ліпосомами або мікрочастинками. Досвідчені фахівці в цій галузі зможуть визначити, які носії більш переважні, в залежності, наприклад, від шляху введення та концентрації антитіла, що вводиться.

Антитіла можуть вводитися суб'єкту, пацієнту або в клітину шляхом (ін'єкції (внутрішньовенної, внутрішньочеревної, підшкірної, внутрішньом'язової), чи іншими методами, такими як інфузія, котрі забезпечують доставку в систему кровообігу в ефективній формі.

Антитіла також можуть вводитись внутрішньо- чи перитуморальним шляхом, для локальної та системної терапевтичної дії. Переважними є локальні чи внутрішньовенні ін'єкції.

Ефективні дози та схеми введення антитіл можуть визначатись емпірично, таке визначення підпадає під сферу компетенції спеціалістів в цій галузі. Досвідчений спеціаліст зрозуміє, що доза антитіл, які повинні вводитись, буде варіюватися в залежності, наприклад, від суб'єкта, що отримує антитіло, шляху введення, конкретного типу антитіла та інших призначених ліків. Див.

Зо роботу Апіїродіе5 іп Нитап Оіадпозіз апа Тпегару, Набег еї аї, ед5. Камеп Рге55, Межм/ Моїк (1977) рр. 365-389. Типова денна доза антитіла, що використовується окремо, може варіюватись від приблизно 1 мкг/кг до 100 мг/кг ваги тіла чи більше, в залежності від факторів, зазначених вище. Після введення антитіла для лікування гліобластоми, ефективність терапевтичного антитіла можна оцінювати різними способами, відомими досвідченому спеціалісту-практику. Наприклад, розмір, показники та/або поширення ракового захворювання у суб'єкта, який проходить лікування, можна контролювати з використанням стандартних методів візуалізації пухлин. Введене в терапевтичних цілях антитіло, що припиняє ріст пухлини, призводить до зморщування пухлини та/або не допускає розвитку нових пухлин, в порівнянні з динамікою захворювання без введення антитіл, є дієвим антитілом для лікування гліобластоми.

Оскільки маркери пухлин гліобластоми ВСА, СІ ІР2, ЮОТМА, МОМАХ, МК2Е1, МЕСАМ та

РОРМ цього винаходу значною мірою експресуються в клітинах гліобластоми та на дуже низьких рівнях в нормальних клітинах, інгібування експресії ВСА, СІПІР2, ЮТМА, МОМАХ,

МА2ЕЇ, МАСАМ або РОРМ чи поліпептидної активності може бути включене в будь-яку стратегію лікування чи попередження гліобластоми.

Принцип антисенс-терапії базується на гіпотезі, що специфічна до послідовності супресія генної експресії (шляхом транскрипції або трансляції може бути досягнена внутрішньоклітинною гібридизацією між геномною ДНК чи мРНК та комплементарними антисенсними видами. Формування такого гібридного нуклеїново-кислотного дуплексу перешкоджає транскрипції антигенкодуючої геномної ДНК пухлини-мішені, або процесингу/транспорту/грансляції та/або стабільності мРНК антигену пухлини-мішені.

Антисенсні нуклеїнові кислоти можуть доставлятися з використанням різних підходів.

Наприклад, антисенсні олігонуклеотиди чи антисенсні РНК можуть вводитися безпосередньо (наприклад, за допомогою внутрішньовенної ін'єкції) суб'єкту в тій формі, що дозволяє їх отримання клітинами пухлини. Як альтернативний варіант, в клітини можуть вводитися іп мімо вірусні чи плазмідні вектори, що кодують антисенсну РНК (чи фрагменти РНК). Антисенсні ефекти також можуть індукуватися сенсними послідовностями; однак, ступінь фенотипових змін значно варіюється. Фенотипові зміни, індуковані ефективною антисенс-терапією, оцінюються відповідно до змін, наприклад, в рівнях мРНК-мішеней, білків-мішеней та/або в рівнях активності білків-мішеней.

В конкретному прикладі, інгібування функції маркера гліобластоми антисенсною генною терапією може досягатися прямим введенням антисенсної РНК-маркера гліобластоми суб'єкту.

Антисенсна РНК-маркера пухлини може продукуватись та виділятись за допомогою будь-якої стандартної методики, але найпростіший спосіб її продукування - це транскрипція іп міго з використанням антисенсної кДНК-маркера пухлини, під контролем високоефективного промотора (наприклад, промотор 17). Введення антисенсної РНК маркера пухлини в клітини може здійснюватись відповідно до будь-якого методу прямого введення нуклеїнової кислоти, що описаний нижче.

Альтернативна стратегія інгібування функції ВСА, СІІР2, ЮОТМА, М ОМАХ, МК2Е1, МКСАМ талабо РОРМ за допомогою генної терапії включає внутрішньоклітинну експресію анти-ВСА,

СПР2, ОТМА, М ОМАХ, МК2ЕЇ, МЕСАМ або РОРМ-антитіла або частини анти-ВСА, СПІР,

ОТМА, МЕОМАХ, МК2Е1, МЕСАМ або РОРМ-антитіла. Наприклад, ген (чи фрагмент гену), що кодує моноклональне антитіло, яке специфічно зв'язується з поліпептидом ВСА, СПІР2, ОТМА,

МІОМАХ, МК2ЕЇ, МКСАМ або РОРМ та інгібує його біологічну активність, розміщується під транскрипційний контроль специфічної (наприклад, тканино- чи пухлино-специфічної) генної регуляторної послідовності, в межах вектора експресії нуклеїнової кислоти. Потім вектор вводиться суб'єкту таким чином, щоб він був прийнятий клітинами гліобластоми чи іншими клітинами, котрі згодом секретують анти-ВСА, СІПІР2, ЮОТМА, МЕСМАХ, МК2Е1, МАСАМ або

РОРМ-антитіло і таким чином блокують біологічну активність поліпептиду ВСА, СГІР2, ОТМА,

МІОСМАХ, МК2ЕЇ, МКСАМ та РОРМ. Переважно, поліпептиди ВСА, СІПІР2, ЮТМА, МІ ОМАХ,

МА2Е1, МАСАМ та РОРМ є присутніми на позаклітинній поверхні клітин гліобластоми.

В методах, описаних вище, які включають введення екзогенної ДНК та її прийняття клітинами суб'єкта (тобто, генна трансдукція або трансфекція), нуклеїнові кислоти можуть бути у формі "оголеної" ДНК чи у векторі для доставки нуклеїнових кислот до клітин для інгібування експресії білка-маркера гліобластоми. Вектор може бути комерційно доступним препаратом, таким як аденовірусний вектор (Очапішт Віоїесппо|одієв5, Іпс. (І амаІ, Квебек, Канада). Доставка нуклеїнової кислоти чи вектора до клітин може здійснюватися різними механізмами. Одним з прикладів є доставка через ліпосому, з використанням наявних у продажу ліпосомних препаратів, таких як ГІРОРЕСТІМ, ГІРОРГЕСТАМІМЕ (СІВСО-25 ВВ, Іпс., Сайпетериго, Ма.),

ЗПИОРЕКЕЕСТ (Оіадеп, Іпс. Хілден, Німеччина) і ТКАМЗЕЕСТАМ (Рготеда Віоїес, Іпс., Медісон,

Вісконсін), а також інших ліпосом, розроблених відповідно до процедур, стандартних для цієї галузі. Крім того, нуклеїнова кислота або вектор цього винаходу можуть доставлятися іп мімо шляхом електропорації, технологію якої можна придбати у фірми Сепеїгопісв5, Іпс. (Сан Дієго,

Каліфорнія), а також з використанням пристрою БОМОРОКАТІОМ (Ітакх РПагтасецшіса! Согр.,

Туксон, Арізона).

Як один з прикладів, векторна доставка може здійснюватися через вірусну систему, таку як ретровірусна векторна система, що може пакувати рекомбінантний ретровірусний геном.

Рекомбінантний ретровірус може потім використовуватись для інфікування і таким чином доставки до інфікованих клітин антисенсної нуклеїнової кислоти, яка інгібує експресію ВСА,

СІПР2, ОТМА, МІОМАХ, МЕ2ЕЇ, МАСАМ або РОРМ. Точний метод введення зміненої нуклеїнової кислоти в клітини ссавців, звичайно, не обмежується використанням ретровірусних векторів. Широко доступними є інші методики для цієї процедури, включаючи використання аденовірусних векторів, аденоасоційованих вірусних (ААМ) векторів, лентивірусних векторів, псевдотипованих ретровірусних векторів. Також можуть бути використані методики фізичної трансдукції, наприклад, ліпосомна доставка, опосередковані рецепторами та інші ендоцитозні механізми. Цей винахід може використовуватись в поєднанні з будь-яким з цих чи інших зазвичай використовуваних методів генного перенесення.

Антитіла також можуть використовуватись для діагностичного аналізу іп мімо. Як правило, антитіло мітиться радіонуклеотидом (таким як "п, У9Тс, С, 11І, ЗН, З2Р або 255), щоб пухлину можна було локалізувати за допомогою імуносцинтиграфії. В одному з втілень винаходу, антитіла чи їхні фрагменти зв'язуються з позаклітинними доменами двох чи більше мішеней

ВСА, СПІР2, ОТМА, МІ ОМАХ, МКЕ2Е1, МЕСАМ і РОРМ, і значення афінності (Ка) є меншим ніж 1 х 10 мкМ.

Антитіла для діагностичних цілей можуть маркуватися барвниками ("зондами"), прийнятними для детекції різними методами візуалізації Методи для визначення таких барвників включають флуоресцентну, оптичну, конфокальну та електронну мікроскопію, магнітно-резонансну томографію та спектроскопію, рентгеноскопію, комп'ютерну томографію і позитронно-емісійну томографію, але не обмежені ними. Прийнятні барвники включають, без обмежень, флуоресцин, родамін, еозин та інші флуорофори, радіоізотопи, золото, гадоліній та 60 інші лантаніди, парамагнітне залізо, фтор-18 та інші позитронно-активні радіонукліди. До того ж,

барвники можуть бути бі- та мультифункціональними, і здатними визначатися більш ніж одним методом з перерахованих нижче. Антитіла можуть прямо чи непрямо маркуватися зазначеними барвниками. Приєднання барвників до антитіл включає ковалентне приєднання, введення в антитіло та ковалентне приєднання хелатної сполуки для зв'язування барвника, що серед багатьох інших добре відоме в цій галузі. Для цілей імуногістохімії зразок ураженої тканини може бути свіжим чи замороженим, чи може бути залитий в парафін або зафіксований в консерванті, такому як формалін. Зафіксований чи залитий таким чином зріз вміщує зразок та контактує з маркованим первинним антитілом та вторинним антитілом, і антитіло використовується для детекції експресії білків ВСА, СГІР2, ОТМА, МІ ОМАХ, МК2Е1, МЕСАМ та

РОРМ іп віш або іп міїго.

Цей винахід ще в одному з переважних втілень пропонує пептид, який вміщує послідовність, вибрану з групи від 5ЕО ІЮ МО: 1 до ЗЕО ІЮ МО: 30 або її варіант, що на 85 95 гомологічний послідовності від ЗЕО ІЮО МО: 1 до 5ЕО ІО МО: 30, або її варіант, котрий індукуватиме перехресне реагування Т-клітин з зазначеним пептидом.

В переважному втіленні пептид вибирається з групи пептидів, яка вміщує послідовність, вибрану з групи ЗЕО ІЮ МО: 1-5Е0 ІЮ МО: 24 чи її варіант, що принаймні на 85 95 гомологічний послідовності від 5хЕО ІО МО: 1 до 5ЕО ІЮ МО: 24 чи її варіант, що індукуватиме перехресне реагування Т-клітин з зазначеним пептидом.

Пептиди винаходу мають здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (МНС) класу І чи ІІ.

Термін "гомологічний" в цьому винаході належить до ступеня ідентичності між послідовностями двох амінокислотних послідовностей, тобто, пептидними або поліпептидними послідовностями. Вищеназвана "гомологія" визначається порівнянням двох послідовностей, доведених в оптимальних умовах до порівнюваних послідовностей. Послідовності, які порівнюються в цьому винаході, можуть мати доповнення чи делецію (наприклад, розрив і т. ін.) в оптимальному ряду двох послідовностей. Гомологія таких послідовностей може бути розрахована шляхом створення порівняльного ряду із використанням, наприклад, алгоритму

СіивіаіМу (Мисієїс Асіа Вев., 22(22): 4673 4680 (1994). Можуть також використовуватись наявні комп'ютерні програми для аналізу послідовностей, зокрема, Месіог МТІ, ЗЕМЕТУХ або засоби

Зо аналізу в загальнодоступних базах даних.

Досвідчений фахівець в цій галузі зможе оцінити, чи здатні Т-клітини, індуковані варіантом конкретного пептиду, перехресно реагувати з самим пептидом (Ропо еї аї., 2001); (Хагетбва еї а!., 1997; Соіотрейі єї а!., 2006; Аррау єї а!., 2006).

Під терміном "варіант" даної амінокислотної послідовності автори винаходу мають на увазі, що бокові ланцюжки, наприклад, одного чи двох амінокислотних залишків змінюються (зокрема, шляхом заміни їх боковим ланцюжком іншого природно існуючого амінокислотного залишку чи якимось іншим боковим ланцюжком) таким чином, що пептид все ще здатний зв'язуватися з молекулою НГА, по суті, в такий же спосіб, як і пептид, що складається з даної амінокислотної послідовності від ЗЕО ІО МО: 1 до 30. Наприклад, пептид може бути модифікований так, що він буде якнайменше зберігати, чи навіть поліпшувати, здатність взаємодіяти та зв'язуватися з порожниною зв'язування прийнятної молекули МНС, такою як НІГА-А"02 або -ОК, та якнайменше зберігати, чи навіть поліпшувати, здатність зв'язуватися з ТСК чи активованим

СТУ. Такі СТІ згодом можуть перехресно реагувати з клітинами та знищувати клітини, котрі експресують поліпептид, що містить природну амінокислотну послідовність спорідненого пептиду, як визначено в аспектах винаходу. Як можна дізнатися з наукової літератури (Каттепзее еї аї., 1997) та баз даних (Каттепзее еї аї., 1999), окремі позиції пептидів, що зв'язуються з НГА, є типово якірними залишками, формуючими ключову послідовність, яка відповідає ділянці зв'язування Ні А-рецептора, котрий визначається полярними, електрофізичними, гідрофобними та просторовими властивостями поліпептидних ланцюгів, утворюючих порожнину зв'язування. Досвідчений фахівець зможе модифікувати амінокислотні послідовності, визначені в 5ЕО ІЮ МО: 1-30, зберігаючи відомі якірні залишки, та зможе визначити, чи мають такі варіанти здатність зв'язувати молекули МНС класу І чи ІІ. Варіанти цього винаходу зберігають здатність зв'язуватися з ТСЕ. чи активованим СТІ, що згодом можуть перехресно реагувати з клітинами та знищувати клітини, котрі експресують поліпептид, що містить природну амінокислотну послідовність спорідненого пептиду, як визначено в аспектах винаходу.

Ті амінокислотні залишки, що не є суттєвими для взаємодії з Т-клітинним рецептором, можуть бути модифіковані шляхом заміни іншою амінокислотою, введення якої не має значного впливу на реактивність Т-клітин та не виключає зв'язування із відповідним МНС. Отже, за 60 винятком зазначеної умови, пептид винаходу може бути будь-яким пептидом (до цього терміну автори винаходу відносять олігопептид чи поліпептид), котрий включає амінокислотні послідовності або їхню частину чи варіант, що надається.

Таблиця 2

Варіанти та мотив (ділянка) пептиду відповідно до 5ЕО ІЮ МО:1-25 11171771 |Позція | 1 234 | 516 | 7 | 8 | 5

С5Р-001 |Кодпепиду.ї | |т7|М|: |А/В/ А 5/|А

ГЕ! Ї71717к 111111 1А|С|Ї1111А ЕЕГ ши и и г Я ПО СО ПО аО ПО ОО НОЯ НОЯ

Т1111є1єЇ | етно 1 1кі РІ мМ! 171717 мі м! |в 171 1 пи и и о о ПЗ По ПО ТО ПО НОЯ НОЯ НОЯ мів 1 171111 11711111 (Позиція | 1 234516 | 7 85

АС5-001 Кодпепиду.4.4.47774:/ /|К| ! | м! Е В|! ОО Е УХ

Тк 11111 1А|Їс|111 А |.

ТР Кк її

Тв | вт тнї 111 1РІ мі! 177171 мі 1 11717717 17 пи и и о я Пс По ПО У По НО НОЯ НОЯ 1 1мМміІ в! її 171711 11117071 (Позиція | 1 2 3| 4 | 516 7 8

ВСА-001 |Кодпептиду.4.4.:4:77/:/ || |с|0|РІ|Р ЕЕ КС 5ЕОІ04 |Варантиї/// | | |м/ | / 7 її її

ТТГ гЕЇ ТТ 11 1111А| СІ 11 11А ЕЕГ ши и и г Я ПО осо ПОЧНИ ПО НО НОЯ НОЯ 11111 тн 1 1кі РІ мМ! 171717 мі м! |в 11 1 пи и и о я ПУ По ПО У По НОЯ НОЯ НОЯ 1 1мМмі в її 171111 11117011 (Позиція | 7 2 3| 4516 7 85

ВСА-002 |Кодпетиду,ї | |А|Ї |М|А|МІ/Р| 5 Е/

ГЕ! Ї7О17717кК 11111 1А|Їа| 1111 АЇ |. ни и и г Я ПО ос ПОСИПАННЯ НОЯ

Т11є1єЇ | етно 1 1кі РІ мМ! 171717 мі м! |в 171 1 пи и и о о ПЗ По ПО ТО ПО НОЯ НОЯ НОЯ 1 1мМмі в її 171111 11117071 (Позиція | 7 2 3| 4516 7 85

СНІЗІ1-010 |Кодпептиду.ї | ||: || а|м/: м ту

ГЕ! ЇО17717к 1 111гАЇ | 1111АЇЕЇ

Таблиця 2

Варіанти та мотив (ділянка) пептиду відповідно до 5ЕО ІЮ МО:1-25 11117771 (Позиція | 1 234 | 516 | 7 | 8 | 5 1111 РІКІ м її

Т11є1єЇ | етно 1 1кі РІ мМ! 171717 мі м! |в 11 1 пи і и о я ПЕ ПНЯ ПО РО ПО НО НОЯ НОЯ мів 1 171111 11711111 (Позиція | 7 2 3| 4516 7 85

СИРО-001 |Кодпептиду.4.44077.:/ |5| || ЕВ М СС

Тк 1111111 1А|СІ| 11 111А ЕЕ 111111 РІКкКІ мМ її

Т1111є1єЇ | етно 1 1кі РІ мМ! 17171 мі м! |в 171 1 пд и и о о Пс По ПО ТО ПО НОЯ НОЯ НОЯ мів 1 171111 11711111 (Позиція | 7 2 3| 4516 7 85 5ІСО1С1-001 Ц|Кодпептиду.40:/ | М| (| 1 | А|Сс/| 1 1 5

ГЕС С17717717к 111111 гА||1 11 1А ЕЕ 111111 РІКкКІ мМ її

Т1111є1єЇ | етно 1 1кі РІ мМ! 17171 мі м! |в 171 1 пи и и п Я ПЗ По ПО ТО ПО НОЯ НОЯ НОЯ мів 1 171111 11711111 (Позція | 7 2 3| 4516 7 85

ОтмА-001 (|Кодпептиду.ї | |К|: |09|0|ЕЇА ХХ ОХ

ГЕС С17717717к 1111111 1А|СІ| 111 11А ЕЕ пи и и г п По о св ПО ПО НОЯ НОЯ НОЯ

Т1111є1єЇ | етно 111 РІ мі 177171 мі м! |в 171 1 пд и и о о Пс По ПО ТО ПО НОЯ НОЯ НОЯ шо і п т я п: ОО По ПО ПО НО НО НОЯ

Таблиця 2

Варіанти та мотив (ділянка) пептиду відповідно до 5ЕО ІЮ МО:1-25 77111171 | Позиця | / 2 3/4 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 16

ЕСЕВ-007 |Кодпепиду..4.00/ | А | А! М | 5 м/о А

Тс Ас 111 1АЇЕЇ тпм РІКкКІ см | 1

Таблиця 2

Варіанти та мотив (ділянка) пептиду відповідно до 5ЕО ІЮ МО:1-25 77111171 | Позиця | / | 2| 34 | 5 | 6 | 7 | 8 | 9 | 10

СТГ! єї ет тніІ її 1111 к РІЇ мМ! 07 1 | Її 111 |мі їм! |в ЇЇ 1 1 1 ни и я п я ПЕ По ПО По НОЯ НОЯ ПОЛЯ КО пд і п ПТ я ПХТ По По По НОЯ НОЯ ОН ПО

Таблиця 2

Варіанти та мотив (ділянка) пептиду відповідно до 5ЕО ІЮ МО:1-25 11711171 | Позиця | 1 2 | 3 | 4 | 5 6 | 7 | 8 5

БАВР7-001 |Кодпептиду.7744:/ |||, с2|0|мМ|М АХ

ЗЕОІЮТо |Вараати | | мі | / | | || с пд и и п Я ПО ПНЯ ПО ПО КОХ НОЯ ПО гг ЕЇ ЇЇ 17 кг 111 гАЇ | 117 1А ЕЇ 111 РІ кс! 1111 1 1 тін 11 к РІ мМ! Її 1 1 мі мі 1 еЕЇ |! 71 1 ни и и о я ПС Я ПО РО По ПО НОЯ НОЯ пд и и т я Ос Я ПО ПО КОХ НОЯ НОЯ 11117171 |Позиця./ | 12345167 в

СЕАР-О01 |Кодпептиду./77777/:/ 0 (|М)/ (1 |АО|0| А т

ОРАББб-002 |Кодпептиду.:/ | ЕЕ | |5ЇЕЇРІМ А

ЗЕОІЮТ12 |Вараати | | |/м/і | / гг ЕЇ ЇЇ 17 кг 111111 гА|Їс|1|11|1А ЕЕГ 1111 РІ кс! 111! тін 111 к РІ мМ! Її 1 11 мі м! ЇЇ | 71 11 ни и и о я ПС Я ПО РО По ПО НОЯ НОЯ пд и и т я Ос Я ПО ПО КОХ НОЯ НОЯ 11117171 |Позиця./ | 12345167 в8/|5 2ВІ-001 |Кодпепиду.:.4.40777474:/ /|МмМ)/ 1 | | ЕЇ О| 1 | мМ 51

ЗЕОІЮІ13 |Вараяти | | |/м/і | / пд и и п Я ПО ПНЯ ПО ПО КОХ НОЯ ПО гг ЕЇ ЇЇ 17 кг 111111 гА|Їс|1|11|1А ЕЕГ тпм РІ кс!

Таблиця 2

Варіанти та мотив (ділянка) пептиду відповідно до 5ЕО ІЮ МО:1-25 77777117 | Позиця | 1 2 | 3 | 45 6 | 7 | 8 5 111111 ллє ве! тт н її 11 к РІ мМ! Її 1 1 мі мі 1 еЕЇ |! 71 1 ни и и о я ПС Я ПО РО По ПО НОЯ НОЯ пд и и т я Ос Я ПО ПО КОХ НОЯ НОЯ 11171771 |Позиця./ | 12345167 8/5 0сг2ВРЗ-001 |Кодпептиду.:/ | КІ 1 | ОЇ ЕЕ 1 | | т ох

ЗЕОІ014 |Вараати | | |/м/і | / | | || с пд и и п Я ПО ПОЯ ПО ПО КОХ КОНЯ ПО

МІС-001 |Кодпепиду.4.4.4.47474:/ |5)|/М|М| ЕЕ Ї|ЇМ|1А Сс

ЗЕОІЮ15 |Вараяти | | |/м/і | / | | || с пд и и п Я ПО ПОЯ ПО ПО КОХ НОЯ ПО пд и и п Я По ПНЯ ПО ПО КОХ НОСА ПОЛЯ гл гАЇаК|1|і1 її 1 гл РІ кс! 111111 ллє ве! тт н її 11 к РІ мМ! Її 1 1 мі мі | еЕЇ |! 71 1 ши и и о я ПС Я ПО ПО ПО НОЯ НОЯ пд и и т я Ос Я ПО ПО КОХ НОЯ НОЯ 11117171 |Позиця./ | 12345167 в8/|5 о МЕБ-001 | Кодпептиду../.4.4.ДЇ | с 1 10151401 |А ОХ

ЗЕОІЮ16 |Вараяти | | мі | / | | с пд и и п Я ПО ПНЯ ПО ПО КОХ НОЯ ПО гг ЕЇ 1 1 717к гл гАЇсаК|11|1 11 гл РІ кс! 111111 ллє Етно 111 кі РІ мМ! Її 1 Її мі мі 1 еЕЇ |! 1 1 ши и и о я ПС Я ПО РО ПО ПО НОЯ НОЯ пд і и т я Ос Я ПО ПО КОХ НОЯ НОЯ 11171771 |(Поиця.їЇ | 12345167 в8/|5

МЕ5-002 |Кодпеппиду |: |5/ 09 ЕЕ Ї|М|: | Е 5

ЗЕОІ0Ю17 |Вараати | | |/м/і | /

Кк 111111 гА|сІ|1|11|1А ЕЕГ гл м РІкІ мМ її 111111 ллє етно 11 к РІ ЇЇ 1 1771771 мі мі 1 еЕЇ |! 1 1 ши и и о я ПС Я ПО РО ПО ПО НОЯ НОЯ пд і и т я Ос о Я ПО ПО КОХ НОЯ НОЯ п НнН7ОС 1

Таблиця 2

Варіанти та мотив (ділянка) пептиду відповідно до 5ЕО ІЮ МО:1-25 11717771 | Позиця 11231451 617 8 19 | 10 | 11 | 12

МЕ5-003 |Кодпепиду...00 |! СГ|Е|РЇС|Ї ТЕ М/' ОЇ

НН сєсть7ньутумлЕо 1 ЕЇ ЇЇ 17 1кК 11 11111111 АС 11 1АТЕ Її пд и и т о ПТ По ОО ПО ОО По НОЯ НОЯ НОЯ ПО тні 11111 кІ РІ мі 771 171 мі мі! ЕЕГ 1712 пд і и Пт о о Я ОТ По ПО ПО НОЯ НОЯ НОЯ КН мі ві 1 1711

Таблиця 2

Варіанти та мотив (ділянка) пептиду відповідно до 5ЕО ІЮ МО:1-25 777711171717717171717171717171111 о |(Поиця.ї | 1 (2 |3 | 4 | 567 |8

ЗЕОІ019 (Варанти | | / м! | | Її пд і п п Я ПО ПО ПО КОНЯ ПОЛО КОНЯ ПО

Кк 11111111 1АЦЕЇ 1111-11 РІкКІ хі її 111111! є вт тінНні 1111 к РІ мМ | 1 71 11111 мМі мМ! |в | її 1 ни і и о я ПС Я ОО ПО ПОЛО НОЯ НОЯ пд і и т Я ОО: ОВ ПНЯ ОХ НОЯ ОН КОНЯ НОЯ 11171711 |(Поиця.ї | 1/2 | 3 | 4|5 6785

Міемах-001 Кодпептиду.б/:/ | М с |о0|т| смітті

ЗЕОІЮІ1 0 Варантиї/ | - 'Ї мі | | Її пило і п п Я ПО ПО ПО КОНЯ ПОЛО КОНЯ ПО г гЕЇ ЇЇ 1 717кК 1111111 гА|Їс| 1111 АЇЕЇ ни і и т Я ПО СВ ПО ПООИ ОО НОЯ ОЛЯ 1111111 11 |у тінНні 1111 к РІ мМ | 1 71 11111 мМі мМ! |в | її 1 ни і и о я ПС Я ОО ПО ПОЛО НОЯ НОЯ пд і и т Я ОО: ОВ ПНЯ ОХ НОЯ ОН КОНЯ НОЯ 11717171 |(Поиця.ї | 1/2 | 3 | 4 | 5 6785

ОМА2ЕЇ-001 Кодпептиду.0.:/ | К 1 | 1 | 54 Е І! | ОО А| (Ц

ТР кс, її 111111! єї | вт тіні 11 РІ мМ | 1 1 11111 мМі мМ! |в | її 1 пи і и о я ПС Я ОА РО НОЯ ПОЛО НОЯ НОЯ пд і і т я Ос Я ОХ НОЯ ОЛЯ КОНЯ НОЯ

МАСАМ-001 |Кодпептиду.44.:/ |сС| |Мм|ніні/о|т ЕХ

Таблиця 2

Варіанти та мотив (ділянка) пептиду відповідно до 5ЕО ІЮ МО:1-25 777711... юю |Позиця.Ї | 1 (2314 51617851 8ЗЕОІ021 |Варанти | | |м!/ / ЇЇ є недо я я В ПНЯ ПНЯ НОЯ НОЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ 11111 ЕЇ ЇЇ 17 кі 1111 1г111АГа111Г17АЇЕЇ 11111 Ркх її 111111 г! тм тінії 111, 1РІЇ мМ! Її 7717 111 мі мії 17111 ши я я ПТО я ПЕ Я ПОТОП ПО НОЯ НОЯ недо я я ПО Я ПО ХО НОЯ ООН ПОН КОНЯ НОЯ КОНЯ 11111... юю |Позиця. | 1 2314 51617 851

РОРМ-001 |Кодпептиду..:/ /|т7|: 1 |У/|а 1 1|М с 8ЗЕОІ022 |Варанти | | |м!/ / її Її недо я я В ПНЯ ПНЯ НОЯ НОЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ

ГЕ 1 1 17к 1111111 АЇЇ1 1 ЇЇ 1А ЕЕ 111111 РєІк м 111111 г! тм тінії 11, гРІЇ мМ! Її 7717 1111 мі мі єї! ЇЇ 1717 ши я я ПТО я ПЕ Я ПОТОП ПО НОЯ НОЯ недо я я ПО Я ПО ХО НОЯ ООН ПОН КОНЯ НОЯ КОНЯ 77111111... юю |Позиця.Ї | 12/34 51617 851

ТМо-001 |Кодпептиду.0777.:/ | А|М/| ТО | А СХ 8ЗЕОІр23 |Варанти | | | / / її 1 гг 11111 ЕЇ ЇЇ 17 кі 1111111 Ага 11111 1ЕТ 1111 РІКк 111111 г! тм тінії 11,1 1РІЇ мМ! Її 7717 1111 мі мі єї! ЇЇ 1717 ши я я ПТО я ПЕ Я ПОТОП ПО НОЯ НОЯ недо я я ПО Я ПО ХО НОЯ ООН ПОН КОНЯ НОЯ КОНЯ 71711111... ю |Позиця.Ї | 12/31/4516 17 851 лМо-002 |Кодпептиду...:/ |09| | 4|А СІМ Е СА 8ЗЕОІ024 |Варанти | | |м!/ / Її Її недо я я В ПНЯ ПНЯ НОЯ НОЯ КОНЯ КОНЯ КОНЯ НОЯ 11111 ЕЇ ЇЇ 17 кі 1111 1г111АГа111Г17АЇЕЇ 11111 Ркх її 111111 г! тм тінії 11,1 1РІЇ мМ! Її 7717 1111 мі мі єї! ЇЇ 1717 ши я я ПТО я ПЕ Я ПОТОП ПО НОЯ НОЯ недо я я ПО По По З ТО По ПО НОЯ ПО НО НОЯ

Крім того, відомо, стосовно МНСОС-презентуючих пептидів (класу Ії) відомо, що ці пептиди складаються з "ключової послідовності", яка має амінокислотну послідовність, яка відповідає певному НІ А-алель-специфічному фрагменту, та, додатково, М- та/або С-термінальні подовження, які не втручаються у функцію ключової послідовності (тобто, вважаються нерелевантними до взаємодії пептиду та усіх клонів або субпопуляції клонів Т-клітин, які розпізнають природну копію). М- та/або С-термінальні подовження можуть мати довжину,

наприклад, від 1 до 10 амінокислот, відповідно. Ці пептиди можуть використовуватись безпосередньо для завантаження МНС-молекул класу ІЇ, або послідовність може клонуватись у вектори, згідно із наведеним нижче описом. Оскільки ці пептиди формують кінцевий продукт обробки більш крупних пептидів в межах клітини, також можуть використовуватися довші пептиди. Пептиди винаходу можуть мати будь-який розмір, але, як правило, вони можуть бути меншими, ніж 100 000, за молекулярною вагою, переважно, меншими ніж 50 000, ще більш переважно меншими, ніж 10 000 та, зазвичай, приблизно дорівнюючими 5 000. Стосовно кількості амінокислотних залишків, пептиди винаходу можуть мати менше 1000 залишків, переважно менше ніж 500 залишків, ще більш переважно - менше 100 залишків та найбільш переважно від 30 до 8 залишків. Відповідно, цей винахід також надає пептиди та їхні варіанти, в яких пептид чи варіант має загальну довжину від 8 до 100, переважно, від 8 до 30, та найбільш переважно - від 8 до 16, а саме, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15 чи 16 амінокислот.

Також прийнятними є довші пептиди, і 9-мерні чи 10-мерні пептиди, як описано в наведеній вище Таблиці 2, є переважними для пептидів МНС класу І, в той час як 12-15-мери переважні для пептидів МНС класу ІІ.

Для пептидів, обмежених МНС класу ІїЇ, кілька різних пептидів з однаковою ключовою послідовністю можуть бути представлені в МНС-молекулі. Оскільки взаємодія з розпізнавальною Т-клітиною (хелпером) визначається ключовою послідовністю в 9-11 амінокислот, декілька варіантів довжини можуть розпізнаватись одним і тим самим клоном Т- клітини (хелпера). Отже, можна використовувати кілька різних довжин ключової послідовності зв'язування для прямого завантаження молекул МНС класу ІІ без необхідності подальшого процесінгу та вирівнювання на М- або С-термінальних кінцях.

Відповідно, природно існуючі або штучні варіанти, що індукують перехресне реагування Т- клітин з пептидом винаходу, часто є варіантами з різною довжиною.

Якщо пептид, більший ніж приблизно 12 амінокислотних залишків, використовується безпосередньо для зв'язування з МНО-молекулою класу ІІ, бажано, щоб залишки, розташовані по краях основної ділянки зв'язування НІ А, не мали значного впливу на здатність пептиду специфічно зв'язуватися з порожниною зв'язування МНОС-молекули класу Ії чи презентувати пептид в Т-клітину (хелпер). Однак, як вже зазначалося вище, перевага надається

Зо використанню більш крупних пептидів, особливо, коли вони кодуються полінуклеотидом, оскільки ці більш крупні пептиди можуть розділятися на частини відповідними антигенпрезентуючими клітинами. Але в деяких випадках було показано, що фланкуючі ділянки ключової послідовності можуть впливати на пептид, що зв'язується з МНОС-молекулою класу ІЇ, або на взаємодію димерного МНОС-пептидного комплексу з ТСЕ в обох напрямках, в порівнянні з контрольним пептидом з такою ж ключовою послідовністю. Внутрішньо-молекулярні третинні структури в межах пептиду (наприклад, формація петлі) зазвичай знижують афінності до МНС чи ТОК. Внутрішньомолекулярні взаємозв'язки бокових ділянок з частинами МНС або ТСЕ біля порожнин зв'язування пептиду можуть стабілізувати взаємодію. Ці зміни в афінності можуть значно впливати на потенціал пептиду МНС класу ІІ в індукуванні реакцій Т-клітин (хелперів).

Також можливо, щоб епітопи МНС класу І хоча вони мають, зазвичай, довжину 8-10 амінокислот, утворювались шляхом процесингу пептидів з більш довгих пептидів чи білків, які включають фактичний епітоп. Бажано, щоб залишки, розташовані по краях фактичного епітопу, не мали значного впливу на протеолітичний розпад, необхідний для експозиції фактичного епітопу в ході процесингу.

Отже, переважними є пептиди з ключовою послідовністю, вибраною з групи, яка складається з БЕО ІЮО Мо 1-56 ІЮО Мо 30 з подовженнями від 1 до 10 амінокислот на С-кінці та/або М-кінці, більш переважною є загальна довжина цих бокових амінокислот від 1 до 12, більш переважною - від 1 до 10, більш переважною - від 1 до 8, більш переважною від 1 до 6, більш переважною від 1 до 4 та навіть ще більш переважною - від 1 до 2, де бокові амінокислоти можуть розподілятися в будь-якому співвідношенні до С-кінця та М-кінця (наприклад, усі бокові амінокислоти можуть додаватися до одного кінця, чи амінокислоти можуть додаватися в рівних кількостях до обох кінців, чи в будь-якому іншому співвідношенні), за умови, що пептид зберігає здатність зв'язуватися з молекулою НІ А в такий же спосіб, як і зазначений пептид, відповідно до будь-якої з послідовностей від 5ЕО ІЮО Мо 1 до 5ЕО ІО Мо 30.

Фланкуючі амінокислоти також можуть зменшувати швидкість пептидної деструкції іп мімо, отже, кількість фактичного пептиду, доступного для СТІ, є вищою, в порівнянні з пептидом без бокових амінокислот, і таким чином вони діють як передліки.

Відповідно, цей винахід також надає пептиди та варіанти епітопів МНС класу І, в яких пептид чи варіант має загальну довжину від 8 до 100, переважно від 8 до 30 та найбільш переважно від 60 8 до 16, а саме 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 амінокислот.

Звичайно, пептид чи варіант, відповідно до цього винаходу, матимуть здатність зв'язуватися з молекулою головного комплексу гістосумісності людини (МНС) класу І чи ІІ. Зв'язування пептиду чи варіанта з МНО-комплексом може бути перевірене за допомогою методів, добре відомих в цій галузі, наприклад, описаних в довідковій літературі для різних алелей МНС класу

ІЇ (наприклад, в роботах (моді еї а!., 1994; Маїснегек еї аї., 1994; Мапісі єї аї!., 1999; Наттег єї а!., 1995; ТотрКіпз еї а!., 1993; Воуїюп еї а!., 1998)).

В особливо переважному втіленні винаходу пептид складається чи по суті складається з амінокислотної послідовності відповідно до послідовності від 5ЕО ІЮ МО: 1-560 10 МО: 30.

Вираз "по суті, складається" означає, що пептид, згідно із цим винаходом, на додаток до будь-якої послідовності за номерами від 5ЕО ІЮ МО: 1 до 5ЕО ІО МО: 30, чи її варіанта, вміщує додаткові М- та/або С-термінальні ділянки амінокислот, які не обов'язково формують частину пептиду, що функціонує як епітоп для епітопу МНСОС-молекул.

Однак, ці ділянки можуть бути важливими для забезпечення ефективного введення пептиду, відповідно до цього винаходу, в клітини. В одному з втілень цього винаходу, пептид цього винаходу є гібридним білком, який вміщує, наприклад, 80 М-термінальних амінокислот НІГ А-ОВ- антигенасоційованого інваріантного ланцюгу (р33, надалі "Ії", одержаного з МСВІ, інвентарний номер в генному банку (СсСепВапк) Х00497 (5ігибіп, М. єї а! 1984).

Крім того, пептид чи варіант може бути додатково модифікований для поліпшення його стабільності та/або зв'язку із молекулами МНС, щоб викликати сильнішу імунну реакцію. Методи для такої оптимізації пептидної послідовності добре відомі в цій галузі та включають, наприклад, введення реверсованих пептидних зв'язків чи непептидних зв'язків.

В реверсованому пептидному зв'язку амінокислотні залишки не з'єднуються пептидними зв'язками (-СО-МН-), а пептидний зв'язок реверсується. Такі ретроінверсивні пептидні міметики можуть вироблятися за методами, відомими в даній галузі, наприклад, описаними в роботі

Мелієгте єї а! (1997) У. Іттипої. 159, 3230-3237, яка включена в даний документ шляхом посилання. Такий підхід включає формування псевдопептидів, які вміщують зміни із залученням основи, а не орієнтації бокових ланцюгів. Автори Мелієге еї а! (1997) показують, що для реакцій клітин МНС і Т-клітин-хелперів зазначені псевдопептиди є прийнятними. Ретроінверсивні пептиди, які вміщують зв'язки МН-СО замість пептидних зв'язків СО-МН, набагато більш стійкі до

Зо протеолізу.

Непептидний зв'язок - це, наприклад, -СН2-МН, -СНег5-, -СНаСНе-, -СНе:СН-, -СЄОСН»-, -

СН(ОН)СН»- та -СН25О-. Патент США 4,897,445 пропонує метод твердофазного синтезу непептидних зв'язків (-СНо-МН) в полі пептидних ланцюгах, що включає поліпептиди, синтезовані за допомогою стандартних процедур, та непептидний зв'язок, синтезований шляхом реакції аміноальдегіду та амінокислоти в присутності МасМВН».

Пептиди, що включають послідовності, описані вище, можуть бути синтезовані з додатковими хімічними групами, присутніми на їхніх аміно- та/або карбоксильних кінцях, зокрема, для посилення стабільності, біологічної доступності та/або афінності пептидів.

Наприклад, гідрофобні групи, такі як карбобензоксильні, данзильні чи І-бутилоксикарбонільні групи можуть додаватися до аміно-кінців пептидів. Подібним чином, на аміно-кінцях пептидів може розміщуватись ацетильна група чи 9-фторенілметокси-карбонільна група. До карбоксильних кінців пептидів може бути додана також, наприклад, гідрофобна група, 1- бутилоксикарбонільна чи амідогрупа.

Крім того, пептиди винаходу можуть бути синтезовані для зміни їхньої стеричної конфігурації. Наприклад, може використовуватися ЮО-ізомер одного чи кількох амінокислотних залишків пептиду, а не звичайний І-ізомер. До того ж, принаймні один з амінокислотних залишків пептидів винаходу може замінюватись одним з добре відомих амінокислотних залишків не природного походження. Такі заміни можуть служити для підвищення стабільності, біологічної доступності та/або функції зв'язування пептидів винаходу.

Подібним чином, пептид чи варіант винаходу може модифікуватися хімічно шляхом реакції окремих амінокислот до чи після синтезу пептиду. Приклади таких модифікацій добре відомі в цій галузі та узагальнені, зокрема, в роботі К. І ипабіад, Спетіса! Кеадепіб їог Ргоїеїп

Модіїісайноп, 39 ей. СС Ргезв5, 2005, яка включена в цей документ шляхом посилання. Хімічна модифікація амінокислот включає, без обмежень, модифікацію шляхом ацилювання, амідинування, піридоксилювання лізину, відновлювального алкілування, тринітробензилювання аміногруп 2,4,6-тринітробензол-сульфоновою кислотою (ТМВ5), амідну модифікацію карбоксильних груп та сульфгідрильну модифікацію шляхом окиснення цистеїну надмурашиною кислотою в цистеїнову кислоту, формування похідних ртуті, утворення змішаних дисульфідів з іншими тіольними сполуками, реакцію з імідом малеїнової кислоти, карбоксиметилювання бо йодооцтовою кислотою чи йодоацетамідом та карбамоїлування ціанатом при лужному рнН, хоча способи модифікації не обмежуються наведеними вище. В цьому випадку, досвідчений спеціаліст повинен звернутися до Глави 15 роботи Сшитепі РгоїосоїЇ5 Іп Ргоївеіп Зсіепсе, Еа5.

Соїїдап єї аі. (дойп М/йеу 5 опе МУ 1995-2000), де викладена детальна методика відносно хімічної модифікації білків.

Успішна модифікація РЕС (поліетиленгліколем) терапевтичних білків та пептидів, що часто асоціюється з подовженням напівперіоду циркуляції при перехресному зшиванні білків з глютаральдегідом, поліетиленгліколь-діакрилатом та формальдегідом використовується для приготування гідрогелів. Хімічна модифікація алергенів для імунотерапії часто досягається шляхом карбамоїлування з ціанатом калію.

Пептид чи варіант, в якому пептид модифікується чи включає непептидні зв'язки, є переважним втіленням винаходу. В цілому, пептиди та варіанти (принаймні, ті, що вміщують пептидні зв'язки між амінокислотними залишками) можуть бути синтезовані, наприклад, із використанням Етос-поліамідного способу синтезу пептидів твердої фази, як розкривається в роботі Ги еї а! (1981) та посиланнях на літературні джерела, наведених в ній. Тимчасовий захист М-аміно-групи забезпечується 9-фторенілметилоксикарбонільною (Етос) групою.

Повторне розщеплювання цієї високо-лабільної основної захисної групи виконується із використанням 20 95 піперидину в М, М-діметилформаміді. Функціональність бокових ланцюгів може захищатися у виді їхніх простих бутилових ефірів (у випадку серинового треоніну і тирозину), складних бутилових ефірів (у випадку глутамінової кислоти та аспарагінової кислоти), бутилоксикарбонільних похідних (у випадку лізину та гістидину), тритилового похідного (у випадку цистеїну) та 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонільного похідного (у випадку аргініну). Коли глютамін чи аспарагін є С-термінальними залишками, використовується 4,4'- диметоксибензогідрильна група для захисту функціональних амідних груп бокових ланцюгів. Як твердофазну підкладку використовують полідиметил-акриламідний полімер, що складається з трьох мономерів, диметилакриламіду (основний мономер), бісакрилоїлетилендіаміну (крос- лінкер) та метилового ефіру акрилоїлсаркозину (функціональна речовина). Використовувана речовина пептидно-полімерного зв'язку, що розщеплюється, - це кислотно-лабільна похідна 4- гідроксиметил-феноксіоцтової кислоти. Усі амінокислотні похідні додаються у виді їхніх сформованих симетричних ангідридних похідних, за винятком аспарагіну та глютаміну, що

Зо додаються за допомогою реверсованої процедури зв'язку, де посередником виступає М, М- дициклогексилкарбодіїмід/ 1 гідроксибензотриазол. Контроль усіх реакцій зв'язування та зняття захисту ведеться із використанням нінгідринового, тринітробензол-сульфоново-кислотного чи ізотинового тестів. Після завершення синтезу пептиди звільняються від полімерної підкладки з одночасним видаленням захисних груп бокових ланцюгів шляхом обробки 95 95 трифтороцтовою кислотою, яка вміщує 50905 суміші поглиначів. Поглиначі, які зазвичай використовуються, - це етандитіол, фенол, анізол та вода; точний вибір залежить від амінокислот-складників пептиду, який синтезується. Крім того, можлива комбінація методик твердої фази і рідкої фази для синтезу пептидів (див. наприклад, роботу ВгискКаогег еї аї. 2004 та наведені в цій роботі посилання).

Трифтороцтова кислота видаляється шляхом випарювання у вакуумі, з подальшим розтиранням в порошок з діетиловим ефіром, з одержанням первинного пептиду. Будь-які присутні поглиначі видаляються простою процедурою екстракції, яка після ліофілізації водної фази дає первинний пептид, вільний від поглиначів. Реактиви для пептидного синтезу, взагалі, можна одержати, наприклад, в компанії Саіріоспет-Момабіоснет (ОК) ЦЯ, Мойіпанат МИа7 20),

Кк.

Очищення може виконуватися за допомогою будь-якого одного чи кількох методів, таких як рекристалізація, гель-хроматографія, іонообмінна хроматографія, хроматографія гідрофобної взаємодії та (зазвичай) зворотно-фазна високоефективна рідинна хроматографія із градієнтним розділенням, наприклад ацетонітрил/вода.

Аналіз пептидів може виконуватися за допомогою тонкошарової хроматографії, електрофорезу, зокрема, капілярного електрофорезу, твердофазної екстракції (С9РЕ), зворотно-фазної високоефективної рідинної хроматографії, амінокислотного аналізу після гідролізу кислот та мас-спектрометричного аналізу, аналізу із бомбардуванням прискореними атомами (РАВ), а також мас-спектрометричного аналізу МАСІ та Е5І-О-ТОБЕ.

Ще один аспект винаходу пропонує нуклеїнову кислоту (наприклад, полінуклеотид), що кодує пептид чи варіант пептиду винаходу. Полінуклеотид, наприклад, може бути ДНК, кДНК,

ПНК, СНК, РНК, чи їхньою комбінацією, одно- та/або двонитковою, природними чи стабілізованими формами полінуклеотидів, такими як, наприклад, полінуклеотиди з фосфоротіатним скелетом; він може вміщувати або не вміщувати інтрони, за умови, що бо полінуклеотид кодує пептид. Звичайно, тільки ті пептиди, що вміщують природно існуючі амінокислотні залишки, з'єднані природними пептидними зв'язками, кодуються полінуклеотидом. Інший аспект винаходу пропонує вектор експресії, здатний експресувати поліпептид, відповідно до винаходу.

Були розроблені різноманітні методи для оперативного зв'язку полінуклеотидів, зокрема

ДНК, з векторами, наприклад, за допомогою комплементарних когезійних сайтів термінації.

Наприклад, комплементарні гомополімерні ділянки можуть додаватися до ДНК-сегмента для введення у векторну ДНК. Вектор та ДНК-сегмент потім з'єднуються шляхом водневого зв'язку між комплементарними гомополімерними кінцями для формування рекомбінантних молекул

ДНК.

Синтетичні лінкери, які вміщують один чи кілька рестрикційних сайтів, забезпечують альтернативний метод з'єднання ДНК-сегмента з векторами. Синтетичні лінкери, що вміщують ряд рестрикційних сайтів ендонуклеази, можна придбати в багатьох компаніях, включаючи

Іптетаййопаї Віотесппоіодіез Іпс, Мем/ Намеп, СМ, США.

Бажаним способом модифікації ДНК, що кодує поліпептид винаходу, є використання ланцюгової полімеразної реакції, як розкривається в роботі (ЗаїкКі еї а! (1988)). Цей метод може застосовуватись для введення ДНК у відповідний вектор, наприклад, шляхом створення належних рестрикційних сайтів, чи для модифікації ДНК іншими прийнятними шляхами, які відомі в цій галузі. Якщо використовуються вірусні вектори, переважними є вектори, основані на вірусі віспи чи аденовірусі.

ДНК (або, у випадку ретровірусних векторів, РНК) може потім експресуватися в належному організмі хазяїна для утворення поліпептиду, що становить пептид чи варіант винаходу. Таким чином, ДНК, що кодує пептид або варіант винаходу, може використовуватися за відомими методами, відповідним чином модифікованими згідно із доктринами, вміщеними тут, для створення вектора експресії, який згодом використовується для трансформації відповідної клітини хазяїна з метою експресії та формування поліпептиду винаходу. Такі методики включають ті, що розкриті в патентах США, а саме: патенти Мо 4,440,859, 4,530,901, 4,582,800, 4,677,063, 4,678,751, 4,704,362, 4,710,463, 4,757,006, 4,766,075, та 4,810,648.

ДНК (або, у випадку ретровірусних векторів, РНК), що кодує поліпептид, який є сполукою винаходу, може з'єднуватись з різними іншими ДНК-послідовностями для введення в належний

Зо організм хазяїна. Супутня ДНК буде залежати від характеру хазяїна, способу введення ДНК до хазяїна та від того факту, чи бажане епісомне утримання або інтеграція.

В цілому, ДНК вводиться у вектор експресії, такий як плазміда, в належній орієнтації та з відповідною рамкою зчитування для експресії. При необхідності, ДНК може зв'язуватися з належними нуклеотидними послідовностями транскрипційного і трансляційного регуляторного контролю, що розпізнаються бажаним хазяїном, хоча такі контрольні елементи взагалі є доступними у векторі експресії. Вектор згодом вводиться хазяїну із використанням стандартних методик. В цілому, не всі організми-хазяїни будуть трансформуватися вектором. Таким чином, виникає необхідність обрати трансформовані клітини хазяїна. Одна з методик вибору включає введення у вектор експресії ДНК-послідовності з будь-якими необхідними контрольними елементами, що кодує специфічну рису у трансформованій клітині, наприклад, резистентність до антибіотиків.

Як альтернативний варіант, ген для такої специфічної риси може бути на іншому векторі, котрий використовується для котрансформації бажаної клітини хазяїна.

Клітини хазяїна, трансформовані рекомбінантною ДНК винаходу, потім культивуються протягом достатнього часу в належних умовах, які відомі досвідченим фахівцям, з урахуванням розкритих в цьому документі доктрин, щоб дозволити експресію поліпептиду, котрий згодом може бути виділений.

Існує багато систем експресії, включаючи бактерії (наприклад, Е. соїї та Васіййв5 5!ЦбБЇв), дріжджі (наприклад, засспаготусез сегемізіає), нитковидні грибки (наприклад, Азрегайшв5 зрес.), клітини рослин, тварин і комах. Переважною системою можуть бути клітини ссавців, такі як клітини СНО (яєчнику китайського хом'ячка), котрі можна одержати в АТСС сеї! Віоіоду

СоПесііоп.

Типова векторна плазміда клітин ссавців для конститутивної експресії вміщує СММ або

ЗУ40-промотор, з належним полі-А-кінцем та маркером резистентності, таким як неоміцин.

Одним з прикладів є рем, що є в наявності в компанії Ріагтасіа, Різсаїамж'ау, Нью-Джерсі, США

Прикладом індукованого вектора експресії у ссавців є РМ5О, який також можна придбати в

Рпаптасіа. Прийнятними плазмідними векторами дріжджів є рК5403-406 та рКк5413-416, що, як правило, доступні для придбання в Зігаїадепе Сіопіпд Зубзіет5, Га доПа, Каліфорнія 92037,

США. Плазміди рК5403, рКк5404, рК5405 та рК5406 - це дріжджові інтегровані плазміди (мір), бо що включають специфічні маркери дріжджів НІЗЗ, ТКРІ, ГЕО2 та ОКАЗ. Плазмідами рК5413-

416 є дріжджові центромерні плазміди (Уср5). Вектори на основі промоторів СММ (наприклад, від фірми 5бідта-Аїагісп), забезпечують тимчасову чи стабільну експресію, цитоплазматичну експресію чи секрецію, а також М- чи С-термінальне маркування в різних комбінаціях РІ Ас,

ЗХРГАС;Ь, с-тус або МАТ. Ці гібридні білки дозволяють здійснювати детекцію, очищення та аналіз рекомбінантного білка. Гібриди з подвійним маркуванням забезпечують гнучкість детекції.

Регуляторна ділянка потужного цитомегаловірусу людини (СМУ) керує рівнями конститутивної експресії білків в кількості 1 мг/л в клітинах СО5. Для менш потужних клітинних ліній, рівні білку, як правило, «0,1 мг/л. Наявність сайту початку реплікації 5440 призведе до високих рівнів реплікації ДНК в клітинах СО5, що допускають реплікацію 540. Вектори СММУ, наприклад, можуть вміщувати сайт рРМВІ1 (похідного від РВЕ322) для реплікації в бактеріальних клітинах, ген б-лактамази для селективної резистентності ампіциліну в бактеріях, ПОН полі-А та сайт Я. Вектори, які вміщують послідовність лідируючого препротрипсину (РРТ), можуть спрямовувати секрецію гібридних білків РАС в культурне середовище для очищення з використанням АМТІ-ЕГ АС антитіл, полімерів та планшетів. Інші вектори та системи експресії добре відомі в цій галузі для використання з різними клітинами хазяїна.

Цей винахід також належить до клітини хазяїна, що трансформується полінуклеотидним вектором даного винаходу. Клітина хазяїна може бути прокаріотом чи еукаріотом. Бактеріальні клітини можуть бути переважно прокаріотичними клітинами хазяїна; в деяких обставинах це типові штами Е. соїї, такі як, наприклад, штами ОН5 Е. соїї, які можна придбати в Веїпезаа

Кезеагсі І арогайгієз Іпс., Бетесда, Меріленд, США, та ЕК, доступні для придбання в Атегісап

Туре Сийиге СоПесіоп (АТСС) ої КосКмійє, Меріленд, США (Мо АТСС 31343). Переважні еукаріотичні клітини хазяїна включають клітини дріжджів, комах та ссавців, переважно клітини хребетних, такі як клітини мишей, пацюків, мавп чи фібробластні клітинні лінії та клітинні лінії товстої кишки людини. Дріжджові клітини хазяїна включають УРН499, УРН5БОО та уРН5БО1, що, як правило, є доступними для придбання в 5бігаїадепе Сіопіпд Зузіетв5, Га доа, Каліфорнія 92037, США. Переважні клітини хазяїна у ссавців включають клітини яєчнику китайського хом'ячка (СНО), що можна придбати в АТСС під номером ССІ61, клітини ембріона МІН швейцарської миші МІН/З3Т3, доступні для придбання в АТСС під номером СКІ. 1658, клітини

Ко) СО5-1, виділені з нирок мавпи, що є в наявності для продажу в АТСС під номером СК. 1650, та клітини 293, які представляють клітини нирок ембріона людини. Переважними клітинами комах є клітини 519, в які можуть вводитись вектори експресії бакуловірусу. Огляд щодо вибору належних клітин хазяїна для експресії можна знайти, наприклад, в посібнику Раціїпа ВаїЇразх та

Агдеїйа Гогепсе "Методи рекомбінантної генної експресії в молекулярній біології, огляди та протоколи", Частина 1, друге видання, ІЗВМ 978-1-58829-262-9, та в іншій літературі, відомій досвідченому фахівцю.

Трансформація відповідних клітин хазяїна ДНК-конструкцією цього винаходу виконується за допомогою добре відомих методів, що, як правило, залежать від типу використовуваного вектора. Трансформація прокаріотичних клітин хазяїна описана, наприклад, в роботах Сопеп еї а! (1972) Ргос. Май). Асад. сі. ОБА 69, 2110 та Батргоок еї а! (1989) МоїІесшіаг СіІопіпуд, А

ІГарогаїогу Мапиаї, Со Зргіпд Нагрог Гарогаїогу, Соїй 5ргіпд Нагрог, МУ. Трансформація дріжджових клітин описана в роботі ЗПпегтап еї а! (1986) Мейоз Іп Уеєаві Сепеїіс5, А І арогафгу

Мапиаї, Соїд З5ргіпд Нагбог, ММ. Метод Бегса (Ведд5 (1978) Майте 275, 104-109) також є прийнятним. Стосовно клітин хребетних, реактиви, які використовуються для трансфекції таких клітин, наприклад фосфат кальцію та ОЕАЕ-декстран чи ліпосомні композиції, можна придбати в компаніях бігаїадепе Сіопіпуд бувзіет5, або І їе ТесппоЇодіе5 Іпс., сбайпегеригд, Меріленд 20877, США. Електропорація також прийнятна для трансформації та/або трансфекції клітин і є добре відомим в цій галузі методом трансформації дріжджових клітин, бактеріальних клітин, клітин комах та хребетних.

Успішно трансформовані клітини, тобто, клітини, які вміщують ДНК-конструкцію цього винаходу, можна ідентифікувати за допомогою добре відомих методик, таких як РСЕ (полімеразна ланцюгова реакція). Альтернативно, присутність білку в надосадовій рідині може визначатися із використанням антитіл.

Далі роз'яснюється, що певні клітини хазяїна, згідно із винаходом, можуть застосовуватись у підготовці пептидів винаходу, наприклад, бактеріальні, дріжджові клітини та клітини комах.

Однак, в ряді терапевтичних методів можуть бути застосовними інші клітини хазяїна.

Наприклад, антигенпрезентуючі клітини, такі як дендритні клітини, можуть з успіхом використовуватись для експресування пептидів винаходу, за умови, що ці пептиди можуть надходити у відповідні МНС-молекули. Отже, цей винахід пропонує клітину хазяїна, яка вміщує бо нуклеїнову кислоту або вектор експресії, згідно із винаходом. В переважному втіленні, клітина хазяїна є антигенпрезентуючою клітиною, зокрема, дендритною клітиною або антигенпрезентуючою клітиною. Клітини АРС, в які завантажений рекомбінантний гібридний білок, що вміщує кислотну фосфатазу простати (РАР), зараз вивчаються з метою лікування раку простати (Зіршеисе!-Т) (Зтаї! ЕУ еї а! 2006; Віпі єї а! 2006).

Ще один аспект винаходу пропонує метод створення пептиду чи його варіанта, що полягає в культивуванні клітини хазяїна та виділенні пептиду з клітини хазяїна або з відповідного середовища для культивування.

Ще в одному втіленні, пептид, нуклеїнова кислота чи вектор експресії винаходу використовуються в медицині. Наприклад, пептид чи варіант можуть бути підготовлені для внутрішньовенного (і.м.) введення, підшкірного (5.с.) введення, інтрадермального (і.а.) введення, внутрішньочеревного (і.р.) введення, внутрішньом'язового (і.т.) введення. Переважними способами введення пептиду є 5.с, і.а., і.р., і.п. та і.м. Переважними способами введення ДНК є і.а., ї.т., 5.с, і.р. та ім. Можуть вводитись дози, наприклад, від 50 мкг до 1,5 мг, переважно від 125 мкг до 500 мкг пептиду чи ДНК, та вони будуть залежати від відповідного пептиду чи ДНК.

Дози в цьому діапазоні успішно використовувались в попередніх дослідженнях (Вгип5мід еї аї 2006; єаепйіег єї а! 2007).

Інший аспект цього винаходу включає метод іп міго для виробництва активованих Т-клітин, що передбачає контакт Т-клітин іп міго з антигензавантаженими МНСО-молекулами класу І або ІЇ людини, експресованими на поверхні відповідної антигенпрезентуючої клітини протягом періоду часу, достатнього для активації Т-клітини антигенспецифічним способом, коли антиген являє собою пептид згідно із винаходом. Переважно, з антигенпрезентуючою клітиною використовується достатня кількість антигену.

Коли як антиген використовується епітоп МНС класу ІІ, Т-клітини є СО4-позитивними клітинами-хелперами, переважно Тні-типу. МНО-молекули класу ІЇ можуть експресуватися на поверхні будь-якої прийнятної клітини. Переважно, щоб клітина природно не експресувала

МНеС-молекули класу ІІ (в цьому випадку виконується трансфекція клітини для експресії такої молекули). Альтернативно, якщо клітина природно експресує МНС-молекули класу І, переважно, щоб вона була дефектною в шляхах процесингу чи презентації ангигену. Таким чином, для клітини, що експресує МНОС-молекулу класу ІЇ, можливе завантаження, повністю вибраним пептидним антигеном до активації Т-клітини.

Антигенпрезентуюча клітина (чи клітина-стимулятор), як правило, має на своїй поверхні

МНС-молекули класу ІІ, та вона переважно не здатна, сама по собі, завантажувати зазначену

МНС-молекулу класу ІЇ вибраним антигеном. Як описується більш детально нижче, МНО- молекула класу ІЇ може легко завантажуватись вибраним антигеном іп мйго.

Переважно, клітина ссавців не має пептидного транспортера ТАР, чи має його знижений рівень або зменшену функцію. Відповідні клітини, в яких немає пептидного транспортера ТАР, включають Т2, КЕМА-5 та клітини дрозофіли. ТАР - це Транспортер, асоційований з процесингом антигенів.

Клітинна лінія Т2, яка не здатна завантажувати пептиди людини, є доступною для придбання в Атегісап Туре Сикиге СоїПесііоп, 12301 РакКіам/п Огіме, КосКміе, Меріленд 20852,

США, номер за каталогом СК 1992; лінія клітин дрозофіли, лінія 5сппеїдег 2, доступна для придбання в АТСС, номер за каталогом СКІ 19863; клітинна лінія миші КМА-5 описана авторами Каїте еї а! 1985.

Переважним є те, щоб зазначена клітина хазяїна перед трансфекцією не експресувала, по суті, МНО-молекули класу І. Також бажано, щоб клітина-стимулятор експресувала молекулу, важливу для надання костимуляторного сигналу для Т-клітин, наприклад, будь-яку з В7.1, В7.2,

ІСАМ-1 та ГРА 3. Нуклеїново-кислотні послідовності різних МНОС-молекул класу ІІ, а також костимуляторних молекул, доступні в базах даних СсСепВапк та ЕМВІ..

Подібним чином, у випадку, коли як антиген використовується епітоп МНС класу Ії, Т- клітинами є СО8-позитивні СТІ.

Якщо антигенпрезентуюча клітина трансфекується для експресування такого епітопу, переважно, щоб клітина вміщувала вектор експресії, здатний експресувати пептид, що включає послідовності від «ЕО ІЮ МО: 1 до 5БЕО ІЮО МО: 30 чи варіант амінокислотної послідовності.

Для генерації СТІ. іп міо може використовуватись ряд інших методів. Наприклад, методи, описані в роботах Реорієв5 еї а! (1995) та КамакКкаті еї а! (1992), використовують аутологічні лімфоцити з популяцій пухлинних клітин в генерації СТІ. Ріерап5Кі еї а (1995) описує використання аутологічних лімфоцитів периферичної крові (РІ В) для підготовки СТІ. Робота

ЧУЧосптиз еї а! (1997) стосується продукування аутологічних СТІ. шляхом імпульсного введення пептиду чи поліпептиду до дендритних клітин або інфікування рекомбінантним вірусом. Автори бо роботи Ній ей а! (1995) та Чеготе еї а! (1993) використовують В-клітини у формуванні аутологічних СТІ. Крім того, макрофаги, завантажені пептидом чи поліпептидом імпульсним методом або інфіковані рекомбінантним вірусом, можуть використовуватись для отримання аутологічних СТІ. Автори 5. УМапйег еї ам. 2003 описують примування Т-клітин іп міо, З використанням штучних антигенпрезентуючих клітин (аАРС), котрі є також прийнятним методом для генерації Т-клітин проти вибраного пептиду. В цьому дослідженні аАРС були генеровані приєднанням завчасно сформованих комплексів МНС:пептид до поверхні полістирольних частинок (мікросфер) з використанням біотино-стрептавідинової біохімії. Ця система дозволяє здійснювати точний контроль щільності МНС на а4АРС, що дає змогу селективно викликати високо- чи низькоавідні антигенспецифічні Т-клітинні реакції з високою ефективністю від зразків крові. Крім комплексів МНС:пептид, а4РС повинні включати інші білки з костимуляторною активністю, наприклад, анти-СО28-антитіла, з'єднані з їхньою поверхнею. Крім того, така аАРС- система часто вимагає додання належних розчинних факторів, наприклад, цитокінів, таких як інтерлейкін-12.

Алогенні клітини також можуть використовуватись у підготовці Т-клітин; спосіб детально описаний в патенті М/О 97/26328. Наприклад, на додаток до клітин дрозофіли та клітин 12, можуть застосовуватись інші клітини для представлення антигенів, такі як клітини СНО, клітини комах, інфіковані бакуловірусом, клітини бактерій, дріжджів та клітини-мішені, інфіковані коров'ячою віспою. Крім того, можуть використовуватись віруси рослин (див., наприклад, роботу

Рога еї аї (1994)), в якій описується розробка мозаїчного вірусу вігни як високопродуктивної системи для презентування чужорідних пептидів.

Активовані Т-клітини, коли вони спрямовуються проти пептидів винаходу, є корисними в терапії. Отже, ще один аспект винаходу пропонує активовані Т-клітини, що одержуються за допомогою згаданих вище методів винаходу.

Активовані Т-клітини, продуковані за допомогою наведеного вище методу, будуть селективно розпізнавати клітину, що аберантно експресує поліпептид, який вміщує амінокислотну послідовність від ЗЕО ІЮ МО: 1 до 30.

Переважно, Т-клітина розпізнає клітину шляхом взаємодії через її ТОК з комплексом

НГА/пептид (наприклад, зв'язування). Т-клітини є корисними у методі знищення клітин-мішеней у пацієнта, клітини-мішені якого аберантно експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність винаходу, коли пацієнту вводиться ефективна кількість активованих Т-клітин. Т- клітини, що вводяться пацієнту, можуть бути одержані у пацієнта та активовані, як описано вище (тобто, вони є аутологічними Т-клітинами). Альтернативно, Т-клітини одержуються не від пацієнта, а від іншої людини. Безумовно, переважно, якщо ця людина є здоровою людиною. Під терміном "здорова людина" автори винаходу мають на увазі, що людина взагалі має добре здоров'я, переважно має адекватну імунну систему та, ще більш переважно, не страждає від якогось захворювання, що може бути легко перевірено та виявлено.

Іп мімо, клітинами-мішенями для СО4-позитивних Т-клітин, відповідно до цього винаходу, можуть бути клітини пухлини (котрі іноді експресують МНС сіавх5 ІЇ) та/або стромальні клітини, що оточують пухлину (пухлинні клітини) (котрі іноді також експресують МНС класу ІІ (Оепдієї! еї а!., 2006)).

Т-клітини цього винаходу можуть використовуватися як активні інгредієнти в терапевтичній композиції. Отже, винахід також пропонує метод знищення клітин-мішеней у пацієнта, коли клітини-мішені аберантно експресують поліпептид, що вміщує амінокислотну послідовність винаходу. Метод включає введення пацієнту ефективної кількості Т-клітин, як визначено вище.

Під терміном "аберантно експресовані" автори винаходу мають на увазі, що поліпептид надмірно експресований, в порівнянні з нормальними рівнями експресії, або що ген є мовчазним у тканині, з якої походить пухлина, але він експресується в пухлині. Термін "надмірно експресований" трактується авторами винаходу таким чином: поліпептид присутній на рівні, що принаймні в 1,2 рази перевищує рівень, який спостерігається в нормальній тканині; та переважно, принаймні, в 2 рази та ще більш переважно принаймні в 5 або 10 разів більше рівня, присутнього в нормальній тканині.

Т-клітини можуть одержуватися за методами, відомими в цій галузі, наприклад, такими, як описано вище.

Протоколи для так званого адоптивного переносу Т-клітин добре відомі в цій галузі, та їх можна знайти, наприклад в роботах (Козепрбего еї аї!., 1987; Козепбего еї аї., 1988; Юшаїеу еї аї., 2002; Уее еї аї., 2002; Юшиаіеу еї аї!., 2005); огляд яких зроблений в роботах (Саціпопі еї аї., 2006) та (Могдап еї аї., 2006).

Будь-яка молекула винаходу, тобто, пептид, нуклеїнова кислота, вектор експресії, клітина, активований СТІ, Т-клітинний рецептор чи нуклеїнова кислота, що кодує його, є прийнятними бо для лікування порушень, які характеризуються клітинами, що уникають імунної реакції. Отже,

будь-яка молекула цього винаходу може використовуватись як медикамент чи у виготовленні медикаменту. Молекула може бути використана сама по собі чи комбінована з іншими молекулами винаходу чи відомими молекулами.

Переважним медикаментом є вакцина. Вона може вводитись пацієнту безпосередньо, в уражений орган чи системно і.а., і.т., 5.с, і.р. та і.м., або застосовуватись ех мімо до клітин, виділених у пацієнта чи клітинної лінії людини, котрі згодом вводяться пацієнту, або використовуватись іп міго для вибирання субпопуляції з імунних клітин, які виділяються. у пацієнта і потім знов вводяться йому. Якщо нуклеїнова кислота вводиться у клітини іп міїго, вона може бути корисною для клітин, що трансфекуються, щоб спільно експресувати імунно- стимулюючі цитокіни, наприклад, такі як інтерлейкін-2. Пептид може бути, по суті, чистим, або поєднаним з імуностимулюючим ад'ювантом (див. нижче) чи використовуватись в комбінації з імуностимулюючими цитокінами, або вводитись з належною системою доставки, наприклад, ліпосомами. Пептид також може поєднуватись з належним носієм, таким як гемоціанін лімфи равлика (КІН) або маннан (див. Патент МУО 95/18145 та роботу І опдепесКег еї а! (1993)).

Пептид також може бути міченим, і бути гібридним білком чи гібридною молекулою. Очікується, що пептиди, послідовність яких надається в цьому винаході, стимулюють СО4 або СО8 Т- клітини. Однак, стимуляція СО8 СТІ. більш ефективна у присутності підтримки, яка надається Т- клітинами-хеллерами СО4. Отже, для епітопів МНС Класу ІІ, які стимулюють СО8 СТІ, гібридний партнер або частини гібридної молекули належним чином надають епітопи, що стимулюють СО4-позитивні Т-клітини. СО4- та СО8-стимулюючі епітопи добре відомі в цій галузі та включають епітопи, ідентифіковані в цьому винаході.

В одному з аспектів, вакцина вміщує принаймні один пептид, що має амінокислотну послідовність, зазначену в ЗЕО ІЮ МО:1 або 20, та принаймні один додатковий пептид, переважно від двох до 50, більш переважно від двох до 25, навіть більш переважно від двох до 15 та найбільш переважно два, три, чотири, п'ять, шість, сім, вісім, дев'ять, десять, одинадцять, дванадцять або тринадцять пептидів. Пептиди можуть бути одержані з одного чи кількох специфічних ТАА та можуть зв'язуватись з молекулами МНС класу І та/або класу ІІ.

Полінуклеотид може бути, по суті, чистим, або включеним в належний вектор чи в систему доставки. Нуклетїновою кислотою може бути ДНК, кКДНК, ПНК, СНК, РНК чи їхні комбінації.

Зо Методи розробки та введення такої нуклеїнової кислоти добре відомі в цій галузі. Огляд наведений в роботі, наприклад, Рабсоїю 5. 2006; ап К. 2006, або А Майдамі 2006.

Полінуклеотидні вакцини прості в приготуванні, але спосіб дії цих векторів в індукуванні імунної реакції не є повністю зрозумілим. Прийнятні вектори та системи доставки включають вірусні

ДНК та/або РНК, такі, як системи, що базуються на аденовірусі, вірусі коров'ячої віспи, ретровірусах, вірусі герпесу, аденоасоційованому вірусі чи гібридах, які включають елементи більш, ніж одного вірусу. Невірусні системи доставки включають катіонні ліпіди та катіонні полімери, добре відомі як засоби доставки ДНК. Також може використовуватись фізична доставка, наприклад, за допомогою "генної пушки". Пептид чи пептиди, кодовані нуклеїновою кислотою, можуть бути гібридним білком, наприклад, з епітопом, що стимулює Т-клітини для відповідного протилежного СОК, як зазначено вище.

Медикамент винаходу може включати один чи кілька ад'ювантів. Ад'юванти - це речовини, котрі неспецифічно збільшують чи посилюють імунну реакцію (наприклад, імунні реакції, де посередниками виступають СТІ. і Т-клітини-хелпери (Тн) на антиген, отже, вони вважаються доцільними для медикаменту цього винаходу. Прийнятні ад'юванти включають, без обмежень, 1018 І55, солі алюмінію, Атріїмах, А5 15, БЦЖ, СР-870,893, Сро7909, СуаА, аб ІМ, флагеллін чи ТІЛ5-ліганди, одержані з флагеліну, ліганд, ліганд ЕІТ3, ЗМ-С5Е, ІСЗО, ІСЗ1, Іміквімод (А БАКА), резиміквімод, ІтиРасі ІМРЗ321, Інтерлейкіни, такі як 1-2, 1-13, 1-21, Інтерферон- альфа чи -бета, або його пегіловані похідні, І5 Раїсі, ІЗ5, ІЗСОМАТЕЇХ, імуностимулюючі комплекси ІЗСОМ, Чиміттипе, ГіромМас, МАСР2, МЕ59, монофосфориловий ліпід А, Монтанід

ІМ5 1312, Монтанід ІЗА 206, Монтанід ІЗА 50М, Монтанід ІЗА-51, емульсії типу "вода в маслі" та "масло в воді", ОК-432, ОМ-174, ОМ-197-МР-ЕС, ОМТАК, О5рА, векторну систему Рертеїю, мікрочастинки РІ С та декстрану, резіквімод, ЗК 172, Віросоми та інші вірусоподібні частинки,

МЕ-17О, МЕСЕ ігар, К848, бета-глюкан, РатЗСує5, стимулон 0521 Адийа, який виділяється з сапоніну, мікобактеріальні екстракти та синтетичні імітатори стінок бактеріальних клітин, а також інші патентовані ад'юванти, такі як Кірі'є Оеюх, Опції, чи Зирего5. Переважними є такі ад'юванти, як ад'ювант Фрейнда або СОМ-С5Р. Кілька імунологічних ад'ювантів (наприклад, МЕ59), специфічних для дендритних клітин, та їхнє приготування, були описані раніше (ЮОириї5 М еї аї 1998; АЇїЇбоп 1998). Також можуть застосовуватися цитокіни. Окремі цитокіни були прямо співвіднесені з впливом на міграцію дендритних клітин до лімфоїдних тканин (наприклад, ТМЕ- бо а), прискорюючи перетворення дендритних клітин в ефективні антигенпрезентуючі клітини для

Т-лімфоцитів (наприклад, ЗМ-С5Е, 1-1 та 1-4) (Патент США Мо 5,849,589, окремо включений в цей документ шляхом посилання в усій повноті) та діючи як імуноад'юванти (наприклад, ІІ -12,

І-15, 1-23, 1-7, ІЕМ-альфа, ІЕМ-бета) (Сабгпіомісй еї а! 1996).

Також доповідалося про те, що імуностимулюючі Сро-олігонуклеотиди посилюють ефект ад'ювантів у вакцинному складі. Теоретично, не будучи зв'язаними, Сро олігонуклеотиди діють шляхом активації природної (не здобутої) імунної системи за допомогою ТоїІ-подібних рецепторів (ТІК), переважно ТКУ. Активація ТІКУ, ініційована Сро, посилює антигенспецифічні гуморальні та клітинні реакції на широкий спектр антигенів, включаючи пептидні чи білкові антигени, живі або знищені віруси, вакцини на основі дендритних клітин, аутологічні клітинні вакцини та полісахаридні кон'юЮгати в профілактичних і терапевтичних вакцинах. Більш важливим є те, що ця активація посилює визрівання та диференціацію дендритних клітин, що в результаті збільшує активацію Тні-клітин та генерацію цитотоксичних

Т-лімфоцитів (СТІ), навіть за відсутності допомоги СО4 Т-клітин. Активація Тні, індукована стимуляцією ТІ КУ, зберігається навіть у присутності вакцинних ад'ювантів, таких як солі алюмінію чи неповний ад'ювант Фрейнда (ІРА), котрі зазвичай сприяють активації Тно». Сра- олігонуклеотиди демонструють навіть більшу ад'ювантну активність, коли формулюються або вводяться разом 3 іншими ад'ювантами чи в таких формуляціях, як мікрочастинки, наночастинки, ліпідні емульсії або подібні формуляції, особливо необхідні для індукування сильної реакції, коли антиген відносно слабкий. Вони також прискорюють імунну реакцію та дозволяють зменшити дози антигену приблизно на два порядки, в порівнянні з реакціями антитіл на вакцину в повній дозі без Сро в деяких експериментах (Кгієд еї а! 2006). В Патенті

США Мо 6,406,705 В1 описується комбіноване використання Сро-олігонуклеотидів, ад'ювантів, що не вміщують нуклеїнових кислот, та антигену для індукування антигенспецифічної імунної реакції. Сро ТІ К9-антагоністом є аз'!М (імуномодулятор з подвійно нитчастим контуром) фірми Моіодеп (Берлін, Німеччина), котрий є переважним компонентом фармацевтичної композиції цього винаходу. Також можуть використовуватись інші ТІ К- зв'язувальні молекули, наприклад, ТІ К 7, ТІК 8 та/або ТІ ЕК. 9, зв'язані з РНК.

Інші приклади прийнятних ад'ювантів включають, без обмежень, хімічно модифіковані Сров5 (наприклад, СрЕ, Ідега), аналоги дсеРНК, такі як Роїу(І:С) та Атріїсбеп, бактеріальні ДНК або

РНК, відмінні від Сро, а також невеликі імуноактивні молекули та антитіла, такі як циклофосфамід, сунітиніб (зипійпіб), бевакізумаб, целебрекс (сеІебгех), МСХ-4016, сілденафіл (5ідепаїйй), тадалафіл (адаїагті), варденафіл (магадепаїйй), сорафеніб (5огаїййпір), темозоломід (етолгоотіде), темзиролімус (ептвігоїйтив), Хі -999, СР-547632, пазопаніб (рагорапів), МЕСЕ

Тгар, 202171, А2О2171, анти-СТІ А4 та 5058175, котрі можуть діяти терапевтично та/або як ад'ювант. Кількості та концентрації ад'ювантів та добавок, прийнятих в контексті цього винаходу, можуть бути легко визначені досвідченим спеціалістом без неналежного експериментування. Переважними ад'ювантами є аз ІМ, інтерферон-альфа, -бета, Сре7909,

ІСЗ1, іміквімод, резиміквімод, РеміТег, РНК, тадалафіл, темозоломід та дхиміттипе.

Переважними ад'ювантами є азіІмМ, БЦЖ, ОК432, іміквімод, резиміквімод, ОМСО5Е, інтерферон-альфа, РеміТег та диміттипе або їхні комбінації.

В переважному втіленні фармацевтичної композиції, відповідно до винаходу, ад'ювант вибирається з групи, що складається з факторів стимулювання колоній, таких як Фактор

Стимулювання Колоній Гранулоцитів-макрофагів ((ЗМ-С5Е, сарграмостим), іміквімод, резиквімод та інтерферон-альфа.

В іншому переважному втіленні фармацевтичної композиції, відповідно до винаходу, ад'ювантом є іміквімод або резиміквімод. В навіть ще більш переважному втіленні фармацевтичної композиції, відповідно до винаходу, ад'ювантом є комбінація ЗМ-С5Е та іміквімоду.

Ця композиція використовується для парентерального введення, наприклад, підшкірного, інтрадермального, внутрішньом'язового або перорального введення. Для цього пептиди і додатково інші молекули розчиняються або суспендуються у фармацевтично прийнятному, переважно водному, носії. До того ж, композиція може вміщувати наповнювачі, такі як буферні елементи, зв'язувальні речовини, розпушувачі, розріджувачі, ароматизатори, мастильні речовини та ін. Пептиди також можуть вводитись разом із імуностимулюючими речовинами, наприклад, цитокінами. Вичерпний перелік наповнювачів, які можуть використовуватись у такій композиції, наведений, наприклад, в книзі А. Кірбе, Напаброок ої Рпагтасецшііса! Ехсірієпів, 3. Ей. 2000, Атегісап РПагтасешіса! Авв5осіайоп апа рпаптасешіса! рге55. Композиція може використовуватися для попередження, профілактики та/або терапії аденомних чи ракових захворювань.

Цей винахід пропонує медикамент, котрий є прийнятним для лікування раку, зокрема, гліоми та раку мозку, раку молочної залози, раку простати, раку стравоходу, колоректального раку, раку нирки, раку підшлункової залози, плоскоклітинного раку та кератиноцитних новоутворень шкіри, лейкемії, раку легенів, раку яєчників, а також меланоми.

Цей винахід включає комплект у такому складі: (а) контейнер, який вміщує фармацевтичну композицію, як описано вище, в розчині або в ліофілізованій формі; (Б) додатково, другий контейнер, який вміщує розріджувач або відновлюючий розчин для ліофілізованої формуляції; та (с) додатково, інструкції по (і) використанню розчину або (ії) відновленню та/або використанню ліофілізованої формуляції.

Комплект може, крім того, включати один чи кілька (ії) буферів, (ім) розріджувачів, (м) фільтрів, (мі) голок або (м) шприців. Контейнер, переважно, є пляшкою, пробіркою, шприцом чи тестовою пробіркою; він може бути контейнером багаторазового використання. Фармацевтична композиція є переважно ліофілізованою.

Комплекти цього винаходу, переважно, включають ліофілізовану формуляцію цього винаходу в належному контейнері та інструкції по її відновленню та/або використанню. Належні контейнери включають, наприклад, пляшки, пробірки (наприклад, пробірки з двох частин), шприці (такі як двокамерні шприци) і тестові пробірки. Контейнер може бути виготовлений з різних матеріалів, таких як скло чи пластмаса. Переважно, комплект та/або контейнер вміщує інструкції на контейнер або такі, що належать до нього, із вказівками щодо відновлення та/або використання. Наприклад, на ярлику може вказуватися, що ліофілізована формуляція повинна бути відновлена до концентрацій пептидів, як зазначено вище. Ярлик, крім того, може зазначати, що формуляція є прийнятною або призначена для підшкірного введення.

Контейнер, що містить формуляцію, може бути пробіркою багаторазового використання, котра дозволяє робити повторні введення (наприклад, від 2 до б введень) відновленої формуляції. Комплект, крім того, може включати другий контейнер з прийнятним розріджувачем (наприклад, розчином бікарбонату натрію).

Після змішування розріджувача та ліофілізованої формуляції, остаточна концентрація

Зо пептиду у відновленій формуляції становить, переважно, принаймні 0,15 мг/мл/пептид (75 мкг) та переважно не більше З мг/мг/пептид (51500 мкг). Комплект, крім того, може включати інші матеріали, бажані з комерційної точки зору та із врахуванням використання, включаючи інші буфери, розріджувачі, фільтри, голки, шприци та вкладиші з інструкціями по використанню.

Комплекти цього винаходу можуть включати один контейнер, який вміщує формуляцію фармацевтичних композицій, відповідно до цього винаходу, з іншими компонентами чи без них (наприклад, інші сполуки або фармацевтичні композиції інших сполук) чи включати окремий контейнер для кожного компонента.

Переважно, комплекти винаходу включають формуляцію винаходу, упаковану для використання, в комбінації з одночасним введенням другої сполуки, такої, як ад'юванти (наприклад, СМ-С5Е), хіміотерапевтична речовина, природний продукт, гормон чи антагоніст, антиангіогенезний агент чи інгібітор, апоптозіндукуючий агент або хелатор, чи їхню фармацевтичну композицію. Компоненти комплекту можуть бути завчасно змішані, чи кожний компонент може бути в окремому контейнері, до введення пацієнту. Компоненти комплекту можуть бути надані в одному чи кількох рідких розчинах, переважно, водному розчині, більш переважно, стерильному водному розчині. Компоненти комплекту також можуть надаватись як речовини у твердому стані, які можуть перетворюватися на рідини шляхом додання прийнятних розчинників, котрі переважно вміщені в іншому окремому контейнері.

Контейнер терапевтичного комплекту може являти собою пробірку, тестову пробірку, колбу, пляшку, шприц або будь-який інший засіб для зберігання твердого тіла чи рідини. Зазвичай, коли є більш ніж один компонент, комплект буде включати другу пробірку чи другий контейнер, який дозволяє окреме дозування. Комплект може також вміщувати інший контейнер для фармацевтично прийнятної рідини. Переважно, терапевтичний комплект буде включати апарат (наприклад, одну чи кілька голок, шприців, крапельниць, піпетку та ін.), який робить можливим введення речовин винаходу, що становлять компоненти цього комплекту.

Ця формуляція є прийнятною для введення пептидів будь-яким зручним методом, наприклад, пероральним (ентеральним), назальним, очним, підшкірним, інтрадермальним, внутрішньом'язовим, внутрішньовенним або трансдермальним. Переважно, введення здійснюється 5.сб, та найбільш переважно, і4.-методом. Введення може виконуватись інфузійним насосом.

Оскільки пептиди винаходу, одержані з ВСА, СГІР2, ЮОТМА, МОМАХ, МК2Е1, МАКСАМ та

РОРМ, були виділені з гліобластоми, медикамент винаходу, переважно, використовується для лікування гліобластоми.

Тепер цей винахід буде описуватись на наведених нижче прикладах, котрі розкривають переважні втілення винаходу, однак, не обмежуються цим. З метою цього винаходу, усі довідкові матеріали, згадані тут, включені шляхом посилань в усій повноті.

Фіг. 1: Зразок мас-спектра з ІСЕ2ВРЗ-001, що демонструє його презентування на зразку первинної пухлини (ЗВ60О10. Був виконаний аналіз МапоЕ5І-ЇїСМ5 на пептидному пулі, елюйованому зі зразка ВМ, 586010. Мас-хроматограма для т/72 536.323820.001 Ба, 7-2 показує пікове значення пептиду при часі утримання 49.89 хв. В) Визначений пік у мас- хроматограмі при 48,76 хв. виявив сигнал Іп/; 536.3239 у спектрі М5. С) Мас-спектр індукованого зіткненнями розпаду з вибраного прекурсору т/72 536.3239, зафіксований в експерименті папоЕ5І-ЇСМ5 при даному часі утримання, підтвердив наявність ІЗЕ2ВРЗ-001 в зразку пухлини 586010. Ю) Модель фрагментації синтетичного контрольного пептиду ІЗЕ2ВРЗ- 001 була зареєстрована та порівняна з генерованою природною моделлю фрагментації ТОМАР, показаною в С для верифікації послідовності.

Фіг. 2а показує профілі експресії МРНК вибраних білків в нормальних тканинах та в 19 зразках гліобластом.

Фіг. 265 показує профілі експресії мРНК обраних білків в нормальних тканинах та в 19 зразках гліобластом.

Фіг. З показує зразок імуногенності іп міго ТОМАР класу І ІМА950.

Фіг. 4 показує зразок афінностей зв'язування пептидів НІ А класу І винаходу з А"02.

ЗБЕО ІО Мо5 1-24 показують послідовність переважних пухлиноасоційованих пептидів, відповідно до цього винаходу.

ПРИКЛАДИ

Одержані пептиди ЕТЕЇТІОЕБЕ (НГА-А1; РоїуРеріййде ІаБрогаїогіеєх, Волфенбюттель,

Німеччина), /МІСЕРІКІ (НГА-А2; СіїпаМа, Зіссах, Швейцарія) та ЕРОГАОСЕМ (НІ А-В35;

РоїуРерійае І арогагієеєз) мають фармацевтичну якість.

ПРИКЛАД 1:

Зо Ідентифікація пухлиноасоційованих пептидів, присутніх на поверхні клітин

Зразки тканин

Тканини пухлин і здорові тканини пацієнтів були надані університетом Норйа! Сапіопаї

Опімегейаійе де Сепеме (Медична онкологічна лабораторія по імунології пухлин) та клінікою

Меигоспігигдієспе | Опімегейав-Кіїпік Неїдерегуд (Лабораторія молекулярної біології"). До хірургічного видалення тканин, була одержана письмова інформована згода від усіх пацієнтів.

Тканини були заморожені шоковим способом в рідкому азоті відразу після хірургічної операції та зберігались до виділення ТОМАР при -80 "С.

Виділення НІ А-пептидів із зразків тканин

Пули пептидів НГА з заморожених шоковим способом зразків тканин були одержані імунним осадженням з твердих тканин, відповідно до незначно зміненого протоколу (гаїК, К. еї а! 1991; зЗеедег, Р.Н. еї а. Т 1999) з використанням НІ А-А"02-специфічного антитіла ВВ7.2 або НІ А-А, -

В, -С-специфічного антитіла М/б/32, СМВг-активованої сефарози, кислотної обробки та ультрафільтрації

Методи:

Одержані пули пептидів НІГА розділялися відповідно до їхньої гідрофобності із використанням зворотно-фазної хроматографії (Асдийу ОРІ С 5у«(ет, МУМаїег5), елюйовані пептиди були проаналізовані на гібридному мас-спектрометрі ГТО-Огрйгар (ТпептпоЕЇесігоп) з джерелом ЕбІ. Пептидні пули були завантажені безпосередньо на аналітичну кварцову мікрокапілярну колонку (75 мкм іа. х 250 мм), заповнену 1.7 мкм С18 зворотно-фазного матеріалу (Умаїегв5), із застосуванням швидкості потоку 400 нЛ на хвилину. Згодом пептиди були розділені з використанням двоетапного 180-хвилинного бінарного градієнта з 10 95 до 33 95 В при швидкості потоку 300 нЛ на хвилину. Градієнт був складений з розчинника А (0.1 95 мурашиної кислоті в воді) та розчинника В (0,1 96 мурашиної кислоті в ацетонітрілі). Був використаний скляний капіляр з золотим покриттям (РісоТір, Мем ОбБіесіїме) для введення в мікро-Е5ЗІ джерело. Мас-спектрометр ГТО-Огріїгар працював в режимі, залежному від даних, з використанням стратегії ТОР5. Стисло кажучи, цикл сканування був ініційований з повним скануванням, при високій точності маси, в огрйгар (К-30 000), з наступними сканами М5/М5 також в огрйгар (К-7500) на 5 найбільш поширених прекурсорних іонах з динамічним виключенням раніше обраних іонів. Тандемні мас-спектри були інтерпретовані ЗЕООЕ5Т, з бо додатковим контролем в ручному режимі. Ідентифікована пептидна послідовність була 5О0 підтверджена порівнянням генерованої природної моделі фрагментації ТОМАР з моделлю фрагментації синтетичного контрольного пептиду з з ідентичною послідовністю. На Фіг. 1 показаний зразок спектра, одержаного з тканини пухлин для пептиду ІСЕ2ВРЗ-001, асоційованого з МНС класу І, та його профіль елюювання на системі ОРІ С.

ПРИКЛАД 2

Профілі експресії генів, що кодують пептиди винаходу

Не всі пептиди, ідентифіковані як такі що презентуються на поверхні клітин пухлин молекулами МНС, є прийнятними для імунотерапії, оскільки більшість з цих пептидів отримують з нормальних клітинних білків, експресованих багатьма типами клітин. Лише кілька з цих пептидів є пухлиноасоційованими та, ймовірно, здатні індукувати Т-клітини з високою специфічністю для пухлини, з якої вони походять. Щоб ідентифікувати такі пептиді і звести до мінімуму ризик аутоіїмунності, викликаної вакцинацією, автори винаходу зосередились на тих пептидах, що одержані з білків, котрі надмірно експресуються на клітинах пухлин, в порівнянні з більшістю нормальних тканин. Ідеальний пептид буде одержаний з білка, котрий є унікальним для пухлини, та не присутній на будь-якій іншій тканині. Щоб ідентифікувати пептиди, котрі одержуються з генів з профілем експресії, близьким до ідеального, ідентифіковані пептиди були закріплені за білками та генами, відповідно, з яких вони походять, та були побудовані профілі експресії цих генів.

Джерела та підготовка РНК

Зразки тканин, видалені хірургічним шляхом, були надані кількома різними клінічними установами (див. Приклад 1), після одержання письмової інформованої згоди від кожного пацієнта. Зразки тканини пухлин були миттєво заморожені в рідкому азоті відразу після хірургічної операції та пізніше гомогенізовані з використанням ступки та пестика під рідким азотом. Усі РНК були підготовлені з цих зразків з використанням ТРІ201 (Іпмйгодеп, Карлсруе,

Німеччина), з наступним очищенням за допомогою КМеазу (ОІАСЕМ, Хільден, Німеччина); обидва методи виконувались за протоколом виробника.

РНК зі здорових тканин людей, в повному обсязі, були одержані комерційним шляхом (Атбіоп, Хантінгтон, Великобританія; Сіопіесії, Гейдельберг, Німеччина; Зігаїадепе, Амстердам,

Нідерланди; ВіоСпаіп, Хейард, Каліфорнія, США). РНК від кількох людей (від 2 до 123 людей)

Зо були змішані таким чином, щоб РНК від кожної особи була однаково зважена. Лейкоцити були виділені зі зразків крові 4 здорових добровольців.

Якість та кількість усіх зразків РНК були оцінені на Біоаналізаторі Адіепі 2100 (Адіепі,

Вальдбронн, Німеччина), з використанням комплекту ЕМА 6000 Рісо І арсСпір Кії (АдіїепоО).

Експерименти з використанням мікрочипів

Аналіз генної експресії усіх зразків РНК пухлин та нормальних тканин був виконаний з використанням олігонуклеотидних мікро-чипів Айутейіх Нитап Сепоте (НС) О133А або Но- 133 Ріюиз 2.0 (Апутеїгіх, Санта Клара, Каліфорнія, США). Усі етапи виконувалися відповідно до посібника Айутеїгіх. Стисло кажучи, двониткова кКДНК була синтезована з 5-8 мкг усієї РНК, з використанням Зирегзоагірі КЕТІ! (Іпмігодеп) та оліго-4Т-Т7-праймера (МУУС Віоїесп, Еберсберг,

Німеччина), як описано в посібнику. Іп міго-транскрипція була виконана з використанням приладу маркування РНК-транскриптів ВіоАітау Нідп мМівій КМА Тгапзогірі І абеїйпуд КИ (ЕМ2О

Ріадповіїйсв, Іпс., Фармінгейл, штат Нью-Йорк, США) для чипів О133А, або приладу СепесСпір ІМТ

І абеїїїпуд Кії (Апутеїгіх) для чипів О133 Різ 2.0, після чого були здійснені кРНК-фрагментація, гібридизація та викрашування стрептавідин-фікоеритриновим та біотинілованим антистрептавідиновим антитілом (МоЇІесшаг Ргобе5, Лейден, Нідерланди). Зображення були скановані приладом Адііепі 2500А СепелАітау Зсаппег (0133А) або Апутеїгіх Сепе-Спір Зсаппег 3000 (0133 Ріиз 2.0). Дані аналізувалися за допомогою програми 5ЗСО5 (АПутеїгіх), з використанням стандартних установок для усіх параметрів. Для стандартизації були застосовані 100 службових генів, наданих АйПутеїгіх. Відносні значення експресії були розраховані відносно реєстрації сигналу, наданим комп'ютерною програмою, та нормальний зразок був довільно встановлений на 1,0.

Профілі експресії вихідних генів цього винаходу показують надмірну експресію в гліобластомі, див. Рисунок 2.

ПРИКЛАД 3:

Імуногенність іп міго для пептидів, презентованих МНС класу І, в ІМА9У5О

Для одержання інформації відносно імуногенності ТОМАР цього винаходу, ми провели дослідження з використанням добре відомої методики стимуляції іп міго, вже описаної в роботі (Умамег, 5, Неїтдеп, Ї, Зспоог, О, Уипо, с, УМегпеї, О, Вийгіпд, НУ, Каттепзее, НО, апа

Зіемапоміс, 5; 2003, Сиціпа еєдде: ргедеїептіпей амідайу ої питап СО8 Т сеї ехрапдед оп 60 саїїбгаїєд МНС/апіі-Ср28-соаієд тісгозрНегев, у. Іттипої., 171, 4974-4978). Таким чином, ми могли показати високу імуногенність для 13 НІГ А-А"0201-обмежених ТОМАР винаходу (у »- 50 95 перевірених донорів ТОМАР-специфічні СТІ. могли бути виявлені), і це демонструє, що такі пептиди є Т-клітинними епітопами, проти яких у людей існують СО8-позитивні прекурсорні

Т-клітини (Табіє 3).

Примування СО8-позитивних Т-клітин іп міго

Для виконання стимуляцій іп міо штучними антигенпрезентуючими клітинами (аАРС), завантаженими комплексом пептид-МНС (рмМНе) та анти-СО28-антитілом, ми спочатку виділили

РВМС (мононуклеари периферичної крові) зі свіжих лейкоцитарних плівок НГА-А"02- за допомогою середовища градієнтного розділення стандартної щільності (РАА, Кольбе,

Німеччина). Лейкоцитарні плівки були одержані з Банку Крові в Тюбінгені або з клініки

КаїПпагіпеппозріїаІ в Штутгарті. Виділені РВМС були інкубовані протягом ночі в Т-клітинному середовищі (ТОМ) для примування іп мйго клітин людей, що складається з КЕРМІ-СІшатах (Іпмігодеп, Карлесрує, Німеччина), з додаванням 10 95 термоінактивованої АВ-сироватки людини (РАА, Кольбе, Німеччина), 100 ШО/мл пеніциліну / 100 мкг/мл стрептоміцину (Сатрбгех, Вервьєр,

Бельгія), 1 мМ пірувату натрію (СС Рго, Нойштадт, Німеччина) та 20 мкг/мл гентаміцину (Сатьгех). СО8-позитивні лімфоцити були виділені з використанням комплекту позитивного відбору СО8-МАСЗ5 (Мінепуї, Бергіш Гладбах, Німеччина), ассогайпд їо ї Ше тапиїасіигег5 іпбігисійопо, відповідно до інструкцій виробника. Одержані СО8в-позитивні Т-клітини були інкубовані до використання в ТОМ, з додаванням 2,5 нг/мл 1-7 (Рготосеї|І, Гейдельберг,

Німеччина) та 10 О/мл ІС-2 (Спігоп, Мюнхен, Німеччина). Генерація мікросфер, покритих рМНС/анти-СО28, Т-клітинні стимуляції та зчитування виконувалися, як описано раніше (М/анйег еї аіІ,, 2003), з невеликими модифікаціями. Стисло кажучи, біотиніловані рекомбінантні НІ А-

А"0201-молекули без трансмембранного домену, що були біотиніловані на карбоксильному кінці важкого ланцюга, вироблялися за методом, описаним в роботі (АМаїап еї аї!., 1996). Очищений костимуляторний Ідб2а миші проти СО28 АБ 9.3 людини (дипд еї аї., 1987) був хімічним способом біотинілований з використанням сульфо-М-гідроксисукцинімідобіотину, як рекомендовано виробником (Регбіо, Бонн, Німеччина). Використовувані мікросфери являли собою полістирольні частинки діаметром 5,60 мкм із стрептавідиновим покриттям (Вапо5

І арогасогіє5, Іллінойс/США). рМНОС, використаними як позитивний і негативний контроль, були

А"0201/МІ А-001 (пептид ЕГАСІСІСТМ з модифікованого Меіап-А/МАНТ-1) та А"0201/200Х5-001 (М РАЇМНІ з ООХ5) або А"0201/НВМУ-001 (РІ РЗОБГЕРБЗМ), відповідно.

Мікросфери в концентрації 800,000/200 мкл були розміщені в планшети на 96 лунок в присутності 600 нг біотинілованих анти-СО28 плюс 200 нг релевантного біотин-яРМНС (мікросфери високої щільності) або 2 нг релевантного плюс 200 нг нерелевантного (бібліотека

РМНСО) МНС (мікросфери низької щільності). Стимуляції були ініційовані в планшетах на 96 лунок шляхом коїнкубування 1х105 СОв-позитивних Т-клітин з 2х105 промитих мікросфер з покриттям в 200 мкл ТОМ, з доданням 5 нг/мл 1-12 (РготосеїІ) протягом 3-4 днів при 37 "С.

Половина середовища була потім замінена свіжим ТСМ, з доданням 80 МО/мл 1-2, та інкубування продовжувалося 3-4 дні при 37 "С. Цей цикл стимуляцій був виконаний три рази.

Нарешті, були виконані тетрамерні аналізи за допомогою флуоресцентних МНС-тетрамерів, вироблених, як описано в роботі (АПаїап еї аї., 1996) плюс клон ЗК1 антитіла СО8-РІТО (ВО,

Гейдельберг, Німеччина) на чотирикольоровому ГАСзЗСаїїбиг (ВО). Пептидоспецифічні клітини були розраховані як процент від загальної кількості СО8-позитивних Т-клітин. Оцінка тетрамерного аналізу була виконана за допомогою комп'ютерної програми ЕС5 Ехрге55 (Ое

Момо Боїмаге). Примування іп міго специфічних тетрамер-позитивних СОвж лімфоцитів було визначене належною установкою дискримінаційного вікна та порівнянням зі стимуляціями негативних контролів. Імуногенність для даного антигену визначалася, якщо було виявлено, що принаймні одна оцінювана іп міго стимульована лунка одного здорового донора вміщує специфічну СО8-позитивну Т-клітинну лінію після стимуляції іп мійго (тобто, коли ця лунка вміщувала хоча б 1 95 специфічних тетрамер-позитивних серед СО8-позитивних Т-клітин, та процент специфічних тетрамер-позитивних клітин був принаймні в 10 разів більше середнього значення стимуляцій негативних контролів).

Імуногенність іп міго для пептидів ІМАУ5О

Для перевірених пептидів НІ А класу І, імуногенність іп міго могла бути продемонстрована генерацією пептидоспецифічних Т-клітинних ліній. Зразок результатів проточної цитометрії після ТОМАР-специфічного тетрамерного викрашування для двох пептидів винаходу показані на Фіг. 3. Результати для 13 пептидів винаходу узагальнені в таблиці 3.

Таблиця 3:

Імуногенність Іп міго високоїмуногенних пептидів НІ А класу І винаходу

На додаток до цих результатів, одержаних від здорових донорів крові, пептиди ВСА-002,

СНІЗІ 1-001 та МіеМ4Х-001 також були перевірені у невеликої кількості пацієнтів з гліобластомою. Усі пептиди виявилися імуногенними тією мірою, що подібна результатам здорових донорів, і це демонструє існування прекурсорних Т-клітин в релевантній цільовій популяції для вакцини.

ПРИКЛАД 4

Зв'язування пептидів винаходу, обмежених НГ А класом І, з НІ А-А"0201

Задача та стислий зміст

Задачею цього аналізу була оцінка афінності пептидів НА класу І до МНС-молекули, кодованої алеллю НІ А-А"0201, оскільки це є важливий параметр для способу дії пептидів в імунотерапії раку. Афінності до НГ А-А"0201 були від середніх до високих для усіх пептидів, обмежених НІ А класом І в ІМАУ5О і МЕТ-001, з константами дисоціації в діапазоні пептиду позитивного контролю НВМ-001, відомого потужного зв'язувального елемента А"02 з корового антигену вірусу гепатиту В. Ці результати підтвердили високу афінність зв'язування усіх перевірених пептидів НГА класу І винаходу.

Принцип тесту

Стабільні комплекси НІ А/пептид складаються з трьох молекул: важкий ланцюг НІ А, бета-2 мікроглобулін (р21т) та пептидний ліганд. Активність денатурованих рекомбінантних молекул важкого ланцюга НІ А-А"0201, самих по собі, може зберігатись, роблячи їх функціональними еквівалентами "порожніх НІ А-А"0201-молекул". При розведенні у водному буферному розчині, який вміщує р2т та відповідний пептид, ці молекули швидко та ефективно складаються пептидозалежним способом. Наявність цих молекул використовується в аналізі на основі ЕГІЗА для визначення афінності взаємодії між пептидом та молекулою НІ А класу І (ЗуЇмезіег-Нмій єї а!., 2002).

Очищені рекомбінантні НІ А-А"0201-молекули були інкубовані разом із б2т та зростаючими дозами відповідного пептиду. Кількість складених спочатку (де помо) комплексів НІ А/пептид була визначена кількісним аналізом ЕГІЗА. Константи дисоціації (значення Ко) були розраховані

Зо з використанням стандартної кривої, побудованої згідно із розведеннями калібранта комплексу

НГ А/пептид.

Результати

Результати показані на Фіг. 4. Нижче значення КО відображає більш високу афінність до

НІ А-А"0201. Усі перевірені пептиди винаходу мали високу афінність до НІ А-А"0201, близько до

КО для пептиду позитивного контролю НВМУ-001, відомого потужного зв'язувального елемента

А"02. Отже, усі ТОМАР класу І винаходу мають високу афінність зв'язування до МНОС-молекули

А"02.

Джерела інформації:

Ароці І, І аштепі-Мадніп 0, Гепданпі 0, Міївіадів ТА (2000). Мезііп ехргезвіоп іп етбгуопіс апа адий питап їесїп ипаег поттаї апа раїпоіодіса! сопайіоп5. Ат У Раїйпої. 157, 287-295.

Адні М, Саміапі Р, Непзоп МУ, Ваїснейог ТТ, І оці ОМ, ВатЖег Ра (2005). Мадпеїйс гезопапсе ітадіпу спагасіегівіїс5 ргедісї ерідеттаї! дгоулЛи Тасюг гесеріог атрійісайоп 5іайшв5 іп аіобіазюта.

Сіїп Сапсег Незв. 11, 8600-8605.

Адовії ВАМ, Гешйтоій М, СиПскК УУу, Мазагді! МО, М/іезПег ОО (1992). Ехргезвіоп ої Ше ерідепта! дгоуМи Тасюг гесеріог іп авігосуїйс Штоиг5 і зресіїїсапПу аззосіаївй м/п діобріавіота тиййопте. Мігспом5 Агсп. А Раїйої. Апаї. Нізіорайної. 420, 321-325.

АІ-доцаї Е5, ІвКападаг 2А, Ітгтап АК (2007). Зигміміп ехргевзвіоп соїтеїаїе5 м/ййп иптамоигтаріє ргодпозез іп іпмавзіме дисіа! сагсіпота ої Ше Бргеавзі. Меса У Маїаузіа 62, 6-8.

АІ-Медам/і К, Меенап В, МісаїІеї У, І Ноїак У, Мау ГІ, Сина А, Рак . (2008). ІпіегсеїІшіаг ігапетег ог Ше опсодепіс гесеріогї ЕСЕВМІІ Бу тістомевзісіе5 дегімейд тот Шштоитг сеїІ5. Маї. Сеї! Віої!.

Айтап 920, Мо55 РА, Сошцідег РУ, Вагоисп ОН, Неугег-УММШіатве МИ, Веї! Л, МеМіснав! А/,

Баміз ММ (1996). Рпепоїуріс апаїузів ої апіїідеп-зресіїс Т Іутрпосуїев5. Зсієпсе 274, 94-96.

Атоп У, Мапд М, її Її, Веупозо /), Воимеї М, Моозза АН, КаїзиоКа К, Нойтап НМ (2005).

Мезвійп-ПпКей дгеєп Пиогебзсепі ргоївїп ШМапздепіс пиде тоибе ог ітадіпд Ппитап їШштог апдіодепевзів. Сапсег Вев. 65, 5352-5357.

Апдіїеті ЕЕ, Адиеппоцяа М, Сопії А, Га ТО, Сагоаїї 5, Стурі В, Тотавзеїо С, Сегтапо А, Мпа С,

Тотаве!по Е (2008). Мисієаг Тасіог-Каррав асіїмайоп апа діїегепіа! ехргезвіоп ої вигуіміп апа Всі-2 іп питап дгаде 2-4 авігосуютав. Сапсег.

Аррау М, 5реїзег ОЕ, Вшиїег М, Веупага 5, Вагбеу С, Сегоціпі УС, І еумга 5, Ріпійа С, Вотего Р (2006). Оєстєазейд з5ресіїс СО8-- сеї сго55-геасіїмну ої апіїдеп гесодпіоп оПоміпд массіпайоп м/п Меїап-А рерііає. Єишиг. У Іттипої!. 36, 1805-1814.

Агтоій ЗЕ, Тгоіапомжекі У (1996). Нитап їеїа! пірросатра! демеІортепі: ІІ. Те пешгопаї суюзкКеїеюп. У Сботр Мешгої. 367, 293-307.

АВОМБОМ М, АВКОМБОМ ВЕ (1965). СЕМТААЇ МЕВМОО5 5МБТЕМ ІМ ОІАВЕТЕ5 МЕШІТО5: ГОМ'ЕВЕО ЕВЕООЕМСМ ОБГ СЕВТАЇМ ІМТААСВАМІАЇ МЕОРІАБМ5. Агсй. Меиго). 12, 390-398.

АвПпецег М, Віеспе І, Їашепдеай І, Мозег А, Наіпдие В, Мідаца М, А!йброиту Р (2005).

Оестгеазед ехргезвіоп ої АВСО4 апіа Всі депеб5 єапу іп Ше раїйодепевібв ої Х-ІпКей адгепоїеиКкодузігорпу. Нит. Мої. Сепеї. 14, 1293-1303.

Коо) АзКіІшпа Т, АрреізКод ІВ, Аттегропі О, ЕКвігот ТУ, АІтомівї РМ (2004). Нібюпе авєасеїуїазе іпйпірйог 4-рпепуІршугаїє тоашіаїев діа! тргійагу асідіс ргоївїп апа соппехіп 43 ехргезвіоп, апа еппапсез дар-|шпсіп соттипісайоп, іп питап адіїоріазюта сеїІв. Єиг. / Сапсег 40, 1073-1081.

Ваїкег Ра, бБіттоп5 МІ, Спапду ЗМ, Ргадов МО, Гаггзоп ВА, 5певеа РК, У/ага ММ, Вегдег М5,

Спеп Р, Ізгає!ї МА, АІдаре КО (2001). ЕСЕВ омегехргеззіоп апа гадіайоп гезропве іп діобіазюта тиййопте. Іпі. У Вадіаї. Опсої Віої. Рнуз. 51, 410-418.

Вепеїїї Е, Веодоїї М, ЕРоп?і І, Осспіпі В, Мапписсі 5, Ептіпі Г, Тоїї Р (2007). Мезійп ехргевззіоп іп адий апа демеІоріпуд питап Кіапеу. У Нівїоспет. Суюспет. 55, 411-421.

Вішт А, УасоБ-Нігзси у, Неспамі С, Кіоосд М (2006). зирргеввіоп ої в5игуіміп ехргезвіоп іп діїобріазіота сейб5 Бу Ше Ваз іппірпог ТагпезуйНпіозаїїсуїйс асій рготоїе5 сазразе-дерепаепі ароріовзі5. Мої. Сапсег ТНег. 5, 2337-2347.

Вошгдоп МА, МУїквігапа Су, Еипйтауг Н, Майпеме ТУ, Відпег БО (1983). Нитап діота- тезепспутаї! ехігасеїЇІшміаг тайіх апіїдеп аєїпей Бу топосіопа! апіїбоду. Сапсег Рез. 43, 2796- 2805.

Вожеп АВ, Напк5 АМ, Мигрпу КУ, Ріогеї!ї БА, Стоз5тап О (2004). Ргоїїїтегайоп, ароріовів, апа 5игміміп ехргезвзіоп іп Кегайпосуїйс пеоріазтвз апа пурегріазіа5. Ат У Оептаїораїйної. 26, 177-181.

Воуїюп ВУ, Гоптапп Т, Гопаєї М, Каїрбаснег Н, Наїдег Т, Егаїег Ау, Юоцек ОС, І евіїє ба,

Намеї! ВА, Айтапп ОМ (1998). Сішатіс асіа десагрохуїазе Т Іутрпосуїе гезроп5ез аззосіаїей м/п 5ив5серіїрійу ог гезівїапсе 0 їуре І аіарегех: апаїувзів іп дізеазе дізсогаапі питап Мм/іпв5, поп- орезе діабеїйс тісе апа НІ А-0О ігапздепіс тісе. Ійї. Іттипої!. 10, 1765-1776.

ВгеККе С, Гипаегмоїй А, Епдег РО, ВгеККеп С, зіаібзей Е, Редегзеп ТВ, Нагаїадзейн О, Кгидег

Ра, ВіеїКмід А, СпеКепуа М (2006). Мс2 ехргеззіоп гедціаїез мазсшцаг тогрпоіоду апа Гпсіоп іп питап Бгаїп ШшШтоитг5. Меигоіїтаде. 29, 965-976.

Вгеппег АУ, І іІпеї М5, Ріпе НА, Зпаріго МУ/В, ЗеїКег ВО, ВіаскК РМ, ІпеКір РО (2002). Нівзюгу ої аіПегаіе5 апа ашоіїттипе аізеазез апа гізК ої Бгаїп штогз іп адийв. Іпі. / Сапсег 99, 252-259.

Вготтеїапа Т, НРКозепдгеп І, ЕРгіаішна 5, Неппід В, ІваКкзеп М (2007). Зегит Іємеїв ої діа! триПагу асіадіс ргооївіп согтеїаїє ю їштоиг моїште ої піднп-агаде діоюотав. Асіа Мешгої!. Зсапа. 116, 380-384.

Вгопдег Н, Копід у, Корріом К, бієїпег НН, Аптаді В, Негоїд-Мепаєе С, Керрієг 0, Міеє5 АТ (2005). АВСС ага етйих ритр5 апа огдапіс апіоп иріаКе ігапзропегв іп питап діотав апа Ше (510) ріоса-штог Баїтівг. Сапсег Вез. 65, 11419-11428.

Вгуспюома 5, РішгазКома М, Ніоріїкома А, Вгусніа Т, Нітак / (2007). Мевіїп ехргезвіоп іп сшапеоив5 теіапотавх апа теїапосуїс пемі. У Сшап. Раїної. 34, 370-375.

Виснпег А, Савзігюо М, Неппід А, Рорр Т, Аз5тапп с, НоївіеНег А, (єї С, 7іттептапип Му (2007). Птапзстірюте апаїузез іп гепаї! сеїЇ сагсіпота. Сотрбіпайоп ої Іазег тістодівзесіп апа тістоатаув|. Огоїоде А 46, 1170-1175.

Само А, Саїепа А, Мобіє М5, Сатоїй 0, (ціЇІ-Ваго І, СопгаІє2-Могепо О, Ний І, Зпагр В, Оїши

ТН, Апмег МА, Мепіпо с, Оісквоп ВВ, Чдоппвоп МО, Стеєп УЕ (2008). Ідепійісайоп ої МЕС Е- гедшайеєй депе5 авззосіаїєй м/йй іпстеазей Ішпдуд теїавзіаїййс роїепійа!: Тпсіопа! іплмоїметепі ої

Іепазсіп-С іп Штог дгоуУлЛНи апа Ішпу теїавзіавів. Опсодепе.

Сатроїї МА, Спапд СС, Кадезпйа Т, УУапуд Х, МесСапну В, Регтопе 5 (2004). Нитап підп тоїесшіаг меїднпі-теіапота-а5зосіаївд апіїдеп (НМУУ-МАА): а теїапота сеї зипйасе спопагойіп зиНаїе ргоїводіусап (МБСР) м/п бБіоіодісаї! апа сіїпіса! зідпітісапсе. Стії Веу. Іттипої. 24, 267-296.

Сагтетоїйа В, СазіеїЇІІапі Р, Ропавззі М, Вогзі І, Обіпі 5, Місоїю С, богсагано А, МіаІе С, М/іпіег

С, Мегі 0, 7агаї ЇЇ (1999). Ідепійісаноп ої а аійобіазіота-аззосіаїейд іепазсіп-С івотогтт Бу а підн аніпйу тесотбріпапі апіїроду. Ат .) Раїйпої. 154, 1345-1352.

Сатеге С, ЗевіІву Е5, Соєїге Т, ГопдпесКег 05, Кос М (2007). Те Мевіїп ргодепіог Іппеаде ів Те сотраптепі ої огідіп ог рапсгеаїйс іпігаеріїНнеїіа! пеоріавзіа. Ргос Маї)!. Асад. 5сі. 0. 5. А 104, 4437-4442.

Сазаїї С, ОаїІегтба Р, Вімойіпі Г, Сайпо С, Оего Р, Віпі Е, Веїйї Е, Ме2727апгапіса 0, Совіа А,

Апагеоїа 5, І ео Е, Рагтіапі С, Савзієїїї С (2003). Тпе ароріовзів іппірйог ргоїеіп зигміміп іпаисев5

Тїмтог-5ресіїїс СО8-апа СрА--1 сеїЇ5 іп соіогеста! сапсег раїіепіб5. Сапсег Ве. 63, 4507-4515.

Савівїїїпо Е, Ниапд АХ, їап-Воппеї С, 200! 5, ЗспеїіпесКег С, Септаїп ВАМ (2006). СпетокКіпев еппапсе іттипйу Бу диїдіпуд паїме СО8--Т сеї о 5йе5 ої СО44-1 сеїІ-депатйіс сеї! іпіегасійоп.

Маїшге 440, 890-895.

Спакгамапі А, Мої! Е, Віаск РМ, РіпКкеївівєїп ОРЕ, РіпКеївієїп ОМ, Оузоп МУ, Гоейег УЗ (2002).

Опцапійаймеїу дегегтіпей вигуіміп ехргезвіоп Іемеї5 аге ої ргодповіїс маше іп питап дііотав. / Сіїп

Опсої 20, 1063-1068.

Спеемег МА, Спеп МУ, Оіві5 МІ, ТаКканавпі М, Реасе 0 (1993). Т-сеїЇ іттипйу (о опсодепіс ргоїєїп5 іпсійдіпа тиїаїеай газ апа спітетіс рег-арі. Апп М. У. Асад. 5сі. 690, 101-112.

Зо СпеКепуа М, Епдег РО, Тногзеп Е, Тузпез ВВ, А!І-Заїта) 5, Кеай ТА, Риптапек Т, Мапезрагап

В, І еміпе УМ, Вий АМ, Ріїкіпаюп су, ВієїКмід В (200г2а). Тнеє діа! ргесигзог ргоїеодіусап, МС, ів ехргез5ей оп їштоиг пеомазсшціашйте Бу мазсшіаг регісуїез іп питап таїїдпнапі Ббгаїп Штоигв.

Мепгораїної. Аррі. Мешигобіої. 28, 367-380.

СпнеКепуа М, Нівівшеп М, Епаеєг РО, Тногзеп Е, дасоь АГ, Ргобрзі В, Нагаїдзеїйн О, РіїКіпдаюп С,

Вий А, І еміпе УМ, ВієїКмід А (20025). Маг ргоїеодіусап рготоїез апдіодепевзіз-дерепдепі Штог гом іп СМ5 Бу зедиезієгіпу апдіовіайп. ЕАБЕВ / 16, 586-588.

СпеКепуа М, Іттегмої! Н (2007). МОе2/НМР ргоїеодіусап аз а сапсег ІНегарешіс Іагаєї.

Меїпод5 Мої. Віої. 361, 93-117.

СпеКепуа М, Кгакзіай С, 5мепазеп А, Мейапа ІА, 5іааіезеп М, Тузпе5 ВВ, ЗеїНеїт Е, У/апа у, ЗакКаїавззеп РО, Запааї! Т, І оппіпуд РЕ, Ріаїтаж Т, Епдег РО, ВіеїКмід АВ, Біоца М, егаїїсир МВ (2008). Те ргодепіюг сеїЇ таїжег МОа2/МРО рготоїев спетогевзівіапсе Бу асіїмайоп ої іпіедгіп- дерепаепі РІЗК/АКІ 5ідпаїїпд. Опсодепе.

СпекКепуа М, Ріїкіпоїоп СУ (2002). Маг ргесигзог сеїЇв іп пеоріавзіа: їшпсіопаї, пізіодепевів апа

Іегареціїс ітріїсайопв Тог таїїднпапі ргаїп Тштоиг5. У Мешигосуїо!. 31, 507-521.

СпеКепуа М, Кооргаї НК, Оамієз О, І еміпе УМ, Вий АМ, РіїКіпдїоп с) (1999). Тие Маг спопагойіп зиМаїе ргоїеодіусап: гоїє іп таїдпапі ргодгезвіоп ої питап Бгаїп ТШштоитв5. пі У Овєму.

Мешговсі. 17, 421-435.

Спідпе(-ЕНівзтапп АВ, ТисКег АР (2004). Соппесіїме Іізвцев: 5ідпаїйпу Бу їепавсіп5. пі. у

Віоспет. Сеї! Віо!. 36, 1085-1089.

Спи С, 1 УМ, Воадо ВУ, Рагагдде ММ (2008). Віоса-нгаїп Брагтієг депотіс5 апа сіопіпдоїа помеї огдапіс апіоп Мапзрогпіег. У Сегеб. Віоой Ріож Меїаь 28, 291-301.

Соїїп С, Ваєга М, Вапої С, Ріпа Е, Ейдез М, Маппі І, Мапіп РМ, Опаїїйк ГІ, РідагеПа-Вгапдег О (2006). Ідепійісайоп ої депе5 айегепійапу ехргеззей іп діюбріабвіота мегзив рііосуїїс азігосуюта ивіпд Бирргезвіоп Зибігасіїме Нубгіаігайоп. Опсодепе 25, 2818-2826.

СоІотбенйі 5, Ваззо М, МиеїІег ОЇ, Мопаїпо А (2006). Ргоопдеа ТСВ/СО28 епдадетепі агімев5

І -2-іпдерепадепі Т сеї! сіопа! ехрапзіоп їШйгоцдп в5ідпаїйпуд тедіаївй Бу Ше таттаїап їагдеї ої гаратусіп. / Іттипої. 176, 2730-2738.

Сопассі-б5оїтеї! М, Каріап А, Ваменй 5, Саме М, ЗаКигаії Т, Веп-2еєм А (2005). Тне 5пеа есіодотаіп ої Мі/-САМ віїтшиіасев сеї! ргоїїегайоп апа тоїйїйу, апа соп'іег5 сеї! їапвтоптаїйоп. 60 Сапсег Невз. 65, 11605-11612.

Сопассі-5оїтеї! МЕ, Веп-Уедідіа Т, 5піштап М, Ееїпвівїп Е, Еїіпаї Р, Веп-2е'єм А (2002). Мі-

САМ і5 а їагдєї депе ої Ше Беїа-саїепіп// ЕБР-1 раїйулау іп теіапота апа соїоп сапсег апа її5 ехргезвіоп епнпапсез тоїййу апа сопіег5 Штогідепевів. СЧепез ЮОеу. 16, 2058-2072.

Со5Кип 3, Матас 0, Сиібанаг О, Запсак В, КагатапМ, О2Кап 5 (2007). ГосаПпу адмапсей ргєаві сагсіпота ігеаївй м/йп пеоадіимапі спетоїПегару: аге Ше спапдез іп зегит Іємеї!5 ої УКІ -40,

ММР-2 апа ммР-9 соїтеєїаїей м/йй їштог гезропзе? Меоріазта 54, 348-352.

Стеззуеі! Р (1994). Аззетрбіу, апзроїп, апа їпсіп ої МНС сіавзв ІЇ тоїІесціе5. Аппи. Неу.

Іттипої. 12, 259-293.

Бапівігапа У, СоїПйпе МР, Гепаанпі ОО (1992). Ехргезвіоп ої Ше сіаз5 МІ іпіегтеадіаїе йатепі пезіїп іп питап сепіга! пегуоив зувієт Штог5. Сапсег Вев. 52, 5334-5341.

Оепаді|єї У, Мавзіке МО, Сошнетапдєаз С, Сіївіоцаів С, Зспоог О, АМепрегепа Е, Мийег М,

Ктатег В, Міззіои А, Зашег М, Неппепіонег /), Мегттеї 0, 5іеп7!І А, Ваттепзеєе На, Кіїпаєї К,

Зіемапоміс 5 (2006). Опехресієд Арбипадапсе ої НІ А Сіаз5 ІІ Ргезепієйд Рерійез іп Ріїтагу Вепаї

Сеї! Сагсіпотав. Сіїп Сапсег Вев. 12, 4163-4170. ріхоп ОМ, І2оп 0), Оаддег 5, Саом Му, Таріїп ВН, Кее5 ОВ, Стеєпе МК (2007). ТІХ1/НОХ11

Тапзсегіріоп Тасіюог іппірії5 айетгепіайноп апа рготоїев а поп-паєтороїеїіс рпепоїуре іп тигіпе Ббопе та!тому сеїІ5. Вг. У Наетаїйо!. 138, 54-67. ротоїйо Т, Міуата У, 5и2иКі Н, Тегаїапі Т, Агаї К, З,удіуата Т, Такауата Т, Мидіуа 5, О20по

З, Могама В (2007). ЕмаІнайоп ої 5100А10, аппехіп Ії апа В-РАВР ехргеззіоп аз таке" ог гепаї сеї сагсіпота. Сапсег 5сі. 98, 77-82.

Оидієу МЕ, УУипаеплісн ОВ, Воббіп5 РЕ, Мапд УС, Ну Р, Зспугайгепігибег 0), Тораїїап 51,

Зпегту В, Вевійо МР, Нибіскі АМ, Нобіпзоп МА, Вайеїа М, Оигау Р, Зеірр СА, Водегв-НЕгееге!" І,

Мопоп КЕ, МамгошиКакКів ЗА, М/пе ОЕ, Возепбего 5А (2002). Сапсег геагезвіоп апа ашоіїттипйну іп рамепів айег сіопа! героршіайоп м/йй апіййтог ІутрНосуїев. Зсівєпсе 298, 850-854.

ОиаІєу МЕ, У/ипаенпіси УВ, Мапд УС, Зпегу ВМ, Тораїїап 5, Невійо МР, Воуаї! ВЕ, Каттиїа

М, Мпіїе ОРЕ, МамгошикКаків 5А, Водегз І), Стгасіа С), допе5 ЗА, Мапдіатеїї ОР, РеїІейег ММ, Сва-

Вапасіоспе У, НКобіпзоп МА, Вептап ОМ, Ріїе АС, Абаїї А, Козепрегу ЗА (2005). Адоріїме сеї їгапетег Тегару тюїІоміпд поп-тує!їоабіайме риї Імутрподерієїїпуд спетоїПегару ог Ше геаїтепі ої раїепів м/йй геїгасіогу теїавзіаййс теїІапота. У. Сіїп. Опсої. 23, 2346-2357.

Зо Еррепрегдег О, Миеїег Н (1994). СтоулАи Тасюг гесеріогв апа ІНеїг Ідапав. ) Мешйгоопсої. 22, 249-254.

Епип С, 5йп 7, Наєпаїе І, ЗспМіег- ТГпитпег В, Неїптап С, ТНнієїетапвз К, мап дег ВР, 5спМШег а,

ЗспШий: ЕБ (2007). Титог-геасіме СО4--1 сеї! тезропзез Ю Ше теіапота-аззосіаїед спопагойіп зйцІрпаїе ргоїеодіусап іп теіапота раїепів апа пеайпу іпаїмідца!5 іп Шїе арзепсе ої ашоіїттипіу. /

Іттипої. 178, 7703-7709.

Ніогепе5 МА, Ноїт В, МуКіерозі О, Іепаані , БРоавзіай О (1994). Ехргезвіоп ої Ше пеигоесіодеттаї іпіеттеаіайе Патепі певійп іп питап теіапотав. Сапсег Нев. 54, 354-356.

Еопа Ї, Нои У, Вімаз А, Вепіке С, Меп А, Рівпег СА, Оамів ММ, Епдієтап ЕС (2001). Анегєйд рерііде Ідапа массіпайоп м/їйп РІЗ Ідапа ехрапаєа депаййіс сеї тог Тштог іттипоїПегару. Ргос.

Маї). Асад. сі. ). 5. А 98, 8809-8814.

Саїї В, Віпаа Е, Опапеїї О, СіреїІені В, Стіні А, Ое МУ5, Ріоссо В, Еогопі С, Оітесо Е, Мезсомі А (2004). Івоїайоп апа сНагасієгігайоп ої Шштогідепіс, віет-їКе пешга! ргеситвої5 Пот Ппитап діоюбіазіота. Сапсег Рез. 64, 7011-7021.

Саоп У, Совієз А, Запспе2-Сабро РЕ, КіпіомеКу А, Міеспік В, І адогсе-Раде5 С, Товоїїпі М,

Сатиз М, Вегдег А, М/іпа Р, 2іпгіпдопоце Е, Вгипемаї! Р, Сидпепс РН, Тгтаідаповкі 7, Епідтап УУ/Н,

Радез Е (2006). Туре, деповйу, апа Іосайоп ої іттипе сеї мйпіп питап соіогесіа! їТштогв5 ргедісі сіїпіса! оцісоте. Зсіепсе 313, 1960-1964.

Сагсіоп Е, Наїйадіс А, Раіїззпег А, Ятепсп-Сопеїапі С (2004). Сепегайоп ої ап епмігоптепіаї пісне бог пешга! віет сеїЇ демеіортепі Бу Ше ехігасеїЇІшміаг таїйгіх тоіІесце їепазсіп С. ОемеІортепі 131, 3423-3432.

Сагу 5С, КеПу СМ, НосКптеїй 5 (1998). ВЕНАВ/гемісап: а Бгаіп-5ресіїіс Ієсіїсап ітріїсатей іп діотав апа діа! сеї!Ї тоййу. Ситт. Оріп. Меигобіо!. 8, 576-581.

Сагу 5С, 7епіо СА, Спіапд МІ, Сам У, Ссагау с, Носкієїй 5 (2000). сОМА сіопіпд, спготозотаї! Іосаїї2айоп, ап ехргезвзіоп апаїузіз ої питап ВЕНАВ/ргемісап, а Бгаїп зресіїїс ргоїєодіусап гедиаїєйд дигіпуд сопіса! аємеІортенпі апа іп аіота. Сепе 256, 139-147.

Саціпопі Ї, Ромеї! БУ, уУг., Нозепрегд ЗА, Невійо МР (2006). Адоріїме іттипоїНегару ог сапсег: риїаіпд оп зиссе55. Маї. Неу. Іттипої. б, 383-393. сСтпозй 9УС, Бопі Т, Капу ВН, АЦетгі ОС (2008). Нзрбо гедшиіайоп ої Шштог сеї! ароріовів. У) Віо!.

Спет. 283, 5188-5194.

Сірр У, Си С, Стуїєп С, Казврег 5, Визптап МУ (2007). Недденод раїнмау асіїмпу іп Ше ГАСУ ргозіаге їштог тоаеї. Мої. Сапсег 6, 19.

СіІвїрептап АБ, Міспигіпа Т, Епсіпа5 УМ, Ноїд У, Кгтазпом Р, Вайогаї Е, Різпеї! С, Возепіеїай

Ма, Епікоіором Сі (2008). Сепеїййс арргоаснез ідепійу адиїї ріийагу вієт сеїІв. Ргос Маї). Асад. 5сі.

Ц. 5. А 105, 6332-6337.

Спайс 5, АгапасКоміс О, дадег Е, Маївно М, бемаКитаг А, Апоїкі МК, Макі ВО, Юиропі В,

Війбег С, Спеп МТ, Кипшй А, СІЯ Гу (2003). Бйигуєу ої пайштапйу оссиптіпд СО4-Ї сеї! тезропзев адаіпві МУ-Е5О-1 іп сапсег раїієпів: соттеїЇайоп м/йп апіїбоду гезропзев. Ргос Маї). Асад. 5сі. 3. 5.

А 100, 8862-8867.

Сюодроці В, Віздгоме ЮА, 5ИКоїпу ОО, Юау А5, Ш (1998). Соітеїіайоп ої В-РАВР апа СЕАР ехргезвіоп іп таїїдпапі діоюота. Опсодепе 16, 1955-1962.

СогКка В, 5Кибіз-едаадіо У, Мікша М, Вагаадіп К, Раїїс7Ка Е, Сгатоска В (2007). МЕСАМ, а пешигопа! зузіет сеїІ-аанезіоп тоїіесиїіє, і іпдисед іп раріПагу Ійугоїй сагсіпотав. Вг. ) Сапсег 97,531-538.

Со У, Маївигакі М, Кигінага 5, ЗНітіги А, ОКада Т, Мататоїо К, Мигаїа Н, ТаКаїа М,

Аригагапі Н, Нооп 05, Заїда Т, КажаКаті мМ (2006). А пем теїапота апіїдеп Тану асіа-ріпаінпд роївїп 7, іпмоїмей іп ргоїїГегайоп апа іпмавіоп, іх а роїепійа! Тагдеї ог іттипоїпегару апа тоїесшаг їагудеї Інегару. Сапсег Вез. 66, 4443-4449.

Стипда УМ, Мабогв ІВ, Раїтег СА, Сппієпд ОС, 5169 А, МікКеївеп Т, Оіазіо ВАВ, 2Напяо К,

Айвоп О, Сігі2ліє М/Е, МУапуд МУ, СіШевзріє СУ, доппзоп МА (2006). Іпстеазейд ехргезвіопо ої

Тутіадуїаїе зупіпеїазе (Т5), ибідийіп вресіїіс ргоїєазе 10 (О5Р10) апа вигміміп із аззосіаїей м/йн роог зигуїмаї іп діїобіазіота типтогпте (ВМ). У Меигоопсої. 80, 261-274.

Си с, Мцуап у, М/і5 М, Казрег 5 (2007). Рговіаїе сапсег сеїЇ5 м/їй 5ієт сеї! спагасієгівіїс5 гесопзійціе Ше огідіпа! питап Штог іп мімо. Сапсег Рез. 67, 4807-4815.

Сипійег Не, стій! МО, Рийір5 Не, Кеттіпа 0, Кнагбапаа 5, богіапо В, Моадгизап 7,

Меїззпег Н, Умезірнпа! М, Гатзгливз К (2008). СіІоБбіазіота-дегмей віт сеїІ-епгісней сипйигев Тогт дівііпсі зирдгоирз ассогаїпу ю тоїіесціаг апа рпепоїуріс спіегіа. Опсодепе 27, 2897-2909.

Наттег У, СаїПаг?гі Е, Вопо Е, Каїт ВМУ/, Сиепої У, Маїзазпіпі Р, Маду 7А, з5іпідадііа Е (1995).

Рерііде Бріпаїпа зресіїйсну ої НІГ А-ОНА. тоїіІесшев: соїтеїайоп м їй пПештаїйоіа апйтйів5 аззосіайоп. у

Ко) Ехр. Мей 181, 1847-1855.

Напада К, Уемжавєї! УМ, Мапд 9УС (2004). Іттипе гесодпіоп ої а питап гепа! сапсег апіїдеп

Ігоцдп розі-ігапзіайопаї ргоївїп 5ріісіпд. Майте 427, 252-256.

Нац Р, Кип2-5сп!йоНап І А, Виттвеїе Р, Агзіап Е, бопеїї А, Косі Н, І оптвеїег А, Нігзсптапп В,

Миїег А, Водаанп І, Воззетоїї АК (2006). Тепавзсіп-С ргоївїп ів іпдисей Бу ігапзюптіпу дгомли

З5 Тасіої-беїа! Бшї доеб5 пої сотеїаїє мйй їте їо їШтог ргодгевзвіоп іп Підп-дгаде діотав. У

Мешгоопсої. 77, 1-7.

Неїтрегаєг АВ, Низзаїп 5Е, АІдаре К, Заулауа НВ, АгсНег СА, Егієдтап Н, Веагаоп 0, Егіієдтап

А, Відпег БО, Затрзоп УН. Титог-5ресіїїс рерііде массіпайоп іп пемлу-діадпозей раїйепів м/н

СВМ. уоштпаї ої Сіїпіса! Опсоіоду, 2006 АБСО Аппиа! Мевїїпд Ргосеєдіпов Раї І Мої 24, Мо. 185 (Чипе 20 Буррієтепі), 2006: 2529. 6-20-2006.

Негоїд-Мепаєе С, Миеїег ММ, Вопзапюо ММ, 5сптій НР, Кипге 5, 5івїпег НН (2002). Сііпіса ітрасі апа їшпсійопа! азресів ої їепазсіп-С ехргезвіоп дигіпд діота ргодгезвіоп. Іпї. / Сапсег 98, 362-369.

Неїтега МВ, Вгипо 5, Вийідієг 5, Тена С, Сані 5, Оегедібив МС, Визвзоїаїї В, Сативві С (2006). ІзоЇайоп апа сНагасієгігайоп ої а віет сеїЇ роршайоп їот адий питап Імег. 5іет СеїЇв 24, 2840-2850.

Нойтапп МЕ, 5Неїпіп У, Гонзе СМ, РаїКег АБ, І віромісп ВС, діапу 7, Кжмоп ЕО (2008). Ехіетаї! маїїдайоп ої ІМРЗ ехргевзіоп аз ап іпаерепаепі ргодпобіїс таїКег ог теїабвіаїййс ргодгезвіоп апа деа ог райепів м/йй сієаг сеї! тепаї сеї сагсіпота. Сапсег 112, 1471-1479.

Ногтідо А, Си В, Кагіті 5, Вівдеї! Е, Рападеаз К5, Еддаг МА, Тапулаг МК, Нао 5, Рівївпег М,

ОРеАпдеїїв ІМ, Ноїапа ЕС (2006). УКІ-40 апа тайіх теїаПоргоїєїпазе-9 а5 роїепіа! 5егпит

Біота!Кетгв Тог раїєпів м/йй підп-дгаде діотав. Сіїп Сапсег Вев. 12, 5698-5704.

Ниапд у, Ни У, Віап Х, Спеп К, бопд МУ, Юипіор ММ, Ножага ОМ, М/апд УМ (2007).

Тгапзасіїмайоп ої Ше еріадаентаї! дгоули Тасіог тесеріог Бу Тогтуїреріїде гесеріог ехасегбаїез Ше таїїдпапі рбенаміог ої пПитап дііобіазіота сеїІв. Сапсег Нез. 67, 5906-5913.

Ниапао У, ЕРап У, Мапа у), 7пи 72 (2008). СНагасієгіганоп ої РАБ ргоївіп апа її зирргеззей ехргеззіоп іп пПитап рапсгеаїйс сапсег сеїІ5. Мої. Сеї! Віоспет. 308, 133-139.

Нипспагек М, Киреїпіск В (2000). Ерідегта! дгоулп Тасіог гесеріог депе атрійісайоп аз а ргоапозіїс таїкКег іп діоріавіота тийтогте: гезийв5 ої а теїа-апаїувзів. Опсої! Вев. 12, 107-112.

Нмапо МІ, ГиКепз УВ, ВшиПоск ТМ (2007). Содпаїе тетогу СО4-- сеї депегаїєа м/йН депатййіс сеї! ргітіпуд іпїнепсе Ше ехрапвіоп, МайісКіпду, апа айегепіайноп ої зесопдагу СО8-- сеї апа еппапсе штог сопігої. ) Іттипої. 179, 5829-5838.

Ідисні Т, ЗаКаїа К, Мо5пігакі К, Тадо К, Мігипо М, Мой Н (2008). Огрнап С ргоївіп-соирієй гесеріот аРАБб гедшіаїез пешга! ргодепіюг сеї! тідгайоп міа а СаІрна 12/13 апа Во раїпулау.

Віо!. Снет.

ІЩЦа Воог РК, де СК, Ме)/)азкі-Возпіак У, Вгеппег С, мап дег Кпаар М5, Зсперег ас, РгопкК Ус (2006). МедаІепсернаїїс ІеиКоепсерпаіораїШшу м/йй 5ирсопіса! сувзібє: ап ирдаїє апа ехієпадєй тиїайоп апаїувів ої МІ С1. Нит. Миїаї. 27, 505-512.

Івпінсні 5, Т8и2иКкі К, Мовзпіда М, Матада М, Надітигта М, ОКадо Н, Міжа А, Кипінага Н,

МакКагай У, Татига М, Завзакі Т, Огаума 5 (2002). ВіосКаде ої Са(2--)-реппеаріє АМРА гесеріогв вирргез5з5ез тідгайноп апа іпдисез ароріовів іп питап дііобіазхюта сеїїв. Маї. Меса 8, 971-978.

Івпігакі М, Івпімата Т, Адасні А, Татига М, Спагігаден М, Кіїатига Н, Зидізакі М, МатапакКа

М, Майо 7, Рикида мМ (2006). Ехргезвзіоп ої певійп іп тах апа питап діотегшіаг родосуїев. /

Б!уртістовс. Сую!. Раїної. 38, 193-200.

Уап5зеп ЕМ, Геттеп5 ЕЕ, ММоМе Т, Спгісїеп О, моп Неїтай Ма, Зспоепрегдег ЗР (2003).

СО04-Т сеї5 аге гедцігей ог зесопадагу ехрапзіоп апа тетогу іп СО8--Т ІутрНосуїев. Маїшцге 421, 852-856.

Уажої5кі ОМ, КеПу СМ, Ріертеїег УМ, Носкіїєїй 5 (1996). ВЕНАВ (Бгаїп епгісней НуаІштопап ріпаїіпо) із ехргеззеа іп зигдіса! затрієвз ої діота апа іп іпігастапіа! дгайе ої іпмазіме аіота сеї

Іпез. Сапсег Вез. 56, 2293-2298. апа 7, Спи РО, Мода ВА, Роск КІ, іш О, Нвзіеп СС, її С, Спеп М, Юцап НО, Мебоцааї 5,

Ми СІ (2006). Апаїувів ої ВМА-ріпаїпд ргоївїп ІМРЗ юю ргедісі теїавіазів апа ргодповів ої гепаї!-сеїЇ сагсіпота: а геігозресіїме зіцау. І апсеї Опсої! 7, 556-564.

Уапа 27, Гопйве СМ, Спи РО, Ми СІ, Мода ВА, Носк КІ, Кмжмоп ЕО (2008). Опсоїеза! ргоївїп

ІМРЗ: а поме! тоїІесшіаг тагїКег Таї ргедісіє теїавіавіб ої раріїагу апа спготорпобре гепаї сеї! сагсіпота5. Сапсег 112, 2676-2682.

УЧопапзеп У5, Уепзеп ВМ, Нозіїпа А, Мівівєп О, Ріїсе РА (2006). Зегит УКІ-40, а пем/ ргоапозіїс Біота!кег іп сапсег раїєпів? Сапсег Ерідетіо!. ВіотаКег5 Ргеум. 75, 194-202.

Коо) Уонапзеп 95, Уепзеп ВУ, Возвіїпа А, Ргісе РА (2007). І5 УКІ-40 а пем/ Іпегарешіс їагоеї іп сапсег? Ехрен. Оріп. ТНег. Тагувіїв. 11, 219-234.

Уипд 05, Роєгсп С, Зспаплег А, Неск А, Ріаїе КН, 5еїйїеп У, бБівіптеєї Н, Ваабре А, 5йгег М (2007). Зетит СЕАР із а діадповіїс таКег гог аіобіазіота тиййПопте. Вгаїп 130, 3336-3341.

Уцпд а, І еабейег УА, Миїег/-Ебрегнага Ну (1987). Іпдисіоп ої суїюїохісйу іп гевіпд питап Т

Іутрпосуїез роипа ю Шштог сеї Бу апіїрбоду Неіегосопіцдаїев. Ргос Маї! Асай 5сі ОО 5 А 84, 4611- 4615.

УцпКег М, щдопапзеп 95, Напзеп ІТ, Її ипа Еї, Кгіздапвеп РЕ (2005). ВНедшіаїйоп ої УКІ -40 ехргезвіоп дигіпуд депоїохіс ог тісгоепмігоптепіа! зіге55 іп питап аїЇобіазіюта сеїІ5. Сапсег 5бі. 96, 183-190.

Каїїмага У, Матавакі Е, Ната 5, Манага К, МовпіоКа Н, 5и!идіуата К, Ага К, Кигізи К (2003).

Ехргезвіоп ої вигміміп іп азігосуїйс їШтогв: сотеїайоп м/йй таїїдпапі агаде апа ргодпові5. Сапсег 97, 1077-1083.

Каїовні сї, МокКнїагі К, Сагрепіїєг С, Таїїрегі 5, І еївипе У, Маїе М, Оєвіацте УМ, Содроці В,

Запбзоп М (2007). ЕАВР7 ехргеззіоп іп дііобіавіотав: геїЇайоп юю ргодповів, іплазіоп апа ЕСЕВ віайшв. У Мешигоопсої. 84, 245-248.

Ка У, Еційа М, Кипіга А, Заю 5, КапеКо М, Озама М, Твигно Т (2003). МоїІесшаг ідепійісайоп ої Аддги5/11 аїрна аз а ріаїєівї адагедайоп-іпдисіпу Тасіог ехргеззей іп соїогесіа! гитогв. У Віої.

Спет. 278, 51599-51605.

Каю У, Капеко МК, Кипіїа А, по Н, Катеуата А, Одазамжага 5, Маївицга М, Назедама У, 00 Би2ИиКі-Іпоце К, Іпоце О, Олакі У, Магітаїви Н (2008). МоіІесціаг апаїувів ої Те раїйорпузіоіодісаї

Біпаїпу ої їпе ріаїеієї адагедайоп-іпдисіпа Тасіог родоріапіп юю Ше С-їуре Ієсііп-ІЇКе гесеріог СІ ЕС- 2. Сапсег сі. 99, 54-61.

Каю У, Капеко МК, Кипо А, Оспіуата М, Атапо К, Спіра У, Назедамжа У, Нігарауавні /,

Магітаїзи Н, Мізпіта К, Озаума М (2006). Іппірйоп ої Штог сеїЇІ-іпдисей ріаївіеї аддгедайоп ивіпд а помеї апії-родоріапіп апіїбоду геасіїпд м/їп й ріаїєІвєї-аддгедаїйоп-5іїтиайпд дотаїп. Віоспет.

Віорпуз. Ве5. боттип. 349, 1301-1307.

Ке М, з,ипаагат В, Гі С, Спіопів У, Бап МУ, Нодегїз С, Амлай Т, Стіїтап М, Ми 0, Уопд-еїааї Е,

ЦПООХ (2007). Огрпап С ргоїєіп-соишрієд гесерюг СРАБб ріауз а гоїе іп сеї! Мапетоптаїйоп апа

Іштогідепевзів іпмоїЇміпд Ше сеїЇ аапезіоп раїйу/ау. Мої. Сапсег Тег. 6, 1840-1850.

Кеппеду ВС, Зпеагег МН, Ул/аїїх АМ, Вгідні АК (2003). С04--1 Іутрпосуїез ріау а сійісаї гоїє іп апііроду ргодисійоп апа їштог іттипіу адаїпві вітіап мігив 40 Іагде Шштог апіїдеп. Сапсег Нев. 63, 1040-1045.

Кіт СН, Вак КН, Кіт м5, Кіт ОМ, Ко М, Оп 5, Кіт КМ, Нопо ЕК (2000). Ехргезвіоп ої епазсіп-С іп азігосуїіс Шштогв: й5 геІємапсе о ргоїТегайоп апа апдіодепевів. Зигу Мешцгої. 54, 235- 240.

Кіт ЗН, Оа5 К, Могеєп 5, Сопйтап РЕ, Натеєй М (2007). Ргодпозіїс ітріісайопе ої іттипопйівіоспетісаїП у аєїесієй УКІ -40 ехргезвіоп іп ргєавзі сапсег. Мопа у Бига Опсо!ї! 5, 17.

Ківєерегдег МУ, Вома 5, Мівїзеп МЕ, Негамжі М, Спцапд АМ, Ервівіп ЛІ, Вептап ОМ (2007).

Ноїе5 Тог Ше 5іет сеї! абзосіаїєд іпів"тедіафє йЙатепі Мевіїп іп рговіаїе сапсег тідгайоп апа теїавзіавзів. Сапсег Невз. 67, 9199-9206.

Ківїп Т, Спо 7, Неїтрегуд Н, Мадзеп ОБ, НеїІег А5, Зегир Р (2003). Мевіїп ів ехргеззей іп мазсціаг епдоїНеїа! сеї іп ШТе адиїї питап рапсгеав. у Нівіоспет. Суїоспет. 51, 697-706.

Ківїп МУМ, УУи ВР, 2Нао 5, Ми Н, Ківїп-52апію АуУ, Тапап 5А (2007). Іпстеазєейд ехргезвіоп ої віт сеїЇ также!» іп таїїдпапі теіапота. Мод. Раїйої. 20, 102-107.

Корауавнї Н, Отіуа В, Виї? М, Ниагіе Е, Загорбе Р, І азапе у, Неїтаї? М, Заподго В, Ріє У,

Воїтаз-Сиезіа Е, Сеїїв Е (2002). Ідепійісайоп ої ап апіідепіс ерйоре ог НеІрег Т утрпосуїез їот сагсіпоетбгуопіс апіїдеп. Сіїп Сапсег Рез. 8, 3219-3225.

Копо Т, 5пПітода М, ТаКканавзпї М, Маїзитою К, Мовпітоїо Т, Мігшапі М, Табата С, ОКовні К,

Мада Н, Киро Н (2007). ІттипопПівіоспетіса! деїесіюп ої Ше ІутрНаїїс тажег родоріапіп іп дімегзе їурев ої пПитап сапсег сеї и5іпа а помеї апіїбсау. Іпі у) Опсої 31, 501-508.

Козагі Е, РагКкег А5, Кибе ОМ, Гойзе СМ, І еіромісп ВС, Віше МІ, СпеміПе ОС, Мавтаїгіб5 о (2005). Сівєаг сеї! гепаї! сеї! сагсіпота: депе ехргезвіоп апаїузе5 ідепійу а роїепійа! відпайште ог їмтог адагеззімепевз5. Сііп Сапсег Вев. 11, 5128-5139.

Ктоез ВА, Юамвоп сії, МовКаї УА (2007). Росизей тістоа!тау апаїувзів ої діусо-депе ехргезвіоп іп питап дііоріазіотав. У Меигоспет. 103 Зиррі 1, 14-24.

Ктопа А, Атап Р, ОгпааіІ С, Чдозеїввоп А (2007). Опсозіаййп М-іпдисед депе5 іп питап авігосуїютазв. Іпі. У Опсої 31, 1457-1463.

Киспагсгак У, Раппедиіп У, Сатбу І, ОєсаезівскКег С, Ків5 В, Мапіпе? У (2001). Савініп іпдисев омег-ехргезвіоп ої депев іплоїмейд іп питап ОЗ37З дііобіазіота сеї! тідгайоп. Опсодепе 20, 7021- 7028.

Кисиг М, Івтап ЕК, Ваїсі С, Опаї В, Насірекігтодіи М, О2;Кап Е, О2Кап А (2008). бБегит УКІ -40

Іємеіє апа сппоїміовідазе асіїмпу аз роїепіа! Біота!Кег5 іп ргітагу рговіаїє сапсег апа репідп ргозіаїйс пурегріазіа. Огої. Опсої 26, 47-52.

Китінага Н, 7ата А, Татига М, ТакКеда .), Зазакі Т, ТаКеисні Т (2000). СПіота/аійобіавіота- зресіїйс адепоміга! депе ехргезвіоп ивіпа їпе певіїп депе гедшаюг. Сепе ТНег. 7, 686-693.

Га А, Реїегв Н, 5І СВ, Нагооп 2А, Оеулпігзі ММУ, Зігаизрега ВІ, Каапаегв УН, мап дег Кодеї

Ау, Віддіпв СУ (2001). Тгапвстгіріїопа! гезропвзе о Пурохіа іп питап їштогв5. У Маї!. Сапсег Іпві. 93, 1337-1343.

Геттеї! С, МеїкК 5, Ебепе І, Оепдіє! У, Кгаїї Т, ВесКег НО, Наттепзее На, 5іємапоміс 5 (2004). ОїйМегепіа! доапійайме апаїузіз ої МНС Іїдапавз ру тав5 зресіготеїгу ивзіпу віабіє ізоїюре

Іабеїїпд. Маї. Віоїесппої. 22, 450-454.

Іепаані 0, йіттептап ІВ, МесКау ВО (1990). СМ5 5іет сеї ехрге5з5 а пем/ сіабз5 ої іпіептедіате Патепі ргоївіп. Сеї! 60, 585-595.

ЦІ ОМ, Мапа Н, Мау 5, 5опо Х, Риєуо У, Ешег М, УУапо Н (2008а). Сопвійшіме асіїмайіоп ої с-

Уцп М-їеттіпаї! Кіпазе согтеїаїев м/йй Нівіоіодіс дгаде апа ЕСЕ ехргезвіоп іп айиве діотав. /

Мепгоопсої. 88, 11-17.

ЦІ, Хи Н, зрашцаїпу ВО, Спепо Г, 5ітоп В, Мао ЛІ, аї Запгадпезе РА, Воште РА, Ниапа / (20085). Ехргезвіоп ої АМА-ріпаїпу ргоївіп ІМРЗ (КОС) іп репідп игоїпеїшт апа игоїпеїа! (тогв.

Нит. Раїної.

ШЦапо МІ, Ма у), Но М, 5оіотоп І, ВошМеї Е, КшкКа УТ, Намжм/Кіп5 С (2008). Тугозіпе Кіпазе ехргезвіоп іп редіайніс підй дгаде азігосуїюта. У Меигоопсо!. 87, 247-253.

Папа мМ, ВоПеп АМУ, АІдаре КО, Сиріа М (2006). Мисівєаг БАВР7 іттипогеасімйну ів ргеїєгепійайу ехргезбзей іп іпіійгайме діота ап іє авззосіаїєй м роог ргодпозів іп ЕСЕВ- омегехргезвіпу аіобіазіота. ВМО. Сапсег 6, 97.

Папа У, Оіепп М, УМаїбзоп М, Воїеп АМУ/, АіІдаре КО, Міспоїаз МК, Гатброгп КА, Вегдег М5,

Воївівїп 0, Вгомуп РО, Івгаєї МА (2005). Сепе ехргевзвіоп ргоїїїпуд гемеа!5 тоїІесшапу апа сіїпісау дівііпсі зибіурез ої аіобіазіота типйпопте. Ргос. Маї!. Асад. 5сі. Ш. 5. А 102, 5814-5819.

Мао В, Ни М, Неттіск БУ, Вгежег С (2005). Тне АМА-бріпаїпо ргоїєїп ІМР-З3 і5 а гапвіайопаї! асіїмаютг ої іп5цп-ЇКе дгоули Тасіог ІЇ Ігєадеї-3 тАМА аигіпд ргоїїегайоп ої питап К562 ІвиКетіа сеїІв. У Віої. Спет. 280, 18517-18524.

І Шаца ВА, ТаКкеда А, Сти У, Еппі5 ЕА (1992). Массіпіа мігив-зресіїйс питап СО4-нсуїююхіс Т-

ІутрПосуїе сіопезв. У Міго!. 66, 2274-2280.

Ши М, Раїкег ВМ, бабу К, Еуге НУ, Сореїапа Ма, Стамлога У, сійрей 0, Ззйшпепапа ав,

УепКіп5 МА, Нег209 Н (1999). РАБ, а помеї! зестеїйп-їКе питап Сі-ргоївіп-соирієй гесеріог депе.

Сепотісв 55, 296-305.

Пи 5, Сіпевіїєї С, СНагате-Чашнтеї Е, Росо Н, Ківег СО, Мегаїмег 50, Бопіш С, Місна М5 (2008). ВАСА!1 гедиіаіе5 питап таттагу 5іет/ргодепіюг сеї! Таїє. Ргос Маї). Асад. 5сі. 0. 5. А 105, 1680-1685.

Ци МУ, Ршпат А, Хи-мМи 7, 5201 СІ, Ї ее МА, 2Ни 5, СоцієБ РА, Каргапом Р, Сіпдегаз ТВ, де

ЗІ Стгоїйп ВЕ, СіІаубегдег С, Зорег ОМ, 2іедієг ЗЕ, Віневзіопе ЗА (2006ба). СО127 ехргезвіоп іпмегзеїу соїтеЇаіїез м/ййп ГохРЗ апа зирргезвіме Тпсіоп ої пПитап СО4(-) Т гед сеїІв. У Ехр. Мей 203, 1701- 1711.

Пи Х, Спеп М, Мапд Х, Не М, Спеп Х, Ниапуд М, Міп МУ, 7йои О (20065). Ароріовів апа рооїїегайоп тажегв5 іп айшивеїу іп'йгайпд авзігосуїотав: ргоїйййпу ої 17 тоіІесшціе5. / Мепгораїної.

Ехр. Меипгої. 65, 905-913.

Го МІ, Зіаірапо 5, Раппопе сії, Мідподпа МО, Магіддіо А, Замаюге С, Спіейі Р, Тгатопіапо 0,

Ое Ва, АМіетгі ОС (2001). Ехргеззіоп ої Ше ароріовів іппібйог вигміміп іп аддгеззіме занатоиз сеї! сагсіпота. Ехр. Мої. Раїйої. 70, 249-254.

ГирепзкКу ІА, Могітеуег АОС, Кіт 5, І опзег КК, Рак ОМ, ІКеігі В, Гї У, ОКатоїйо Н, Умаїбгіаде 5,

ВузсНиКем/їзсй С, Маїйог Е, Оіатієїй ЕН, 7пиапа 2 (2006). Ідепійїісайноп ої Штог ргесигзог сеїЇв іп їйе

Бгаїнз ої ріітаїез улИй гадіаноп-іпдисейд де помо діоюбіазіюта тийпопте. Сеї! Сусіє 5, 452-456.

Масн В, 5ієїтіе М, Мапіпе2-5огпа Е, Вейй М/ (1996). Ведшіаїйоп ої МНС сіавзз ІЇ депев: Іе550п5 їгот а дізеазе. Аппи. Нему. Іттипої. 14, 301-331.

Маадегпа Е, ЗаІтаодді А, Саїаг277010о С, І ітідо Ї, Роїо В (2007). Мезііп, РОСЕАВБеїа, СХСІ 12 апа МЕСЕЕ іп Сііота Раїепів: ОіМегепі Ргоїйез ої (Рго-Апдіодепіс) Моієсше Ехргеззіоп Аге Веїаївй м/п Титог Стаде апа Мау Ргоміде Ргодпозвіїс Іпіоптаїйоп. Сапсег Віо!. ТНег. 6.

Зо Мапйіатакі ЕН, Вапипа М, Таппег М, Согипома ГІ, Нодіюйпа М, Каїи НВ, КаїЇопієті А (2002).

Егедиепі атрійісайоп ої 8д24, 1 Ід, 174, апа 20д-5ресіїйс депе5 іп рапсгеєаїйс сапсег. Сепев5

Спгото5отев. Сапсег 35, 353-358.

Маїснегек С, Спа М, бівмапоміс 5, Наттепзеє НО, Упа С, Меїтв А (1994). Апаїузів ої апПеІе-5ресіїіс сопіасі 5ітез5 ої пашгта! НІГ А-ОНІ17 Ідапав. / Іттипої. 753, 1141-1149.

Мапісі 5, 2Шгпіоіо Т, Ітго МА, Наттег .), Зіпідадііа Е, Морреп С, Зрадпоїї С, Маг2і В, ВеПопе

М, ОеІаропа Р, Ргойі МР (1999). Меіапота сеї ргезепі а МАСЕ-3 еріюре ю Ср) суїюхіс Т сеїїв іп азбзосіайоп м/їй пПівіосотрайрії у ІеиКосуїеє апіїдеп ОНІ11. ) Ехр. Меса 189, 871-876.

Мао У, 2пои Г, 2пи МУ, Умапу Х, Мапо с, Хіє І, Мао Х, діп К (2007). РгоїїГегайме «чашве ої Штог вівт сеї тау ре соїтеїаіїєд м/п таїїдпапсу агаде ої пПитап азігосуютав. Егопі Віовсі. 12, 2252- 2259.

Маг2о АГ, Кіппеаг ВЕ, І аКке КА, Егеїїпдег 9), Соїйп5 ЕУ, Коріпзоп ВМУ, Зсой В (2000). Титог- вресіїс СО4--ї1 сеїЇє Наме а тайог "рові-Іїсепвіпд" гоїє іп СТІ тедіаїєд апіі-штог іттипйу. у

Іттипої!. 165, 6047-6055.

Меїїаії М, Саїдега М, Раїтссо А, Аппомаггі ЇЇ, спе О (2008). Бигуміп ехргеввіоп іп діїоріазіотавх со!теїатез м/п ргоїїегайоп, риї пої м/йй ароріовів. Апііїсапсег Невз. 28, 109-118.

Мібпіта К, Каїо У, Капеко МК, Мібпікажа В, Нігобзе Т, Маївшапі М (2006). Іпстеазей ехргезвіоп ої родоріапіп іп таїїдпапі авігосуїїс їТШштог5 аз а поме! тоЇІесшаг таїКег ої таїїдпапі ргодгезвіоп. Асіа Меигораїної. 111, 483-488.

Міга В, Соїез УЕ, Сішбгеспі 00, 5!ипд В, Бйп Х, Содроці А (2007). В-ЕАВР-ехргеззіпо гадіа! діа! сеїїв: Те таїїдпапі діота сеї ої огідіп? Меоріавіа. 9, 734-744.

Міуамжакі Т, Оетига А, Оєгама М, Ми ВТ, Іде С, Мібвпікажа 5, Нопада У, Тапабе У, Тапабе Т (2004). ТІх, ап огрпап писієаг гесеріог, гедшіаїевз сеїЇ питбрег5 апа азігосуїе демеІортепі іп Те демеїоріпо геїїпа. У Мешговсі. 24, 8124-8134.

Мі2иКаті У, Копо К, Оаїдо У, ТаКапо А, Тзипода Т, Камжадисні У, МаКатига М, Еціїї Н (2008).

Оеїесійоп ої поме! сапсе!-їевії5 апіїдеп-5ресіїїс Т-сеїЇ гезропзез іп ТІЇ, гедіопа! (утри подев, апа

РВІ іп раїепів м/ййп езорнадеа! здпатоиз сеї! сагсіпота. Сапсег 5сі.

Мокпагі К, Рагівз 5, диїте-Сти І, Ріїмаї М, Стіпівете Е, Магіє У, Найм У, Кціа5 М, Воміїсий О,

Ноапд-Хиап К, ОеїЇацте УМ, Запзоп М (2005). Оїїд2 ехргезвзіоп, СЕАР, р5З апа тр Іов5 апаїувів сопігірше (о діоюота 5!йбрсіазвіїсайоп. Меигораїної. Аррі. Мешйигобіо!. 31, 62-69. бо

МокКгу У, Сі2Кома 0, Ніїр 5, Епгтапп ./), Овіегтеєїспег у, Коїаг 7, Еподіївй О (2004). Мевіїп ехргезвіоп Бу пеуму Тоттеєйд питап ріоса меззвів. 5іет СеїІв Оєм. 13, 658-664.

Могдап ВА, ЮиаІєу МЕ, Уипаеплісп УВА, Ниднез М5, Мапд УС, Зпегту ВМ, Ноуаї АЕ, Тораїїап

ЗІ, Каттиша 05, Вевійо МР, 2Непа 7, Мамі А, де Міівєз СВ, Кодегв-Егее?ег І), МамгоцикКаків 5А,

Возепрегу ЗА (2006). Сапсег Недгеввіоп іп Раїіїєпів Айег Тгтапеїег ої Сепеїїсау Епдіпеегей

Гутрпосуїев. Зсієепсе.

Могіага І, СавзіеєїІапі Р, Меагла НВ, Тові С, Оє І етта ВА, Ргосоріо ГА, Сотез А, 7агаї І, Ретіпі

З, Ассоїїа Н5 (2006). СІПТА-іпдисед МН сіавзз ІІ ехргеззіоп іп таттагу адепосагсіпота Ієадз» а Тит роїагігайоп ої Ше шШтог тістоепмігоптепі, їштог геі)есіоп, апа 5ресійс апігитог тетогу.

Сіїп Сапсег Вев. 12, 3435-3443.

Момеїїпо І, Савієїїї С, Раптіапі С (2005). А Іївііпа ої питап їштог апіїдеп5 гесодпігей ру Т сеї: Магсй 2004 ирааїе. Сапсег Іттипо!. Іттипоїнег. 54, 187-207.

Мий СІ, ВеїепозКу ВА, Вгожег МА, ВаїсНейог ТТ, І оців ОМ, біеттегї-Каспатітом АО (2005).

УКІ-40 і5 а айтегепііа! аіадповіїс тагКег ююг Нівіоіодіс зибіурев ої підн-агаде діюотав. Сіїп Сапсег

Вев. 11, 2258-2264.

Ми СІ, Майнеме ВТ, Носкіїєїй 5 (2001). Сіїа! Штог іпмавіоп: а гоїє Тог Ше иргедшіайоп апа сієалхаде ої ВЕНАВ/бгемісап. Мешйгозсіепіїві. 7, 113-122.

О'Огівсоїї Ї, Гіпенап А, Сіупе5 М (2003). Зигміміп: гої6е іп попта! сеїв апа іп раїпоіодісаї сопайіопв5. Си. Сапсег Огид Тагоеїв. 3, 131-152.

Опіке М, Заю М, Нізауцикі Т, Ітайака Н, бай 5, МУада У, Зайо К, ТаКанНазні М, Таїїгі Т,

Кипітигта Т, Могопозпі Т (2007). ІттипоПівіоспетіса! апаїувіє ої певіїпй ап с-КИ апа Пеїг відпітсапсе іп рапсгеаїйс Штотгв5. Раїйої. Іпї. 57, 589-593.

ОКада У, Ойпо С, екКкі К, Одіпо М, Кажатоїо 5, Кіт Р (2007). Сотрагізоп ої питегіса спапде ої ерідептаї! дгоуй Тасіог гесеріогї депе атопа рге-апа розігадіайоп діюта, апа адіовів, апа її5 сіїпіса! изе. Вгаіп Титог Раїйої. 24, 15-18.

Огегдет Ш (2006). Тагдеїйпод ої регісуїе5 дітіпізне5 пеомазсціаггайоп апа Іутрнапдіодепезів іп ргозіайе сапсег. Ргозіайе 66, 294-304.

Реї 7, Оєу МА, 2цідегуааг ММ, ма 2, г ї М, 5івіпрегу 5, Зтій КО, У/аїкіп5 РА (2003). Те асуІ-СоА зупіпеїазе "бибрієдит" (Ірідовіп): ТийНег спагасієгігайоп апа гоїє іп пешгопаї! Тайну асіа

Коо) реїа-охідайоп. / Віо!. Спет. 278, 47070-47078.

РеїозКкі СЕ, іп Е, 7Напд Ї, Мипуд МУК, Соїтап Н, іш У, М/о 5У, Неітрегдег АВ, ЗиКі 0,

Ргадоз М, Спапяо 5, Вагкег РО, ІП, Ешег СМ, АІдаре КО (2006). Ргодпозіїс аззосіайопз5 ої асіїмаїєй тпПодеп-асіїмаїєд ргоївіп Кіпазєе апа АКІ раїпмжауз іп діобіазюта. Сіїп Сапсег Рез. 12, 3935-3941.

Реїов5кі СЕ, МапНадап А, Маог М, Спапд ЕЇ, М/оо 5, Ссіїретп М, СоїІтап Н, Мапо Н, ГІ едоих А,

Віаійг Н, Равззе 5, УепКіп5 ВВ, АІдаре КО (2005). МКІ -40 ехргевзвіоп із аззосіаївй м/йй роогег гезропзе юю гадіайоп апа зпопег омегаї! вигміма! іп аПобіазюта. Сіїп Сапсег Рез. 11, 3326-3334.

Репаг РІ, Кпозпуотп 5, Впи5пап А, Топ ТА (1997). Іппірйіоп ої ерідепта! дгоули Тасіог гесеріог-аззосіаїедй їугозіпе Кіпазе ріоск5 діобіазіота іпмавіоп ої Ше Бгаїп. Мешгозигдегу 40, 141- 151.

Реппа А, ЕРоулег Р, Вепоїейі А, СсиНої 5, Мо55 В, МагодоізКеє АЕ, Самаїї А, Маїї А, Ріассадогї

Е, Спізагі ЕМ, . (1992). Нераййів5 В мігиз (НВМ)-5ресіїіс суюїохіс Т-сеї! (СТІ) гезропзве іп питапв: сНагасієгігайоп ої НІ А сіазв І-тезінісієдй СТІ 5 ІНаї гесодпіге епдодепоивіу зупіпезігеа. НВУ епмеіоре апіідепв. ./ Мігої!. 66, 1193-1198.

Регіз І, ТНегу М, Раше У, Заоцаї У, Іатапеспеге І, Спійоп УК, Сюогдоп-М/еекв Р, СацЦай М,

Вотеп5 М, УМ/огаєтап І, Уепіапа у, Апагівих А, дор 0 (2006). Тириїп їугозіпайоп і5 а та|ог Тасіог анесіїпу Ійе гестийтепі ої САР-СІУ ргоївіп5 аї тістоїшриїе рів епав. У) Сеї! Віої. 174, 839-849.

Реїту у, Но М, Мієго 5, 2пепо К, дасоре В, Тпогпег РБ5 (2007). Те іпіептєадіаїе Патепі певіїп ів підпІу ехргеззей іп потта! питап родосуїез апа родосуїез іп діотегціаг дібзеазе. Редіаїг. Оєм.

Раїної. 10, 369-382.

Ріезсне М, Ніідебгапаї мМ, 2ейні ЕР, Спариу В, Зсптії: М, М/шї с, Тгитрег Г, Зспгоеєгв А (2007).

Ідепійісайноп ої а рготізсиоив НІ А ОВ-гевзігісієй Т-сеї! еріоре дегімейд їтот пе іппірйог ої ароріовів ргоївіп 5зигміміп. Нит. Іттипо)ї. 68, 572-576.

Ріг2адаїйї Е, Надеприсі В, 5ієедег В, КієпкК І, РоїКегв Сі, Меїєг РУ (2002). Ідепійїсайоп ої а поме! питап огдапіс апіоп ігапзропіпа роіІуреріїде аз а підп айіпйу (пугохіпе ігапзрогпіег. Мої.

Епадостіпої. 16, 2283-2296.

Ргуог Ус, Войгтте РА, Мапуд ОО, брацідіпд ВО, бсой СА, Хи Н (2008). ІМР-З ів а помеї ргодгезвзіоп таїКег іп таїдпапі теіапота. Маоа. Раїпої. 21, 431-437.

Ригом/ В, З,ипадагезап ТК, ВигаїскК МУ, Кеїаз В, Сотеаи ГІ, Намккіпзоп М, зи О, Койіагом У, І ве

У, папу М, Ріпе НА (2008). Моїсп-1 Недшіаїевз Тгапзсгіріоп ої Ше Еріденпта! Стоули Расіог 60 Весерюг Тигоцон роз. Сагсіподепезвів.

Оіп 72, ВіапКепвівїп Т (2000). СбО04-1 сеїІ-теадіаїєд їштог ге|есіоп іпмоїме5 іппібйіопо ої апдіодепевзів Шаї іє дерепдепі оп ІЕМ датта гесеріог ехргезбвіоп Бу поппетаїйороїіеїїс сеїЇ5.

Іттипіу. 12, 677-686.

Оіп 27, ЗспугапгКорії у, Ргадега Е, Каттепоепз Т, Зеїїдег В, РігсНег Н, ВіапКепвівіп Т (2003).

А спііса| гедцігетепі ої іпїепегоп датта-тевдіаїей апдіовіавзів Тог Штог геіесіоп Бу СО8--Т сеїІв.

Сапсег Невз. 63, 4095-4100.

Опагапіа М, ОімеїЇа В, Оапієїе А, бі Т5, Меппеті МТ, І ої І, Ттоссоїї сх (2007). Еріденптаї! дгоУли

Тасіог гесеріог зегит Іємеї!в апа ргодпозвіїйс маїЇшце іп таїїдпапі діотав. Гитотгі 93, 275-280.

Ваттепзее На, Васптапп /), ЕЄттегіспн МР, Васпог ОА, 5іемапоміс 5 (1999). 5МЕРЕЇТНІ: дагаразе ог МНО Іідапаз апа реріїде тоїйїв. Іттиподепеїсв 50, 213-219.

Ваттепзевеє, Н.С., Васптапп, у)., апа біємапоміс, 5. (1997). МНО І ідапаз апа Рерііде Моїїйїв.

Зргіпдег-Мепад, НеїдеїІрего9, Септапу).

Ваттепзее НО, Нгієде Т, 5іємапоміїс 5 (1995). МНО Іїдапавз апа реріїде тоїіїв: ПЙгві Іівііпд.

Іттиподепеїісз 41, 178-228.

АВеуа? М, Таууар М, Кнап 5А, бЗідаідне Т (2005). Сотеїайоп ої діа! трийагу асідіс ргоївіп (СЕАР) м/йЙП дгадіпд ої Те пеигодіїа! Тштоигв5. У СоїІ. Ріузісіап5 Зигу. Рак. 15, 472-475.

Віпдозпой М, Нодааї ЕМ, Чонапбзеп 95, Ріїсе РА, СПгізієпвеп ІН (2007). УКІ-40 ргоївіп ехргезвіоп іп поттаї адиї питап їіз5йе5--ап іттипопівІоспетісаї! 5ішау. У Мої. Нівюої. 38, 33-43.

Возепбрего 5А, І оїге МТ, Миші І М, Спапод АЕ, Аміз5 ЕР, І ейтап 5, І іпенап МУМ, Кобрепзоп СМ,

ІЇ еє ВЕ, Вибіп УТ, . (1987). А ргодгев5 герой оп Пе геаїтепі ої 157 раїепів мйй адмапсеа сапсег ивіпд ІутрпоКіпе-асіїмаїеай Кіїег сеїїв апа іпеплеийкКіп-2 ог підн-дозе іпіепеиКіп-2 аіопе. М. Епа). 5.

Меа. 316, 889-897.

Возепрегу 5А, РасКкага В5, Аерегзоїй РМ, боіотоп 0, Тораїйап 51, Тоу 5Т, бітоп Р, І ої276

МТ, Мапд УС, Зеірр СА, . (1988). Ове ої Штог-іпіійгайпа Іутрпосуїез апа іпіепеикКіп-2 іп Ше іттипоїНегару ої райепів м/п теїавіаїййс теіапота. А ргеїїтіпагу героп. М. Епаї. У Меа 319, 1676- 1680.

Возіїпа А, ЧУдопапзеп б, СНгізієпзеп ІМ, Ківз К, Ваївієм Е, Мієїзеп ОЇ, Вепігеп у, Ргісє РА,

Апаегзеп Е (2008). Нідй 5егит Ієме!5 ої УКІ -40 іп райепі5 м/п здиатоив сеї! сагсіпота ої Те

Неайд апа песк аге авзосіаїей м/п 5погі вигуїмаї. Іпі. У Сапсег 122, 857-863.

Зо Виї2 С, Ниапу МУ, Неді МЕ, Гапде К, Натои МЕ, Рішгі Е, ОаКеїІєу ЕУ, Спідпеї-Енгізтапп В,

Огепа с (2004). Стоули рготоїіпо 5ідпаїїпу Бу ієпазсіп-С |соїтесієді|. Сапсег Вез. 64, 7377-7385. забаїйпі Р, Реїесспіа Ї, Таміап М, Чодоп ЯМ, М, Воз5і СА, Вгошу-Воуе О (2005). Нитап

Бгопесніа! ЯПргобБіабіє ехпірйї а тезепспута! 5ієт сеїЇ рпепоїуре апа тиїШінпеаде айегепіайпад роїепійа|йіев. І ар Іпмезі 85, 962-971.

Заїаїі А, дамеггаї 5, ВеМансепе А, Ое У, Веїюо І, Савзітопомо М, Рерге? М, І оізєваи Н, ВіКЧамі А,

Надедогп М (2007). Ехрегітепіа! апіі-апдіодепевзі5 сайзе5 иргедшіайоп ої депе5 аззосіаїва м/п роог зигмімаї іп аобіазюта. Іпі. ) Сапсег. зайо Т, Агійп МТ, Ната 5, Каїїмага У, зидіуата К, Матазвакі Е, НідакКка Т, Аа К, Кигізи К (2007). Бигміміп зирсеїІШаг Іосаїїгайоп іп підп-дгаде азігосуїотав: зітинапеоив ехргезвіоп іп роїй писієн5 апа суюріаєт і5 педаїме ргодповіїс тагКег. У Мешигоопсої. 82, 193-198. закКигада К, баїпо М, Мошгі М, За А, Кіїапака С, Кауата Т (2007). Мевіїп ехргеввіоп іп сепіта! пегуоив зувієт депт сеї! тог5. Меигозига. Неу.

Запото-ВіКаїа М, Твцітига Т, Гепаданпі ОО, Міеніпеп М (2002). Рацегтп5 ої пезіїп апа оїйег іптептеаіате Пйатепі ехргезвіоп дізііпдиібп Беїм'єєп дазігоіпіезійпа! зтотаї! (тогв, Ієїотуотавз апа зспулаппотавз. АРМІБ 110, 499-507. зазакі Т, Горе5 МВ, НапКіпе СВ, Нет СА (2002). Ехргезвіоп ої 5игміміп, ап іппірйог ої ароріовів ргоївіп, іп їштог5 ої Те пегубив зузіет. Асіа Мешигораїної. 104, 105-109. зай ЕЕ, Абгапат УМ, Міп У, Кап Т, По Т, Могі М, Натійоп УР, іп 7, Снепод У, Рашп В, Вежі АТ,

Мапд 5, Зпітада У, Мейгег 5У (2006). Роіо-ІйКе Кіпазе апа 5игміїміп аге езорпадеа! Штог-5ресіїїс ротоїегв. Віоспет. Віорпуз. Не5. Соттип. 342, 465-471. зепасні М, Оайдгаз 55, допп5оп ГА, даскзоп СО, Нопу УК, Оєїтаг М (2005). Ор-гедшіайоп ої

Ше ІутрНаїййс таткег родоріапіп, а тисіп-їуре апзтетбгапе діусоргоївіп, іп пПитап здоатоиз сеї! сагсіпотаз апа дегт сеї! Титог5. Ат . Раїної!. 166, 913-921.

Зспінег О, Мапа?7а А, Татадпо І (2006). Мезіїп ехргезвіоп іп пешгоеріїнеїйа! їштог5. Мешговзсі. ей. 400, 80-85.

ЗеспіедеІ У, Мегдез А, Бійитт (с, АІрепй ЕК, Рогзіпуд М, Нупе5з М, Кіеєввзіпу М (1994).

Атрійісайоп ої Те ерідепта!-д"омН-Ттасіюг-гтесеріог депе соїтеїаїе5 м/п ашегепі дгоуУлЛи Бепаміоцг іп питап дііобіазюта. Іпі. / Сапсег 56, 72-77.

оспіеноїег В, Віейпег М, Ргезіоп-Майіп 5, Міеноїї ОО, Мангепаот у), Атвіап А, АпПІірот А, Сної

ММ, Ссіез СС, Номе СВ, І їШе У, Мепедо? Е, Вуап Р (1999). Воїе ої тедісаї! пізіогу іп Бгаїп шШтоиг демеіортепі. Незиїйв їгот їПе іпіегпайопаї адиїї бгаїп їмтоиг 5щшау. Іпі. / Сапсег 82, 155-160.

Зептій А, Сопйегіє М, УУерег М, Меуег У, Моззпег В, Гезсп КР (2003). Те Бгаїп-гресіїйїс ргоївєїп

МІ С1 ітріїсаїей іп тедаІепсернаїїс ІеникоепсернаІораїну мн зибрсопісаї сувів ів ехргеззеай іп аїа! сеїЇв іп Те титгіпе Бгаїп. Сіїа 44, 283-295.

Зспоепрегдег 5Р, Тоез ВЕ, мап а, М, Онпода В, Меїїеї С) (1998). Т-сеї! НеІр ог суююхіс Т

Іутрпосуїез із тедіатед Бу СО40-СО401. іпіегасіопв. Маїште 393, 480-483.

Зспуапграцт У, допвзоп Е, АНірот А, Ргевіоп-Мапіп 5, Гопп 5, 5одегбрегуд КС, Реуспііпд М (2003). Сопогі віцдіез ої авззосіайоп Беїмеєп зеїй-геропей айПегдієс сопайопв, іттипе-геїЇаїей діадпозез апа діюта апа тепіпдіота гізК. Ії. У Сапсег 106, 423-428.

Зспуапграцт .), допезоп Е, Апірот А, Ргезіоп-Майіп 5, МаЇтег В, Гопп 5, бодегрега К,

Ееуспііпда М (2005). Рог Ппозріаїї2айноп ог ерііеєрзу, адіареїев, апа 5ігоКе апа зиббзедиепі діота апа тепіпдіота гізК. Сапсег Еріаетіо!. ВіотагКегв Ргем. 14, 643-650. зЗепжесппеітег К, Ниапд 5, Самепее МУК (1995). ЕСЕВ депе атріїйісайоп-геатапдетепі іп питап аііоріазіотазв. Іпі. У Сапсег 62, 145-148.

Зеїпіаєїї СА, Сапоні Са, уг., ОКатоїю ОК, Апагаде М5, Сопе? МА, Мопйа Р), Гисіо-ЕТегоміс АК,

Медег І, Козетбего 5, Оба-5піпіо ЗМ, Магіе 5К, Топе Г Сх (2008). Сепе ехргезвіоп ргойе апаїувів ої ргітагу діобіазіота5 апа поп-пеоріавіїс бБгаїп їїввие: ідепійісайоп ої роїепіа! їагдеї депе5 Бу оЇїдописієоїіде тісгоаітау апа геаІ-їійте диапійайме РСВ. У Метоопсої. зЗеподаї! А, Воупюп АГ, Мошпа ВЕ, Мептешеп 55, Мопетига К5, Копієг ЕР, АІдаре НС, 5іттгеї!

СА, Митрпу СР (1998). СеїЇ ааневіоп тоїесше Міи-САМ ів омег-ехргев5зей іп питап бгаїп їштогв. пі

У Сапсег 76, 451-458. зепааї А, Віск5 5, УМаттіск У, Воупіоп АГ, Митрпу СР (1999). Апіїзепзе питап пеигодіїа геїіаїєй сеїЇ аднезіоп тоЇесшце НМі-САМ, гедисев Ше Шштогідепіс ргорепіев5 ої питап діоюбіазюта сеїв.

Апіїсапсег Незв. 19, 4947-4953.

Зпазпіанаг 5, І огепіє С, Мадамагари І, Ме!зоп А, Кио У, Ситтіпв У, Мікоїїсп К, Омег В, ЕоеєнНг

ЕО (2005). РАБ із а СРС ІПаї і5 омегехргевзеад іп діотавз апа Гпсійопв5 іп Штог сеїЇ аапезіоп.

Опсодепе 24, 1673-1682.

Ко) зпедіоск БУ), 5пеп Н (2003). Ведцігетепі ог СО4 Т сеї! НеІр іп депегаїіпу Типсіопа! СОВ8 Т сеї тетогу. Зсієпсе 300, 337-339. зЗпібанага у, Казпіта Т, Кікиснпі М, Кипійа А, Рикауата М (2006). Родоріапіп із ехргеззеай іп вирзеїв ої Штогвз ої їпе сепіга! пегуоив5 зубвівт. Мігепому5 Агеп. 448, 493-499.

Зпіп АН, Ноїапа ЕС (2006). Моїсп зідпаїпуд еппапсез певіїп ехргезвіоп іп діотав. Меоріавзіа. 8,1072-1082.

ЗПігаз А, Спеціаг 5Т, ЗПпера! М, Ва|єпагап С, Ргазадй СВ, Зпазігу Р (2007). Зропіапеои5 їапетоптайоп ої питап адий попіштогідепіс віт сеїІ5 о сапсег 5ієт сеїІ5 із апмеп Бу депотіс іпетаріїйу іп а питап тоавеї ої діобіазіюта. 5іет СеїЇв 25, 1478-1489. зповіак К, Гарип5Куу М, ЮтігепКо МУ, Маїїзпема Т, Зпатауєм М, Когитепко М, 207Шшуа У, 7еНеїпег С, Каузап М (2003). НС др-39 депе із иргедшіаїеа іп діобіавіотав. Сапсег І ей. 198, 203- 210.

Зіпай ЗК, Сіаке І, Ніае Т, Оіже5 РВ (2004а). Сапсег вієт сеїЇ5 іп пегуоив 5увівт Штогв.

Опсодепе 23, 7267-7273. зЗіпдй 5К, Сіатке ІО, Тегазакі М, Вопп МЕ, Намукіпз С, Здціге У, біїк5 РВ (2003). Ідепійісайоп ої а сапсег віт сеї іп питап Ббгаїп їштогв. Сапсег Нез. 63, 5821-5828.

Зіпай 5К, Наужкіпо5 С, СіІатке ІО, Баціге УА, Вауапі .), Ніде Т, НепКеітап ЕМ, Сивітапо МО, ріїк5 РВ (20045). Ідепійісайноп ої питап Бгаїп Штоиг іпійайпуд сеї. Майте 432, 396-401.

Зіпдап-Уазціа Н, Еттегісп МР, ВНаттепзеє На (2004). Тне Тибіпдеп арргоаси: ідепійісайоп, веїІесійоп, апа маїїдайноп ої ТШштог-аззосіаїєд НІ А рерііде5 їог сапсег Шегару. Сапсег Іттипо).

ІттипоїНег. 53, 187-195.

Зіпікома І, Мепаезе С, іш О, М/ода ВА, Ги 0, Огеззег К, Мопапіу 5, Роск КІ, Лапод 7 (2008).

ІМРЗ ргєдісі5 аддгезвіме зирепісіа! игоїНеїїа! сагсіпота ої Ше Бріадаег. Сіїп Сапсег Незв. 14, 1701- 1706.

Зіо А, Мадпивзоп КЕ, Реїєегзоп КН (2005). Аззосіайоп ої аїрпа-дузігобгеміп м/йй геогдапігіпа

ТДНІ |нпсіопв5. ) Метиьг. Віої. 203, 21-30.

Зрап РМ, Змеер ЕС, М/ієдегіпек ЕТ, ТПап-Неї)пеп МС, Мапаегз: Р, Веех ІМ, де Кок В (2004).

Зигміміп із ап іпаерепаєпі ргодповіїс также тюг гізК вігаййісайоп ої ргєаві сапсег раїепів. Сіїп

Спет. 50, 1986-1993.

Зіапайег МЕ, Оцуапду О, Рападіоїорошіов С, Мегснеге СВ, Тап В, Стеепрацт СУ, РіноКег С,

Мерот СТ (2006). Ідепійісайоп ої Моме! НІ А-А"0201-Незвігісіїеєд Еріюрез іп Весепі-Опзеї Туре 1 ріабеїіс Зибіесів апа Апіїроду-Розіїїме Неїаїїме5. Оіареїтез 55, 3061-3067. зЗіго|пік Т, Вовіапа СУ, ЗаКагіавззеп РО, Камаїаг В, Ган Т (2007). Мешга! віет сеї таїКегв, певіїп апа тизабвпі ргоївїп5, іп Те ргодгезвзіоп ої пПитап діюта: сотеїайоп ої певііп У/йй ргодповів ої райіепі зигуїма!. Зигу Меишгої!. 68, 133-143. зи М, Спеп У, Мапа Н, Мои Ї, Хи І, УМапо Х, її В, Сао І, Си М, Пп 5, Хи Н, Вгеуег МО, Нао

СМ (2007). Ехргезвіоп ої певзіїп іп Ше родосуїє5 ої поптаї апа адізвазед питап Кіапеу5. Ат У

Рпузіо! Веди. Іпіедг. Сотр РпПувзіо! 292, В1761-81767. зидамага К, Китіпага Н, Медівні М, Зайо М, МаКагаю У, Зазакі Т, ТаКешсні Т (2002). Мевіїп ав а тажег" ог ргоїГегайме епдоїШтеїїшт іп діютахєв. І аб Іпмеві 82, 345-351.

Зп б, Ми ВТ, Емапе ВМ, 5пЇ М (2007). Огрпап писієаг гесеріог ТІ Х гесгийв Півіопе деасеїуїазез іо гергез5 Мапзстгіріоп апа гедшіаїе пешгаї! віт сеї! ргоїїтегайоп. Ргос Маї!. Асад. 5сі.

Оу. 5. А 104, 15282-15287.

Зип УС, Вемап МУ (2003). Оесїесіїме СОВ8 Т сеїЇ тетогу їІом/па асшиїє іпЇесіоп мйпоці С0р4 т сеї! НеІр. бсіепсе 300, 339-342. зЗигикі Н, Каю У, КапеКо МК, ОКіга У, Магітаїви Н, Каїо М (2008). Іпдисііоп ої родоріапіп Бу тмапвтоптіпу дгоули Тасіог-реїа іп питап їргозагсота. РЕВЗ5З І ей. 582, 341-345.

Зи2иКі Т, Магипо М, Уада К, Кадама М, ЕРціїтоїю МУ, Назпітоїю М, Ілитоїо 5, Мо5Ппітіпе Т (2004). Сепеїйс апаїувзів ої питап діобіавіотав изіпд а депотіс тістоаітау зузієт. Вгаійп Титог

Раїної. 21, 27-34.

ТаКапо Т, ВесКег ГЕ (1997). ОемеІортепіаї! спапде ої Ше певііп-іттипогеасіїме тіадіїпе тарпе аіїа! вігисішге іп пПитап Бгаїпо5іет апа 5ріпаї! сога. Оеєм. Мешговсі. 19, 202-209.

Тап НМ, Пи У, Ми ЗМ, Шо Н5 (2005). Ехргезвіоп ої а поме! ароріовів іппірйог-вигміміп іп соогесіа! сагсіпота. Ууопа У Сіавігоепіегої. 11, 4689-4692.

Тапмжаг МК, сіре МА, Ноїїіапа ЕС (2002). Сепе ехргезвіоп тістгоатау апаїувів геуеа!5 УКІ -40 то Бе а роїепійа!І зегит таке" ог таїїдпапі снагасієг іп питап аіота. Сапсег Нез. 62, 4364-4368.

Тегапібпі М, Майо 7, Івпіжайа Т, Тапака М, РигиКажша К, Зеуа Т, ЗПіпії 5, Таїїії т (2007).

Ідепійісайоп ої пеомазсціайте ивіпу певіїп іп соіогесіа! сапсег. Іпі. У Опсої! 30, 593-603.

Зо Тегаїапі Т, отой Т, КипКі К, Кадеуата Т, ТаКауата Т, Ізпікажа А, О2опо 5, Могажа В (2007). Оеєїесійп ої ШМапзсетірі Тог бгаіп-їуре Тацйу Асіа-ріпаїпа ргоївіп іп Тштог апа шгпе ої райепів м/йй гепаї сеїЇ сагсіпота. Огоіоду 69, 236-240.

Тпотрзхоп ОМ, Сі ем (1985). Тне ЕСЕ гесеріог: зігисішге, тедшіайноп апа роїепійа! гоїє іп таїїдпапсу. Сапсег Зигм. 4, 767-788.

Топуата Т, І еє УМ, РоїкКе І В, Магуїп М, МеКау НО, ТгодапомувКкі У (1992). Мевіїп ехргезвіоп іп етбгуопіс питап пеигоеріїпеїшт апа іп питап пештоеріїнеїїа! шток сеїІ5. І аб Іпмевів, 303-313.

ТотрКіп ЗМ, ВКоїа РА, Мооге УС, Уепзеп РЕ (1993). А егторіит Яогоіттипоаззау ог теазигіпд Біпаїпу ої апіїдеп ю сіазз ІІ! МНС діусоргоївіпв. У Іттипої!. Меїподз 163, 209-216.

Тоїї Р, Недоїї М, Мезі Сї, Осспіпі В, Вапоіоттеї 5, Еоп?гі І, Вепеїїї Е (2005). Мевіїп ехргеввіоп іп поттаї адгепаї діапа апа адгепосопіса! ТШтотгв. Нівіої. Нісораїйної. 20, 1115-1120.

Тву|ітига Т, МакКіїзпі-Зпітобауавні С, І ипакміві .), Гепаані 0, МаКазно К, Зидінага А, Імазакі

Т, Мапо М, Матада М, Матабвніа К, ТоуозаКа А, Тегада М (2001). Ехргезвіоп ої Ше іпіептеадіаїє

ТПатепі певійп іп давігоіпіевіїпа! віготаї! їштоїв апа іпіегвійаї! сеї ої СадаІ. Ат ./ Раїпої. 755, 817- 823.

Оеєтаїзи М, ОНзаучла І, АоКаде Т, Мізпітакі К, Маїзитоїйо К, ТаКаНавні Н, Азоп 5, Тегатойю А,

Ота 5 (2005). Ргодповіїс відпіїсапсе ої Те іттипопізіоспетіса! іпдех ої зигміміп іп аіота: а сотрагаїїме 5ішау мій Ше МІВ-1 іпаех. У Мешигоопсої. 72, 231-238. мап Віїзеп УН, мап ОН, Гага І В, мап 4, М, ЕМГеппк ра, ВакКег АМ, Міпепригу АМ, Ниїгіпда ТУ, де Міє5 АНА, Тоез ВЕ (2004). Рипсеїйопа! гедшайюгу іттипе гезропзе5 адаіпві питап сапіаде діусоргоївїп-39 іп пеайй мв5. ргоіпПаттайюгу гезропзез іп Пештайіа апнгтйів5. Ргос. Маї!. Асад. 5сі.

ШО. 5. А 101, 17180-17185. мап дег Вгиддеп Р, Тгамегзагі С, Снпотез Р, Гигдціп С, Ое РЕ, Мап деп ЕВ, Кпишй А, Вооп Т (1991). А депе епсодіпу ап апіїдеп гесодпігейд Бу суїюуїс Т Іутрпосуїе5 оп а Ппитап теїіапота.

Зсієпсе 254, 1643-1647.

Мапаегміпдеп УМ, СіШага К, Оеє Гаєї МН, Меззат СА, 5спійтапп ЗМ (2002). Оівтіршіоп ої Ше іпіептедіате Патепі певіїп іп Ше тизсціагі5 ргоргіа ої Ше питап дазвігоіпіезіїпа! гасі. Сеї! Тізвие

Вез. 309, 261-268.

МееіКатр УН, іттептап АМ/ (2001). Ранцу асіа-ріпаіпо ргоїеіп5 ої пегмои5 ї55це. у Мої.

Мешпгобвсі. 16, 133-142.

МезеїзКа АН, Кидіїк Р, Се)рек Р, Змаспома Н, Мегадії! У, Гоа Т, Веїїспома У (2006). Мевіїп ехргезвіоп іп їІйе сеї! Іїпез дегімед їот дііоріавіота тийтогте. ВМО. Сапсег 6, 32.

Міаріапо М5, Ві М/І, Ріертеїієг У, НосКієїй 5, Майнеме ВТ (2005). Моме! Штог-5ресіїіс івотоптв ої ВЕНАВ/бгемісап ідепійіва іп питап таїїдпапі аіота»в. Сапсег Рез. 65, 6726-6733.

Міаріапо М5, НоскКіїєїй 5, Майпем5 ВТ (2008). ВЕНАВ/Бгемісап гедцігтез АРАМТ5-теадіаїва ргоїео|уїс сієалхаде Юю рготоїе діота іпмавзіоп. У Меитоопсо).

Мідпегоп М, Бігообапі М, Спаріго У, Оотв А, Оеєдіомаппі Сї, Могеї! 5, мап дег ВР, Вооп Т, Мап

Оеп Еупає ВУ (2004). Ап апіїдепіс реріїде ргодисеєд Бу рерійає з5ріїсіпуд іп їпе ргоїєазоте. б5сієпсе 304, 587-590.

Моді АВ, Кгорепоїег Н, Каїбаснег Н, КаїЇри5 М, Ваттепзеє На, Соїїдап УЕ, Мапіп А (1994).

Іідапа тоїйв5 ої НГА-ОАВ5"0101 апа ОАВІ171501 тоїіесшцшіев аеєїїпеаїєй їтот взеїї-рерііде5. /

Іттипої!. 153, 1665-1673.

Муацнег 5, Неїтдеп ГІ, Зспоог О, дипду Сї, Мегпеї 0, Витіпуд НУ, Ваттепвзее НО, Біємапоміс 5 (2003). Сиціпа едає: ргедеїепттіпед амідйу ої питап СО8 Т сеї ехрапаєай оп саїїбгаїєд МНеС/апії- Сра28-соаіед тісгозрНегез. ./). Іттипої. 171, 4974-4978.

Мапа УС, І міпазіопе АМ (2003). Сиціпд єдде: СО4--Ї сеї! пер сап бе еззепіа! ог ргітагу

СО8--Т сеї! тезропвзез іп мімо. ) Іттипої. 171, 6339-6343.

МУеї ІС, ЗП М, Сао В, Спеп І/.МУ, Спап у5 (2008). Мевіїп зтаї! іпіепегіпа ВМА (5івМА) гедисев сеїїЇ дгоУли іп сийигейа азігосуїта сеїІв. Вгаіп Невз. 1196, 103-112.

МУвіпвспепКк Т, СошНетапдеаз С, Зспійе М, Обептауг Е, МУанег 5, 5Зспоог О, Кигек В, І оєзег

МУ, Віспієг КН, УУегтеї 0, 5іемапоміс 5, Наттепзеє На (2002). Іпієдгаїей шпсійопа! депотісв арргоасн ог Іїе дезідп ої раїепі-іпаїмідца! апійитог массіпе5. Сапсег Вев. 62, 5818-5827.

УММіскі А, Генетрбге Е, М/іск М, Напизсй В, Кепазенкі 0, Снгівіогюгі Сх (2006). Титог іпмазіоп іп

Ше арзепсе ої еріїпеЇйаіІ-тевзепспута! ШМап5йоп: родоріапіп-тедіаїєд гетодеїйпуд ої Ше асійп суюзКеїєюп. Сапсег Сеї| 9, 261-272.

М/іпег 5, Твиї Н, Гай А, 5опа А, Гі Х, Спеипу АК, Ззатрзоп А, Аїййуап Е, ЕМога А, УЧасКомувкі а,

ВескКег 0, Запіатаїгпіа Р, ОНавні Р, бозсп НМ (2003). АшоіЇттипе ізівї аевігисіоп іп зропіапеои5 їуре 1 адіабегтез і5 пої реїа-сеї! ехсіивіме. Маї. Меса 9, 198-205.

МігапожвКа М, І ада 5, тій 5А, Сойзсепаї! РЕ (2006). СО44 аднезіоп тоїіеєсціе апа пешгоаїа!

Зо ргоїєодіусап МО2 аз іплазіме такегз ої аіота. Вгаїп Сеї! Віо!. 35,159-172.

Хі О, 7епд УМХ, М/апд НУ, Меп ОМ, Тао У, 5пат 95, Сцап ХМ (2006). Ехргезвіоп ої суюріазтіс апа писієаг Зигміміп іп ріїтагу апа зесопдагу питап дііоріавіота. Вг. ) Сапсег 94, 108-114.

Хи І, Ведит 5, Нєеат 90, Нупе5 ВО (2006). РАБ, ап аїуріса! Сх ргоївїп-соицирієд гесеріог,

Бріпавз їїззце ігапздішатіпазе, Та, апа іппірії5 теіапота їтог дгоулЛи апа теїавіавів. Ргос Маї).

Асад. осі. 0. 5. А 103, 9023-9028.

Хи І, Нупез ВО (2007). аРАБб апа Та2: розвіріє гоіе5 іп зирргезвіоп ої Тштог дгоули Бу Ше тістоєпмігоптепі. Сеї! Сусіє 6, 160-165.

Уатавнйа 5, Мазида У, Кигігакі Т, Нада У, Мигауата Т, ІКеї 5, Катеї М, ТаКепо 5, Каманага

К (2007). бБигміміп ехргеззіоп ргедісі5 еагпу гесиггепсе іп еапу-5іаде Ббгеаві сапсег. Апііїсапсег Нев. 27, 2803-2808.

Уапа у, Ргісе МА, Мецйдацег СІ, М/зоп С, Ретопе 5, Хіа Н, Іада У, бітрзоп МА, МеСапну ОВ (2004). Меіапота спопагойіп 5!йіІГТае ргоїеодіусап еппапсе5 ГАК апа ЕВК асіїмайноп Бу аївіпсі теспапівтв. / Сеї! Вісі. 165, 881-891.

Уапіївв ВК, Созаг Е, Різспег АН (2008). Ове ої ІМРЗ іп ідепійісайоп ої сагсіпота іп їїпе пеєдіє азрігайоп Біорзіез ої рапстєаз. Асіа Суші. 52, 133-138.

Мапіївв ВК, М/ода ВА, Рапдег СВ, Каїоз М, М/наіеп СЕ, Тада Н, Ападегзєп ОК, Роск КІ,

Огеззег К (2005). КОС (К потоіоду дотаїп сопіаїіпіпу ргоївіп омегехргеззей іп сапсег): а помеї! тоїесціаг таКег ІНаї дівїіпдиі5пе5 реїмееп репідп апа таїїдпапі Іебвіоп5 ої (пе рапсгеа5. Ат У

Биго Ратої. 29, 188-195.

Уее С, Тпотрзоп ЗА, Вуга 0, Відаєї! 5А, Росне Р, Сеїїз Е, Стеєпрегу РО (2002). Адоріїме Т сеї! Шегару ивіпд апіїдеп-5ресіїс СО8--Ї сеї сіопев5 їог Ше гєеаїтепі ої раїєепів м/йй теїавіаїіс теїапота: іп мімо регзівієпсе, тідгайоп, апа апійитог ейПесі ої ігапвтетеа Т сеїІ5. Ргос. Маї!. Асай. зЗсі. 0. 5. А 99, 16168-16173. уиво-Засідо А, Стапат С, Стеепівіїд УР, Вооскмаг 9А (2006). Те ацаїйу ої еріденптаї! дгомли

Тасіог тесеріог (ЕСЕР) зідпаїїпоа апа пешга! вієт сеї! рпепоїуре: сеїЇ епнапсег ог сеї! ігапетогттеї?

Ситт. Зієт Сеї! Невз. ТНег. 1, 387-394. 7апдеп І, Кпей»2 5, Мопогапи СМ, АиїКкомувКі 5, НіпКез В, Міпсе СН, Ниапод В, НКоддепаогї Му (2007). Ерепаутота депе ехргеззіоп ргоїйез аззосіаїва улій Півіоіодіса! зибіуре, ргоїїегайноп, апа 60 райенпі 5игміма!. Асіа Меигораїної. 113, 325-337.

7агетра 5, Ваггада Е, 7пи М, 5оагез М, Твапд КМ, спот ./ (1997). Ідепійісанйоп ої ап епнапсег адопіві суїюїюхіс Т ІутрПосуїе реріїде їтот питап сагсіпоетбгуопіс апіїдеп. Сапсег Везв. 57, 4570-4577. бамтосКі А, Вієта! М/ (2005). Ерідепта! дгоумли Тасіог гесеріог іп діобіазіота. Роїа

Мешгораїної. 43, 123-132. 7ен НУ, ПІ, Регту-ГаїІеу 0, ЮцаІєу МЕ, Возепбего 5А, Мапо УС (1999). Нідн аміайу СТІ 5 ог їмо веїї-апіїдеп5 детопвігаїе 5,ирепгіог іп міїго апа іп мімо апійштог ейісасу. У Іттипої. 162, 989-994. 2леп НМ, 2Напао Х, Ни Р, Мапа ТТ, Еві 7, 2Напд УМ, Ри ГА, Не Х5, Ма ЕС, Мапд ХІ. (2005). зЗигміміп ехргезвіоп апа її5 геіаййоп м/йй ргоїїегайоп, ароріозів, апа апдіодепевів іп Бгаїп діотав.

Сапсег 104, 2775-2783. 7пепдуд МУ, Мі Х, Радаге О, Ііапа 5Х, Мапе! М, Зспугап? РЕ, Лапду 7 (2008). Те опсоїевіаї! ргоївіп ІМРЗ: а помеї! БіотагКег тог епдотеїнаї взегоив сагсіпота. Ат У 5!игу Раїної. 32, 304-315. 2пои К, ЗКаїїї О (2000). Тов-аІрна дінегепііанПу гедшагевз СЕАР, мітепійп, апа певііп депе ехргезвіоп іп О-373 Ма діобріазюта сеїІв: согтеїЇайоп м/йй сеї! зпаре апа тоїййу. Ехр. Сеї! Вев. 254, 269-278. гіттептанп Г, Раїт В, Гепадані ОО, Сиппіпдапат М, МсКау В, Саміп В, Мапп ., Мавзіїєма ОП,

МеМапогп А (1994). Іпаерепаєпі гедшайогу есІетепів іп Ше певіїп депе аїгесі (аподепе ехргезвіоп то пешга! бієт сеїІ5 ог тивсіє ргесиг5ог5. Мешгоп 12, 11-24. 7іи М, бспитідї МО, Сагдіоїї ТО, Абооду К5, Віаск РМ, Саїгтоїї 5 (2006). Сііота-ргодисей ехігасеїІшаг тайїйгіх іпїнепсез бгаїп їТштог ігорізт ої питап пешга! 5ієт сеїЇІв. / Меигоопсої. 79, 125- 133. 7иКівє!ї В, Можак 5, М/уз2Ко Е, Воїе К, Самтоп5кКа І, Вагсізгему5Ка М, ВагсізгемувКкі У (2006). зЗирргезвіоп ої пПитап Бгаїп Шштог м/йй іпіепегепсе ВМА зресіїйс Гог їепазсіп-С. Сапсег Віої. ТнНег. 5, 1002-1007. 7Мемзкі Н, Абгапат Е.), Сепаси МУ, Вбапієї РВ, Мопії: МУ, МийПег В, МаПео М, Тпотавз МК,

Набепег УР (2001). МийроїепійаІ певііп-розійме 5ієт сеїЇ5 ізоїаївд їот адий рапсгеаїсс івієїв5 аіегепіаце ех мімо іпіо рапсгеаїййс епадосгіпе, ехосііпе, апа Пераїйс рпепоїурез. Оіабеїез 50, 521- 533.

Ко) ПЕРЕЛІК ПОСЛІДОВНОСТЕЙ «110» іттаїййсвз БіоїесппоЇодіеєз СТЬН 1205 Нові методи імунотерапії для лікування декількох видів пухлин, включаючи нейрональні пухлини та пухлини мозку «130»51317740ОА «1502ЕРОВ8О17305.7 -15152008-10-01 «1502ЕРОВ8О017921.1 -15152008-10-13 -15050561/105,928 -15152008-10-16 -160530 «170»5РаїепіЦп мегвіоп 3.4 «21051 21159 «212»Білок «2135Ното 5арієп5 «40051

Авп їм АвроТбкх йо Меї Твж о тТУухк Уві

«212» Білок «2135Ното зарієп5 -40052

Тух Бен Її йіз біу їі Жіе беж жи ї 5 «21053 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 40053

Гув їЇ1е Меб 315 АгчЯ їі пів 210 Уві ї В «21054 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «40054

Ре и б1іу Ар рго Рго бій БУу5 ей

Зо -21055 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 40055

Аїй Пез Ткр о Аза Тур Рко бек бі Бей ї 5 «21056 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 -40056

Тв йец тТук ЗБУ Мес їей вай ТВ їжи ї я «21057 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5

Бек Ген Авап біз без Ак Ма1і без Гев ї 5 -21058 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 -40058 їув йви бів Авр бі: Аза Тук бів Узі «21059 -211510 «212» Білок «2135Ното зарієп5 40059 дів рес Віа Малі івги бек Аню» Тук вер лів ї ї 10 -210510 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400510 їжо ТИХ вне 1 вро Уаі Уві Аїя Уа

А 5

Зо -210511 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 -400511 дип обец Аія бБіп дар без діа Тих Уді 1 5 -210512 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 -400512 вве їжи пев Ввжх піз Рхо Уві Віз Пйеу -210513

«212» Білок «2135Ното зарієп5 «400513 ав оїіє їжи бій бів тії Уді Бех Ма3 «210514 «-21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400514 їз їі бів біз бів цем Ток біз Уві «-210515 «-21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400515 пеї Уаї Уві бій Уаї ї1іе Аза біу ї3е 1 5 «-210516 «-21159 «212» Білок

Коо) «2135Ното 5арієп5 «400516 піч респ Бій Явк чів хів діз бів Узі ї 5 «-210517 «-21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400517 ех їжи Фів Зіб ди без Сім Бех Бей «-210518 -211511 «212» Білок «2135Ното зарієп5

БО -400518

Ре ей Бе Ркє бі Тк Зі деп обі бі Ки 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400519 дя ви; Аза зів біз Бев ожів зі ті

АХ го 210520 21159 «212» Білок «2135Ното 5арієп5 «400520 їУув їі Хі Беж іо бів бів Аїв цей «210521 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400521

Фі ес; Ткр о Нів Нів вів ТВжх бів УаХ і 5

Зо «210522 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400522

ТвВх їбем Уві ші їі її Уві піу чаї ї 5 «210523 21159 «212» Білок «213»5Ното зарієп5 «400523

Аіз Ммеб Твх о Зіп Бей Беви Аза бік уайї «210524 21159

«212» Білок «2135Ното зарієп5 «400524 біз їн їєх діа Бі жЖаї Бе Бе) йідх 3 5 «210525 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400525 тн Меб їжу Аів Ауч їз діа Бех лій ї 5 «210526 -211515 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400526

Жрх їжа Фі бів Бе бен ув їж. дво Аха Зі же Авіа був Аж «210527 -211515 «212» Білок «2135Ното зарієп5

Зо «400527 тТрх їжа (1 Біб Бе ем же ем йвр о бхоа Зіз же лав був Ай «210528 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400528

Бе Тпт біо її ТВх ев б1у біз ве

З їх «210529 21159 «212» Білок «2135Ното зарієп5 «400529 ів Ме дев пі бів Ре Бей бує Бей

-21159 «212» Білок «213»5Ното зарієп5 «400530 із Бгто Аз оїже від іп Кув Ре тує ї Ж

Claims

ФОРМУЛА ВИНАХОДУ

1. Пептид, вибраний з: а) пептиду, що складається з послідовності ЗЕО ІЮ МО: 14, б) пептиду згідно з (а), де згаданий пептид включає непептидні зв'язки, та в) пептиду згідно з (а), де згаданий пептид є частиною злитого білка, для застосування у виробництві лікарського засобу для лікування раку, де згаданий рак вибраний з таких: астроцитома, пілоцитна астроцитома, змішані гліоми, епендимальні клітинні пухлини, гангліогліома, гангліоцитома, гліобластома, медулобластома, нейробластома, астробластома, гермінома, олігодендрогліома, примітивні нейроектодермальні пухлини, дизембріопластична нейроепітеліальна пухлина, нейроепітеліальні пухлини невідомого походження, пухлини хороїдного сплетіння, гліоматоз головного мозку, епендимома, епендимобластома, ретинобластома і тератома.

2. Пептид для застосування за п. 1, де згаданий злитий білок містить М-термінальні амінокислоти НГА-ОК антигенасоційованого інваріантного ланцюга (Ії).

3. Активований цитотоксичний Т-лімфоцит (СТІ), одержаний згідно з /л Уго способом, що включає контактування /л мо СТІ з навантаженими антигеном молекулами МНС класу І людини, експресованими на поверхні придатної антигенпрезентуючої клітини або штучної Зо конструкції, що імітує антигенпрезентуючу клітину, протягом періоду часу, достатнього для активації СТІ. у антигенспецифічний спосіб, де згаданий антиген являє собою пептид за п. 1 (а), який селективно розпізнає клітину, що аберантно експресує поліпептид, який містить амінокислотну послідовність, зазначену в п. 1 (а), для застосування у лікуванні раку, де згаданий рак вибраний з таких: астроцитома, пілоцитна астроцитома, змішані гліоми, епендимальні клітинні пухлини, гангліогліома, гангліоцитома, гліобластома, медулобластома, нейробластома, астробластома, гермінома, олігодендрогліома, примітивні нейроектодермальні пухлини, дизембріопластична нейроепітеліальна пухлина, нейроепітеліальні пухлини невідомого походження, пухлини хороїдного сплетіння, гліоматоз головного мозку, епендимома, епендимобластома, ретинобластома і тератома.

4. Спосіб одержання антитіла, яке має здатність специфічно розпізнавати пептид, що складається з БЕО ІЮ МО: 14, який включає: - культивування клітини-хазяїна, яка експресує рекомбінантне антитіло, яке специфічно розпізнає пептид, що складається з 5ЕО ІЮ МО: 14, - виділення вказаного антитіла із вказаної клітини-хазяїна, та - очищення вказаного антитіла, яке має здатність специфічно розпізнавати пептид, що складається з БЕО ІЮ МО: 14.

5. Лікарський засіб, що містить пептид згідно з п. 1 або СТІ. згідно з п. 3, разом з придатним носієм для застосування у лікуванні раку, де згаданий рак вибраний з таких: астроцитома, пілоцитна астроцитома, змішані гліоми, епендимальні клітинні пухлини, гангліогліома, БО гангліоцитома, гліобластома, медулобластома, нейробластома, астробластома, гермінома, олігодендрогліома, примітивні нейроектодермальні пухлини, дизембріопластична нейроепітеліальна пухлина, нейроепітеліальні пухлини невідомого походження, пухлини хороїдного сплетіння, гліоматоз головного мозку, епендимома, епендимобластома, ретинобластома і тератома.

А чар яке в їх ак Ех : Я Ох зо і: ЩЕ х З : ре СТЕ тт З прут у ресор реюрср сову уккнркккрксрессиннуу В ща що ІС ВО, як 12) чай «ва 1 ме х лрнЕ УНІ в . ча ши Еш зба і: ще п й С 5 ин а В МО Я уклиникнининнннинниннини и никинанишї ка Ви зх 33 8 во В 5 БЖ я мо 058 ЕС ех жі вх я с і ТОНУ Ж ук З Ще «Бо М св З юВ : Ще що 5 за КАБ КН Ж зо ). | ям Ва їм пече Мсите вар е а Мокін Ї сечі ше не жени й пуста орел ща же як яке ще тва Во що чаю це ва скерааи з МІУ р вел также ку й Е г о ягво У х У Е Е як зектаво | в З й й ; Е І і Я Е їє шле пиши 1-й й аф-керіню совка нм з ми М а вини нин хе ЗІЖЕ я Б вою тов ВОЗ за чо чеж геізіже арипадасе хх відносна кількість Кече (піп) 7» час іхнипин)

Фіг. 1 ж - ЗЕ я їЕ З едйеех шк КІ Р? (Реобенеї й 8 ГАВРІЇ ХЗ й Е У с ж ї вок ах . . кое Е ГК ек хх вові і ЕЕ Ще ії що КУ ща В кВ КОХ 1 КЕ З Во ККУ З і і. ОАЄ ІН її. і. Е ГО, І шщ її

! . ЩІ і. : я КІ АЕКХ А хі ЗІ о . о ещ МУК ся КЗ З і Н Коза У х й : ; КЕ БІ х НЕ Н Ха І, я І Ей Н МУК щ А ЕВ . І. о . ЕВ я КЗ КІ ЧІ КХ в ша с КІ. . п п 0. 0 І Б п ЕЕ і. ТЕ г і КЕ Ж Кк ККЗ х вах о - і Ж КЗ ОБ КЗ Ж ЧК У КУ КУ і ККЗ А ІІ ще . А що А ще |і п елоретватт п і синя т щи БЕ КВУ ВЕ Же щі Н зх «в кожух ЕК Не ІНІЕ ' - ко дк кош пе . БЖ й Я ві п що пн к нн Н яке з же ше руеря Ж кеВ КІ Ж КЕ ЕХ Пежо і лах ІК! ж БАБА ШИ є КЕ НННН в ї її жаЕЕБЕК вк. ; ех ) г щи СЯ ії по Я З ї 5 ВЕ Б 5 її НІ ї У я і; х Де ЧТО: 207443 аю х ВМТ ї й МЕ : й Я «З КУ Заря «З А З : З . і Зх «З Е З хх КУ 1 З їх ХУ : ху Її З с в

:. ях і. з ве 5. ши і. мові ху ще Б ІЗ з : МКУ КЗ Б. З і : Ку КХ КУ ЕЕ й щі КЕ і 5 ОЗ ХУ я 4 ї УЗ хі КУ КЗ Я І Ух Ії щі 0: ве Кк о 0: 0. бе: ; і НІ о: 0 А Й ї ї шЕКККЕЕЕ м | І хх її У Я. З СЕЕБСЕН кВ ре ХЕ ПН ве ан; і свт БЕХ Ві п і пив шк нене ще док п ЕН ЩЕ е ит НН Поненвннн і «вище се ж ж код ЕЕ Е жк ще З що дир ї й шк ек КУ во роя і 5 З ше ні ще КК З АНЯ їЗ ся І ех х ' поп; З ще ЗЕ Ех їК 1 ЕВ й. га «фіг.

м Я кри ще КИ 0650 БІ ВБЕСО1СІ (Ргобехеї НО: 290450 зі вв х КЗ КЗ «а в в З і КЗ і КУ

, . жі о ї ЕХ : ХХ : - : Я СУЩЕ я заеї В г Я: Бе ії Н МЕ ях І КАХ МО гу : «ВЕ М Е зе їх о Е. . « З КЕ 5 Х

І. 8 а С КУ ККУ ЖЖ ЗО е - ОК СКЗ ЗУ ШЕ ЕХ Кх УЧИ ЩЕ ЕХ ЖЖ КУКОВУ ж ЗХ ЕХ ВХ МУК КУ КУ КУ м ІЗ в. в ІК АТІІ ИЕЕ 5. 302 Но ХУ УК КУ ЕЖ З ЗЕ КЗ вав 55 Я: ; ки списи УНІ мамам ПО ПАЙ ВИНИ НН НН БЕ ОжЖЕюЕе У Ж. мишки в РИ до М шк що Ж пики ее шЕБЕВЕВЕ я КТК: ЕВ ЖЕК ВЕК; кадЕнаЗиеВ Бех ВЕН хх ЕНН ВЕ. ЕЄ ев кешввим БЕПКОБУУ НА ННННННЬ Не і ЕЕ ЕЕ Бей КЕ Е ство; ЕТ: 216493 5 й ; зр вх - 210493 5 щі ВИС БІВЕЗ (Руорезої НК З -4 ВЕ «

г.

й . їх го зи З З : КУ хх іх ш ве х ж й ЕХ КУ Ї

; о. БЖ З КЗЗ в. в ю : Я КХ гаї - АХ « К ; Що: . кВ ї 5 ха х хх З ж з Ще 1. З ОК. ех о ОК: ОВ КЗ ЕК ей Ще ЕК з» Кк КУКУ КУ Аз З КК т, КЕ ЗУ м ЗКУ КУ Х ХВ: Х Ф ча я РЕ ІІІ АК ТЕН З - х ву ро А а ее КУ КК КЗЗ ХК о в як Бу Жах 5 и ХК у у сх даю МО обкл дво Мо Фо ях НЯ зерен то В о ЗЕ гк я аа р ус смик кре ве «МУ БУМ Же БЖ БОЖУ В Ве дк пт ви вве сЕБЕКБЕКВЕКи за пу с х шах х еЕ 5 5 М я НН и НН ї: К-Я Ж з І х Є 5 х - м я ЗК отв й І а ЕІ. НІ ЦИ Я НІ я іх ще

Фіг. 25 гоїайте ехргеввіст » відносна вкспресів вогепаї діа є» мадниркова запоза сщівагу Відсів» сечовим міхую опе пзагочує» кістковий молок Вгевві-» молочна залоза внегує» артерів уане» вена мАлсне Югаій ек меню, В ційОМму СПО априюєсу ває» лімфоцити СІ СЕК дапропасувви» лімфоцити СОЯ шепнзе сег шмика матки сооть товста кишка івикосуцав, зепогє з лейкоцити, дендоитні аворпациеє» стравохід пав» серце Кклеує мирка івикосуїюа» пейкоцити Бмерею печінка мало подає» пімфовузол Ши» легеня спчудгуєю нечник рапогевв" підшлункова запоза прасегтає плацента това єв простати вайчагу он» спмина заляаза вила інтелек тонкий кишщечних вк шкіра екеївів) тис скелетні м'язи врієвле селезінка вотаст щилунок Кеене сім'яник Інну» зобна залоза Кугокі-» щитовидна запоза ців матка