BRPI0920791A2

BRPI0920791A2 - imunoterapia contra vários tumores, incluindo os tumores neuronais e cerebrais

Info

Publication number: BRPI0920791A2
Authority: BR
Inventors: Trautwein Claudia; Singh Harpreet; Hilf Norbert; Schoor Oliver; Walter Steffen; Weinschenk Toni
Original assignee: Immatics Biotechnologies Gmbh
Priority date: 2008-10-01
Filing date: 2009-09-28
Publication date: 2019-12-10
Also published as: PT2341927T; PT3132801T; HRP20182151T1; HRP20200722T1; PT2172211E; UA110599C2; ES2788129T8; US10047124B2; SI2341927T1; UA125277C2; CY1121258T1; HUE030296T2; US8961985B2; RS53782B1; CA2936887C; EP2172211A1; JP6150859B2; ES2770090T3; US20100158931A1; EP3120869B1

Abstract

imunoterapia contra vários tumores, incluindo os tumores neuronais e cerebrais a presente invenção refere-se a peptídeos, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos imunoterápicos. em particular, a presente invenção refere-se à imunoterapia do câncer. a presente invenção refere-se ainda a epítopos peptídicos de célula t citotóxica (ctl) associados a tumores, sozinhos ou em combinação com outros peptídeos associados a tumores, que sirvam de ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras de respostas imunes antitumorais. a presente invenção refere-se a 30 sequências peptídicas e suas variações derivadas de moléculas hla classe i ou ii de células tumorais humanas utilizáveis em composições de vacinas para provocar respostas imunes antitumorais.

Description

PIA CONTRA VÁRIOS TUMORES, INCLUINDO OS TUMORES NEURONAIS E CEREBRAIS.

A presente invenção refere-se a peptídeos, ácidos nucleicos e células para utilização em métodos imunoterápicos. Em particular, a presente invenção se refere à imunoterapia do câncer. A presente invenção refere-se ainda a epítopos peptídicos de célula T citotóxica (CTL) associados a tumores, sozinhos ou em combinação com outros peptídeos associados a tumores, que sirvam de ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras de respostas imunes antitumorais. A presente invenção refere-se a 30 sequências peptídicas e suas variações derivadas de moléculas HLA classe I ou II de células tumorais humanas utilizáveis em composições de vacinas para provocar respostas imunes antitumorais.

Antecedentes da Invenção

Gliomas são tumores de cérebro provenientes de células gliais no sistema nervoso. As células gliais, geralmente chamadas neuroglia ou simplesmente glia, são células não neuronais que fornecem apoio e nutrição, mantêm homeostase, formam mielina e participam na transmissão de sinal no sistema nervoso. Os dois subgrupos de gliomas mais importantes são astrocitomas e oligodendrogliomas, denominados de acordo com o tipo normal de célula glial da qual eles se originaram (astrócitos ou oligodendrócitos, respectivamente). Pertencente ao subgrupo de astrocitomas, o glioblastoma multiforme (citado a partir de agora simplesmente como glioblastoma) é o tumor de cérebro maligno mais comum em adultos e é responsável por aproximadamente 40% de todos os tumores malignos de cérebro e aproximadamente 50% dos gliomas. Ele invade agressivamente o sistema nervoso central e é classificado no nível mais elevado de malignidade (grau IV) entre todos os gliomas. Glioblastomas continuam sendo incuráveis, embora haja progresso constante em seu tratamento devido a melhorias em neuroimagens, microcirurgia e diferentes opções de tratamento, tais como temozolomida ou radiação. A taxa letal deste tumor cerebral é muito alta: A expectativa de

2/153 vida média é de 9 a 12 meses após o primeiro diagnóstico. O índice de sobrevivência de 5 anos de 1986 a 1990 era de 8,0%. Até agora, o índice de sobrevivência de cinco anos depois da realização da terapia agressiva inclusive ressecção de tumor bruto - ainda é é menor do que 10%. Consequentemente, há uma forte necessidade médica de uma alternativa e método terapêutico eficaz.

As células de tumor de glioblastomas são as mais não diferenciadas entre os tumores de cérebro, pois as células de tumor têm alto potencial de migração e proliferação e são altamente invasivas, resultando em um prognóstico muito pobre. Glioblastomas levam à morte devido a um crescimento rápido, agressivo e infiltrativo no cérebro. O padrão de crescimento infiltrativo é responsável pela natureza inressectável destes tumores. Glioblastomas também são relativamente resistentes à radiação e quimioterapia e, sendo assim, os índices de recorrência pós-tratamento são altos. Além do mais, a resposta imune às células neoplásicas é basicamente ineficaz em erradicar completamente todas as células neoplásicas após a realização de terapias de ressecção e radiação.

Glioblastoma é classificado em glioblastoma primário (de novo) e glioblastoma secundário, dependendo das diferenças no mecanismo de gene durante a transformação maligna de astrócitos não diferenciados ou células precursoras gliais. Glioblastoma secundário ocorre em uma população mais jovem de até 45 anos de idade. Durante 4 a 5 anos, em média, o glioblastoma secundário desenvolve-se de um astrocitoma de baixo nível a um astrocitoma não diferenciado. Em contraste, o glioblastoma primário predominantemente ocorre numa população mais velha com uma idade média de 55 anos. Geralmente, o glioblastoma primário ocorre como glioblastoma fulminante caracterizado por progressão de tumor dentro de 3 meses a partir do estado sem anormalidades clínicas ou patológicas (Pathology and Genetics of the Nervous Systems. 29-39 (IARC Press, Lyon, France, 2000)).

Glioblastoma migra ao longo de nervos mielinizados e se expande largamente no sistema nervoso central. Na maioria dos casos ο

3/153 tratamento cirúrgico só mostra efeito terapêutico sustentável limitado.

Células malignas de glioma fogem da detecção pelo sistema imune do hospedeiro ao produzir agentes imunossupressivos que comprometem a proliferação de células de T e a produção de citoquinas imuno-estimulantes

IL-2.

Os neoplasmas intracraniais podem surgir de qualquer tipo de estruturas ou células presentes no CNS, inclusive o cérebro, meninges, glândula pituitária, crânio e mesmo do tecido embrionário residual. A incidência anual total de tumores cerebrais primários nos Estados Unidos é de 14 casos por 100.000. Os tumores de cérebro primários mais comuns são meningiomas, representando 27% de todos os tumores primários de cérebro, e glioblastomas, representando 23% de todos os tumores primários de cérebro (sendo que glioblastomas representam 40% dos tumores malignos de cérebro em adultos). Muitos destes tumores são agressivos e de alto nível. Tumores primários de cérebro são os tumores sólidos mais comuns em crianças e a segunda causa mais frequente de morte por câncer depois de leucemia em crianças.

A procura por um tratamento eficaz de glioblastomas em pacientes continua até hoje. Uma imunoterapia, ou tratamento via recrutamento do sistema imune, para combater estas células neoplásicas tem sido pesquisada. Os primeiros resultados encorajadores com abordagens imunoterapêuticas em pacientes que sofrem de glioblastoma foram obtidos pela Northwest Biotherapeutics usando DCVax Brain, uma abordagem de vacinação baseada em células que utiliza células dendríticas derivadas de pacientes e carregadas com lisados de células autólogas de tumor, e por Celldex, que utilizou um peptídeo da EGFRvIII para induzir respostas de CTL específicas de antígeno, que por sua vez está relacionado com o tempo médio de sobrevivência prolongado em relação ao tempo médio de sobrevivência obtido com o tratamento padrão (Heimberger et al., 2006).

Carcinoma colorretal

De acordo com a Sociedade Americana de Câncer, câncer colorretal (CRC) é o terceiro câncer mais comum nos EUA, afligindo mais de

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175.000 novos pacientes cada ano. Nos EUA, Japão, França, Alemanha, Itália, Espanha e Reino Unido, ele afeta mais de 480.000 pacientes. É uma das causas mais comuns de mortalidade de câncer em países desenvolvidos. A sobrevivência relativa de 1 e 5 anos para pessoas com câncer colorretal é de 84% e 64%, respectivamente. A sobrevivência continua em queda depois de 5 anos para 57% em 10 anos após o diagnóstico. Quando os cânceres colorretais são detectados em uma fase precoce, localizada, a sobrevivência de 5 anos é de 90%, no entanto, apenas 39% dos cânceres colorretais são diagnosticados nesta fase, principalmente devido às baixas taxas de triagem. Depois que o câncer se espalhou regionalmente para envolver órgãos adjacentes ou linfonodos, a sobrevivência de 5 anos cai para 68%. Para pessoas com metástases distantes, a sobrevivência de 5 anos é de 10%.

A pesquisa sugere que o princípio do câncer colorretal é o resultado de interações entre fatores herdados e ambientais. Na maioria dos casos, pólipos adenomatosos parecem ser precursores de tumores colorretais; contudo, a transição pode demorar muitos anos. O fator primário de risco para câncer colorretal é a idade, com 90% de casos diagnosticados durante a idade de 50 anos. Outros fatores de risco para câncer colorretal de acordo com a Sociedade Americana de Câncer incluem consumo de álcool, uma dieta alta em gordura e/ou de carne vermelha e uma ingestão insuficiente de frutas e verduras. A incidência continua a aumentar, especialmente em áreas tais como no Japão, onde a adoção de dietas ocidentalizadas com gordura em excesso, ingestão de carne e uma diminuição na ingestão de fibra podem ser a causa. No entanto, índices de incidência não aumentam tão rápido como anteriormente o que pode ser devido ao aumento de proteções e remoções de pólipo, prevenindo assim uma progressão de pólipos ao câncer.

Como na maioria dos tumores sólidos, o tratamento de primeira linha é a cirurgia, no entanto, seus benefícios permanecem reservados a pacientes do estágio inicial, mas uma proporção significativa de pacientes é diagnosticada em estágios avançados da doença. Para regimes avançados

5/153 de quimioterapia de câncer colorretal, regimes baseados em fluorouracila são um padrão de tratamento. A maioria destes regimes são os chamados protocolos FOLFOX (5-FU infusional/leucovorina mais oxaliplatina) e

FOLFIRI (irinotecan, leucovorina, bolus e 5 FU de infusão contínua).

A introdução de citotóxicos de terceira-geração tais como irinotecan e oxaliplatina levantou a esperança de melhorar significativamente a eficácia, mas o prognóstico é ainda relativamente pobre, e o índice de sobrevivência geralmente permanece em aproximadamente 20 meses em doença metastática e, como um resultado, as expectativas não satisfeitas nesta doença permanecem elevadas.

Recentemente uma nova geração de fármacos, agentes de alvo molecular, tais como Avastin® (Bevacizumab) e Erbitux® (Cetuximab), tornaram-se disponíveis e aproximadamente 40 compostos estão em etapa avançada de desenvolvimento clínico para diferentes estágios de câncer colorretal. As combinações de vários destes compostos aumentam o número de opções potenciais de tratamento a serem esperados para o futuro. A vasta maioria de substâncias está na fase 2, com EGFR sendo endereçado por estes compostos mais frequentemente do que por qualquer outro alvo em testes de câncer colorretal, o que é devido ao fato de que em -80% dos pacientes com câncer colorretal, a expressão de EGFR é sobrerregulada.

Testes clínicos com pacientes na etapa II combinando quimioterapia com os anticorpos monoclonais recentemente aprovados (mAbs) (cetuximab + irinotecan ou FOLFOX4; bevacizumab como um agente único ou junto com FOLFOX4) são conduzidos atualmente. Períodos de três a quatro anos de observação são esperados para resultados estatisticamente significativos destes testes.

Os anticorpos monoclonais (mAbs) atualmente usados em oncologia em geral têm uma chance excelente de não interferir na imunoterapia ativa. Na verdade, não há evidência pré-clínica (GABRILOVICH 1999) e clínica sugerindo que a depleção de VEGF (por bevacizumab) contribui positivamente para a ativação mediada por DC de células T (Osada T, Chong G, Tansik R, Hong T, Spector N, Kumar R, Hurwitz HI, Dev I, Nixon

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AB, Lyerly HK, Clay T, Morse MA. The effect of anti-VEGF therapy on immature myeloid cell and dendritic cells in cancer patients. Cancer Immunol

Immunother. 2008 Jan 10.).

Carcinoma da próstata e outros tumores

Com uma estimativa de 27.050 óbitos em 2007, o câncer de próstata é a principal causa de morte por câncer nos homens. Embora as taxas de mortalidade tenham vindo a diminuir entre os homens brancos e afro-americanos desde o início de 1990, as taxas de homens afro-americanos permaneceu mais do que o dobro das taxas nos homens brancos. O câncer de próstata é o câncer mais frequentemente diagnosticado nos homens. Por razões que permanecem obscuras, as taxas de incidência são significativamente maiores em homens afro-americanos do que nos homens brancos. As taxas de incidência de câncer de próstata têm mudado substancialmente nos últimos 20 anos: aumentou rapidamente entre 19881992, decaiu acentuadamente entre 1992-1995 e aumentou modestamente desde 1995. Estas tendências refletem em grande parte, o aumento dos testes do câncer da próstata com exame de sangue de antígeno prostático específico (PSA). Aumentos moderados das incidências na última década, mais provavelmente foram causados pelos testes de PSA frequentemente realizados entre os homens com menos do que 65 anos. Taxas de incidência de câncer de próstata têm sido estabilizadas nos homens com 65 anos e mais velhos. Taxas de pico em homens brancos em 1992 (237,6 por 100.000 homens) e homens afro-americanos em 1993 (342,8 por 100.000 homens).

Tratamento para câncer de próstata pode envolver a espera vigilante, cirurgia, radioterapia, ultrassom focalizado de alta intensidade (HIFU), a quimioterapia, a criocirurgia, a terapia hormonal, ou alguma combinação. Qual é a melhor opção depende do estágio da doença, do escore de Gleason e do nível de PSA. Outros fatores importantes são a idade do homem, sua saúde geral, e os seus sentimentos sobre os tratamentos possíveis e seus possíveis efeitos colaterais. Como todos os tratamentos podem ter efeitos colaterais significativos, como a disfunção

7/153 erétil e incontinência urinária, discussões de tratamento muitas vezes se concentram em equilibrar os objetivos da terapia com os riscos de alterações de estilo de vida.

Se o câncer se espalhou além da próstata, as opções de tratamento se alteram significativamente, a maioria dos médicos que tratam de câncer de próstata usa uma variedade de nomogramas para prever a probabilidade do câncer se espalhar. Tratamento por conduta vigilante, HIFU, radioterapia, crioterapia e cirurgia são geralmente oferecidos aos homens cujo câncer ainda permanece dentro da próstata. A terapia hormonal e quimioterapia são reservadas para as doenças que se espalharam além da próstata. No entanto, há exceções: a terapia de radiação pode ser utilizada para alguns tumores avançados, e a terapia hormonal pode ser utilizada para alguns tumores em estágio inicial. A crioterapia, a terapia hormonal, e a quimioterapia também podem ser oferecidas se o tratamento inicial falhar e se o câncer avançar.

Em um número significativo de pacientes com carcinoma de próstata submetidos à prostatectomia radical por causa da suspeita clínica de crescimento limitado ao órgão, um processamento histológico definitivo do preparo cirúrgico mostra um tumor localmente extensivo ultrapassando as fronteiras do órgão. Esses pacientes têm um risco elevado de recaída local precoce, geralmente detectável como um nível de PSA crescente em termos de recidiva bioquímica. As opções terapêuticas nesta situação incluem a radioterapia externa e a ablação hormonal, no entanto, o valor destas abordagens terapêuticas, especialmente no que diz respeito ao prolongamento da sobrevivência a longo prazo do paciente, não deve ser considerado como comprovado. Além disso, complicações associadas ao tratamento possíveis, tais como o desenvolvimento de estenoses uretrais (radioterapia), perda do libido e impotência, o risco de uma redução de sais de cálcio do esqueleto, em termos de osteoporose, e um risco significativamente aumentado de fraturas ósseas patológicas (ablação de hormônios) devem ser considerados.

Mais de 90% de todos os cânceres da próstata são detectados

8/153 nas fases locais e regionais, a taxa de sobrevivência de 5 anos em relação aos pacientes cujos tumores são diagnosticados nestes estágios se aproxima de 100%. Nos últimos 25 anos, a taxa de sobrevivência de 5 anos para todas as fases combinadas aumentou de 69% para quase 90%. De acordo com os dados mais recentes, a sobrevivência de 10 anos relativa é de 93% e sobrevivência de 15 anos é de 77%. As melhorias dramáticas na sobrevivência, especialmente de cinco anos, são em parte atribuíveis a um diagnóstico mais adiantado e melhorias no tratamento. No entanto, a taxa de sobrevivência cai significativamente após a disseminação para outros tecidos e órgãos.

Câncer de Pulmão

Estimativa 210.000 novos casos são esperados em 2007 nos EUA, representando cerca de 15% dos diagnósticos de câncer. A taxa de incidência está a diminuir significativamente nos homens, depois de uma elevação de 102 casos por 100.000 habitantes em 1984 para 78,5 em 2003. Nas mulheres, a taxa se aproxima de um patamar após um longo período de crescimento. O câncer de pulmão é classificado clinicamente como de pequenas células (13%) ou células não pequenas (87%) para os efeitos do tratamento.

O câncer de pulmão é responsável pela maioria das mortes por câncer em homens e mulheres. Estima-se que 160.390 mortes, que representam cerca de 29% das mortes por câncer, são esperadas para ocorrer em 2007. Desde 1987, mais mulheres morreram a cada ano por câncer de pulmão do que de câncer de mama. As taxas de mortalidade continuaram a diminuir significativamente nos homens de 1991-2003 em cerca de 1,9% ao ano. As taxas de morte por câncer de pulmão feminino estão se aproximando de um patamar fixo após aumentar continuamente durante várias décadas. Estas tendências da mortalidade por câncer de pulmão refletem a queda nas taxas de fumantes nos últimos 30 anos.

As opções de tratamento são determinadas pelo tipo (de pequenas células e células não pequenas) e estágio do câncer e incluem cirurgia, radioterapia, quimioterapia e terapias biológicas direcionadas, tais

9/153 como o bevacizumabe (Avastin®) e erlotinibe (Tarceva®). Para os cânceres localizados, a cirurgia é geralmente o tratamento de escolha. Estudos recentes indicam que a sobrevivência com câncer de pulmão em estágio inicial, em células não pequenas é melhorada pela quimioterapia após a cirurgia. Pelo fato da doença geralmente ter se espalhados no momento que ela é descoberta, a radioterapia e a quimioterapia são utilizadas com frequência, às vezes em combinação com a cirurgia. Quimioterapia isoladamente ou combinada com a radiação é o tratamento usual de escolha para o câncer de pulmão de pequenas células; sobre este regime, uma grande porcentagem de pacientes sofre de remissão, que é de longa duração, em alguns casos.

A sobrevivência relativa em 1 ano para câncer de pulmão aumentou ligeiramente de 37% em 1975-1979 para 42% em 2002, em grande parte devido às melhorias nas técnicas cirúrgicas e terapias combinadas. O índice de sobrevivência de 5 anos em todos os estágios é de apenas 16%. A taxa de sobrevivência é de 49% dos casos detectados quando a doença ainda é localizada, no entanto, apenas 16% dos cânceres do pulmão são diagnosticados nesta fase inicial.

Sendo assim, permanece a necessidade de uma nova opção de tratamento eficaz e seguro para o glioblastoma, tumor de próstata, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer colorretal, carcinoma de células renais claras, câncer de pulmão, CNS, ovário, melanoma, câncer de pâncreas, carcinoma epidermoide, leucemia e meduloblastoma assim como outros tumores que mostram uma superexpressão de survivina e/ou outras proteínas da presente invenção, melhorando o bem-estar dos pacientes sem o uso de agentes quimioterápicos ou outros agentes que possam provocar efeitos colaterais graves.

Sumário da invenção

Em um primeiro aspecto da mesma, a presente invenção referese a um peptídeo compreendendo uma sequência selecionada do grupo de SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 30 ou uma variante destes que é 85% homóloga a SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 30 ou uma variante destas que induzirá a

10/153 reação cruzada de células T com a variante do dito peptídeo, na qual o dito peptídeo não é o polipeptídeo de comprimento total da survivina humana.

Preferencialmente, o dito peptídeo é selecionado a partir de um peptídeo tendo um subtipo de HLA específico, como o HLA-A*02 ou HLA-DR.

Em um segundo aspecto da mesma, a presente invenção diz respeito a um ácido nucleico, codificando um peptídeo de acordo com a presente invenção, ou um vetor de expressão capaz de expressar os ditos ácidos nucleicos.

Em seu terceiro aspecto, a presente invenção refere-se a uma célula hospedeira que compreende o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a presente invenção, em que a dita célula hospedeira de preferência é uma célula apresentadora de antígeno, em particular uma célula dendrítica ou célula apresentadora de antígenos.

Em um quarto aspecto, a presente invenção refere-se a um método in vitro para a produção de linfócitos T citotóxicos ativados (CTL), que compreende contatar CTL in vitro com moléculas MHC de classe I humanas carregadas com antígeno expressas na superfície de uma célula apresentadora de antígeno adequada ou um construto artificial que imita uma célula apresentadora de antígeno por um período de tempo suficiente para ativar a CTL de uma forma específica do antígeno, no qual o dito antígeno é um peptídeo de acordo com a presente invenção.

Em seu quinto aspecto, a presente invenção refere-se ao uso de um peptídeo de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a presente invenção, a célula de acordo com a presente invenção, ou um linfócito T citotóxico ativado produzido de acordo com a presente invenção para o tratamento do câncer ou para a fabricação de um medicamento contra o câncer, em que o dito medicamento de preferência é uma vacina. Preferencialmente, o dito câncer é selecionado a partir de astrocitoma, astrocitoma pilocítica, tumor neuroectodérmico disembrioplásico, oligodendrogliomas, ependimoma, glioblastoma multiforme, gliomas mistos, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma,

11/153 gangliocitoma central, tumores neuroectodérmicos primitivos (PNET, por exemplo, meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma ependimoblastoma,), tumores do parênquima pineal pineocitoma (por exemplo, pineoblastoma), tumores de células ependimárias, tumores do plexo coroide, tumores gliais de origem incerta (por exemplo, gliomatose cerebral, astroblastoma), tumor de próstata glioblastoma, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer de cólon, câncer colorretal, carcinoma de células renais, carcinoma claro de células renais, câncer de pulmão, CNS, ovário, câncer melanoma de pâncreas, carcinoma epidermoide, leucemia, meduloblastoma, e outros tumores ou cânceres mostrando uma sobre-expressão de survivina e / ou as outras proteínas da presente invenção.

Em um sexto aspecto dela, a presente invenção refere-se a um kit, composto por: (A) um recipiente que contém uma composição farmacêutica contendo um peptídeo de acordo com a presente invenção, o ácido nucleico ou o vetor de expressão de acordo com a presente invenção, uma célula de acordo com a presente invenção, ou um linfócito T citotóxico ativado de acordo com a presente invenção, em solução ou na forma liofilizada, (b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução de reconstituição para a formulação liofilizada, (c) opcionalmente, pelo menos um peptídeo selecionado do grupo constituído de peptídeos de acordo com a SEQ ID números 1 a 30, e (d) opcionalmente, instruções para o uso da solução e / ou da reconstituição e / ou o uso da formulação liofilizada. Em uma modalidade preferida, o peptídeo é selecionado do grupo de SEQ ID No 1 a SEQ ID 24.

Em um sétimo aspecto, a presente invenção refere-se a um método para a produção de um anticorpo recombinante que se liga especificamente a um complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II complexado com um antígeno restrito de HLA, o método compreendendo: a imunização de um mamífero geneticamente modificado não humano compreendendo células expressando o dito principal complexo de histocompatibilidade humana (MHC) de classe I ou II com uma forma solúvel de uma classe de moléculas MHC de classe I ou II

12/153 sendo complexada com o dito antígeno restrito de HLA; isolamento das moléculas de mRNA de células produtoras de anticorpos do referido mamífero não humano; produção de uma biblioteca de visualização de fagos exibindo moléculas de proteína codificadas pelas ditas moléculas de mRNA, e isolamento de pelo menos um fago da dita biblioteca de exibição de fagos, o dito pelo menos um fago exibindo o dito anticorpo específico ligável ao dito complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II complexado com o dito antígeno restrito de HLA.

Em um oitavo aspecto da mesma, a presente invenção refere-se a um anticorpo que especificamente se liga a um complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II sendo complexado com um antígeno restrito a HLA, onde o anticorpo de preferência é um anticorpo policlonal, anticorpos monoclonais e / ou um anticorpo quimérico.

Sumário da invenção

Breve Descrição dos Desenhos

A figura 1 demonstra os espectros de massas por cromatografia líquida ESI identificando peptídeos associados a tumores (TUMAPs) IGF2BP3-001 da amostra de glioblastoma GB6010 que foi apresentada de uma maneira restrita a MHC de classe I.

A figura 2 mostra o perfil de expressão de mRNA dos genes alvo da invenção que são altamente superexpressos em amostras de glioblastoma. Expressão destes genes está ausente ou muito baixa em tecidos normais, embora seja fortemente aumentada nas amostras de glioblastoma. Expressões relativas de mRNA são mostradas para diversos tecidos normais e amostras de glioblastoma individual multiforma (GBM) medidas pela análise de chip do gene. Os valores são relativos aos níveis de expressão do rim normal (valor sempre arbitrariamente definido para 1.0). Os valores para os tecidos normais foram gerados com pools de mRNA comercialmente disponíveis. Letras entre parênteses indicam a chamada de detecção, como determinado pelo software de análise. A chamada de detecção designa se a transcrição foi especificamente detectada por completo na amostra ou se não pôde ser observada nenhuma detecção

13/153 significativa. Ela pode tomar os valores P (presente), A (ausente), ou M (marginalmente detectada).

Figura 3 retrata a análise de tetrâmero de proliferação de acionamento microesférico de linfócitos CD8+ específicos de CSP-001 e NLGN4X-001 do sangue periférico de um doador saudável. PBMCs enriquecidas com 1 x 10⁶ CD8+ por poço foram estimuladas semanalmente com microesferas unidas a anti-CD28 mais antígeno tumoral de alta densidade A*0201/CSP-001 (painel esquerdo) ou anti-CD28 mais antígeno tumoral de alta densidade A*0201/NLGN4X-001 (painel direito). Depois de três estímulos in vitro, todas as células foram manchadas com anticorpo CD8 FITC e tetrâmeros marcados com fluorescente A*0201/ CSP-001 e A*0201/ NLGN4X-001. As células são bloqueadas em linfócitos CD8+; os números representam a porcentagem de células no quadrante indicado entre os linfócitos CD8+.

Figura 4 mostra a afinidade de peptídeos de HLA da classe I da invenção à molécula MHC codificada pelo alelo HLA-A*0201. Constantes de dissociação (K_D) de TUMAPs HI_A de classe I da invenção e o peptídeo de controle HBV-001 (ligante A*02 forte) foram medidos por um ensaio de MHC redobrante baseado em ELISA.

Descrição Detalhada da Invenção

Como usado neste documento e salvo indicação do contrário, todos os termos são definidos como dado a seguir.

O termo peptídeo é usado aqui para designar uma série de resíduos de aminoácido, conectados um ao outro tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carbonila dos aminoácidos adjacentes. Os peptídeos têm tipicamente 9 aminoácidos de comprimento, mas podem ser tão curtos quanto 8 aminoácidos de comprimento e tão longos quanto 16 ou 10, 11, 12, 13, 14 ou 15 aminoácidos de comprimento.

O termo oligopeptideo é usado aqui para designar uma série de resíduos de aminoácido, conectados um ao outro tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carbonila dos aminoácidos adjacentes. O comprimento do oligopeptideo não é crítico para a invenção,

14/153 enquanto o epitopo ou os epítopos corretos forem mantidos nele. Os oligopeptídeos são tipicamente menores do que aproximadamente 30 resíduos de aminoácido em comprimento e maiores do que aproximadamente aminoácidos em comprimento.

O termo polipeptídeo designa uma série de resíduos de aminoácido, conectados um ao outro tipicamente por ligações peptídicas entre os grupos alfa-amino e carbonila dos aminoácidos adjacentes. O comprimento do polipeptídeo não é crítico para a invenção, enquanto o epitopo ou os epítopos corretos forem mantidos nele. Em contraste com os termos peptídeo ou oligopeptídeo, o termo polipeptídeo refere-se a moléculas contento mais do que aproximadamente 30 resíduos aminoácidos.

Um peptídeo, oligopeptídeo, proteína, ou polinucleotídeo que codifica tal molécula é imunogênico (e assim um imunógeno dentro da presente invenção), se ele for capaz de induzir uma resposta imune. No caso da presente invenção, a imunogenicidade é mais precisamente definida como a capacidade de induzir uma resposta de célula T. Assim, um imunógeno seria uma molécula que fosse capaz de induzir uma resposta imune, e no caso da presente invenção, uma molécula capaz de induzir uma resposta de célula T.

Um epitopo de célula T requer um peptídeo pequeno que é ligado a um receptor MHC da classe I ou II, formando um complexo ternário (cadeia alfa de MHC da classe I, microglobulina beta-2 e peptídeo) que pode ser reconhecido por uma célula T portando um receptor de células T correspondente se ligando ao complexo de MHC / peptídeo com afinidade adequada. Peptídeos de ligação a moléculas de MHC de classe I são tipicamente de 8 a 14 aminoácidos de comprimento, e mais tipicamente 9 aminoácidos de comprimento. Epítopos de células T que se ligam a moléculas de MHC da classe II têm tipicamente 12 a 30 aminoácidos de comprimento. No caso dos peptídeos que se ligam às moléculas de MHC da classe II, o mesmo peptídeo e o epitopo de célula T correspondente podem compartilhar um segmento de núcleo comum, mas diferem no comprimento, devido às sequências de flanqueamento de diferentes comprimentos a

15/153 montante do término amino da sequência de núcleo e a jusante do seu término carbóxi, respectivamente. Receptores de MHC da classe II têm uma conformação mais aberta, peptídeos ligados a receptores de MHC da classe II são correspondentemente não completamente enterrados na estrutura da fenda de ligação de peptídeo de molécula de MHC de classe II, à medida que eles estão na fenda de ligação de peptídeo de molécula de MHC de classe I. Surpreendentemente, este não é o caso dos peptídeos de acordo com SEQ ID NO: 1, com pequenas variações no comprimento da ligação de peptídeos para uma redução extrema de atividade (vide abaixo).

Em seres humanos, existem três diferentes locais genéticos que codificam moléculas de MHC da classe I (as moléculas de MHC do ser humano também são designadas antígenos leucocitários humanos (HLA)): HLA-A, HLA-B, e HLA-C. HI_A-A*0l, HLA-A*02, e HLA-A*11 são exemplos de diferentes moléculas de MHC de classe I que podem ser expressas a partir destes locais.

Há três locais genéticos diferentes que se codificam para moléculas de MHC de classe II: HLA-DR, HLA-DQ e HLA-DP. Receptores de MHC da classe II são heterodímeros constituídos por uma cadeia alfa e uma beta, ambas ancorando na membrana da célula através de uma região transmembrana. HLA-DRB1*04 e HLA-DRBV07 são dois exemplos de diferentes alelos MHC da classe II beta que são conhecidos por serem codificados nesses locais. Alelos de classe II são muito polimórficos, por exemplo, várias centenas de diferentes alelos HLA-DRB1 têm sido descritos. Portanto, para fins terapêuticos e de diagnóstico, um peptídeo que se liga com afinidade adequada para vários receptores diferentes HLA de classe II é altamente desejável. Um peptídeo de ligação a várias diferentes moléculas de HLA de classe II é chamado ligante promíscuo.

Como usado anteriormente, a referência a uma sequência de DNA inclui tanto um DNA de fita única como um de fita dupla. Assim, a sequência específica, a menos que o contexto indique contrariamente, se refere ao DNA de fita única de tal sequência, o dúplex de tal sequência com seu complemento (DNA de fita dupla) e o complemento de tal sequência. O

16/153 termo região de codificação refere-se a essa porção de um gene que se codifica naturalmente ou normalmente para o produto de expressão desse gene em seu ambiente natural genômico, isto é, a região codificando-se in vivo para o produto de expressão nativo do gene.

A região de codificação pode ser de um gene normal, mutado ou alterado, ou mesmo proveniente de uma sequência de DNA, ou gene, totalmente sintetizado no laboratório usando os métodos bem-conhecidos por aqueles versados na técnica de síntese de DNA.

O teimo sequência de nucleotídeos refere-se a um heteropolímero de desoxirribonucleotídeos.

A sequência de nucleotídeos de codificação para um peptídeo particular, oligopeptídeo, ou polipeptídeo pode ocorrer naturalmente ou ela pode ser construída sinteticamente. Geralmente, segmentos de DNA de codificação dos peptídeos, polipeptídeos, e proteínas desta invenção são montados de fragmentos de cDNA e ligantes de oligonucleotídeos curtos, ou de uma série de oligonucleotídeos, para fornecer um gene sintético de que é capaz de ser expresso em uma unidade transcricional recombinante contendo elementos reguladores derivados de um óperon microbiano ou viral.

O termo produto de expressão significa o polipeptídeo ou proteína que é o produto natural de tradução do gene e qualquer sequência de ácido nucleico codificando resultados equivalentes de degeneração de código genético e, desta forma, codificando para o(s) mesmo(s) aminoácido(s).

O termo fragmento, quando se refere a uma sequência de codificação, significa uma porção de DNA compreendendo menos do que a região de codificação completa, cujo produto de expressão essencialmente retém a mesma função ou atividade biológica do produto de expressão de toda a região de codificação.

O termo segmento de DNA se refere a um polímero de DNA, na forma de um fragmento separado ou como um componente maior de DNA, que foi derivado de DNA isolado pelo menos uma vez em forma substancialmente pura, isto é, livre de materiais endógenos contaminados e

17/153 em uma quantidade ou concentração que possibilita a identificação, manipulação e recuperação do segmento e suas sequências componentes de nucleotídeos por métodos bioquímicos padronizados, por exemplo, utilizando-se um vetor de clonagem. Tais segmentos são fornecidos na forma de um quadro de leitura aberto ininterrupto por sequências internas não traduzidas, ou introns, que estão tipicamente presentes em genes eucarióticos. As sequências de DNA não traduzidas podem estar presentes a jusante do quadro de leitura aberto, onde o mesmo não interfere com a manipulação ou expressão das regiões de codificação.

O termo iniciador significa uma sequência de ácido nucleico curta que pode ser correlacionada a uma fita de DNA e fornece uma extremidade 3ΌΗ livre, no qual uma DNA polimerase começa a síntese de uma cadeia de desoxirribonucleotídeo.

O termo promotor significa uma região de DNA envolvida na ligação de RNA polimerase para iniciar a transcrição.

O termo quadro de leitura aberto (ORF) indica uma série de tripletos codificando para os aminoácidos sem quaisquer códons de terminação e é uma sequência (potencialmente) traduzível para a proteína.

O termo isolado significa que o material é retirado de seu ambiente original (por exemplo, o ambiente natural, se ele ocorre naturalmente). Por exemplo, um polinucleotídeo que ocorre naturalmente ou presente em um animal vivo não é isolado, mas o mesmo polinucleotídeo ou polipeptídeo - separado de alguns ou todos os materiais que coexistem no sistema natural - é isolado. Tais polinucleotídeos poderíam ser parte de um vetor e/ou tais polinucleotídeos ou polipeptídeos poderíam ser parte de uma composição, e ainda serem isolados em tal vetor ou composição, que não faz parte do seu ambiente natural.

Os polinucleotídeos, e polipeptídeos recombinantes ou imunogênicos, descritos de acordo com a presente invenção, também podem estar em forma purificada. O termo purificado não exige pureza absoluta; e sim é pretendido como uma definição relativa, e pode incluir preparações que sejam altamente purificadas ou preparações que sejam somente parcial

18/153 mente purificadas, como aqueles termos são entendidos pelos profissionais da área relevante. Por exemplo, clones individuais isolados de uma biblioteca de cDNA que foram purificados de maneira convencional para homogeneidade eletroforética. A purificação do material inicial ou material natural para ao menos uma ordem de magnitude, preferivelmente duas ou três ordens e, mais preferivelmente, quatro ou cinco ordens de magnitude é expressamente contemplada. Além do mais, o polipeptídeo reivindicado que tem uma pureza preferivelmente de 99,999%, ou ao menos 99,99% ou 99,9%; e ainda desejavelmente 99% em peso ou maior é expressamente contemplado.

Os ácidos nucleicos e produtos de expressão de polipeptídeo descritos de acordo com a presente invenção, bem como vetores de expressão contendo esses ácidos nucleicos e/ou polipeptídeos, podem estar em forma enriquecida. Como usado aqui, o termo enriquecido significa que a concentração do material é pelo menos aproximadamente 2, 5, 10, 100, ou 1000 vezes maior do que a sua concentração natural (por exemplo), vantajosamente 0,01 %, em peso, preferivelmente pelo menos aproximadamente 0,1% em peso. Preparações enriquecidas de aproximadamente 0,5%, 1%, 5%, 10%, e 20% em peso também são contempladas. As sequências, construtos, vetores, clones, e outros materiais compreendendo a presente invenção podem vantajosamente estar em forma enriquecida ou isolada.

O termo fragmento ativo significa um fragmento que gera uma resposta imune (isto é, tem atividade imunogênica) quando administrado, sozinho ou opcionalmente com um adjuvante conveniente, a um animal, tal como a um mamífero, por exemplo, um coelho ou um camundongo, ou também um ser humano, tal resposta imune tomando a forma de estimular uma resposta de célula T dentro do animal recipiente, tal como um ser humano. Alternativamente, o fragmento ativo também pode ser usado para induzir uma resposta de célula T in vitro.

Conforme utilizado aqui, os termos porção, segmento e fragmento, quando utilizado em relação aos polipeptídeos, referem-se a

19/153 uma sequência contínua de resíduos, como resíduos de aminoácidos, que formam um subconjunto de sequência maior. Por exemplo, se um polipeptídeo fosse submetido ao tratamento com qualquer uma das endopeptidases comuns, tal como tripsina ou quimiotripsina, os oligopeptídeos resultantes de tal tratamento representariam porções, segmentos ou fragmentos do polipeptídeo iniciais. Isto significa que qualquer fragmento conterá necessariamente como parte de sua sequência de aminoácidos, um segmento, fragmento ou porção, que é substancialmente idêntico, se não exatamente idêntico, a uma sequência de SEQ ID NO: 1 a 30, que correspondem às proteínas que surgem naturalmente, ou proteínas mãe, de SEQ ID NO: 1 a 30. Quando usado em relação a polinucleotídeos, tais termos referem-se aos produtos produzidos por tratamento dos ditos polinucleotídeos com qualquer uma das endonucleases comuns.

De acordo com a presente invenção, o termo identidade percentual ou porcento idêntico quando se refere a uma sequência, significa que uma sequência é comparada com uma sequência reivindicada ou descrita depois do alinhamento da sequência a ser comparada (a Sequência Comparada) com a sequência reivindicada ou descrita (a Sequência de Referência). A Identidade Percentual é então determinada de acordo com a seguinte fórmula:

Identidade percentual = 100 [I -(C/R)] onde C é o número de diferenças entre a Sequência de Referência e a Sequência Comparada sobre o comprimento de alinhamento entre a Sequência de Referência e a Sequência Comparada, na qual (i) cada base ou aminoácido na Sequência de Referência que não tem uma base ou aminoácido correspondente alinhado na Sequência Comparada e (ii) cada lacuna na Sequência de Referência e (i) cada base ou aminoácido alinhado na Sequência de Referência que seja diferente de uma base ou aminoácido alinhado correspondentemente na Sequência Comparada, constitui a diferença;

e R é o número de bases e aminoácidos na Sequência de

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Referência sobre o comprimento de alinhamento entre a Sequência Comparada com qualquer lacuna criada na Sequência de Referência também considerada como uma base ou um aminoácido.

Se um alinhamento existe entre a Sequência Comparada e a Sequência de Referência para as quais a identidade percentual como calculada acima é aproximadamente igual ou maior do que um mínimo especificado como Identidade percentual, então a Sequência Comparada tem o mínimo especificado à Identidade percentual mesmo que os alinhamentos possam existir, sendo que a Identidade percentual calculada acima é menor do que a Identidade percentual especificada.

Os peptídeos originais descritos aqui podem ser modificados pela substituição de um ou mais resíduos em áreas diferentes, talvez seletivas, dentro da cadeia peptídica, se não contrariamente determinadas. Tais substituições podem ser de uma natureza conservadora, por exemplo, onde um aminoácido é substituído por um aminoácido de estrutura e características semelhantes, tal como onde um aminoácido hidrofóbico é substituído por outro aminoácido hidrofóbico. Ainda mais conservador seria a substituição de aminoácidos do mesmo tamanho ou tamanho semelhante e natureza química, tal como quando uma leucina é substituída por isoleucina. Em estudos de variações de sequência em famílias de proteínas homólogas que ocorrem naturalmente, algumas substituições de aminoácidos são mais toleradas do que outras, e estas muitas vezes mostram correlação de semelhanças em tamanho, carga, polaridade e hidrofobicidade entre o aminoácido original e sua substituição, e essa é a base para a definição de substituições conservadoras.

Substituições conservadoras são aqui definidas como trocas dentro de um dos cinco seguintes grupos: Grupo 1 - resíduos pequenos, alifáticos, não polares ou levemente polares (Ala, Ser, Thr, Pro, Gly); Grupo 2 - resíduos polares, carregados negativamente e suas amidas (Asp, Asn, Glu, Gin); Grupo 3 - resíduos polares, carregados positivamente (His, Arg, Lys); Grupo 4 - resíduos grandes, alifáticos, não polares (Met, Leu, He, Vai, Cys); e Grupo 5 - resíduos grandes, aromáticos (Phe, Tyr, Trp).

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Substituições menos conservadoras talvez envolvam a reposição de um aminoácido por outro que tenha caracteristicas semelhantes, mas é um pouco diferente em tamanho, tal como a substituição de uma alanina por um resíduo de isoleucina. Substituições altamente não conservadoras, talvez envolva substituir um aminoácido acídico por um que seja polar, ou mesmo para um que seja básico em caráter. Tais substituições radicais não podem, no entanto, ser menosprezadas como potencialmente ineficazes, pois efeitos químicos não são totalmente previsíveis e substituições radicais também poderão resultar em efeitos esplendidos, contrariamente não previsíveis de princípios químicos simples.

Naturalmente, tais substituições podem envolver estruturas diferentes dos L-aminoácidos comuns. Assim, D-aminoácidos talvez podem ser substituídos pelos L-aminoácidos geralmente encontrados nos peptídeos antigênicos da invenção e mais ainda ser abrangidos pela descrição aqui a seguir. Além do mais, aminoácidos possuindo grupos R não padrão (isto é, grupos R diferentes daqueles encontrados nos 20 aminoácidos comuns de proteínas naturais) também podem ser usados para propósitos de substituição para produzir imunógenos e polipeptídios imunogênicos de acordo com a invenção presente.

Se for determinado que substituições em mais de uma posição resultam em um peptídeo com atividade antigênica substancialmente equivalente ou maior conforme definido abaixo, então as combinações dessas substituições serão testadas para determinar se as substituições combinadas resultam em efeitos aditivos ou sinergísticos sobre a antigenicidade do peptídeo. Na maioria dos casos, não mais de 4 posições dentro do peptídeo seriam simultaneamente substituídas.

O termo resposta de célula T significa a proliferação e ativação específica de funções efetoras induzidas por um peptídeo in vitro ou in vivo. Para CTLs restritos a MHC da classe I, as funções efetoras podem ser lise de células alvo que apresentam peptídeo de forma natural, peptídeopulsada, ou peptídeo-precursor-pulsada, secreção de citoquinas, preferivelmente Interferon-gama, TNF-alfa, ou IL-2 induzidos por peptídeo,

22/153 secreção de moléculas efetoras, preferivelmente granzimas ou perforinas induzidas por peptídeo, ou degranulação. Para células T auxiliares restritas a MHC da classe II, as funções efetoras podem ser secreções induzidas por peptídeo de citoquinas, preferivelmente, IFN-gama, TNF-alfa, IL-4, IL5, IL10, ou IL-2, ou degranulação induzida por peptídeo. Possíveis funções efetoras para CTLs e células T auxiliares não são limitadas a esta lista.

Preferivelmente, quando os CTLs específicos para um peptídeo de SEQ ID NO: 1 a 30 são testados contra os peptídeos substituídos, a concentração peptídica em que os peptídeos substituídos realizam a metade do aumento máximo em lises relativas ao antecedente não é mais do que aproximadamente 1 mM, preferivelmente não mais do que aproximadamente 1 μΜ, mais preferivelmente não mais do que aproximadamente 1 nM, e ainda mais preferivelmente não mais do que aproximadamente 100 pM, e em sua maioria preferivelmente não mais do que aproximadamente 10 pM. Também é preferido que o peptídeo substituído seja reconhecido por CTLs de mais de um indivíduo, ao menos dois, e mais preferivelmente três indivíduos.

Assim, os epitopes da presente invenção podem ser idênticos aos epítopo s associados a tumores ou específicos de tumores que ocorrem naturalmente ou podem incluir epítopo s que se diferem por não mais de 4 resíduos do peptídeo de referência, contanto que eles tenham atividade antigênica substancialmente idêntica.

A estimulação da resposta imune depende da presença de antígenos que sejam reconhecidos como estranhos pelo sistema imune do hospedeiro. A descoberta da existência de antígenos associados a tumores agora levantou a possibilidade de usar um sistema imune do hospedeiro para fomentar uma resposta imune que seja específica para antígenos alvo expressos na superfície de células de tumor e que por este mecanismo de ação seja capaz de induzir regressão, estase ou crescimento de mais lento do tumor. Vários mecanismos de aproveitamento das armas humorais e celulares do sistema imunológico estão sendo explorados atualmente na imunoterapia do câncer.

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Alguns elementos específicos da resposta imune celular são capazes de reconhecer e destruir células tumorais. O isolamento de células T citotóxicas (CTL) a partir de populações celulares que se infiltram no tumor ou, a partir do sangue periférico, sugere que essas células desempenham um papel importante nas defesas imunes naturais contra o câncer (Cheever et al., 1993; Zeh, III et al., 1999). Baseado na análise de 415 espécimes de pacientes sofrendo de câncer colorretal, Galon et al. puderam demonstrar que tipo, densidade e localização de células imunes em tecido de tumor são realmente um melhor prognosticador para sobrevivência de pacientes do que o largamente utilizado estadiamento de TNM de tumores. (Galon et al.,

2006).

Peptídeos presentes em MHC da classe I que resultam de divagem de proteolítica de proteínas predominantemente endógenas, DRIPs e peptídeos maiores. Moléculas de MHC da classe II podem ser encontradas predominantemente em células apresentadoras de antígenos profissionais (APCs) e peptídeos presentes provenientes principalmente de proteínas exógenas ou transmembranas que são ocupadas por APCs durante o curso de endocitose, e transformadas posteriormente (Cresswell, 1994). Os complexos de peptídeo e moléculas de MHC de classe I são reconhecidos por linfócitos T citotóxicos CD8 positivos suportando o TCR apropriado (receptor de células T) e complexos de peptídeo e moléculas de MHC de classe II são reconhecidos por células T auxiliares CD4 positivas suportando o TCR apropriado. Sabe-se bem que o TCR, o peptídeo e o MHC estão assim presentes em uma quantidade estequiométrica de 1:1:1.

As células T auxiliares CD4 positivas fazem um papel importante em induzir e apoiar respostas eficazes por células T citotóxicas CD8 positivas. (Wang e Livingstone, 2003; Sun e Bevan, 2003; Shedlock e Shen, 2003). Inicialmente, a preparação e a expansão de CTLs nos gânglios linfáticos são apoiadas por células T CD4 + (Schoenberger et al., 1998). Um mecanismo, portanto, poderia ser a orientação de células CD8 + para o local de células T CD4+ funcionais de interação APC (Castellino et al., 2006). Finalmente, a geração de células de memória funcional CD8 + está na

24/153 maioria dos casos, dependente da assistência de células T CD4 + (Sun e Bevan, 2003; Janssen et al., 2003). Por estas razões, a identificação de epítopos de células T positivas para CD4 derivados de tumor associados a antígenos (TAA) é de grande importância para o desenvolvimento de produtos farmacêuticos para desencadear respostas imunes antitumorais (Kobayashi et al., 2002; Qin et al., 2003; Gnjatic et al., 2003). No local do tumor, as células T auxiliares apoiam um meio de citocina CTL amigável (Qin e Blankenstein, 2000; Mortara et al., 2006) e atraem células efetoras como, por exemplo, CTLs, células NK, macrófagos, granulócitos (Marzo et al., 2000; Hwang et al., 2007).

Na ausência de inflamação, a expressão de moléculas de MHC de classe II se restringe principalmente a células do sistema imunológico, em especial às células profissionais apresentadoras de antígenos (APC), como por exemplo, os monócitos, células derivadas de monócitos, macrófagos e células dendríticas. Em pacientes com câncer, as células do tumor surpreendentemente expressaram moléculas de MHC da classe II (Dengjel et al.,

2006).

Foi mostrado em modelos animais mamíferos, por exemplo, em camundongos, que mesmo na ausência de células efetoras de CTL (isto é, linfócitos de T CD8-positiva), células de T CD4-positivas são suficientes para impedir a manifestação de tumores via inibição de angiogênese por secreção de interferon-gama (IFNy) (Qin e Blankenstein, 2000). Também foi proposta a eliminação direta de células tumorais por células T CD4+ citotóxicas via linfotoxinas e granzima B (Penna et al., 1992; Littaua et al., 1992).

Adicionalmente, foi demonstrado que células de T CD4-positivas reconhecidas de peptídeos de antígenos associados a tumor apresentados por moléculas de HLA de classe II podem agir contra progressão de tumor via indução de respostas de anticorpo (Ab) (Kennedy et al., 2003).

Em contraste com peptídeos associados a tumor que se ligam a moléculas de HLA de classe I, apenas um número pequeno de ligantes da classe II de antígenos associados a tumor (TAA) foram descritos até a data de hoje.

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Considerando que a expressão constitutiva das moléculas de HLA classe II normalmente se limita a células do sistema imunológico (Mach et al., 1996), não se considerava possível isolar peptídeos classe II diretamente a partir de tumores primários. No entanto, Dengjel et al. recentemente foram bem-sucedidos em identificar vários epítopos de MHC de classe II diretamente de tumores (WO 2007/028574, EP 1 760 088 B1; (Dengjel et al., 2006).

Os antígenos que são reconhecidos pelos linfócitos T citotóxicos específicos do tumor, ou seja, os seus epítopos podem ser moléculas derivadas de todas as classes de proteínas, tais como enzimas, receptores, fatores de transcrição, etc. que são expressos e, em comparação com células inalteradas da mesma origem, regulamentados em células do respectivo tumor.

A classificação atual de antígenos associados a tumor (TAAs) contém os seguintes grupos importantes: (Novellino et al., 2005):

1. Os antígenos de câncer de testículo: Os primeiros TAAs já identificados que puderam ser reconhecidos por células T (van der Bruggen et al., 1991) pertencem a esta classe, que originalmente foi chamada antígenos câncer-testículo (CT) por causa da expressão de seus membros em tumores humanos histologicamente diferentes e, entre tecidos normais, só em espermatócitos/espermatogônias de testículo e, ocasionalmente, em placentas. Já que as células de testículo não expressam moléculas de HLA de classe I e II, estes antígenos não podem ser reconhecidos por células T em tecidos normais e, portanto podem ser considerados como imunologicamente tumor-específico. Exemplos conhecidos para antígenos de CT são os membros de família MAGE ou NY-ESO-1.

2. Os antígenos de diferenciação: Estes TAAs são compartilhados entre tumores e o tecido normal do qual o tumor surgiu; a maioria é achada em melanomas e melanócitos normais. Muitas destas proteínas de linhagem relacionadas de melanócitos são envolvidas na biossíntese de melanina e, portanto, não são específicas de tumor, mas não obstante largamente são usadas para imunoterapia do câncer. Os exemplos incluem,

26/153 mas não são limitados a, tirosinase e Melan-A/MART-1 para melanoma nem

PSA para câncer de próstata.

3. TAAS superexpressos: Genes codificando TAAs largamente expressos foram detectados em tipos de tumores histologicamente diferentes assim em muitos tecidos normais, geralmente com expressão de nível mais baixo. É possível que muitos dos epitopo s processados e potencialmente apresentado por tecidos normais estão sob o nível de limiar para reconhecimento de célula T, enquanto sua superexpressão em células de tumor pode desencadear uma resposta anticâncer quebrando a tolerância previamente estabelecida. Exemplos proeminentes para esta classe de TAAs são Her-2/neu, Survivina, Telomerase ou WT1.

4. Antígenos específicos de tumor: Estes TAAs raros surgem de mutações de genes normais (tais como β-catenina, CDK4, etc.). Algumas destas mudanças moleculares são associadas com progressão e/ou transformação neoplásica. Os antígenos específicos de tumor geralmente podem induzir respostas imunes fortes sem induzir o risco para reações autoimunes contra tecidos normais. Por outro lado, estes TAAs são na maioria dos casos só relevantes ao tumor exato, em que eles foram identificados e normalmente não são compartilhados entre muitos tumores individuais.

5. TAAs surgem de modificações anormais pós-translacionais: Tais TAAs podem surgir de proteínas que não são nem específicas nem superexpressas em tumores, mas não obstante tornam-se associadas a tumor por processos pós-translacionais principalmente ativos em tumores. Os exemplos para esta classe surgem de padrões alterados de glicosilação levando a epítopos novos em tumores como para MUC1 ou eventos como junção de proteína durante degradação que podem ou não podem ser específicos de tumor. (Hanada et al., 2004; Vigneron et al., 2004).

6. Proteínas oncovirais: Estes TAAs são proteínas virais que podem desempenhar um papel crítico no processo oncogênico e, pelo fato de serem proteínas estranhas (não de origem humana), podem evocar uma resposta de célula T. Os exemplos de tais proteínas são as proteínas de

27/153 virus do tipo 16 humano do papiloma, E6 e E7, que são expressos em carcinomas cervicais.

Para que as proteínas sejam reconhecidas pelos linfócitos T citotóxicos como antígenos específicos ou associados do tumor e, para que sejam usadas num tratamento, elas precisam atender a certos prérequisitos. O antígeno deve ser expresso principalmente por células tumorais e não por tecidos saudáveis normais ou preferivelmente em quantidades pequenas. Além disso, é desejável que o respectivo antígeno esteja presente não só num tipo específico de tumor, mas também que esteja presente em altas concentrações (por ex., número de cópias do respectivo peptídeo por célula). Antígenos específicos ou associados de tumor frequentemente são derivados de proteínas diretamente envolvidas em transformação de uma célula normal a uma célula de tumor, devido a uma função, por exemplo, em controle de ciclo de célula ou supressão de apoptose. Adicionalmente, alvos na jusante das proteínas também diretamente causativos para uma transformação também podem ser super-regulados e assim podem ser indiretamente associados a tumor. Tais antígenos indiretamente associados a tumor também podem ser alvos de uma tentativa de vacinação. (Singh-Jasuja et al., 2004). Em ambos os casos, é essencial a presença de epítopos na sequência de aminoácidos do antígeno, uma vez que esse peptídeo (“peptídeo imunogênico”), derivado de um antígeno associado a tumor, deve induzir uma resposta da célula T in vitro ou in vivo.

Basicamente, qualquer peptídeo capaz de ligar uma molécula de MHC pode funcionar como um epítopo de célula T. Um pré-requisito para a indução de uma resposta de célula T em vitro ou em vivo é a presença de uma célula T com um TCR correspondente e a ausência de tolerância imunológica para este epítopo particular.

Portanto, TAAs são um ponto inicial para o desenvolvimento de uma vacina antitumor. Os métodos para identificar e caracterizar as TAAs são baseados no uso de CTL que pode ser isolado de pacientes ou pessoas saudáveis, ou são baseados na geração de perfis diferenciais de transcrição ou padrões de expressão peptídicos diferenciais entre tumores e tecidos

28/153 normais. (Lemmel et al.» 2004; Weinschenk et al., 2002).

No entanto, a identificação de genes superexpressos em tecidos de tumor ou linhagens humanas de célula de tumor, ou seletivamente expressos em tais tecidos ou linhagens de célula, não fornece informações precisas quanto ao uso dos antígenos sendo transcritos destes genes em uma terapia imune. Isto é porque só uma subpopulação individual de epítopo s destes antígenos é conveniente para tal aplicação, pois uma célula de T com um TCR correspondente tem que estar presente e a tolerância imunológica para este epítopo particular deve ser ausente ou mínima. É, portanto importante selecionar só esses peptídeos de proteínas superexpressos ou seletivamente expressos que são apresentados em relação a moléculas de MHC contra as quais uma célula T funcional pode ser achada. Tal célula T funcional é definida como uma célula T, pois o estímulo com um antígeno específico pode ser clonalmente expandido e pode executar funções efetoras (célula T de efetoras).

As células T auxiliares desempenham um importante papel na coordenação da função efetora das células T citotóxicas na imunidade antitumoral. Os epítopos das células T auxiliares que provocam uma resposta das células T auxiliares do tipo TH1 apoiam as funções efetoras das células T assassinas CD8+, que incluem funções citotóxicas dirigidas contra as células tumorais que apresentam complexos peptídeo/MHC associados ao tumor nas superfícies celulares. Desta forma, os epítopos peptídicos de célula T auxiliar associados a tumores, isoladamente ou em combinação com outros peptídeos associados a tumores, podem servir como ingredientes farmacêuticos ativos em composições de vacinas estimuladoras das respostas imunes antitumor.

Já que ambos os tipos de respostas, CD8 e CD4 dependente, contribuem conjuntamente e sinergicamente para o efeito antitumor, a identificação e a caracterização de antígenos de associados a tumor reconhecidos por qualquer CD8 + CTLs (ligante: molécula de MHC de classe I + epítopo peptídico) ou por células T, auxiliares CD4-positivas (ligante: molécula de MHC de classe II + epítopo peptídico) é importante no desenvol29/153 vimento de vacinas de tumor.

Considerando os graves efeitos colaterais e as despesas associadas com o câncer, melhores métodos de diagnóstico e prognóstico são desesperadamente necessários. Portanto, há a necessidade de identificar outros fatores que representam biomarcadores para o câncer em geral e glioblastoma em particular. Portanto, há a necessidade de identificar outros fatores que possam ser usados no tratamento do câncer em geral e glioblastoma em particular.

Além disso, não há nenhum projeto terapêutico estabelecido para pacientes de câncer de próstata com recidiva bioquímica após prostatectomia radical, geralmente causada por tumor residual deixado in situ na presença de crescimento de tumor localmente avançado. Deseja-se atualmente novas abordagens terapêuticas que confiram menor morbidade com eficácia terapêutica comparável em relação às abordagens terapêuticas disponíveis.

A invenção presente fornece peptídeos que são úteis em tratar glioblastoma, o câncer de próstata e outros tumores que superexpressam survivina e/ou CSP e/ou outros peptídeos da invenção. Estes peptídeos foram parcialmente mostrados diretamente por espectrometria de massa a ser naturalmente apresentada por moléculas de HLA em amostras de glioblastoma humanas primárias (vide Exemplo 1 e Figura 1), ou no caso de SEQ ID NO: 26, previsto de acordo com o algoritmo de predição SYFPEITHI (Rammensee et al., 1995) em serem ligantes promíscuos aos alelos HLADRB1*01, DRB1*03, DRB1*04, DRB1*11, e DRB1*15. Com base nestes dados e nas frequências desses alelos DRB1 frequentes, pode presumir-se que 92% dos caucasianos A*02 positivos expressam pelo menos um alelo DRB1 que liga estes peptídeos de acordo com SEQ ID NO: 26.

A fonte de genes a partir da qual SEQ ID NO: 26 a 30 são derivadas - survivina - mostrou-se ser altamente superexpressa no glioblastoma, no tumor de próstata, no câncer de mama, câncer de esôfago, câncer colorretal, carcinoma de células de células renais claras, câncer de pulmão, CNS, ovário, melanoma (Tamm et al. 1998), câncer de pâncreas, carcinoma

30/153 epidermoide, leucemia e meduloblastoma em comparação com tecidos normais (ver Exemplo 2 e Figura 2), demonstrando um elevado grau de associação de tumor do peptídeo, ou seja, estes peptídeos estão fortemente representados no tecido tumoral, mas não no tecido normal. WO 2004/067023 descreve peptídeos MHC restritos de classe I derivados do antígeno de survivina associado a tumor, do qual os peptídeos são capazes de se ligar a moléculas de HLA de Classe I em uma grande afinidade.

Peptídeos ligados a HLA-LIMITE podem ser reconhecidos pelo sistema imune, especificamente linfócitos T/ células T. As células de T podem destruir as células apresentando o complexo HLA/peptídico reconhecido, por exemplo, células de tumor de glioblastoma apresentando peptídeos derivados. Células T auxiliares ativadas pelos peptídeos derivados de survivina podem inibir a vascularização do tumor, podem atrair células efetoras do sistema imune e podem facilitar preparação CTL, proliferação e resposta sustentada de célula T CD8 +.

Todos os peptídeos da invenção presente foram mostrados ser capazes de estimular respostas de célula T (veja Exemplo 3 e Figura 3). Assim, os peptídeos são úteis para gerar uma resposta imune em um paciente, no qual células de tumor podem ser destruídas. Uma resposta imune num paciente pode ser induzida por administração direta dos peptídeos descritos ou substâncias precursoras convenientes (por exemplo, peptídeos alongados, proteínas, ou ácidos nucleicos codificando estes peptídeos) ao paciente, idealmente em combinação com um agente melhorando a imunogenicidade (isto é um adjuvante). A resposta imune que se origina de tão vacinação terapêutica pode ser esperada em ser altamente específica contra células de tumor porque os peptídeos alvo da invenção presente não são apresentados em tecidos normais em números de cópia comparáveis, prevenindo o risco de reações indesejáveis autoimunes contra células normais no paciente.

As composições farmacêuticas incluem os peptídeos, tanto na forma livre ou na a forma de um sal farmaceuticamente aceitável.

Conforme utilizado aqui, um sal farmaceuticamente aceitável

31/153 refere-se a um derivado do peptídeo revelado onde o peptídeo é alterado por formação de ácido ou por sais básicos do agente. Por exemplo, sais ácidos são preparados a partir da base livre (normalmente onde a forma neutra da fármaco tem um grupo NH2 neutro), envolvendo uma reação com ácido adequado. Ácidos adequados para a preparação de sais de ácidos incluem tanto os ácidos orgânicos, por exemplo, ácido acético, ácido propiônico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malônico, succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinâmico, ácido mandélico, ácido metanossulfônico, etanossulfônico, ácido p-toluenossulfônico, ácido salicílico e similares, bem como ácidos inorgânicos, por exemplo, ácido clorídrico, ácido bromídrico, ácido sulfúrico, ácido fosfórico, ácido nítrico e similares. Inversamente, a preparação de sais de base provenientes de moléculas ácidas, que podem estar presentes em um peptídeo, é efetuada utilizando-se uma base farmaceuticamente aceitável como o hidróxido de sódio, hidróxido de potássio, hidróxido de amônio, hidróxido de cálcio, trimetilamina ou similares.

Em uma variante especialmente preferida, as composições farmacêuticas compreendem peptídeos como sais de ácido acético (acetatos) ou ácido clorídrico (cloretos).

Além de serem úteis para tratar o câncer, os peptídeos da invenção presente são também úteis como diagnósticos. Já que os peptídeos foram gerados de glioblastoma e já que foi determinado que estes peptídeos não estão presentes em tecidos normais, estes peptídeos podem ser usados para diagnosticar a presença de um câncer.

A presença dos peptídeos reivindicados em biópsias de tecido pode auxiliar um patologista no diagnóstico do câncer. A detecção de certos peptídeos por meio de anticorpos, espectrometria de massa ou outros métodos conhecidos na técnica podem contar ao patologista que o tecido é maligno ou inflamado ou geralmente doente. A presença dos grupos de peptídeos pode capacitar a classificação ou subclassificação de tecidos doentes.

A detecção de peptídeos em espécime doente de tecido pode

32/153 capacitar a decisão sobre o benefício de terapias envolvendo o sistema imune, especialmente se linfócitos T são conhecidos ou esperados em ser envolvido no mecanismo de ação. Perda de expressão de MHC é um mecanismo bem descrito, pelo qual células malignas ou infectadas escapam à imunomonitorização. Assim, presença de peptídeos mostra que este mecanismo não é explorado pelas células analisadas.

Os peptídeos podem ser usados para analisar respostas de linfócito contra esses peptídeos tal como respostas de célula T ou respostas de anticorpo contra o peptídeo ou o TUMAP complexado para as moléculas de MHC. Estas respostas de linfócito podem ser usadas como marcadores de prognóstico para decisão em outros passos de terapia. Estas respostas também podem ser usadas como marcadores de substituto em tentativas de imunoterapia tentando induzir respostas por meios diferentes, por exemplo, vacinação de proteína, ácidos nucleicos, materiais autólogos, transferência adotiva de linfócitos. Em cenários de terapia de gene, respostas de linfócito contra peptídeos podem ser consideradas na avaliação de efeitos colaterais. Monitoração de respostas de linfócito também talvez seja uma ferramenta valiosa para exames complementares de terapias de transplantação, por exemplo, para a detecção de transplante contra hospedeiro e hospedeiro contra doenças de transplante.

Os peptídeos podem ser usados para gerar e desenvolver anticorpos específicos contra complexos de MHC/peptídeo. Estes podem ser usados para terapia, direcionando toxinas ou substâncias radioativas ao tecido doente. Outro uso destes anticorpos pode estar direcionando os radionuclídeos ao tecido doente para propósitos de imagens tais como PET. Este uso pode ajudar a detectar metástases pequenas ou determinar o tamanho e localização precisa de tecidos doentes.

Além do mais, eles podem ser usados para verificar um diagnóstico de patologista sobre um câncer, com base em uma amostra de biópsias.

A tabela 1 mostra os peptídeos de acordo com a presente invenção, seu respectivo SEQ ID NO, os alelos de HLA aos quais os

33/153 respectivos peptídeos se ligam, e as proteínas de fonte das quais estes peptídeos possam surgir. De interesse especial é o fato dos peptídeos de acordo com SEQ ID No 1 se ligarem ao HLA-DR, assim como HLA-A*02, portanto, provocando duas respostas diferentes.

Tabela 1: Peptídeos da presente invenção

SEQ ID NO:	Código peptídico	Sequência	Alelos de HLA	Proteína(s) de fonte
1	NLGN4X-001	NLDTLMTYV	HLA-A*02	NLGN4X
2	SLC01C1-001	YLIAGIISL	HLA-A*02	SLCO1C1
3	ACS-001	KIMERIQEV	HLA-A*02	ACSBG1
4	BCA-001	FLGDPPEKL	HLA-A*02	BCAN
5	BCA-002	ALWAWPSEL	HLA-A*02	BCAN
6	CHI3L1-010	TLYGMLNTL	HLA-A*02	CHI3L1
Ί	CLIP2-001	SLNELRVLL	HLA-A*02	CLIP2
8	DTNA-001	KLQDEAYQV	HLA-A*02	DTNA
9	EGFR-007	ALAVLSNYDA	HLA-A*02	EGFR
10	FABP7-001	LTFGDWAV	HLA-A*02	FABP7
11	GFAP-001	NLAQDLATV	HLA-A*02	GFAP
12	GPR56-002	FLLSEPVAL	HLA-A*02	GPR56
13	GRI-001	NILEQIVSV	HLA-A*02	GRIA4
14	IGF2BP3-001	KIQEILTQV	HLA-A*02	IGF2BP3
15	MLC-001	SWEVIAGI	HLA-A*02	MLC1
16	NES-001	GLQSQIAQV	HLA-A*02	NES
17	NES-002	SLQENLESL	HLA-A*02	NES
18	NES-003	FLFPGTENQEL	HLA-A*02	NES
19	NES-004	NLAEELEGV	HLA-A*02	NES
20	NR2E1-001	KIISEIQAL	HLA-A*02	NR2E1
21	NRCAM-001	GLWHHQTEV	HLA-A*02	NRCAM
22	PDPN-001	TLVGIIVGV	HLA-A*02	PDPN
23	TNC-001	AMTQLLAGV	HLA-A*02	TNC
24	TNC-002	QLLAGVFLA	HLA-A‘02	TNC
25	CSP-001	TMLARLASA	HLA-A*02	CSPG4

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26	BIR-002	TLGEFLKLDRERAKN	HLA-DR e HLA-A*02	BIRC5/Survivina
27	BIR-002a	TLGEFLKLDRERAKD	HLA-DR	BIRC5/Survivina
28	BIR-002B	FTELTLGEF	HLA-A1	BIRC5/Survivina
29	BIR-002c	LMLGEFLKL	HLA-A2	BIRC5/Survivina
30	BIR-002d	EPDLAQCFY	HLA-B35	BIRC5/Survivina

Proteoglicano de sulfato condroitina 4 (CSPG4)

CSPG4 (proteoglicano de sulfato condroitina) representa um integrante da membrana de proteoglicano de sulfato de condroitina em pericitos nascentes com um papel funcional na neovascularização (Ozerdem, 2006). Durante a embriogênese, o proteoglicano CSPG4 é expresso em vasos capilares imaturos, mas quando os vasos se tornam maduros, eles perdem essa expressão. Isso é conhecido como um marcador de progressão de melanoma na superfície celular precoce implicado em estimular a proliferação, migração e invasão de célula tumoral. CSPG4 está fortemente presente em mais de 90% das lesões de melanoma humano. Embora o CSPG4 não seja estritamente específico de tumor, respostas de células T CD4+ reativas ao tumor em pacientes com melanoma e indivíduos saudáveis reconhecem CSPG4693-709 em células de melanoma expressando HLA-DR11, na ausência de autoimunidade (Erfurt et al., 2007).

Expressão de CSPG4 aprimora a expansão de células mediada por integrinas, fosforização FAK (quinase de adesão focal) e ativação de ERK1/2 (quinase regulada por sinal extracelular) (Yang et al., 2004). Além disso, existem evidências de dados in vitro de que CSPG4 desempenha um papel importante na angiogênese do tumor. Assim, foi descoberto que os tumores CSPG4 positivos aumentaram significativamente as taxas de neovascularização, os volumes vasculares e CSPG4 demonstrou poder sequestrar angiostatina, que normalmente inibe a proliferação endotelial e angiogênese de células. Vasos imaturos também contêm pericitos CSPG4 positivos, sugerindo um papel para essa população de células na modulação da proliferação das células endoteliais, bloqueando os efeitos inibitórios de angiostatina durante o desenvolvimento do vaso (Chekenya et al., 2002b).

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A expressão CSPG4 também tem sido descrita em alguns tecidos normais além de pericitos ativados, como células endoteliais, condrócitos, células musculares lisas, alguns queratinócitos basais na epiderme, bem como as células dentro do folículo capilar (Campoli et al., 2004).

Durante a angiogênese e em resposta a patologias do CNS, as células CSPG4 altamente móveis sofrem rápidas alterações morfológicas e são recrutadas para locais onde o crescimento e reparação dos vasos estão ocorrendo. CSPG4 é superexpressa por ambos: as células tumorais e os pericitos dos vasos sanguíneos dos tumores cerebrais malignos (Chekenya and Pilkington, 2002). Ao implantar as células de uma linhagem celular do glioma humano CSPG4 positivo em cérebros de ratos imunodeficientes nus, foi demonstrado que estes tumores tiveram uma maior densidade microvascular em relação aos controles, o que implica que a expressão CSPG4 regula tanto a função como a estrutura dos vasos do tumor derivados do hospedeiro (Brekke et al., 2006). Em um experimento de xenoenxerto de implantação de esferoides de biópsia GBM em ratos nus, CSPG4 foi identificado como sendo principalmente associado aos vasos sanguíneos de ambos, dos pericitos e dos componentes da membrana basal dos vasos do tumor, e a expressão também foi associada com áreas de alta proliferação celular (Chekenya et al., 2002a). Além disso, a progressão estava em paralelo à expressão de CSPG4 do tumor em um modelo de implantação de glioma). Progressão maligna é mantida por diafonia (“crosstalk”) entre o tumor e o seu estroma, onde o estroma ativado alimenta as células proliferativas e neoplásicas invasoras, fornecendo neovascularização, componentes da matriz extracelular e fatores de crescimento estimulantes. Neste contexto, CSPG4 desempenha um papel importante na ativação do estroma tumoral por meio de alterações na adesão celular, migração, proliferação e morfogênese vascular (Chekenya e Immervoll, 2007).

CSPG4 é diferencialmente expresso em gliomas humanos com maior expressão em gliomas de baixo grau em comparação com os de alto grau (Chekenya et al., 1999). Alta expressão de CSPG4 se correlaciona à resistência a múltiplos fármacos mediada pelo aumento da ativação de α3β1

36/153 integrina/ sinalização de PI3K e os seus alvos a jusante, promovendo a sobrevivência da célula (Chekenya et al., 2008).

PEC-001 foi encontrada nos seguintes órgãos I tecidos e cânceres:

Cérebro: - Glioblastoma; - glioblastoma secundário (derivado de astrocitoma)

Cólon: - Adenocarcinoma (excluindo tipo mucinoso) primário;

Reto: - Adenocarcinoma, metástase

Estômago: - Adenocarcinoma (excluindo o tipo de célula em anel de sinete) primário;

Rim: - Carcinoma de células renais, linhagem celular; - carcinoma de células renais, células claras, metástase, todos os locais secundários; - carcinoma de células renais, células claras, primárias, - carcinoma de células renais, primário

Pulmão: - Adenocarcinoma primário; - carcinoma adenoescamoso primário; - câncer primário; - carcinoma de pequenas células primário; - carcinoma de células escamosas, primário;

Pâncreas: - Adenocarcinoma primário; - O tumor de células da ilhota, malignos, metástase

Próstata - Adenocarcinoma, primário

Pele: - Melanoma maligno metastático, metástases linfonodais

Portanto, uma composição farmacêutica contendo um peptídeo de acordo com SEQ ID NO: 1 é particularmente preferido para o tratamento de:

Cérebro: - Glioblastoma; - glioblastoma secundário (derivado de astrocitoma)

Cólon: - Adenocarcinoma (excluindo tipo mucinoso) primário;

Reto: - Adenocarcinoma, metástase

Estômago: - Adenocarcinoma (excluindo tipo de célula em anel de sinete) primário;

Rim: - Carcinoma de células renais, linhagem celular; carcinoma de células renais, células claras, metástase, todos os locais secundários;

37/153 carcinoma de células renais, células claras, primário, carcinoma de células renais, primário

Pulmão: - Adenocarcinoma primário; estágio 1, - carcinoma adenoescamoso primário; - câncer primário; - carcinoma de pequenas células primário; - carcinoma de células escamosas, primário;

Pâncreas: - Adenocarcinoma primário; - O tumor de células da ilhota, maligno, metástase

Próstata - Adenocarcinoma, primário

Pele: - Melanoma maligno metastático, metástases linfonodais Membro da família bubblegum 1 de Acil-CoA Sintetase (ACSBG1)

A proteína codificada por esse gene possui cadeia de longa atividade de acil-CoA sintetase. Acredita-se que ela desempenha um papel central na ativação do cérebro em muitos metabolismos de cadeia longa dos ácidos graxos e mielinogênese. Ativação de ácidos graxos por tioesterificação ao acetil-CoA é um pré-requisito da maioria das reações envolvendo esta classe de moléculas. Funções específicas de câncer ou superexpressão ainda não foram descritas na literatura. O padrão de expressão de ACSBG1 no cérebro, a glândula adrenal, testículos e ovários assim como sua função sugere um papel desta proteína na patologia bioquímica de adrenoleucodistrofia ligada ao cromossomo X (XALD). XALD é uma doença neurodegenerativa grave, frequentemente fatal caracterizada por níveis elevados do plasma e de ácidos graxos muitos saturados de cadeia longa do tecido (Asheuer et al., 2005; Pei et al., 2003).

Brevican (BCAN)

Brevican é uma proteína de matriz extracelular, que é altamente expressa a partir do nascimento e até 8 anos de idade e é sub-regulada aos 20 anos de idade para os níveis baixos que são mantidos no córtex adulto normal. Uma isoforma de GPI é expressa em baixos níveis uniformes durante todo o desenvolvimento (Gary et al., 2000). Gliomas malignos invadem agressivamente o cérebro normal circundante, que pode ser mediado por um tecido ou proteínas extracelulares específicas de tumor. Assim, a

38/153 matriz extracelular pode modular, em parte, a permissividade de um tecido para a movimentação das células. Devido a isso, a capacidade de gliomas para modificar o ECM do CNS pode mediar a invasão dessas células. Uma molécula de ECM que mostra super-regulação dramática em gliomas é a BCAN, um proteoglicano de sulfato de condroitina específico do cérebro. A expressão de BCAN também é super-regulada durante os períodos de aumento da motilidade celular glial no desenvolvimento e na sequência de uma lesão cerebral. No glioma, pode ser detectado um aumento de expressão aproximadamente sete vezes acima dos níveis normais (Gary et al., 2000; Gary et al., 1998). Além super-regulação de BCAN no glioma, processamento proteolítico da proteína de longa-metragem também pode contribuir para a invasão (Gary et al., 1998; Nutt et al., 2001). Assim pôde ser demonstrado que o processamento proteolítico de BCAN de metaloproteases da família ADAMTS é um passo necessário para mediar seu efeito pró-invasivo no glioma. O mutante, como forma não rachável de BCAN é incapaz de melhorar a invasão de células de glioma in vitro e a progressão tumoral in vivo (Viapiano et al., 2008). mRNA para BCAN não é detectável no córtex humano adulto normal ou em qualquer tumor não glioma, assim BCAN é considerado um marcador exclusivo e seletivo em glioma (Jaworski et al., 1996). Além disso, a análise da proteína revelou não só um aumento da expressão do BCAN inteiro, mas também a presença de outras isoformas únicas no glioma. Assim, B/b_Ag é um produto de comprimento total de BCAN mRNA, que surge de uma glicosilação incompleta ou reduzida da proteína do núcleo. B/b_Ag está ausente do cérebro adulto normal, mas é encontrado em amostras de glioma de alto grau (Viapiano et al., 2005).

BCAN tem sido descrito como expresso seletivamente em um tipo de célula de tumor tipo tronco derivado de glioblastoma (Gunther et al., 2008). Esse subtipo de células tipo tronco mostrou ter uma maior pluripotência e tumorigenicidade in vivo.

Quitinase 1 tipo 3 (glicoproteína de cartilagem-39) (CHI3L1)

CHI3L1, um membro das ’’proteínas de mamíferos tipo quitinase, é expresso e secretado por vários tipos de tumores sólidos. É

39/153 produzida pelas células cancerosas e macrófagos associados a tumores, exibe atividade de fator de crescimento para células envolvidas nos processos de remodelação do tecido e pode desempenhar um papel na proliferação, diferenciação, sobrevivência, invasão, metástase da célula cancerosa, na angiogênese e na inflamação assim como no remodelamento da matriz extracelular em torno do tumor (Johansen et al., 2006; Johansen et al., 2007; Ringsholt et al., 2007). Além disso, CHI3L1 é um autoantígeno candidato na artrite reumatoide. Linhas de células T CD4 de doadores saudáveis dirigidas contra CD25 expressos em CHI3L1, receptor do fator de necrose tumoral induzida por glucocorticoide, e moléculas Foxp3 e foram capazes de suprimir respostas de célula T específicas do antígeno. Respostas em 50% dos pacientes com artrite reumatoide apresentam polarização em direção a um fenótipo pró-inflamatório da T auxiliar 1 e são significativamente menos potentes em suprimir respostas recall específicas do antígeno (van Bilsen et al., 2004).

CHI3L1 é super-regulada por oncostatina M que é conhecida por ser induzida no sistema nervoso, como resultado do estresse celular, e é expressa na maioria dos tumores cerebrais humanos e ativa a via de sinalização JAK / STAT (Krona et al., 2007). A expressão CHI3L1 também foi associada à expressão de p-MAPK, p-mTOR e p-p70S6K no glioblastoma (Pelloski et al., 2006).

Em vários estudos de expressão gênica, CHI3L1 mostrou-se mais altamente expresso em glioblastoma em relação ao cérebro normal com uma faixa de elevação de 3 a 62 vezes mais do que no cérebro normal (Saidi et al., 2007; Kroes et al., 2007; Shostak et al., 2003; Tanwar et al., 2002). Os estudos imuno-histoquimicos revelaram que todas as células com um núcleo de funcionamento são capazes de expressar CHI3L1 em seu citoplasma, mas a intensidade da expressão CHI3L1 foi dependente da atividade celular. Assim, as células conhecidas por exercer uma atividade metabólica elevada tendem a mostrar a mais intensa coloração citoplasmática (Ringsholt et al., 2007). Além disso, pôde ser demonstrado por imuno-histoquímica que glioblastomas apresentam expressão CHI3L1 mais

40/153 impressionante do que oligodendrogliomas anaplásicos (Nutt et al., 2005). Análise Western blot das amostras de glioma para os níveis de proteína CHI3L1 revelou elevação substancial em 65% dos GBMs e níveis indetectáveis em gliomas de baixo grau (grau II e III) ou tecido normal do cérebro (Tanwar et al., 2002). Em comparação com o astrocitoma pilocítico, que não se espalha e pode ser curado através de cirurgia, somente glioblastoma expressa CHI3L1 (Colin et al., 2006).

Os níveis séricos de CHI3L1 são elevados em uma variedade de neoplasias malignas e têm sido associados com pior sobrevivência. Níveis séricos mais elevados de CHI3L1 foram encontrados em pacientes com câncer metastático com o menor intervalo livre de recidiva e menor sobrevivência geral. Especificamente no soro de pacientes com glioblastoma, a expressão CHI3L1 foi elevada (Kim et al., 2007; Johansen et al., 2007; Johansen et al., 2006; Junker et al., 2005; Tanwar et al., 2002). Pacientes com tumor GBM ativo têm um nível significativamente maior de CHI3L1 do que pacientes sem evidência radiográfica da doença. Além disso, há uma associação inversa significativa entre CHI3L1 e sobrevivência em GBM (Hormigo et al., 2006; Pelloski et al., 2005).

Além disso, expressão elevada de CHI3L1 pode ser observada no câncer da mama, onde se correlaciona com tumor de maior tamanho, diferenciação mais pobre do tumor e uma pior sobrevivência livre de doença (Kim et al., 2007; Coskun et al., 2007). Além disso, em carcinoma de célula escamosa da cabeça e pescoço, elevados níveis séricos de CHI3L1 foram detectados em 53%. Pacientes com níveis séricos elevados de CHI3L1 têm menor sobrevivência do que pacientes com soro normal CHI3L1 (33 vs 84 meses) (Roslind et al., 2008).

Pacientes que sofrem de câncer de próstata mostraram níveis significativamente mais altos de CHI3L1 em comparação com pacientes com HBP ou pessoas saudáveis (Kucur et al., 2008).

Domínio CAP-GLI que contêm proteína ligante 2 (CLIP2)

A proteína codificada pelo CLIP2 pertence à família de proteínas ligantes citoplasmáticas, que têm sido propostas para mediar a interação

41/153 entre organelas membranosas específicas e microtúbulos. Foi descoberto que CLIP2 está associado a ambos os microtúbulos e uma organela chamada corpo lamelar dendrítico (informações gerais a partir da página web da

NCBI).

CLIP2 se localiza nas extremidades dos microtúbulos tirosinados, mas não para as extremidades dos microtúbulos detirosinados. Tubulina-tirosina ligase (TTL), a enzima que catalisa a adição de um resíduo de tirosina C-terminal para alfa-tubulina no ciclo tirosinação de tubulina, está envolvida na progressão do tumor e tem um papel vital na organização neuronal (Peris et al., 2006). Um estudo do DNA genômico a partir de seções congeladas de 30 casos de glioblastomas primários por amplificações gênicas caracterizadas por GenoSensor Array 300, deleções de genes, e as informações cromossômicas em todo o genoma. Os genes que foram frequentemente amplificados incluem = CLIP2 (63,3%), EGFR (53,3%), IL6 (53,3%), ABCB1 (MDR1) (36,7%), e PDGFRA (26,7%) (Suzuki et al., 2004).

Família transportadora aniônica orgânica portadora de soluto, membro 1C1 (SLCO1C1)

SLCO1C1 é seletivamente expresso na barreira hematoencefálica (Chu et al., 2008). SLCO1C1 tem preferência substrato seletiva e pode desempenhar um papel importante na disposição dos hormônios tireoidianos no cérebro e nos testículos (Pizzagalli et al., 2002). SLCO1C1 não foi especificamente detectável por imunofluorescência. SLCO1A2 e SLCO2B1 foram detectáveis por microscopia de imunofluorescência na membrana luminal das células endoteliais que formam a barreira cérebrosangue e a barreira de tumor-sangue, mas não nas células de glioma (Bronger et al., 2005).

Distrobrevina, alfa (DTNA)

Alfa distrobrevina foi descrita primeiramente como um componente citoplasmático do complexo distrofina-glicoproteínas em células de músculo esquelético. Isoformas de DTNA mostram localização diferente nas células e tecidos; na membrana basolateral das células epiteliais, distrobrevinas medeiam o contato com as proteínas da matriz extracelular, periféricos

42/153 e transmembrana assim como do citoesqueleto da actina filamentosa. Além de seu papel estrutural, DTNAs são consideradas importantes na sinalização celular e diferenciação celular e estão associadas a junções apertadas durante a sua reorganização (Sjo et al., 2005). DTNA pode estar envolvida na formação e estabilidade das sinapses, bem como no agrupamento de receptores colinérgicos nicotínicos.

Receptor do fator de crescimento epidérmico (homólogo do oncogene viral de leucemia eritroblástica (v-erb-b), aviário) (EGFR)

Uma área de interesse recente é o receptor do fator de crescimento epidérmico (EGFR), pois suas anormalidades são um dos fenômenos moleculares mais comuns no glioblastoma. Especialmente EGFRvIII (receptor do fator de crescimento epidérmico variante III) é uma forma mutante constitutivamente ativa e oncogênica do EGFR, que é comumente expresso em glioblastoma (Zawrocki and Biernat, 2005). EGFR está envolvido na ativação de uma série de vias que regulam o fenótipo de células progenitoras. Atividade de EGFR tirosina quinase aumenta a migração, proliferação e sobrevivência de células-tronco neurais. Como sinalização EGFR também é conhecida por desempenhar um papel importante no glioblastoma, pode-se concluir que o glioblastoma deriva de uma célulatronco cancerígena e que os sinais de EGFR são comumente alterados nestas células precursoras (Yuso-Sacido et al., 2006).

Glioblastomas primários surgem de novo em pacientes mais velhos e, muitas vezes, sobreexpresam EGFR. A expressão do EGFR se correlaciona com o aumento da angiogênese, edema e invasão (Aghi et al., 2005). Além disso, glioblastomas de EGFR amplificados são resistentes à radiação (Barker et al., 2001) e retornam mais rapidamente após o tratamento (Schlegel et al., 1994).

GBM é o único tumor não epitelial humano, para o qual uma ativação excessiva de EGFR tem sido associada ao crescimento do tumor e sobrevivência do paciente; e ativação de EGFR promove infiltração de GBM in vitro (Penar et al., 1997).

EGFR é o proto-oncogene do erbB. Superexpressão de EGFR

43/153 pode aumentar o crescimento celular por aumento da formação de complexos ativos de ligante:receptor. A amplificação do gene é o mecanismo subjacente à superexpressão de receptores de EGF em tumores de GBM (Thompson e Gill, 1985). O gene EGFR no cromossomo 7 é conhecido por ganhar, em número de cópias, frequentemente em gliomas de alto grau (Okada et al., 2007). Depleção de EGFR por curta interferência de RNA suprime a tumorigênese de células de glioblastoma (Huang et al., 2007).

A expressão de EGFR é detectada em 40-70% dos GBM, onde astrocitoma pilocítica de baixo grau ou anaplásicas são invariavelmente EGFR negativa. (Agosti et al., 1992; Schwechheimer et al., 1995; Eppenberger e Mueller, 1994; Huncharek e Kupelnick, 2000; Liu et al., 2006a) . Níveis séricos elevados de EGFR indicam a sobrevivência reduzida (Quaranta et al., 2007). Além disso, foi demonstrado que os sobreviventes de longo prazo com alto grau são astrocitomas EGFRvIII negativos (Liang et al., 2008).

Notch-1 sobrerregula a expressão de EGFR e correlaciona entre os níveis de EGFR e mRNA. Notch-1 pode ser encontrado em gliomas humanos primários de alto grau (Purow et al., 2008). EGFR está envolvido na ativação constitutiva do terminal c-Jun NH2 quinase (JNK), que contribui para a sobrevivência, proliferação e tumorigênese em alguns tumores, incluindo os gliomas (Li et al., 2008a).

Embora a EGFRvIII só seja expressa por uma porcentagem pequena de células de glioma, a maioria das células apresentam um fenótipo transformado. Foi mostrado que expressão EGFRvIII em células de glioma indolente estimula a formação de microvesículas relacionadas a vasos de lipídios contendo EGFRvIII, que são liberados ao meio celular e podem se fundir com as membranas plasmáticas das células cancerosas sem EGFRvIII levando à transferência da atividade oncogênica (Al-Nedawi et al., 2008).

Proteína 7 de ligação de ácidos graxos, cérebro (FABP7)

Proteínas de ligação de ácidos graxos (FABPs) são proteínas citosólicas 14-15 kDa, que estão supostamente envolvidas na captação,

44/153 transporte e segmentação de ácidos graxos (AG). Eles podem modular a concentração de FA e, deste modo, influenciar função de enzimas, membranas, canais iônicos e receptores, e expressão gênica assim como crescimento e diferenciação celular. Nove tipos de FABP podem ser reconhecidos com uma distribuição de tecidos específicos. Apesar de 30-70% de identidade de sequência aminoácida, eles têm uma estrutura clam-beta terciária similar, na qual a FA está vinculada. O tecido nervoso contém quatro tipos de FABP com uma distribuição geográfica espaço-temporal distinta (Veerkamp and Zimmerman, 2001). FABP7 é altamente expressa no cérebro em desenvolvimento e da retina e sua expressão diminui significativamente no CNS de adultos (Godbout et al., 1998). Com base nos resultados in vitro, tem sido sugerido que FABP7 é necessário para o estabelecimento do sistema radial glial do cérebro em desenvolvimento (Mita et al., 2007). No cérebro normal proteína FABP7 é praticamente indetectável, mas mostra expressão nuclear e citoplasmática moderada a forte em vários GBMs. Células FABP7 transfectadas apresentam uma migração 5 vezes maior do que células de controle. Desta forma, o grau curto de sobrevivência geral associado com superexpressão de FABP7 especialmente em glioma, deve ter sido causado pelo aumento de migração e invasão de células tumorais para o parênquima ao redor do cérebro (Liang et al., 2005). Translocação nuclear de FABP7 é especificamente relacionado com a amplificação do EGFR e tumores mais invasivos (Kaloshi et al., 2007). Assim, FABP7 nuclear pode ser induzida pela ativação do EGFR em promover a migração de células tumorais GBM (Liang et al., 2006).

Expressão FABP7 também tem mostrado ser um marcador para o carcinoma de células renais. Expressão FABP7 só pode ser detectada em tecidos de carcinoma, mas não em partes não cancerosos de amostras de rim (Teratani et al., 2007). A expressão de FABP7 no carcinoma de células renais mostrou ser 20 vezes maior no tumor, em comparação ao tecido normal do rim (Domoto et al., 2007; Buchner et al., 2007). Foi também demonstrado que FABP7 é frequentemente expresso em melanoma onde podem estar envolvidos na proliferação e invasão celular (Goto et al., 2006).

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Proteína glial fibrilar ácida (GFAP)

GFAP codifica uma das principais proteínas dos filamentos intermediários de astrócitos. É usado como um marcador para distinguir os astrócitos de outras células gliais durante o desenvolvimento. Mutações nesse gene causam doença de Alexander, um distúrbio raro de astrócitos no sistema nervoso central. Uma variante transcrição adicional tem sido descrita, mas sua sequência de comprimento total não foi determinada. Níveis elevados têm sido relatados em cérebros de autistas enquanto cérebros de pessoas com depressão grave apresentaram diminuição de GFAP.

Cérebros de primatas, que desenvolveram tumores de novo dez anos após a irradiação inteira do cérebro - foram analisados. Precursores de tumor demonstraram mitoses e atipias celulares, e foram negativos para marcadores associados tumor GFAP EGFR e p53 (Lubensky et al., 2006).

Em neoplasias astrocitárias o número de células GFAP positivas e a intensidade da mancha foi diretamente proporcional ao grau de malignidade. Todos os 3 casos de oligodendroglioma demonstraram reação negativa para GFAP (Reyaz et al., 2005). Oligodendrogliomas puros são imunohistologicamente negativos para GFAP (Mokhtari et al., 2005). Níveis séricos de GFAP em pacientes com glioma de alto grau apresentaram uma correlação linear para o volume tumoral (Brommeland et al., 2007). Mesmo entre os pacientes GB uma correlação significativa entre o volume tumoral, volume de necrose tumoral, a quantidade de células necróticas GFAP positivas e nível sérico de GFAP podem ser detectados (Jung et al., 2007).

Após o tratamento de linhagens de células de glioblastoma com o inibidor da histona desacetilase 4-fenilbutirato, o aumento da concentração de GFAP fosforilado não foi relatado, enquanto que as isoformas fosforiladas permaneceram intactas (Asklund et al., 2004).

Em uma linhagem celular do glioblastoma tratado com TGFalpha, a transcrição do gene GFAP, o nível de mRNA e a síntese de proteína específica diminuíram em cerca de 50% (Zhou e Skalli, 2000).

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Tecnicamente, o promotor de GFAP é frequentemente utilizado como uma ferramenta em modelos de ratos para induzir a expressão de proteínas especificamente desejadas no sistema nervoso.

As ilhotas pancreáticas de Langerhans são envolvidas por células de Schwann peri-ilhota (PSC), que expressam GFAP. Segmentação autoimune dos elementos do tecido do sistema nervoso pancreático parece ser uma parte integral e antecipada da diabetes tipo 1 natural (Winer et al., 2003). Esta expressão de pâncreas não é refletida pela ’’immatics” ou dados de expressão gênica de tecidos externos a granel. GFAP-001 foi publicada como um epítopo contra o qual pacientes diabéticos tipo 1, bem como seus parentes não diabéticos com respostas de anticorpos contra antígenos diabetes (risco aumentado de diabetes) apresentaram maior reatividade de CTLs secretores de granzima B (ex vivo ELISPOT), em comparação com os doadores saudáveis (Standifer et al., 2006).

Curiosamente, parece existir uma correlação inversa entre a manifestação de doenças autoimunes, especialmente a diabetes e o risco de desenvolvimento de glioma (Aronson and Aronson, 1965; Schlehofer et al., 1999; Brenner et al., 2002; Schwartzbaum et al., 2003; Schwartzbaum et al., 2005).

Receptor 56 acoplado com proteína G (GPR56)

GPR56 é urn receptor atípico de proteína G acoplada (GPCR), com uma região N-terminal extracelular muito grande, que contém uma região longa e rica em Ser/Thr que formam um talo similar à mucina e, devido a esta característica, GPR56 possivelmente tem um papel nas interações célula-célula, ou célula-matriz. Juntamente com o elevado nível de expressão de mRNA e sua ampla distribuição, tem sido sugerido um possível papel deste receptor nos processos de interação célula-célula (Liu et al., 1999). GPR56 pertence ao GPCR da família secretina, que tem um papel importante no desenvolvimento de células progenitoras neurais e tem sido associada a malformações do desenvolvimento do cérebro humano. Maior expressão GPR56 é correlacionada com o fenótipo de transformação celular de câncer de vários tecidos em comparação com suas contrapartes normais,

47/153 o que implica uma função potencial oncogênica. Silenciamento de GPR56 por interferência mediada com RNA resultam na indução de apoptose e crescimento independente de ancoragem reduzido de células cancerosas através de anoikis aumentada. Silenciamento GPR56 também reduz a adesão celular à matriz extracelular (Ke et al., 2007). Super-regulação de GPR56 tem sido demonstrada em glioblastoma multiforme utilizando genômica funcional. Estudos imuno-histoquímicos confirmaram a expressão de GPR56 em uma maioria de glioblastoma / amostras do tumor astrocitoma com níveis indetectáveis de expressão no cérebro adulto normal (Shashidhar et al., 2005). Em células de câncer pancreático, GPR56 mRNA é expresso em níveis elevados de proteína enquanto GPR56 é negligenciável ou indetectável nestas células, sugerindo que a expressão da proteína GPR56 é suprimida em células humanas de câncer de pâncreas (Huang et al., 2008). Estudos anteriores mostraram que a metástase relativa GPR56 é marcadamente sub-regulada em variantes altamente metastáticas de uma linhagem de células de melanoma humana, que causa a superexpressão de GPR56, que suprime a metástase e o crescimento do tumor. Acredita-se que esta supressão do crescimento é mediada pela interação de GPR56 com tecido transglutaminase (TG2), um componente generalizado de tecido e estroma, que tem sido implicado na supressão da progressão do tumor em si (Xu et al., 2006; Xu e Hynes, 2007). Outro impacto inibidor da GPR56 foi relatado para a migração de células progenitoras neurais (NPCs). GPR56 é altamente expresso em NPCs e, provavelmente, participa na regulação da circulação através de movimento NPC através da via sinalização Galpha (12/13) e Rho, sugerindo que GPR56 exerce um papel importante no desenvolvimento do sistema nervoso central (Iguchi et al., 2008).

AMPA 4 (GRIA4) receptor de glutamato, ionotrófico

Receptores (AMPARs) de glutamato a-Amino-3-hidróxi-5-metil-4isoxazolpropionato do tipo (AMPA) medeiam a neurotransmissão rápida em sinapses excitatórias no sistema nervoso central e são compostos de subunidades tomadas a partir de um conjunto de quatro proteínas, de GluR1 a GluR4 (GRIA4).

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Subunidades GRIA4 são notavelmente expressas em células de glioblastoma humano, funcionando como AMPARs permeáveis a Ca^{2 +}. Conversão para receptores impermeáveis a Ca^{2 +} inibe a locomoção celular e induz apoptose, sendo que a superexpressão de receptores AMPA permeáveis a Ca^{2 +} facilita a migração e proliferação das células tumorais. Portanto, receptores AMPA permeáveis a Ca² * parecem ter papel crucial no crescimento do glioblastoma (Ishiuchi et al., 2002).

Proteína 3 que se liga a mRNA com fator de crescimento similar à insulina 2 (IGF2BP3)

IGF2BP3 é um membro da família de proteínas do fator de crescimento II que se liga ao mRNA, implicada na localização, movimentação e controle translacional de mRNA. A proteína codificada contém vários domínios KH, que são importantes na união de RNA e conhecidos por serem envolvidos na síntese de RNA e metabolismo. Ela é expressa principalmente durante o desenvolvimento embrionário e em alguns tumores. Assim, IGF2BP3 é considerada uma proteína oncofetal (Liao et al., 2005). Informação específica sobre a expressão IGF2BP3 no glioblastoma não foi encontrada, mas IGF2BP3 é descrita como sendo superexpressa em diversas outras doenças malignas. Assim, IGF2BP3 é expressa em 30% dos 716 das amostras de células de carcinoma de células renais claras analisadas. Neste estudo, sua expressão foi associada a um estágio avançado e grau de tumores primários, bem como outras características adversas, incluindo a necrose tumoral coagulativa e diferenciação sarcomatoide. Além disso, a expressão IGF2BP3 positiva foi associada com um risco aumentado de 5010 vezes de metástases distantes e com um aumento de 42% -50% no risco de morte da RCC, sugerindo que a expressão IGF2BP3 representa um preditor independente de comportamento do tumor carcinoma de células renais claras agressivas (Hoffmann et al., 2008; Jiang et al., 2006; Jiang et al., 2008). A expressão IGF2BP3 também foi detectada em pacientes com melanoma em comparação com nevos benignos, onde nenhuma expressão foi determinada, mesmo quando as características displásicas estão presentes (Pryor et al., 2008). No câncer de endométrio, a expressão de IGF2BP3

49/153 está intimamente associada com o câncer do tipo II, do endométrio e um fenótipo histológico agressivo entre lesões neoplásicas endométricas (Zheng et al., 2008). Em 20 pacientes portadores de carcinoma de células escamosas do esôfago, a indução da resposta específica de células T no TILs, linfócitos de linfonodos regionais e linfócitos do sangue periférico contra um peptídeo epitopo de IGF2BP3 restrito a HLA-A2402 puderam ser observados em 40% dos casos (Mizukami et al., 2008). IGF2BP3 também é altamente expresso em carcinomas pancreáticos. Em 2 estudos > 90% das amostras de tecido com tumor pancreático apresentaram expressão IGF2BP3 após imunocoloração, enquanto que tecidos pancreáticos não neoplásicos foram negativos para IGF2BP3. Além disso, IGF2BP3 mRNA estava superexpresso em carcinomas de pâncreas, em comparação com amostras de tecido não neoplásica e expressão aumentada progressivamente com o estágio do tumor (Yantiss et al., 2005; Yantiss et al., 2008). Expressão IGF2BP3 também foi encontrada por ser significativamente aumentada nos tumores de alto grau urotelial enquanto não é geralmente expressa em urotélio benigna ou tumores de baixo grau urotelial. Além disso, os pacientes com tumores IGF2BP3 positivos têm uma taxa de sobrevivência livre de progressão e livre de doença muito menor do que aquelas com tumores IGF2BP3 negativos. Pacientes de IGF2BP3 positivos com carcinoma invasivo urotelial superficial no momento do diagnóstico inicial também passaram a desenvolver metastases, visto que nenhuma metástase foi encontrada em pacientes de IGF2BP3 negativo. Além disso, os dados desses estudos sugerem que IGF2BP3 podem estar envolvidos na progressão dos tumores uroteliais de baixo grau a alto grau de ambas as lesões papilares e planas (Li et al., 2008b; Sitnikova et al., 2008).

Leucoencefalopatia megalencefálica com quistos subcorticais 1 (MLC1)

Leucoencefalopatia megalencefálica com quistos subcorticais (MLC) é umdistúrbio autossômico recessivo com matéria branca cerebral em crianças. MLC é causada por mutações no gene MLC1 (llja Boor et al., 2006). De acordo com o entendimento dos inventores, não há relatos sobre

50/153 todas as associações de MLC1 com tumores cerebrais encontrados na literatura.

Um trabalho investigou a distribuição celular e regional de MLC1 em cérebro de rato (Schmitt et al., 2003). Maior expressão de MLC1 foi encontrada durante o período pré-natal e perinatal em células multipotenciais precursoras neurais. No cérebro de camundongos adultos MLC1 mRNA foi detectado exclusivamente em células gliais. Em contraste com o desenvolvimento e astrócitos maduros, oligodendrócitos são desprovidos de expressão MLC1.

Nestin (NES)

Durante o desenvolvimento, há expressão extensiva de filamentos de nestin intermediário de células gliais na camada ventricular de 11 semanas de idade pós-concepcional em todas as partes do sistema nervoso central, enquanto que a imunorreatividade de nestin diminui durante o segundo e terceiro trimestre (Takano e Becker, 1997; Lendahl et al., 1990; Zimmerman et al., 1994; Tohyama et al., 1992). Durante ou após a migração de distância da camada proliferativa ventricular, expressão nestin é fortemente diminuída nos neurônios pós-mitótico (Arnold e Trojanowski, 1996). Mancha de nestin não neoplásica do tecido do cérebro humano adulto só mostrou fraca marcação de um número muito pequeno de células endoteliais (Dahlstrand et al., 1992). Nestin pode ser re-expresso durante a transformação neoplásica (Veselska et al., 2006). Em tecidos de glioma, imunorreatividade nestin ocorre apenas nas células tumorais e a quantidade de nestin produzido aumenta à medida que o grau de glioma torna-se mais maligno com relação ao glioblastoma. Glioblastomas (grau IV de malignidade) expressam a maior incidência de células nestin-positivas e, em geral, os maiores níveis de coloração nestin. Expressão de nestin pode ser detectada nas células tumorais de diversos tipos de tumores primários do CNS, que são de origem neuroectodérmica, mas não em células de carcinoma metastático (Dahlstrand et al., 1992; Tohyama et al., 1992). Nestin quase não é expresso em astrocitomas difusos, variavelmente expresso em astrocitomas anaplásicos e fortemente expresso e expresso de forma

51/153 irregular em glioblastomas, onde a sua distribuição varia de forma complementar com GFAP e Vimentina (Schiffer et al., 2006). Clinicamente, células germinativas de tumores CNS nestin negativas não apresentaram divulgação, enquanto todos os tumores que exibiam divulgação também fortemente expressaram a proteína nestin (Sakurada et al., 2007).

As células tumorais que expressam fortemente nestin geralmente estão localizadas próximas aos vasos sanguíneos (Dahlstrand et al., 1992), (Kurihara et al., 2000; Sugawara et al., 2002; Florenes et al., 1994; Strojnik et al., 2007) e expressão nestin endotélia ativada tem sido sugerida como um marcador de angiogênese (Teranishi et al., 2007; Maderna et al., 2007; Amoh et al., 2005; Mokry et al., 2004).

GBM compreende precursores transformados que suportam o conjunto completo de características funcionais esperadas de células-tronco, incluindo a capacidade de geração de tumor. Estas células podem estabelecer GBM, mesmo após o transplante de série e podem ser identificadas como células-tronco neurais de tumor (Galli et al., 2004). Essas células pertencem à subpopulação de células CD133+ de tumores cerebrais humanos e coexpressam o marcador nestin NSC, mas não diferenciam marcadores de linhagem neural (Singh et al., 2004b; Singh et al., 2003; Singh et al., 2004a; Mao et al., 2007). A presença de população CD133+/nestin+ em tumores cerebrais sugere que uma célula-tronco neural normal pode ser a célula de origem dos gliomas (Shiras et al., 2007). Como a sinalização Notch está ativa em tumores cerebrais e células-tronco, tem sido demonstrado que o promotor nestin pode ser ativado em cultura através da atividade Notch (Shih and Holland, 2006).

Transfecção da linhagem celular C6 de astrocitoma do rato com dúplex nestin siRNA, revelou uma influência efetiva de supressão de siRNA nestin no crescimento celular de células de astrocitoma cultivadas de maneira dependente de dose (Wei et al., 2008).

A expressão nestin também tem sido relatada para célulastronco cancerosas na próstata (Gu et al., 2007; Gipp et al., 2007) e câncer de pâncreas (Carriere et al., 2007) bem como no melanoma (Klein et al.,

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2007). Além disso, nestin também se expressa nos seguintes tumores: GIST (Tsujimura et al., 2001; Sarlomo-Rikala et al., 2002), melanomas (Florenes et al., 1994; Brychtova et al., 2007), câncer colorretal (Teranishi et al., 2007) e tumores pancreáticos (Ohike et al., 2007; Kleeberger et al., 2007).

Expressão de nestin também pode ser encontrada em vários tecidos normais: Expressão de nestin tem sido relatada em podócitos de glomérulos de rim em humanos normais adultos. Em condições normais nestina é expressa em vários tipos de célula glomerular em estágios iniciais de desenvolvimento e torna-se limitado a podócitos em glomérulos maduros (Ishizaki et al., 2006), indicando que nestina é crítica para alguns aspectos da função podócita. Glomérulos adultos exibem imunorreatividade nestin em células que expressam vimentina com a morfologia podócita (Bertelli et al.,

2007). Através de uma interação com vimentina nestin possivelmente serve para reforçar a resistência mecânica de podócitos que experienciam estresse de alta tensão durante a filtração glomerular (Perry et al., 2007). Assim, no rim humano, nestin é expresso desde os primeiros passos de glomerulogênese dentro de células podócitas, mesangiais e endoteliais. Esta expressão é, então, restrita aos podócitos em glomérulos maduros e não pode ser detectada em outras estruturas do rim humano adulto (Su et al.,

2007). Imuno-histoquímica revelou expressão nestin constante no córtex de glândulas suprarrenais de seres humanos normais. Nestin expressando células são predominantemente localizadas na zona reticular, onde carcinomas adrenals exibem um número variável de células imunorreativas a nestin (Toti et al., 2005).

Expressão de nestin também é relatada a partir de células intersticiais de Cajal (ICC) no trato gastrointestinal normal. Assim CIC mais intramuscular no antro e todos ICC mientéricos do intestino delgado são imunorreativos a nestin bem como alguns ICC mioentéricos e a maioria de ICC na musculatura circular do cólon (Vanderwinden et al., 2002). No pâncreas, as células imunorreativas a nestin podem ser encontradas em ilhotas, e na porção exócrina. Na área de grandes duetos pancreáticos, células nestin positivas representam pequenos capilares espalhados no

53/153 tecido conjuntivo em tomo do epitélio dos duetos. Assim, nestin é expressa por células do endotélio vascular no pâncreas humano (Klein et al., 2003). Nas ilhotas em si, as células progenitoras das ilhotas que expressam nestin puderam ser encontradas. A hipótese é que essas células progenitoras de nestin positivo derivadas de ilhotas são uma população distinta de células que residem dentro de ilhotas pancreáticas e podem participar nas neogênese de células endócrinas de ilhotas (Zulewski et al., 2001). No fígado adulto normal, uma população de células-tronco do fígado humano, que é positiva para vimentina e nestin, pôde ser isolada (Herrera et al., 2006). Em experimentos de cultura celular, a análise do citoesqueleto e da composição da matriz por imunocoloração revelou que células adultas fetais derivadas do pulmão e da medula expressam proteínas vimentinas e nestin em filamentos intermediários (Sabatini et al., 2005). Em dentes permanentes jovens, nestin é encontrado em odontoblastos funcionais. Sua expressão é sub-regulada e nestin é ausente em dentes permanentes mais velhos, enquanto que em dentes cariados e feridos - por outro lado - ele é sobrerregulado (About et al., 2000).

Células-tronco adultas expressando nestin também podem ser encontradas na região perilumenal da hipófise anterior madura, através do mapeamento direcionado genético induzível foi demonstrado que eles servem para gerar subconjuntos de todos os seis tipos de células endócrinas terminalmente diferenciadas da glândula pituitária. Essas células-tronco, apesar de não ter um papel importante na organogênese, passam por uma expansão pós-natal e começam a produzir descendência diferenciada, que colonizam o órgão que, inicialmente e inteiramente é composto por células diferenciadas derivadas de precursores embrionários (Gleiberman et al.,

2008).

Subfamília receptora nuclear 2, grupo E, membro 1 (NR2E1)

NR2E1 (TLX) é um fator de transcrição que é essencial para a proliferação de células-tronco neurais e autorrenovação pelo recrutamento de histonas desacetilases (HDACs) aos seus genes alvos a jusante para reprimir a sua transcrição que, por sua vez, regula a proliferação de células

54/153 tronco neurais. Recrutamento de HDACs leva à repressão da transcrição de genes-alvo TLX, ao inibidor de quinase dependente de ciclina, ao p21 (CIP1/WAF1) (p21), e ao gene supressor de tumor PTEN (Sun et al., 2007). A subfamília TLX/HOX11 de genes homeobox divergentes está envolvida em vários aspectos da embriogênese e, no caso de TLX1/HOX11 e TLX3/HOX11L2, tem um lugar de destaque como oncogenes em leucemia linfoblástica aguda de células T humanas (Dixon et al., 2007). NR2E1 foi submetido a um programa de desenvolvimento fundamental de organização da retina e controla a geração dos números adequado de progênies na retina e o desenvolvimento de células gliais durante o período prolongado de retinogênese (Miyawaki et al., 2004). Não há informações específicas encontradas sobre glioblastoma.

Molécula de adesão celular neuronal (NRCAM)

NRCAM humana (molécula de adesão celular relacionadas à neuroglia) é mais expressa em tecido glioblastoma multiforme (GMT), em comparação ao tecido normal do cérebro (NBT). NRCAM é descrita como proteína transmembrana tipo I de passagem única que interage com anquirina. hNRCAM antisenso causou redução na expressão hNRCAM nativa, mudanças na morfologia celular, taxa de proliferação celular reduzida e alongamento do ciclo celular. Além disso, a superexpressão hNRCAM antissenso nessas células causou redução extensa em número de colônias de ágar macio e invasão através de gel extracelular (ECM) da matriz in vitro. A injeção subcutânea de hNRCAM antissenso sobrexpressando células do glioblastoma em ratos nus causaram inibição completa da formação do tumor em relação a células transfectadas exclusivas de vetor. Inoculação intratumoral de hNRCAM antissenso plasmídeo expressando o crescimento do tumor também causou lentidão em camundongos nus in vivo (Sehgal et al., 1999). Análise de RT-PCR gene-específica indicaram que hNRCAM é superexpresso em astrocitomas de alto grau, gliomas e tecidos do tumor glioblastoma em comparação ao tecido normal do cérebro (Sehgal et al., 1998). NRCAM, uma molécula de adesão célula-célula da imunoglobulina da família molecular de adesão celular tipo imunoglobulina, conhecida por sua

55/153 função no crescimento e orientações neuronais, foi recentemente identificada como um gene alvo da sinalização beta-catenina em células e tecidos de melanoma humano e carcinoma de cólon. Transdução NRCAM mediada de modo retroviral em fibroblastos induz a motilidade e tumorigênese celular (Conacci-Sorrell et al., 2005). A indução de transcrição NRCAM por betacatenina ou placoglobina desempenha um papel na tumorigênese do melanoma e câncer do cólon, provavelmente por promover o crescimento celular e a motilidade (Conacci-Sorrell et al., 2002). Também outros alvos na sinalização beta-catenina são sobrerregulados como MYC (Liu et al.,

2008). NrCAM é superexpressa em carcinomas papilares humanos nos níveis de mRNA e de proteína, independentemente do estágio do tumor (Gorka et al., 2007).

A superexpressão de mRNA NRCAM nos tumores é associada com índices de proliferação alta e está associada a um pior prognóstico nos ependimomas (Zangen et al., 2007).

Podoplanina (PDPN)

PDPN é uma glicoproteína integral de membrana tipo I similar a mucina com uma distribuição diversificada em tecidos humanos. Ela está envolvida na migração de células cancerosas, invasão, metástase e progressão maligna e também está envolvida na agregação plaquetária. CLEC-2 é o primeiro receptor fisiopatológico identificado da podoplanina (Kato et al., 2008). 115 glioblastomas foram investigados por meio de imunoistoquímica com anticorpo anti-PDPN. 47% dos glioblastomas PDPN expressa nas células da superfície, especialmente em torno de áreas de necrose e células endoteliais de proliferação. Além disso, PDPN mRNA e expressão de proteínas foram significativamente mais altos no glioblastoma do que em astrocitomas anaplásicos, sugerindo que a expressão PDPN pode estar associada com a malignidade de astrócitos (Mishima et al., 2006). PDPN também mostrou ser expresso em 82,9% dos glioblastomas (29/35) em uma outra análise (Shibahara et al., 2006). Em um estudo investigando expressão PDPN e atividades de agregação de plaquetas de linhagens celulares do glioblastoma, LN319 altamente expressou PDPN e induziu a agregação

56/153 plaquetária. NZ-1, que é um anticorpo altamente reativo e anti-PDPN, neutralizou agregação plaquetária por LN319 sugerindo que PDPN é a principal razão para a agregação plaquetária induzida por (Kato et al., 2006). Níveis PDPN de expressão de gene foram significativamente maiores nos glioblastomas do que em matéria branca não neoplásica, que foi confirmado por imuno-histoquímica (Scrideli et al., 2008). PDPN é especificamente expressa pelo sangue linfático, mas não células do endotélio vascular na cultura e na linfangiogênese associada ao tumor. Embora PDPN tenha sido essencialmente ausente da epiderme humana normal, sua expressão foi fortemente induzida em 22 dos 28 carcinomas espinocelulares, sugerindo um papel para PDPN na progressão tumoral (Schacht et al., 2005). PDPN é super-regulado na frente invasiva de uma série de carcinomas humanos. Investigação de expressão PDPN em cultura de células humanas de câncer de mama, em um modelo do rato de carcinogênese da célula beta pancreática, e em biópsias de câncer humano, indicou que PDPN promove a invasão de células tumorais in vitro e in vivo. PDPN induz a migração coletiva celular através da formação de filopodia pela regulação negativa das atividades de GTPases da família Rho pequena. Em conclusão, PDPN induz uma via alternativa de invasão das células tumorais na ausência de transição epitelial-mesenquimal, (Wicki et al., 2006) nível de expressão PDPN foi reforçada na maioria dos pacientes com tumores colorretais (Kato et al., 2003), TGF-beta é suposto em ser um regulador fisiológico da PDPN em células tumorais (Suzuki et al., 2008), PDPN é expressa por células cancerosas provenientes de esôfago, pulmão, fígado, cólon e mama, bem como células endoteliais linfáticas (Kono et al., 2007).

Tenascina C (hexabraxion) (TNC)

A expressão da TNC glicoproteína da matriz extracelular no glioblastoma, mas não no cérebro normal e sua associação com a membrana basal glioblastoma-proliferativa endotélio sugeriram já em 1983 que a TNC pode ser um marcador útil de gliomas (Bourdon et al., 1983). Durante a progressão do tumor, o ECM dos tecidos do tumor é remodelado e agora oferece um ambiente que é mais adequado para a progressão do

57/153 tumor, que a angiogênese é um passo crucial (Carnemolla et al., 1999). Além disso, TNC é superexpressa em vasos tumorais que têm um alto índice proliferativo, que indica que a TNC está envolvida na angiogênese neoplásica (Kim et al., 2000). Nos tumores, a expressão TNC pode ser induzida por hipóxia (Lal et al., 2001). Indução TNC é mediada por TGF-beta1, fornecendo um mecanismo para a invasão de gliomas de alto grau em parênquima saudável (Hau et al., 2006). Além disso, a superexpressão TNC é uma consequência da ativação específica do promotor do gene C-tenascina pela gastrina, que é conhecida por significativamente modular a migração de células de glioblastoma humano (Kucharczak et al., 2001). TNC subregula tropomiosina-1 e, assim, desestabiliza fibras estresse de actina. Ela também provoca sub-regulação do inibidor Wnt Dickkopfl. Como expressão reduzida de tropomiosina-1 e sinalização elevada de Wnt estão diretamente ligadas à transformação e gênese tumoral. TNC, especificamente, modula estas vias de sinalização para melhorar a proliferação de células de glioma (Ruiz et al., 2004).

Coloração perivascular da TNC em torno de vasos sanguíneos que abastecem o tumor é observada em tecidos glioblastoma, enquanto que em gliomas WHOII e III, a coloração perivascular TNC é menos frequente, indicando que a intensidade da coloração TNC se correlaciona com o grau de tumor e a coloração mais forte indica um mau prognóstico (Herold-Mende et al., 2002; Zukiel et al., 2006). Maior expressão TNC é observada no tecido conjuntivo envolvendo tumores (Chiquet-Ehrismann and Tucker, 2004). TNC também contribui para a geração de um nicho de células-tronco dentro da zona subventricular (SVZ), exercendo a função de orquestrar o fator de crescimento sinalizando uma aceleração do desenvolvimento de célulastronco neurais. TNC é essencial para a expressão acelerada do EGFR nas células-tronco neurais e ainda reforça sinalização FGF2. O efeito predominante da TNC em células no SVZ é a regulamentação da progressão desenvolvimental (Garcion et al., 2004). TNC é o indutor mais forte de migração de NSC humanas dirigidas (haptotaxia). A ECM produzida por tumor oferece, assim, um ambiente permissivo para um tropismo NSC para

58/153 células tumorais disseminadas (Ziu etal., 2006).

A via TNC também desempenha um papel importante no crescimento do tumor mamário e metástases. Assim, o bloqueio de sinalização ou a degradação de TNC em células MDA-MB-435 resultou em um prejuízo significativo na migração celular e na proliferação celular de fixação independente. Os ratos injetados com células clonais MDA-MB-435 com expressão reduzida de TNC demonstraram uma diminuição significativa no crescimento do tumor primário, bem como uma diminuição da recidiva tumoral após a remoção cirúrgica do tumor primário e uma diminuição na incidência de metástase pulmonar (Calvo etal., 2008).

Survivina (BIRC5)

Expressão de BIRC5 (survivina), um membro do inibidor da família de proteína de apoptose (IAP), é elevada em tecidos fetais e em vários cânceres humanos, com expressão muito reduzida no tecido de adulto normal diferenciado, especialmente se o seu índice de proliferação é baixa. Survivina parece ser capaz de regular tanto a proliferação celular como a morte celular apoptótica. Apesar da survivina geralmente ser localizada na região citoplasma celular e associada, também têm sido relatados prognósticos pobres sobre o câncer, localização nuclear e indicativos de prognóstico favorável (O'Driscoll et al., 2003). Regulamento de survivina e através dela tem sido descrito por diversos mecanismos. Survivina parece estar associada com a chaperone Hsp60 molecular. In vivo, Hsp60 é abundantemente expressa em tumores primários humanos em comparação tecidos normais direcionados. Ablação aguda de Hsp60 por RNA de baixa interferência desestabiliza a piscina mitocondrial de survivina, induz disfunção mitocondrial e ativa a apoptose caspase-dependente (Ghosh et al., 2008). Além disso, a inibição de Ras resulta na liberação do survivina freio na apoptose e na ativação da via apoptótica mitocondrial. Especialmente no glioblastoma, a resistência a apoptose pode ser abolida por um inibidor de Ras que atinge a survivina (Blum et al., 2006). Também parece haver uma correlação entre hiperatividade NF-kappaB em gliomas e hiperexpressão da survivina, um dos genes-alvo NF-kappaB. Assim, os genes NF-kappaB

59/153 ativados antiapoptóticos são hiperexpressos em amostras de tumor. Especialmente no glioblastoma, níveis muito altos de expressão de survivina são detectáveis (Angileri et al., 2008). É sugerido que a superexpressão de survivina em gliomas cerebrais pode desempenhar um papel importante na proliferação maligna, na antiapoptose e na angiogênese (Zhen et al., 2005; Liu et al., 2006b). Várias análises foram realizadas para estudar a expressão de survivina e seu impacto na sobrevivência em glioblastoma. Para resumir, a expressão de survivina, especialmente a expressão simultânea nos núcleos e citoplasma em tumores astrocíticos foi significativamente associada com o grau de malignidade (survivina com a maior expressão no glioblastoma) e com o tempo de sobrevivência global menor em comparação com pacientes que tiveram tumores de survivina negativa (Kajiwara et al., 2003; Saito et al., 2007; Uematsu et al., 2005; Mellai et al., 2008; Grunda et al., 2006; Xie et al., 2006; Sasaki et al., 2002; Chakravarti et al., 2002).

Superexpressão de survivina tem sido descrita também para entidades de outro tumor. No câncer de mama, a expressão survivina está associada com o grau mais elevado e menor sobrevivência livre de doença (Yamashita et al., 2007; Al-Joudi et al., 2007; Span et al., 2004). Em linhagem celular de câncer de esôfago, a atividade promotora de survivina mostrou ser 28,5 vezes maior do que em tecidos normais (Sato et al., 2006). No câncer colorretal, a expressão de survivina também é associada com o grau patológico e com a metástase linfonodal (Tan et al., 2005) . A agressividade do carcinoma de células renais claras demonstrou estar associada com a expressão de survivina. Além disso, a expressão da survivina está inversamente associada com a sobrevivência específica do câncer (Kosari et al., 2005). A expressão de survivina pode ser detectada em um painel de neoplasias queratinocíticas e lesões de pele hiperproliferativas, mas não em pele normal (Bowen et al., 2004). Em linhagens celulares do câncer pancreatítico, a survivina foi ampliada em 58% das linhagens celulares testadas (Mahlamaki et al., 2002). No carcinoma de células escamosas, a expressão de survivina pode ajudar a identificar os casos com fenótipo clínico mais agressivo e invasivo (Lo etal., 2001).

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Como a survivina é um alvo promissor para o tratamento de câncer, os estudos com peptídeos derivados de survivina mostraram que survivina é imunogênica em pacientes com tumor, elicitando respostas mediada por células T CD8 +. Além disso, survivina especificamente estimulou reatividade de células T CD4+ em linfócitos periféricos do sangue dos mesmos pacientes (Casati etal., 2003; Piesche et al., 2007).

Survivina (SVN, BIRC) é superexpressa em uma infinidade de entidades do câncer. Assim, em geral, acredita-se que a superexpressão da survivina está associada com menor sobrevivência global, e níveis de malignidade mais elevados.

A presente invenção também refere-se a proteínas marcadoras específicas, que podem ser usadas no prognóstico do glioblastoma. Além disso, a presente invenção também diz respeito à utilização destes novos alvos para o tratamento do câncer.

Conforme previsto neste documento, as proteínas GFAP, FABP7, DTNA, NR2E1, SLCO1C1, CHI3L1, ACSBG1, IGF2BP3, NLGN4X, MLC1, NRCAM, BCAN, EGFR, PDPN, NES, e CLIP2 são altamente superexpressas em comparação com glioblastomas normais do cérebro e outros tecidos vitais (por exemplo, rim, fígado, coração). Foi comprovado que as proteínas GRP56, CSPG4, NRCAM, TNC, BIRC5, CLIP2, NES, PDPN, EGFR, BCAN, GRIA4 têm um papel importante na tumorigênese, pois elas estão envolvidas na transformação maligna, no crescimento celular, angiogênese, proliferação e invasão em tecido normal.

As proteínas NES, TNC, BIRC5, EGFR estão associadas com células-tronco de câncer ou nichos de células-tronco no glioblastoma. Células-tronco cancerosas são uma subpopulação de células tumorais com a autorrenovação potencial necessária para o crescimento do tumor sustentado. Estas células residem em estruturas especializadas e altamente organizadas, os chamados nichos de células-tronco cancerosas que são necessários para a manutenção do potencial de autorrenovação das célulastronco cancerosas. A superexpressão das proteínas BIRC5, NRCAM, IGF2BP3 nos tumores demonstrou ser associada com estágios avançados

61/153 da doença e pior prognóstico para os pacientes.

Foi constatado que BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN podem desempenhar um papel importante na remodelação tissular necessária para o crescimento do tumor no sistema nervoso. Portanto, a expressão de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN pode ser usada como um marcador para distinguir glioblastoma de outras formas de câncer.

Assim, a presente invenção fornece métodos de identificação de animais, de preferência humanos que provavelmente tenham glioblastoma. Em uma modalidade, a probabilidade determinada é de 80% para 100%. Um tal método compreende a determinação do nível de pelo menos uma das proteínas BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN em uma amostra de tumor do animal testado. Em uma modalidade, a amostra é obtida através de cirurgia radical. Em outra modalidade, a amostra é obtida por biópsia de agulha.

Quando o nível de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN como determinado for de 20% ou mais de super-regulação em células em relação à regulação determinada em células epiteliais benignas da mesma amostra, o indivíduo analisado animal é identificado como sendo provavelmente portador de glioblastoma.

Quanto mais diferentes proteínas do grupo composto por BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN estiverem superreguladas, maior a possibilidade de o indivíduo analisado animal ser identificado como portador de glioblastoma.

Em uma modalidade, a determinação do nível de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN é realizada in situ. Em uma outra modalidade, a determinação do nível de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN é realizada in vitro. Ainda em uma outra modalidade, a determinação do nível de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN é realizada in vivo. Em uma modalidade preferida, a determinação do nível do BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN é realizada pela captação do laser microscópico acoplado

62/153 a um (Microscópio de Capturas por Laser) Western Blot.

Em uma modalidade especial, a determinação do nível de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN é realizada com um anticorpo específico para BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou 5 PDPN. Em uma modalidade adicional, a determinação do nível de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN é realizada por PCR com um iniciador específico para uma codificação do mRNA BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN. Em uma outra modalidade adicional, a determinação do nível de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, 10 NRCAM ou PDPN é realizada por PCR com uma sonda de nucleotídeos específica para uma codificação de mRNA BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN. Em uma modalidade, a determinação do nível de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN é realizada usando um Northern blot. Em uma outra modalidade, a determinação do 15 nível de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN é obtida através de um ensaio de proteção a ribonuclease. Em outras modalidades, testes imunológicos, como ensaios de imunoabsorção de enzimas (ELISA), radioimunoensaios (RIA), e Western blots podem ser usados para detectar BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e polipeptídeos PDPN em 20 uma amostra de fluido corporal (tais como sangue, soro, saliva, urina ou líquido peritoneal). Biópsias, amostras de tecidos e amostras de células (tais como ovários, linfonodos, raspas da superfície do ovário das células epiteliais, biópsias de pulmão, biópsias do fígado, e qualquer amostra de fluido que contém células, como p. ex. no líquido peritoneal, expectoração, e 25 derrame pleural) podem ser testadas pela desagregação e/ou solubilização da amostra de tecido ou célula e submetidas a um imunoensaio para detecção de polipeptídeos, como o ELISA, RIA, ou Western blot. Tais células ou amostras de tecido também podem ser analisadas por métodos à base de ácido nucleico, por exemplo, revertendo a reação de polimerase em 30 cadeia (RT-PCR), amplificação de hibridização da Northern, ou mancheamento por ranhura ou pontos. Para visualizar a distribuição das células do tumor dentro de uma amostra de tecido, testes de diagnóstico que

63/153 preservam a estrutura do tecido de uma amostra, por exemplo, imunocoloração, a hibridização in situ de RNA, ou in situ RT-PCR podem ser empregadas para detecção de polipeptídeo marcador de glioblastoma ou mRNA, respectivamente. Por localização in vivo das massas tumorais, exames de imagem como a ressonância magnética (RM) podem ser empregados introduzindo ao indivíduo de teste um anticorpo que se liga especificamente um polipeptídeo BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN (particularmente uma célula polipeptídica localizada na superfície), onde o anticorpo é conjugado ou acoplado a um marcador paramagnético (ou outra porção adequada para detecção, dependendo do método de imagem usado), alternativamente, a localização de um anticorpo não classificado específico do marcador de tumor pode ser detectado através de um anticorpo secundário acoplado a uma porção detectável.

Além disso, a presente invenção ainda fornece proteínas/peptídeos quiméricos/fusionais compreendendo os polipeptídeos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e/ou PDPN, assim como fragmentos dos mesmos, incluindo fragmentos funcionais, proteolíticos e antigênicos.

O parceiro de fusão ou as secções de uma molécula híbrida apropriada produzem epítopos que estimulam as células T CD4+. Os epítopos que estimulam as CD4+ são bem conhecidos no estado da técnica, e incluem aqueles identificados no toxoide tetânico. Em uma variante preferida, o peptídeo é uma proteína de fusão, em particular compreendendo aminoácidos de terminal N da cadeia invariante HLA-DR associada ao antígeno (li). Em uma outra variante da invenção, o peptídeo é uma proteína humana truncada ou uma proteína de fusão de um fragmento de proteína e outra parte polipeptídica, desde que a parte humana inclua uma ou mais sequências de aminoácidos conforme a invenção.

Anticorpos para os polipeptídeos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN, para as proteínas quiméricas/de fusão compreendendo os polipeptídeos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN, bem como os fragmentos de polipeptídeos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN, incluindo fragmentos proteolíticos e

64/153 antigênicos e para proteínas/peptídeos quiméricos/de fusão contendo estes fragmentos também são parte integrante da presente invenção. Além disso, métodos de uso destes anticorpos para o prognóstico de câncer, e em particular, de glioblastoma também fazem parte da presente invenção.

Os anticorpos da presente invenção podem ser anticorpos policlonais, anticorpos monoclonais e/ou anticorpos quiméricos. Linhagens celulares imortais que produzem um anticorpo monoclonal da presente invenção também fazem parte da presente invenção.

Um profissional de competências normais na matéria vai entender que em alguns casos, maior expressão de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN como um gene marcador tumoral irá indicar um pior prognóstico para um paciente de teste com glioblastoma. Por exemplo, níveis relativamente elevados de expressão BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN pode indicar um tumor primário relativamente grande, uma maior carga tumoral (por exemplo, mais metástases), ou um fenótipo de tumor relativamente mais maligno.

Quanto mais diferente a superexpressão das distintas proteínas do grupo composto por BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN, pior é o prognóstico para um paciente.

Os métodos de diagnóstico e prognóstico da invenção envolvem o uso de métodos conhecidos, como por exemplo, os métodos baseados em anticorpos para detectar polipeptídeos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN assim como métodos baseados em hibridização e/ou de amplificação de ácido nucleico para detecção de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e/ou PDPN mRNA.

Além disso, já que a destruição rápida de células tumorais geralmente resulta na geração de autoanticorpos, os marcadores de tumor glioblastoma da invenção podem ser usados em testes sorológicos (por exemplo, um teste ELISA de soro de um paciente) para detectar autoanticorpos contra BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN em um paciente. Níveis de autoanticorpos específicos de polipeptídeo BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN são pelo menos cerca de

65/153 vezes maior (e de preferência pelo menos cinco ou sete vezes maior, mais preferivelmente pelo menos 10 vezes ou 20 vezes maior) do que em uma amostra de controle, sâo indicativos de glioblastoma.

Polipeptídeos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN intracelulares, secretados e localizados na superfície da célula podem ser empregados para a análise de biópsias, por exemplo, tecidos ou amostras de células (incluindo células obtidas de amostras de líquidos como fluido da cavidade peritoneal) para identificar uma biópsia de tecido ou célula como contendo células de glioblastoma. Uma biópsia pode ser analisada como um tecido intacto ou como uma amostra de células inteiras, ou a amostra de tecido ou de células podem ser desagregadas e/ou solubilizadas como necessárias para o tipo específico de teste de diagnóstico a ser utilizado. Por exemplo, biópsias ou amostras podem ser submetidas à análise do tecido inteiro ou da célula inteira dos níveis dos polipeptídeos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN ou mRNA in situ, por exemplo, usando imuno-histoquímica, hibridização in situ do mRNA, ou RT-PCR in situ. O profissional habilidoso saberá como processar tecidos ou células para análise de polipeptídeos ou níveis de mRNA utilizando métodos imunológicos, como ELISA, immunoblotting, ou métodos equivalente, ou a análise dos níveis de mRNA baseada em ácido nucleico através de métodos analíticos, tais como RT-PCR, hibridização Northern, ou mancheamento por ranhura ou pontos.

Kits para medição dos níveis de expressão de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN

A presente invenção fornece kits para a detecção de um nível maior de expressão de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN como um gene marcador de glioblastoma em um indivíduo testado. Um kit para a detecção de polipeptídeo marcador de glioblastoma de preferência que contenha um anticorpo que se liga especificamente a um polipeptídeo marcador do glioblastoma escolhido. Um kit para a detecção de mRNA marcador glioblastoma de preferência contendo um ou mais ácidos nucleicos (por exemplo, um ou mais iniciadores ou provas de oligonu66/153 cleotídeos, provas de DNA, provas de RNA, ou modelos para a geração de provas de RNA), que hibridizam especificamente com o BCA, CLIP2, DTNA,

NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN mRNA.

Particularmente, o kit baseado em anticorpos pode ser usado para detectar a presença de - e/ou medir o nível dos - polipeptídeos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e/ou PDPN que sejam especificamente ligados pelo anticorpo ou fragmento imunorreativo dos mesmos. O kit pode incluir um anticorpo reativo com o antígeno e um reagente para a detecção de uma reação do anticorpo com o antígeno. Tal kit pode ser um kit de ELISA e pode conter um controle (por exemplo, uma determinada quantidade de um polipeptídeo marcador de um glioblastoma específico), primário e secundário de anticorpos quando for o caso, e quaisquer outros reagentes necessários, tais como grupos detectáveis, substratos de enzimas e reagentes de cor como descrito acima. O kit de diagnóstico pode, alternativamente, ser um kit imunoblot geralmente contendo os componentes e reagentes descritos.

Um kit baseados em ácido nucleico pode ser usado para detectar e/ou medir o nível de expressão de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN através da detecção e/ou medição da quantidade de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN mRNA em uma amostra, como uma biópsia do tecido ou célula. Por exemplo, um kit de RTPCR para detecção de expressão elevada de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN contendo de preferência iniciadores suficientes para realizar a transcrição reversa do mRNA marcador de glioblastoma para cDNA e amplificação PCR do cDNA marcador de glioblastoma, que de preferência também conterá moléculas e iniciadores de modelo de controle PCR para efetuar controles adequados positivos e negativos, e controles internos para a quantização. Um profissional de competências normais na matéria vai entender como selecionar os iniciadores adequados para realizar a transcrição reversa e reações PCR assim como as reações de controle adequadas a serem realizadas. Essa orientação é encontrada, por exemplo, em F. Ausubel et al., Current Protocols in Molecular Biology, John Wiley &

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Sons, New York, N.Y., 1997. Numerosas variações RT-PCR são conhecidas na matéria. Entrega direcionada de imunotoxinas a BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN podem ser empregados como alvos terapêuticos para o tratamento ou prevenção de glioblastoma. Por exemplo, uma molécula de anticorpo que se liga especificamente a polipeptídeos BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN localizados na superfície da célula, que podem ser conjugados com um radioisótopo ou outros compostos tóxicos. Conjugados de anticorpos são administrados ao indivíduo de teste de modo que a ligação do anticorpo a seus resultados polipeptídeos de glioblastoma cognato na entrega prevista do composto terapêutico para as células do glioblastoma, tratando assim um câncer de ovário.

O grupo terapêutico pode ser uma toxina, radioisótopo, fármaco, produto químico ou uma proteína (vide, por exemplo, al Bera al. Pharmacokinetics and antitumor activity of a bivalent disulfide-stabilized Fv immunotoxin with improved antigen binding to erbB2 Cancer Res. 59:40184022 (1999)). Por exemplo, o anticorpo pode ser ligado ou conjugado a uma toxina bacteriana (por exemplo, a toxina da difteria, pseudomonas exotoxinas A, toxina da cólera) ou toxina da planta (por exemplo, a toxina ricina) para a entrega alvejada da toxina para uma célula que expressa BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1 NRCAM e PDPN. Esta imunotoxina pode ser entregue a uma célula e ao se ligar a polipeptídeo marcador de glioblastoma localizados na superfície da célula, a toxina conjugada ao anticorpo específico do marcador glioblastoma será entregue para a célula.

Um outro aspecto da presente invenção refere-se a um anticorpo que se liga especificamente a um complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) classe I ou II complexado com um antígeno restrito a HLA (A seguir também designado como anticorpo específico do complexo). Um outro aspecto da presente invenção está relacionado com um método para a produção de tal anticorpo que se liga especificamente a um complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II complexado com um antígeno HLA-restrito, o método compreendendo: um imunizante

68/153 geneticamente modificado não humano compreendendo células de mamíferos expressando os principais complexos de histocompatibilidade humana (MHC) de classe I ou II com uma forma solúvel de uma classe de moléculas de MHC I ou II complexada com o dito antígeno HLA-restrito; isolando moléculas de mRNA de células produtoras de anticorpos do dito mamífero não humano, produzindo uma biblioteca de visualização de fagos exibindo proteína moléculas codificadas por moléculas de mRNA disse, e isolando pelo menos uma biblioteca fagos da dita visualização de fagos, sendo que pelo menos um fago exibindo o dito anticorpo específico ligável para o dito complexo de histocompatibilidade humana principal (MHC) de classe I ou II complexado com o dito antígeno HLA-restrito. Respectivos métodos para produzir tais anticorpos e complexos de histocompatibilidade principal de classe I em cadeia única, bem como outras ferramentas para a produção destes anticorpos são descritos em WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, and Cohen CJ, Denkberg G, Lev A, Epel M, Reiter Y. Recombinant antibodies with MHC-restricted, peptide-specific, T-cell receptor-like specificity: new tools to study antigen presentation and TCR-peptide-MHC interactions. J Mol Recognit. 2003 SetOut, 16 (5):324-32.; Denkberg G, Lev A, L Eisenbach, Benhar I, Reiter Y. Segmentação seletiva de melanoma e APCs usando um anticorpo com especificidade TCR, dirigidas a um antígeno de diferenciação melanoma. J Immunol. 2003 Sep 1; 171 (5):2197-207; e Cohen CJ, Sarig O, Yamano Y, Tomaru U, Jacobson S, Reiter Y. Análise direta fenotípica de apresentação de antígenos MHC classe I humanos: visualização, quantificação e detecção in situ de epítopos humanos virais usando peptídeos específicos, anticorpos humanos recombinantes restritos de MHC. J Immunol. 2003 15 de abril, 170 (8):4349-61, que, para efeitos da presente invenção, são explicitamente incorporados por referência em suas totalidades.

Preferencialmente, o anticorpo é obrigatório, com uma afinidade de ligação com é menor do que 20 nanomolares, de preferência abaixo dos 10 nanomolares, para o complexo, que é considerado específico no contexto da presente invenção.

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O termo anticorpo é usado aqui em sentido amplo e inclui tanto anticorpos policlonais e como monoclonais. Além de moléculas de imunoglobulina intacta, também estão incluídos no conceito de anticorpos fragmentos ou polímeros de moléculas de imunoglobulinas e as versões humanizadas de moléculas de imunoglobulinas, desde que eles apresentem uma das propriedades desejadas (por exemplo, sendo um complexo de anticorpos específicos como acima, a entrega de uma toxina de uma célula de câncer que expresse um gene marcador de câncer - de preferência glioblastoma - em um nível mais elevado e/ou iniba a atividade de uma proteína marcadora de câncer, como survivina) aqui descritas.

Além disso, para qualquer polipeptídeo BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN, para o qual existe um ligante específico (por exemplo, um ligante que se liga uma proteína da superfície celular localizada), o ligante pode ser usado no lugar de um anticorpo para atingir um composto tóxico para a célula do glioblastoma, como descrito acima.

Sempre que possível, os anticorpos da invenção podem ser adquiridos a partir de fontes comerciais. Os anticorpos da invenção também podem ser gerados através de métodos bem conhecidos. O versado na técnica vai entender que todo o comprimento dos polipeptídeos marcadores de glioblastoma ou fragmentos do mesmo podem ser usados para gerar os anticorpos da invenção. Um polipeptídeo a ser usado para gerar um anticorpo da invenção pode ser total ou parcialmente purificado a partir de uma fonte natural, ou podem ser produzidos utilizando técnicas de DNA recombinante. Por exemplo, um cDNA codificando um polipeptídeo BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN, ou um fragmento deste, pode ser expresso em células procarióticas (por exemplo, bactérias), ou células eucarióticas (por exemplo, leveduras, insetos, ou células de mamíferos), após o qual a proteína recombinante pode ser purificada e usada para gerar uma preparação de anticorpos monoclonais ou policlonais que se ligam especificamente ao polipeptídeo marcador do câncer usado para gerar o anticorpo.

Os versados na técnica sabem que a geração de dois ou mais

70/153 conjuntos diferentes de anticorpos monoclonais ou policlonais maximiza a probabilidade de obtenção de um anticorpo com especificidade e afinidade necessária para a sua utilização (por exemplo, ELISA, imuno-histoquímica, imagens in vivo, terapia imunotoxina). Os anticorpos são testados para a atividade pretendida pelos métodos conhecidos, em conformidade com os fins para que os anticorpos devam ser utilizados (por exemplo, ELISA, imuno-histoquímica, imunoterapia, etc, para mais orientações sobre a geração e teste de anticorpos, vide, por exemplo, Harlow e Lane, anticorpos: A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, N.Y., 1988). Por exemplo, os anticorpos podem ser testados em ensaios de ELISA, Western blot, imuno-histoquímica de glioblastomas de formalina fixa ou cortes de tecido congelado. Após a sua caracterização inicial in vitro, os anticorpos destinados para fins terapêuticos ou de uso em diagnóstico in vivo são testados de acordo com métodos conhecidos de teste clínicos.

O termo anticorpo monoclonal, conforme usado aqui, refere-se a um anticorpo obtido a partir de uma população substancialmente homogênea de anticorpos, ou seja, os anticorpos individuais, incluindo a população são idênticos, exceto para possíveis mutações naturais que possam estar presentes em quantidades menores. Os anticorpos monoclonais daqui incluem especificamente os anticorpos quiméricos, nos quais uma parte da cadeia pesada e/ou leve, são idênticos ou homólogos a sequências correspondentes em anticorpos derivados de uma determinada espécie ou pertencentes a uma classe de anticorpos específicos ou subclasse, enquanto o restante da(s) cadeia(s) é/são idênticos ou homólogos a sequências correspondentes em anticorpos derivadas de uma outra espécie ou pertencente a outra classe ou subclasse de anticorpos, bem como fragmentos de tais anticorpos, enquanto exibem a atividade desejada antagônicos (U.S. Pat. No.4, 816,567).

Os anticorpos monoclonais da invenção podem ser preparados através de métodos de hibridoma. Em um método de hibridoma, um rato ou outro animal hospedeiro adequado, geralmente é imunizado com um agente

71/153 imunizante para provocar linfócitos que produzem ou são capazes de produzir anticorpos que se ligam especificamente ao imunizante. Alternativamente, os linfócitos podem ser imunizados in vitro.

Os anticorpos monoclonais também podem ser feitos através de métodos de DNA recombinante, tal como as descritas na U.S. Pat. No.4,816,567. DNA que codifica os anticorpos da invenção podem ser prontamente isolados e sequenciados utilizando-se os procedimentos convencionais (por exemplo, usando sondas de oligonucleotídeos que são capazes de se ligar especificamente a genes que codificam as cadeias pesadas e leves de anticorpos murinos).

Métodos in vitro também são adequados para a preparação de anticorpos monovalentes. Digestão de anticorpos para produzir fragmentos, especialmente os fragmentos Fab, pode ser realizada utilizando-se técnicas de rotina conhecida na técnica. Por exemplo, a digestão pode ser realizada utilizando-se papaína. Exemplos de digestão papaina são descritos em WO 94/29348, publicada em 22.12.1994, e U.S. Pat. No.4,342,566. Digestão de papaína de anticorpos normalmente produz dois fragmentos de ligação de antígeno idênticos, chamados de fragmentos Fab, cada um com um único sítio de ligação de antígeno, e um fragmento Fe residual. O tratamento de pepsina resulta num fragmento que tem dois sítios - que combinam antígeno - e ainda é capaz de ligação cruzada de antígenos.

Os fragmentos de anticorpos, sejam anexados a outras sequências, ou não, também podem incluir inserções, exclusões, substituições ou outras modificações selecionadas de determinadas regiões ou resíduos de aminoácidos específicos, desde que a atividade do fragmento não seja significativamente alterada ou diminuída em relação aos anticorpos não modificados ou fragmentos de anticorpo. Essas modificações podem prever algumas propriedades adicionais, tais como para remover / adicionar aminoácidos capazes de ligação de dissulfeto, para aumentar a sua longevidade de biológica, alterar as suas características secretoras, etc. Em qualquer caso, o fragmento de anticorpo deve possuir uma propriedade bioativa, como atividade obrigatória, regulamentação da vinculação no domínio de

72/153 ligação, etc. Regiões funcionais ou ativas dos anticorpos podem ser identificadas por mutagênese de uma região específica da proteína, seguidas de expressão e de testes do polipeptídeo expresso. Tais métodos são prontamente aparentes a um versado na técnica e pode incluir a mutagênese específica da área do ácido nucleico que codifica o fragmento de anticorpo.

Os anticorpos da invenção ainda podem compreender anticorpos humanizados ou anticorpos humanos. Formas humanizadas de não humanos (por exemplo, murino) os anticorpos são imunoglobulinas quiméricas, cadeias de imunoglobulinas ou fragmentos das mesmas (como Fv, Fab, Fab' ou outras subsequências de ligação de antígenos de anticorpos), que contém sequências mínimas derivadas da imunoglobulina não humana. Anticorpos humanizados incluem imunoglobulinas humanas (anticorpos destinatários) nas quais os resíduos de uma região complementar de determinação (CDR) do destinatário são substituídos por resíduos de um CDR de uma espécie não humana (anticorpos de doador), como o camundongo, o rato ou o coelho com a especificidade, afinidade e capacidade desejadas. Em alguns casos, quadro Fv (FR) dos resíduos das imunoglobulinas humanas são substituídas pelos resíduos correspondentes não humanos. Anticorpos humanizados também podem incluir os resíduos que se encontram nem no anticorpo destinatário nem no CDR importado ou nas sequências de quadro. Em geral, o anticorpo humanizado compreende substancialmente todos os domínios variáveis, que são ao todo pelo menos um, e tipicamente dois, em que todas ou quase todas as regiões CDR correspondem àqueles de uma imunoglobulina não humana e todas ou quase todas as regiões FR são àquelas de uma sequência de imunoglobulina humana de consenso. O anticorpo humanizado otimamente também incluirá, pelo menos, uma parte da região constante da imunoglobulina (Fc), tipicamente a de uma imunoglobulina humana.

Métodos para a humanização de anticorpos não humanos são bem conhecidas na técnica. Geralmente, um anticorpo humanizado tem um ou mais resíduos de aminoácidos introduzidos a partir de uma fonte que não é humana. Estes resíduos aminoácidos não humanos são muitas vezes dito

73/153 s como resíduos de importação, que normalmente são tomados a partir de uma importação de domínio variável. Humanização pode ser feita essencialmente através da substituição de CDRs roedores ou sequências CDR para as sequências correspondentes de um anticorpo humano. Assim, como humanizados os anticorpos são anticorpos quiméricos (U.S. Pat. No. 4,816,567), onde substancialmente menos do que um domínio variável intacto humano foi substituído pela sequência correspondente de uma espécie não humana. Na prática, os anticorpos são anticorpos humanizados tipicamente humanos em que alguns resíduos CDR e, possivelmente, alguns resíduos FR são substituídos por resíduos de sites semelhantes em anticorpos de roedores.

Animais transgênicos (por exemplo, ratos), que são capazes, após a imunização, de produzir um repertório cheio de anticorpos humanos, na ausência da produção endógena de imunoglobulinas, também podem ser utilizados. Por exemplo, tem sido descrito que a deleção homozigótica do gene da região de junção de cadeia pesada do anticorpo em camundongos mutantes quiméricos e de linhagem germinal resultou em inibição completa da produção endógena de anticorpos. Transferência da matriz do gene humano germinal de imunoglobulina em tal linhagem germinal de ratos mutantes vai resultar na produção de anticorpos humanos frente ao desafio de antígeno. Os anticorpos humanos podem ser produzidos em bibliotecas de mostra fago.

Os anticorpos da invenção são preferivelmente administrados a um paciente em um veículo farmaceuticamente aceitável. Normalmente, uma quantidade adequada de um sal farmaceuticamente aceitável é utilizada na formulação para tornar a formulação isotônica. Exemplos do transportador farmaceuticamente aceitável incluem salina, solução de Ringer e solução de dextrose. O pH da solução é de preferência cerca de 5 a cerca de 8, e mais preferivelmente cerca de 7 a cerca de 7,5. Outros portadores incluem preparações de liberação sustentada, tais como matrizes semipermeáveis de sólidos polímeros hidrofóbicos contendo o anticorpo, do qual as matrizes estão na forma de artigos em molde, por exemplo, filmes, lipos74/153 somas ou micropartículas. Torna-se evidente que versados na técnica que algumas portadoras podem ser preferíveis, dependendo, por exemplo, da via de administração e da concentração de anticorpos que está sendo administrada.

Os anticorpos podem ser administrados ao objeto, paciente, ou célula por injeção (por exemplo, por via intravenosa, intraperitoneal, subcutânea, intramuscular), ou por outros métodos, como infusão, que garanta a sua entrega para a corrente sanguínea de uma forma eficaz. Os anticorpos também podem ser administrados por via intratumoral ou peritumoral, para exercer efeitos terapêuticos sistêmicos e locais. A injeção local ou intravenosa é preferida.

Doses eficazes e horários para administrar os anticorpos podem ser determinados de forma empírica, e fazer essas determinações está dentro da habilidade na técnica. Aqueles hábeis na matéria vão entender que a dosagem de anticorpos que deve ser administrada irá variar dependendo, por exemplo, do indivíduo analisado que irá receber os anticorpos, da via de administração, do tipo de anticorpo utilizado e de outras fármacos a serem administradas. Antibodies in Human Diagnosis and Therapy, Haber et al, eds. Raven Press, New York (1977) pp. 365-389. Uma dose diária típica do anticorpo utilizado isoladamente pode variar de cerca de 1 (pg/kg até 100 mg/kg de peso corporal por dia ou mais, dependendo dos fatores acima mencionados. Após a administração de um anticorpo para tratamento de glioblastoma, a eficácia do anticorpo terapêutico pode ser avaliada de diversas maneiras bem conhecidas do profissional qualificado. Por exemplo, o tamanho, número e/ou distribuição de glioblastoma em um indivíduo que receba o tratamento pode ser controlado por meio de técnicas padrão de imagem do tumor. Um anticorpo administrado terapeuticamente que prende o crescimento de tumor, resulta em diminuição do tumor, e/ou impede o desenvolvimento de novos tumores, em comparação com o curso da doença - que ocorria na ausência da administração de anticorpo - é um anticorpo eficaz para o tratamento de glioblastoma.

Como os marcadores de tumor glioblastoma BCA, CLIP2, DTNA,

75/153

NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN da invenção são altamente expressos em células de glioblastoma e expressos nas células normais em níveis extremamente baixos, a inibição de expressão ou atividade de polipeptídeos de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN pode ser integrada em qualquer estratégia terapêutica para o tratamento ou prevenção de glioblastoma.

O princípio da terapia antissenso baseia-se na hipótese de que a supressão de específica de sequência da expressão gênica (através da transcrição e tradução) pode ser obtida por hibridação intracelular entre DNA genômico ou mRNA e uma espécie complementares antissenso. A formação de um tal duplex de ácido nucleico híbrido interfere com a transcrição do DNA genômico que codifica o antígeno de tumor alvo, ou processamento / transporte / tradução e/ou estabilidade do mRNA do antígeno de tumor.

Ácidos nucleicos antissenso podem ser fornecidos por uma variedade de abordagens. Por exemplo, oligonucleotídeos antissenso ou antiRNA antissenso pode ser administrado diretamente (por exemplo, por injeção intravenosa) a um paciente de uma forma que permita a captação em células tumorais. Alternativamente, os vetores virais ou plasmídeos que codificam RNA antissenso (ou fragmentos de RNA) podem ser introduzidos em células in vivo. Efeitos antissenso também podem ser induzidos por sequências de senso, no entanto, a extensão das alterações fenotípicas é altamente variável. Mudanças fenotípicas induzidas por terapia antissenso eficazes são avaliadas de acordo com as alterações, por exemplo, os níveis de mRNA alvo, os níveis de proteína-alvo, e / ou níveis de atividade da proteína alvo.

Em um exemplo específico, a inibição da função de marcador de glioblastoma pela terapia de gene antissenso pode ser realizada por administração direta do RNA marcador de glioblastoma antissenso a um paciente. O marcador tumoral antissenso RNA podem ser produzido e isolado por uma técnica padrão, mas é mais facilmente produzido por transcrição in vitro utilizando um marcador de tumor cDNA antissenso sob o controle de um promotor de alta eficiência (por exemplo, o promotor T7). A

76/153 administração de marcador antissenso tumoral RNA nas células pode ser realizada por qualquer um dos métodos para a administração direta de ácidos nucleicos como descrito abaixo.

Uma estratégia alternativa para inibir a BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e/ou função PDPN usando terapia genética envolve a expressão intracelular de um anti- BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou anticorpo PDPN ou uma parte de um anti- BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou anticorpo PDPN. Por exemplo, o gene (ou fragmento do gene) que codifica um anticorpo monoclonal que se liga especificamente a um polipeptídeo BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN e inibe sua atividade biológica, é colocado sob o controle transcricional de uma (por exemplo, específico de tecido ou de tumor) sequência reguladora do gene, dentro de um vetor de expressão de ácido nucleico. O vetor então é administrado ao tal paciente que é captado pelas células do glioblastoma ou de outras células, que então secreta o anti- BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou anticorpos PDPN e, assim, bloquear a atividade biológica do polipeptídeo BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN. Preferencialmente, o BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, polipeptídeos NRCAM e PDPN estão presentes na superfície extracelular de células de glioblastoma.

Nos métodos acima descritos, que incluem a administração e a absorção de DNA exógeno em células de um indivíduo (ou seja, a transdução ou transfecção do gene), os ácidos nucleicos da presente invenção pode ser na forma de DNA nu ou os ácidos nucleicos podem ser um vetor para entregar os ácidos nucleicos para as células para inibição da expressão da proteína do marcador de glioblastoma. O vetor pode ser uma preparação comercialmente disponível, como um vetor de adenovirus (Quantum Biotecnologias, Inc. (Lavai, Quebec, Canadá). Entrega do ácido nucleico ou de vetor a células pode ser através de uma variedade de mecanismos. Como um exemplo, a entrega pode ser via lipossomas, utilizando preparações comercialmente disponíveis, tais como LIPOFECTIN, LIPOFECTAMINE (GIBCO-25, Inc., Gaithersburg, Maryland), Superfect

77/153 (Qiagen, Inc. Hilden, Alemanha) e TRANSFECTAM (Promega Biotec, Inc., Madison, Wisconsin), bem como outros lipossomas desenvolvidos de acordo com procedimentos normalizados na técnica. Além disso, o ácido nucleico ou vetores da presente invenção pode ser entregue através de eletroporação in vivo, a tecnologia para a qual está disponível a partir da Genetronics, Inc. (San Diego, Califórnia), bem como por meio de uma máquina de SONOPORAÇÃO (ImaRx Pharmaceutical Corp ., Tucson, Arizona).

Como um exemplo, a entrega do vetor pode ser através de um sistema viral, como um sistema de vetores retrovirais, que pode empacotar um genoma recombinante retroviral. Os retrovirus recombinantes podem ser usados para infectar e, assim, entregar ao ácido nucleico de antissenso células infectadas que inibem a expressão de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM ou PDPN. O método exato de introdução do ácido nucleico alterado em células de mamíferos, é claro, não se limita ao uso de vetores retrovirais. Outras técnicas estão amplamente disponíveis para este procedimento, incluindo o uso de vetores adenovirais, vírus adeno-associado (AAV) vetores, vetores lentiviral, vetores retrovirais pseudotipos. Técnicas de transdução físicas também podem ser utilizadas, tais como entrega de lipossomas e mediadas pelos receptores e outros mecanismos de endocitose. Esta invenção pode ser usada em conjunto com qualquer destes ou de outros métodos de transferência de genes usados.

Os anticorpos também podem ser utilizados para ensaios de diagnóstico in vivo. Geralmente, o anticorpo é marcado com uma radionucleotídeo (como ¹¹¹ln, Tc, ¹⁴C, ¹³¹l, ³H, ³²P ou ³⁵S) de modo que o tumor possa ser localizado usando imunocintiografia. Em uma modalidade, os anticorpos ou fragmentos ligam os domínios extracelulares de dois ou mais alvos de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN e o valor de afinidade (Kd) é inferior a 1x1 ΟμΜ.

Anticorpos para uso diagnóstico podem ser rotulados com sondas de detecção por diferentes métodos de imagem. Os métodos de detecção de sondas incluem, mas não estão limitados a, fluorescência, luz, microscopia confocal e eletrônica; imagem de ressonância magnética e espectroscopia,

78/153 fluoroscopia, tomografia computadorizada e tomografia por emissão de positrons. Sondas adequadas incluem, mas não estão limitados a, fluoresceína, rodamina, eosina e outros fluoróforos, radioisótopos, ouro, gadolínio e outros lantanídios, ferro paramagnético, flúor 18 e outros radionuclideos emissores de positrons. Além disso, as sondas podem ser bi ou multifuncionais e podem ser detectáveis por mais de um dos métodos listados. Esses anticorpos podem ser marcados diretamente ou indiretamente com as provas citadas. A ligação de testes para os anticorpos inclui ligação covalente da sonda, a incorporação da sonda para o anticorpo, e a ligação covalente de um composto quelante para ligação da sonda, entre outros bem reconhecidos na matéria. Por imuno-histoquímica, a amostra de tecido de doença pode ser fresca ou congelada, ou podem ser embebida em parafina e fixada com um conservante, como formol. As seções fixas ou embutidas que contêm a amostra são contatadas com um anticorpo marcado primário e secundário de anticorpos, onde o anticorpo é usado para detectar as proteínas BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN expressas in situ ou in vitro.

A presente invenção em um aspecto preferido, dispõe um peptídeo compreendendo uma sequência que é selecionada do grupo de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 30 ou uma variante dela que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 30 ou uma variante dele que vai induzir reação cruzada das células T com os peptídeos ditos.

Em uma modalidade preferida, o peptídeo é selecionado de um grupo de peptídeos que compreende uma sequência que é selecionada do grupo de SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 24 ou uma variante dela que é pelo menos 85% homóloga à SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 24 ou uma variante dele que vai induzir reação cruzada das células T com os peptídeos ditos.

Os peptídeos da invenção têm a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) classe I ou II.

Na invenção presente, o termo homólogo refere ao grau de identidade entre sequências de duas sequências de aminoácido, isto é

79/153 peptídeo ou sequências polipeptídicas. A homologia acima mencionada é determinada comparando-se duas sequências alinhadas sob condições ideais sobre as sequências serem comparadas. As sequências a serem comparadas podem ter uma adição ou supressão (por exemplo, lacuna e similares) no alinhamento ideal das duas sequências. Essa homologia de sequência pode ser calculada através da criação de alinhamento, utilizando, por exemplo, o algoritmo ClustalW (Nucleic Acid Res., 22(22): 4673 4680 (1994). Software para análise de sequências disponíveis comumente, mais especificamente, Vector NTI, GENETYX ou ferramentas de análise fornecidas por bancos de dados públicos.

Uma pessoa versada na técnica será capaz de avaliar, se as células T induzidas por uma variante de um peptídeo específico será capaz de efetuar uma reação cruzada com o próprio peptídeo (Fong et al., 2001); (Zaremba et al., 1997; Colombetti et al., 2006; Appay et al., 2006).

Com uma variante da sequência de aminoácido especifico, os inventores querem dizer que nas cadeias laterais, por exemplo, um ou dois dos resíduos de aminoácidos são alterados (por exemplo, substituindo-os com a cadeia lateral de outro resíduo de aminoácidos surgido naturalmente ou uma cadeia do outro lado), de tal modo que o peptídeo ainda seja capaz de ligar a uma molécula HLA substancialmente da mesma forma que um peptídeo que consiste em sequência de aminoácidos determinada na SEQ ID NO 1 a 30. Por exemplo, um peptídeo pode ser modificado de modo que ao menos mantenha, se não melhora, a capacidade de interagir e de ligar ao sulco comprometedor de uma molécula conveniente de MHC, tal como HLAA*02 ou -DR, e nessa maneira ele ao menos mantém, se não melhora, a capacidade de ligar ao TCR de CTL ativado. Estes CTL subsequentemente cruzam com células e destroem células que expressam um polipeptídeo que contenha a sequência natural de aminoácido do peptídeo de cognato como definido nos aspectos da invenção. Como pode ser derivado da literatura científica (Rammensee et al., 1997) e bases de dados, (Rammensee et al., 1999), certas posições de peptídeos que se ligam a HLA são tipicamente resíduos de âncora formando uma sequência de centro servindo ao motivo

80/153 comprometedor do receptor de HLA, que é definido por cadeias polipeptídicas polares, eletrofísicas, hidrofóbicas e propriedades espaciais constituindo o sulco comprometedor. Assim, um versado na técnica seria capaz de modificar as sequências de aminoácidos definidas na SEQ ID NO 1 a 30, mantendo a âncora conhecida de resíduos, e seria capaz de determinar se as variantes mantém a capacidade de vincular moléculas MHC de classe I ou II. As variantes da presente invenção mantêm a capacidade de se ligar à TCR da CTL ativada, o que poderá, posteriormente, cruzar e matar as células que expressam um polipeptídio contendo a sequência de aminoácido natural do peptídeo cognato, tal como definido nos aspectos da invenção.

Esses resíduos de aminoácido que não contribuem substancialmente a interações com o receptor de células T podem ser modificados por substituição com outro aminoácido cuja integração substancialmente não afeta reatividade de célula T e não elimina encadernação ao MHC relevante. Assim, aparte da condição dada, o peptídeo da invenção pode ser qualquer peptídeo (sendo que aqui os inventores incluem oligopeptídeo ou polipeptídeo), que inclui as sequências de aminoácido ou uma porção ou variante disso como dado.

Tabela 2: Variantes e motivo dos peptídeos de acordo com

SEQ ID NO: 1 a 25

		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
CSP-001	Código peptídico	T	M	L	A	R	L	A	S	A
SEQ ID 25	Variantes										L
				L							L
						E				K
			I		A	G	I	I	A	E
			L		Y	P	K		Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R

81/153

		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
ACS-001	Código peptídico	K	1	M	E	R	1	Q	E	V
SEQ ID 3	Variantes			M							L
				L							L
										K
			I		A	G	1		A
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
					P		N
			M				F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
BCA-001	Código peptídico	F	L	G	D	P	P	E	K	L
SEQ ID 4	Variantes			M
						E
			I		A	G	1	1	A	E
			L		Y	P	K	L	Y
					F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
BCA-002	Código peptídico	A	L	W	A	W	P	S	E	L
SEQ ID 5	Variantes			M
						E				K
			I		A	G	1	1	A
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N

82/153

			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
CHI3L1-010	Código peptidico	T	L	Y	G	M	L	N	T	L
SEQ ID 6	Variantes			M
						E				K
			I		A		I	I	A	E
			L			P	K		Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
CLIP2-001	Código peptidico	S	L	N	E	L	R	V	L	L
SEQ ID 7	Variantes			M
										K
			I		A	G	I	I	A	E
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
SLC01C1-001	Código peptidico	Y	L	I	A	G	I	I	S	L
SEQ ID 2	Variantes			M
						E				K
			I		A	G	I		A	E
			L		Y	P	K	L	Y

83/153

F

T

Y

T

H

K

P

N

M

F

S

V

R

Posição

1

2

3

4

5

6

7

8

9

DTNA-001

Código peptidico

K

L

Q

D

E

A

Y

Q

V

SEQ ID 8

Variantes

M

L

E

K

I

A

G

I

A

E

L

Y

P

K

L

F

T

Y

T

H

P

N

M

F

Y

S

V

R

Posição

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

EGFR-007

Código peptidico

A

L

A

V

L

S

N

Y

D

A

SEQ ID 9

Variantes

M

L

E

K

I

A

G

I

A

E

L

Y

P

K

L

Y

F

T

Y

T

H

K

P

N

M

F

Y

S

V

R

Posição

1

2

3

4

5

6

7

8

9

FABP7-001

Código peptidico

L

T

F

G

D

V

A

V

84/153

SEQ ID 10	Variantes			M							L
				L							L
						E				K
			I		A		I	I	A	E
					Y	P	K	L	Y
			F			T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
GFAP-001	Código peptídico	N	L	A	Q	D	L	A	T	V
SEQ ID 11	Variantes			M							L
											L
						E				K
			I			G	I	I		E
			L		Y	P	K		Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
GPR56-002	Código peptídico	F	L	L	S	E	P	V	A	L
SEQ ID 12	Variantes			M
						E				K
			I		A	G	I	I	A	E
			L		Y	P	K	L	Y
					F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F

85/153

			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
GRI-001	Código peptidico	N	I	L	E	Q	I	V	S	V
SEQ ID 13	Variantes			M							L
				L							L
						E				K
			I		A	G	I	I	A	E
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
IGF2BP3-001	Código peptidico	K	I	Q	E	I	L	T	Q	V
SEQ ID 14	Variantes			M							L
				L							L
										K
			I		A	G		I	A	E
			L		Y	P	K		Y
			F		F	T	Y	T	H
					P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
MLC-001	Código peptidico	s	V	V	E	V	I	A	G	I
SEQ ID 15	Variantes			M							L
				L							L
										K

86/153

			I		A	G	I			E
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
NES-001	Código peptidico	G	L	Q	S	Q	I	A	Q	V
SEQ ID 16	Variantes			M							L
											L
						E				K
			I		A	G	I			E
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
NES-002	Código peptidico	S	L	Q	E	N	L	E	S	L
SEQ ID 17	Variantes			M
										K
			I		A	G	I	I	A	E
			L		Y	P	K		Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		I

87/153

Posição

1

2

3

4

5

6

7

8

9

10

11

12

NES-003

Código pe

ptídico

F

L

F

P

G

T

E

N

Q

SEQ ID 18

Variantes

M

L

E

K

I

A

G

I

A

E

L

Y

K

L

Y

T

Y

H

K

P

N

M

F

Y

S

V

R

Posição

1

2

3

4

5

6

7

8

9

NES-004

Código peptídico

N

L

A

E

L

E

G

V

SEQ ID 19

Variantes

M

L

K

I

G

I

A

E

L

Y

P

K

Y

F

T

Y

T

H

K

P

N

M

F

Y

S

V

R

Posição

1

2

3

4

5

6

7

8

9

NLGN4X-001

Código peptídico

N

L

D

T

L

M

T

Y

V

SEQ ID 1

Variantes

M

L

E

K

I

A

G

I

A

E

L

Y

P

K

L

Y

88/153

			F		F		Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
NR2E1-001	Código peptidico	K	I	I	S	E	I	Q	A	L
SEQ ID 20	Variantes			M
				L
						E				K
			I		A	G	I		A	E
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
					P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
NRCAM-001	Código peptidico	G	L	W	H	H	Q	T	E	V
SEQ ID 21	Variantes			M							L
											L
						E				K
			I		A	G	I	I	A	E
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
PDPN-001	Código peptidico \|	T	L	V	G	I	l	v	G	V

89/153

SEQ ID 22	Variantes			M							L
											L
						E				K
			I		A				A	E
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
TNC-001	Código peptídico	A	M	T	Q	L	L	A	G	V
SEQ ID 23	Variantes										L
				L							L
						E				K
			I		A	G	I	I		E
			L		Y	P	K		Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N
			M		M		F
			Y		S		V
			V		R
		Posição	1	2	3	4	5	6	7	8	9
TNC-002	Código pe	itídico	Q	L	L	A	G	V	F	L	A
SEQ ID 24	Variantes			M							L
											L
						E				K
			I		A	G	I	I	A	E
			L		Y	P	K	L	Y
			F		F	T	Y	T	H
			K		P		N

90/153

M	M	F
Y	S	V
V	R

Além do mais é conhecido para peptídeos MHC apresentados de classe II, que estes peptídeos são compostos de uma sequência de centro tendo uma sequência de aminoácido servindo a um certo motivo alelo HLA específico, e opcionalmente extensões terminais N e/ou C que não interferem na função da sequência de centro (isto é, são considerados como irrelevantes para a interação do peptídeo e todos ou um subconjunto de clones de células T reconhecendo a contrapartida natural). As extensões do terminal N e / ou C podem conter, por exemplo, de 1 a 10 aminoácidos de comprimento, respectivamente. Estes peptídeos podem ser usados diretamente para carregar moléculas MHC da classe II ou da sequência podem ser clonadas nos vetores de acordo com a descrição contida abaixo. Como estes peptídeos constituem o produto final do processamento de peptídeos maiores dentro da célula, peptídeos mais longos também podem ser usados. Os peptídeos da invenção podem ser de qualquer tamanho, mas tipicamente podem ser menos que 100000 em peso molecular, preferivelmente menos que 50000, mais preferivelmente menos que 10000 e tipicamente aproximadamente 5000. Em termos do número de resíduos de aminoácido, os peptídeos da invenção podem ter menos que 1000 resíduos, preferivelmente menos que 500 resíduos, mais preferivelmente menos que 100, mais preferivelmente menos que 100 e a maioria preferivelmente entre 30 e 8 resíduos. Assim, a presente invenção também fornece peptídeos e variantes, em que o dito peptídeo ou variante tem um comprimento total entre 8 e 100, de preferência entre 8 e 30, e mais preferido entre 8 e 16, ou seja, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 aminoácidos.

Peptídeos mais longos também podem ser adequados, porém, peptídeos de 9-mer ou 10-mer, como descrito na tabela 2 acima, são os preferidos para peptídeos MHC da classe I, enquanto 12-mers a 15-mers são preferidos para peptídeos MHC da classe II.

Para peptídeos MHC de classe II restritos, vários peptídeos dife

91/153 rentes com a sequência do mesmo núcleo podem ser apresentados na molécula de MHC. Como a interação com a célula T (auxiliar) reconhecida é definida por uma sequência de núcleo de 9 a 11 aminoácidos, várias variantes de comprimento podem ser reconhecidas pelo mesmo clone de célula T (auxiliar). Assim, várias versões de diferentes comprimentos de uma sequência de núcleo obrigatório podem ser utilizadas para carregamento direto de moléculas MHC classe da II sem necessidade de processamento adicional de aparar as pontas terminais N ou C. Correspondentemente, variantes ocorrendo naturalmente ou artificialmente que induzem células de T que cruzam com um peptídeo da invenção são frequentemente variantes de longo comprimento.

Se um peptídeo que é mais longo que ao redor de 12 resíduos de aminoácido, ele é usado diretamente ligar a uma molécula MHC de classe II, sendo que é preferido que os resíduos que ladeiam a região de encadernação de HLA de centro são resíduos que substancialmente não afetam a capacidade do peptídeo ligar especificamente ao sulco comprometedor das moléculas MHC de classe II ou apresentar o peptídeo à célula T auxiliar. No entanto, como já indicado acima, será apreciado que peptídeos maiores podem ser usados, por exemplo, quando codificados por um polinucleotídeo, desde que estes peptídeos maiores possam ser fragmentados por células convenientes que apresentam antígenos. No entanto, em alguns casos tem sido demonstrado que a sequência núcleo de regiões de acompanhamento podem influenciar a ligação ao peptídeo da molécula MHC de classe II ou a interação do MHC dimérica: peptídeo complexo com o TCR em ambos os sentidos em relação a um peptídeo de referência com o mesmo núcleo de sequência. Estruturas intramoleculares terciárias no peptídeo (por exemplo, a formação de loop), normalmente diminuem as afinidades do MHC e TCR. Interações intermoleculares das regiões de acompanhamento com as partes do MHC e TCR junto aos poços de peptídeo de ligação podem estabilizar a interação. Essas mudanças na afinidade pode ter uma influência dramática sobre o potencial de um peptídeo MHC de classe II para induzir as respostas da célula T (auxiliar).

92/153

É também possível, que epítopos MHC da classe I, embora normalmente entre 8-10 aminoácidos de comprimento, sejam gerados por processamento peptídico de peptídeos mais longos ou proteínas que incluem o epítopo real. É preferido que os resíduos que ladeiam o epítopo real são resíduos que não afetam substancialmente a divagem proteolítica necessária para expor o epítopo real durante processamento.

Preferidos são, portanto, peptídeos com uma sequência de núcleo selecionada a partir de um grupo composto da SEQ ID N° 1 a SEQ ID n° 30 com as extensões de 1 a 10 aminoácidos no terminal C e / ou terminal N, de preferência, o número total destes aminoácidos de acompanhamento é de 1 a 12, mais de preferência de 1 a 10, de ainda mais preferência 1 a 8, de ainda mais preferência 1 a 6, de ainda mais preferência 1 a 4 e de ainda mais preferência 1 a 2, nos quais os aminoácidos de acompanhamento podem ser distribuídos em qualquer relação ao terminal C e terminal N (por exemplo, todos os aminoácidos de acompanhamento podem ser adicionados a um término, ou os aminoácidos podem ser adicionados igualmente a ambos os terminais ou em qualquer outra razão), desde que o peptídeo ainda seja capaz de ligar-se a uma molécula HI_A da mesma maneira como no dito peptídeo de acordo com qualquer uma das SEQ ID N° 1 a SEQ ID N° 30.

Os aminoácidos de acompanhamento também podem reduzir a velocidade de degradação do peptídeo in vivo de modo que o montante dos peptídeos reais disponíveis para o CTLs é superior em comparação com o peptídeo sem flanquear aminoácidos, assim agindo como um profármaco.

Assim, a presente invenção também fornece peptídeos e variantes, em que o peptídeo ou variantes de epítopos MHC da classe I, têm um comprimento total entre 8 e 100, de preferência entre 8 e 30, e mais preferido entre 8 e 16, ou seja, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14, 15, 16 aminoácidos.

Naturalmente os peptídeos ou variantes de acordo com a presente invenção têm a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo principal de histocompatibilidade humana (MHC) classe I ou II. A encadernação de um peptídeo ou uma variante a um complexo MHC pode

93/153 ser testada por métodos conhecidos na técnica, por exemplo, esses descritos na literatura para diferentes alelos MHC da classe II (por exemplo, (Vogt et al., 1994; Malcherek et al., 1994; Manici et al., 1999; Hammer et al.,

1995; Tompkins etal., 1993; Boyton etal., 1998)).

Numa modalidade particularmente preferida da invenção o peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácidos de acordo com SEQ ID No: 1 a SEQ ID NO: 30.

Consistindo essencialmente em quer dizer que um peptídeo de acordo com a presente invenção, além da sequência de acordo com qualquer uma das SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 30 ou uma variante dessas, contêm extensões N e/ou C terminalmente localizadas provenientes de aminoácidos que necessariamente não formam a parte do peptídeo, que funciona como um epítopo para epítopos de moléculas MHC.

Não obstante, estas extensões podem ser importantes para fornecer uma introdução eficiente do peptídeo - de acordo com a invenção presente - nas células. Em uma modalidade da presente invenção, o peptídeo é uma proteína de fusão que inclui, por exemplo, os aminoácidos de terminal N 80 do antígeno associado a cadeia invariante HLA-DR (p33, a seguir simplesmente li) como derivado do NCBI, GenBank Número acessão X00497 (Strubin, M. et al 1984).

Além do mais, o peptídeo ou variante podem ser modificados mais adiante para melhorar a estabilidade e/ou ligar a moléculas de MHC para extrair uma resposta imune mais forte. Os métodos para tal otimização de uma sequência peptídica bem são conhecidos na técnica e incluem, por exemplo, a introdução de ligações peptídicas inversas ou ligações não peptídicas.

Em resíduos inversos de aminoácido de ligação peptídica não são unidos por peptídeo (-CO-NH-) conexões, mas a ligação peptídica é invertida. Tais peptideomiméticos retroinversos podem ser criados usandose métodos conhecidos na técnica, por exemplo, tal como esses descritos em Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, aqui incorporados por referência. Este aprimoramento envolve a criação de pseudopeptideos

94/153 contendo alterações envolvendo a vértebra, e não a orientação de correntes laterais. Meziere et al (1997) mostra que para encadernação de MHC e respostas de célula de T auxiliares, estes pseudopeptideos são úteis. Os peptídeos retroinversos, que contêm ligações NH-CO em vez de ligações peptídicas CO-NH, são muito mais resistentes a proteólise.

Uma ligação não peptídica é, por exemplo, -CH₂-NH, -CH₂S-, CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂-, e -CH₂SO-, Patente dos Estados Unidos 4,897,445 fornece um método para a síntese sólida de fase de ligação não peptídica (-CH₂-NH) em correntes de polipeptídeo que envolvem polipeptídeos sintetizados por procedimentos padronizados e a ligação não peptídica sintetizada por reagir com um amino aldeído e um aminoácido na presença de NaCNBH₃.

Os peptídeos constituindo as sequências descritas acima podem ser sintetizados com grupos químicos adicionais presentes em seus terminais aminados e/ou carboxílicos, para melhorar a estabilidade, biodisponibilidade e/ou afinidade dos peptídeos. Por exemplo, grupos hidrofóbicos tal como carbobenzoxila, dansila, ou os grupos de t-butiloxicarbonila podem ser adicionados aos términos aminados dos peptídeos. Da mesma maneira, um grupo de acetila ou um grupo de 9 fluorenilmetóxi-carbonila podem ser colocados nos términos aminados dos peptídeos. Adicionalmente, o grupo hidrofóbico, t-butiloxicarbonila ou grupo aminado podem ser adicionados aos términos aminados dos peptídeos.

Além disso, os peptídeos da invenção podem ser sintetizados de tal modo que sua configuração estérica seja alterada. Por exemplo, o Disômero de um ou mais dos resíduos aminoácidos do peptídeo pode ser usado, em vez do L-isômero normal. Mais ainda, ao menos um dos resíduos de aminoácido dos peptídeos da invenção pode ser substituído por um dos resíduos aminoácidos conhecidos que ocorrem não naturalmente. As alterações tal como estas podem servir para aumentar a estabilidade, biodisponibilidade e/ou de ação de ligação dos peptídeos da invenção.

95/153

Similarmente, um peptídeo ou variante da invenção podem ser modificados quimicamente reagindo com aminoácidos específicos antes ou depois da síntese do peptídeo. Os exemplos para tais modificações são bem conhecidos na técnica e são resumidos, por exemplo, em R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. CRC Press, 2005, que é incorporado nisto por referência. Modificação química de aminoácidos inclui, mas não é limitado a, modificação por acilação, amidinação, piridoxilação de lisina, alquilação redutiva, trinitrobenzilação de grupos aminados com ácido de sulfônico 2,4,6-trinitrobenzeno (TNBS), modificação de amido dos grupos de carboxila e modificação de sulfidrilo por oxidação perfórmica ácida de cisteina, a ácido de cisteico, formação de derivados mercuriais, formação de bissulfeto misturado com outros compostos de tiol, reação com maleimida, carboximetilação com ácido de iodoacetico ou iodoacetamida e carbamoilação com cianeto em pH alcalino, embora sem limitação à isso. Nesta consideração, a pessoa versada é referida ao Capítulo 15 dos Protocolos Atuais em Ciência de Proteína, Eds. Coligan et al. (John Wiley & Filhos NY 1995-2000) para metodologia mais extensa relativa à modificação química das proteínas.

Modificação bem-sucedida de proteínas terapêuticas e peptídeos com PEG frequentemente é associada com uma extensão de meio-vida circulatória enquanto que uma ligação cruzada de proteínas com glutaraldeído, diacrilato de polietilenoglicol e formaldeído é usada para a preparação de hidrogéis. Modificação química de alérgenos para imunoterapia frequentemente é realizada por carbamilação com cianeto de potássio.

Um peptídeo ou variante, em que o peptídeo é modificado ou inclui ligação não peptídica é uma personificação preferida da invenção. Geralmente, peptídeos e variantes (ao menos esses a conter conexões peptídicas entre resíduos de aminoácido) podem ser sintetizados pelo modo de Fmoc-poliamido de síntese de fase sólida peptídica como descrito por Lu et al (1981) e referências lá contidas. Proteção de grupo N-amino temporária é proporcionada pelo grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonila (Fmoc). Clivagem repetitiva deste grupo de proteção de base altamente lábil é feita usando-se

96/153 piperidina 20% em N, N-dimetilformamida. As funcionalidades de corrente lateral podem ser protegidas como seus éter de butila (no caso de treonina de serina e tirosina), ésteres de butila (no caso de ácidos glutâmicos e ácidos aspárticos), derivado de butiloxicarbonila (no caso de histidina e lisina), derivado de tritila (no caso de cisteína) e derivado de 4-metóxi-2,3,6trimetilbenzenesulfonila (no caso de arginina). Onde glutamina ou asparagina são resíduos de terminal C, o uso é feito do grupo 4,4'-dimetoxibenzidrila para proteção das funcionalidades laterais de amido de corrente. O apoio de fase sólida é baseado num polímero de polidimetil-acrilamida constituído dos três monômeros de dimetilacrilamida (cadeia-monômero), diamina de bisacriloiletileno (vinculador de cruz) e éster de metila de acriloilsarcosina (agente de funcionalização). O agente peptídico-a-resina ligado de divagem usado é o ácido derivativo de 4 hidroximetil-fenoxiacético lábil a ácido. Todos derivados de aminoácido são adicionados como seus derivados simétricos pré-formados de anidrido com a exceção de asparagina e glutamina, que são adicionados usando um procedimento invertido mediado por N, N-diciclo-hexil-carbodi-imida/1hidroxibenzotriazola. Todas as reações de engate desproteção são controladas usando-se ninidrina, ácido sulfônico de trinitrobenzeno ou procedimentos de prova de isotina. Sobre conclusão de síntese, peptídeos são rachados do apoio de resina com remoção concomitante de lado-corrente protegendo os grupos por tratamento com 95% de ácido trifluoroacético contendo uma mistura de 50 % de interceptor radical. Interceptores radicais geralmente usados incluem etanditiol, fenol, anisolo e água, a escolha exata dependendo dos aminoácidos constituintes do peptídeo a ser sintetizado. Também uma combinação de metodologias em fase sólida e fase de solução para a síntese de peptídeos é possível (vide, por exemplo, Bruckdorfer et al. 2004 e as referências como citadas lá).

O ácido de trifluoroacético é retirado por evaporação in vacuo, com trituração subsequente com éter de dietila proporcionando o peptídeo bruto. Quaisquer interceptores radicais presentes são retirados por um procedimento simples de extração no qual a liofilização da fase aquosa

97/153 proporciona peptídeo bruto de interceptares radicais. Reagentes para síntese peptídica são geralmente disponíveis de, por exemplo, CalbiochemNovabiochem (UK) Ltda, Nottingham NG7 2QJ, UK.

A purificação pode ser realizada por qualquer um, ou uma combinação de técnicas tal como a recristalização, cromatografia de exclusão de tamanho, cromatografia de íon-trocador, cromatografia de interação de hidrofóbico e (normalmente) cromatografia líquida de alto desempenho na fase reversa usando-se, por exemplo, separação de declive de acetonitrilo/água.

A análise de peptídeos pode ser executada usando-se cromatografia de fina de camada, eletroforese, em tubo particular eletroforese capilar, extração de fase sólida (CSPE), cromatografia líquida de alto desempenho na fase reversa, análise de aminoácido depois da hidrólise ácida e por bombardeio rápido de átomos (FAB) análise espectrométrica de massa, assim como MALDI e ESI-Q-TOF análise espectrométrica de massa.

Mais um aspecto da invenção fornece um ácido nucleico (por exemplo, um polinucleotídeo) codificando um peptídeo ou variante da invenção. O polinucleotídeo pode ser, por exemplo, DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações destes, tanto de fita única como de fita dupla, ou formas nativas ou estabilizadas de polinucleotídeo, tal como, por exemplo, polinucleotídeos com uma cadeia principal de fosforotioato, e pode ou não pode conter introns contanto que ele se codifica para o peptídeo. Naturalmente, só os peptídeos contendo resíduos de aminoácido que ocorrem naturalmente são unidos por ligações peptídicas que surgiram naturalmente, que podem ser codificados por um polinucleotídeo. Um ainda mais aspecto da invenção fornece um vetor de expressão capaz de expressar um polinucleotídeo de acordo com a invenção.

Uma variedade de métodos foi desenvolvida para ligar polinucleotídeos, especialmente DNA, a vetores, por exemplo, via términos coesos complementares. Por exemplo, áreas complementares de homopolímero podem ser adicionadas ao segmento de DNA ser inserido ao vetor DNA. O segmento de vetor e DNA e são então unidos por hidrogênio elo entre as

98/153 caudas complementares de homopolímero para formar moléculas de DNA recombinante.

Ligantes sintéticos contendo um ou mais locais de restrição fornecem um método alternativo de unir-se ao segmento de DNA a vetores. Ligantes sintético contendo uma variedade de locais de endonuclease de restrição estão comercialmente disponíveis de um número de fontes inclusive na International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EUA.

Um método desejável de modificar o DNA - codificando ο polipeptídeo da invenção - emprega a reação em cadeia de polimerase como descrito por (Saiki et al (1988)). Este método pode ser usado para a introdução do DNA em um vetor adequado, por exemplo, através de engenharia em sítios de restrição adequados, ou ele pode ser usado para modificar o DNA de outras formas úteis como é conhecido na técnica. Se vetores virais são usados, vetores de vírus varicela ou adenovirus são preferidos.

O DNA (ou no caso de vetores retrovirais, RNA) pode ser expresso num hospedeiro conveniente para produzir um polipeptídeo constituindo o peptídeo ou variante da invenção. Assim, o DNA codificando o peptídeo ou variante da invenção pode ser usado de acordo com técnicas conhecidas, adequadamente modificado em vista dos ensinos contidos nisto, para construir um vetor de expressão, que então é usado para transformar uma célula apropriada de hospedeiro para a expressão e produção do polipeptídeo da invenção. Tais técnicas incluem aquelas descritas na Patente US n ⁰ 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 e 4.810.648.

O DNA (ou no caso de vetores retrovirais, RNA) codificando o polipeptídeo constituindo o composto da invenção pode ser unido a uma variedade larga de outras sequências de DNA para introdução num hospedeiro apropriado. O DNA companheiro dependerá em sua natureza do hospedeiro, da maneira da introdução do DNA no hospedeiro, e se é desejada uma manutenção episomal ou integração.

Geralmente, o DNA é inserido num vetor de expressão, tal como

99/153 um plasmida, em orientação adequada e corrigida lendo-se a armação para expressão. Se for necessário, o DNA pode ser ligado às sequências reguladoras de nucleotídeo de controle transcricional e translacional apropriados e reconhecidos pelo hospedeiro desejado, embora tais controles sejam geralmente disponíveis no vetor de expressão. O vetor então é introduzido no hospedeiro através de técnicas normais. Geralmente, não todos os anfitriões serão transformados pelo vetor. Portanto, será necessário selecionar para células transformadas de hospedeiro. Uma técnica de seleção envolve incorporar no vetor de expressão uma sequência de DNA, com quaisquer elementos necessários de controle, que codifica para uma característica selecionável na célula transformada, tal como resistência antibiótica.

Por outro lado, o gene para tal característica de selecionável pode estar em outro vetor, que é usado a cotransforma a célula desejada de hospedeiro.

Células hospedeiras que foram transformadas pelo recombinante DNA da invenção são então cultivadas para um tempo suficiente e sob condições apropriadas conhecidas a esses profissionais versados na técnica em vista dos ensinos descritos aqui para permitir a expressão do polipeptídeo, que então pode ser recuperado.

Muitos sistemas de expressão são conhecidos, inclusive bactérias (para exemplo, E. coli e Bacillus subtilis), fermentos (para exemplo, Saccharomyces cerevisiae), fungos filamentosos (para exemplo, Aspergillus spec), células de planta, células animais e células de insetos. Preferivelmente, o sistema pode ser de células mamíferas tal como células de CHO disponíveis da Coleção de Biologia de Célula de ATCC.

Um plasmídeo de vetor de célula mamífero típico para expressão constitutiva constitui o CMV ou promotor SV40 com um polo conveniente cauda A e um marcador de resistência, tal como neomicina. Um exemplo é pSVL disponível de Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. Um exemplo de um vetor de expressão induzível mamífera é o pMSG, também disponível de Pharmacia. Vetores úteis de fermento plasmida são pRS403-406 e pRS413

100/153

416 e estão geralmente disponíveis por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Plasmidas pRS403, pRS404, pRS405 e pRS406 são plasmidas integrantes de fermento (Ylps) e incorporam os marcadores de fermento selecionável HIS3, TRP1, LEU2 e URA3. Plasmidas pRS413-416 são plasmidas centrômeros de fermento (Ycps). Os vetores à base de promotor CMV (por exemplo, aqueles de Sigma-Aldrich) fornecem expressão transitória ou estável, expressão ou secreção citoplásmico, e terminal N ou terminal C etiquetando em várias combinações de FLAG, 3xFLAG, c-myc ou MAT. Estas proteínas de fusão permitirão a detecção, tratamento e análise da proteína recombinante. As fusões de etiqueta dupla fornecem flexibilidade em detecção.

A região reguladora de citomegalovirus humano forte (CMV) gera altos níveis de expressão constitutiva de proteína tão altos quanto 1 mg/L em células COS. Para linhagens celulares menos potentes, os níveis de proteína são tipicamente ~ 0,1 mg / L. A presença da origem de replicação SV40 resultará em altos níveis de replicação do DNA na replicação SV40 células permissivas COS. Os vetores de CMV, por exemplo, podem conter o pMB1 (derivado de pBR322) origem para replicação em células bacterianas, o gene b-lactamase para seleção de resistência de ampicilina em bactérias, polyA hGH, e a origem f1. Vetores contendo o líder de sequência preprotripsina (PPT) pode dirigir a secreção de proteínas de fusão FLAG no meio de cultura para purificação usando anticorpos ANTI-FLAG, resinas, e pratos. Outros vetores e sistemas de expressão bem são conhecidos na técnica para uso com uma variedade de células hospedeiras.

A invenção presente também relaciona a uma célula hospedeira transformada com um construto de vetor de polinucleotídeo da invenção presente. A célula hospedeira pode ser ou procarióticas ou eucarióticas. Células bacterianas podem ser preferencialmente células hospedeiras procarióticas e, em algumas circunstâncias, tipicamente uma estirpe de E. coli tal como, por exemplo, as estirpes de E. coli DH5 disponíveis de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EUA, e RR1 disponível da American Type Culture Collection (ATCC) of Rockville, MD, EUA (No

101/153

ATCC 31343). Células eucarióticas preferidas de hospedeiro incluem fermento, inseto e células mamíferas, preferivelmente células vertebradas tal como essas de um camundongo, rato, macaco ou células humanas fibroblásticas e linhagem celular de cólon. Células hospedeiras de fermento incluem YPH499, YPH500 e YPH501 que geralmente são disponíveis por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EUA. Células hospedeiras mamíferas preferidas incluem ovário chinês de hamster (CHO) células disponíveis do ATCC como CCL61, NIH/3T3 de células de embrião de camundongo suíço de NIH disponível do ATCC como CRL 1658, células COS-1 derivadas de rim de macaco disponíveis do ATCC como as células CRL 1650 e 293 que são células embrionárias humanas de rim. Células preferidas de inseto são células Sf9 que podem ser transfectadas com vetores de expressão baculovírus. Uma vista geral concernente à escolha de células convenientes de hospedeiro para expressão pode ser achada em, por exemplo, no texto de Paulina Balbás e Argélia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols”, Parte Um, Segunda Edição, ISBN 978-1-58829-262-9, e outra literatura conhecida à pessoa versada.

A transformação de células de anfitriões apropriados com um construto de DNA da invenção presente é realizada por métodos bem conhecidos que tipicamente dependem do tipo de vetor usado. No que diz respeito à transformação de células do hospedeiro procariótico, vide, por exemplo, Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sei. USA 69, 2110, e Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. A transformação de células de fermento é descrita em Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY. O método de Beggs (1978) Nature 275,104-109 também é útil. Com referência a células vertebradas, reagentes úteis em transferir tais células, por exemplo, fosfato de cálcio e DEAE-dextrano ou formulações de lipossoma, estão disponíveis de Stratagene Cloning Systems, ou Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EUA. Eletroporação é também útil para transfectar e/ou transformar

102/153 células e bem é conhecida na técnica para transformar célula de fermento, células bacterianas, células de inseto e células vertebradas.

Células transformadas com êxito, isto é, células que contêm um construto de DNA da invenção presente, podem ser identificadas por técnicas bem conhecidas tal como PCR. Por outro lado, a presença da proteína no sobrenadante pode ser detectada usando-se anticorpos.

Também será apreciado que certas células hospedeiras da invenção são úteis na preparação dos peptídeos da invenção, por exemplo, células bacterianas, de fermento e de inseto. No entanto, outras células hospedeiras podem ser úteis em certos métodos terapêuticos. Por exemplo, células que apresentando antígenos, tal como células dendriticas, podem ser sensatamente usadas para expressar os peptídeos da invenção de tal modo que elas possam ser carregadas em moléculas MHC apropriadas. Assim, a invenção atual fornece uma célula de hospedeiro constituindo um ácido nucleico ou um vetor de expressão de acordo com a invenção.

Numa personificação preferida, a célula hospedeira é uma célula que apresenta antígeno, em particular uma célula dendritica ou célula que apresenta antígeno. APCs carregadas com uma proteína de fusão recombinante contendo fosfatase de ácido prostático (PAP) estão atualmente sob investigação para o tratamento de câncer de próstata (Sipuleucel-T) (Small EJ et al 2006; Rini et al 2006)

Mais um aspecto da invenção fornece um método de produzir um peptídeo ou seu variante, que constituindo a cultura de uma célula de hospedeiro que isola o peptídeo da célula de hospedeiro ou seu meio de cultura.

Em outra personificação o peptídeo, o ácido de nucleico ou o vetor de expressão da invenção são usados em medicina. Por exemplo, o peptídeo ou seu variante podem ser preparados para injeção intravenosa (i.v.), injeção subcutânea (s.c.), injeção intradermal (id.), injeção intraperitoneal (i.p.), injeção intramuscular (i.m.). Métodos preferidos de injeção de peptídeos incluem s.c., i.d., i.p., i.m., e i.v. Métodos preferidos de injeção de DNA incluem i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Doses, por exemplo, entre 50

103/153 pg e 1,5 mg, de preferência, 125 pg a 500 pg de peptídeo ou DNA podem ser dadas e vão depender do respectivo peptídeo ou DNA. As doses deste alcance foram usadas com êxito em testes prévios (Brunsvig et al 2006;

Staehler et al 2007).

Outro aspecto da presente invenção inclui um método in vitro para a produção de células T ativadas, o método compreendendo o contacto de células T in vitro com moléculas humanas MHC da classe I ou II expressas na superfície de uma célula adequada que apresenta antígeno por um período de tempo suficiente para ativar a célula T de maneira antigénica específica, na qual o dito antígeno é um peptídeo de acordo com a invenção. Preferivelmente uma quantidade suficiente do antígeno é usada com uma célula apresentadora de antígenos.

No caso de um epítopo MHC da classe II sendo usado como um antígeno, as células de T são células ajudantes CD4 positivas, preferivelmente do tipo Thi. As moléculas MHC de classe II podem ser expressas na superfície de qualquer célula conveniente. Preferivelmente a célula naturalmente não expressa moléculas MHC de classe II (neste caso a célula foi transfectada para expressar tal molécula). Por outro lado, se a célula naturalmente expressa moléculas MHC de classe II, é presumível que ele está com defeito no processamento de antígenos ou nos caminhos apresentados de antígenos. Desta maneira, é possivel para a célula expressando as moléculas MHC de classe II ser completamente carregada com um antígeno peptídico escolhido antes de ativar a célula T.

A célula apresentadora de antígeno (ou célula estimuladora) normalmente tem moléculas MHC da classe II em sua superfície e, de preferência, por si só é substancialmente incapaz de carregar a dita molécula MHC da classe II com o antígeno selecionado. As moléculas MHC de classe II podem ser facilmente carregadas com o antígeno selecionado in vitro.

Preferivelmente a célula mamífera carece ou tem um nível reduzido da função do transportador peptídico TAP. Células convenientes que carecem de transportador peptídico TAP incluem T2, RMA-S e células

104/153 de drosófila. TAP é o transportador associado com Processamento de

Antígeno.

O peptídeo humano carregando linhagem celular T2 deficiente está disponível na American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EUA sob o Catalogue No CRL 1992; a linhagem celular de drosofila Schneider está disponível no ATCC sob o Catalogue No CRL 19863; a linhagem celular de RMA-S de camundongo é descrita em Karre et al 1985.

De preferência, antes da transfecção a célula de hospedeiro substancialmente não expressa nenhuma molécula MHC de classe I. Também é preferível que a célula estimuladora expresse uma molécula importante para fornecer um sinal coestimulatório de células T, como qualquer B7.1, B7.2, ICAM-1 e LFA 3. As sequências de ácido nucleico de inúmeras moléculas MHC classe de II,e das moléculas coestimuladoras, estão disponíveis ao público a partir do banco de dados GenBank e EMBL.

Da mesma forma, no caso de um epítopo MHC da classe I sendo usado como um antígeno, as células de T são células CTLs CD8 positivas.

Se uma célula apresentadora de antígenos for transfectada para expressar tal epítopo, preferivelmente a célula constitui um vetor de expressão capaz de expressar um peptídeo contendo SEQ ID NO: 1 a SEQ ID NO: 30 ou a sequência de aminoácido variante.

Um número de outros métodos pode ser usado para gerar CTL in vitro. Por exemplo, os métodos descritos em Peoples et al (1995) e Kawakami et al (1992) usam linfócitos autólogos com infiltração de tumor na geração de CTL. Plebanski et al (1995) utiliza linfócitos autólogos periféricos de sangue (PLBs) na preparação de CTL. Jochmus et al (1997) descreve a produção de CTL autólogos pulsando células dendriticas com peptídeo ou polipeptídeo, ou via infecção com vírus recombinantes. Hill et al (1995) e Jerome et al (1993) utilizam células de B na produção de CTL autólogos. Além do mais, macrófagos pulsados com peptídeo ou polipeptídeo, ou infectado com vírus recombinante, pode ser usado na preparação de CTL autólogos. S. Walter et al. 2003 descreve a preparação in vitro de células T

105/153 usando antígeno artificial apresentando células (aAPCs), que também é uma maneira conveniente para gerar células T contra o peptídeo de escolha. Neste estudo, aAPCs foram gerados pelo engate de MHC pré-formados: complexos peptídicos à superfície de partículas de poliestireno (microflanges) por biotina: bioquímica de streptavidina. Este sistema permite o controle exato da densidade de MHC em aAPCs, que permite seletivamente extrair respostas de avidez alta ou baixa específicos de antígeno de célula de T com alta eficiência de amostras de sangue. A parte de MHC: complexos peptídicos, aAPCs devem carregar outras proteínas com atividade de coestimulatórias como anticorpos anti-CD28 unidas à sua superfície. Além do mais, tais sistemas baseados em aAPC frequentemente exigem a adição de fatores solúveis apropriados, por exemplo citoquinas como interleucina-12.

As células alogênicas também podem ser usadas na preparação de células T em um método descrito em detalhe em WO 97/26328. Por exemplo, além de células de drosofila e células T2, outras células podem ser usadas para apresentar antígenos tal como células de CHO, células de inseto infectados com baculovírus, bactérias, fermento, células alvo de vacina infectadas. Em adição, vírus de planta pode ser usado (vide, por exemplo, Porta et al (1994)) que descreve o desenvolvimento de vírus de mosaico cowpea como um sistema de alto rendimento para a apresentação de peptídeos estrangeiros.

As células T ativadas que são dirigidas contra os peptídeos da invenção são úteis em terapia. Assim, mais um aspecto da invenção fornece células ativadas de T conseguível pelos métodos precedentes da invenção.

As células T ativadas, que são produzidas pelo método acima, seletivamente reconhecem uma célula que aberrantemente expressa um polipeptídeo que compreende uma sequência de aminoácidos de SEQ ID NO: 1 a 30.

Preferivelmente, a célula de T reconhece a célula interagindo através de seu TCR com o HLA/complexo de peptídeo (por exemplo, ligante). As células T são úteis num método de eliminação de células alvo

106/153 em paciente cujas células alvo aberrantemente expressam um polipeptídeo constituindo uma sequência de aminoácido da invenção, na qual ao paciente é administrado um número eficaz das células T ativadas. As células T, que eram administradas ao paciente podem ser derivadas do paciente e ativadas como descrito acima (ou seja, elas são células T autólogas). Alternativamente, as células T não são do paciente, mas de outro indivíduo. Naturalmente, é preferido se o indivíduo é um indivíduo saudável. Com indivíduo saudável os inventores querem dizer que o indivíduo está geralmente em boa saúde, preferivelmente com um sistema imune competente e, mais preferivelmente, não sofre de qualquer doença que prontamente pode ser testada e detectada.

In vivo, as células alvo para as células T CD4 positiva de acordo com a invenção presente podem ser células do tumor (que às vezes expressa MHC de classe II) e/ou células estromais ao redor do tumor (células de tumor) (que às vezes também expressa MHC de classe II; (Dengjel et al., 2006)).

As células T da presente invenção podem ser usadas como ingredientes ativos de uma composição terapêutica. Assim, a invenção também fornece um método de matar células-alvo em um paciente cujas células alvo aberrantemente expressam um polipeptídeo composto por uma sequência de aminoácidos da invenção, o método compreendendo a administração ao paciente de um número efetivo de células T, tal como definido anteriormente.

Com aberrantemente expresso os inventores também querem dizer que o polipeptídeo é superexpressado se comparado com níveis normais de expressão ou que o gene é silencioso no tecido do qual o tumor foi derivado, mas no tumor ele é expresso. Por superexpressado os inventores querem dizer que o polipeptídio é presente num nível em pelo menos 1,2 vezes aquele presente em tecido normal; preferivelmente ao menos 2 vezes, e mais preferivelmente ao menos 5 vezes ou 10 vezes o nível atual presente no tecido normal.

As células T podem ser obtidas por métodos conhecidos na técni

107/153 ca, por exemplo, aqueles descritos acima.

Os protocolos para esta transferência adotiva das assim chamadas células T bem são conhecidos na técnica e podem ser achados, por exemplo, em (Rosenberg et al., 1987; Rosenberg et al., 1988; Dudley et al., 2002; Yee et al., 2002; Dudley et al., 2005); revisados em (Gattinoni et al., 2006) e (Morgan et al., 2006).

Qualquer molécula da invenção, isto é, o peptídeo, ácido nucleico, vetor de expressão, célula, CTL ativado, receptor de célula T ou o a codificação do ácido nucleico é útil para o tratamento de desordens, caracterizado por células escapando de uma resposta imune. Portanto qualquer molécula da presente invenção pode ser utilizada como medicamento ou para a fabricação de um medicamento. A molécula pode ser usada por si mesma ou em combinação com outra(s) molécula(s) da invenção ou (uma) molécula(s) conhecida(s).

Preferencialmente, o medicamento da presente invenção é uma vacina. Ela pode ser administrada diretamente ao paciente, no órgão afetado ou do sistematicamente i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v., ou aplicada ex vivo a células derivadas do paciente ou uma linhagem celular humana que subsequentemente foram administradas ao paciente, ou usadas in vitro para selecionar um subpopulação de células imunes derivadas do paciente, que são então readministradas ao paciente. Se o ácido nucleico é administrado a células in vitro, pode ser útil para as células se elas forem transfectadas de forma a coexpressar citocinas imuno-estimulantes, como interleucina-2. Os peptídeos podem ser substancialmente puros, ou combinados com um adjuvante imunoestimulante (vide abaixo), ou usados em combinação com citoquinas imunoestimulantes, ou ser administrados com um sistema de administração adequado, por exemplo, lipossomas. O peptídeo também pode ser conjugado com um veículo apropriado, como o hemocianina do molusco fechadura (KLH) ou manana (vide WO 95/18145 e Longenecker et al (1993)). O peptídeo também pode ser marcado, ser uma proteína de fusão ou uma molécula híbrida. Espera-se que os peptídeos cujas sequências são dadas

108/153 na presente invenção estimulem as células CD4 ou CD8 T. No entanto, a estimulação das CTLs CD8 é mais eficiente quando houver ajuda por parte das células T auxiliares CD4. Assim, para epítopos MHC da Classe I que estimulam CTL CD8, o parceiro de fusão ou secções de uma molécula híbrida adequada proporciona epítopos que estimulam as células T CD4 positivas. Os epítopos que estimulam as CD4 e CD8 são bem conhecidos no estado da técnica, e incluem aqueles identificados na presente invenção.

Em um aspecto, a vacina compreende pelo menos um peptídeo tendo a sequência de aminoácidos estabelecida na SEQ ID NO 1 ou 20 e pelo menos um peptídeo adicional, de preferência de dois a 50 anos, mais de preferência de dois a 25, ainda mais preferencialmente dois a 15 e ainda mais preferencialmente dois, três, quatro, cinco, seis, sete, oito, nove, dez, onze, doze ou treze peptídeos. O(s) peptídeo(s) pode(m) ser derivado(s) de um ou mais TAAs específicos e podem ligar moléculas MHC da classe I e/ou classe II.

O polinucleotídeo pode ser substancialmente puro, ou estar contido num vetor conveniente ou sistema de entrega. O ácido nucleico pode ser DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA ou combinações dos mesmos. Métodos para a concepção e introdução de um ácido nucleico são bem conhecidas na técnica. Uma visão geral é fornecida, por exemplo, por Pascolo S. 2006; Stan R. 2006, ou A Mahdavi 2006. Vacinas polinucleotídicas são fáceis de se preparar, mas o modo de ação desses vetores em induzir uma resposta imunológica não é totalmente compreendido. Vetores convenientes e sistemas de entrega incluem DNA viral de e/ou de RNA, tal como sistemas baseados em adenovirus, vírus de vaccinia, retrovirus, vírus de herpes, vírus associado a adeno ou híbridos contendo elementos de mais de um vírus. Sistemas não virais de entrega incluem lipídios catiônicos e polímeros catiônicos e são bem conhecidos na técnica de entrega de DNA. Entrega física, tal como via um gene-arma, também pode ser usada. O peptídeo ou peptídeos codificados pelo ácido nucleico também pode ser uma proteína de fusão, por exemplo, com um epítopo que estimula células T para o respectivo CDR oposto como observado acima.

109/153

O medicamento da invenção também pode incluir um ou mais adjuvantes. Adjuvantes são substâncias que não reforçam ou potencializam especificamente a resposta imune (por exemplo, respostas imunes mediadas por CTLs e células T auxiliares (T_H)) para um antígeno, e terão, portanto, de ser considerados úteis para o medicamento da presente invenção. Adjuvantes adequados incluem, mas não estão limitados a, 1018 ISS, sais de alumínio, Amplivax, AS15, BCG, CP-870893, CpG7909, CyaA, dSLIM, flagellin ou TLR5 ligantes derivados de flagellin, FLT3 ligante, GMCSF, IC30, IC31, Imiquimod (Aldara), resimiquimodo, ImuFact IMP321, Interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferon-alfa-ou beta, ou pegylated, seus derivados, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, Juvlmmune, LipoVac, MALP2, MF59, monofosforil lipídico A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsões água em óleo e óleo em água, OK-432, OM-174, OM-197 - MP-CE, ONTAK, OspA, PepTel ® sistema vetor, PLG e dextram micropartículas, resiquimod, SRL172, Virosomes e outros vírus, como partículas, YF-17D, armadilha VEGF, R848, beta-glucano, Pam3Cys, Aquila da QS21 stimulon, que é obtido a partir de saponina, micobacterianos extratos bacteriano e síntese da parede celular mímica, e de outros adjuvantes proprietários, como Ribi's Detox, Quil, ou Superfos. Adjuvantes, tais como Freund's ou GM-CSF, são preferidos. Vários adjuvantes imunológicos (por exemplo, MF59) específicos para células dendríticas e suas preparações foram descritos anteriormente (Dupuis M et al 1998; Allison 1998). Também é possível utilizar citoquinas. Várias citocinas têm sido diretamente ligadas à célula dendrítica que influencia a migração para os tecidos linfoideoides (por exemplo, TNF-a) acelerando a maturação das células dendríticas em células eficientes apresentadoras de antígenos para linfócitos T (por exemplo, a GM-CSF, IL-1 e IL -4) (U.S. Pat. N ⁰ 5849589, especificamente aqui incorporados por referência em sua totalidade) e agindo como imunoadjuvantes (por exemplo, IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa. IFN-beta) (Gabrilovich etal 1996).

Oligonucleótidos imunoestimulatórios CpG também foram relatados para melhorar os efeitos de adjuvantes na elaboração de uma vacina.

110/153

Sem estar vinculada por teoria, CpG oligonucleótideos atuam através da ativação do sistema imunitário do inata (não adaptativo), através de receptores do tipo “toll” (TLR), principalmente TLR9. Ativação TLR9 de CpG disparado aumenta as respostas humorais e celulares específicas do 5 antígeno para uma ampla variedade de antígenos, incluindo antígenos de peptídeo ou proteína, vírus vivos ou mortos, vacinas de células dendríticas, vacinas celulares autólogas e polissacarídeos conjugados em ambas as vacinas, profiláticas e terapêuticas. Mais importante é o fato que ela reforça a maturação e diferenciação de células dendríticas, resultando em uma 10 maior ativação de células Thi e em uma forte geração de linfócitos T citotóxicos (CTL), mesmo na ausência da ajuda de células T CD4. O viés de TH1 induzida por estimulação de TLR9 é mantida mesmo na presença de adjuvantes de vacina, tais como alumínio ou adjuvante incompleto de Freund (IFA) que, normalmente, promove um viés de TH2. Oligonucleótideos CPG 15 mostram uma atividade ainda maior de adjuvante quando formulado ou coadministrado com outros adjuvantes ou em formulações como as micropartículas, nanopartículas, emulsões lipídicas ou formulações similares, que são especialmente necessárias para induzir uma resposta forte quando o antígeno é relativamente fraco. Eles também aceleram a resposta imune e 20 permitem as doses de antígeno a serem reduzidas por aproximadamente duas ordens de magnitude, com respostas comparáveis de anticorpo para a vacina de dose integral sem CpG em algumas experiências (Krieg et al 2006). US Pat. No. 6,406,705 B1 descreve o uso combinado de CPG oligonucleotídeos, adjuvantes de ácido não nucleico e um antígeno para 25 induzir uma resposta imune específica do antígeno. Uma CPG TLR9 antagonista é o dSLIM (double Stem Loop Immunomodulator) por Mologen (Berlim, Alemanha), que é um componente preferido da composição farmacêutica da presente invenção. Outras moléculas que se ligam a TLR, como a TLR 7, TLR 8 e / ou TLR 9 que se ligam ao RNA também podem ser 30 utilizadas.

Outros exemplos de adjuvantes úteis incluem, mas não estão limitados a CpGs quimicamente modificados (por exemplo, CPR, Idera),

111/153 dsRNA análogos, como a Poly(l:C) e AmpliGen, não CPG bacteriana DNA ou RNA, bem como pequenas moléculas e anticorpos imunoativos tais como a ciclofosfamida, sunitiniba, Bevacizumab, Celebrex, NCX-4016, o sildenafil, tadalafil, vardenafil, Sorafenib, temozolomide, temsirolimus, XL-999, CP547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4 e SC58175, que podem agir terapeuticamente e/ou como urn adjuvante. As quantidades e concentrações de adjuvantes e aditivos úteis no contexto da presente invenção podem ser facilmente determinadas pelo artesão qualificado sem experimentação. Adjuvantes preferidos são dSLIM, interferon-alfa, interferonbeta, CpG7909, IC31, Imiquimod, resimiquimod, PeviTer, RNA, tadalafil, temozolomide, e Juvlmmune.

Adjuvantes preferidos são dSLIM, BCG, OK432, imiquimod, resimiquimod, GMCSF, interferon-alfa, PeviTer e Juvlmmune ou combinações dos mesmos.

Em uma variante preferida, a composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é selecionado dentre o grupo de fatores estimulantes de colônias, tais como o fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF, Sargramostim), imiquimode, resiquimode, e interferon-alpha.

Em uma variante ainda mais preferida, a composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é imiquimode ou resimiquimode. Em uma modalidade ainda mais preferida, a composição farmacêutica de acordo com a invenção, o adjuvante é a combinação de GM-CSF e imiquimode.

A composição é usada para administração parenteral, como por exemplo, por via subcutânea, intradérmica ou intramuscular ou para administração oral. Para isso, os peptídeos e outras moléculas opcionais são dissolvidos ou suspensos em veículo em forma farmacêutica aceitável, de preferência em forma aquosa. Além disso, a composição pode conter excipientes, tais como tampões, agentes de ligação, agentes desintegrantes, diluentes, flavorizantes, lubrificantes, etc.. Os peptídeos também podem ser administrados juntamente com substâncias imunoestimulantes tais como as

112/153 citoquinas. Uma relação completa de excipientes utilizáveis nessa composição pode ser obtida, por exemplo, de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3a. Ed. 2000, American Pharmaceutical Association e a imprensa farmacêutica. A composição pode ser usada para a prevenção, profilaxia e/ou terapia de doenças adenomatosas ou cancerígenas.

A presente invenção proporciona um medicamento que é útil no tratamento do câncer, em particular glioma e câncer cerebral, câncer de mama, câncer de próstata, câncer de esôfago, câncer colorretal, câncer renal, câncer de pâncreas, carcinoma de células escamosas e neoplasias queratinocíticas da pele, leucemia, câncer de pulmão, câncer de ovário e melanoma.

Além disso, a presente invenção ainda inclui um kit composto por:

(a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica, conforme o descrito acima, em solução ou em forma liofilizada;

(b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução reconstituinte para a formulação liofilizada; e (b) opcionalmente, instruções para o (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e / ou a utilização da formulação liofilizada.

O kit pode ainda incluir um ou mais tampões (iii), um diluente (iv), um filtro (v), uma agulha (vi), ou uma seringa (v). O recipiente deve ser de preferência uma garrafa, um frasco, uma seringa ou um tubo de ensaio, e ele pode ser um recipiente multiuso. A composição farmacêutica é, de preferência, liofilizada.

Kits da presente invenção contêm, de preferência, uma formulação liofilizada da presente invenção em um recipiente adequado assim como as instruções para a sua reconstituição e/ou utilização. Recipientes adequados incluem, por exemplo, garrafas, frascos (por exemplo, frascos de câmara dupla), seringas (por exemplo, seringas de câmara dupla) e tubos de ensaio. O recipiente pode ser formado a partir de uma variedade de materiais como vidro ou plástico. Preferencialmente, o kit e / ou o recipiente contêm instruções sobre o recipiente ou similares, que indicam as indicações para a reconstituição e/ou utilização. Por exemplo, o rótulo poderá indicar

113/153 que a formulação liofilizada deverá ser reconstituída a concentrações de peptídeos, tal como descrito acima. O rótulo ainda pode indicar que a formulação é destinada ou apropriada para administração subcutânea.

O recipiente que detém a formulação pode ser um frasco multiuso, que permite a repetição de administrações (por exemplo, 2-6 administrações), da formulação reconstituída. O kit ainda pode incluir um segundo recipiente, contendo um diluente adequado (por exemplo, solução de bicarbonato de sódio).

Após a mistura do diluente e da formulação liofilizada, a concentração no final de peptídeo na formulação reconstituída é, de preferência, pelo menos, 0,15 mg/mL/peptídeo (= 75pg) e preferencialmente não superior a 3 mg/mL/peptídeo (= 1500pg). O kit ainda pode incluir outros materiais, conforme desejado a partir de uma perspectiva comercial ou do usuário, incluindo outros tampões, diluentes, filtros, agulhas, seringas, e suplementos de embalagem com instruções de utilização.

Kits da presente invenção podem ter um único recipiente que contém a formulação das composições farmacêuticas, segundo a presente invenção, com ou sem outros componentes (por exemplo, outros compostos ou composições farmacêuticas desses outros compostos), ou podem ter recipientes distintos para cada componente.

Preferencialmente, kits da invenção incluem uma formulação da invenção embalada para uso em combinação com a coadministração de um segundo composto (como adjuvantes (por exemplo GM-CSF), um agente quimioterápico, um produto natural, um hormônio ou antagonista, um agente ou inibidor de antiangiogênese, um agente indutor de apoptose ou um quelante) ou uma composição farmacêutica dos mesmos. Os componentes do kit podem ser pré-complexados ou cada componente pode ser depositado separadamente em recipientes distintos antes da administração a um paciente. Os componentes do kit podem ser fornecidos em uma ou mais soluções líquidas, de preferência, uma solução aquosa, ainda mais preferencialmente, uma solução aquosa estéril. Os componentes do kit também podem ser fornecidos como sólidos, que podem ser convertidos em

114/153 líquidos através da adição de solventes adequados, que devem ser fornecidos preferencialmente em um recipiente distinto.

O recipiente de um kit terapêutico pode ser um frasco, tubo de ensaio, container, garrafa, seringa, ou quaisquer outros meios de armazenamento de sólidos ou líquidos. Normalmente, quando há mais de um componente, o kit deverá conter um segundo frasco ou outro recipiente, que permita separar a dosagem. O kit também pode conter um outro recipiente para um líquido farmaceuticamente aceitável. De preferência, o kit terapêutico deverá conter um aparelho (por exemplo, uma ou mais agulhas, seringas, conta-gotas, pipetas, etc), que permita a administração correta dos agentes da invenção que são componentes do presente kit.

A presente formulação é adequada para a administração dos peptídeos por qualquer via aceitável, tal como a oral (entérica), nasal, oftálmica, subcutânea, intradérmica, intramuscular, intravenosa ou transdérmica. Preferencialmente a administração s.c., e mais de preferência, i.d. A administração pode ser por bomba de infusão.

Uma vez que os peptídeos derivados da invenção de BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e PDPN foram isolados da glioblastoma, o medicamento da invenção é preferivelmente usado para tratar o glioblastoma.

A presente invenção será agora descrita nos exemplos e figuras a seguir, que descrevem suas modalidades preferidas sem que ela seja limitada, no entanto, a estes exemplos. Para os fins da presente invenção, todas as referências aqui citadas passam a fazer parte integral deste documento por referência.

Figura 1: Espectro exemplar de massa de IGF2BP3-001 demonstrando a sua apresentação em amostra de tumor primário GB6010. NanoESI-LCMS foi realizado em uma bacia de peptídeo eluida da amostra GBM GB6010. O cromatograma de massas para m/z 536.3238 ± 0.001 Da, z = 2 mostra um pico de peptídeo na retenção de 49,89 min de tempo. B) O pico detectado no cromatograma de massa em 48,76 min revelou um sinal de m/z 536.3239 no espectro de MS. C) Um espectro de massa decaído

115/153 induzido por colisão do precursor selecionado m/z 536.3239 registrado no experimento nanoESI-LCMS no tempo de retenção dado confirmou a presença de IGF2BP3-001 na amostra do tumor GB6010. D) O padrão de fragmentação do peptídeo sintético de referência IGF2BP3-001 foi registrado e comparado com o padrão de fragmentação natural TUMAP gerado e mostrado em C para verificação sequencial.

A figura 2 mostra os perfis de expressão de mRNA de proteínas selecionadas em tecidos normais e em 19 amostras de glioblastoma.

A figura 2b mostra os perfis de expressão de mRNA de proteínas selecionadas em tecidos normais e em 19 amostras de glioblastoma.

A figura 3 mostra a imunogenicidade exemplar in vitro dos TUMAPs de classe I IMA950.

A figura 4 mostra as afinidades exemplares de ligação dos peptídeos HLA de classe I da invenção ao A*02.

SEQ ID n° 1 a SEQ ID n° 24 mostram as sequências de outros peptídeos associados a tumor de acordo com a presente invenção.

EXEMPLOS

Os peptídeos FTELTLGEF (HLA-A1; PolyPeptide Laboratories, Wolfenbüttel, Alemanha), LMLGEFLKL (HLA-A2; Clinalfa, Sissach, Suíça), e EPDLAQCFY (HLA-B35; PolyPeptide Laboratories) foram todos obtidos em qualidade farmacêutica.

EXEMPLO 1:

A identificação de peptídeos associados a tumor na superfície da célula

Amostras de tecido

Os tecidos tumorais de pacientes foram fornecidos pelo Hôpital Cantonal Universitaire de Genève (Laboratório Médico de Oncologia de Imunologia de Tumor) e pelo Neurochirurgische Universitãts-Klinik Heidelberg (Laboratório Molecularbiológico). Consentimentos expressos por escrito dos pacientes foram dados antes da cirurgia. Os tecidos foram congelados por choque em nitrogênio líquido imediatamente após a cirurgia e armazenados até o isolamento das TUMAPs a -80° C.

116/153

Isolamento de peptídeos HLA em amostras de tecido

Bacias de peptídeos HLA provenientes de amostras de tecidos congelados por choque foram obtidas por precipitação imune a partir de tecidos sólidos de acordo com um protocolo ligeiramente modificados (Falk, K. et al 1991; Seeger, F.H. et al. T 1999) usando o anticorpo HLA-A*02 específico BB7.2 ou o anticorpo específico HLA-A, -B, -C W6/32, sefarose de CNBr ativado, tratamento ácido, e ultrafiltração.

Métodos:

As obtidas bacias peptídicas de HLA foram separadas de acordo com sua hidrofobicidade por cromatografia de fase revertida (Acquity UPLC system, Waters) e os peptídeos a serem diluídos foram analisados num espectrômetro de massa híbrido LTQ-Orbitrap (ThermoElectron) equipados com uma fonte ESI. As bacias peptídicas foram carregadas diretamente para coluna analítica de silica fundida microcapilar (75 pm i.d. x 250 mm) empacotada com 1,7 pm de material C18 de fase revertida (Waters), aplicando um índice de fluxo de 400 nL por minuto. Subsequentemente, os peptídeos foram separados usando um gradiente binário de 180 minutos em dois passos de 10% a 33% B em índices de fluxo de 300 nL por minuto. O gradiente foi composto de Solvente A (0,1% ácido fórmico em água) e solvente B (0,1% de ácido fórmico em acetonitrilo). Um tubo capilar revestido de vidro dourado (PicoTip, New Objective) foi usado para introdução na fonte de micro-ESI. O espectrômetro de massa LTQ-Orbitrap foi operado no modo dependente dos dados usando uma estratégia TOP5. Em sumário, um ciclo de escaneamento foi inicializado com um escaneamento pleno de alta exatidão de massa no orbitrap (R = 30 000), que foi seguido por escaneamentos da MS/MS também no orbitrap (R = 7500) nos 5 íons mais abundantes de precursor com a exclusão dinâmica de íons previamente selecionados. Os espectros de massa tandem foram interpretados por SEQUEST e por controle manual adicional. A sequência de peptídeos identificada foi assegurada por comparação do padrão de fragmentação de peptídeo natural gerado com o padrão de fragmentação de um peptídeo de

117/153 referência sequência idêntica sintética. A figura 1 mostra um espectro exemplar obtido a partir de tecido tumoral para o peptídeo associado a MHC da classe I IGF2BP3-001 e seu perfil de elução no sistema UPLC.

EXEMPLO 2:

A expressão de perfil de genes codificando os peptídeos da invenção

Não todos os peptídeos identificados como sendo apresentados na superfície de células de tumor por moléculas MHC são adequados para imunoterapia, porque a maioria destes peptídeos é derivada de proteínas celulares normais expressas por muitos tipos de célula. Só alguns destes peptídeos são associados a tumor e provavelmente capazes de induzir células T com uma alta especificidade de reconhecimento para o tumor, do qual eles foram derivados. Para poder identificar tais peptídeos e reduzir o risco para autoimunidade induzida por vacinação, os inventores focaram nesses peptídeos, que são derivados de proteínas que são superexpressas em células de tumor comparadas à maioria de tecidos normais.

O peptídeo ideal será derivado de uma proteína que é rara ao tumor e não presente em qualquer outro tecido. Para identificar peptídeos que são derivados de genes com um perfil de expressão semelhante ao gene ideal, os peptídeos identificados foram designados às proteínas e genes, respectivamente, dos quais eles foram derivados, e perfis de expressão destes genes foram gerados.

Fontes de RNA e preparação

Espécimes de tecido cirurgicamente retirados foram fornecidos por dois locais clínicos diferentes (vide exemplo 1) depois do consentimento expresso por escrito ter sido obtido de cada paciente. Os espécimes de tecido de tumor foram congelados por estalo em nitrogênio líquido imediatamente depois de cirurgia e, mais tarde, homogeneizados com almofariz e pilão sob nitrogênio líquido. RNA total foi preparado destas amostras usando TRIzol (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) seguido por uma limpeza com RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemanha); ambos métodos foram executados de acordo com o protocolo do fabricante.

118/153

RNA total de tecidos humanos saudáveis foi obtido comercialmente (Ambion, Huntingdon, Reino Unido; Clontech, Heidelberg, Alemanha; Stratagene, Amsterdã, Países Baixos; BioChain, Hayward, CA, EUA). O RNA de vários indivíduos (entre 2 e 123 indivíduos) foi misturado, de tal modo que o RNA de cada indivíduo foi igualmente pesado. Os leucócitos foram isolados de amostras de sangue de 4 voluntários saudáveis.

A qualidade e quantidade de todas as amostras de RNA foram avaliadas num bioanalisador Agilent 2100 (Agilent, Waldbronn, Alemanha) usando o kit 6000 Pico LabChip (Agilent).

Experimentos micromatrix

A análise de expressão de gene de todas as amostras RNA de tecido tumoral e normal foi executada por micromatrix oligonucleotídeas Affymetrix Human Genome (HG) U133A ou HG-U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EUA). Todas as etapas foram realizadas de acordo com o manual Affymetrix. Em resumo, cDNA de fita dupla foi sintetizado de 5-8 pg do RNA total, usando SuperScript RTII (Invitrogen) e o iniciador oligo-dT-T7 (MWG Biotech, Ebersberg, Alemanha) como descrito no manual. Uma transcrição in vitro foi executada com o kit de rotulação de transcrito RNA BioArray High Yield (Diagnósticos ENZO, Inc., Farmingdale, NY, EUA) para as séries U133A ou com o kit de rotulação GeneChip IVT (Affymetrix) ara as séries U133 Plus 2.0, seguidas por fragmentação de cRNA, hibridação, e manchandas com estreptavidina-ficoeritrina e anticorpo de anti-estreptavidina de biotina (Molecular Probes, Leiden, Países Baixos). As imagens foram escaneadas com o scanner Agilent 2500A GeneArray (U133A) ou o scanner Affymetrix Gene-Chip 3000 (U133 Plus 2.0), e dados foram analisados com o software GCOS (Affymetrix), usando cenários padrão para todos parâmetros. Para a normalização, foram utilizados 100 genes housekeeping fornecidos pela Affymetrix. Valores relativos de expressão foram calculados das relações do diário de sinal fornecidas pelo software e a amostra normal rim de foi arbitrariamente posta em 1.0.

Os perfis de expressão dos genes de origem da presente invenção que são altamente superexpressos em glioblastoma da presente

119/153 invenção são mostrados na figura 2.

EXEMPLO 3:

Imunogenicidade in vitro de peptídeos apresentados em MHC de classe IIMA950

A fim de obter informações sobre a imunogenicidade de TUMAPs da presente invenção, realizamos investigações com uma plataforma de estimulação in vitro em bacia já descritas por (Walter, S, Herrgen, L, Schoor, O, Jung, G, Wernet, D, Buhring, HJ, Rammensee, HG, and Stevanovic, S; 2003, Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres, J.Immunol., 171, 49744978). Dessa forma pudemos mostrar imunogenicidade consideravelmente elevada para 13 TUMAPs restritos a HLA-A*0201 da invenção (em >= 50% dos doadores testados puderam ser detectados CTLs específicos de TUMAP), demonstrando que estes peptídeos são epítopos de células T contra o qual há células T precursoras CD8+ em seres humanos (Tabela 3).

Preparação in vitro de células T CD8+

Para poder executar estímulos in vitro por células artificiais apresentando antígeno (aAPC) carregadas com complexo peptídico MHC (pMHC) e anticorpo anti-CD28, em primeiro lugar foi isolado PBMCs (células periféricas mononucleares de sangue) de camadas leuco-plaquetárias frescas HLA-A*02+ usando um agente normal para separação gradiente de densidade (PAA, Coibe, Alemanha). As camadas leuco-plaquetárias foram obtidas ou do Banco de Sangue de Tübingen ou do Katharinenhospital Stuttgart. PBMCs isolados foram incubados durante a noite em agente de célula T (TCM) para preparação em seres humanos in vitro formada por RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemanha) suplementadas com 10% de calor de soro humano AB inativado (PAA, Coibe, Alemanha), 100 U/ml de penicilina /100 pg/ml de estreptomicina (Cambrex, Verviers, Bélgica), 1 mM de sódio piruvato (CC Pro, Neustadt, Alemanha) e 20 pg/ml de gentamicina (Cambrex,). Linfócitos CD8+ foram isolados usando o kit positivo de seleção CD8+ MACS (Miltenyi, Bergisch Gladbach, Alemanha) de acordo com as instruções do fabricante. As células T CD8+ obtidas foram incubadas até o

120/153 uso em TCM suplementados com 2.5 ng/ml IL-7 (PromoCell, Heidelberg, Alemanha) e 10 U/ml IL-2 (Chiron, Munique, Alemanha). A geração de contas revestidas com pMHC/anti-CD28, os estímulos de célula Tea revisão foram executadas como descrito anteriormente (Walter et al., 2003) com pequenas modificações. Em resumo, moléculas HLA-A*0201 recombinantes biotiniladas carecendo de domínio de transmembrana e biotiniladas nos términos de carbóxi da corrente pesada, foram produzidas seguindo um método descrito por (Altman et al., 1996). O lgG2a antihumano CD28 Ab 9.3 purificado (Jung et al., 1987) costimulatoriamente de rato foi quimicamente biotinilado usando-se um Sulfo-N-hidroxisucinimidobiotina como recomendado pelo fabricante (Perbio, Bonn, Alemanha). As contas usadas eram formadas por partículas de poliestireno revestidas com streptavidina com um tamanho de 5,60 pm (Bangs Laboratories, lllinois/EUA). A pMHC usada como controles positivos e negativos foram A*0201/MLA-001 (ELAGIGILTV peptídico de Melan-A/MART-1 modificado) e A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5) ou A*0201/HBV-001 (FLPSDFFPSV), respectivamente.

800.000 contas / 200 μΙ foram revestidas em pratos de 96 poços ondulados na presença de 600 ng de biotina anti-CD28 mais 200 ng biotina pMHC relevante (contas de alta densidade) ou 2 ng de MHC relevante mais 200 ng de MHC irrelevante (biblioteca de pMHC) (contas de baixa de densidade). Os estímulos foram iniciados em pratos de 96 poços ondulados por coincubação de 1x10⁶ células T CD8+ com 2x10⁵ contas revestidas lavadas em 200 μΙ TCM suplementadas com 5 ng/ml IL-12 (PromoCell) por 3-4 dias a 37° C. A metade do agente foi então trocada por TCM fresco suplementado com 80 U/ml IL-2 e a incubação foi continuada por 3-4 dias a 37° C. Este ciclo de estímulo foi executado para um total de três vezes. Finalmente, análises tetraméricas foram executadas com fluorescente de tetrâmeros MHC (produzidos como descrito por (Altman et al., 1996)) mais anticorpo-clone CD8-FITC clone SK1 (BD, Heidelberg, Alemanha) em um FACSCalibur de quatro cores(BD). Células específicas peptídicas foram calculadas como porcentagem de CD8 + células T totais. A avaliação de

121/153 análise de tetramérica foi feita usando-se o software FCS Express (De Novo Software). Preparação in vitro de tetramer específico + CD8 + linfócitos foi detectado por comutação apropriada e por comparação com estímulos negativos de controle. Imunogenicidade para um antígeno dado foi 5 detectado se pelo menos um poço estimulado, avaliado in vitro proveniente de um doador saudável tenha sido encontrado contendo uma linhagem celular T CD8+ após a estimulação in vitro (ou seja, este poço continha pelo menos 1% do tetrâmero específico + entre células T CD8+ e a porcentagem de células tetrâmero+ específicas era pelo menos 10x maior do que a média 10 dos estímulos de controle negativos).

Imunogenicidade in vitro para peptídeos IMA950

Para peptídeos HLA de classe I testados, a imunogenicidade in vitro pôde ser demonstrada pela geração de linhagens celulares T específicas do peptídeo. Resultados exemplares de fluxo de citometria após 15 coloração tetrâmera específica de TUMAP para dois peptídeos da invenção são mostrados na figura 3. Resultados de 13 peptídeos da invenção são resumidos na tabela 3.

Tabela 3: Imunogenicidade in vitro de peptídeos altamente imunogènico HLA de classe I da invenção

Antígeno	Doadores positivos / doadores testados	Bacias positivos / bacias testadas
BCA-001	60%	5%
BCA-002	75%	35%
CLIP2-001	75%	6%
CSP-001	100%	57%
FABP7-001	100%	27%
IGF2BP3-001	50%	21%
NES-001	75%	38%
NLGN4X-001	100%	62%
NRCAM-001	86%	39%
PDPN-001	60%	11%
SLCO1C1-001	60%	7%

122/153

TNC-001	60%	30%
TNC-002	50%	14%

Além desses resultados obtidos de doadores de sangue saudáveis, os peptídeos BCA-002, CHI3L1-001, e NLGN4X-001 também foram testados em um pequeno número de pacientes com glioblastoma. Todos os peptídeos mostraram ser imunogênicos a um nível semelhante em comparação com indivíduos saudáveis, demonstrando a existência de células T precursoras em uma população-alvo relevantes para a vacina.

EXEMPLO 4:

A ligação de peptídeos restringidos a HLA de classe I da invenção a HLA-A*0201

Objetivo e Resumo

O objetivo desta análise era avaliar a afinidade da classe de peptídeos HLA de classe I à molécula MHC codificada pelo alelo HLAA*0201, pois isto é um parâmetro importante para o modo de ação de peptídeos como parte da imunoterapia do câncer. Afinidades ao HLA-A*0201 foram de médio a alto para todos os peptídeos 0 HLA restritos de classe I testados da invenção, com constantes de dissociação no intervalo do peptídeo HBV-001 de controle positivo, um conhecido e forte ligante A*02 derivado do antígeno núcleo do vírus da hepatite B. Estes resultados confirmam a forte afinidade de ligação de todos os peptídeos HLA de classe I testados da presente invenção.

Princípio do teste

Complexos HLA/peptídeo estáveis consistem em três moléculas: HLA de corrente pesada, beta-2 microglobulina (b2m) e o ligante peptídico. A atividade de moléculas de corrente pesada do recombinante desnaturado HLA-A*0201 sozinhos podem ser conservadas, fazendo delas os equivalentes funcionais das moléculas HLA-A*0201 vazias”. Quando diluídas em tampões aquosos contendo b2m e um peptídeo apropriado, estas moléculas dobram rapidamente e eficientemente numa maneira inteiramente dependente de peptídeo. A disponibilidade destas moléculas é usada num ensaio baseado em ELISA para medir a afinidade de interação entre peptídeo e

123/153 molécula HLA da classe de I (Sylvester-Hvid et al., 2002).

Moléculas purificadas HLA-A*0201 de recombinante foram incubadas juntos com doses b2m e graduadas do peptídeo de interesse. A quantidade de complexos HLA/peptídeo dobrados em “de novo” foi determinada por ELISA quantitativa. Constantes de dissociação (valores KD) foram calculadas usando-se uma curva padrão registrada de diluições de um complexo HLA/peptídeo calibrante.

Resultados

Os resultados são mostrados na figura 4. Um menor valor de KD reflete maior afinidade para HLA-A*0211. Todos os peptídeos testados da invenção tiveram uma forte afinidade com o HLA-A*0201 em todo o KD para o peptídeo de controle positivo HBV-001, um conhecido e forte ligante A*02. Desta forma, todos TUMAPs de classe I têm uma forte afinidade de ligação com a molécula MHC A*02.

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Claims

REIVINDICAÇÕES

1. Peptídeo constituindo uma sequência que é selecionada do grupo SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 30 ou um variante destes que é 85% homóloga a SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 30 ou um variante destas que induzirá células T cruzando com a variante do dito peptídeo, na qual o dito peptídeo não é o polipeptídeo de comprimento total subjacente.
2. Peptídeo ou variante do mesmo de acordo com a reivindicação 1, em que o dito peptídeo ou variante dele mantém a capacidade de se ligar a uma molécula do complexo de histocompatibilidade humana importante (MHC) da classe I ou II, em que o dito peptídeo é capaz de estimular células T CD4 e/ou CD8.
3. Peptídeo de acordo com a reivindicação 1 ou 2, em que a sequência de aminoácido constitui uma extensão contínua de aminoácidos conforme o grupo com a SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 30.
4. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

3, em que o dito peptídeo é selecionado a partir de um subtipo HLA específico, de acordo com a tabela 2, sendo capaz de estimular as células CD8, e em que o dito peptídeo compreende a âncora específica de motivo aminoácido, conforme ilustrado na tabela 2.
5. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

4, em que o dito peptídeo ou variante do mesmo tem um comprimento total de entre 8 e 100, preferivelmente entre 8 e 30, e mais preferivelmente entre 8 e 16 aminoácidos, e ainda mais preferivelmente em que o peptídeo consiste ou consiste essencialmente em uma sequência de aminoácido de acordo com SEQ ID No. 1 a SEQ ID No. 30.
6. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

5, em que o peptídeo é modificado e/ou inclui ligações não peptídicas.
7. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1 a

6, em que o peptídeo é uma proteína de fusão, em especial, compreendendo aminoácidos de terminal N da cadeia invariante HLA-DR associada a antígeno (li).
8. Ácido nucleico, que codifica um peptídeo como definido em

2/4 qualquer uma das reivindicações 1 a 7.
9. Vetor de expressão capaz de expressar um ácido nucléico como definido na reivindicação 8.
10. Peptídeo de acordo com qualquer uma das reivindicações 1

5 a 7, um ácido nucléico de acordo com a reivindicação 8 ou um vetor de expressão de acordo com a reivindicação 9 para uso na medicina.
11. Célula hospedeira compreendendo o ácido nucléico como definido na reivindicação 8, ou um vetor de expressão como definido na reivindicação 9, em que a dita célula hospedeira é de preferência uma célula

10 que apresenta antígeno, em especial uma célula dendrítica ou célula que apresenta antígeno.
12. Método de produzir um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, o método compreendendo o cultivo da célula hospedeira como definida na reivindicação 11 que expressa o ácido nucléico

15 como definido na reivindicação 8 ou o vetor de expressão como definido na reivindicação 9, e o isolamento do peptídeo da célula hospedeira ou do seu meio de cultura.
13. Método in vitro para a produção de linfócitos T citotóxicos ativados (CTL), o método compreende contatar CTL in vitro com moléculas

20 MHC de classe I ou II de antígeno humano carregado expresso na superfície de uma célula adequada apresentadoras de antígenos ou uma construção artificial que imite uma célula apresentadora de antígeno por um período de tempo suficiente para ativar o dito CTL de uma forma específica do antígeno, no qual o dito antígeno é um peptídeo como definido em qualquer uma das 25 reivindicações 1 a 10.
14. Linfócito T citotóxico (CTL) ativado, produzido pelo método como definido na reivindicação 13, que reconhece seletivamente uma célula que expressa aberrantemente um polipeptídeo compreendendo uma sequência de aminoácidos como definida em qualquer um das reivindicações

30 de 1 a 5.
15. Método de matar células alvo em um paciente cujas células alvo aberrantemente expressam um polipeptídeo composto por uma sequên-

3/4 cia de aminoácidos como definida em qualquer uma das reivindicações 1 a

8, o método compreendendo a administração ao paciente de um número efetivo de linfócitos T citotóxicos (CTL), como definido na reivindicação 14.
16. Uso de um peptídeo como definido em qualquer uma das

5 reivindicações 1 a 7, peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1 a 7, o ácido nucleico como definido na reivindicação 8, o vetor de expressão como definido na reivindicação 9, uma célula como definida na reivindicação 11, ou um linfócito de T citotóxico ativado como definido na reivindicação 14 para o tratamento de câncer ou na fabricação 10 de um medicamento contra câncer, sendo que o dito medicamento é de preferência uma vacina.
17. Uso de acordo com a reivindicação 16, em que o dito câncer é selecionado a partir de astrocitoma, astrocitoma pilocítica, tumor neuroectodérmico disembrioplástico, oligodendrogliomas, ependimoma,

15 glioblastoma multiforme, gliomas mistos, oligoastrocitomas, meduloblastoma, retinoblastoma, neuroblastoma, germinoma, teratoma, gangliogliomas, gangliocitoma, gangliocitoma central, tumores neuroectodérmico primitivo (PNET, por exemplo, meduloblastoma, meduloepitelioma, neuroblastoma, retinoblastoma ependimoblastoma), tumores do parênquima pineal pineoci20 toma (por exemplo, pineoblastoma), tumores de células ependimárias, tumores do plexo coroideoide, tumores gliais de origem incerta (por exemplo, gliomatose cerebral, astroblastoma), tumor de próstata glioblastoma, câncer de mama, câncer de esôfago, câncer colorretal, carcinoma de células renais claras, câncer de pulmão, CNS, câncer de ovário, câncer de pâncreas 25 melanoma, carcinoma de células escamosas, leucemia meduloblastoma, tumor no cólon, reto, estomago, rins, pulmão, pâncreas, próstata, pele e outros tumores mostrando uma superexpressão de survivina e/ou CSPG4 e/ou outras proteínas, das quais os peptídeos da SEQ ID 1 a SEQ ID 30 foram derivados.

30
18. Kit compreendendo:

(a) um recipiente que contém uma composição farmacêutica contendo um peptídeo como definido em qualquer uma das reivindicações 1

4/4 a 7, o ácido nucleico como definido na reivindicação 8, o vetor de expressão como definido na reivindicação 9, uma célula como definida na reivindicação

11, ou um linfócito T citotóxico ativado como definido na reivindicação 14, em solução ou na forma liofilizada;

(b) opcionalmente, um segundo recipiente contendo um diluente ou solução reconstituinte para a formulação liofilizada;

(c) opcionalmente, pelo menos mais um peptídeo selecionado do grupo constituído de peptídeos de acordo com SEQ IDs No 1 a 30, e (d) opcionalmente, instruções para o (i) uso da solução ou (ii) reconstituição e / ou a utilização da formulação liofilizada.
19. Kit de acordo com a reivindicação 18, ainda pode incluir um ou mais tampões (iii), um diluente (iv), um filtro (v), uma agulha (vi), ou uma seringa (vii).
20. Kit de acordo com a reivindicação 18 ou 19, em que o dito peptídeo é selecionado do grupo consistindo em SEQ ID 1 e SEQ ID 20.
21. Método para distinguir glioblastoma de outras formas de câncer, compreendendo analisar a expressão do BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e/ou PDPN em uma amostra obtida do cérebro ou outras amostras tumorais a partir de um paciente a ser diagnosticado.
22. Kit para medir o nível de expressão do BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e/ou PDPN como (um) gene(s) marcador(es) de glioblastoma, incluindo pelo menos um anticorpo que se liga especificamente um polipeptídeo marcador de glioblastoma escolhido, ou um ou mais ácidos nucleicos que especificamente cruzam com o BCA, CLIP2, DTNA, NLGNAX, NR2E1, NRCAM e/ou mRNA PDPN, e, opcionalmente, um controle (por exemplo, uma quantidade específica de um polipeptídeo marcador de glioblastoma particular), primária e secundária de anticorpos quando for o caso e, opcionalmente, outros reagentes, tais como metades detectáveis, substratos da enzima, e/ou reagentes de cor.