DE602005005196T2

DE602005005196T2 - Tumor-assoziierte Peptide, welche an unterschiedliche menschliche Leukozytenantigene der Klasse II binden

Info

Publication number: DE602005005196T2
Application number: DE602005005196T
Authority: DE
Inventors: Jörn DENGJEL
Original assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Current assignee: Immatics Biotechnologies GmbH
Priority date: 2005-09-05
Filing date: 2005-09-05
Publication date: 2008-06-26
Anticipated expiration: 2025-09-06
Also published as: CY1112186T1; AU2006289290B2; KR20080052643A; US20080207520A1; AU2006289290A1; PL1806358T3; WO2007028574A9; EP1806359A1; WO2007028574A2; JP5627180B2; US20080206218A1; DK1806359T3; DK2135878T3; PL1760088T3; PL1806359T3; SI1806359T1; US20100040590A1; CN105440119A; US20080206217A1; PL2135878T3

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft immuntherapeutische Methoden und Moleküle und Zellen für die Verwendung in immuntherapeutischen Methoden. Insbesondere betrifft die vorliegende Erfindung die Immuntherapie von Krebs, im Besonderen Nieren- und Darmkrebs. Die vorliegende Erfindung betrifft weiterhin tumorassoziierte T-Helferzellen Peptid-Epitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, die als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impfstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren. Insbesondere bezieht sich die vorliegende Erfindung auf 49 neue Peptidsequenzen, die von Molekülen der HLA-Klasse-II menschlicher Zelllinien abgeleitet sind, welche in Impfstoffkompositionen zur Auslösung von antitumoralen Immunantworten verwendet werden können.
Grundlagen der Erfindung
Die Stimulation einer Immunantwort hängt von der Präsenz von Antigenen ab, die vom Immunsystem des Wirts als fremd erkannt werden. Die Entdeckung der Existenz von tumorassoziierten Antigenen hat jetzt die Möglichkeiten erweitert, das Immunsystem des Wirts dafür zu nutzen, um ins Tumorwachstum einzugreifen. Gegenwärtig werden verschiedene Mechanismen zur Einbindung beider, sowohl der humoralen als auch der zellularen Zweige des Immunsystems für die Krebsimmunotherapie untersucht.
Spezifische Elemente von Zellimmunantworten sind fähig, Tumorzelle spezifisch zu erkennen und sie zu zerstören. Die Isolierung von zytotoxischen T-Zellen (CTL) aus tumorinfiltrierenden Zellenpopulationen oder aus dem peripheren Blut weist darauf hin, dass solche Zellen bei dem natürlichen Immunschutz gegen Krebs eine wichtige Rolle spielen (Cheever et al., Annals N.Y. Acad. Sci. 1993 690: 101-112). Eine wichtige Rolle bei dieser Antwort spielen insbesondere CD8-positive T-Zellen (TCD8+), die Moleküle der Klasse I des Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) erkennen, die mit Peptiden beladen sind, die gewöhnlich 8 bis 10 von zytosolischen Proteinen abgeleitete Reste haben. Die MHC-Moleküle des Menschen werden auch als humane Leukozyten-Antigene (HLA) bezeichnet.
Es gibt zwei Klassen von MHC-Molekülen: MHC-I-Moleküle, die auf den meisten Zellen mit einem Zellkern vorkommen, die Peptide präsentieren, die aus einer proteolytischen Spaltung endogener Proteine und größerer Peptide entstehen. MHC-II-Moleküle können nur auf professionel len Antigen-präsentierenden Zellen (APC) vorkommen und präsentieren Peptide von exogenen Proteinen, die von den APCs während des Ablaufes der Endozytose aufgenommen und anschließend prozessiert wurden. Die Komplexe aus Peptiden und MHC-I werden von CD8-positiven zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt, während die Komplexe aus Peptiden und MHC-II von CD4-positiven T-Helferzellen erkannt werden.
CD4-positive T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle beim Steuern der Effektorfunktionen der antitumoralen T-Zellantworten und aus diesem Grund kann die Identifizierung von CD4-positiven aus tumorassoziierten Antigenen (TAA) abgeleiteten T-Zell-Epitopen von einem großen Belang für die Entwicklung pharmazeutischer Produkte für die Auslösung antitumoraler Immunantworten sein (Kobayashi, H., R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta, and E. Celis. 2002. Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen. 8: 3219-3225., Gnjatic, S., D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N. K. Altorki, R. G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y. T. Chen, A. Knuth, and L. J. Old. 2003. Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 100(15): 8862-7).
Es konnte in Tiermodellen an Säugetieren, z. B. bei Mäusen, gezeigt werden, dass auch in Abwesenheit von zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) Effektorzellen (speziell CD8-positive T-Lymphozyten) CD4-positive T-Zellen ausreichend sind, die Sichtbarmachung von Tumoren durch Inhibition der Angiogenese durch Sekretion von Interferon-gamma (IFNγ) zu inhibieren (Qin, Z. and T. Blankenstein. 2000. CD4+ T-cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent an IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells Immunity. 12: 677-686). Weiterhin konnte gezeigt werden, dass CD4-positive T-Zellen, die Peptide von tumorassoziierten Antigenen, welche von HLA-Klasse-II-Molekülen präsentiert werden, erkennen, der Tumorprogression durch die Induktion von Antikörper (Ab)-Antworten entgegenwirken können (Kennedy, R. C., M. H. Shearer, A. M. Watts, and R. K. Bright. 2003. CD4+ T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. 63: 1040-1045). Im Gegensatz zu tumorassoziierten Peptiden, die an HLA-Klasse-I-Moleküle binden, ist nur eine geringe Anzahl von Klasse-II-Liganden von TAA bisher beschrieben worden (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Da die konstitutive Expressi on von HLA-Klasse-II-Molekülen normalerweise auf Zellen des Immunsystems beschränkt ist (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14: 301-331), wurde die Möglichkeit, Klasse-II-Peptide direkt aus primären Tumoren zu isolieren, als unmöglich angesehen. Deshalb wurde eine Reihe von Strategien beschrieben, um Antigene in den Klasse-II-prozessierenden-Signalweg von Antigen-präsentierenden Zellen (APCs) einzuschleusen, zum Beispiel die Inkubation von APCs mit einem interessierenden Antigen, um dessen Aufnahme, Prozessierung und Präsentation zu ermöglichen (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon, and B. P. van der Bruggen. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189: 767-778), oder der Transfektion von Zellen mit Genen oder Minigenen, die das interessierende Antigen kodieren und mit der unveränderlichen (invarianten) Kette verbunden sind, welche die Translokation von Antigenen zu den lysosomalen MHC-Klasse-II prozessierenden und beladenden Kompartimenten (MIIC) vermittelt.
Damit ein Peptid eine zelluläre Immunantwort auslösen (initiieren) kann, muss es an MHC-Moleküle binden. Dieser Vorgang ist vom Allel des MHC-Moleküls und von dem spezifischen Polymorphismus der Aminosäuresequenz des Peptids abhängig. MHC-Klasse-I bindende Peptide sind in der Regel 8-10 Reste lang und enthalten in ihrer Sequenz zwei konservierte Reste ("Anker"), die mit der entsprechenden Bindungsfurche des MHC-Moleküls interagieren.
In Abwesenheit einer Entzündung ist die Expression von MHC-Klasse-II bindenden Peptiden hauptsächlich auf Zellen des Immunsystems, besonders auf professionellen Antigenpräsentierenden Zellen (APC), wie zum Beispiel Monozyten, von Monozyten abgeleitete Zellen, Makrophagen und dendritische Zellen, begrenzt.
Die Antigene, die von den Tumor-spezifischen zytotoxischen T-Lymphozyten erkannt werden, bzw. deren Epitope, können Moleküle aus sämtlichen Proteinklassen, wie Enzyme, Rezeptoren, Transkriptionsfaktoren, etc. sein. Weiterhin können beispielsweise Tumor-assoziierte Antigene auch nur in Tumorzellen vorhanden sein, zum Beispiel als Produkte von mutierten Genen oder alternativen offenen Leserastern (Open Reading Frames, ORFs) oder durch Proteinsplicing (Vigneron N, Stroobant V, Chapiro J, Ooms A, Degiovanni G, Morel S, van der Bruggen P, Boon T, Van den Eynde BJ. An antigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome. Science. 2004 Apr 23; 304 (5670): 587-90.). Eine weitere wichtige Klasse von tumorassoziierten Antigenen sind gewebespezifische Strukturen, wie CT ("cancer testis")-Antigene, die in verschiedenen Arten von Krebs und in gesundem Gewebe der Testis exprimiert werden.
Verschiedene tumorassoziierte Antigene sind identifiziert worden. Weiterhin wurde ein großer Forschungsaufwand betrieben, um weitere tumorassoziierte Antigene zu identifizieren. Einige Gruppen von tumorassoziierten Antigenen, im Stand der Technik auch tumorspezifische Antigene genannt, sind gewebespezifisch. Beispiele enthalten, sind aber nicht beschränkt auf, Tyrosinase für Melanom, PSA und PSMA für Prostatakrebs und chromosomale Cross-Overs wie bcr/abl bei Lymphom. Allerdings kommen viele identifizierte tumorassoziierte Antigene in zahlreichen Tumortypen vor und einige, wie onkogene Proteine und/oder Tumor-Suppressorgene (Krebs unterdrückende Gene, diese sind zum Beispiel für Nierenkrebs in Linehan W. M., Walther M. M., Zbar B. The genetic basis of cancer of the kidney. J Urol. 2003 Dec; 170(6 Pt 1): 2163-72 zusammengefasst), die die eigentliche maligne Transformation erzeugen und in nahezu allen Krebsarten vorkommen. Zum Beispiel können normale zelluläre Proteine, die das Zellwachstum und die Differentiation kontrollieren, wie p53 (das ein Beispiel für ein Tumor-Suppressorgen ist), ras, cmet, myc, pRB, VHL und HER-2/neu Mutationen akkumulieren, was zu einer Upregulation der Expression dieser Genprodukte führt und sie dadurch onkogen macht (McCartey et al. Cancer Research 1998 15: 58 2601-5; Disis et al. Ciba Found. Symp. 1994 187: 198-211). Diese mutierten Proteine können das Ziel einer tumorspezifischen Immunantwort in zahlreichen Krebstypen sein.
Damit die Proteine durch die zytotoxischen T-Lymphozyten als tumorspezifisches Antigen erkannt werden, und um somit in einer Therapie eingesetzt werden zu können, müssen bestimmte Voraussetzungen vorliegen. Das Antigen soll hauptsächlich von Tumorzellen und nicht von gesunden Normalgeweben oder nur in geringeren Mengen exprimiert werden. Weiterhin ist wünschenswert, wenn das betreffende Antigen nicht nur in einer Tumorart, sondern auch in hoher Konzentration vorliegt (z. B. Kopienzahl pro Zelle). Essentiell ist auch das Vorliegen von Epitopen in der Aminosäuresequenz des Antigens, da ein solches von einem tumorassoziierten Antigen abgeleitetes Peptid ("immunogenes Peptid") zu einer T-Zell-Antwort in vitro oder in vivo führen soll.
Bisher wurde eine Reihe von Strategien beschrieben, um Antigene in den Klasse-II prozessierenden Signalweg einzuschleusen. Es ist möglich, Antigen-präsentierende Zellen (APCs) mit einem interessierenden Antigen zu inkubieren, um es aufzunehmen und zu prozessieren (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J. Exp. Med. 189, 767-778). Andere Strategien verwenden Fusionsproteine, die lysosomale Zielsequenzen enthalten. Solche in den APCs exprimierten Fusionsproteine führen Antigene in das Klasse-II prozessierende Kompartiment (Marks, M. S., Roche, P. A., van Donselaar, E., Woodruff, L., Peters, P. J. & Bonifacino, J. S. (1995) J. Cell Biol. 131, 351-369, Rodriguez, F., Harkins, S., Redwine, J. M., de Pereda, J. M. & Whitton, J. L. (2001) J. Virol. 75, 10421-10430).
In WO 03/068940 werden Komplexe von insgesamt zwei Polypeptiden und Methoden für Anwendung von diesen beschrieben, zum Beispiel Screening-Agenten, die Polypeptid-Komplexe zerstören, Methoden zur Bestimmung der Änderungen in der Expression eines Polypeptids in einem Subjekt und Methoden der Behandlung/Prävention von Erkrankungen, die geänderte Niveaus des Komplexes oder des Polypeptids einschließen. Die Leitstrategie der WO 03/068940 besteht darin, kritische Proteininteraktionen eines HPV-Wirts zu identifizieren, da HPV das Zervixkarzinom verursacht, WO 03/068940 legt SEQ. ID No. 55 nicht als tumorassoziiertes Antigen offen.
T-Helferzellen spielen eine wichtige Rolle beim Steuern der Effektorfunktionen der zytotoxischen T-Zellen (CTLs) in der antitumoralen Immunität. T-Helferzell-Epitope, die eine T-Helferzellantwort des TH1-Types auslösen, unterstützen die Effektorfunktionen der CD8-positiven Killer-T-Zellen, welche zytotoxische Funktionen gegen Tumorzellen, die tumorassoziierte Peptid/MHC Komplexe auf ihrer Zelloberfläche präsentieren, beinhalten. Auf diese Weise können tumorassoziierte T-Helferzellen Peptid-Epitope für sich allein oder in Kombination mit anderen tumorassoziierten Peptiden, als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von Impstoffkompositionen dienen, die antitumorale Immunantworten stimulieren.
Die Hauptaufgabe bei der Entwicklung eines Krebsimpfstoffes ist die Identifizierung und Charakterisierung von neuen tumorassoziierten Antigenen und davon abgeleiteten immunogenen T-Helfer-Epitopen, die von CD4-positiven CTLs erkannt werden können. Vor diesem Hintergrund ist es Aufgabe der vorliegenden Erfindung, neue Aminosäuresequenzen für ein derartiges Peptid bereitzustellen, welches die Fähigkeit aufweist, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-II zu binden.
Diese Aufgabe wird erfindungsgemäß gelöst durch die Bereitstellung eines tumorassoziierten Peptids mit einer Aminosäuresequenz von 9 bis 30 Aminosäuren, umfassend eine Sequenz gemäß SEQ ID-Nr. 43 aus dem beiliegenden Sequenzprotokoll, wobei das Peptid die Fähigkeit aufweist, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-II zu binden, unter der Vorraussetzung, dass das Peptid nicht das intakte humane tumorassoziierte Polypeptid ist.
In der vorliegenden Erfindung zeigen die Erfinder, dass es möglich ist, Peptide, die an HLA-Klasse-II-Moleküle binden, direkt von Säugetiertumoren, bevorzugt menschlichen Tumoren, bevorzugt soliden Tumoren, zum Beispiel Nierenzelltumore und Darmkrebs, zu isolieren und zu charakterisieren. Infiltrierende Monozyten exprimierten MHC-Klasse-II-Moleküle genauso wie Tumorzellen und Tumorzellen zeigten zusätzlich eine Upregulation von verschiedenen Zytokinen oder Chemokin-induzierte Genprodukte, wie zum Beispiel Interferon-gamma-induzierte Genprodukte.
Die vorliegende Erfindung stellt Peptide, die von Antigenen, die mit der Tumorigenese assoziiert sind, und die Fähigkeit haben, ausreichend an HLA-Klasse-II-Moleküle zu binden, um eine Immunantwort von menschlichen Leukozyten, speziell Lymphozyten, im Speziellen T-Lymphozyten, speziell CD4-positiven T-Lymphozyten, die T_H1-artige Immunantworten vermitteln, abgeleitet sind, zur Verfügung. Die Peptide stammen von tumorassoziierten Antigenen, speziell tumorassoziierten Antigenen mit Aufgaben zum Beispiel in Proteolyse, Angiogenese, Zellwachstum, Regulierung des Zellzyklus', Zellteilung, Regulierung der Transkription, Regulierung der Translation und der Gewebeinvasion.
Weiterhin sind tumorassoziierte Peptide aus der Matrix-Metalloproteinase 7 (MMP7; SEQ ID No. 1) und dem Insulin-like Growth Factor Binding Protein 3 (IGFBP3; SEQ ID No. 25) beschrieben.
In der vorliegenden Erfindung liefern die Erfinder außerdem schlüssige Belege, dass tumorassoziierte Peptide, die ausreichend an verschiedene HLA-Klasse-II-Moleküle binden, speziell den HLA-Klasse-II-Allelen, die durch die HLA DR Loci des menschlichen Genoms kodiert werden, in der Lage sind, durch menschliche CD4-positive T-Zellen vermittelte Immunantworten auszulösen. Die CD4-positiven T-Zellen wurden aus menschlichem peripherem Blut isoliert, wodurch gezeigt werden kann, dass die beanspruchten Peptide dazu geeignet sind, T-Zellantworten des menschlichen Immunsystems gegen ausgesuchte Peptide des Tumorzellpeptidomes auszulösen. Da die Peptide chemisch synthetisiert werden können und als aktive pharmazeutische Inhaltsstoffe von pharmazeutischen Abmischungen dienen können, können die Peptide der Erfindung der Erfinder für die Immuntherapie, bevorzugt die Krebsimmunotherapie verwendet werden.
Um HLA-Klasse-II-Liganden aus TAA für die Entwicklung von peptidbasierter Immuntherapie zu identifizieren, haben die Erfinder versucht, HLA-DR-präsentierte Peptide direkt aus sezierten soliden Tumoren zu isolieren, im Besonderen aus Nierenzellkrebs (RCC), über den berichtet wurde, dass er in der Lage ist, Klasse-II-Moleküle zu exprimieren (Gastl, G., T. Ebert, C. L. Finstad, J. Sheinfeld, A. Gomahr, W. Aulitzky, and N. H. Bander. 1996. Major histocompatibility complex class I and class II expression in renal cell carcinoma and modulation by interferon gamma. J. Urol. 155: 361-367). Auch wenn die Mehrheit der Tumorzellen Klasse 11 negativ sein sollte, sollten state-of-the-art Massenspektrometer die Sensitivität, die für die Identifizierung von Klasse-II-Peptiden aus einer minimalen Anzahl von Tumorzellen oder von infiltrierenden Leukozyten, die möglicherweise TAAs kreuzpräsentieren, oder aus Stromalzellen in der Umgebung der wachsenden Tumore, erforderlich ist, aufweisen.
Die Gründe, sich auf RCC zu konzentrieren, um den technischen Proof of Concept zu zeigen, waren die Folgenden: Etwa 150.000 Menschen werden jährlich weltweit mit RCC neu diagnostiziert, die Krankheit besitzt eine hohe Mortalitätsrate, die zu etwa 78.000 Toten pro Jahr führt (Pavlovich, C. P. and L. S. Schmidt. 2004. Searching for the hereditary causes of renal-cell carcinoma. Nat. Rev. Cancer 4: 381-393). Wenn Metastasen diagnostiziert werden, verringert sich die Ein-Jahr-Überlebensrate auf etwa 60% (Jemal, A., R. C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E. J. Feuer, and M. J. Thun. 2004. Cancer statistics, 2004. CA Cancer J. Clin. 54: 8-29), was den hohen nicht gedeckten medizinischen Bedarf in dieser Indikation betont. Da RCC ein immunogener Tumor zu sein scheint (Oliver RTD, Mehta A, Barnett MJ. A Phase 2 study of surveillance in patients with metastatic renal cell carcinoma and assessment of response of such patients to therapy an Progression. Mol Biother. 1988; 1: 14-20. Gleave M, Elhilali M, Frodet Y, et al. Interferon gamma-1b compared with placebo in metastatic renal cell carcinoma. N Engl J Med. 1998; 338: 1265), wie durch die Existenz von Tumor-reagierenden und Tumor-infiltrierenden CTLs angedeutet wird (Finke, J. H., P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R. R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes, and R. Bukowski. 1990. Characterization of the cytolytic activity of CD4-positive and CD8-positive tumor-infiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma. Cancer Res. 50: 2363-2370), wurden klinische Versuche initiiert, um peptidbasierte antitumorale Impfungen zu entwickeln (Wierecky J, Mueller M, Brossart P. Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1. Cancer Immunol Immunother. 2005 Apr 28). Aber auf Grund der fehlenden T-Helferzell-Epitope der TAAs umfassen molekular definierte Impfstoffe im Regelfall Peptide, die ausschließlich als Klasse-I-Liganden funktionieren.
Während der wissenschaftlichen Arbeit, die zu der vorliegenden Erfindung führte, gelang es den Erfindern Klasse-II-Liganden aus zehn RCC-Proben, drei kolorektalen Karzinomen (CCA) und einem Transitionalzellkarzinom (maligner Tumor des Übergangsgewebes, TCC, Urothelkarzinom) zu isolieren. Nur die ausgewählten Liganden der TAAs, die durch diesen Ansatz identifiziert wurden, haben die gemeinsamen Eigenschaften:

1. Von Antigenen mit bekannter Tumorassoziation abzustammen;
2. An die am weitesten verbreiteten HLA-Klasse-II-DR-Allele, HLA DRB1·0101 zu binden; und
3. sich dadurch von der Mehrheit der HLA-Klasse-II-Liganden zu unterscheiden, dass sie eine Bedingung an ihre primäre Aminosäuresequenz erfüllen, die ihnen erlaubt, promiskuitiv an HLA-DR-Moleküle, von mindestens zwei verschiedenen Allelen, zu binden.

Wie unten beispielhaft an einem Peptid von MMP7 (SEQ ID No. 1) erläutert wird, wurde gefunden, dass diese promiskuitiv HLA-DR-bindenden tumorassoziierten Peptide durch CD4-positive T-Zellen erkannt werden.
Die vorliegende Erfindung betrifft in einem ersten Aspekt ein Peptid, umfassend eine Aminosäuresequenz mit einer Länge zwischen 9 und 30 Aminosäuren, umfassend eine Sequenz entsprechend SEQ ID No. 43.
Wie im Folgenden beschrieben wird, wurden die Peptide, die die Basis der vorliegenden Erfindung bilden, alle als durch MHC-Klasse-II tragende Zellen (RCC) präsentierte identifiziert. Dadurch werden diese speziellen Peptide, wie auch andere Peptide, die die Sequenz beinhalten (d. h. abgeleitete Peptide), mit hoher Wahrscheinlichkeit alle eine spezifische T-Zellantwort auslösen, auch wenn sich der Umfang, in dem eine solche Antwort ausgelöst wird, durchaus zwischen Peptid und Peptid unterscheiden kann. Unterschiede können zum Beispiel durch Mutationen in besagten Peptiden entstehen (siehe unten). Der Fachmann im vorliegenden Fachgebiet ist sich sehr wohl den Methoden, die angewandt werden können, um das Ausmaß der induzierten Antwort durch ein individuelles Peptid zu bestimmen, insbesondere in Bezug auf die hier gegebenen Beispiele und die entsprechende Literatur, bewusst.
Bevorzugt besteht ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung essentiell aus einer Aminosäuresequenz entsprechend jeglicher SEQ ID No. 43.
"Besteht essentiell aus" soll bedeuten, dass ein Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung auch zusätzlich zu der Sequenz entsprechend SEQ ID No. 43 oder einer Variante davon weitere N- und/oder C-terminal lokalisierte Abschnitte von Aminosäuren enthalten kann, die nicht unbedingt einen Teil des Peptids bilden, welches als Kernsequenz des Peptids umfassend das Bindungsmotiv und als immunogenes T-Helfer-Epitop dient.
Gleichwohl können diese Abschnitte wichtig sein, um eine effiziente Einführung der Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung in die Zellen zu ermöglichen. In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung die 80 N-terminalen Aminosäuren der HLA-DR Antigen-assoziierten unveränderlichen Kette (p33, im Folgenden "Ii") wie sie von der NCBI, GenBank Accession-number X00497 (Strubin, M., Mach, B. and Long, E. O. The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity EMBO J. 3 (4), 869-872 (1984)) zu erhalten ist.
Unter einer "Variante" einer vorgegebenen Aminosäuresequenz verstehen die Erfinder, dass zum Beispiel die Seitenketten von einem oder zwei der Aminosäurenreste in einer Weise verändert sind (z. B. durch ihren Austausch durch die Seitenkette des Restes einer anderen natürlich vor kommenden Aminosäure oder einer anderen Seitenkette), so dass das Peptid immer noch in derselben Weise wie das Peptid mit der vorgegebenen Aminosäuresequenz an ein HLA-Molekül binden kann. Zum Beispiel kann ein Peptid so modifiziert werden, dass es die Fähigkeit, mit einem geeigneten MHC-Molekül, wie HLA-A, zu interagieren und zu binden, zumindest beibehält, wenn nicht sogar verbessert und dass es weiterhin die Fähigkeit, aktivierte CTL zu generieren, die Zellen, welche ein Polypeptid exprimieren, welches eine wie in der Beschreibung der Erfindung definierte Aminosäuresequenz enthält, erkennen und töten, zumindest beibehält, wenn nicht sogar verbessert. Wie aus der Datenbank abgeleitet werden kann, wie im Folgenden beschrieben, sind bestimmte Positionen der HLA-A bindenden Peptide typischerweise Ankerreste, die eine Kernsequenz bilden, welche in das Bindungsmotiv der HLA-Bindungsfurche passen.
Jene Aminosäurereste, die für die Wechselwirkung mit dem T-Zellrezeptor nicht essentiell sind, können durch Ersetzung mit einer weiteren Aminosäure, deren Aufnahme die T-Zellaktivität nicht substantiell ändert und die Bindung an das relevante MHC nicht verhindert, modifiziert werden. So kann das Peptid gemäß der Erfindung, abgesehen von der angegebenen Bedingung, jedes Peptid (wobei die Erfinder in diesen Begriff auch Oligopeptide oder Polypeptide einschließen), welches die Aminosäuresequenz oder einen Teil oder eine Variante davon enthält, wie angegeben sein.
Ferner ist es bekannt, dass MHC-Klasse-II präsentierte Peptide aus einer "Kernsequenz", welche ein bestimmtes HLA-spezifisches Aminosäuremotiv hat, und optional aus N- und/oder C-terminalen Verlängerungen, die die Funktion der Kernsequenz nicht stören (d. h. sie werden als irrelevant für die Wechselwirkung des Peptides und der T-Zelle angesehen), bestehen. Die N- und/oder C-terminalen Verlängerungen können jeweils zwischen 1 und 10 Aminosäuren lang sein. Folglich weist ein bevorzugtes Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung eine Gesamtlänge von 9 bis 30 Aminosäuren auf. Diese Peptide können entweder direkt benutzt werden, um MHC-Klasse-II-Moleküle zu beladen, oder die Sequenz kann gemäß der hier unten aufgeführten Beschreibung in Vektoren geklont werden. Da diese Peptide das Endprodukt des Prozessierens längerer Peptide innerhalb der Zelle darstellen, können auch längere Peptide verwendet werden.
Wenn ein Peptid, welches größer als etwa 12 Aminosäurereste ist, verwendet wird, um direkt an ein MHC-Molekül zu binden, so ist es bevorzugt, dass die Reste, die die Kern-HLA- Bindungsregion flankieren, solche sind, die die Fähigkeit des Peptides, spezifisch an die Bindungsfurche des MHC-Moleküls zu binden, oder das Peptid den CTLs zu präsentieren, nicht substantiell einschränken. Aber, wie schon oben angedeutet, ist zu verstehen, dass längere Peptide eingesetzt werden können, speziell wenn sie durch ein Polynuldeotid kodiert werden, da diese längeren Peptide durch geeignete Antigen-präsentierende Zellen fragmentiert werden können.
Beispiele für Peptide von MHC-Liganden, Motiven und Varianten sowie bestimmte Beispiele für N- und/oder C-terminale Verlängerungen können zum Beispiel aus der Datenbank SYFPEITHI (Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and Peptide motifs. Immunogenetics. 1999 Nov; 50(3-4): 213-9.) unter http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com/ und den dort zitierten Referenzen erhalten werden.
Als nicht einschränkende Beispiele für bestimmte Peptide für HLA-DR in der Datenbank sind K H K V Y A C E V T H Q G L S S, erhalten von der Ig kappa Kette 188-203 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr; 27(4): 1014-21); K V Q W K V D N A L Q S G N S, erhalten von der Ig kappa Kette 145-159 (Kovats et al. Eur J Immunol. 1997 Apr; 27(4): 1014-21); L P R L I A F T S E H S H F, erhalten von GAD65 270-283 (Endl et al. J Clin Invest. 1997 May 15; 99(10): 2405-15) oder F F R M V I S N P A A T H Q D I D F L I, erhalten aus GAD65 556-575 (Endl et al. J Clin Invest. 1997 May 15; 99(10): 2405-15). Des Weiteren können Peptide auch aus mutierten Sequenzen von Antigenen erhalten werden, wie es für A T G F K Q S S K A L Q R P V A S der Fall ist, erhalten aus dem bcr-abl 210 kD Fusionsprotein (ten Bosch et al. Blood. 1996 Nov 1; 88(9): 3522-7), G Y K V L V L N P S V A A T, erhalten aus HCV-1 NS3 28-41 Diepolder et al. J Urol. 1997 Aug; 71(8): 6011-9) oder F R K Q N P D I V I Q Y M D D L Y V G, erhalten aus HIV-1 (HXB2) RT 326-345 (van der Burg et al. J Urol. 1999 Jan 1; 162(1): 152-60). Alle "Anker"-Aminoäuren (siehe Friede et al., Biochim Biophys Acta. 1996 Jun 7; 1316(2): 85-101; Sette et al. J Urol. 1993 Sep 15; 151(6): 3163-70.; Hammer et al. Cell. 1993 Jul 16; 74(1): 197-203., und Hammer et al. J Exp Med. 1995 May 1; 181(5): 1847-55. Als Beispiele für HLA-DR4) wurden fett markiert, die mutmaßlichen Kernsequenzen unterstrichen.
Alle oben beschriebenen Peptide sind durch den Bergriff "Variante" der gegebenen Aminosäuresequenz umfasst.
Unter "Peptid" verstehen die Erfinder nicht nur solche Moleküle, in denen die Aminosäurenreste durch Peptidbindungen (-CO-NH-) verbunden sind, sondern auch Moleküle, in denen die Peptidbindung umgekehrt (reversed Peptide bond) ist. Solche retro-inversen Peptidomimetika können durch Methoden, die im Stand der Technik bekannt sind, hergestellt werden, zum Beispiel so, wie beschrieben in Meziere et al (1997) J. Immunol. 159, 3230-3237, hierin durch Referenz eingeschlossen. Dieser Ansatz beinhaltet die Herstellung von Pseudopeptiden, die zwar Änderungen im Rückgrat beinhaltet, aber die Orientierung der Seitenketten nicht ändert. Meziere et al (1997) zeigen, dass diese Pseudopeptide zumindest für MHC-Klasse-II und T-Helferzellantworten nützlich sein können. Retro-inverse Peptide, die NH-CO Bindungen anstelle von CO-NH Peptidbindungen besitzen, sind gegenüber der Proteolyse erheblich resistenter.
Typischerweise ist das Peptid gemäß der Erfindung ein solches, welches, wenn es in einer Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert wird, prozessiert werden kann, so dass ein Fragment produziert wird, welches in der Lage ist, an ein adäquates MHC-Molekül zu binden, und durch geeignete Zelle präsentiert werden kann und eine geeignete T-Zellantwort auslöst. Es ist zu verstehen, dass auch ein aus dem Peptid produziertes Fragment, ein Peptid gemäß der Erfindung sein kann. In geeigneter Weise enthält das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung einen Teil, der die offenbarte Aminosäuresequenz oder einen Teil oder eine Variante davon und einen weiteren Teil, welcher eine gesuchte Eigenschaft zeigt, beinhaltet. Zum Beispiel kann dieser weitere Teil ein weiteres T-Zell-Epitop beinhalten (welches sowohl aus demselben Polypeptid, wie der erste T-Zell-Epitop enthaltende Teil, stammen kann oder auch nicht) oder er beinhaltet ein Carrierprotein oder -peptid. Somit ist in einer Ausführungsform das Peptid gemäß der Erfindung ein trunkiertes humanes Protein oder ein Fusionsprotein von einem Proteinfragment und einem weiteren Polypeptidteil unter der Bedingung, dass der humane Teil eine oder mehrere erfindungsgemäße Aminosäuresequenzen beinhaltet.
In einer besonders bevorzugten Ausführungsform enthält das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung eine Aminosäuresequenz gemäß der Erfindung und zumindest ein weiteres T-Zell-Epitop, wobei dieses weitere T-Zell-Epitop in der Lage ist, die Produktion einer T-Zellantwort gegen die Tumorart, die aberrant ein tumorassoziiertes Antigen exprimiert, zu unterstützen. Somit enthalten die Peptide gemäß der vorliegenden Erfindung sogenannte "beads an a string" (Perlschnurstruktur) Polypeptide, die auch als Impfstoffe verwendet werden können.
Dem Fachmann ist es aus dem Folgenden selbstverständlich, dass die erfindungsgemäßen Peptide in einigen Anwendungen direkt verwendet werden können (d. h. sie werden nicht durch Expression eines Polynukleotides in einer Zelle des Patienten oder in einer Zelle, die dem Patienten verabreicht wurde, produziert); in solchen Anwendungen ist es bevorzugt, dass das Peptid weniger als 100 oder 50 Reste besitzt. Ein bevorzugtes Peptid weist gemäß der vorliegenden Erfindung eine Gesamtlänge von 9 bis 30 Aminosäuren auf.
Bevorzugt ist es, wenn die erfindungsgemäßen Peptide in der Lage sind, an HLA-DR zu binden. Es ist besonders bevorzugt, wenn die Peptide selektiv an HLA-DRB1·0101 binden.
Ein weiterer Aspekt ist, dass, wie beschrieben, der oben für MHC-Klasse-II-Moleküle erklärten Situation ähnlich, die beschriebenen Peptide dafür verwendet werden können, eine MHC-Klasse-I spezifische T-Zellantwort auszulösen. Ein bevorzugtes erfindungsgemäßes MHC-Klasse-I spezifisches Peptid weist eine Gesamtlänge zwischen 9 und 16, bevorzugt zwischen 9 und 12 Aminosäuren auf. Es muss verstanden werden, dass diese Peptide, analog zu MHC-Klasse-II-Peptiden, als längere Peptide (z. B. in einem Impfstoff) eingesetzt werden können. Methoden, um MHC-Klasse-I spezifische "Kernsequenzen", die ein bestimmtes HLA-spezifisches Aminosäuremotiv für HLA-Klasse-I-Moleküle besitzen, sind dem Fachmann bekannt und können, zum Beispiel, durch die Computerprogramme PAProC (http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) und SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de) vorhergesagt werden.
Das erfindungsgemäße Peptid ist in immuntherapeutischen Methoden besonders nützlich, um Zellen zu markieren und zu töten, die aberrant Polypeptide exprimieren, die die Basis für die erfindungsgemäßen Peptide bilden. Da diese spezifischen Peptide, bestehend aus den angegebenen Aminosäuresequenzen, an HLA-DR binden, ist es bevorzugt, dass die erfindungsgemäßen Peptide die Eigenschaft haben, an HLA-DR zu binden, und wenn sie so gebunden sind, der HLA-DR-Peptid Komplex, wenn er auf der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle präsentiert wird, in der Lage ist, die Produktion einer CTL auszulösen, welche eine Zelle erkennt, die aberrant ein Polypeptid exprimiert, das eine angegebene Aminosäuresequenz enthält.
In einer Ausführungsform der vorliegenden Erfindung enthält das Peptid gemäß der vorliegenden Erfindung die 80 N-terminalen Aminosäuren der HLA-DR Antigen-assoziierten unveränderlichen Kette (p33, im Folgenden „Ii"), wie sie von der NCBI, GenBank Accession-number X00497 zu erhalten ist (siehe auch unten).
Mit "aberrant exprimiert" umfassen wir die Bedeutung, dass die Polypeptide im Vergleich zu normalen Werten der Expression überexprimiert sind oder dass die Gene in dem Gewebe, aus dem der Tumor erhalten wurde, still sind, aber im Tumor exprimiert werden. Mit "überexprimiert" meinen wir, dass das Polypeptid in einem Niveau vorkommt, das mindestens 1,2 × dem Niveau in normalem Gewebe entspricht; bevorzugt mindestens 2 × und bevorzugter mindestens 5 × oder 10 × dem Niveau in normalem Gewebe entspricht.
Peptide (zumindest die, die zwischen den Aminosäureresten eine Peptidbindung besitzen) können durch den Fmoc-Polyamid-Modus der Festphasenpeptidsynthese, wie durch Lu et al (1981) J. Org. Chem. 46,3433 und den dortigen Referenzen offenbart, synthetisiert werden. Die N-amino-Gruppen werden zwischenzeitlich durch die 9-Fluorenylmethyloxycarbonyl-Schutzgruppe (Fmoc) geschützt. Wiederholte Abspaltung dieser höchst basenlabilen Schutzgruppe wird mit einer 20%igen Lösung von Piperidin in N,N-dimethylformamide erreicht. Seitenkettenfunktionalitäten können als ihre Butylether geschützt werden (im Fall von Serin Threonin und Tyrosin), Butylester (im Fall von Glutaminsäure und Aspartamsäure), Butyloxycarbonylderivat (im Fall von Lysin und Histidin), Tritylderivat (im Fall von Cystein) und 4-Methoxy-2,3,6-trimethylbenzensulphonylderivat (im Fall von Arginin). Wenn Glutamin oder Asparagin die C-terminalen Reste sind, wird die 4,4'-Dimethoxybenzhydryl-Gruppe als Schutzgruppe für die Seitenkettenfunktionalitäten verwendet. Die Festphase basiert auf einem Polydimethylacrylamid-Polymer, der aus den drei Monomeren: Dimethylacrylamid (Rückgrad-Monomer), Bisacryloylethylendiamin (cross linker, Quervernetzer) und Acryloylsarcosinmethylester (Funktionalisierungsmittel). Als abspaltbarer Linker zwischen Peptid und Harz wird ein säurelabiles 4-Hydroxymethyl-phenoxyessigsäurederivat benutzt. Alle Aminosäurederivate, mit der Ausnahme von Asparagin und Glutamin, die über eine reverse N,N-dicyclohexylcarbodiimid/1hydroxybenzotriazol vermittelte Kupplung eingesetzt werden, werden als vorgeformtes symmetrisches Anhydridderivat eingesetzt. Alle Kupplungs- und Entschützungsschritte werden mit Ninhydrin, Trinitrobenzensulfonsäure oder Isotin überwacht. Nach der Fertigstellung der Synthese werden die Peptide bei gleichzeitiger Entfernung der Schutzgruppen an den Seitenketten durch Verwendung von 95% Trifluoressigsäure, die eine 50% Mischung aus Radikalfängern enthält, vom Harz abgespalten. Die normalerweise verwendeten Radikalfänger sind Ethandithiol, Phenol, Anisol und Wasser, wobei die Wahl von der Zusammensetzung der Aminosäuren des zu synthetisierenden Peptides, abhängt. Es können weiterhin auch Kombinationen von Festphasensynthese und Methoden für die Synthese in Lösung für die Synthese von Peptiden verwendet werden (siehe z. B. Bruckdorfer T, Marder O, Albericio F. From production of Peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future. Curr Pharm Biotechnol. 2004 Feb; 5(1): 29-43 und die dort zitierten Referenzen).
Trifluoressigsäure wird durch Vakuumdestillation entfernt, das rohe Peptid wird durch anschließende Ausfällung mit Diethylether erhalten. Alle vorhandenen Radikalfänger werden durch einfache Extraktion entfernt, die nach Lyophlisierung der wässrigen Phase die rohen Peptide in radikalfängerfreier Form liefert. Die Reagenzien für die Peptidsynthese sind im Allgemeinen von Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, Großbritannien zu erhalten.
Die Aufreinigung kann durch Anwendung einer Technik oder einer Kombination mehrerer Techniken wie zum Beispiel Gel-Permeations-Chromatographie (GPC), Ionenaustauschchromatographie, hydrophobe Chromatographie (Hydrophobic Interaction Chromatography, HIC) und (normalerweise) Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie (reverse-phase high Performance liquid chromatography, HPLC) mit einem Acetonitril/Wassergradienten erfolgen.
Die Analyse der Peptide kann durch Dünnschichtchromatographie, Umkehrphasen-Hochleistungsflüssigkeitschromatographie, Aminosäureanalyse nach saurer Hydrolyse und durch Fast Atom Bombardment (FAB) massenspektrometrische Analyse sowie durch MALDI und ESI-Q-TOF massenspektrometrische Analyse erfolgen.
Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt eine Nukleinsäure (beispielsweise ein Polynukleotid), welche ein erfindungsgemäßes Peptid kodiert. Die Nukleinsäure kann DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA oder Kombinationen davon sein und sie kann oder kann keine Introns enthalten, solange sie das Peptid kodiert. Natürlich können nur Peptide, die natürlich vorkommende Aminosäurereste enthalten, die wiederum über natürliche Peptidbindungen verbunden sind, durch ein Polynukleotid kodiert werden. Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt einen Expressionsvektor, der in der Lage ist, ein Polypeptid gemäß der vorliegenden Erfindung zu exprimieren.
Eine Anzahl von Methoden wurde entwickelt, um Polynukleotide, speziell DNA, durchführbar an Vektoren zu binden, zum Beispiel durch komplementäre klebrige Enden (complementary cohesive termini). Zum Beispiel können komplementäre Homopolymer-Abschnitte an das DNA-Segment hinzugefügt werden, um in die Vektor-DNA insertiert zu werden. Der Vektor und das DNA-Segment werden dann durch Wasserstoffbrückenbindungen zwischen den komplementären homopolymerischen Enden zusammengehalten und formen so rekombinante DNA-Moleküle.
Synthetische Linker, die eine oder mehrere Restriktionsorte (restriction sites) enthalten, stellen eine weitere Methode zum Verknüpfen des DNA-Segmentes und Vektoren dar. Das DNA-Segment, welches, wie früher beschrieben, durch Abbau durch Restriktionsendonuklease generiert wurde, wird mit Bakteriophage T4 DNA Polymerase oder E. coli DNA Polymerase I, Enzymen, die die ausladenden 3'-Einzelstrang Termini mit ihren 3'-5'-exonukleolytischen Aktivitäten entfernen und fehlende 3'-Enden mit Ihren polymerisierenden Aktivitäten auffüllen, behandelt.
Die Kombination dieser Aktivitäten erzeugt deshalb stumpf endende DNA-Segmente. Die stumpf endenden Segmente werden dann mit einem großen molaren Überschuss an Linkermolekülen in der Anwesenheit eines Enzyms inkubiert, das in der Lage ist, die Ligation der stumpf endenden DNA-Moleküle zu katalysieren, wie beispielsweise Bakteriophage-T4-DNA-Ligase. So sind die Reaktionsprodukte DNA-Segmente, die polymere Linkersequenzen an ihren Enden tragen. Diese DNA-Segmente werden dann mit dem geeigneten Restriktionsenzym gespalten und an einen Experessionsvektor gebunden, der mit einem Enzym gespalten wurde, das Termini erzeugt, die mit jenen des DNA-Segments kompatibel sind.
Synthetische Linker, die eine Vielzahl von Endonukleaserestriktionsorte enthalten, sind aus einer Anzahl von Quellen einschließlich International Biotechnologies Ine, New Haven, CN, USA, kommerziell erhältlich.
Ein wünschenswerter Weg, die DNA, die die Polypeptide gemäß der Erfindung kodiert, zu modifizieren, ist es, die Polymerasekettenreaktion zu verwenden, wie sie von Saiki et al (1988) Science 239, 487-491 offenbart wurde. Diese Methode kann dazu verwendet werden, die DNA in einen geeigneten Vektor einzuführen, zum Beispiel durch gentechnische Veränderung an geeigneten Restriktionsorten (restriction sites), oder es kann dazu verwendet werden, die DNA auf andere nützliche Arten zu modifizieren, wie es im Fachgebiet bekannt ist. Bei diesem Verfahren wird die enzymatisch zu verstärkende DNA durch zwei spezifische Primer flankiert, die ihrerseits in die verstärkte DNA eingebaut werden. Die genannten spezifischen Primer können Endonukleaserestriktionserkennungsorte enthalten, die unter Verwendung von im Stand der Technik bekannten Verfahren zum Klonieren in Expressionsvektoren verwendet werden können.
Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren, RNA) wird dann in einem geeigneten Wirt exprimiert, um ein Polypeptid, enthaltend eine Verbindung gemäß der Erfindung, zu produzieren. Somit kann die DNA, die das Polypeptid, welches eine Verbindung gemäß der Erfindung darstellt, kodiert, nach bekannten Techniken verwendet werden, um, in Hinblick auf die hier enthaltene Lehre entsprechend modifiziert, einen Expressionsvektor zu konstruieren, der dann dazu verwendet wird, um eine geeignete Wirtszelle zu transformieren, welche dann dazu verwendet wird, um ein erfindungsgemäßes Polypeptid zu exprimieren und zu produzieren. Solche Techniken beinhalten die Techniken, die in den folgenden US-Patenten offenbart wurden, US Patent Nr. 4,440,859 erteilt am 3. April 1984 an Rutter et al, 4,530,901 erteilt am 23. Juli 1985 an Weissman, 4,582,800 erteilt am 15. April 1986 an Crowl, 4,677,063 erteilt am 30. Juni 1987 an Mark et al, 4,678,751 erteilt am 7. Juli 1987 an Goeddel, 4,704,362 erteilt am 3. November 1987 an Itakura et al, 4,710,463 erteilt am 1. Dezember 1987 an Murray, 4,757,006 erteilt am 12. Juli 1988 an Toole, Jr. et al, 4,766,075 erteilt am 23. August 1988 an Goeddel et al und 4,810,648 erteilt am 7. März 1989 an Stalker, die hiermit alle durch Referenz eingeschlossen sind.
Die DNA (oder im Fall von retroviralen Vektoren, RNA), die das Polypeptid, welches eine Verbindung gemäß der Erfindung darstellt, kodiert, kann an eine Vielzahl verschiedener anderer DNA-Sequenzen gebunden werden, um in einen geeigneten Wirt eingeführt zu werden. Die Begleit-DNA ist von Art des Wirtes, der Art der Einführung der DNA in den Wirt und, ob episomale Erhaltung oder Integration erwünscht ist, abhängig.
Im Allgemeinen wird die DNA in einen Expressionsvektor, wie einem Plasmid in der richtigen Orientierung und dem korrekten Leserahmen für die Expression insertiert. Wenn notwendig, kann die DNA an eine geeignete nukleotidische Transkriptions- und Translationsregulierungssequenz gebunden werden, die durch den gewünschten Wirt erkannt wird, auch wenn solche Regulierungen im Allgemeinen in dem Expressionsvektor vorhanden sind. Der Vektor wird dann mit Standardtechniken in den Wirt eingeführt. Im Allgemeinen werden nicht alle Wirte durch den Vektor transformiert. Somit ist es notwendig, die transformierten Wirtzellen zu selektieren. Eine Selektionstechnik beinhaltet den Einbau einer DNA-Sequenz, die die notwendigen regulatorischen Elemente enthält und die das genetische Merkmal in der transformierten Zelle, wie zum Beispiel Antibiotikaresistenz, kodiert, in den Expressionsvektor.
Alternativ kann das Gen für ein ausgesuchtes genetisches Merkmal ein anderer Vektor sein, der für die Co-Transformation der gewünschten Wirtszelle verwendet wird.
Wirtszellen, die durch die erfindungsgemäße rekombinante DNA transformiert wurden, werden dann für eine ausreichende Zeit und unter geeigneten Bedingungen, die den Fachleuten auf dem Gebiet bekannt sind, in Hinblick auf die Lehre der vorliegenden Offenbarung kultiviert, um die Expression des Polypeptides zu ermöglichen, welches dann gewonnen werden kann.
Viele Expressionssysteme sind bekannt, einschließlich Bacteria (z. B. E. coli und Bacillus subtilis), Hefen (z. B. Saccharomyces cerevisiae), Fadenpilze (z. B. Aspergillus), Pflanzenzellen, Tierzellen und Insektenzellen. Bevorzugt ist das System RCC- oder Awells-Zellen.
Ein Promoter ist ein Expressionssteuerelement, welches aus einer DNA-Sequenz gebildet wird, die die Bindung von RNA-Polymerase und die Durchführung der Transkription erlaubt. Promotersequenzen, die mit exemplarischen bakteriellen Wirten kompatibel sind, werden typischerweise als Plasmidvektoren zur Verfügung gestellt, die geeignete Restriktionsorte für die Insertion eines erfindungsgemäßen DNA-Segmentes enthalten. Typische prokaryotische Vektorplasmide sind pUC18, pUC19, pBR322 und pBR329, zu erhalten über Biorad Laboratories, (Richmond, CA, USA) und pTrc99A und pKK223-3, zu erhalten über Pharmacia, Piscataway, NJ, USA.
Ein typisches Säugetierzellvektorplasmid ist pSVL, zu erhalten über Pharmacia, Piscataway, NJ, USA. Dieser Vektor benutzt den SV40 Late Promoter, um die Expression der klonierten Gene anzutreiben, wobei das höchste Niveau der Expression in Antigen-produzierenden T-Zellen, wie zum Beispiel COS-1 Zellen, gefunden wird. Ein Beispiel für einen induzierbaren Säugetierexpressionsvektor ist pMSG, welcher auch über Pharmacia erhältlich ist. Dieser Vektor benutzt den Glukokortikoid-induzierten Promoter des Long-Terminal-Repeats des Mausbrustkrebsviruses, um die Expression des klonierten Genes anzutreiben. Nützliche Hefeplasmidvektoren sind pRS403-406 und pRS413-416 und sind grundsätzlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich. Die Plasmide pRS403, pRS404, pRS405 und pRS406 sind Hefeintegrierende Plasmide (Yeast Integrating Plasmids = Ylps) und schließen die Hefeselektierbaren Marker HIS3, TRP1, LEU2 und URA3 ein. Die Plasmide pRS413-416 sind Hefezentromerplasmide (Yeast Centromere Plasmids = YCps). Andere Vektoren und Expressionssysteme sind für den Gebrauch mit einer Vielzahl von Wirtszellen aus dem Stand der Technik gut bekannt.
Die vorliegende Erfindung bezieht sich weiterhin auf eine mit einem Polynuldeotidvektorkonstrukt gemäß der vorliegenden Erfindung transformierte Wirtszelle. Die Wirtszelle kann entweder prokaryotisch oder eukaryotisch sein. Bakterienzellen können unter bestimmten Umständen die bevorzugten prokaryotischen Wirtszellen sein und sind typischerweise ein Stamm von E. coli, wie zum Beispiel der E. Coli Stamm DH5, erhältlich über Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, USA, und RR1, erhältlich über die American Type Culture Collection (ATCC) aus Rockville, MD, USA (No ATCC 31343). Bevorzugte eukaryotische Wirtszellen beinhalten Hefe-, Insekten- und Säugetierzellen, bevorzugt Wirbeltierzellen, wie zum Beispiel die der Maus, Ratte, Affe oder menschliche Fibroblasten- und Nierenzelllinien. Hefewirtszellen schließen pRS403-406 und pRS413-416 ein, die grundsätzlich von Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, USA, erhältlich sind. Bevorzugte Säugetierzellen enthalten CHO-Zellen (Eierstockzellen des Chinesischen Hamsters), zu erhalten über das ATCC als CCL61, NIH Embryozellen der Swiss-Mause NIH/3T3, zu erhalten über das ATCC als CRL 1658, von Affennieren erhaltene COS-1 Zellen, zu erhalten über das ATCC als CRL 1650, und 293-Zellen, welche embryonale menschliche Nierenzellen sind. Bevorzugte Insektenzellen sind Sf9-Zellen, die mit Expressionsvektoren des Baculovirus transfiziert werden können.
Die Transformation einer geeigneten Wirtszelle mit einem erfindungsgemäßen DNA-Konstrukt wird typischerweise durch sehr gut bekannte Methoden, die üblicherweise von der Art des verwendeten Vektors abhängen, erreicht werden. In Bezug auf die Transformation von prokaryotischen Wirtszellen siehe zum Beispiel Cohen et al (1972) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 69, 2110 und Sambrook et al (1989) Molecular Cloning, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor Laboratory, Cold Spring Harbor, NY. Die Transformation von Hefezellen sind in Sherman et al (1986) Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, beschrieben. Das Verfahren nach Beggs (1978) Nature 275, 104-109 ist ebenfalls nützlich. In Bezug auf Wirbeltierzellen gibt es einige für die Transfektion solcher Zellen nützliche Reagenzien, wie zum Beispiel Kalziumphosphat und DEAE-dextran oder Liposomformulierungen, die über Stratagene Cloning Systems oder Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, USA zu erhalten sind. Elektroporation ist auch nützlich, um Zellen zu transformieren und/oder zu transfizieren, und ist im Stand der Technik für die Transformation von Hefezellen, Bakterienzellen, Insektenzellen und Wirbeltierzellen gut bekannt.
Erfolgreich transformierte Zellen, d. h. Zellen, die ein DNA-Konstrukt der vorliegenden Erfindung enthalten, können durch wohlbekannte Techniken identifiziert werden. Zum Beispiel können Zellen, die aus der Einführung eines Expressionskonstrukts resultieren, gezogen werden, um das erfindungsgemäße Polypeptid zu produzieren. Die Zellen können geerntet und lysiert werden und ihr DNA-Inhalt kann unter Anwendung eines Verfahrens wie jenes, das durch Southern (1975) J. Mol. Biol, 98, 503 oder Bereut et al (1985) Biotech. 3, 208 beschrieben wird, auf die Anwesenheit der DNA untersucht werden. Alternativ kann die Anwesenheit des Proteins in dem Überstand unter Verwendung von Antikörpern, wie unten beschrieben, detektiert werden.
Zusätzlich zur direkten Suche nach der Anwesenheit von rekombinanter DNA, kann eine erfolgreiche Transformation auch durch gut bekannte immunologische Methoden nachgewiesen werden, wenn die rekombinante DNA in der Lage ist, die Expression des Proteins zu steuern. Zum Beispiel produzieren Zellen, die mit einem Expressionsvektor transformiert wurden, Proteine, die eine geeignete Antigenizität zeigen. Proben von Zellen, von denen erwartet wird, dass sie transformiert wurden, werden geerntet und auf das Protein unter Benutzung geeigneter Antikörper getestet. Somit betrachtet die Erfindung zusätzlich zu den transformierten Wirtszellen selbst auch eine Kultur jener Zellen, vorzugsweise eine monoklonale (klonal homogene) Kultur, oder eine Kultur, die von einer monoklonalen Kultur erhalten wurde, in einem Nährmedium.
Dem Fachmann ist es selbstverständlich, dass bestimmte erfindungsgemäße Wirtszellen, wie zum Beispiel Bakterien, Hefe und Insektenzellen, für die Herstellung von erfindungsgemäßen Peptiden nützlich sind. Jedoch können auch andere Wirtszellen für bestimmte therapeutische Verfahren nützlich sein. Zum Beispiel können Antigen-präsentierende Zellen, wie zum Beispiel dendritische Zellen, nützlich dazu benutzt werden, die erfindungsgemäßen Peptide so zu exprimieren, dass sie in geeignete MHC-Moleküle beladen werden.
Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt ein Verfahren, um ein Peptid für eine intravenöse Infusion (i.v.), eine subkutane Injektion (s.c.), intradermale Injektion (i.d.), intraperitoneale Injektion (i.p.) oder intramuskuläre Injektion (i.m.) zu produzieren. Bevorzugte Arten, die Peptide zu injizieren, sind s.c., i.d., i.p., i.m., und i.v. Dosen zwischen 1 und 500 mg der Peptide oder der DNA können verabreicht werden.
Die Erfindung betrifft weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen tumorassoziierten Peptides, einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors in der Medizin.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, das Verfahren umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Peptides oder einer effektiven Menge eines Polynukleotides oder eines Expressionsvektors, die besagtes Peptid kodieren, an einen Patienten, wobei die Menge des besagten Peptides oder des besagten Polynukleotides oder des Expressionsvektors ausreicht, um eine anti-Zielzellen-Immunantwort in besagtem Patienten auszulösen. Die Zielzelle ist typischerweise eine Tumor- oder Krebszelle.
Das Peptid oder die Peptid kodierende Nukleinsäure stellt einen Tumor- oder Krebsimpfstoff dar. Es kann dem Patienten direkt, in das betroffene Organ oder systemisch verabreicht werden oder auch ex vivo an Zellen angewandt werden, die vom Patienten oder einer menschlichen Zelllinie abstammen und dem Patienten anschließend verabreicht werden, oder es wird in vitro benutzt, um eine Subpopulation der Immunzellen, die aus dem Patienten gewonnen wurden, auszuwählen, die dem Patienten dann zurück verabreicht werden. Wenn die Nukleinsäure den Zellen in vitro verabreicht wird, kann es für die Zellen nützlich sein, transfiziert zu sein, damit sie immunstimulierende Zytokine co-exprimieren, wie zum Beispiel Interleukin-2. Das Peptid kann im Wesentlichen rein sein oder es wird mit einem immunstimulierenden Adjuvans wie Detox kombiniert oder es wird in Kombination mit immunstimulierenden Zytokinen verwendet oder es wird mit einem geeigneten Abgabesystem, wie zum Beispiel Liposomen, eingesetzt. Das Peptid kann auch an einen geeigneten Träger befestigt werden, beispielsweise an Napfschnecken-Hämozyanin (KLH) oder Mannan (siehe WO 95/18145 und Longenecker et al (1993) Ann. NY Acad. Sci. 690, 276-291). Das Peptid kann auch markiert sein oder ein Fusionsprotein oder ein Hybridmolekül sein. Von den Peptiden, deren Sequenz in der vorliegenden Erfindung angegeben ist, wird erwartet, dass sie CD4 CTL stimulieren. Jedoch ist die Stimulation in Anwesenheit von Hilfe durch CD4-positive T-Zellen effektiver. Somit stellt der Fusionspartner oder Teile eines geeigneten Hybridmoleküls Epitope, die CD4-positive T-Zellen stimulieren, bereit. CD4-positive stimulierende Epitope sind im Stand der Technik wohlbekannt und beinhalten diejenigen, die im Tetanus-Toxoid gefunden wurden. Das Polynukleotid kann im Wesentlichen rein oder in einem geeigneten Vektor oder Abgabesystem enthalten sein.
Geeignete Vektoren und Zufuhrsysteme beinhalten virale, solche Systeme basieren auf Adenvirus, Vacciniavirus, Retroviren, Herpesvirus, Adeno-assoziiertem Virus oder Hybriden, die Elemente von mehr als einem Virus enthalten. Nicht virale Zufuhrsysteme beinhalten kationische Lipide und kationische Polymere, wie sie im Stand der Technik für die Beförderung von DNA bekannt sind. Physikalische Verabreichung, wie zum Beispiel durch eine "Gene-gun", kann auch verwendet werden. Das Peptid oder Peptide, die durch eine Nukleinsäure kodiert sind, können ein Fusionsprotein zum Beispiel mit einem Epitop, das CD4-positive T-Zellen stimuliert, sein.
Das Peptid für den Gebrauch in einem Krebsimpfstoff kann jedes geeignete Peptid sein. Speziell kann es ein geeignetes 9-mer Peptid oder ein geeignetes 7-mer oder 8-mer oder 10-mer oder 11-mer Peptid oder 12-mer sein. Längere Peptide können auch geeignet sein, aber 9-mer oder 10-mer Peptide, wie in der angehängten Tabelle 1 beschrieben, sind bevorzugt.
Geeigneterweise ist jede Nukleinsäure, die dem Patienten verabreicht wird, steril und frei von Pyrogen. Nackte DNA kann intramuskulär oder intradermal oder subkutan gegeben werden. Die Peptide können intramuskulär, intradermal, intraperitoneal, intravenös oder subkutan (siehe auch oben betreffend die Methode zur Herstellung eines Peptides) verabreicht werden. Bevorzugt werden die Peptide als aktive pharmazeutische Komponenten mit einem Adjuvans gegeben, wie zum Beispiel IL-2, IL-12, GM-CSF, nicht vollständiges Freundsches Adjuvans, vollständiges Freundsches Adjuvans oder liposomale Formulierungen. Die am meisten bevorzugten Adjuantien können zum Beispiel in Brinkman JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WM. Peptide-based vaccines for cancer immunotherapy. Expert Opin Biol Ther. 2004 Feb; 4(2): 181-98 gefunden werden.
Die Impfung führt zu CTL-Antworten, die durch professionelle Antigen-präsentiende Zellen stimuliert werden; wenn die CTLs geprimt sind, kann es einen Vorteil einer verstärkten MHC-Expression in Tumorzellen geben.
Es kann auch nützlich sein, mit dem Impfstoff auf spezifische Zellenpopulationen, zum Beispiel Antigen-präsentierende Zellen, entweder durch die Stelle der Injektion, der Benutzung von Targeting-Vektoren und Zufuhrsystemen oder selektive Aufreinigung einer solchen Zellpopulation des Patienten und ex vivo Zugabe des Peptides oder der Nukleinsäure, zu zielen (z. B. können dendritische Zellen wie in Zhou et al (1995) Blood 86, 3295-3301; Roth et al (1996) Scand. J. Immunology 43, 646-651 beschrieben, sortiert werden). Zum Beispiel können die Targeting-Vektoren einen Gewebe- oder tumorspezifischen Promoter enthalten, der die Expression des Antigens an eine geeignete Stelle leitet.
Die Erfindung betrifft weiterhin einen Impfstoff, der wirksam gegen Krebs oder Krebs- oder Tumorzellen ist und eine ausreichende Menge eines erfindungsgemäßen Peptides oder einer Nukleinsäure, die ein solches Peptid kodiert, umfasst. Es ist weiterhin bevorzugt, dass der Impfstoff ein Nukleinsäureimpfstoff ist. Es ist bekannt, dass die Impfung mit einem Nukleinsäureimpfstoff, wie zum Beispiel einem DNA-Impfstoff, der ein Polypeptid kodiert, zu einer T-Zellantwort führt. Am meisten ist ein Impfstoff bevorzugt, der ein (synthetisches) Peptid oder Peptide (d. h. entweder allein oder in Kombinationen von 1, 2, 3, 4, 5 oder 6, 11 oder noch mehr Peptiden, siehe auch weiter unten) umfasst.
Geeigneterweise umfasst der Nukleinsäureimpfstoff ein geeignetes Behilfsmittel zur Nukleinsäurezufuhr. Die Nukleinsäure, bevorzugt DNA, kann nackt sein (d. h. sie wird mit substantiell keinen anderen Komponenten verabreicht) oder sie kann in einem Liposom oder als ein Teil eines viralen Vektorzufuhrsystems verabreicht werden.
Es wird angenommen, dass die Aufnahme der Nukleinsäure und die Expression des kodierten Polypeptides durch dendritische Zellen der Mechanismus des Primings der Immunantwort sein kann; jedoch können dendritische Zellen nicht transfiziert werden, sind aber immer noch wichtig, da sie in der Lage sind, das exprimierte Peptid von transfizierten Zellen im Gewebe aufzunehmen.
Es ist bevorzugt, wenn der Impfstoff, wie zum Beispiel ein DNA-Impfstoff, in einen Muskel verabreicht wird. Es ist weiterhin bevorzugt, wenn der Impfstoff in die Haut verabreicht wird. Der Nukleinsäureimpfstoff kann ohne Adjuvans verabreicht werden. Der Nukleinsäureimpfstoff kann auch mit einem Adjuvans wie BCG oder Alum verabreicht werden. Andere geeignete Adjuvantien beinhalten Aquila's QS21 Stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), welches von Saponin abstammt, Extrakte aus Mykobakterien und synthetische bakterielle Imitationen der Zellwand und urheberrechtlich geschützte Adjuvantien wie Ribi's Detox. Quil A, ein anderes von Saponin abgeleitetes Adjuvans, kann auch verwendet werden (Superfos, Dänemark). Es ist bevorzugt, wenn der Nukleinsäureimpfstoff ohne Adjuvans verabreicht wird. Andere Adjuvantien wie Freund's können auch nützlich sein. Es kann nützlich sein, das Peptid an Napfschnecken-Hämozyanin befestigt zu geben, bevorzugt ebenfalls mit einem Adjuvans.
Polynukleotid-vermittelte Immunisierungstherapie von Krebs ist beschrieben in Conry et al (1996) Seminars in Oncology 23, 135-147; Condon et al (1996) Nature Medicine 2, 1122-1127; Gong et al (1997) Nature Medicine 3, 558-561; Zhai et al (1996) J. Immunol. 156, 700-710; Graham et al (1996) Int J. Cancer 65, 664-670; und Burchell et al (1996) pp 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo et al (eds), John Libbey Eurotext, die hiermit alle durch Referenz eingeschlossen werden.
Die Erfindung betrifft außerdem weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptides oder eines Polynukleotides oder eines Expressionsvektors, die ein solches Peptid kodieren, in der Herstellung eines Medikamentes zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren.
Die Erfindung betrifft außerdem weiterhin die Verwendung eines erfindungsgemäßen Peptides oder eines Polynukleotides oder eines Expressionsvektors, die ein solches Peptid kodieren, in der Herstellung eines Medikamentes zur Induzierung einer Immunantwort, insbesondere einer zellulären Immunantwort, noch spezieller einer T-Zell-vermittelten Immunantwort gegen Zellen von soliden Tumoren, wobei die Zellen ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplexes (MHC) Klasse-II auf ihrer Oberfläche exprimieren und ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz präsentieren. Überraschenderweise wurde im Kontext der vorliegenden Erfindung gefunden, dass Tumorzellen von soliden Tumoren im Gegensatz zu gesunden Zellen desselben Gewebes an ihrer Oberfläche menschliche HLA-Klasse-II-Moleküle exprimieren.
Ein weiterer Aspekt der Erfindung betrifft ein Verfahren zur Produktion aktivierter zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL) in vivo oder in vitro, das Verfahren umfasst das für eine ausreichende lange Zeit in vitro in Kontakt bringen von CTL mit Antigen-beladenen menschlichen Klasse-II-MHC-Molekülen, exprimiert an der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle, um besagte CTL in einer Antigen-spezifischen Art und Weise zu aktivieren, wobei das Antigen ein erfindungsgemäßes Peptid ist.
Geeigneterweise sind die CTLs CD4-positive Helferzellen, bevorzugt des T_H1-Types. Die MHC-Klasse-II-Moleküle können an der Oberfläche von jeder geeigneten Zelle exprimiert werden und es ist bevorzugt, wenn Zelle eine solche ist, die auf natürliche Weise keine MHC-Klasse-II-Moleküle exprimiert (in diesem Fall wird die Zelle transfiziert, um ein solches Molekül zu exprimieren) oder, wenn es dies tut, ist sie in den Antigenprozessierungs- oder Antigenpräsentierenden Signalwegen fehlerhaft. Auf diese Weise ist es für die Zelle, die die MHC-Klasse-II-Moleküle exprimiert, möglich, substantiell komplett mit einem ausgewählten Peptidantigen geprimt zu werden, bevor die CTLs aktiviert werden.
Die Antigen-präsentierende Zelle (oder Stimulatorzellen) haben typischerweise ein MHC-Klasse-II-Molekül auf ihrer Oberfläche und ist bevorzugt nicht selber in der Lage, besagtes MHC-Klasse-II-Molekül mit dem ausgewählten Antigen zu beladen. Wie unten detailreicher beschrieben wird, kann das MHC-Klasse-II-Molekül einfach mit dem ausgewählten Antigen in vitro beladen werden.
Bevorzugt fehlt der Säugetierzelle oder sie besitzt eine reduzierte Funktion der Peptid-Transporter TAP. Geeignete Zellen, denen TAP Peptid-Transporter fehlt, beinhalten T2, RMA-S und Drosophila-Zellen. TAP ist der mit der Antigenprozessierung assoziierte Transporter.
Die menschliche Peptid-ladungsdefiziente Zelllinie T2 ist von der American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, USA mit der Katalognummer CRL 1992 erhältlich; die Drosophila-Zelllinie Schneider Line 2 ist von der ATCC mit der Katalognummer CRL 19863 erhältlich; die Maus RMA-S Zelllinie ist in Karre und Ljunggren (1985) J. Exp. Med. 162,1745 beschrieben.
Geeigneterweise exprimiert besagte Wirtszelle vor der Transfektion substantiell keine MHC-Klasse-I-Moleküle. Es ist auch bevorzugt, wenn eine Stimulatorzelle ein Molekül, das für die Kostimulation von T-Zellen wichtig ist, wie eines der folgenden B7.1, B7.2, ICAM-1 und LFA 3, exprimiert.
Die Nukleotidsequenz zahlreicher MHC-Klasse-II-Moleküle und der Kostimulatormoleküle sind öffentlich über die GenBank und EMBL-Datenbanken erhältlich.
In einer weiteren Ausführungsform können auch Kombinationen von HLA-Molekülen verwendet werden, wie zum Beispiel MHC-Klasse-II-Moleküle wie sie hier in Tab. A und B beschrieben sind. Die Verwendung von rekombinanten polyepitopen Impfstoffen für die Zufuhr von multiplen CD8⁺ CTL-Epitopen ist in Thomson et al (1996) J. Immunol. 157, 822-826 und WO 96/03144 beschrieben, die hiermit beide durch Referenz eingeschlossen werden. Im Zusammenhang mit der vorliegenden Erfindung kann es wünschenswert sein, in einem einzigen Impfstoff ein Peptid (oder eine Peptid-kodierende Nukleinsäure), wobei das Peptid in beliebiger Reihenfolge eine Aminosäuresequenz gemäß der vorliegenden Erfindung und ein weiteres CD8⁺ T-Zell stimulierendes Epitop enthält, zu vereinen. Ein solcher Impfstoff wäre besonders für die Behandlung von Krebs nützlich. Solche "beads an a string" (Perlschnurstruktur) Impfstoffe sind gewöhnlich DNA-Impfstoffe. Das gleichzeitige Triggern einer MHC-Klasse-II-abhängigen Immunantwort zusammen mit einer MHC-Klasse-I-abhängigen Immunantwort hat den Vorteil, dass es zu einer lokalen TH₁-ähnlichen T-Zell-Reaktion von CD4-positiven T-Zellen kommt, wobei die MHC-Klasse-I-abhängigen CD8-positiven T-Zellen unterstützt werden.
Verschiedene andere Methoden können zur Erzeugung von CTLs in vitro verwendet. Zum Beispiel die Methoden, die in Peoples et al (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 92, 432-436 beschrieben sind, und Kawakami et al (1992) J. Immunol. 148, 638643 benutzen autologe tumorinfiltrierende Lymphozyten für die Erzeugung von CTLs. Plebanski et al (1995) Eur. J. Immunol. 25, 1783-1787 benutzen autologe periphere Blutlymphozyten (PLBs) für die Erzeugung von CTLs. Jochmus et al (1997) J. Gen. Virol. 78, 1689-1695 beschreiben die Erzeugung von autologen CTLs durch Pulsen von dendritischen Zellen mit einem Peptid oder einem Polypeptid oder über eine Infektion mit einem rekombinanten Virus. Hill et al (1995) J. Exp. Med. 181, 2221-2228 and Jerome et al (1993) J. Immunol. 151, 1654-1662 benutzen B-Zellen für die Erzeugung von CTLs. Des Weiteren können mit einem Peptid oder Polypeptid gepulste Makrophagen oder mit einem rekombinanten Virus infizierte Makrophagen für die Erzeugung von CTLs benutzt werden. S. Walter et al. (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded an calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. J Immunol. 2003 Nov 15; 171(10): 4974-8) beschreiben das in vitro Priming von T-Zellen durch künstliche Antigen-präsentierende Zellen, was auch ein geeigneter Weg zur Erzeugung von T-Zellen gegen ein bestimmtes Peptid ist.
Allogene Zellen können auch für die Erzeugung von CTLs verwendet werden und diese Methode ist im Detail in der WO 97/26328 beschrieben, die hiermit durch Referenz eingeschlossen wird. Zum Beispiel können, zusätzlich zu Drosophila-Zellen und T2-Zellen, andere Zellen verwendet werden, wie zum Beispiel CHO-Zellen, mit Baculovirus infizierte Insektenzellen, Bakterien, Hefe und Vaccinia-infizierte Zielzellen, um Antigene zu präsentieren. Weiterhin können auch Pflanzenviren benutzt werden (siehe z. B. Porta et al (1994) Virology 202, 449-955, welche die Entwicklung des Cowpea Mosaic Virus' als ein System für die Präsentation von fremden Peptiden mit hohen Ausbeuten beschreiben.
Die aktivierten CTL, die gegen die erfindungsgemäßen Peptide gerichtet sind, sind für die Therapie nützlich. Somit betrifft ein weiterer Aspekt der Erfindung aktivierte CTLs, die nach den vorher beschriebenen erfindungsgemäßen Methoden zu erhalten sind.
Die Erfindung betrifft außerdem weiterhin aktivierte CTLs, die selektiv eine Zelle erkennen, die aberrant ein Polypeptid, umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, exprimieren. Bevorzugt erkennt die CTL besagte Zelle durch interagieren mit dem HLA/Peptid-Komplex (z. B. durch binden). Die CTLs sind in einem Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten nützlich, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid, umfassend eine erfindungsgemäße 3e exprimieren, wobei dem Patienten eine effektive Menge aktivierter CTLs verabreicht wird. Die CTLs, die dem Patienten verabreicht werden, können von dem Patienten erhalten werden und, wie oben beschrieben, aktiviert werden (d. h. sie sind autologe CTLs). Alternativ werden die CTLs nicht von dem Patienten, sondern von einem anderen Individuum erhalten. Natürlich ist es bevorzugt, dass es sich hierbei um ein gesundes Individuum handelt. Mit "gesundem Individuum" meinen die Erfinder, dass das Individuum im Allgemeinen bei guter Gesundheit ist, bevorzugt ein kompetentes Immunsystem besitzt und, weiter bevorzugt, unter keiner Krankheit leidet, auf die einfach getestet und die einfach entdeckt werden können.
Die aktivierten CTLs exprimieren einen T-Zell-Rezeptor (TCR), der an der Erkennung der Zellen beteiligt ist, die aberrant das Polypeptid exprimieren. Es ist nützlich, wenn die cDNA, die den TCR kodiert, von einer aktivierten CTL geklont wird und in eine weitere CTL für die Expression überführt wird.
In vivo können die Zielzellen für die CD4-positiven CTLs gemäß der vorliegenden Erfindung Zellen eines Tumors (die manchmal MHC-Klasse-II exprimieren) und/oder Stromalzellen in der Umgebung des Tumors (Tumorzellen) (die manchmal auch MHC-Klasse-II exprimieren) sein.
Die TCRs der CTL-Klone der Erfindung, spezifisch für die erfindungsgemäßen Peptide, sind geklont. Die Benutzung der TCR in den CTL-Klonen wird durch die Verwendung von (i) TCR variabler regionspezifischer monoklonaler Antikörper und (ii) RT PCR mit spezifischen Primern für die Va und Vp Genfamilien bestimmt. Eine cDNA-Bibliothek wird aus Poly-A mRNA, die aus den CTL Klonen extrahiert wurde, hergestellt. Es werden für den C-terminalen Anteil der TCR a und der P-Kette und den N-terminalen Anteil der identifizierten Va und P-Segmente spezifische Primer benutzt. Die komplette cDNA für den TCR a und die P-Kette wird mit "High Fidelity DNA"-Polymerase verstärkt und die verstärkten Produkte werden in einen geeigneten Klonvektor geklont. Die geklonten a und P-Kettengene können in einen Einzelketten-TCR durch die von Chung et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658 beschriebene Methode zusammengeführt werden. In diesem Einzelkettenkonstrukt folgt auf das VaJ-Segment das V DJ-Segment, gefolgt durch das Cp-Segment, gefolgt durch das transmembrane und zytoplasmatische Segment der CD3-Kette. Der Einzellketten-TCR wird dann in einen retroviralen Expressionsvektor insertiert (eine Gruppe von Vektoren kann basierend auf ihrer Fähigkeit, reife menschliche CD8-positive T-Lymphozyten zu infizieren und die Genexpression zu vermitteln, verwendet werden: Das retrovirale Vektorsystem Kat ist eine bevorzugte Möglichkeit (siehe Finer et al (1994) Blood 83, 43). Hohe Titer amphotroper Retroviren werden verwendet, um aufgereinigte CD8-positive oder CD4-positive T-Lymphozyten, die aus dem peripherem Blut von Tumorpatienten gewonnen wurden, zu infizieren (einem durch Roberts et al (1994) Blood 84, 2878-2889 veröffentlichten Protokoll folgend, welches hiermit durch Referenz eingeschlossen wird). Anti-CD3-Antikörper werden benutzt, um die Proliferation von aufgereinigten CD8⁺ T-Zellen, welche retrovirale Integration und stabile Expression von Einzelketten-TCRs erleichtern, zu triggern. Die Effizienz der retroviralen Transduktion wird durch Anfärbung von infizierten CD8⁺ T-Zellen mit Antikörpern, die für den Einzelketten-TCR spezifisch sind, bestimmt. In vitro Analyse von transduzierten CD8-positiven T-Zellen begründet, dass sie dasselbe spezifische Töten zeigen, wie es bei den Allo-beschränkten CTL-Klonen, von denen die TCR-Ketten ursprünglich geklont wurden, beobachtet wird. Populationen von transduzierten CD8-positiven T-Zellen mit einer erwarteten Spezifität können für eine adoptive Immunotherapie von Tumorpatienten verwendet werden. Patienten können mit etwa 10⁸ bis zu 10¹¹ autologen transduzierten CTLs behandelt werden. Analog zu CD8-positiven können transduzierte CD4-positive T-Helferzellen, die verwandte Konstrukte tragen, generiert werden.
Andere geeignete Systeme für die Einführung von Genen in CTLs sind in Moritz et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 4318-4322 beschrieben, hiermit durch Referenz eingeschlossen. Auch Eshhar et al (1993) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 90, 720-724 und Hwu et al (1993) J. Exp. Med. 178, 361-366 beschreiben die Transfektion von CTLs. Somit betrifft die Erfindung außer dem einen TCR, welcher eine Zelle erkennt, die aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimiert, wobei der TCR aus den aktivierten CTLs erhalten werden kann.
Zusätzlich zu dem TCR sind funktionell äquivalente Moleküle zu dem TCR in der Erfindung beinhaltet. Diese beinhalten jegliches Molekül, welches zu TCR funktionell äquivalent ist, welches dieselbe Funktion wie ein TCR ausführen kann. Insbesondere beinhalten solche Moleküle genetisch konstruierte Drei-Domänen-Einzelketten-TCRs, wie sie nach der von Chung et al (1994) Proc. Natl. Acad. Sci. USA 91, 12654-12658 beschriebenen Methode hergestellt wurden, welche hiermit durch Referenz eingeschlossen wird und oben beschrieben ist. Die Erfindung betrifft weiterhin ein Polynukleotid, welches den TCR oder ein funktionell äquivalentes Molekül kodiert und einen Expressionsvektor, der den TCR oder ein dazu funktionell äquivalentes Molekül kodiert. Expressionsvektoren, die für die Expression des erfindungsgemäßen TCRs geeignet sind, beinhalten die oben Beschriebenen in Bezug auf die Expression der erfindungsgemäßen Peptide.
Es ist allerdings bevorzugt, dass die Expressionsvektoren diejenigen sind, die in der Lage sind, den TCR in einer der CTL folgenden Transfektion zu exprimieren.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (1) Erhalten der CTLs von einem Patienten; (2) Einführung eines Polynukleotides, welches den TCR oder ein funktionell äquivalentes Molekül, wie oben definiert, kodiert, in die genannten Zellen; und (3) die Einführung der in Schritt (2) erzeugten Zellen in den Patienten.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, wie in dem ersten, zweiten oder dritten Aspekt der Erfindung definiert, das Verfahren beinhaltet die folgenden Schritte: (1) Erhalten der Antigen-präsentierenden Zellen, wie zum Beispiel dendritischer Zellen, aus einem Patienten; (2) Kontaktierung der besagten Antigenpräsentierenden Zellen mit einem Peptid, wie in dem ersten, zweiten oder dritten Aspekt der Er findung definiert, oder mit einem Polynukleotid, das ein solches Peptid kodiert, ex vivo; und (3) Zurückführung der so behandelten Antigen-präsentierenden Zellen in den Patienten.
Bevorzugt sind die Antigen-präsentierenden Zellen dendritische Zellen. Geeigneterweise sind die dendritischen Zellen autologe dendritische Zellen, welche mit einem antigenen Peptid gepulst wurden. Das antigene Peptid kann jedes geeignete antigene Peptid sein, welches zu der Auslösung einer adäquaten T-Zell-Antwort führt. Eine T-Zell-Therapie, die autologe dendritische Zellen, die mit einem Peptid aus einem tumorassoziierten Antigen gepulst wurden, verwendet, ist in Murphy et al (1996) The Prostate 29, 371-380 and Tjua et al (1997) The Prostate 32, 272-278 offenbart.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Antigen-präsentierenden Zellen, wie zum Beispiel dendritische Zellen, mit einem Polynukleotid, welches ein erfindungsgemäßes Peptid kodiert, in Kontakt gebracht. Das Polynukleotid kann jedes geeignete Polynukleotid sein und es ist bevorzugt, dass es in der Lage ist, die dendritischen Zellen zu transduzieren, was zu der Präsentation eines Peptides und zur Induktion von Immunität führt.
Geeigneterweise kann das Polynukleotid in einem viralen Polynukleotid oder einem Virus beinhaltet sein. Zum Beispiel konnte gezeigt werden, dass Adenvirus-transduzierte dendritische Zellen eine Antigen-spezifische Antitumorimmunität in Bezug auf MUC1 induzieren (siehe Gong et al (1997) Gene Ther. 4, 1023-1028). In ähnlicher Weise können auf den Adenvirus basierende Systeme benutzt werden (siehe z. B. Wan et al (1997) Hum. Gene Ther. 8, 1355-1363); retrovirale Systeme können verwendet werden (Specht et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1213-1221 und Szabolcs et al (1997). Blutpartikel-vermittelter Transfer zu dendritischen Zellen kann auch verwendet werden (Tuting et al (1997) Eur. J. Immunol. 27, 2702-2707); und auch RNA kann verwendet werden (Ashley et al (1997) J. Exp. Med. 186, 1177-1182).
Es ist zu verstehen, dass es in Bezug auf die Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten besonders bevorzugt ist, dass die Zielzellen Krebszellen sind, weiter bevorzugt Nieren- oder Darmkrebszellen.
Es ist besonders bevorzugt, wenn die Patienten, die mit den erfindungsgemäßen Verfahren behandelt werden, eine HLA-DR-Typisierung besitzen. Somit wird in einer bevorzugten Ausfüh rungsform der Erfindung die HLA-Typisierung des Patienten vor der Behandlung bestimmt. Die HLA-Typisierung kann über jedes geeignetes Verfahren ausgeführt werden; diese Verfahren sind im Stand der Technik gut bekannt.
Die Erfindung beinhaltet im Besonderen die Verwendung der erfindungsgemäßen Peptide (oder von Polynukleotiden, die diese kodieren) für die aktive in vivo Impfung; für die Manipulation von autologen dendritischen Zellen in vitro, gefolgt durch die Einführung der auf diese Weise manipulierten dendritischen Zellen in vivo, um CTL-Antworten auszulösen; zur Aktivierung von autologen CTLs in vitro, gefolgt von einer adoptiven Therapie (d. h. die auf diese Weise manipulierten CTLs werden in den Patienten eingeführt); und zur Aktivierung von CTLs von gesunden Spender (MHC-übereinstimmend oder nicht übereinstimmend) in vitro, gefolgt von einer adoptive Therapie.
In einer bevorzugten Ausführungsform werden die Impfstoffe der vorliegenden Erfindung entweder allein oder in Kombination mit einer anderen Krebstherapie verabreicht, um die Bildung von Tumoren zu inhibieren oder zu unterdrücken.
Der Nukleinsäureimpfstoff kann ohne Adjuvans verabreicht werden. Der Peptidimpfstoff kann auch mit einem Adjuvans wie BCG oder Alum verabreicht werden. Andere geeignete Adjuvantien beinhalten Aquila's QS21 Stimulon (Aquila Biotech, Worcester, MA, USA), welches von Saponin abstammt, Extrakte aus Mykobakterien und synthetische bakterielle Zellwandmimics und urheberrechtlich geschützte Adjuvantien wie Ribi's Detox. Quil A, ein anderes von Saponin abgeleites Adjuvans, kann auch verwendet werden (Superfos, Dänemark). Andere Adjuvantien wie zum Beispiel CpG-Oligonukleotide stabilisierte RNA, Imiquimod (kommerziell erhältlich unter dem Markennamen Aldara^TM von 3M Pharma, USA), unvollständiges Freund's Adjuvans (kommerziell erhältlich Montanide ISA-51 über Seppic S. A., Paris, Frankreich), liposomale Formulierungen oder GM-CSF können auch nützlich sein. Es kann auch nützlich sein, das Peptid an Napfschnecken-Hämozyanin befestigt zu geben, bevorzugt ebenfalls mit einem Adjuvans.
Die erfindungsgemäßen Peptide können aber auch als diagnostische Reagenzien eingesetzt werden. So kann mit den Peptiden herausgefunden werden, ob in einer CTL-Population spezifisch gegen ein Peptid gerichtete CTL vorliegen oder durch eine Therapie induziert wurden. Außerdem kann mit den Peptiden die Zunahme von Vorläufer-T-Zellen getestet werden, die eine Reaktivität gegen das definierte Peptid aufweisen. Ferner kann das Peptid als Marker dazu verwendet werden, um den Krankheitsverlauf eines Tumors zu verfolgen, der das besagte Antigen exprimiert, von dem das Peptid abstammt.
In der beigefügten Tabelle 1 sind die identifizierten Peptide aufgeführt. In der Tabelle sind außerdem die Proteine angegeben, von denen das Peptid abstammt, und die jeweilige Position des Peptids in dem betreffenden Protein. Ferner sind jeweils die Acc-Nummern angegeben, die in der Genbank des "National Center for Biotechnology Information" des National Institute of Health geführt werden (siehe http: www.ncbi.nlm.nih.gov).
In einer anderen bevorzugten Ausführungsform werden die Peptide zur Markierung von Leukozyten, insbesondere von T-Lymphozyten verwendet. Diese Benutzung ist von besonderem Vorteil, wenn nachgewiesen werden sollte, ob in einer CTL-Population spezifische CTLs vorhanden sind, die gegen ein Peptid gerichtet sind. Ferner kann das Peptid als Marker zur Beurteilung eines Therapieverlaufes bei einer Tumorerkrankung verwendet werden.
In einer weiteren Ausführungsform werden die Peptide zur Herstellung eines Antikörpers eingesetzt. Polyklonale Antikörper können in herkömmlicher Weise durch Immunisierung von Tieren mittels Injektion der Peptide und anschließender Reinigung des Immunglobulins gewonnen werden. Monoklonale Antikörper können nach Standardprotokollen hergestellt werden, wie bspw. in Methods Enzymol. (1986), 121: „Hybridoma technology and monoclonal antibodies" beschrieben.
Die Erfindung betrifft außerdem in einem weiteren Aspekt eine pharmazeutische Zusammensetzung, die eines oder mehrere der Peptide enthält. Diese Zusammensetzung dient der parenteralen Verabreichung, bspw. subkutan, intradermal oder intramuskulär oder der oralen Verabreichung. Dabei sind die Peptide in einem pharmazeutisch annehmbaren, vorzugsweise wässrigen, Träger gelöst oder suspendiert. Darüber hinaus kann die Zusammensetzung Hilfsstoffe, wie bspw. Puffer, Bindemittel, Verdünnungsmittel, etc. enthalten. Die Peptide können auch zusammen mit immunstimulierenden Substanzen, z. B. Zytokinen, verabreicht werden. Eine umfassende Darstellung von Hilfsstoffen, wie sie bei einer derartigen Zusammensetzung verwendet werden können, ist z. B. in A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceu tical press, aufgeführt. Die pharmazeutische Zusammensetzung kann dabei zur Prävention, Prophylaxe und/oder Therapie von Tumorerkrankungen eingesetzt werden.
Das pharmazeutische Mittel, das zumindest eines der Peptide mit der Sequenz ID-Nr. 1 bis 49 enthält, wird einem Patienten verabreicht, der an einer Tumorerkrankung leidet, mit der das betreffende Peptid bzw. Antigen assoziiert ist. Dadurch kann eine CTL-spezifische Immunantwort ausgelöst werden.
In einem weiteren Aspekt der vorliegenden Erfindung kann eine Kombination von zwei oder mehreren erfindungsgemäßen Peptiden als Impfstoff verwendet werden, entweder in direkter Kombination oder innerhalb derselben Behandlung. Weiterhin können Kombinationen mit anderen Peptiden, wie zum Beispiel MHC-Klasse-II spezifischen Peptiden, verwendet werden. Der Durchschnittsfachmann wird in der Lage sein, bevorzugte Kombinationen der immunogenen Peptide durch Testung, zum Beispiel sowohl der Erzeugung von T-Zellen in vitro als auch ihrer Effizienz und Gesamtvorkommen, der Proliferation, Affinität und Expansion bestimmter T-Zellen für bestimmte Peptide, und der Funktionalitäten der T-Zellen, z. B. durch Analyse der Produktion von IFN-γ (siehe auch die Beispiele unten), IL-12 oder Perforin, auszuwählen. Gewöhnlich werden die effizientesten Peptide dann zu einem Impfstoff für die oben beschriebene Zwecke kombiniert.
Ein geeigneter Impfstoff enthält 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 oder 15 verschiedene Peptide, bevorzugt 4, 5, 6 oder 7 verschiedene Peptide und besonders bevorzugt 6 verschiedene Peptide.
Schließlich kann der Impfstoff sowohl von dem spezifischen Krebstypus, unter dem der zu behandelnde Patient leidet, als auch von dem Krankheitszustand, der vorangegangenen Behandlung, dem Immunstatus des Patienten und natürlich der HLA-Typisierung des Patienten abhängen.
Es konnte gezeigt werden, dass die 80 N-terminalen Aminosäuren von Ii ausreichend sind, um Proteine in den Klasse-II prozessierenden Signalweg einzuschleusen (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 92, 7217-7221, Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354).
Die Identifizierung von T-Helferzell-Epitopen von tumorassoziierten Antigenen bleibt eine wichtige Aufgabe in der antitumoralen Immuntherapie. Hier beschreiben die Erfinder ein allgemein anzuwendendes Verfahren und Peptide, die aus differentieller Peptidanalyse durch MS erhalten wurden, um natürlich prozessierte und präsentierte MHC-Klasse-II-Liganden von tumorassoziierten Antigenen zu identifizieren. Dieser Ansatz kombiniert zum ersten Mal den Transfektionsschritt der APC mit einem Vektor, der ein Fusionsprotein zwischen der Ii-Kette und dem interessierenden Zielantigen (Ag), Elution der HLA-gebundenen Peptide und MS-Identifikation der von dem Ag abgeleiteten Peptide, die durch transfizierte Zellen im Vergleich zu nicht-transfizierten Zellen präsentiert werden. Darüber hinaus konnten die Erfinder die Methode dadurch validieren, dass sie zeigten, dass die T-Zellen, die gegen die identifizierten Peptide induziert sind, spezifisch Transfektanten erkennen, die das verwandte Ag überexprimieren. Auch wenn die identifizierten Peptide immer noch auf ihre Immunogenität in vivo getestet werden müssen, führt unser Ansatz zu einer exakten Charakterisierung von natürlich prozessierten MHC-Klasse-II-Liganden. Somit vermeiden die Erfinder das Testen von entweder synthetischer überlappender Peptide von tumorassoziierten Antigenen oder eines breiten Bereiches von Peptiden, die durch Epitopvorhersage ausgewählt wurden, welche im Vergleich zu der Klasse-I Epitopvorhersage weniger genau ist. Im Gegensatz zu mühevollen T-Zellassays, die zu der Identifizierung von kryptischen T-Zell-Epitopen, die nicht in der Lage sind, eine T-Zellaktivierung in vivo zu induzieren, führen (Anderton, S. M., Viner, N. J., Matharu, P., Lowrey, P. A. & Wraith, D. C. (2002) Nat. Immunol. 3, 175-181), kann die Arbeit auf die wenigen Peptide beschränkt werden, die als präsentiert aufgefunden wurden. Darüber hinaus ist es bei dieser Methode nicht nötig, rekombinante Ags zu produzieren oder Ag-exprimierende Tumorzelllinien zu besitzen, um zu beweisen, dass die Peptide natürlich prozessiert werden.
Die Erfinder benutzten den N-Terminus von Ii, um die tumorassoziierten Antigene in das Klasse-II prozessierende Kompartiment von EBV-transformierten B-Zellen zu führen. Um dies zu erreichen, konstruierten die Erfinder einen vielseitigen Vektor, mit dem wir dann jedes Antigen als ein Fusionsprotein mit Ii exprimieren können und welcher uns hilft, das Expressionsausmaß des Proteins in den transfizierten Zellen durch Western Blot Analyse zu bestimmen. Es ist schon gezeigt worden, dass der N-Terminus von Ii ausreichend ist, um Proteine in das Klasse-II prozessierende Kompartiment zu führen. Bis jetzt ist dies aber nur in einem Modell, welches Ovalbumin benutzt, gezeigt worden (Sanderson, S., Frauwirth, K. & Shastri, N. (1995) Proc. Natl. Acad. Sci. U S. A 92, 7217-7221), um unbekannte Ags mittels Fusionsprotein-kodierenden cDNA Bibliotheken zu identifizieren (Wang, R. F., Wang, X., Atwood, A. C., Topalian, S. L. & Rosenberg, S. A. (1999) Science 284, 1351-1354) oder um die Spezifität bekannter T-Zellklone zu bestätigen (Chaux, P., Vantomme, V., Stroobant, V., Thielemans, K., Corthals, J., Luiten, R., Eggermont, A. M., Boon, T. & van der, B. P. (1999) J Exp. Med. 189, 767-778). Nach dem Wissen der Erfinder wurde diese Methode noch nie angewandt, um natürlich präsentierte MHC-Klasse-II gebundene Peptide von bekannten tumorassoziierten Antigenen zu identifizieren. Die differentielle Analyse von Klasse-II-Liganden von transfizierten und nicht transfizierten Zellen durch MALDI-MS und die weitere Charakterisierung von differentiell exprimierten Peptiden durch ESI-MS führt zur direkten Methode für die Identifizierung von Klasse-II-Liganden interessierender Antigene. Die Transfektion von Zellen mit Keratin-18 Fusionsproteinen bewies, dass die Methode der Erfinder generell für interessierende Antigene anwendbar ist, wiederum waren die Erfinder auch in der Lage, ein HLA-DR-präsentiertes Peptid von einem Model Transgen, Keratin-18 zu beschreiben.
Die Identifizierung von T-Helferzell-Epitopen von tumorassoziierten Antigenen (TAA) bleibt eine wichtige Aufgabe in der antitumoralen Immunotherapie. Bis jetzt wurde eine Reihe von Strategien durchgeführt, um Peptide der Klasse-II von TAA zu identifizieren, die von der Inkubation von APCs mit einem Antigen von Interesse, um dessen Aufnahme, Prozessierung und Präsentation zu ermöglichen (Chaux, P., V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon, and B. P. van der Bruggen. 1999. Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. J. Exp. Med. 189: 767-778), bis zu verschiedenen Transfektionsstrategien mit Fusionsproteinen (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34: 3644-3651) reichen. Alle diese Methoden sind sehr zeitaufwändig und es bleibt oft unklar, ob die identifizierten HLA-Liganden wirklich in vivo durch menschliches Gewebe präsentiert werden. Die Erfinder konnten zum allerersten Mal nachweisen, dass es möglich ist, HLA-Klasse-II-Liganden direkt aus sezierten soliden Tumoren zu isolieren, und somit die Peptide zu identifizieren, die von den Tumoren und durch das umgebende Gewebe in vivo präsentiert werden, welche demzufolge durch T-Zellen, die den geeigneten T-Zell-Rezeptor tragen, erkannt werden können und welche gleichzeitig den kostimulierenden Ligand CD4 auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Unter den Proteinen, die als Quelle für endogen prozessierte HLA-Klasse-II-Liganden dienen, wurden verschiedene "Housekeeping"- und immunrelevante Proteine identifiziert. Jedoch konnten auch Peptide von TAAs detektiert werden, was zu einem direkten Ansatz für die Identifizierung von in vivo relevanten Klasse-II-Liganden von TAAs führt.
Die Erfinder identifizierten drei Liganden, die eine Kernsequenz von IGFBP3 nachwiesen, und einen Liganden von MMP7. Die Erfinder fanden, dass diese Proteine in Nierenzelltumoren überexprimiert wurden, weiterhin sind sie als tumorassoziiert beschrieben worden (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity an insulin-like growth factor binding Protein 3. Cancer Res. 64: 665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. Oncol. Rep. 10: 567-570; Cheung, C. W., D. A. Vesey, D. L. Nicol, and D. W. Johnson. 2004. The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regulation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell Proliferation. Kidney Int. 65: 1272-1279). Diese Peptide banden promiskuitiv an HLA-Klasse-II-Moleküle und waren in der Lage, CD4-positive T-Zellen von verschiedenen gesunden Spender zu aktivieren. Somit wird der Ansatz der Erfinder für die Identifizierung von neuen Klasse-II-Peptidkandidaten von TAAs für die Verwendung in klinischen Impfprotokollen hilfreich sein.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz exprimieren, das Verfahren umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge eines erfindungsgemäßen Peptides oder einer erfindungsgemäßen Nukleinsäure oder eines erfindungsgemäßen Expressionsvektors, wobei die Menge des besagten Peptides oder der besagten Nukleinsäure oder des besagten Expressionsvektors ausreicht, um eine anti-Zielzellen-Immunantwort in besagtem Patienten auszulösen.
Die Erfindung betrifft weiterhin ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid, umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, expri mieren, das Verfahren umfasst die Verabreichung einer effektiven Menge von zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL), wie in der vorliegenden Erfindung definiert.
Die Erfindung beschreibt weiterhin ein Verfahren zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, dessen Zielzellen ein Polypeptid, umfassend eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz, exprimieren, das Verfahren umfasst die folgenden Schritte: (1) Erhalten der zytotoxischen T-Lymphozyten (CTL) von einem Patienten; (2) Einführung einer Nukleinsäure, welche den TCR oder ein funktionell äquivalentes Molekül, wie in der vorliegenden Erfindung definiert, kodiert, in die genannten Zellen; und (3) Einführung der in Schritt (2) erzeugten Zellen in den Patienten.
Bevorzugt sind die Zielzellen Krebszellen. Weiter bevorzugt ist besagter Krebs Leukämie oder Lymphom, der ein Polypeptid, welches eine erfindungsgemäße Aminosäuresequenz umfasst, exprimiert.
Überraschenderweise wurde im Kontext der vorliegenden Erfindung gefunden, dass Tumorzellen von soliden Tumoren, im Gegensatz zu gesunden Zellen desselben Gewebes, an ihrer Oberfläche menschliche HLA-Klasse-II-Moleküle exprimieren. Diese Tatsache ist bisher nur einmal in Brasanac et al (Brasanac D, Markovic-Lipkovski J, Hadzi-Djokic J, Muller GA, Muller CA. Immunohistochemical analysis of HLA class II antigens and tumor infiltrating mononuclear cells in renal cell carcinoma: correlation with clinical and histopathological data. Neoplasma. 1999; 46(3): 173-8.) beschrieben worden, wo Kryostatschnitte von 37 Nierenzelltumoren (RCC) – 25 klarzellig, 10 granular and 2 chromophob – mit der indirekten Immunoperoxidase-Methode unter Anwendung von monoklonalen Antikörpern (MoAb) zu HLA-DR, -DP und -DQ Antigenen für die Analyse von HLA-Klasse-II-Antigenen und anti-CD14, -CD3, -CD4 und -CD8 MoAb für Tumor-infiltrierende mononukleare Zellen (TIM) untersucht wurden. Die Anzahl der positiven Zellen wurde semiquantitativ geschätzt und die Ergebnisse der immunohistochemischen Untersuchung wurden mit den klinischen (Patientenalter und -geschlecht, Tumorgröße und TNM-Stadium) und histopathologischen (Zytology, Histology, Grad) Charakteristika von RCC korreliert. Alle RCC exprimierten HLA-DR, 92%-DQ und 73%-DP Antigenen, mit dem Niveau der Expression in der Abfolge- DR > -DQ > -DP, es konnte aber keine statistisch wichtige Korrelation mit einem der analysierten histopathologischen oder klinischen Parameter gefunden werden. Monozyten waren reichlicher vorhanden als T-Lymphozyten und CD4+ reichlicher als CD8+ T- Zellen, wobei Tumore mit einer Dominanz von T-Lymphozyten und einer annähernd gleichen Zahl von CD4+ und CD8+ T-Zellen den größten durchschnittlichen Durchmesser hatten. Unzureichende Aktivierung von T-Lymphozyten durch Tumorzellen (trotz der Befähigung zur Antigenpräsentation) könnte der Grund für die Verbindung der Parameter sein, was ein aggressiveres Tumorverhalten bei aberranter HLA-Klasse-II-Antigenexpression bei RCC indiziert.
Es versteht sich, dass Merkmale der Erfindung, wie offenbart und hier beschrieben, nicht nur in der jeweils angegebenen Kombination, sondern auch in Alleinstellung verwendbar sind, ohne den Rahmen der vorliegenden Erfindung zu verlassen.
Ausführungsbeispiele der Erfindung werden in den nachfolgenden Figuren, in dem Sequenzprotokoll und Beispielen genauer dargestellt und erläutert. Die folgenden Beispiele sind nur zur Illustrierung gedacht und dienen nicht dazu, die Erfindung in irgendeiner Weise einzuschränken.
SEQ ID No 1 bis SEQ ID No 49 zeigen Peptidsequenzen von T-Zell-Epitopen, die erfindungsgemäße Peptide, die durch MHC-Klasse-II präsentiert werden, beinhalten.
SEQ ID No 50 bis SEQ ID No 79 zeigen Peptidsequenzen aus Tab. 3.
1 zeigt die Expression von HLA-Klasse-II-Molekülen in RCCs von drei Patienten. Wohingegen die HLA-positiven Zellen in dem Tumor von Patient RCC132 bevorzugt am Rand lokalisiert waren (A, B), waren die HLA-Klasse-II Expressionsmuster der Tumore der Patienten RCC190 und RCC211, eine mehr papilläre Struktur zeigend, gleichmäßiger verteilt (C, E, G). Die Visualisierung von CD68-positiven Makrophagen (B, D, F) in Seriengewebsschnitten zeigt eine enge räumliche Beziehung von Tumor-infiltrierenden mononuklearen Immunzellen und HLA-II exprimierenden Tumorzellen. Inkubation mit Maus-IgG anstelle von spezifischen Antikörpern zeigte reproduzierbar negative Ergebnisse der Färbung (H). Ein großes T markiert den Tumor.
2 zeigt eine FACS Analyse von CD4-positiven T-Zellen spezifisch für IGFBP3_169-181, MMP_247-262 und CCND1_198-212. Gezeigt werden die repräsentativen Dot Blots von intrazellulärer IFNγ Färbung gegen CD4-FITC.
3 zeigt eine schematische Darstellung von Antigen-spezifischen IFNγ produzierenden CD4-positiven T-Zellen, in jedem Spender und für jedes Peptid nachgewiesen. Gezeigt wird der Prozentsatz von IFNγ produzierenden CD4-positiven T-Zellen, in jedem Spender und für jedes Peptid, das für die Stimulation benutzt wurde. Die Zellen wurden in 96-Well Platten inkubiert – 7 Wells pro Spender und Peptid. In den Boxen sind die Werte, die als positiv angesehen werden: Der Prozentsatz von IFNγ produzierenden CD4-positiven T-Zellen war im Vergleich mit der negativen Kontrolle ohne Peptid mehr als zweifach höher. Der Prozentsatz von IFNγ produzierenden CD4-positiven T-Zellen, der nach der der Stimulation mit irrelevanten Peptiden detektiert wurde, korreliert mit den Werten nach einer Stimulation ohne Peptide, mit der Ausnahme von Spender 1 nach der dritten Stimulation mit IGFBP3_169-181. Jedoch konnte dieser Effekt nach der vierten Stimulation nicht mehr gesehen werden.
4 zeigt die Expression von HLA-Klasse-II-Molekülen in CCA165 (moderat differenziertes Adenkarzinom des Darms). In der Lamina Propria von Gebieten mit normaler Kolonschleimhaut (Abbildung c und linke Seite von Abbildung a, markiert mit einem Asterisk) wurden typischerweise einige HLA-Klasse-II positive Makrophagen beobachtet, aber Epithelzellen waren reproduzierbar negativ für HLA-Klasse-II Expression. In den Epithelzellen von verschiedenen Gebieten des Tumors wurde aber eine ausgeprägte Expression von HLA-II gesehen, wie auf der rechten Seite in Abbildung a und in Abbildung b und d zu sehen ist.
5a und 5b zeigen die Identifizierung von Peptidsequenzen von Peptiden, die von HLA-Klasse-II-Molekülen, die aus primärem menschlichen Tumorgewebe durch Massenspektroskopie isoliert wurden, eluiert wurden. 5a: Fragmente erhalten aus der Fragmentierung von den natürlich prozessierten und präsentierten HLA-Klasse-II-Liganden von MMP7, korrespondierend mit der Peptidsequenz mit der SEQ ID No. 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS). Annotierte Fragmente sind in Tab 5. dargestellt. 5b: Fragmente erhalten aus der Fragmentierung von synthetischen Peptiden mit der Peptidsequenz der SEQ ID No. 1. Fragmentierung von beiden – synthetischen und natürlich prozessierten Peptiden – liefern äquivalente Fragmentierungsmuster und erlauben die Ableitung und Bestätigung der primären Aminosäuresequenz, der vorher nicht charakterisierten Peptidsequenz (SEQ ID No. 1) dieses HLA-Klasse-II-Liganden des menschlichen MMP7s.
Beispiele
Materialien und Methoden
MHC-Klasse-II Immunhistologie: Tumore wurden in 4% phosphatgepuffertem Formaldehyd fixiert, in Paraffin eingebettet, mit Hematoxylin-Eosin angefärbt und mit Lichtmikroskopie untersucht. Die Diagnose des RCCs wurde gemäß den histopathologischen und immunhistologischen Routineuntersuchungen (Fleming, S. and M. O'Donnell. 2000. Surgical pathology of renal epithelial neoplasms: recent advances and current status. Histopathology 36: 195-202) durchgeführt.
Für den immunohistologischen Nachweis von MHC-Klasse-II-Molekülen oder CD68-Molekülen wurden 5 um in Paraffin eingelegte Gewebeschnitte mit 10 mM Citratpuffer, pH 6 vorbehandelt, gefolgt durch Inkubation entweder mit einer Maus anti-HLA-DR alpha-Kette mAb (Klon TAL.1B5, 1:50) oder CD68 Ab (Klon PGM1, 1:50) (DAKO, Hamburg, Deutschland) oder Maus IgG1 (2 μg/ml, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, USA) und durch Benutzung des „Ventana iView DAB detection kit" (Nexes System, Ventana Medical Systems, Illkirch, Frankreich) sichtbar gemacht. Gewebeschnitte wurden mit Hematoxylin gegengefärbt und schließlich in Entellan eingebettet.
Elution und molekulare Analyse von HLA-DR gebundenen Peptiden: Gefrorene Tumorproben wurden wie zuvor beschrieben verarbeitet (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of Patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62: 5818-5827) und die Peptide wurden gemäß den Standardprotokollen (Dengjel, J., H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2005. Glycan side chains an naturally presented MHC class II ligands. J Mass Spectrom. 40: 100-104) unter Benutzung der HLA-DR spezifischen mAb L243 (Lampson, L. A. and R. Levy. 1980. Two populations of Ia-like molecules an a human B cell line. J. Immunol. 125: 293-299) isoliert.
Natürliche Peptidgemische wurden mit einem Reversed-Phase Ultimate HPLC System (Dionex, Amsterdam, Netherlands), gekoppelt an ein Q-TOF I Massenspektrometer (Waters, Eschborn, Deutschland), oder mit einem Reversed-Phase CapLC HPLC System, gekoppelt an ein Q-TOF Ultima API (Waters), wie zuvor beschrieben (Lemmel, C., S. Weik, U. Eberle, J. Dengjel, T. Kratt, H. D. Becker, H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling. Nat. Biotechnol. 22: 450-454), analysiert. Fragmentierungsspektren wurden manuell und automatisch analysiert.
Genexpressionsanalyse durch High-Density Oligonukleotid-Microarray-Analyse: Sowohl die RNA-Isolierung von Tumor- und autologen normalen Nierenproben als auch die Genexpressionsanalyse mit Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 Oligonukleotid-Microarrays (Affymetrix, Santa Clara, CA, USA) wurden, wie schon zuvor beschrieben (Krüger, T., O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Müller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Lessons to be learned from primary renal cell carcinomas: novel tumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. J Immunol. Immunother), durchgeführt. Die Daten wurden mit der GCOS Software (Affymetrix) analysiert. Paarweise Vergleiche zwischen dem Tumor und dem autologen normalen Nieren wurden unter der Benutzung des jeweiligen normalen Arrays als Basislinie berechnet. Für RCC149 und RCC211 waren keine autologen normalen Nieren-Arraydaten erhältlich. Deshalb wurde vereinte gesunde menschliche Nieren-RNA gewerblich bei Clontech erworben (Clontech, Heidelberg, Deutschland) und als Basislinie für diese Tumore verwendet.
Maturation der DC: DCs wurden aus Blut von gesunden Spender gewonnen. Kurz gefasst, wurden die PBMCs mit Standard-Gradienten-Zentrifugation (Lymphocyte Separation Medium, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Österreich) isoliert und mit einer Dichte von 7 × 10⁶ Zellen/ml in ein X-Vivo 15 Medium plattiert. Nach 2 Stunden bei 37°C wurden die nicht-adhärierenden Zellen entfernt und die adhärierenden Monozyten für 6 Tage in einem X-Vivo Medium mit 100 ng/ml GM-CSF und 40 ng/ml IL-4 (AL-ImmunoTools, Friesoythe, Deutschland) kultiviert. Am 7. Tag wurden unreife DCs mit 10 ng/ml TNF-α (R&D Systems, Wiesbaden, Deutschland) und 20 μg/ml poly(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Deutschland) für 3 Tage aktiviert.
Erzeugung von Antigen-spezifischen CD4-positiven T-Zellen: 10⁶ PBMCs pro Well wurden mit 2 × 10⁵ Peptid-gepulsten (5 μg/ml) autologen DCs stimuliert. Die Zellen wurden in 96-Well-Platten mit dem T-Zellmedium inkubiert (7 Wells pro Spender und Peptid): Ergänzt RPMI 1640 in der Gegenwart von 10 ng/ml IL-12 (Promocell, Heidelberg, Deutschland). Nach 3 bis 4 Tagen Ko-Inkubation bei 37°C wurde frisches Medium mit 80 U/ml IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, USA) und 5 ng/ml IL-7 (Promocell) zugegeben. Restimulation mit autologen PBMCs plus Peptid wurde alle 6 bis 8 Tage durchgeführt.
Intrazelluläre IFNγ Färbung: Nach 3 und 4 Stimulationsdurchläufen wurden die PBMCs aufgetaut, zweimal in X-Vivo 15 Medium gewaschen, mit 10⁷ Zellen/ml in dem T-Zell-Medium rücksuspendiert und über Nacht kultiviert. Am nächsten Tag wurden die PBMCs, gepulsed mit 5 μg/ml Peptid, mit Effektorzellen in einem Verhältnis 1:1 für 6 h inkubiert. Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Deutschland) wurde für die letzten 4 h der Inkubation hinzugefügt.
Die Zellen wurden mit einem Cytofix/Cytoperm Plus kit (Becton Dickinson) und CD4-FITC-(Immunotools), IFNγ-PE- und CD8-PerCP clone SK1-antibodies (Becton Dickinson) analysiert. Als negative Kontrolle wurden die Zellen aus sieben Wells zusammengeführt und entweder mit einem irrelevanten Peptid oder ganz ohne Peptid inkubiert. Stimulation mit PMA/Ionomycin wurde als positive Kontrolle verwendet. Die Zellen wurden an einem Drei-Farben-Zellanalytik FACSCalibur (Becton Dickinson) analysiert.
Beispiele
HLA-Klasse-II-Expression durch RCC
Unter normalen, nicht-inflammatorischen Bedingungen, sollten die HLA-Klasse-II-Moleküle nur durch Zellen des hämatopoetischen Systems und des thymischen Epitheliums exprimiert werden (Mach, B., V. Steimle, E. Martinez-Soria, and W. Reith. 1996. Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. Annu. Rev. Immunol. 14: 301-331). Die Situation ändert sich während einer Entzündung. HLA-Klasse-II-Expression kann in den meisten Zelltypen und Gewebearten durch IFNγ (Leib und Gut-Landmann, S., J. M. Waldburger, M. Krawczyk, L. A. Offen, T. Suter, A. Fontana, H. Acha-Orbea, and W. Reith. 2004. Mini-review: Specificity and expression of CIITA, the master regulator of MHC class II genes. Eur. J. Immunol. 34: 1513-1525) induziert werden. Da eine RCC-Neuerkrankung oft von entzündlichen Ereignissen einhergeht (Blag, J. Y., J. F. Rossi, J. Wijdenes, C. Menetrier-Caux, S. Schemann, S. Negrier, T. Philip, und M. Favrot. 1997. Role of interleukin-6 in the paraneoplastic inflammatory syndrome associated with renal-cell carcinoma. Int. J. Cancer 72: 424-430; Elsässer- Beile, U., M. Rindsfuser, T. Grussenmeyer, W. Schultze-Seemann, and U. Wetterauer. 2000. Enhanced expression of IFN-gamma mRNA in CD4(+) or CD8(+) tumour-infiltrating lymphocytes compared to peripheral lymphocytes in patients with renal cell cancer. Br. J. Cancer 83: 637-641), werden Klasse-II-Moleküle tatsächlich in der Umgebung oder durch die Tumore selber, wie berichtet wurde, exprimiert.
Immunohistochemische Färbung von HLA-Klasse-II-Molekülen
Die Erfinder analysierten die HLA-Klasse-II-Expression von zehn RCC-Proben, umfassend histologisch klarzellige und papilläre Nierenkarzinome, durch immunohistochemische Färbung und fanden heraus, dass alle untersuchten Proben Klasse-II-positive-Tumorzellen aufwiesen. Wie beispielhaft in 1A erläutert wird, wurde eine ausgeprägte Expression von HLA-Klasse-II oftmals in der Umgebung des Tumors nachgewiesen. In diesem Gebiet beobachteten die Erfinder eine enge räumliche Beziehung von HLA-positiven-Tumorzellen mit Tumor-infiltrierenden Immunzellen, wie durch Visualisierung von CD68-positiven Makrophagen in Seriengewebsschnitten gezeigt wird (1B). In dem einen mehr papillären Aufbau zeigenden RCC waren die HLA-Klasse-II-Moleküle gleichmäßiger durch den Tumor verteilt (1C, E, G). Der Vergleich von HLA-Klasse-II und CD68 immunohistochemischen Färbungsmustern in Seriengewebsschnitten zeigt deutlich, dass zusätzlich zu den Makrophagen auch Tumorzellen HLA-Klasse-II exprimieren (1C, D und E. F). Es ist gezeigt worden, dass sowohl IFNγ produzierende CD4-positiven T_H1-Zellen als auch natürliche Killerzellen (NK-Zellen) RCC infiltrieren (Cozar, J. M., J. Canton, M. Tallada, A. Concha, T. Cabrera, F. Garrido, and O. F. Ruiz-Cabello. 2005. Analysis of NK cells and chemokine receptors in tumor infiltrating CD4 T lymphocytes in human renal carcinomas. J Immunol. Immunother). Während Klasse-II-positive-Tumorzellen überwiegend in den äußeren Bereichen der sezierten Tumore gefunden wurden, könnte man spekulieren, dass die Leukozyten, die durch den Tumor angezogen werden, IFNγ produzieren, welches auf die benachbarten malignen Zellen einwirkt. Die abnormale Expression von HLA-Klasse-II-Molekülen in neoplastischem Gewebe ist nicht auf RCC beschränkt, es kann auch bei TCC und CCA nachgewiesen werden. 4 zeigt die immunohistochemische Färbung von Probegewebe von menschlichem Adenokarzinom des Darms.
Analyse der Expression von IFNγ und Gentranskripten induziert durch IFNγ
Zusätzlich untersuchten die Erfinder die HLA-Klasse-II-Expression durch vergleichende Genexpressionsanalyse mit Oligonukleotid-Microarrays. Mit dieser Technik konnten die Erfin der die HLA-Klasse-II-Gesamtexpression in den sezierten Tumoren unabhängig von den exprimierenden Zelltypen beurteilen. Die Erfinder analysierten die differentielle Expression in vier Tumoren, RCC149, RCC180, RCC190 und RCC211 im Vergleich mit einer normalen Referenzniere. In allen vier Tumoren wurde gefunden, dass die Gene, die HLA-Klasse-II-Moleküle kodieren, überexprimiert werden (Tab. 2). Ein möglicher Grund hierfür kann die induzierte Expression durch IFNγ sein und aus diesem Grund suchten die Erfinder nach Genen, von denen bekannt ist, dass sie durch Interferone hochreguliert werden (Kolchanov, N. A., E. V. Ignatieva, E. A. Ananko, O. A. Podkolodnaya, I. L. Stepanenko, T. I. Merkulova, M. A. Pozdnyakov, N. L. Podkolodny, A. N. Naumochkin, and A. G. Romashchenko. 2002. Transcription Regulatory Regions Database (TRRD): its status in 2002. Nucleic Acids Res. 30: 312-317). Interessanterweise wurde gefunden, dass eine erhebliche Anzahl solcher Gene in einer oder mehreren Tumorproben überexprimiert werden. Tab. 2 zeigt Interferoninduzierbare Gene, die, in Übereinstimmung mit den früheren Beobachtungen der Erfinder, in allen vier Proben hochreguliert wurden, (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of Patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62: 5818-5827). Unter ihnen sind LMP2, LMP7 und MECL1 – Proteine, die gegen konstitutive Untereinheiten von großen proteolytischen Holoenzymen, die im Zytosol, dem Proteasom, angesiedelt sind, ausgetauscht sind, um das Immunoproteasom zu bilden. Der Austausch von normal exprimierten proteolytischen Untereinheiten des Proteasoms gegen IFNγ-induzierbare Untereinheiten ist ein Kennzeichenprozess in einer Interferon-reichen Umgebung. Zusätzlich wurde IFNγ direkt durch quantitative Echtzeit (RT) PCR (TaqMan) bestimmt. Die Tumore, die in der Tab. 2 dargestellt werden, zeigten eine 5- bis 60-fache IFNγ mRNA Überexpression im Vergleich zu autologen normalen RNA-Proben vom gleichen Spender (Daten nicht gezeigt). Somit deuten die Ergebnisse der Erfinder darauf hin, dass IFNγ eine wichtige Rolle in RCC spielen könnte und der Grund für die vorhandene Klasse-II-Expression sein könnte.
Tab. 2: mRNA Expression von Interferon-induzierbaren Genen.

Die Expression in Tumorproben wurde mit autologen normalen Nieren (RCC180, RCC190) oder vereinten gesunden Nieren (RCC 149, RCC211) verglichen. Alle Gene zeigten eine "Erhöhung" in dem "change-call" Algorithmus der GCOS Software für alle vier Tumore und wurden als Interferon-induzierbar beschrieben.

Gensymbol	Entrez GeneID	Genbezeichnung	-fache Übe RCC 149	rexpression RCC 180	Tumor vs. RCC 190	normal RCC211
HLA-DPA1	3113	major histocompatibility complex, class II, DP alpha 1	3.5	3.7	4.9	13.9
HLA-DPB1	3115	major histocompatibility complex, class II, DP beta 1	2.6	2.5	2.8	14.9
HLA-DQB1	3119	major histocompatibility complex, class II, DQ beta 1	4.3	4.0	6.5	5.3
HLA-DRB1	3123	major histocompatibility complex, class II, DR beta 1	1.2	1.9	2.8	4.3
CXCL10	3627	chemokine (C-X-C motif) ligand 10	1.1	3.2	10.6	24.3
FCGR1A	2209	Fc fragment of IgG, high affinity Ia, receptor for (CD64)	6.5	2.6	12.1	29.9
IFI16	3428	interferon, gamma-inducible protein 16	8.6	3.0	4.3	11.3
IFI44	10561	interferon-induced protein 44	2.8	1.4	2.5	2.8
OAS1	4938	2',5'-oligoadenylate synthetase 1, 40/46kDa	3.5	2.3	2.6	5.3
PSMB8	5696	proteasome subunit, beta type, 8 (LMP7)	2.6	4.3	6.1	6.5
PSMB9	5698	proteasome subunit, beta type, 9 (LMP2)	4.3	7.5	6.5	16.0
PSMB10	5699	proteasome subunit, beta type, 10 (MECL1)	3.2	2.5	5.3	13.0
SP100	6672	nuclear antigen Sp 100	4.0	1.1	1.5	2.8
TAP1	6890	transporter 1, ATP-binding cassette, sub-family B (MDR/TAP)	2.5	2.8	6.5	8.0
VCAM1	7412	vascular cell adhesion 5.7 5.3 3.2 12.1 molecule 1	5.7	5.3	3.2	12.1

Aus Krebsgewebe isolierte HLA-DR-Liganden
Nach den öffentlich zugänglichen Daten wurden durch HLA-Klasse-II-Moleküle gebundene Peptide, die in soliden Tumorgeweben exprimiert werden, bisher noch nicht von Anderen isoliert oder identifiziert. Die Erfinder analysierten zehn verschiedene RCC, drei CCA und ein TCC und waren in der Lage, aus allen Proben HLA-DR-Liganden zu isolieren, insgesamt beläuft sich die Zahl auf 453 Peptide (Daten nicht gezeigt). Die Peptidsequenzen wurden durch Kopplung von chromatographischer Trennung und tandemmassenspektrometrischer Analyse (LC-MS/MS), wie zuvor beschrieben (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of Patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62: 5818-582; Schirle M, Keilholz W, Weber B, Gouttefangeas C, Dumrese T, Becker HD, Stevanovic S, Rammensee HG. Identification of tumor-associated MHC class I ligands by a novel T-cell-independent approach. Eur J Immunol. 2000; 30(8): 2216-25) bestimmt. Ein Beispiel für die de novo Sequenzierung von Peptiden durch LC-MS/MS ist in den 5a und 5b angegeben. Die abgeleiteten primären Aminosäuresequenzen der annotierten Kollisionsfragmente in 5a und 5b sind in Tab. 5 eingeschlossen. Die Tumorproben unterschieden sich in ihren HLA-Gentypen, in Gewicht und der Gesamtzahl der identifizierten HLA-Liganden. Tab. 3 zeigt eine repräsentative Liste von Peptiden und entsprechenden Quellproteinen, die aus einer einzelnen Tumorprobe, RCC190, identifiziert wurden. Die Peptide wurden, wie zuvor beschrieben, aus HLA-Klasse-II-Molekülen von Zellen isoliert (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34: 3644-3651).
Tab. 3: Beispielliste der aus RCC190 isolierten HLA-DR-Liganden.

Gezeigt werden die Kernsequenzen der aus RCC 190 isolierten HLA-DR-Liganden (HLA-DRB1·11, DRB1·15, DRB3, DRB5).

Gensymbol	Entrez	Peptidsequenz (SEQ ID No.)	Genbezeichnung
	GeneID
ACTG1	71	WISKQEYDESGPSIVHRKCF (SEQ ID No. 50)	actin, gamma 1 propeptide
ALB	213	LKKYLYEIARRHP (SEQ ID No. 51)	albumin precursor
ALB	213	TLVEVSRNLGKVG (SEQ ID No. 52)	albumin precursor
ALB	213	TPTLVEVSRNLGKVGS (SEQ ID No. 53)	albumin precursor
APOA2	336	EKSKEQLTPLIKKAGTELVNF (SEQ ID No. 54)	apolipoprotein A-II precursor
APOB	338	YPKSLHMYANRLLDHR (SEQ ID No. 55)	apolipoprotein B precursor
C1R	715	EPYYKMQTRAGSRE (SEQ ID No. 56)	complement component 1, r subcomponent
C4B	721	APPSGGPGFLSIERPDSRPP (SEQ ID No. 57)	complement component 4B proprotein
C4BPA	722	FGPIYNYKDTIVFK (SEQ ID No. 58)	complement component 4 binding protein, alpha
CALR	811	SPDPSIYAYDNF (SEQ ID No. 59)	calreticulin precursor
CALR	811	EPPVIQNPEYKGEWKPRQIDNPD (SEQ ID No. 60)	calreticulin precursor
CFL1	1072	GVIKVFNDMKVRK (SEQ ID No. 61)	cofilin 1 (non-muscle)
CPE	1363	APGYLAITKKVAVPY (SEQ ID No. 62)	carboxypeptidase E precursor
FCGBP	8857	ASVDLKNTGREEFLTA (SEQ ID No. 63)	Fc fragment of IgG binding protein
FCN1	2219	GNHQFAKYKSFKVADE (SEQ ID No. 64)	ficolin 1 precursor
FTL	2512	VSHFFRELAEEKREG (SEQ ID No. 65)	ferritin, light polypeptide
FTL	2512	TPDAMKAAMALEKK (SEQ ID No. 66)	ferritin, light polypeptide
GAPD	2597	FVMGVNHEKYDN (SEQ ID No. 67)	glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GAPD	2597	TGVFTTMEKAGAH (SEQ ID No. 68)	glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
GAPD	2597	ISWYDNEFGYSNRVVDLMAHMASKE (SEQ ID No. 69)	glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase
HIST1H1C	3006	GTGASGSFKLNKKAASGEAKPK (SEQ ID No. 70)	H1 histone family, member 2
HLA-DQB1	3119	DVGVYRAVTPQGRPD (SEQ ID No. 71)	major histocompatibility complex, class II, DQ beta 1 precursor
HLA-DRB1	3123	DVGEFRAVTELGRPD (SEQ ID No. 72)	major histocompatibility complex, class II, DR beta 1 precursor
IGFBP3	3486	HPLHSKIIIIKKGHAK (SEQ ID No. 73)	insulin-like growth factor binding protein 3
KNG1	3827	DKDLFKAVDAALKK (SEQ ID No. 74)	kininogen 1
NPC2	10577	KDKTYSYLNKLPVK (SEQ ID No. 75)	Niemann-Pick disease, type C2 precursor
S100A8	6279	VIKMGVAAHKKSHEESHKE (SEQ ID No. 76)	5100 calcium-binding protein A8
SERPINA1	5265	MIEQNTKSPLFMGKVVNPTQK (SEQ ID No. 77)	serine (or cysteine) proteinase inhibitor, clade A (alpha-1 antiproteinase, antitrypsin), member 1
SOD1	6647	GPHFNPLSRKHGGPK (SEQ ID No. 78)	superoxide dismutase 1, soluble
TF	7018	DPQTFYYAVAVVKKDS (SEQ ID No. 79)	transferrin

Es gab eine Korrelation zwischen dem Tumorgewicht und der Anzahl der identifizierten HLA-Liganden. Die Quellproteine der Peptide konnten in zwei Gruppen unterteilt werden. Einerseits wurden Liganden gefunden, die durch Leukozyten präsentiert werden sollten, solche wie Peptide der Komplement-Komponenten, zum Beispiel C3, C4A, C4-bindendes Protein Alpha und andere Proteine, die mit spezifischen Funktionen der Zellen des Immunsystems verbunden sind, wie zum Beispiel CD14 und das Fc-Fragment des IgG-Bindeproteins. Andererseits waren die Erfinder in der Lage, die Natur und die Charakteristika von bisher unbekannten Peptiden, die durch Tumorzellen von überexprimierten TAAs präsentiert werden, offenzulegen, zum Beispiel Vimentin, Matrix Metalloproteinase 7, eukaryotischer Translation Elongation Factor 1 alpha 1 und Nicotinamide N-methyltransferase. Diese Beobachtung stimmt mit den immunohistochemischen Daten (1 und 4) überein und zeigt, dass HLA-Klasse-II positive Tumorzellen und infiltrierende Leukozyten in den analysierten Proben vorhanden waren und dass die eluierten Peptide von Antigenen abstammen, die in diesen verschiedenen Zelltypen überexprimiert werden.
Um die Peptide der TAAs zu identifizieren, verglichen die Erfinder die Quellproteine für die einzelnen Liganden mit überexprimierten Genen, detektiert durch Microarray-Analyse der Tumore (Weinschenk, T., C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic, and H. G. Rammensee. 2002. Integrated functional genomics approach for the design of Patient-individual antitumor vaccines. Cancer Res. 62: 5818-5827; Krüger, T., O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Müller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Lessons to be learned from primary renal cell carcinomas: novel tumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. Cancer Immunol. Immunother). Die Erfinder identifizierten ein Peptid des Insulin-like Growth Factor Binding Proteins 3, IGFBP3_166-181 bei RCC190. Zusätzlich wurden zwei Varianten dieses Peptides, IGFBP3_169-181 und IGFBP3_169-184, welche dasselbe Kernsequenzmotiv enthalten, das sowohl nötig als auch ausreichend ist, die Bindung an HLA-DRB1·0101 zu ermöglichen (zur Referenz, siehe Tab. 1), bei TCC 108 gefunden. Aus demselben Tumor konnte ein Peptid der Matrix Metalloproteinase 7, MMP7_247-262 isoliert werden (Tab. 1). Auf dem mRNA-Level war MMP7 in 13 und IGFBP3 in 22 der 23 analysierten RCC überexprimiert (Daten nicht gezeigt). Insgesamt wurden aus den anfänglich 453 identifizierten Peptidsequenzen (nicht gezeigt) die zugrunde liegenden Antigene für 49 Peptide (SEQ ID Nos. 1-49) entweder durch die Experimente der Erfinder (Daten in diesem Dokument enthalten) oder durch Andere als tumorassoziiert identifiziert, (Miyamoto, S., K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, and A. Ochiai. 2004. Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulin-like growth factor binding Protein 3. Cancer Res. 64: 665-671; Sumi, T., T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima, and O. Ishiko. 2003. Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. Oncol. Rep. 10: 567-570; Cheung, C. W., D. A. Vesey, D. L. Nicol, and D. W. Johnson. 2004. The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regulation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell proliferation. Kidney Int. 65: 1272-1279; Hao, X., B. Sun, L. Hu, H. Lahdesmaki, V. Dunmire, Y. Feng, S. W. Zhang, H. Wang, C. Wu, H. Wang, G. N. Fuller, W. F. Symmans, I. Shmulevich, and W. Zhang. 2004. Differential gene and protein expression in primary breast malignancies and their lymph node metastases as revealed by combined cDNA microarray and tissue microarray analysis. Cancer 100: 1110-1122; Helmke, B. M., M. Polychronidis, A. Benner, M. Thome, J. Arribas, and M. Deichmann. 2004. Melanoma metastasis is associated with enhanced expression of the syntenin gene. Oncol. Rep. 12: 221-228; Hofmann, H. S., G. Hansen, G. Richter, C. Taege, A. Simm, R. E. Silber, and S. Burdach. 2005. Matrix metalloproteinase-12 expression correlates with local recurrence and metastatic disease in non-small cell lung cancer patients. Clin. Cancer Res. 11: 1086-1092; Kamai, T., T. Yamanishi, H. Shirataki, K. Takagi, H. Asami, Y. Ito, and K. Yoshida. 2004. Overexpression of RhoA, Rac1, and Cdc42 GTPases is associated with progression in testicular cancer. Clin. Cancer Res. 10: 4799-4805; Koninger, J., N. A. Giese, F. F. di Mola, P. Berberat, T. Giese, I. Esposito, M. G. Bachem, M. W. Buchler, and H. Friess. 2004. Overexpressed decorin in pancreatic cancer: potential tumor growth inhibition and attenuation of chemotherapeutic action. Clin. Cancer Res. 10: 4776-4783; Mori, M., H. Shimada, Y. Gunji, H. Matsubara, H. Hayashi, Y. Nimura, M. Kato, M. Takiguchi, T. Ochiai, and N. Seki. 2004. S100A11 gene identified by in-house cDNA microarray as an accurate predictor of lymph node metastases of gastric cancer. Oncol. Rep. 11: 1287-1293; Nagler, D. K., S. Kruger, A. Kellner, E. Ziomek, R. Menard, P. Buhtz, M. Krams, A. Roessner, and U. Kellner. 2004. Up-regulation of cathepsin X in prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasia. Prostate 60: 109-119; Nanda, A., P. Buckhaults, S. Seaman, N. Agrawal, P. Boutin, S. Shankara, M. Nacht, B. Teicher, J. Stampfl, S. Singh, B. Vogelstein, K. W. Kinzler, and C. B. St. 2004. Identification of a binding partner for the endothelial cell surface proteins TEM7 and TEM7R. Cancer Res. 64: 8507-8511; Patel, I. S., P. Madan, S. Getsios, M. A. Bertrand, and C. D. MacCalman. 2003. Cadherin switching in ovar ian cancer Progression. Int. J. Cancer 106: 172-177; Santelli, G., D. Califano, G. Chiappetta, M. T. Vento, P. C. Bartoli, F. Zullo, F. Trapasso, G. Viglietto, and A. Fusco. 1999. Thymosin beta-10 gene overexpression is a general event in human carcinogenesis. Am. J. Pathol. 155: 799-804; Schneider, D., J. Kleeff, P. O. Berberat, Z. Zhu, M. Korc, H. Friess, and M. W. Buchler. 2002. Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells. Biochim. Biophys. Acta 1588: 1-6; Welsh, J. B., L. M. Sapinoso, S. G. Kern, D. A. Brown, T. Liu, A. R. Hauskin, R. L. Ward, N. J. Hawkins, D. I. Quinn, P. J. Russell, R. L. Sutherland, S. N. Breit, C. A. Moskaluk, H. F. Frierson, Jr., and G. M. Hampton. 2003. Large-scale delineation of secreted Protein biomarkers overexpressed in cancer tissue and serum. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A 100: 3410-3415; Xie, D., J. S. Sham, W. F. Zeng, L. H. Che, M. Zhang, H. X. Wu, H. L. Lin, J. M. Wen, S. H. Lau, L. Hu, and X. Y. Guan. 2005. Oncogenic role of clusterin overexpression in multistage colorectal tumorigenesis and Progression. World J. Gastroenterol. 11: 3285-3289). Beispielhafte Analyse des immunstimulierenden Potentials der Peptide, die an gewöhnliche HLA-DR-Allele binden, zeigt die Existenz von Antigen-spezifischen CD4-positiven T-Zellen gegen IGFBP3_169-181 and MMP7_247-262:
Promiskuitive Bindung der beispielhaften SEQ ID No. 1 an verschiedene HLA-DR-Allele kann durch verschiedene unabhängige Methoden gezeigt werden: Liganden von bestimmten MHC/HLA-Molekülen tragen an bestimmten Positionen ihrer Primärsequenz chemisch verwandte Aminosäuren, was eine Definition eines Peptidmotives für jedes MHC/HLA-Allel ermöglicht (Falk K, Rotzschke O, Stevanovic S, Jung G, Rammensee HG. Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules. Nature. 1991; 351(6324): 290-6). SYFPEITHI benutzt Motivmatrizen, die von verfeinerten Motiven abgeleitet sind und exklusiv auf natürlicher Ligandenanalyse durch Edmanabbau und Tandemmassenspektroskopie basieren. Diese Matrizen erlauben die Vorhersage von Peptiden einer gegebenen Proteinsequenz, die auf MHC-Klasse-I oder Klasse-II-Molekülen präsentiert werden (Rotzschke O, Falk K, Stevanovic S, Jung G, Walden P, Rammensee HG. Exact prediction of a natural T-cell epitope. Eur J Immunol. 1991; 21(11): 2891-4).
Durch die Anwendung der Vorhersageprinzipien des SYFPEITHI Algorithmus (Rammensee, H. G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. 1997. MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany; Rammensee H, Bachmann J, Emmerich NP, Bachor OA, Stevanovic S. SYFPEITHI: database for MHC ligands and Peptide motifs. Immunogenetics. 1999; 50(3-4): 213-9) an die oben genannte beispielhafte Peptidsequenz (SEQ ID No. 1) wur de die Bindung der SEQ ID No. 1 an verschiedene verbreitete HLA-DR-Allele (siehe Tab. 7) gerankt. Der Algorithmus wurde erfolgreich verwendet, um Klasse-I und Klasse-II-Epitope von verschiedenen Antigenen, z. B. des menschlichen TAA TRP2 (Vorhersage eines HLA-Klasse-I-Liganden) (34) und SSX2 (Vorhersage eines HLA-Klasse-II-Liganden) (Neumann F, Wagner C, Stevanovic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt W, Pfreundschuh M. Identification of an HLA-DR-restricted peptide epitope with a promiscuous binding pattern derived from the cancer testis antigen HOM-MEL-40/SSX2. Int J Cancer. 2004; 112(4): 661-8) vorherzusagen. Der Grenzwert für eine signifikante Bindung wurde basierend auf der Analyse von Bindungswerten für zuvor veröffentlichte promiskuitiv bindende HLA-DR Peptidliganden auf 18 oder höher definiert. Promiskuitives Binden ist definiert als Bindung eines Peptides mit einer guten Bindungsstärke, wie sie durch einen Wert von 18 oder höher an zwei oder mehrere verschiedene HLA-DR-Allele in dem SYFPEITHI Test andeutet. Die am weitesten verbreiteten HLA-DR-Allele sind in Tab. 7 dargestellt. Die Loci der HLA-A und HLA-DR sind in einem Kopplungsungleichgewicht (linkage disequilibrium), was zu Kombinationen von HLA-A2 und spezifischen HLA-DRs führt, die im Vergleich zu anderen bevorzugt werden. Die HLA-DR Gentypen der Quelltumoren wurden analysiert und in beiden Fällen als HLA-DRB1·11 und DRB1·15 bestätigt. Die bevorzugten Ankeraminosäurereste für die am weitesten verbreiteten HLA-Klasse-II-Allele (DRB1·0101, DRB1·0301, DRB1·0401, DRB1·0701, DRB1·1101, und DRB1·1501) sind in Tab. 4 dargestellt. Zum Beispiel bindet das HLA-Klasse-II-Allei DRB1·0301 in seiner Bindungsfurche bevorzugt Peptide, die über spezifische Aminosäurereste in den Positionen 1, 4, 6 und 9 von dem N- zu dem C-terminalen Ende der Kernsequenz eines jeden gegebenen Peptides verfügen. Spezifisch zeigt DRB1·0301 eine gute Bindung, wenn die Kernsequenz eines Peptides sowohl einen Glutamatrest (D) an Position 4 als auch entweder L, I, F, M oder V an Position 1, als auch entweder K, R, E, Q oder N an Position 6, als auch entweder Y, L oder F an Position 9 trägt.
Tab. 4: Peptidmotive von verbreiteten HLA-DR-Allelen.
Gezeigt werden die Ankeraminosäuren im Einbuchstabencode an den entsprechenden Bindungstaschen.
Die Ergebnisse der in silico Analyse basierend auf den Computeralgorithmen für die Vorhersage von Wechselwirkungen zwischen HLA-Molekülen und Peptidsequenzen, bereitgestellt durch www.syfpeithi.de, deuten an, dass das Peptid MMP7_247-262 SEQ ID No. 1 promiskuitiv an verschiedene HLA-DR-Allele bindet. Gemäß den Ergebnissen der Vorhersageanalyse er hält das Peptid mit der SEQ ID No. 1 eine hohe Bindungswertung für die Wechselwirkung mit DRB1·1101, DRB1·1501, DRB1·0401, DRB1·0301 und DRB1·0101 (Tab. 7). Die in diesem Test auf Wechselwirkungen zwischen der Aminosäuresequenz des Peptides und der Bindungsstärke untersuchten HLA-DR-Allele decken mindestens 69,6% der HLA-A2 positiven kaukasischen Bevölkerung ab (Mori M, Beatty PG, Graves M, Boucher KM, Milford EL. HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry. Transplantation. 1997; 64(7): 1017-27). Im Moment stehen keine Daten zur Häufigkeit von HLA-DR15 zur Verfügung, das Allel wurde für die Berechnung der Abdeckung HLA-A2 der positiven kaukasischen Bevölkerung nicht in Betracht gezogen. Somit ist es sehr wahrscheinlich, dass die Abdeckung der Bevölkerung durch SEQ ID No. 1 sogar höher als 69,6% ist, was darauf hin deutet, dass das Peptid eine herausragende Perspektive als Kandidat für die Entwicklung von pharmazeutischen Abmischungen für die Mehrzahl der Krebspatienten hat.
Jedoch führt die Anwendung von Vorhersagealgorithmen nur dann zu schlüssigen Ergebnissen, wenn die Ergebnisse der in silico Analysen mit experimentellen Beweisen für die promiskuitive Bindung kombiniert werden, da es zuvor von Anderen gezeigt wurde, denen es nicht gelang, eine Immunantwort, die von einer Peptidsequenz ausgelöst wurde, welche als guter Binder vorhergesagt wurde, zu zeigen (Bohm CM, Hauski ML, Stefanovic S, Rammensee HG, Stein H, Taylor-Papadimitriou J, Riecken EO, Hanski C. Identification of HLA-A2-restricted epitopes of the tumor-associated antigen MUC2 recognized by human cytotoxic T-cells. Int J Cancer. 1998; 75(5): 688-93). Die Vorhersagen von Artifakten, wie in dem eben genannten Fall, kann prinzipiell nicht ausgeschlossen werden, da der Algorithmus, der für die Vorhersage verwendet wird, nicht in Betracht zieht, dass eine Peptidsequenz nicht unbedingt in einer in vivo Situation generiert wird (in lebenden Zellen). Experimentelle Bestätigung kann durch das Sammeln von in vitro Daten aus biologischen Tests, z. B. durch Nachweis des Vorhandenseins oder des Fehlens von Immunogenität eines Peptides, erhalten werden. Daher wurde die experimentelle Bestätigung für die promiskuitive Bindung der SEQ ID No. 1 durch das Sammeln solcher in vitro Daten erhalten. Um die Peptide auf ihre immunostimulatorische Kapazität durch in vitro T-Zell-Priming Experimente zu testen, wurden die kürzesten Varianten ("Kernsequenz") der IGFBP3 Peptide, IGFBP3_169-181 und des MMP7 Peptids, MMP7_247-262, benutzt.
Um Antigen-spezifische CD4-positive T-Zellen zu generieren und die Peptide auf promiskuitives Binden zu testen, wurden die PBMCs von 4 gesunden Spender mit unterschiedlichen HLA-DR-Allelen (2), ein von ihnen trägt RB1·1101, mit Peptid-gepulsten autologen DCs stimuliert. Zusätzlich wurde das Peptid CCND1_198-212, von dem bekannt ist, dass es ein T-Zell-Epitop ist, als positive Kontrolle verwendet (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class 11 targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34: 3644-3651). Als Auswertungssysteme für die Generation von Antigen-spezifischen CD4-positiven T-Zellen wurden die IFNγ Werte mittels Flusszytometrie bestimmt. Die T-Zellen wurden nach der dritten und vierten wöchentlichen Stimulation durch intrazelluläre IFNγ Färbung plus CD4-FITC und CD8-PerCP Färbung analysiert, um den Prozentsatz der IFNγ-produzierenden Zellen in spezifischen T-Zell-Subpopulationen zu bestimmen. In allen Experimenten wurden Stimulationen mit einem irrelevanten Peptid und ohne Peptid als negative Kontrollen durchgeführt. Die IFNγ Antwort wurde als positiv betrachtet, wenn der Prozentsatz der IFNγ-produzierenden CD4-positiven T-Zellen im Vergleich mit den Negativkontrollen zweifach höher war (Horton, H., N. Russell, E. Moore, I. Frank, R. Baydo, C. Havenar-Daughton, D. Lee, M. Deers, M. Hudgens, K. Weinhold, and M. J. Mc Elrath. 2004. Correlation between interferon-gamma secretion and cytotoxicity, in virus-specific memory T-cells. J. infect. Dis. 190: 1692-1696).
In drei der vier Spender waren die Erfinder in der Lage, spezifische CD4-positive T-Zellen für beide Peptide zu erzeugen (2). In Spender 4 konnte keine T-Zellantwort nach irgendeiner Stimulation beobachtet werden. In Spender 1 wurden 0,05% bis 0,1% (3) IFNγ-produzierender CD4-positiver T-Zellen in allen sieben Stimulationsversuchen nach der dritten Stimulation mit dem Peptid IGFBP3_169-181 gefunden. Diese T-Zellen konnten in den meisten Fällen durch eine weitere Stimulationsrunde auf 0,09% bis 0,13% vermehrt werden. IFNγ-produzierende CD4-positive T-Zellen spezifisch für das Peptid IGFBP3_169-181 wurden auch in Spender 2 und Spender 3 mit maximalen Frequenzen von 0,05% und 0,07% IFNγ-produzierender CD4-positiver T-Zellen beobachtet.
Spender 1, 2 und 3 zeigten auch CD4⁺ T-Zellen, die reaktiv auf das Peptid MMP7_247-262 sind. Die größte Häufigkeit von IFNγ-produzierenden CD4-positiven T-Zellen, spezifischen für das MMP7 Peptid, wurden in Spender 1 und 2 gefunden. Spender 1, 2 und 3 zeigten IFNγ Antworten auf das Peptid CCND1_198-212, das bereits als ein MHC-Klasse-II T-Zell-Epitop be schrieben wurde (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34: 3644-3651).
Somit sind die Peptide aus IGFBP3, MMP7 und CCND1 promiskuitive HLA-Klasse-II-Binder, die in der Lage sind, CD4-positive T-Zellantworten in drei von vier gesunden Spendern mit unterschiedlichen HLA-DR-Allelen auszulösen. Wenn die HLA-Allele der zwei Tumorpatienten, von denen die IGFBP3 und MMP7 Peptide erhalten wurden, mit denen der (von) vier gesunden Spender verglichen wird, wird es deutlich, dass die Peptide durch HLA-DRB1·01, HLA-DRB1·04 und HLA-DRB1·11 präsentiert werden. Alle drei genannten HLA-DR-Allotypen tragen einen Glycinaminosäurerest an Position 86 und einen Aspartamsäurerest an Position 57 ihrer (3 Ketten (siehe www.anthonynolan.com/HIG). Deshalb besitzen sie sehr ähnliche Bindungseigenschaften in ihren Bindungstaschen P1 und P9 (Rammensee, H. G., J. Bachmann, and S. Stevanovic. 1997. MHC Ligands and Peptide Motifs. Springer-Verlag, Heidelberg, Germany). Für das Peptid CCND1_198-212 ist bekannt, dass ein T-Zell-Epitop durch HLA-DRB1·0401 und HLA-DRB1·0408 präsentiert wird (Dengjel, J., P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee, and S. Stevanovic. 2004. Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. Eur. J. Immunol. 34: 3644-3651), dies ist weiterhin gültig. Spender 4 trägt HLA-DRB1·0318 und HLA-DRB1·1401, Allele mit Peptidmotiven, die sich in ihrer primären Aminosäuresequenz von den beta-Ketten der oben Beschriebenen unterscheiden. Dies könnte erklären, warum es nicht möglich war, bei diesem Spender eine T-Zellantwort gegen diese beiden Peptide auszulösen.

Interessanterweise wurden in zwei Spender IFNγ-produzierende CD8-positive Killer-T-Zellen nach Stimulationen mit den drei Peptiden gefunden, dies gilt besonders für den Spender 3, aber in geringerem Ausmaß auch für den Spender 1 (Daten nicht gezeigt). Tab. 5:

	Masse
Fragment	[M+H]+	Aminosäuresequenz
b2	216,1	SQ
y4	447,3	GKRS
y6	723,4	LYGKRS
y7	851,5	KLYGKRS
y8	979,6	QKLYGKRS
y9	1092,6	IQKLYGKRS
y10	1149,7	GIQKLYGKRS
yll	1277,8	KGIQKLYGKRS
y 12	1390,8	IKGIQKLYGKRS
y13	1505,9	DIKGIQKLYGKRS
y14	1620,9	DDIKGIQKLYGKRS
R	129,1	immonium R

Tab. 6:

HLA-Typisierung			Häufigkeit
	HLA-
HLA-A	DR	[%]
2	1	8.8
2	2	14.9
2	3	6.1
2	4	21.3
2	5	1.2
2	6	15.2
2	7	13.0
2	8	4.2
2	9	1.2
2	10	1.4
2	11	8.7
2	12	2.6
2	n.a.	1.4

Tab. 6: Häufigkeit der Haplotypisierung der kaukasischen nordamerikanischen Bevölkerung.
Gezeigt ist die serologische Haplotypisierung. "n.a." steht für nicht bestimmt.
Tab. 7: Bindungswerte von SEQ ID No. 1 an verbreitete HLA-DR-Allele
Gezeigt werden die Bindungswerte für die SEQ ID No. 1 und SEQ ID Nr. 25 SYFPEITHI für die am weitesten verbreiteten HLA-DRB1 Allele in kaukasischen Bevölkerungen. Die Häufigkeit der korrespondierenden serologischen Haplotypen der HLA-A2 positiven Kaukasier sind in Klammern angegeben. Die Bindung der Peptide an HLA-Klasse-II-Moleküle wird als ausreichend gut angesehen, wenn Bindungsstärke gleich oder größer 18 ist.

Antigen DRB1·Allele

0101 (8.8%) 0301 (6.1%) 0401 (21.3%) 0701 (13.0 %) 1101 (8.7%) 1501 (n.a.%)

SEQ ID No. 1 35 18 20 14 26 20

SEQ ID No.

25 28 28 20 18 26 18
SEQUENZLISTE

Claims

Tumorassoziiertes Peptid von zwischen 9 und 30 Aminosäuren, umfassend eine Sequenz nach SEQ ID Nr. 43.
Tumorassoziiertes Peptid nach Anspruch 1, wobei das Peptid aus der Aminosäuresequenz nach SEQ ID Nr. 43 besteht.
Tumorassoziiertes Peptid nach Anspruch 1 oder 2, das die Fähigkeit aufweist, an ein Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse-II, insbesondere an HLA-DRB1·0101, zu binden.
Tumorassoziiertes Peptid nach Anspruch 3, das die Fähigkeit aufweist, an mindestens ein weiteres Molekül des menschlichen Haupthistokompatibilitätskomplex (MHC) Klasse-II zu binden.
Tumorassoziiertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4, wobei das Peptid Nicht-Peptidbindungen einschließt.
Tumorassoziiertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 5, wobei das Peptid ein Fusionsprotein ist, insbesondere umfassend N-terminale Aminosäuren der HLA-DR antigenassoziierten invarianten Kette (Ii).
Nukleinsäure, die ausschließlich für ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6 kodiert.
Nukleinsäure nach Anspruch 7 die DNA, cDNA, PNA, CNA, RNA oder Kombinationen davon ist.
Expressionsvektor, der in der Lage ist, eine Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 zu exprimieren.
Wirtszelle umfassend eine Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 9.
Wirtszelle nach Anspruch 10, die eine rekombinante RCC- oder Awells-Zelle ist.
Verfahren zur Herstellung eines tumorassoziierten Peptids nach einem der Ansprüche 1 bis 6, wobei das Verfahren Kultivieren der Wirtszelle nach Anspruch 10 oder 11 und Isolieren des Peptids aus der Wirtszelle oder ihrem Kulturmedium umfasst.
Pharmazeutische Zusammensetzung umfassend ein tumorassoziiertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, eine Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 oder einen Expressionsvektor nach Anspruch 9 und einen pharmazeutisch akzeptablen Träger.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13, weiter umfassend mindestens ein zusätzliches tumorassoziiertes Peptid von zwischen 9 und 30 Aminosäuren, umfassend mindestens eine Sequenz nach SEQ ID Nr. 1 bis SEQ ID Nr. 42 und SEQ ID Nr. 44 bis SEQ ID Nr. 49.
Pharmazeutische Zusammensetzung nach Anspruch 13 oder 14 in Form einer Krebsvakzine, gegebenenfalls umfassend mindestens ein geeignetes Adjuvans.
Tumorassoziiertes Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 6, eine Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 oder ein Expressionsvektor nach Anspruch 9 zur Verwendung in der Medizin.
Verwendung eines tumorassoziierten Peptides nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 oder eines Expressionsvektors nach Anspruch 11 zur Herstellung eines Medikaments zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 angegeben exprimieren.
Verwendung eines tumorassoziierten Peptides nach einem der Ansprüche 1 bis 6 oder einer Nukleinsäure nach Anspruch 7 oder 8 oder eines Expressionsvektors nach Anspruch 9 zur Herstellung eines Medikaments zur Induzierung einer Immunantwort, insbesondere einer zellulären Immunantwort, noch spezieller einer T-Zell-vermittelten Immunantwort gegen Zellen von soliden Tumoren, wobei die Zellen ein menschliches MHC Klasse-II-Molekül auf ihrer Oberfläche exprimieren, und ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 angegeben präsentieren.
In vitro Verfahren zur Produktion aktivierter zytotoxischer T-Lymphozyten (CTL), das Verfahren umfassend das Kontakt in vitro von CTL mit Antigen-beladenen menschlichen Klasse-II MHC-Molekülen exprimiert an der Oberfläche einer geeigneten Antigenpräsentierenden Zelle für eine ausreichende Zeit, um besagte CTL in einer Antigenspezifischen Art und Weise zu aktivieren, wobei das Antigen ein Peptid nach einem der Ansprüche 1 bis 4 ist.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei das Antigen auf ein Klasse-II MHC-Molekül beladen ist, welches an der Oberfläche einer geeigneten Antigen-präsentierenden Zelle exprimiert wird durch in Kontakt bringen einer ausreichenden Menge des Antigens mit der Antigen-präsentierenden Zelle.
Verfahren nach Anspruch 19, wobei die Antigen-präsentierende Zelle einen Expressionsvektor nach Anspruch 9 umfasst.
Verfahren nach einem der Ansprache 19 bis 21, wobei das Klasse II MHC Molekül HLA-DRB1·0101 ist.
Aktivierte zytotoxische T-Lymphozyten (CTL), hergestellt nach der Methode nach einem der Ansprüche 19 bis 22, welche selektiv eine Zelle erkennen, die abberant ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 exprimiert.
T-Zellrezeptor (TCR), der eine Zelle erkennt, die aberrant ein Polypeptid exprimiert, welches eine Aminosäuresequenz nach einem der Ansprüche 1 bis 4 enthält, wobei der TCR von einer T-Lymphozyte (CTL) nach Anspruch 23 erhalten wurde, oder ein funktionell äquivalentes Molekül zu dem TCR.
Nukleinsäure, die einen T-Zellrezeptor (TCR) nach Anspruch 24 kodiert.
Expressionsvektor, fähig einen T-Zellrezeptor nach Anspruch 24 zu exprimieren.
Verwendung von zytotoxischen T-Lymphozyten, wie in Anspruch 23 definiert, zur Herstellung eines Medikaments zur Abtötung von Zielzellen in einem Patienten, wobei die Zielzellen aberrant ein Polypeptid umfassend eine Aminosäuresequenz wie in einem der Ansprüche 1 bis 4 angegeben exprimieren.