EA013876B1 - Опухолеассоциированные пептиды, беспорядочно связывающиеся с молекулами класса ii человеческого лейкоцитарного антигена (hla) - Google Patents

Abstract

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам и молекулам, а также клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным пептидным эпитопам Т-хелперных клеток, в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к 49 новым пептидным последовательностям, полученным из молекул HLA класса II человеческих опухолевых клеточных линий, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов.

Description

Настоящее изобретение относится к иммунотерапевтическим методам и молекулам, а также к клеткам для применения в иммунотерапевтических методах. В частности, настоящее изобретение относится к иммунотерапии рака, в частности рака печени и толстой кишки. Настоящее изобретение относится в дальнейшем к опухолеассоциированным пептидным эпитопам Т-хелперных клеток в отдельности или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, которые служат как активные фармацевтические ингредиенты для композиций вакцины, которая стимулирует противоопухолевые иммунные ответы. В частности, настоящее изобретение относится к 49 новым пептидным последовательностям, полученным из молекул НЬЛ класса II человеческих опухолевых клеточных линий, которые могут быть использованы в вакцинных композициях для вызывания противоопухолевых иммунных ответов.

В соответствии с целями настоящего изобретения все цитаты описания включены в их целостности путем ссылки.

Уровень техники

Стимуляция иммунных ответов находится под воздействием присутствия антигенов, распознающихся иммунной системой хозяина как чужеродные. Открытие существования опухолеассоциированных антигенов повысило сейчас возможность использования иммунной системы хозяина для вмешательства в рост опухоли. Различные механизмы объединения обеих ветвей иммунной системы, как гуморальной, так и клеточной, исследуются в настоящее время для иммунотерапии рака.

Специфические элементы клеточных иммунных ответов способны к специфическому распознаванию и уничтожению опухолевых клеток. Изоляция цитотоксических Т-клеток (ЦТЛ) из популяций опухоль-инфильтрирующих клеток или из периферической крови предполагает, что такие клетки играют важную роль в естественной иммунной защите против рака (Сйссусг е! а1., Аппа1к Ν.Υ. 8с1. Асаб. 8с1. 1993, 690:101-112). В частности, 008-положительные Т-клетки (ТСЭ8⁺), которые распознают молекулы I класса главного комплекса гистосовместимости (МНС) с пептидами, имеющими обычно 8-10 остатков, образованных из белков, находящихся в ядре или цитозоли, играют важную роль в этом ответе. Молекулы МНС человека называются также человеческими лейкоцитарными антигенами (НЬЛ).

Существуют два класса молекул МНС: молекулы МНС I класса, которые могут встречаться в большинстве клеток, имеющих ядро, которые презентируют пептиды, образующиеся из протеолитического расщепления эндогенных белков и крупных пептидов. Молекулы МНС II класса могут встречаться только на профессиональных антигенпрезентирующих клетках (АПК) и презентировать пептиды экзогенных белков, которые поглощаются АПК в период эндоцитоза и впоследствии процессируются. Комплексы из пептида и МНС класса I распознаются СЭ8-положительными цитотоксическими Т-лимфоцитами, комплексы из пептида и МНС класса II распознаются СЭ4-положительными хелперными Т-клетками.

СЭ4-положительные хелперные Т-клетки играют важную роль в управлении эффекторными функциями противоопухолевых Т-клеточных ответов и поэтому идентификация 004-положительных Т-клеточных эпитопов, образованных из опухолеассоциированных антигенов (ТАА), может быть чрезвычайно важна для разработки фармацевтических препаратов для инициации противоопухолевых иммунных ответов (КоЬауакЫ, Н., Ош1уа, В., Κυίζ, М., Ниайе, Е., 8агоЬе, Р., Ьакайе, ЕЕ, Непщ/, М., 8апдго, В., Рпе1о. 1., Воггак-0иек1а, Е. апб 0ейк, Е. 2002. Иепййсайоп о! ап апйдешс ерйоре Гог йе1рег Т 1утрНосу1ек Ггот сагсшоешЬгуошс апйдеп. 01ш. Сапсег Век. 8:3219-3225, 6п)айс, 8., А1апаскоую, Ώ., 1адег, Е., Ма!кио, М., 8е1уакцтаг, А., А11огк1, Ν.Κ., Мак1, В.О., Оцроп!, В., Вй!ег, О., 011еп Υ.Τ., Кпи1й, А. апб О1б Ь.Е 2003. 8шуеу оГ иа!ига11у осситпд 0Ό4' Т-се11 гекропкек адашк! ΝΥ-Ε8Ο-1 ίη сапсег райеп1к: 0огге1айои \νίΐ1ι апбЬобу гекропкек. Ргос. ИаИ. Асаб. 8сг И.8.А. 100(15):8862-7).

На моделях млекопитающих животных, например мышах, было показано, что даже при отсутствии эффекторных клеток цитотоксических Т-лимфоцитов (т.е. 0О8-положительных Т-лимфоцитов),

0О4-положительных Т-клеток достаточно для ингибирования визуализирования опухолей посредством ингибирования ангиогенеза при секреции интерферон-гамма (ΓΕΝ-γ) (Ош, Ζ. апб В1апкепк1ет, Т. 2000. 0Ό4' Т-се11-теб1а1еб 1итог ге^есПоп щуокек 1пЫЬ1йоп оГ апдюдепещк 1йа1 1к берепбеп! оп ШИ датта гесер!ог ехргеккюп Ьу попйета1оро1ейс се11к. [ттипйу. 12:677-686). К тому же было показано, что 0О4-положительные Т-клетки, распознающие пептиды из опухолеассоциированных антигенов, презентированные молекулами НЬА класса II, могут препятствовать опухолевой прогрессии посредством индукции ответов антител (АЬ) (Кеппебу, В.О., 8йеагег, М.Н., ^айк, А.М. апб Впд1Ц В.К. 2003. 0Ό4' Т 1утр1юсу1ек р1ау а спбса1 го1е ш апйЬобу ргобисйоп апб 1итог 1ттипйу адатк! к1т1ап У1гик 40 1агде 1итог апбдеп. Оапсег Век. 63:1040-1045). В отличие от опухолеассоциированных пептидов, связывающихся с молекулами НЬА класса I, до сих пор было описано лишь небольшое число опухолеассоциированных лигандов класса II (ет'ет'ет.сапсепттцпйу.огд, те^ет.куГре11Ы.бе). Так как конститутивная экспрессия молекул НЬА класса II обычно ограничена клетками иммунной системы (Мас1, В., 81е1т1е, V.,

Маг1и^-8оба Е. апб Вейй, ^. 1996. Ведц1айоп оГ МН0 с1акк II депек: 1еккопк Ггот а б1кеаке. Аппи. Веу. !ттипо1. 14:301-331), то возможность изоляции пептидов класса II напрямую из первичных опухолей считалась невозможной. Поэтому было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскад реакций по процессированию II класса антигенпрезентирующих клеток (АПК), например инкубация АПК с интересующим антигеном для его поглощения, процессинга и презентации (01аих, Р.,

- 1 013876

Уап1оште, V., 8!гооЬап1, V., ТЫе1етапк, К., Сопйа1к, 1., Ьийеп, К., Еддегтоп!, А.М., Вооп, Т. апб уап бег Вгиддеп Β.Ρ. 1999. ИепОйсаНоп о! МАСЕ-3 ерйорек ргекеШеб Ьу НЬА-ОВ то1еси1ек 1о СЭ4(+) Т 1утр1юсу1ек. 1. Ехр. Меб. 189:767-778) или трансфекция клеток генами или мини-генами, кодирующими интересующий антиген, и слитых с инвариантной цепью, которая опосредует транслокацию антигена в лизосомный компартмент МНС класса II по процессингу и погрузке.

Для того чтобы пептид инициировал (вызывал) клеточный иммунный ответ, он должен связываться с молекулой МНС. Этот процесс зависит от аллеля молекулы МНС и специфических полиморфизмов аминокислотной последовательности пептида. Пептиды, связывающиеся с МНС класса I, имеют обычно 8-10 остатков в длину и содержат два зарезервированных остатка (домен) в их последовательности, которые взаимодействуют с соответствующей связывающей бороздкой молекулы МНС.

При отсутствии воспаления экспрессия молекул МНС II класса преимущественно рестриктирована по клеткам иммунной системы, в особенности профессиональным антигенпрезентирующим клеткам (АПК), например моноцитам, образованным из моноцитов клеткам, макрофагам, дендритным клеткам.

Антигены, которые распознаются опухолеспецифическими цитотоксическими Т-лимфоцитами, т.е. их эпитопами, могут быть молекулами, образованными из всех классов белков, таких как энзимы, рецепторы, факторы транскрипции и т.д. Кроме того, опухолеассоциированные антигены могут, например, также присутствовать только в опухолевых клетках, например, как продукты мутировавших генов или альтернативных открытых рамок считывания (ОРС) или белкового сплайсинга (У|дпегоп Ν., 8!гооЬап1 V., Сйарио 1., Оотк А., Эедюуапш С., Моге1 8., уап бег Вгиддеп Р., Вооп Т., Vаη беп Еупбе В.1. Ап апбдешс рерОбе ргобисеб Ьу рерббе крйстд щ Не рго!еакоте. 8аепсе. 2004 Арг. 23; 304 (5670):587-90). Другой важный класс опухолеассоциированных антигенов представлен тканеспецифическими структурами, такими как антигены СТ (раковый тестикул), которые экспрессированы в различных видах опухолей и здоровой ткани тестикул.

Были выявлены различные опухолеассоциированные антигены. Затем много усилий было потрачено на исследования по идентификации дополнительных опухолеассоциированных антигенов. Некоторые группы опухолеассоциированных антигенов, также именуемые в области техники как опухолеспецифические антигены, являются тканеспецифическими. Примеры включают, но не ограничиваются тирозиназой для меланомы, Р8А (простата-специфический антиген) и Р8МА (простата-специфический мембранный антиген) для рака простаты и хромосомными аномалиями (кроссовер), такими как Ьсг/аЬ1 в лимфоме. Тем не менее многие опухолеассоциированные антигены, которые были идентифицированы, встречаются во множестве видов опухолей и некоторые, такие как онкогенные белки и/или гены-супрессоры опухоли (обзор генов-супрессоров опухоли для почечного рака дается, например, у Ьшейап XV. М., ^аИйег М.М., 2Ьаг В. Т1е депебс Ьабк о! сапсег о! Не ктбпеу. 1. Иго1. 2003 Эес.; 170 (6 Р! 1):2163-72), которые фактически вызывают трансформационное явление, встречаются практически во всех видах опухолей. Например, нормальные клеточные белки, контролирующие рост и дифференциацию клетки, такие как р53 (которые являются примером гена-супрессора опухоли), гак, с-те1. тус, рКВ, УНЬ и НЕК-2/пеи, могут аккумулировать мутации, приводящие к активации экспрессии продуктов этих генов, делая их тем самым онкогенными (МсСабеу е! а1. Сапсег Кекеагсб. 1998. 15:58 2601-5; Όίκίκ е! а1. С1Ьа Роипб. 8утр. 1994, 187:198-211). Сапсег Кекеагсб. 1998, 15:58 2601-5; Όίκίκ е! а1. С1Ьа Роипб. 8утр. 1994,187:198-211). Эти мутантные белки могут быть мишенью опухолеспецифического иммунного ответа при многих видах рака.

Для того чтобы белки были узнаны цитотоксическими Т-лимфоцитами в качестве опухолеспецифического антигена и для того чтобы они были использованы в терапии, должны выполняться особые предварительные требования. Антиген должен быть экспрессирован преимущественно опухолевыми клетками, а не здоровыми тканями или в достаточно малом объеме. В дальнейшем желательно, чтобы соответствующий антиген не только присутствовал в одном виде опухоли, но также имел высокую концентрацию (например, число копий на клетку). Необходимо присутствие эпитопов в аминокислотной последовательности антигена, поскольку такой пептид (иммуногенный пептид), который образован из опухолеассоциированного антигена, должен вести т убго или т у1уо к Т-клеточному ответу.

До сих пор было описано множество стратегий по направлению антигенов в каскад реакций по процессингу II класса. Есть возможность инкубировать антигенпрезентирующие клетки с интересующим антигеном для его поглощения и процессирования (Сбаих, Р., Vаηΐοтте, V., 8бооЬап1, V., ТЫе1етапк, К., Собба1к, 1., Ьийеп, К., Еддегтоп!, А.М.Ь., Вооп, Т. & уап бег, В.Р. (1999), 1. Ехр. Меб. 189, 767-778). Другие стратегии используют белки слияния, которые содержат лизосомные последовательности-мишени, Такие белки слияния, экспрессированные в АПК, направляют антигены в отдел процессирования II класса (Магкк, М.8., Косбе, Р.А., уап Эоп8е1ааг, Е., '№ообги!!, Ь., Ре1егк, Р.1. & Вопйасто, 1.8. (1995), 1. Се11 Вю1. 131, 351-369, Робидие/, Р., Нагкшк, 8., Кеб^ше, 1.М., бе Регеба, 1.М. & VЫйοη, 1.Ь. (2001), 1. ^го1. 75, 10421-10430).

Т-хелперные клетки играют важную роль в управлении эффекторной функцией ЦТЛ в противоопухолевом иммунитете. Эпитопы Т-хелперных клеток, инициирующие ответы Т-хелперных клеток типа Т_Н1, поддерживают эффекторные функции СЭ8-положительных киллерных Т-клеток, которые включают цитотоксические функции, направленные против опухолевых клеток, проявляющих опухолеассоцииро

- 2 013876 ванные пептиды/МНС-комплексы на их клеточной поверхности. Таким образом, опухолеассоциированные пептидные эпитопы Т-хелперных клеток, одни или в комбинации с другими опухолеассоциированными пептидами, могут служить в качестве активных фармацевтических ингредиентов вакцинных композиций, которые стимулируют противоопухолевые иммунные ответы.

Основной задачей в разработке вакцины против опухолей является поэтому выявление и характеристика новых опухолеассоциированных антигенов и полученных из них иммуногенных Т-хелперных эпитопов, которые могут быть распознаны СЭД-положительными ЦТЛ. По этой причине целью настоящего изобретения является обеспечение новых аминокислотных последовательностей для таких пептидов, которые обладают способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II.

В соответствии с настоящим изобретением данная задача была решена обеспечением опухолеассоциированного пептида, выбранного из группы пептидов, содержащих по крайней мере одну последовательность в соответствии с любой из 8ЕО ГО № 1-49 из приложенного списка последовательностей, причем пептид обладает способностью связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса II, при условии, что пептид не является интактным человеческим опухолеассоциированным полипептидом.

В настоящем изобретении изобретатели демонстрируют то, что возможно изолировать и охарактеризовать пептиды, связывающиеся с молекулами НЬА класса II, напрямую из опухолей млекопитающих, предпочтительно из опухолей человека, предпочтительно солидных опухолей, например из почечноклеточных карцином и карцином толстой кишки. Инфильтрирующие моноциты экспрессировали молекулы МНС класса II в равной степени, как и опухолевые клетки, и, в дополнение, опухолевые клетки проявляли активацию нескольких цитокинов или хемокин-индуцированных генных продуктов, например интерферон-гамма-индуцированных генных продуктов.

Настоящее изобретение обеспечивает пептиды, образованные из антигенов, ассоциированных с генезом опухоли, и способность связываться в достаточной мере с молекулами НЬА II класса для инициации иммунного ответа человеческих лейкоцитов, в особенности лимфоцитов, в особенности Т-лимфоцитов, в особенности СИД-положительных Т-лимфоцитов, в особенности СИД-положительных Т-лимфоцитов, опосредующих иммунные ответы типа Т_Н1.

Пептиды образованы из опухолеассоциированных антигенов, в особенности опухолеассоциированных антигенов с функциями, например в протеолизе, ангиогенезе, росте клеток, регуляции клеточного цикла, делении клеток, регуляции транскрипции, регуляции трансляции, инвазии ткани, включая, например, опухолеассоциированные пептиды из матричной металлопротеиназы 7 (ММР7; 8ЕО ГО № 1) и связывающего инсулиноподобный фактор роста белка 3 (ЮЕВР3; 8ЕО ГО № 25).

В настоящем изобретении изобретатели обеспечивают также неопровержимую очевидность того, что опухолеассоциированные пептиды в достаточной мере связывающиеся беспорядочно с молекулами НЬА II класса, в особенности с аллелями НЬА II класса, которые генетически закодированы локусом НЬА ИЯ человеческого генома, способны вызывать иммунные ответы, опосредованные человеческими СИД-положительными Т-клетками. СИД-положительные Т-клетки были изолированы из периферийной крови человека, демонстрируя, что заявленные пептиды пригодны для инициации Т-клеточных ответов человеческой иммунной системы против выбранных пептидов пептидомы опухолевых клеток. Так как пептиды могут быть синтезированы химическим путем и могут быть использованы в качестве активных фармацевтических ингредиентов в фармацевтических препаратах, то пептиды, обеспечиваемые этим изобретением, могут быть использованы для иммунотерапии, предпочтительно для иммунотерапии рака.

В целях идентификации лигандов НЬА II класса из опухолеассоциированных антигенов (ТАА) для разработки основанной на пептидах иммунотерапии изобретатели попытались изолировать презентированные пептиды НЬА-ЭЯ напрямую из вырезанных солидных опухолей, в особенности почечноклеточной карциномы (ЯСС), о которой сообщалось, что она способна экспрессировать молекулы II класса (Оакб, О., ЕЬей, Т., Еш81аб, С.Ь., 8йе1п1е1б, I., Оотайг, А., АиШхку. аиб Ваибег И.Н. 1996. Ма.)ог ЫйосошраИЫШу сотр1ех с1акк I аиб с1акк II ехргеккюи ίη гепа1 се11 сагсшота аиб шоби1а1юи Ьу 1и1егГегои датта. I. Иго1. 155:361-367). Даже если большинство опухолевых клеток были негативными по классу II, современный уровень развития масс-спектрометров должен был обеспечить чувствительность, требуемую для идентификации пептидов II класса из минимального числа опухолевых клеток или инфильтрирующих лейкоцитов, которые, возможно, кросс-презентируют опухолеассоциированные антигены, или из стромальных клеток по периметру растущей опухоли.

Причинами для фокусировки внимания на ЯСС для демонстрации доказательства правильности концепции были следующие.

Диагноз ЯСС ставится ежегодно примерно 150 тысячам человек в мире, с данным заболеванием связан высокий уровень смертности, результатом чего являются приблизительно 78 тысяч смертей в год (Рау1оу1сй, С.Р. аиб 8с1ишб1 Ь.8. 200Д. 8еагсЫид Гог Не йегебйагу саикек оГ геиа1-се11 сагсшота. №11. Яеу. Саисег, Д:381-393). Если выявлены метастазы, то одногодичный коэффициент выживаемости сокращается примерно до 60% (1ета1, А., ТЕсай Я.С., Миггау, Т., ОйаГоог, А., 8атие1к, А., ^агб, Е., Ееиег Е.1. аиб Т1ии М.1. 200Д. Саисег 81а11811ск, 200Д. СА Саисег I. С1ш. 5Д:8-29), подчеркивая сильную беспомощность

- 3 013876 медицины при этом показании. Так как КСС является, вероятно, иммуногенной опухолью (ОНуег КТО, Мек!а А., Баглей М.1. А ркаке 2 к!ийу оГ кигуеШаисе ίη райеШк \νίΐ1ι ше1ак1айс гепа1 се11 сагсшота аий аккекктеи! οί гекроике οί киск раОегИк (о (Негару ои ргодгеккюи. Мо1 Вю1йег. 1988; 1:14-20. С1еауе М., Е1Ы1ай М., Егойе! Υ., е! а1. ШегГегои датта-1Ь сотрагей тейй р1асейо т те!ак1айс геиа1 се11 сагетота. N Еид1. 1. Мей. 1998; 338:1265), как было указано существованием опухолевых реагирующих и инфильтрирующих ЦТЛ (Пике. 1.Н., Каутаи, Р., А1ехаийег, 1., Ейшдег, М., ТиЬЬк, К.К., Соиие11у, К., Рои!ек, Е. аий Вико\\'кк| К. 1990. СйагасГеп/аНои οί (Не су1о1уйс асйуйу οί СЭ4-рок111уе аий СЭ8-рок111уе Штог-шЕНгайид 1утр1юсу1ек ш китаи геиа1 се11 сагстота. Саисег Кек. 50:2363-2370), то для разработки основанных на пептидах противоопухолевых вакцинаций были инициированы клинические исследования (\У|егеску 1., Мие11ег М., Вгоккай Р. ОеийгШс се11-Ьакей саисег иптипоШегару 1агде1шд МИС-1. Саисег 1ттиио1 1ттцио1йег. 2005 Арг. 28). Однако в связи с недостатком хелперных Т-клеточных эпитопов из ТАА молекулярные вакцины обычно включают пептиды, функционирующие только как лиганды I класса.

В ходе научной работы, ведущей к настоящему изобретению, изобретатели были в состоянии изолировать лиганды II класса из десяти проб КСС, трех колоректальных карцином (ССА) и одной переходно-клеточной карциномы (ТСС, уротелиальная карцинома). Только выбранные лиганды из ТАА, идентифицированные таким способом, обладают общей способностью

1) происходить из антигена с известной ассоциацией с опухолью;

2) связываться с наиболее распространенными аллелями НЬА II класса БК, НЬА БКВ1*0101 и

3) иметь характеристики, обосабливающие их из большинства лигандов НЬА II класса, в том, что они выполняют критерии, касающиеся их первичной аминокислотной последовательности, позволяющей им беспорядочно связываться с молекулами НЬА-ЭК по крайней мере из двух различных аллелей.

Как поясняется далее на примере с пептидом из ММР7 (8ЕО ГО № 1), эти беспорядочно связывающиеся с НЬА-ЭК опухолеассоциированные пептиды, как было обнаружено, распознаются СЭ4-положительными Т-клетками.

Первый аспект изобретения обеспечивает пептид, включающий аминокислотную последовательность в соответствии с любой из 8ЕО ГО № 1-49 или их вариант, при условии, что пептид не является интактным полипептидом человека, из которого получена аминокислотная последовательность, а именно одна из последовательностей во всю длину, как представлена в списке ГО локус-линкеров (входные номера указаны в приложенной далее табл. 1).

Как здесь описывается в дальнейшем, все пептиды, формирующие основу настоящего изобретения, были выявлены как презентируемые клетками, несущими МНС класса II (КСС). Таким образом, эти конкретные пептиды, так же как и другие пептиды, содержащие данную последовательность (т. е. дериваты пептидов), будут по всей вероятности все вызывать специфический Т-клеточный ответ, хотя уровень, до которого такой ответ будет простимулирован, может варьироваться между отдельными пептидами. Различия, например, могут быть вызваны мутациями в указанных пептидах (см. ниже). Специалист в данной области полностью осведомлен о способах, которые могут использоваться с целью определения силы, с которой был индуцирован ответ каждым отдельным пептидом, в частности, благодаря ссылкам на приведенные здесь примеры и соответствующую литературу.

Предпочтительно, чтобы пептид в соответствии с настоящим изобретением состоял преимущественно из аминокислотной последовательности в соответствии с любой из 8ЕО ГО № 1-49 или одним из их вариантов.

Термин состоял преимущественно из подразумевает, что пептид в соответствии с настоящим изобретением, помимо последовательности в соответствии с любой из 8ЕО ГО № 1-49 или одним из их вариантов, содержит дополнительные находящиеся на Ν- и/или С-конце фрагменты аминокислот, которые не являются обязательно формирующими часть пептида, которая функционирует как коровая последовательность пептида, включая соединяющий элемент, и как иммуногенный Т-хелперный эпитоп.

Тем не менее, эти фрагменты могут быть важны в целях обеспечения эффективного введения пептида в клетки в соответствии с настоящим изобретением. В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению включает 80 Ν-терминальных аминокислот НЬА-ЭК антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем И), как взятая из NСВI, инвентарный номер - СеиВаик Ассеккюи-шшЬег Х00497 (81гиЬш, М., Маск, В. аий Ьоид, Е.О. Тке сотр1е!е кедиеисе οί !ке тЖА Гог (Не НЕА-ОК-аккос1а1ей шуапагИ скат геуеа1к а ро1урерййе \\йк аи ииикиа1 (гаиктетЕгаие ро1агйу ЕМВО 1. 3 (4), 869-872(1984)).

Вариантом данной аминокислотной последовательности изобретатели обозначают то, что боковые цепи, например, одного или двух аминокислотных остатков изменены (например, при их замещении боковой цепью другого встречающегося в природе аминокислотного остатка или какой-либо другой боковой цепью), так что пептид по-прежнему способен связываться с молекулой НЬА, по существу, таким же путем, как и пептид, состоящий из данной аминокислотной последовательности. Например, пептид может быть модифицирован таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность взаимодействовать и связывать подходящую молекулу МНС, такую как НЬА-А, и таким образом, что он, по крайней мере, сохранит, если не улучшит, способность генерировать активированные

- 4 013876

ЦТЛ, которые могут распознавать и уничтожать клетки, которые экспрессируют полипептид, который содержит аминокислотную последовательность, как определено в аспектах этого изобретения. Как может быть извлечено из базы данных, как описано впоследствии, некоторые позиции связывающихся с НЬА-А пептидов являются типичными доменными остатками, образующими центральную последовательность, подходящую к соединительному элементу НЬА-связывающей бороздки.

Те аминокислотные остатки, которые не обязательны для взаимодействия с Т-клеточным рецептором, могут быть модифицированы при замещении другой аминокислотой, включение которой, по существу, не влияет на реактивность Т-клетки и не устраняет связь с соответствующим МНС. Таким образом, помимо данного условия, пептид по изобретению может быть любым пептидом (в обозначение которого изобретатели включают олигопептиды или полипептиды), который включает аминокислотные последовательности, или их часть, или их вариант, как дано.

В дальнейшем известно, что пептиды, презентированные МНС класса II, образованы коровой последовательностью, имеющей конкретный НЬА-специфический аминокислотный фрагмент и, факультативно, Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты, которые не препятствуют функции коровой последовательности (т.е. считаются нерелевантными для взаимодействия пептида и Т-клетки). Ν- и/или С-терминальные удлиняющие сегменты могут иметь длину от 1 до 10 аминокислот соответственно. Таким образом, предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 100, предпочтительно между 9 и 30 аминокислотами. Эти пептиды могут быть использованы как непосредственно для погрузки на молекулы МНС класса II, так и последовательность может быть клонирована на векторы в соответствии с описанным ниже. Так как эти пептиды образуют конечный продукт процессинга более длинных пептидов внутри клетки, то более длинные пептиды могут использоваться в равной степени. Пептиды по изобретению могут быть любого размера, но в основном они могут иметь молекулярный вес менее чем 100000, предпочтительно менее чем 50000, более предпочтительно менее чем 10000 и типично около 5000. В отношении числа аминокислотных остатков пептиды по изобретению могут иметь менее чем 1000 остатков, предпочтительно менее чем 500 остатков, более предпочтительно менее чем 100 остатков.

Если пептид, который имеет более чем около 12 аминокислотных остатков, непосредственно используется для связывания с молекулой МНС, предпочтительно, чтобы остатки, которые примыкают к центральному НЬА-связывающему региону, являлись такими, что, по существу, не влияют на способность пептида специфически связываться со связывающей бороздкой молекулы МНС или презентировать пептид ЦТЛ. Тем не менее, как уже было указано выше, следует понимать, что могут быть использованы более крупные пептиды, в особенности если они закодированы полинуклеотидом, потому что такие крупные пептиды могут быть разделены на фрагменты подходящими антигенпрезентирующими клетками.

Примеры для пептидов из МНС-лигандов, элементов, вариантов, а также отдельные примеры для Ν- и/или С-терминальных удлиняющих сегментов могут быть взяты, например, из банка данных БУРРЕИШ (Ваттепкее Н., Васйтапп I., ЕттепсН Ν.Ρ., Васйог О.А., 81етапо\зс 8. 8УРРЕГТНР ба!аЬаке Гог МНС Ндапбк апб рерббе то!гГк. Iшшиηοдеηе!^ск. 1999, Νον.; 50(3-4):213-9) на сайте 1Шр://5уГреЦ1и.Ь1ш-11е1бе1Ьегд.со1п/ и ссылок, включенных сюда.

В качестве неограниченных примеров некоторые пептиды для НЬА-ОВ в банке данных представлены как пептид КНКУУАСЕУТНОСЕ88. полученный из цепи карра 188-203 (Κονа!к е! а1. Еиг. I. Ептипо1. 1997 Арг; 27(4):1014-21); ΚνΟΑΕνΟΝΆΡΟδΟΝδ, полученный из цепи карра 145-159 (Κονа!к е! а1. Еиг. I. Iтшиηο1. 1997 Арг.; 27(4):1014-21), ЬРВЦАДТ8ЕН8НР, полученный из САЭ65 270-283 (Епб1 е! а1. I. С1ш. ^ек!. 15 Мау, 1997; 99(10):2405-15) или РГВМУгеЫРААТНОПГОРЬЕ полученный из САЭ65 556-575 (Епб1 е! а1. I. С1ш. Мтек! 15 Мау, 1997; 99(10):2405-15). В дополнение, пептиды могут также быть получены из мутировавших последовательностей антигенов, таких как в случае АТСΡΚΟ88ΚА^ΟВΡVА8, полученный из Ьсг-аЫ 210 кЭ белка слияния (!еп Воксй е! а1. В1ооб. 1 №ν., 1996; 88(9):3522-7); 6ΥΚV^V^NΡ8VААТ, полученный из НС^1 Ν83 28-41 П1еро1бег е! а1. I. νπΌ1. 1997 Аид.; 71(8):6011-9); или ΓВΚ0NΡ^IVI0ΥМ^^^ΥV6, полученный из НIV-1 (НХВ2) ВТ 326-345 ^ап бег Вигд е! а1. I. Iтшиηο1. 1 1ап., 1999; 162(1): 152-60). Все доменные аминокислоты (кее Рпебе е! а1., ВюсЫт Вюрйук Ас!а. 7 1ип., 1996; 1316(2):85-101; 8е!!е е! а1. I. ^тцпок 15 8ер., 1993; 151(6):3163-70; Наттег е! а1. Се11. 16 1и1., 1993; 74(1):197-203 апб Наттег е! а1. I. Ехр Меб. 1 Мау, 1995; 181(5):1847-55) как примеры для НЬА-ОВ4 выделены жирным шрифтом, предполагаемые центральные последовательности подчеркнуты.

Все описанные выше пептиды охватываются термином варианты данной аминокислотной последовательности.

В понятие пептид изобретатели включают не только молекулы, в которых аминокислотные остатки присоединены пептидными связями (-СО-ЫН-), но и также молекулы, в которых пептидная связь является обратной. Такие ретрообратные пептидомиметики могут быть получены методами, известными из уровня техники, например, такими, как описано в работе Ме/1еге е! а1. (1997), I. Iшшиηο1. 159, 3230-3237, включенной в данное описание посредством ссылки. Этот принцип охватывает получение псевдопептидов, содержащих изменения, которые охватывают остов, а не ориентацию боковых цепей. Ме/1еге е! а1.

- 5 013876 (1997) показывают, что эти псевдопептиды пригодны, по крайней мере, для МНС класса II и Т-хелперных клеточных ответов. Ретрообратные пептиды, которые содержат связи ΝΗ-СО вместо пептидных связей СО-ΝΗ, более устойчивы к протеолизу.

Типично, что пептид по изобретению является таким, который, если он экспрессирован в антигенпрезентирующей клетке, может процессироваться, так что получается фрагмент, который способен связываться с адекватной молекулой МНС, а также может быть презентирован подходящей клеткой и может вызывать адекватный Т-клеточный ответ. Следует понимать, что полученный из пептида фрагмент может также быть пептидом по изобретению. Целесообразно, что пептид по изобретению содержит участок, который включает данную аминокислотную последовательность, или ее сегмент, или ее вариант, и дальнейший сегмент, который обладает некоторыми желаемыми свойствами. Например, дальнейший сегмент может включать дальнейший Т-клеточный эпитоп (независимо от того, получен ли он из одного и того же полипептида в качестве первого сегмента, содержащего Т-клеточный эпитоп, или нет) или он может включать белок-носитель или пептид. Таким образом, в одном воплощении пептид по изобретению является усеченным белком человека или белком слияния белкового фрагмента и другого сегмента полипептида при условии, что человеческий сегмент включает одну или более аминокислотную последовательность изобретения.

В особенно предпочтительном воплощении пептид по изобретению включает аминокислотную последовательность по изобретению и по крайней мере один дальнейший Т-клеточный эпитоп, причем дальнейший Т-клеточный эпитоп способен содействовать продуцированию Т-клеточного ответа, направленного на вид опухоли, который аберрантно экспрессирует опухолеассоциированный антиген. Таким образом, пептиды по изобретению включают так называемые полипептиды бусины на нити, которые могут также использоваться в качестве вакцин.

Из последующего следует понимать, что в некоторых случаях применения пептиды по изобретению могут быть использованы непосредственно (т.е. их не получают при экспрессии полинуклеотида в клетке пациента или в данной пациенту клетке); в случае такого применения предпочтительно, чтобы пептид имел менее чем 100 или 50 остатков. Предпочтительный пептид настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами.

Предпочтительно, чтобы пептиды по изобретению были способны связываться с НЬА-ϋΚ.. Особенно предпочтительно, если пептиды селективно связываются с НЬА-ОКВ1*0101.

В другом аспекте настоящего изобретения аналогично ситуации, поясненной выше для молекул МНС II класса, пептиды по изобретению могут быть применены для вызывания специфического Т-клеточного ответа МНС I класса. Предпочтительный специфический пептид МНС I класса настоящего изобретения обладает общей длиной между 9 и 16, предпочтительно между 9 и 12 аминокислотами. Нужно понимать, что такие пептиды могут быть использованы (например, в вакцине) как более длинные пептиды, аналогично пептидам МНС II класса. Способы идентификации специфических центральных последовательностей МНС класса I, имеющих конкретный НЬА-специфический аминокислотный фрагмент для молекул НЬА класса I, известны специалисту данной области и могут быть спрогнозированы, например, компьютерными программами РАРгоС (Ы1р://тетете.иш-1иеЫпдеп.бе/ип1/кх1/) и ЗУРРЕИШ (1Шр://\\л\лу.5уГреЦ1н.бе).

Пептиды по изобретению особенно полезны для иммунотерапевтических методов по маркированию и уничтожению клеток, которые аберрантно экспрессируют полипептиды, формирующие основу для настоящих пептидов по изобретению. Так как эти специфические пептиды, состоящие из данных аминокислотных последовательностей, связываются с НЬА-ОВ, предпочтительно, чтобы пептиды по изобретению были такими, которые связывают НЬА-ОВ, и при такой связи НЬА-ПВ-пептидный комплекс, презентированный на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки, был бы способен вызывать продуцирование ЦТЛ, которые распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий данную аминокислотную последовательность.

В одном воплощении настоящего изобретения пептид по изобретению включает 80 Ν-терминальных аминокислот НЬА-ОВ антиген-ассоциированной инвариантной цепи (р33, в дальнейшем И), как взятый из NСΒI, инвентарный номер - ОеиВапк Ассе55Юп-питЬег Х00497 (см. ниже).

В понятие аберрантно экспрессированный авторы включают то, что полипептид гиперэкспрессирован по сравнению с нормальным уровнем экспрессии или что ген является молчащим в ткани, из которой образовалась опухоль, однако он экспрессирован в опухоли. Под понятием гиперэкспрессирован авторы подразумевают, что полипептид представлен на уровне, который по крайней мере в 1,2 раза выше уровня, представленного в нормальной ткани; предпочтительно по крайней мере в 2 раза и более предпочтительно по крайней мере в 5 или 10 раз выше уровня, представленного в нормальной ткани.

Пептиды (по крайней мере, те, что содержат пептидные связи между аминокислотными остатками) могут быть синтезированы Ртос-полиамидным способом твердофазного пептидного синтеза, как раскрыто у Ьи е! а1. (1981), I. Огд. С1ет. 46, 3433 и в прилагающихся ссылках. Временная защита Ν-аминогруппы предусмотрена группой 9-флуоренилметилоксикарбонил (Ртос). Повторное расщепление этой высоко щелочелабильной защитной группы осуществляется при использовании 20% пиперидина в Ν,Ν-диметилформамиде. Функциональности боковой цепи могут быть защищены как их бутиловые

- 6 013876 эфиры (в случае серинтреонина и тирозина), бутиловые сложные эфиры (в случае глютаминовой кислоты и аспарагиновой кислоты), бутилоксикарбониловое производное (в случае лизина и гистидина), тритиловое производное (в случае цистеина) и производное 4-метокси-2,3,6-триметилбензолсульфонила (в случае аргинина). Там, где глютамин или аспарагин являются С-терминальными остатками, для защиты боковой цепи амидофункциональностей используется 4,4'-диметоксибензгидрильная группа. Твердофазный носитель базируется на полимере полидиметилакриламида, состоящем из трех мономеров: диметилакриламида (остов-мономер), бис-акрилоилэтилендиамина (кросслинкер) и метилового эфира акрилоилсаркозина (функционализирующий агент). Использованным агентом с расщепляемым соединением пептид-смола является кислотно-лабильное производное 4-гидроксиметилфеноксиуксусной кислоты. Все аминокислотные производные добавляются как их преформированные симметричные ангидридные производные, за исключением аспарагина и глютамина, которые добавляются с применением метода обратного соединения, опосредованного И,И-дициклогексилкарбодиимид/1-гидроксибензотриазолом. Все реакции сочетания и снятия защитных групп отслеживались с помощью нингидрина, тринитробензолсульфоновой кислоты или технологии контроля изотином. После завершения синтеза пептиды отщепляются от смолы-носителя с сопутствующим удалением защитных групп боковой цепи при обработке 95% трифторуксусной кислотой, содержащей 50% поглотителя примесей. Обычно используемые поглотители - это этандитиол, фенол, анизол и вода, точный выбор зависит от составляющих аминокислот пептида при синтезе. Также возможна комбинация твердофазных и жидкофазных методов для синтеза пептидов (см., например, ВгискбогГег Т., Магбег О., АЬеисю Р. Ргот ргобисбои ой рерббек ίη тбйдгат атоний Гог гекеагсй Ю ишЫ-Югй сци-нИШех Гог бгцдк оГ Не Гн1нге. Сигг Рйагт Вю1ес1то1. 2004 РеЬ.; 5(1):2943 и приводимые здесь ссылки).

Трифторуксусная кислота удаляется выпариванием в вакууме с последующим измельчением с диэтиловым эфиром для получения сырого пептида. Любые представленные поглотители удаляются простой технологией экстракции, которая при лиофилизации водной фазы позволяет получить сырой пептид без поглотителей. Реагенты для синтеза пептидов, как правило, имеются в наличии в Са1Ь1осйет-ИоуаЬ1осйет (Великобритания) Ыб., Иойтдйат N07 20ί. Великобритания.

Очистка может быть произведена любой техникой или комбинацией таких техник, как эксклюзивная хроматография, ионообменная хроматография, хроматография гидрофобного взаимодействия и (обычно) обратнофазная высокоэффективная жидкостная хроматография с использованием градиентного разделения ацетонитрил/вода.

Анализ пептидов может быть произведен при использовании тонкослойной хроматографии, обратнофазной высокоэффективной жидкостной хроматографии, аминокислотного анализа после кислотного гидролиза и масс-спектрометрического анализа при быстрой бомбардировке атомами (РАВ), а также масс-спектрометрического анализа ΜΑΤΌΙ и Е81-0-ТОР.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает нуклеиновую кислоту (например, полинуклеотид), кодирующую пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК (циклогексанилнуклеиновая кислота), РНК или их комбинациями и может или не может содержать интроны в период времени кодирования для пептида. Конечно, это только пептиды, которые содержат встречающиеся в природе аминокислотные остатки, присоединенные природными пептидными связями, которые могут кодироваться полинуклеотидом. Еще один дальнейший аспект изобретения обеспечивает вектор экспрессии, способный экспрессировать полипептид в соответствии с изобретением.

Был разработан ряд методов для функционального связывания полинуклеотидов, в особенности ДНК, с векторами, например, с помощью дополнительных липких концов. К примеру, в сегмент ДНК могут быть добавлены дополнительные гомополимерные участки для внесения в вектор ДНК. Вектор и сегмент ДНК в таком случае соединены водородной связью между дополнительными гомополимерными концевыми участками, образуя рекомбинантные молекулы ДНК.

Синтетические сшивающие агенты, содержащие один или несколько сайтов рестрикции, обеспечивают альтернативный способ соединения сегмента ДНК с векторами. Сегмент ДНК, получаемый в результате расщепления эндонуклеазы рестрикции, как описывалось ранее, подвергается воздействию бактериофага Т4 ДНК полимеразы или Е.соБ ДНК полимеразы I, ферментов, которые удаляют выдающиеся З'-одноцепочечные концы с их 3'-5'-экзонуклеолитическими активностями и наполняют имеющие углубления З'-концы их полимеразными активностями.

Комбинация этих активностей вследствие этого формирует фрагменты ДНК с тупыми концами. Фрагменты с тупыми концами инкубируются затем с большим молярным избытком молекул-линкеров в присутствии фрагмента, способного катализировать лигирование по тупым концам молекул ДНК, такого как бактериофаг Т4 ДНК лигаза. Таким образом, продуктами реакции являются фрагменты ДНК, несущие последовательности полимерных сшивающих агентов на их концах. Затем эти фрагменты ДНК расщепляются подходящим ферментом рестрикции и связываются с вектором экспрессии, который был расщеплен ферментом, вырабатывающим концы, совместимые с концами фрагмента ДНК.

- 7 013876

Синтетические сшивающие агенты, содержащие ряд сайтов рестрикционной эндонуклеазы, имеются в продаже в различных источниках, включая 1п1етаОопа1 Вю1сс11по1ощс5 1пс., Νο\ν Науеп, ΟΝ, США.

Желаемый путь модификации ДНК, кодирующей полипептид по изобретению, - это использование цепной реакции полимеразы, как раскрыто у 8а1к1 е! а1. (1988), Заепсе 239, 487-491. Этот метод может быть использован для введения ДНК в подходящий вектор, например при инженерии в подходящих сайтах рестрикции, или же он может быть использован для модификации ДНК другими пригодными путями, известными из уровня техники. Согласно этому методу для ферментативного амплифицирования ДНК примыкает к двум специфическим праймерам, которые, в свою очередь, внедряются в амплифицированную ДНК. Приведенные специфические праймеры могут содержать сайты узнавания рестрикционной эндонуклеазы, которые могут быть использованы для клонирования в векторы экспрессии с применением известных из уровня техники методов.

Затем ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК) экспрессируется в подходящего хозяина для получения полипептида, включающего соединение по изобретению. Таким образом, ДНК, кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть использована в соответствии с известными техниками, модифицированная соответствующим образом с учетом приведенных здесь идей, для создания вектора экспрессии, который затем используется для трансформации подходящей клетки-хозяина для экспрессии и получения полипептида по изобретению. Такие техники включают также те, что раскрыты в следующих патентах США: 4440859, выданном 3 апреля 1984 г. на имя Ви!!ег е! а1.; 4530901, выданном 23 июля 1985 г. на имя \Уе155тап: 4582800, выданном 15 апреля 1986 г. на имя Сго\\'1; 4677063, выданном 30 июня 1987 г. на имя Магк е! а1.; 4678751, выданном 7 июля 1987 г. на имя Соеббе1; 4704362, выданном 3 ноября 1987 г. на имя Йакига е! а1.; 4710463, выданном 1 декабря 1987 г. на имя Миггау; 4757006, выданном 12 июля 1988 г. на имя Тоо1е, 1г. е! а1.; 4766075, выданном 23 августа 1988 г. на имя Соеббе1 е! а1.; и 4810648, выданном 7 марта 1989 г. на имя 8!а1кег, которые все включены в описание путем ссылки.

ДНК (или в случае ретровирусных векторов РНК), кодирующая полипептид, представляющий собой соединение по изобретению, может быть присоединена к обширному ряду других последовательностей ДНК для введения в адекватного хозяина. ДНК-спутник будет зависеть от природы хозяина, способа введения ДНК хозяину и от того, желательно ли эписомальное поддержание или интеграция.

Как правило, ДНК вводится в вектор экспрессии, такой как плазмида, с правильной ориентацией и корректной рамкой считывания экспрессии. Если необходимо, то ДНК может быть сцеплена с адекватными транскрипционными и трансляционными регулирующими контрольными нуклеотидными последовательностями, распознающимися желательным хозяином, хотя такой контроль обычно имеется в векторе экспрессии. Вектор вводится затем хозяину посредством стандартных способов. Как правило, не все хозяева трансформируются вектором. Поэтому будет необходимо выбрать трансформированные клеткихозяева. Одна из техник отбора включает введение в вектор экспрессии последовательности ДНК с любыми необходимыми элементами контроля, кодирующей выбранный признак в трансформированной клетке, такой как невосприимчивость к антибиотикам.

Альтернативно, ген для такого выбираемого признака может быть на другом векторе, который используется для котрансформации желаемой клетки-хозяина.

Клетки-хозяева, которые были трансформированы рекомбинантной ДНК по изобретению, культивируются затем в течение достаточного времени и при адекватных условиях, известных специалистам данной области, учитывая раскрытые здесь идеи, что ведет к экспрессии полипептида, который после этого может быть получен.

Известно множество систем экспрессии, включающих бактерии (например, Е.сой и ВасШик киЬШщ), дрожжи (например, Зассйаготусек сегеуыае). мицелиальные грибы (например, АкрегдШик), растительные клетки, клетки животных и насекомых. Предпочтительно, чтобы система была КСС (почечноклеточная карцинома) или линией клеток А\се115.

Промотор является контрольным элементом экспрессии, образованным последовательностью ДНК, которая позволяет связывание РНК-полимеразы и приводит к транскрипции. Совместимые с отдельными бактериями-хозяевами последовательности-промоторы типично представлены в плазмидных векторах, содержащих подходящие сайты рестрикции для вставки фрагмента ДНК настоящего изобретения. Типичными прокариотическими векторными плазмидами являются рИС18, рИС19, рВК.322 и рВК.329, имеющиеся в наличии в В юга б ЬаЬога!ог1е8, КтсйтопД, СА, США, а также рТгс99А и рКК223-3, имеющиеся в наличии в Рйагтааа, Рщса!атау, N1, США.

Типичная клеточная векторная плазмида млекопитающих рЗУЪ имеется в наличии в Рйагтааа, Р18са1а^ау, N1, США. Этот вектор использует поздний промотор 8У40 для возбуждения экспрессии клонированных генов, наивысший уровень экспрессии был обнаружен в Т-антигенвырабатывающих клетках, таких как клетки СОЗ-1. Примером индуцируемого вектора экспрессии млекопитающих является рМ8О, имеющийся также в наличии в Рйагтааа. Этот вектор использует глюкокортикоидиндуцируемый промотор длинного концевого повтора опухолевого вируса молочной железы мыши для возбуждения экспрессии клонированного гена. Пригодными плазмидными векторами дрожжей являются рК.8403-406 и рК.8413-416 и, как правило, имеются в наличии в 8!га!адепе С1ошпд Зуйетк, Ьа 1о11а, СА

- 8 013876

92037, США. Плазмиды рВ8403, рВ8404, рВ8405 и рВ8406 являются дрожжевыми интегрирующими плазмидами (У1рк) и включают дрожжевые селектируемые маркеры ΗΙ83, ТКР1, ЬЕи2 и ПК.А3. Плазмиды рВ8413-416 являются дрожжевыми центромерными плазмидами (Усрк). Другие векторы и системы экспрессии для применения с различными клетками-хозяевами хорошо известны из уровня техники.

Настоящее изобретение относится также к клетке-хозяину, трансформированной с помощью полинуклеотидной векторной модели настоящего изобретения. Клетка-хозяин может быть как прокариотической, так и эукариотической. Бактериальные клетки могут быть предпочтительно прокариотическими клетками-хозяевами при некоторых условиях и типично являются штаммом Е.со11, таким как, например, Е.соБ штамма ΩΗ5. имеющимся в наличии в ВеШекба Кекеагсй БаЬогаЮпек 1пс., ВеИекба, МЭ. США, и ВК1, имеющимся в наличии в Американской коллекции типов культур Ашепсап Туре Си11иге СобесОоп (АТСС) о! ВоскуШе, МБ, США (№ АТСС 31343). Предпочтительные эукариотические клетки-хозяева включают дрожжи, клетки насекомых и млекопитающих, предпочтительно клетки позвоночных, таких как мышь, крыса, обезьяна или человеческие фибробластные клетки и почечные клеточные линии. Дрожжевые клетки-хозяева включают ΥΡΗ499, ΥΡΗ500 и ΥΡΗ501, которые, как правило, имеются в наличии в 81га1адепе С1ошпд 8ук1ет8, Ьа 1о11а, СА 92037, США. Предпочтительные клетки-хозяева млекопитающих включают клетки яичника китайского хомяка (СНО), имеющиеся в наличии в АТСС как ССЬ61, ΝΙΗ эмбриональные клетки швейцарской мыши ΝΙΗ/3Τ3, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЕ 1658, почечные клетки обезьяны СО8-1, имеющиеся в наличии в АТСС как СКЕ 1650, и клетки 293, являющиеся эмбриональными клетками печени человека. Предпочтительными клетками насекомых являются клетки 819, которые могут трансфицироваться с помощью бакуловирусных векторов экспрессии.

Трансформация адекватных клеток-хозяев с помощью модели ДНК настоящего изобретения совершается при помощи хорошо известных способов, которые обычно зависят от типа используемого вектора. Относительно трансформации прокариотических клеток-хозяев см., например, СоНеп е1 а1. (1972), Ргос. №И. Асаб. 8сг И8А 69, 2110 и 8ашЬгоок е1 а1. (1989), Мо1еси1аг С1опшд, А БаЬогаГогу Мапиа1, Со1б 8ргшд ИагЬог БаЬога1огу, Со1б 8рпп§ ИагЬог, Нью-Йорк. Трансформация дрожжевых клеток описывается у 811егшап е1 а1. (1986), Мебюбк 1п Уеак1 Сепейск, А БаЬогаЮгу Мапиа1, Со1б 8ргшд ИагЬог, Нью-Йорк. Также подходит метод Бигса (Веддк) (1978), №1Шге 275, 104-109. Что касается клеток позвоночных, то подходящие для трансфекции таких клеток реагенты, например фосфат кальция и ОЕЛЕ-декстран или липосомальные композиции, имеются в наличии в 81га1адепе С1ошпд 8ук1еш8 или ЫГе Тес11по1ощек 1пс., СаййегкЬигд, МБ 20877, США. Электропорация также подходит для трансформации и/или трансфекции клеток и хорошо известна из уровня техники для трансформации дрожжевых клеток, бактериальных клеток, клеток насекомых и клеток позвоночных.

Успешно трансформированные клетки, т.е. клетки, которые содержат модель ДНК настоящего изобретения, могут быть идентифицированы хорошо известными методами. Например, клетки, образующиеся в результате введения модели экспрессии настоящего изобретения, могут выращиваться для получения полипептида по изобретению. Клетки могут собираться и лизироваться, а содержимое их ДНК проверяться на наличие ДНК с помощью такого способа, как описывается у 8ои111егп (1975), 1. Мо1. Вю1. 98, 503 или у Вегеп! е1 а1. (1985), Вю1ес11. 3, 208. Альтернативно, наличие белка в супернатанте может выявляться с применением антител, как описывается ниже.

В дополнение к непосредственному анализу на наличие рекомбинантной ДНК успешная трансформация может быть подтверждена хорошо известными иммунологическими способами, когда рекомбинантная ДНК способна управлять экспрессией белка. Например, клетки, успешно трансформированные с вектором экспрессии, вырабатывают белки, проявляющие соответствующую антигенность.

Образцы предположительно трансформированных клеток собирают и анализируют на белок, используя подходящие антитела. Таким образом, в дополнение к самим трансформированным клеткамхозяевам настоящее изобретение сосредоточено также на культуре таких клеток, предпочтительно моноклональной (клонально-гомогенной) культуре или культуре, полученной из моноклональной культуры в питательной среде.

Следует понимать, что некоторые клетки-хозяева по изобретению подходят для получения пептидов по изобретению, например бактериальные, дрожжевые клетки и клетки насекомых. Тем не менее, другие клетки-хозяева могут быть пригодны в некоторых методах лечения. Например, антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, могут с пользой быть использованы для экспрессирования пептидов по изобретению так, что их можно будет нагружать на адекватные молекулы МНС.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ получения пептида для внутривенной (ί.ν) инъекции, подкожной (к.с) инъекции, внутрикожной (1.б) инъекции, внутрибрюшной (1.р) инъекции, внутримышечной (1.ш) инъекции. Предпочтительными способами пептидной инъекции являются к.с, 1.б., 1.р., 1.ш. и ί.ν. Предпочтительными способами инъекции ДНК являются 1.б., 1.ш., к.с, 1.р. и ί.ν. Вводиться могут дозы от 1 до 500 мг пептида или ДНК.

Дальнейший аспект изобретения относится к использованию опухолеассоциированного пептида в соответствии с изобретением, нуклеиновой кислоты в соответствии с изобретением или вектора экспрессии в соответствии с изобретением в медицине.

- 9 013876

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, способ, включающий введение пациенту эффективного объема пептида в соответствии с изобретением или эффективного объема полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего указанный пептид, причем объем указанного пептида или объем указанного полинуклеотида или вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клеткимишени у указанного пациента. Клетка-мишень типично является опухолевой или раковой клеткой.

Пептид или кодирующая пептид нуклеиновая кислота формирует вакцину против опухолей или рака. Она может вводиться непосредственно пациенту в пораженный орган или систематично или вноситься ех νίνο в клетки, полученные от пациента, или в человеческую клеточную линию, которые затем могут вводиться пациенту или использоваться ίη νίίτο для селекции субпопуляции из иммунных клеток, полученных от пациента, которые после этого вновь вводятся пациенту. Если нуклеиновая кислота введена в клетки ίη νίίτο, то она может быть полезна для трансфекции клеток, чтобы коэкспрессировать иммуностимулирующие цитокины, такие как интерлейкин-2. Пептид может быть в основном чистым или комбинированным с иммуностимулирующим адъювантом, таким как ОеЮх. либо использоваться в комбинации с иммуностимулирующими цитокинами или вводиться с подходящей системой доставки, например липосомами. Пептид может быть также конъюгирован в подходящий носитель, такой как гемоцианин лимфы улитки (КЕН) или маннан (см. \УО 95/18145 и Ьопдепескег е! а1. (1993), Αηη. ΝΥ Асаб. 8с1. 690, 276-291). ΝΥ Асаб. 8с1. 690, 276-291). Пептид может быть также меченым или являться белком слияния или гибридной молекулой. Пептиды, последовательность которых дана в настоящем изобретении, как ожидается, стимулируют С'П4 ЦТЛ. Тем не менее, стимуляция более эффективна в присутствии помощи, производимой СЭ4-положительными Т-клетками. Таким образом, партнеры слияния или секции гибридной молекулы адекватно обеспечивают эпитопами, которые стимулируют С'П4положительные Т-клетки. Стимулирующие СЭ4-положительные эпитопы хорошо известны из уровня техники и включают те, что были выявлены в столбнячном токсине. Полинуклеотид может быть в основном чистым или содержаться в подходящем векторе или системе доставки.

Подходящие векторы и системы доставки включают вирусные системы, такие как те, что основаны на аденовирусе, вирусе осповакцины, ретровирусах, вирусе герпеса, аденоассоциированном вирусе или гибридах, содержащих элементы более чем одного вируса. Невирусные системы доставки включают катионные липиды и катионные полимеры, хорошо известные из уровня техники в области доставки ДНК. Также может быть использована физическая доставка, такая как посредством ген-пистолета. Пептид или закодированный нуклеиновой кислотой пептид может быть белком слияния, например, с эпитопом, который стимулирует СЭ4-положительные Т-клетки.

Пептид для использования в вакцине против рака может быть любым подходящим пептидом. В особенности он может быть подходящим 9-мерным пептидом или подходящим 7-, или 8-, или 10-, или 11-, или 12-мерным пептидом. Более длинные пептиды могут быть также подходящими, но 9- или 10-мерные пептиды, как описано в приложенной табл. 1, являются предпочтительными.

Соответственно любая нуклеиновая кислота, вводимая пациенту, является стерильной и свободной от пирогенов. Обнаженная ДНК может вводиться внутримышечно, или внутрикожно, или подкожно. Пептиды могут вводиться внутримышечно, внутрикожно, внутрибрюшно, внутривенно или подкожно (см. также выше рассмотрение способа получения пептида). Предпочтительно, чтобы пептиды в качестве активных фармацевтических компонентов вводились в комбинации с адъювантом, таким как, например, ИЛ-2, ИЛ-12, ОМ-С8Е, неполным адъювантом Фрейнда, полным адъювантом Фрейнда или липосомальными композициями. Наиболее предпочтительные адъюванты рассматриваются, например, у Вппкшап 1.А., Еаиксй 8.С., ХУеЬег 1.8., Как! \У.М. Рерббе-Ьакеб гассшек Гог сапсег (ттипоГйегару. Ехрег! Ορίη. Βίο1. Тйег. 2004 ЕеЬ; 4(2):181-98.

Вакцинация приводит к ответам ЦТЛ, стимулированных профессиональными антигенпрезентирующими клетками; после примирования ЦТЛ может появиться преимущество по стимуляции экспрессии МНС в опухолевых клетках.

Можно также с пользой направлять вакцину в специфические популяции клеток, например в антигенпрезентирующие клетки, либо на месте инъекции с использованием нацеленных векторов и систем доставки, либо при селективной очистке такой клеточной популяции у пациента и введении ех νίνο пептида или нуклеиновой кислоты (например, дендритные клетки могут быть отсортированы, как описывается у Ζΐιοιι е! а1. (1995), Β1οο6, 86, 3295-3301; Βοϊΐι е! а1. (1996), 8саоб. 1. Iттиηο1ο§у, 43, 646-651). Например, нацеленные векторы могут включать ткане- или опухолеспецифический промотор, который направляет экспрессию антигена в подходящее место.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает поэтому эффективную вакцину против рака или раковых или опухолевых клеток, включающую эффективный объем пептида в соответствии с изобретением или включающую нуклеиновую кислоту, кодирующую такой пептид. Также предпочтительно, чтобы вакцина была вакциной из нуклеиновой кислоты. Известно, что инокуляция вакциной из нуклеиновой кислоты, такой как ДНК-вакцина, кодирующей полипептид, приводит к Т-клеточному ответу. Наиболее предпочтительной является вакцина, включающая (синтетический) пептид или пептиды (т.е. либо от

- 10 013876 дельный, либо в комбинации из 1, 2, 3, 4, 5 или 6 или даже большим числом пептидов, см. также ниже).

Обычно вакцина из нуклеиновой кислоты может включать любое подходящее средство доставки нуклеиновой кислоты. Нуклеиновая кислота, предпочтительно ДНК, может быть обнаженной (т.е., по существу, без других компонентов для введения) либо она может быть доставлена в липосоме или как часть системы доставки вирусного вектора.

Полагают, что поглощение нуклеиновой кислоты и экспрессия закодированного полипептида дендритными клетками может быть механизмом прайминга иммунного ответа; тем не менее, дендритные клетки могут не быть трансфицированы, однако они по-прежнему важны, так как они могут поглощать экспрессированные пептиды из трансфицированных клеток в ткани.

Предпочтительно, если вакцина, такая как ДНК-вакцина, вводится в мышцу. Предпочтительно также, если вакцина вводится в кожу. Вакцина из нуклеиновой кислоты может вводиться без адъюванта. Вакцина из нуклеиновой кислоты может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Ас.|ш1а'5 0821 (Лс.|ш1а Вю!ссй, \Уогсс51сг. МА, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и собственно адъювантов, таких как Κίόί'δ ЭсЮх. Также может быть использован Οιιίΐ А, другой, полученный из сапонина адъювант (§црсг&8, Дания). Предпочтительно, если вакцина из нуклеиновой кислоты вводится без адъюванта. Другие адъюванты, такие как адъювант Фрейнда, могут также быть применены. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом.

Полинуклеотид-опосредованная иммунизационная терапия против рака описывается у Сопгу с! а1. (1996), Бсттагк ΐη Опсо1о§у, 23, 135-147; Сопбоп с! а1. (1996), №1Ц1гс Мсбктс, 2, 1122-1127; Сопд с! а1. (1997), ЫаШгс Мсбюшс, 3, 558-561; 2йа1 с! а1. (1996), 1. 1ттипо1. 156, 700-710; Огайат с! а1. (1996), 1п!. 1. Сапссг, 65, 664-670 и Вигсйс11 с! а1. (1996), р. 309-313 1п: Вгсак! Сапссг, Абуапсск т Ыо1о§у апб 1йсгарси11с8, Са1уо с! а1. (сбк), 1ойп ЫЬЬсу Еиго!сх!, которые все включены в описание путем ссылки.

Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению.

Другой дальнейший аспект настоящего изобретения обеспечивает применение пептида в соответствии с изобретением или полинуклеотида или вектора экспрессии, кодирующего такой пептид, для изготовления медикамента для индуцирования иммунного ответа, в особенности клеточного иммунного ответа, более предпочтительно опосредованного Т-клетками иммунного ответа против клеток солидных опухолей, клетки которых экспрессируют молекулу МНС II класса человека на их поверхности и презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. В контексте настоящего изобретения было неожиданно установлено, что опухолевые клетки солидных опухолей, в отличие от здоровых клеток той же ткани, экспрессируют человеческие молекулы НЬА II класса на их поверхности.

Дальнейший аспект изобретения обеспечивает, таким образом, способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ш у1уо или ш уйго, способ, включающий контактирование ЦТЛ ш уйго с нагруженными антигеном молекулами МНС класса II человека, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточного для активации антигенспецифическим образом указанных ЦТЛ, причем антиген является пептидом в соответствии с изобретением.

Соответственно ЦТЛ являются СО4-положительными хелперными клетками, предпочтительно типа Т_Н1. Молекулы МНС класса II могут быть экспрессированы на поверхности любой подходящей клетки и предпочтительно, если клетка является такой, которая в естественных условиях не экспрессирует молекулы МНС класса II (в этом случае клетка трансфицирована для экспрессии такой молекулы), или если она экспрессирует, то она является дефектной для каскадов реакций процессинга или презентации антигена. Тогда для клетки, экспрессирующей молекулы МНС класса II, возможен, по существу, полный прайминг с выбранным пептидным антигеном до активации ЦТЛ.

Антигенпрезентирующая клетка (или клетка-стимулятор) типично имеет молекулу МНС класса II на своей поверхности и предпочтительно обычно является не способной самостоятельно нагружать на обозначенную молекулу МНС класса II выбранный антиген. Как более детально описано ниже, молекула МНС класса II может быть легко нагружена выбранным антигеном ш уйго.

Предпочтительно в клетке млекопитающих не хватает или имеется пониженный уровень или пониженная функция пептидного транспортера ТАР. Подходящие клетки, в которых не хватает пептидного транспортера ТАР, включают Т2, КМА-8 и клетки дрозофилы. ТАР - это транспортер, ассоциированный с процессингом антигена.

Нагружающая пептид дефектная клеточная линия Т2 человека имеется в наличии в Атспсаи Турс СиЙигс Сойссбоп, 12301 Рагк1а\уп Опус, КоскуШс, Магу1апб 20852, США под каталоговым № СКЙ 1992; клеточная линия дрозофилы линия Бсйпшбсг 2 имеется в наличии в АТСС под каталоговым № СКЬ 19863; клеточная линия мыши КМА-8 описывается у Каггс и Цшщдгсп (1985), I. Ехр. Мсб. 162,

- 11 013876

1745.

Обычно обозначенная клетка-хозяин до трансфекции в основном не экспрессирует молекулы МНС I класса. Также предпочтительно, если клетка-стимулятор экспрессирует молекулу, важную для Т-клеточной костимуляции, такую как любая из В7.1, В7.2, 1САМ-1 и ЬРЛ 3.

Последовательности нуклеиновой кислоты многочисленных молекул МНС II класса и костимулирующих молекул общедоступны в банках данных ОеиВаик и ЕМВЬ.

В дальнейшем воплощении также могут быть использованы комбинации молекул НЬА, такие как, например, молекулы МНС класса II, как описываются здесь в табл. А и В.

Использование рекомбинантных полиэпитопных вакцин для доставки множественных эпитопов СИ8⁺ ЦТЛ описывается у Тйоткоп е! а1. (1996), 1. Iттиηο1. 157, 822-826 и в \УО 96/03144, которые включены сюда путем ссылки.

По отношению к настоящему изобретению может быть желательным включение в одну вакцину пептида (или нуклеиновой кислоты, кодирующей пептид), причем пептид включает в любом порядке аминокислотную последовательность настоящего изобретения и другой С'П8' Т-клеточный стимулирующий эпитоп. Такая вакцина была бы особенно полезна для лечения раковых заболеваний. Такие вакцины бусины на нити являются типичными ДНК-вакцинами. Синхронная инициация МНС класса IIзависимого иммунного ответа вместе с МНС класса ^зависимым иммунным ответом имеет преимущество, которое ведет к локальной Т_ш-подобной Т-клеточной реакции СЭ4-положительных Т-клеток, чем поддерживаются МНС класса ^зависимые СЭ8-положительные Т-клетки.

Для генерации ЦТЛ ίη νίίτο могут быть использованы многие другие способы. Например, в методах, описанных у Реор1ек е! а1. (1995), Ргос. №111. Асаб. 8с1. И8А 92, 432-436 и Кауакат е! а1. (1992), 1. Iттиηο1. 148, 638643, при генерации ЦТЛ используются аутологичные инфильтрующие опухоль лимфоциты. Для приготовления ЦТЛ Р1еЬапкк1 е! а1. (1995), Еиг. 1. Iттиηο1. 25, 1783-1787 использует аутологичные лимфоциты периферической крови (ЛПК). 1ос11ти5 е! а1. (1997), 1. Оеп. У1го1. 78, 1689-1695 описывают получение аутологичных ЦТЛ методом импульсного введения пептида или полипептида в дендритные клетки или посредством инфицирования рекомбинантным вирусом. Н111 е! а1. (1995), 1. Ехр. Меб. 181, 2221-2228 и 1еготе е! а1. (1993), 1. Iттиηο1. 151, 1654-1662 для получения аутологичных ЦТЛ пользуются В-клетками. Кроме того, для получения аутологичных ЦТЛ могут быть использованы макрофаги с введенным импульсным методом пептидом или полипептидом или инфицированные рекомбинантным вирусом. ^а1!ег 8., ^а1!ег 8., Неггдеп Ь., 8сйоог О., Лнщ О., \Уегпе1 Ό., Вийппд Н.1., Ваттепкее Н.О., 8!еνаηον^с 8. СиШпд ебде: ргебе!егттеб щзбйу о! йитап СЭ8 Т се11к ехрапбеб оп сайЬга!еб МНС/апИ-СО28-соа!еб ткгокрйегек. 1. Iттиηο1. 15 №ν., 2003; 171(10):4974-8) описывают прайминг Т-клеток 1п уйго с использованием искусственных антигенпрезентирующих клеток, который является также подходящим путем генерации Т-клеток против выбранного пептида.

При получении ЦТЛ могут быть также использованы аллогенные клетки, и этот метод детально описывается в патенте \¥О 97/26328, включенном в описание путем ссылки. Например, кроме клеток дрозофилы и Т2-клеток, для презентации антигенов могут использоваться другие клетки, такие как клетки яичника китайского хомяка (СНО), инфицированные бакуловирусом клетки насекомых, бактерии, дрожжи, инфицированные осповакциной клетки-мишени. Кроме того, могут быть использованы растительные вирусы (см., например, Ройа е! а1. (1994), У1го1о§у 202, 449-955), который описывает развитие мозаичного вируса китайской вигны как высокопродуктивную систему для презентации чужеродных пептидов.

Активированные ЦТЛ, которые направлены против пептидов изобретения, применимы в терапии. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, получаемые вышеупомянутыми методами по изобретению.

Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает активированные ЦТЛ, которые селективно распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению. Предпочтительно, чтобы ЦТЛ распознавали указанную клетку при взаимодействии с комплексом НЬА/пептид (например, соединение). ЦТЛ применимы в методе уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, причем пациенту вводится эффективное число активированных ЦТЛ.

ЦТЛ, которые введены пациенту, могут быть получены от пациента и активироваться, как описывалось выше (т.е. они являются аутологичными ЦТЛ). Альтернативно, ЦТЛ получают не от пациента, а от другого индивида. Разумеется, предпочтительно, если индивид является здоровым индивидом. Здоровым индивидом изобретатели обозначают, что индивид в общем имеет хорошее здоровье, предпочтительно он имеет компетентную иммунную систему и более предпочтительно не страдает ни одним заболеванием, которые можно легко проконтролировать и выявить.

Активированные ЦТЛ экспрессируют Т-клеточный рецептор (ТКР), который участвует в распознании клеток, которые экспрессируют аберрантный полипептид. Полезно, если кДНК, кодирующая ТКР, клонирована из активированных ЦТЛ и перенесена на дальнейшие ЦТЛ для экспрессии.

- 12 013876

Клетками-мишенями для СЭ4-положительных ЦТЛ ίη νίνο в соответствии с настоящим изобретением могут быть клетки опухоли (которые иногда экспрессируют МНС класса II) и/или стромальные клетки, окружающие опухоль (опухолевые клетки) (которые иногда также экспрессируют МНС класса II).

ТКР клонов ЦТЛ по изобретению, специфические для пептидов по изобретению, клонируются. Использование ТКР в клонах ЦТЛ определяется использованием (1) ТКР вариабельных регионспецифических моноклональных антител и (ίί) ПЦР с обратной транскрипцией с праймерами, специфическими для семейств генов Уа и Ур. Библиотека кДНК подготовлена из поли-(А)-мРНК, экстрагированной из клонов ЦТЛ. Использовались праймеры, специфические для С-терминального участка ТКР а и Р-цепей, а для Ν-терминального участка - идентифицированные сегменты Уа и Р. Вся кДНК для ТКР а и цепи амплифицировалась высокоточной ДНК-полимеразой, и амплифицированные продукты клонировались в подходящий вектор для клонирования. Клонированные гены а и Р-цепи могут быть организованы в одну цепь ТКР с помощью метода, описанного у С1ипд е! а1. (1994), Ргос. №И. Асай. 8οί. И8А, 9112658. В этой отдельной модели цепи за сегментом Уа1 следует сегмент У Ό1, затем сегмент Ср, затем трансмембранный и цитоплазматический сегмент цепи СЭ3. Эта отдельная цепь ТКР вводится затем в ретровирусный вектор экспрессии (панель векторов может быть использована на основе их способности инфицировать взрослые человеческие СИ 8-положительные Т-лимфоциты и способствовать экспрессии генов: ретровирусная система векторов Ка! является одной предпочтительной возможностью (см. Бтег е! а1. (1994), В1оой 83, 43). Насыщенный амфотропный ретровирус используется, чтобы инфицировать очищенные СЭ8-положительные или СЭ4-положительные Т-лимфоциты, изолированные из периферической крови пациентов с опухолями (следуя протоколу, опубликованному у РоЬеПк е! а1. (1994), В1оой 84, 2878-2889, включенному в описание путем ссылки). Антитела анти-СЭ3 используются, чтобы инициировать пролиферацию очищенных СЭ8' Т-клеток, которая способствует ретровирусной интеграции и стабильной экспрессии отдельной цепи ТКР. Эффективность ретровирусной трансдукции определяется окрашиванием инфицированных СЭ8' Т-клеток антителами, специфическими для отдельной цепи ТКР. Анализ ίη \'йго трансдуцированных СЭ8-положительных Т-клеток устанавливает, что они проявляют такое же опухолеспецифическое уничтожение, как в случае с рестриктированным по аллотипу клоном ЦТЛ, из которого были первоначально клонированы цепи ТКР. Популяции трансдуцированных СЭ8положительных Т-клеток с ожидаемой специфичностью могут быть использованы для адоптивной иммунотерапии пациентов с опухолевыми заболеваниями. Для лечения пациентов можно использовать от 10⁸ до 10¹¹ аутологичных, трансдуцированных ЦТЛ. Аналогично СЭ8-положительным могут быть генерированы трансдуцированные СЭ4-положительные Т-хелперные клетки, несущие соотносимые модели.

Другие подходящие системы для введения генов в ЦТЛ описываются в работе Могйх е! а1. (1994), Ргос. №!1. Асай. 8с1. И8А, 91-4322, включенной в описание путем ссылки. Екййат е! а1. (1993), Ргос. №И. Асай. 8сг И8А, 90,720-724 и Н\\и е! а1. (1993), 1. Ехр. Мей. 178, 361-366 описывают также трансфекцию ЦТЛ. Таким образом, дальнейший аспект изобретения обеспечивает ТКР, который распознает клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению; ТКР, полученный из активированных ЦТЛ.

В дополнение к ТКР, в изобретение включены молекулы, функционально эквивалентные ТКР. Они включают любую молекулу, которая функционально эквивалентна ТКР, которая может выполнять такую же функцию, как и ТКР. В частности, такие молекулы включают полученные генной инженерией трехдоменные одноцепные ТКР, как те, что получены методом, описанным у С1шпд е! а1. (1994), Ргос. №!1. Асай. 8сг И8А, 91, 12654-12658, включенным в описание путем ссылки и указанным выше. Изобретение включает также полинуклеотид, кодирующий ТКР или функционально эквивалентную молекулу, и вектор экспрессии, кодирующий ТКР или его функционально эквивалентную молекулу. Векторы экспрессии, которые подходят для экспрессирования ТКР по изобретению, включают те, что описаны выше в связи с экспрессией пептидов по изобретению.

Тем не менее, предпочтительно, чтобы векторы экспрессии являлись такими, которые способны экспрессировать ТКР в следующей за ЦТЛ трансфекции.

Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность по изобретению, метод, включающий стадии (1) получения ЦТЛ от пациента; (2) введения в указанные клетки полинуклеотида, кодирующего ТКР, или функционально эквивалентную молекулу, как определено выше; и (3) введения клеток, полученных на стадии (2), пациенту.

Другой дальнейший аспект изобретения обеспечивает метод уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, которая определена в первом, или втором, или третьем аспектах изобретения, метод, включающий стадии (1) извлечения антигенпрезентирующих клеток, таких как дендритные клетки, у обозначенного пациента; (2) контактирования указанных антигенпрезентирующих клеток с пептидом, как определено в первом, или втором, или третьем аспектах изобретения, или с полинуклеотидом, кодирующим таковой пептид, ех νί\Ό; и (3) введения обработанных таким образом антигенпрезентирующих клеток снова пациенту.

- 13 013876

Предпочтительно, чтобы антигенпрезентирующие клетки являлись дендритными клетками. Соответственно дендритные клетки являются аутологичными дендритными клетками, в которые импульсным методом введен антигенный пептид. Антигенный пептид может быть любым подходящим антигенным пептидом, который вызывает адекватный Т-клеточный ответ. Т-клеточная терапия с использованием аутологичных дендритных клеток с введенными импульсным методом пептидами из опухолеассоциированного антигена раскрывается у Мигрйу е! а1. (1996), Т1е Рго§1а!е 29, 371-380 аиб Тща е! а1. (1997), Т1е Рго81а1е, 32, 272-278.

В дальнейшем воплощении антигенпрезентирующие клетки, такие как дендритные клетки, контактируют с полинуклеотидом, который кодирует пептид по изобретению. Полинуклеотид может быть любым подходящим полинуклеотидом и предпочтительно, чтобы он был способен к трансдукции дендритной клетки, таким образом приводя к презентации пептида и индукции иммунитета.

Как правило, полинуклеотид может быть включен в вирусный полинуклеотид или вирус. Например, аденовирус-трансдуцированные дендритные клетки проявляли способность индуцировать антигенспецифический противоопухолевый иммунитет по отношению к МИС1 (см. Соид е! а1. (1997), Сеие Тйег. 4, 1023-1028). Подобным образом могут быть использованы системы, основанные на аденовирусе (см., например, \¥ап е! а1. (1997), Нит. Сепе Тйег. 8, 1355-1363); могут быть использованы ретровирусные системы (8рес1! е! а1. (1997), 1. Ехр. Меб. 186, 1213-1221 и 8хаЬо1с5 е! а1. (1997), также может быть использован опосредованный частицами крови перенос в дендритные клетки (Тибпд е! а1. (1997), Еиг. 1. 1ттипо1. 27, 2702-2707); а также может быть использована РНК (АкЫеу е! а1. (1997), 1. Ехр. Меб. 186, 1177-1182).

Следует понимать, что с учетом методов уничтожения клеток-мишеней у пациента особенно предпочтительно, чтобы клетками-мишенями были раковые клетки, более предпочтительно раковые клетки почек или толстой кишки.

Особенно предпочтительно, если пациенты, которых лечат методами данного изобретения, имели гаплотип НЬА-ΌΚ.. Таким образом, в предпочтительном воплощении НЬА-гаплотип пациента определяется до начала лечения.

Гаплотипирование НЬА может быть произведено при использовании любого подходящего метода; такие методы хорошо известны из уровня техники.

Изобретение включает в особенности использование пептидов по изобретению (или кодирующих их полинуклеотидов) для активной вакцинации ΐη угуо; для манипуляции аутологичными дендритными клетками ίη νίΙΐΌ при последующем введении манипулированных таким образом дендритных клеток ίη У1уо для активации ответов ЦТЛ; для активации аутологичных ЦТЛ ίη уйго с последующей адоптивной терапией (т.е. манипулированные таким образом ЦТЛ вводятся пациенту) и для активации ЦТЛ здоровых доноров (МНС-совместимых или несовместимых) ίη νίΙΐΌ с последующей адоптивной терапией.

В предпочтительном воплощении вакцины настоящего изобретения вводятся хозяину либо отдельно, либо в комбинации с другой противораковой терапией для ингибирования или супрессии образования опухолей.

Пептидная вакцина может вводиться без адъюванта. Пептидная вакцина может также вводиться с адъювантом, таким как БЦЖ или квасцы. Другие подходящие адъюванты включают стимулон Ас.|ш1а'5 0821 (Ас.|ш1а Вю!есй, ^огсейег, МА, США), который получают из сапонина, микобактериальных экстрактов и синтетических имитаций бактериальных клеточных стенок и собственно адъювантов, таких как КтЬ1'8 Ие!ох. Также может быть использован Ош1 А, другой, полученный из сапонина адъювант (8ирегГо5. Дания). Также могут быть полезны другие адъюванты, такие как олигонуклеотиды СрС, стабилизированная РНК, имиквимод (имеется в продаже под названием А1бага™, изготавливаемый 3М Рйагта, США), неполный адъювант Фрейнда (имеется в продаже как МогИашбе 18А-51, изготавливаемый 8ерр1с 8. А., Париж, Франция), липосомальные композиции или ГМ-КСФ. Полезным также может быть введение пептида, конъюгированного с гемоцианином лимфы улитки, предпочтительно также с адъювантом.

Пептиды в соответствии с изобретением могут также быть использованы в качестве диагностических реагентов. С использованием пептидов может быть проведен анализ, присутствуют ли в популяции ЦТЛ, такие ЦТЛ, которые специфически направлены против пептида или индуцированы при терапии. Кроме того, увеличение числа предшественников Т-клеток может быть проверено теми пептидами, которые имеют реактивность против означенного пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для контроля прогрессирования опухолевого заболевания, экспрессирующего обозначенный антиген, из которого получен пептид.

В табл. 1 приведены пептиды, которые были идентифицированы, а также названия белков, из которых получен пептид, и соответствующая позиция пептида в соответствующем белке. Кроме того, даются соответствующие инвентарные номера, которые относятся к генному банку Национального центра биотехнологической информации (На11оиа1 Сейте Гог В^о!есйηо1оду Шогтабон) Национального института здоровья (НаОогий ИъбЦЦе оГ Неа11й), см. 1Шр: \ν\ν\ν.ηсЬ^.η1т.η^11.доν.

- 14 013876

В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для окрашивания лейкоцитов, в особенности Т-лимфоцитов. Такое использование имеет особенное преимущество, если необходимо проверить, присутствуют ли в популяции ЦТЛ такие специфические ЦТЛ, которые направлены против пептида. Кроме того, пептид может быть использован в качестве маркера для определения прогрессирования терапии в опухолевом заболевании или нарушении.

В другом предпочтительном воплощении пептиды используются для получения антитела. Поликлональные антитела могут быть получены по стандартному способу иммунизации животных путем инъекции пептида и последующей очистки иммуноглобулина. Моноклональные антитела могут быть получены в соответствии со стандартными протоколами, такими как описываются, например, в Меййобк Епхуто1. (1986), 121, НуЬпбота 1ес1то1оду апб топос1опа1 апйЬоб1ек.

Согласно дальнейшему аспекту изобретение относится к фармацевтической композиции, которая содержит один или более указанных пептидов в соответствии с изобретением. Эта композиция используется для парентерального введения, такого как подкожное, внутрикожное, внутримышечное или оральное введение. Для этого пептиды растворяются или суспендируются в фармацевтически приемлемом, предпочтительно водном, носителе. Помимо этого, композиция может содержать наполнители, такие как буферы, связующие агенты, разрушающие агенты, разбавители, вкусоароматические добавки, смазочные вещества и т.д. Пептиды могут быть также введены вместе с иммуностимулирующими веществами, такими как цитокины. Пространный список наполнителей, которые могут быть использованы в такой композиции, может быть взят, например, из А. К1ЬЬе, НапбЬоок оГ Р11агтасеиНса1 Ехар1епй, 3. Еб., 2000, Атепсап Р1агтасеийса1 А88ос1айоп апб рйагтасеийса1 ргекк. Композиция может использоваться для предупреждения, профилактики и/или лечения опухолевых заболеваний.

Фармацевтический препарат, содержащий по крайней мере один из пептидов настоящего изобретения, включающих любую из последовательностей 8ЕО ГО № 1-49, вводится пациенту, страдающему опухолевым заболеванием, которое ассоциировано с соответствующим пептидом или антигеном. Тем самым может быть инициирован ЦТЛ-специфический иммунный ответ.

В другом аспекте настоящего изобретения комбинация двух или нескольких пептидов в соответствии с настоящим изобретением может быть использована в качестве вакцины либо в непосредственной комбинации, либо в рамках той же лечебной схемы. Кроме того, могут быть использованы комбинации с другими пептидами, например с пептидами, специфическими для МНС II класса. Специалист в данной области будет способен выбрать предпочтительные комбинации иммуногенных пептидов при проверке, например, поколения Т-клеток ш νίΙΐΌ в равной степени, как их эффективности и общего присутствия, пролиферации, аффинности и размножения конкретных Т-клеток для конкретных пептидов, и функциональные свойства Т-клеток, например, при анализе выработки ΙΕΝ-γ (см. также примеры ниже), ИЛ-12 или перфорина. Обычно наиболее эффективные пептиды комбинируются затем в качестве вакцины в соответствии с целями, описанными выше.

Подходящая вакцина будет содержать 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 или 15 различных пептидов, предпочтительно 4, 5, 6 или 7 различных пептидов и наиболее предпочтительно 6 различных пептидов.

Наконец, вакцина может зависеть от специфического типа рака, от которого страдает пациент, которому предназначено лечение, в равной степени как и от статуса заболевания, ранних схем лечения, иммунного статуса пациента и, естественно, от НЬА-гаплотипа пациента.

Было показано, что 80 Ν-терминальных аминокислот Ιί достаточно для направления белков в каскад реакций по процессингу II класса (8апбет§оп, 8., Егаитайй, К. & 8йайй, N. (1995), Ргос. №И. Асаб. 8сЕ И.8.А. 92, 7217-7221, ^апд, К.Е., ^апд, X., Айтооб, А.С, Торайап, 8.Ь. & КокепЬетд, 8.А. (1999), 8с1епсе 284, 1351-1354).

Идентификация эпитопов Т-хелперных клеток опухолеассоциированных антигенов остается важной задачей в противоопухолевой иммунотерапии. Здесь изобретатели сообщают об общеприменимом методе и пептидах, которые были получены из дифференциального пептидного анализа на МС для идентификации естественно процессированных и презентированных лигандов МНС II класса опухолеассоциированных антигенов. Этот подход впервые объединяет стадию трансфекции АПК с вектором, кодирующим для белка слияния между цепью И и интересующим антигеном, элюирование связанных с НЬА пептидов и МС-идентификацию образованных из антигена пептидов, презентируемых трансфицированными по сравнению с нетрансфицированными клетками. Более того, изобретатели могли подтвердить действенность этого метода, показав, что Т-клетки, индуцированные против идентифицированного пептида, специфически распознают трансфектанты, гиперэкспрессирующие родственный антиген. Хотя идентифицированные пептиды все еще должны быть протестированы на их иммуногенность ш у1уо, наш подход ведет к точной характеристике естественно процессированных лигандов МНС II класса. Таким образом, изобретатели избегают тестирования как синтетических перекрывающих пептидов опухолеассоциированных антигенов, так и широкого спектра пептидов, выбранных эпитоппрогнозированием, которое по сравнению с эпитоп-прогнозированием класса I менее точно. В отличие от лабораторных Т-клеточных анализов, которые могут вести к идентификации криптических Т-клеточных эпитопов, не способных индуцировать Т-клеточную активацию ш у1уо (Апбейоп, 8.М.,

- 15 013876

Ушег, Ν.Ι, МаЛаги, Р., Бо^геу, Р.А. & ^гаББ, Э.С (2002), Ναι. Iттиио1. 3, 175-181), работа может быть сфокусирована на нескольких пептидах, которые, как было обнаружено, презентируются. Более того, используя этот метод, не нужно получать рекомбинантные антигены или иметь в наличии антигенэкспрессирующие опухолевые клеточные линии, чтобы доказать, что пептиды являются естественно процессированными.

Изобретатели использовали Ν-конец Б для направления опухолеассоциированных антигенов в компартмент по процессингу II класса ЕВУ-трансформированных В-клеток. С целью достижения этого изобретатели сконструировали многосторонний вектор, с помощью которого можно экспрессировать любой антиген, такой как белок слияния с Б, который помогает авторам определять уровень экспрессии белка в трансфицированных клетках с помощью метода иммунного блотинга (ЛУеЧегп-Ыо!). Уже было показано, что Ν-конца Б достаточно для нацеливания белков в компартмент по процессингу II класса. Но до сих пор это было показано лишь на модели с использованием овальбумина (ЗаиБегкои, З., Ргаи\\'й111. К. & ЗНакБг N. (1995), Ргос. №111. АсаБ. Зс1. и.З.А. 92, 7217-7221) с целью идентификации неизвестного антигена с использованием кодирующих белок слияния библиотек кДНК (^апд, К.Р., ^апд, X., А1\\'ооБ А.С., ТораБап, З.Б. & КокепЬегд, З.А. (1999), Зс1епсе 284, 1351-1354) или для подтверждения специфичности известных клонов Т-клеток (СНаих, Р., Уайотте, У., Зΐ^ооЬаиΐ, У., ТЫе1етапк, К., СойБа1к, 1., БиБеп, К., Еддегтоп!, А.М., Вооп, Т. & уаи Бег Вгцддеп, В.Р. (1999), 1. Ехр. МеБ. 189, 767778). Насколько это известно изобретателям, этот метод никогда не использовался ранее для идентификации естественно презентируемых связанных с МНС II класса пептидов известных опухолеассоциированных антигенов. Дифференциальный анализ лигандов класса II трансфицированных и нетрансфицированных клеток на МАБЭРМЗ и последующая характеристика дифференциально экспрессированных пептидов на ЕЗБМЗ приводит к эффективному методу по идентификации лигандов II класса интересующего антигена. Трансфекция клеток с белками слияния кератин-18 подтвердила, что метод изобретателей общеприменим для интересующих антигенов, и вновь изобретатели были способны описать презентируемый НБА-ЭК пептид из модели трансген, кератин-18.

Идентификация эпитопов Т-хелперных клеток опухолеассоциированных антигенов остается важной задачей в противоопухолевой иммунотерапии. До сих пор были разработаны различные стратегии для идентификации пептидов II класса из опухолеассоциированного антигена, начиная с инкубации АПК с интересующим антигеном для его поглощения и процессинга (СНаих, Р., Уап1отте,У., ЗйооЬап!, У., ТЫе1етапк, К., СойБак, 1., БиБеп, К., Еддегтоп!, А.М., Вооп, Т., апБ уап Бег Вгцддеп, В.Р. 1999. IБеиί^βсаБои оГ МА6Е-3 ерБорек ргекеШеБ Ьу НБА-ЭК то1еси1ек !о СЭ4(+) Т 1утркосу1ек. 1. Ехр. МеБ. 189:767-778) до всевозможных стратегий трансфекции с белками слияния (Пепд)е1, 1., Оескег, Р., ЗсНоог О., АБепЬегепБ, Р., ХУетксНепк, Т., Каттепкее, Н.6., апБ З1еуапоую, З. 2004. IБепί^βсаΐ^оп оГ а иа1ига11у ргосеккеБ сус1ш Ό1 Т-Не1рег ерБоре Ьу а поуе1 сотЬтаБоп оГ НБА с1акк II 1агдеБпд апБ ББГегепБа1 такк кресйотейу. Еиг. 1. Iттиио1. 34:3644-3651).

Для всех этих методов требуется большая затрата времени и часто остается неизвестным, действительно ли происходит презентация идентифицированных лигандов НБА ш у1уо человеческими тканями. Изобретатели смогли впервые показать, что возможна изоляция лигандов НБА II класса напрямую из вырезанных солидных опухолей, идентифицируя, таким образом, пептиды, которые презентируются опухолями и окружающей тканью ш у1уо, которые, следовательно, могут быть распознаны Т-клетками, несущими соответствующий Т-клеточный рецептор, и которые одновременно экспрессируют костимулирующий лиганд С'П4 на их клеточной поверхности. Среди белков, функционирующих как источники для процессируемых эндогенно лигандов НБА II класса, было идентифицировано несколько белков домашнего хозяйства и связанных с иммунной системой белков. Однако пептиды из опухолеассоциированных антигенов (ТАА) также могли быть обнаружены, что ведет к эффективному методу по идентификации ш у1уо-релевантных лигандов II класса ТАА.

Изобретатели идентифицировали три лиганда, обнаруживающих одну центральную последовательность из ЮРВР3, и один лиганд из ММР7. Изобретатели обнаружили эти белки гиперэкспрессированными в почечно-клеточных карциномах, к тому же они были описаны как опухолеассоциированные (М1уато!о, З., Уапо, К., ЗидпиоЮ, З., ПБй, 6., НакеЬе, Т., ЕпБоН Υ., КоБата, К., Соуа, М., СЬ1Ьа, Т. апБ ОсЫа1 А. 2004. МаБгх те1а11орго1е1иа5е-7 ГасПкИек шкиБп-Бке дго\\Б1 ГасЮг ЬюасаПаЫШу (НгондН Бк ргсИеБиаке асРуБу оп ткиБп-Бке дго\\111 Гас!ог ЬшБшд рго!еш 3. Сапсег Кек. 64:665-671; Зит1, Т., Nакаίап^, Т., УокЫБа, Н., Нуип, Υ., Уакиг Т., Макито1о, Υ., Nакада\νа. Е., Зидтига, К., Ка^акЫта, Н. апБ ШБко О. 2003. Ехргеккюп оГ таБгх теПИоргсИетакек 7 апБ 2 т Нитап гепа1 се11 сагсшота. Опсо1. Кер. 10:567-570; СНеипд, С.№., Уекеу, Э.А., №со1 Э.Б. апБ .кБткои ϋ.'Μ. 2004. ТНе го1ек оГ ЮР-Σ апБ ЮРВР-3 ш 1Не гедикЮои оГ ргох1та1 1иЬи1е, апБ гепа1 се11 сагстота се11 ргоБГегаБоп. К1Бпеу ШЕ 65:1272-1279). Эти пептиды связывались беспорядочно с молекулами НБА II класса и были способны активировать СП4-положительные Т-клетки различных здоровых доноров. Таким образом, подход изобретателей будет полезен при идентификации новых пептидов-кандидатов II класса из ТАА для использования в клинических протоколах по вакцинации.

- 16 013876

Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в соответствии с настоящим изобретением, включающему введение пациенту эффективного объема пептида в соответствии с настоящим изобретением, или нуклеиновой кислоты в соответствии с настоящим изобретением, или вектора экспрессии в соответствии с настоящим изобретением, причем объем указанного пептида, или объем указанной нуклеиновой кислоты, или объем указанного вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у обозначенного пациента.

Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в соответствии с настоящим изобретением, включающему введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов, как определено в соответствии с настоящим изобретением.

Изобретение в дальнейшем аспекте относится к способу уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность, данную в соответствии с настоящим изобретением, включающему стадии (1) получения цитотоксических Т-лимфоцитов от пациента; (2) введения в указанные клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей Тклеточный рецептор или функционально эквивалентную молекулу, как определено в соответствии с настоящим изобретением; и (3) введения клеток, полученных на стадии (2), пациенту.

Предпочтительно, чтобы клетки-мишени являлись раковыми клетками. Более предпочтительно, чтобы указанный рак являлся лейкемией или лимфомой, которая экспрессирует полипептид, который включает аминокислотную последовательность, которая дана в соответствии с настоящим изобретением.

В контексте настоящего изобретения было неожиданно установлено, что опухолевые клетки солидных опухолей, в отличие от здоровых клеток той же ткани, экспрессируют человеческие молекулы НЬА II класса на их поверхности. Этот факт был описан лишь раз у В гака лас е! а1. (В гака нас Ό., Ма^кον^с-^^ρкονкк^ I., Наб/бОркю I., Ми11ег О.А., Ми11ег С.А. IттиηοЫκ!οсйет^са1 аηа1ук^к οΓ НЬА с1акк II аηί^деηк алб !итο^ шГ11!га!тд тοηοηис1еа^ се11к ίη гела1 се11 сагснюта: ^π^Μοη χνίίΐι с1 1П1си1 алб ЫкЮрабю^щса! ба!а. Nеορ1акта. 1999; 46(3): 173-8), где криостатные срезы 37 почечно-клеточных карцином (ЯСС) - 25 светло-клеточный тип, 10 гранулярный и 2 хромофобный - были исследованы непрямым иммунопероксидазным методом с применением моноклональных антител (МοΑЬ) к антигенам НЬА-ЭЯ, -ЭР и -ЭР для анализа антигенов НЬА класса II и анти-СП14, -СЭ3, -СЭ4 и -СЭ8 МοΑЬ для опухоль-инфильтрующих мононуклеарных клеток (ТГМ). Число положительных клеток оценивалось полуколичественным методом, а результаты иммуногистохимического исследования были соотнесены с клиническими (возраст и пол пациента, размер опухоли и классификация по ΤΝΜ) и гистопатологическими (цитология, гистология, степень) характеристиками ЯСС. Все ЯСС экспрессировали НЬА-ЭЯ, 92% -ЭР- и 73% -ЭР-антигены с уровнем экспрессии в соотношении -ОЯ>-Эр>-ПР, однако не было установлено никакой значимой связи с какими-либо проанализированными гистопатологическими или клиническими параметрами. Моноциты были более многочисленны, чем Т-лимфоциты, а Т-клетки СЭ4⁺, чем СЭ8+, причем опухоли с преобладанием Т-лимфоцитов и приблизительно равным числом СЭ4' и СЭ8+ Т-клеток имеют наибольший средний диаметр. Неадекватная активация Т-лимфоцитов опухолевыми клетками (несмотря на способность презентации антигена) могла быть причиной для ассоциации параметров, которая свидетельствует о более агрессивном поведении опухоли с аберрантной экспрессией антигена НЬА II класса на ЯСС.

Должно быть понятно, что отличительные черты изобретения, раскрываемые и описываемые здесь, могут быть использованы не только в соответствующей комбинации, как было показано, но а также и в отдельной модели без выхода из рамок, обозначенных настоящим изобретением.

Далее изобретение будет описано более детально посредством ссылок на последующие фигуры, примеры и список последовательностей. Примеры приведены исключительно для иллюстрационных целей и не предназначены для ограничения изобретения.

Последовательности 8 Ер Ш № 1-49 демонстрируют пептидные последовательности

Т-клеточного эпитопа, содержащего пептиды, которые презентируются МНС класса II в соответствии с настоящим изобретением. Последовательности 8ЕР Ш № 50-8ЕР Ш № 79 демонстрируют пептидные последовательности из табл. 3.

Фиг. 1 показывает экспрессию молекул НЬА II класса в ЯСС трех пациентов. Тогда как в опухоли пациента ЯСС132 НЬА-положительные клетки были предпочтительно локализованы в пределах (А, В), образцы экспрессии НЬА II класса опухолей пациента ЯСС 190 и ЯСС211, обнаруживающие более папиллярную структуру, были распространены более равномерно (С, Е, О). Визуализация СЭ68-положительных макрофагов (В, Ό, Е) в серийных тканевых срезах иллюстрирует близкую пространственную связь опухоль-инфильтрующих мононуклеарных иммунных клеток и экспрессирующих НЬА II опухолевых клеток. Инкубация с мышиным !§С вместо специфических антител сообразно показала отрицательные результаты окрашивания (Н). Заглавной Т отмечена опухоль.

- 17 013876

На фиг. 2 представлен анализ СП4-положительных Т-клеток, специфических для ЮЕВР31_69-1₈1, ММР7_247-262 и €?0ΝΟ1|_98-2Ι2, на клеточном сортере с возбуждением флуоресценции (ЕАС8). Представлены также репрезентативные дот-блоты внутриклеточного окрашивания ΓΕΝ-γ против СЭ4-ПТС.

На фиг. 3 представлена схематическая иллюстрация антигенспецифических вырабатывающих ΙΕΝ-γ СЭ4-положительных Т-клеток, обнаруженных у каждого донора и для каждого пептида. Показано процентное выражение вырабатывающих ΙΕΝ-γ СП4-положительных Т-клеток для каждого донора и пептида, использованного для стимуляции. Клетки культивировались в 96-луночных планшетах - 7 лунок на донора и пептид. В прямоугольниках стоят значения, рассматриваемые как положительные: процентное выражение вырабатывающих ΙΕΝ-γ СЭ4-положительных Т-клеток более чем в 2 раза выше по сравнению с отрицательным контролем без пептида. Процентное выражение вырабатывающих ΙΕΝ-γ СГО4-положительных Т-клеток, обнаруженных после стимуляции с нерелевантным пептидом, соотносится со значениями после стимуляции без пептида, за исключением Донора 1 после 3-й стимуляции ЮЕВР31_69-1₈1. Однако этот эффект после 4-й стимуляции более не наблюдался.

На фиг. 4 представлена экспрессия молекул НЬА II класса в ССА165 (умеренно дифференцированная аденокарцинома толстой кишки). На Ьатта ргорпа участков с нормальной кишечной слизистой оболочкой (секция с и левая часть секции а, отмечены звездочкой) характерно наблюдалось несколько положительных макрофагов НЬА II класса, но эпителиальные клетки были стабильно отрицательны для экспрессии НЬА II класса. В эпителиальных клетках различных участков опухоли, тем не менее, была замечена ясно выраженная экспрессия НЬА II, как показано с правой стороны секции а и в секциях Ь и б.

На фиг. 5а и 5Ь представлена идентификация пептидной последовательности пептидов, элюированных из молекул НЬА класса II, изолированных из первичной опухолевой ткани человека при массспектроскопии.

Фиг. 5а: фрагменты, полученные при фрагментации естественно процессированных и презентированных лиганд НЬА II класса из ММР7, соответствующие пептидной последовательности 8Е0 ГО № 1 (80ΟΟ[Ι<6[0Ι<ΕΥ6Ι<Ε8). Аннотированные фрагменты представлены в табл. 5.

Фиг. 5Ь: фрагменты, полученные при фрагментации синтетического пептида, имеющего пептидную последовательность 8Е0 ГО № 1. Фрагментации как синтетических, так и естественно процессируемых пептидов показывают эквивалентные фрагментационные образцы и позволяют вывести и подтвердить первичную аминокислотную последовательность не охарактеризованной прежде пептидной последовательности (8Е0 ГО № 1) этого лиганда НЬА II класса человеческого ММР7.

Таблица 1

Пептидные последовательности, расположенные в соответствии с фрагментом НЬАГОКВ1*0101.

Пептиды с показателями выше 19 рассматривались как связки ΌΚΕ1*0101 Последовательность Символ № продукта: Позиция Показатель № послед-ти гена 8ΥΓΡΕΙΤΗΙ

-3 -2 -1 123456789 + + +

I 2 3

1.	5 р О	О I	К О	1 9	К ί Υ С К К 8	ММР7	ΝΡ_0024Ι4	247-262	35	8Εζ> Ю-Νο.	33
2.	N	к ς	К Р	I т	ретаекьако	СОС42	ΝΡ_426359	132*148	26	8ΕΟ Ю-Νο.	2
3.	О	0 Р	8 Т	I Е	КЬ А К N кок Р	СОС42	ΝΡ-426359	121-136	19	8Ε9 ΙΟ-Νο.	3
4.			N Р	Ь К	I Е Р 8 КК I Ь К К Н	СОНЗ	ΝΡ_Ο01784	91-105	27	БЕС} ΙΟ-Νο.	4
5.		Е	Т О Ь	ььикр ь υ к	СРНЗ	ΝΡ 001784	163-175	19	$Ер ΙΟ-Νο.	5
6.		О	N Е	ь Ъ	ЕМЗ N (? О 8 К	сои	ΝΡΟ01822	80-92	24	ЗЕр ΙΟ-Νο.	6
7.		А А	6 Ь	Ь 3	Т Υ и р ь 8 8 н	С0Е15А1	ΝΡ_001846	1243-1257	24	ΙΟ-Νο.	7
8.	А Р 3 Ь	К. Р	К О	Υ Е	V ЭА Т Ь К 8 Ь NN р	СОЫА2	ΝΡ.000080	1125-1145	25	5Ε3 ΙΟ-Νο.	8
9.	6	Р V	β Е	V К	Е Ьр КА 1 С А V Р	СТ80	ΝΡ 001900	303-319	26	5Ε9 ΙΟ-Νο.	9
10.		I	N Н	V V	8 V А С I ЗОС	стзг	ΝΡ_001327	239-253	33	8Ер ΙΟ-Νο.	10
11.	ν р о	ϋ к	О Г	Е Р	8 ЬС Р УС Р Р К	осы	ΝΡ 001911	40-57	23	8Ε9 Ю-Νο.	11
12.	Ь Р р 8	I V	Υ К	Υ м	8 Н 8 ОК 8 V Р 5	ΕΓΕΜΡΙ	ΝΡ_004096	389-408	30	5ΕΟ ΙΟ-Νο.	12
13.		I V	И К.	Υ м	Г I Т 8 Е К 8 V Р А	ЕРЕМР2	ΝΡ 058634	343-358	30	8Ε<) Ю-Νο.	13
14.		к	N С	Г V	V ЬКС К Р ск	ΕΙΕ5Α	ΝΡ 001961	27-39	2«	5Ε3 ΙΟ-Νο.	14
15.	I	т о	Υ 1	I к	ΥΕΚ Р 0 8 Р Р	ΡΝ1	ΝΡ_002017	1930-1944	23	ЗЕр ΙΟ-Νο.	15
16.		с	А Т	Υ N	I I V Е А Ь К ϋ 0	ΕΝ1	ΝΡ_002017	2134-2147	20	8Ε<} ΙΟ-Νο,	16
17.	ί то	Υ к	V К	V т	Р КЕ кто р	ΡΝ1	ΝΡ_002017	1749-1764	21	ΙΟ-Νο.	17
18.	1 Р с	н ь	N 5	Υ т	1 КО ί К Р с	ΡΝ1	ΝΡ_002017	659-674	24	8Ε9 ΙΟ-Νο.	18
19.			N	Ь к	Р Е АТ Т Р N8 Е	ΓΝ1	ΝΡ_997640	1908-1919	26	5Εζ> Ю-Νο.	19
20.		5 N	т о	Ь V	Р А Р А V К I Р т Р Е	СОЕ 15	ΝΡ_004855	76-92	25	$Ер ΙΟ-Νο.	20
21.			А Е	I ь	Е Ь А С N А А К 0 N	Н2АП	ΝΡ 808760	61-74	32	$Ер ΙΟ-Νο.	21
22.		V к	Е Р	V А	V Ь К А N К V V/ С А Е	НЕХВ	ΝΡ_000512	153-169	32	8Ε0 ΙΟ-Νο.	22
23.		т	А Е	I ь	Е Ь ΑΟΝ АА К 0 N К	ΗΙ8Τ3Η2Α	ΝΡ.254280	60-75	32	5ЕС> ΙΟ-Νο.	23
24.	Н Р	ь н	3 К	I I	I I К К С Н А К	1СРВРЗ	ΝΡ 000589	166-181	25	8Ε(2 ΙΟ-Νο.	24
25.	Н 5	К I	I I	I к	КОНА КО 8 0	Ι0ΕΒΡ3	ΝΡ 000589	169-184	28	8Ε0 ΙΟ-Νο.	25

- 18 013876

26.		К Р К	н	Т К I δΕΕΚΑΕΑνΚΚΠ				Ϊ0ΡΒΡ5	ΝΡ 000590	138-155	32	5Εζ> Ιϋ-Νο.	26
27.		б Р	Е	ΏΝ V V I I Υί 5 К. А б N Р	Е			18ЬЯ	ΝΡ 005536	380-397	26	5Ε0 Ιϋ-Νο.	27
28.		5	К	Р V I N I О К Т 1 Т V Т Р N				1ΊΌΑ6	ΝΡ 000201	464-479	32	8Ε<) Ιϋ-Νο.	28
29.		В Ь 5	Р	М<?1АК[.Р5ОЬРУ				ьим	ΝΡ_ΟΟ2336	189-205	30	8Ε6 Ιϋ-Νο.	29
30.		К	ь	Р8УЕСЬНА1УУ8ОК				ΜΑΡ2Κ1ΙΡ	ΝΡ_068805	12-27	32	5Εζ)1ϋ·Νο.	30
31.		ϋ	т	5 ТЬЕММНАРКСО				ММР12	ΝΡ_002417	80-93	23	5Ε6 Ιϋ-Νο.	31
32.	ϋ О N т	I	Е ТЮК Р К. С О N Р ϋ				ММР2	ΝΡ 004521	90-106	20	5Ε(2 Ιϋ-Νο.	32
33.		N	Р	ОЕ ΥΚУТАНА Е С ΥΤ Р	8			АЕВР1	ΝΡ_001Ι20	947-963	20	8Ε6 Ιϋ-Νο.	1
34.			ь	О Р ЬКА V ϋ ΤΝΚΑ 5 Уб				РЬХРС2	ΝΡ.116201	69-83	29	δΕ(? Ιϋ-Νο.	34
35.				Η О N () I А Т N С V V Н	V	I	ϋ к	ΡΟ8ΤΝ	ΝΡ 006466	213-228	23	δΕςίΒ-Νο.	35
36.				КА1ЕАЬНСНЕ1Л?О				К.ВМ14	ΝΡ_006319	50-63	32	8Ε0 Ιϋ-Νο.	36
37.	О Р	О V ί	ϋ	К ММ к К Ь ϋ Т N 8 В				δίΟΟΑΐ!	ΝΡ_005611	56-72	25	8Ε(2 Ιϋ-Νο.	37
38.		N	Е	ЕЕ I К ΑΝ V А VV 5 6 А Р				5БСВР	ΝΡ.00100706	56-71	26	8Ε6 Ιϋ-Νο.	38
39.			Р	АИ5ЕА5АР1РН				δϋΟΒΡ	ΝΡ00100706	29-41	24	ЗЕС? Ιϋ-Νο.	39
40.				КУ I 0 АфТ А Г 8 ΑΝ Р А				8ОСВР	ΝΡ_00!00707	14-27	30	8ΕΟ Ιϋ-Νο.	40
41,		N	6	ΑΥΚΑ I Р V А φ ϋ Ь N А Р	8			8РР1	ΝΡ.000573	183-201	19	БЕС? Ιϋ-Νο.	41
42.			т	ΝΟννΗνίΤΝνίΟΡΡ	А			ΤΟΕΒΙ	ΝΡ 000349	621-636	29	8Ер Ιϋ-Νο.	42
43.		Т Т	ΤΟίΥΤΟΚΤΕΚΙΚΡΕ				ΤΟΕΒΙ	ΝΡ_000349	116-131	23	$Εζ) Ιϋ-Νο.	43
44.				ОККЕ Υ Ь I АС К А Е б ϋ	б			ΤΙΜΡ2	ΝΡ.003246	106-120	25	5Ε(2 Ιϋ-Νο.	44
45.				МО Е I А 8 Г ЭКАК Ь	К	К	т	ТМ8В10	ΝΡ_066926	6-20	20	δΕς» ΐϋ-Νο.	45
46.			м	АЕ1ЕКГВК$КЬКК				ΤΜ8Β4Υ	ΝΡ_Ο04193	6-19	19	£Εζ> Ιϋ-Νο.	46
47.			V	V 5 5 I Е ОКТ Е б А Е К К				Υ\ΥΗΑΖ	ΝΡ_003397	61-75	22	БЕр Ιϋ-Νο.	47
48.			н	5 К 1 I I I ККСН А К				16РВРЗ	ΝΡ 000589	169-18)	25	5Ёр Ιϋ-Νο.	48
49.				N Р Р 8МУА АО 8 V V А	А	V		66Νϋ1	ΝΡ_444284	198-212	24	5Ер Ιϋ-Νο.	49

Примеры

Материалы и методы.

МНС класса II иммуногистология.

Опухоли обрабатывались Д%-ным раствором формальдегида в фосфатном буфере, заливались парафином, окрашивались гематоксилин-эозином и исследовались световой микроскопией. Диагностика ЯСС производилась в соответствии со стандартными гистопатологическими и иммуногистологическими исследованиями (Е1еттд, 8. аиб СПоииеН, М. 2000. 8игд1са1 ра!йо1оду оГ геиа1 ерййейа1 иеор1актк: гесеи! абуаисек аиб сиггеи! к1а1ик. Н1к!ора!йо1оду, 36:195-202).

Для иммуногистологического обнаружения молекул МНС класса II или молекул СЭ68 соответственно 5 мкм залитых парафином тканевых срезов обрабатывались предварительно 10 мМ буфера цитрата, рН 6, затем производилась инкубация либо с мышиным анти-НЬА-ЭЯ тАЬ с альфа-цепью (клон ТАЬ.1В5, 1:50) или СЭ68 АЬ (клон РСМ1, 1:50) (ΠΆΚΟ, НатЬигд, Германия), либо с мышиным [дС1 (2 мкг/мл, ΒΌ Вюкаеисек Рйагттдеи, 8аи Э1едо, США) и визуализировались при помощи Уеи!аиа 1У1ете ЭАВ бе!есйои кй (Ыехек 8ук!ет, Уеи!аиа Меб1са1 8ук!етк, Шкйсй, Франция). С тканевыми срезами было произведено контрастное окрашивание гематоксилином и, наконец, они были залиты средством Еи!е11аи.

Элюирование и молекулярный анализ НЬА-ЭЯ-связывающих пептидов.

Замороженные пробы обрабатывались, как было описано ранее (^ешксйеик, Т., СоийеГаηдеак, С., 8сЫг1е, М., ОЬегтауг, Г., \Уа11ег 8., 8сйоог, О., Кигек, Я., Ьоекег, ^., ВкЫег, К.Н., \Уегпе1 Ό., 81еуаиоу1с 8. аиб Яаттеикее Н.С. 2002. ШедгаЯб Гиисйоиа1 деиоткк арргоасй Гог !йе бек1ди оГ ра!1еи!-тб1У1биа1 аиШитог уассшек. Саисег Яек. 62:5818-5827), а пептиды изолировались в соответствии со стандартными протоколами (Эеид]е1, I., Яаттеикее Н.С. аиб 8!еуаиоу1с, 8. 2005. С1усаи к1бе сйатк ои иа!ига11у ргекеи!еб МНС с1акк II йдаибк. I. Макк 8рес!гот. Д0:100-10Д) с использованием НЬА-ЭЯспецифических тАЬ Ь2Д3 (Ьатркои, Ь.А. аиб Ьеуу Я. 1980. Т\уо рори1абоик оГ йа-йке то1еси1ек ои а йитаи В се11 1те. I. Iттиио1. 125:293-299).

Естественные пептидные смеси были проанализированы обратнофазной ВЭЖХ ИШта!е НРЬС (Эюиех, Атк!егбат, №1йег1аибк), соединенной с 0-ТОР I масс-спектрометром (^а!егк, ЕксйЬоги, Сегтаиу) или обратнофазной системой ВЭЖХ СарЬС НРЬС, соединенной с О-ТОЕ ИШта АРI (^а!егк), как описывалось ранее (Ьетте1, С., ^е1к, 8., ЕЬег1е, и., Эеид)е1, I., Кгай, Т., Вескег, Н.Э., Яаттеикее Н.С. аиб 8!еуаиоу1с 8. 200Д. □йГегеитй диаШйабуе аиа1ук1к оГ МНС йдаибк Ьу такк кресйотейу иктд к!аЬ1е 1ко!оре 1аЬе1тд. №И. В|о1есйпо1. 22:Д50-Д5Д). Фрагментационные спектры анализировались вручную и автоматически.

Анализ экспрессии генов с помощью высокоплотных олигонуклеотидных микрочипов.

Изоляция РНК из опухолевых и аутологичных проб нормальной почки, а также анализ экспрессии генов с помощью олигонуклеотидных микрочипов Айуше!пх Нитаи Сеиоте И133 Р1ик 2.0 (А££уте!пх, 8аи!а С1ага, СА, США) были произведены, как описывалось ранее (Кгцдег, Т., 8сйоог, О., Ьетте1, С., Кгаетег, В., Яекй1е, С., Эеид)е1, I., ^етесйеик, Т., Мй11ег, М., Неηηеη1ойе^, I., 81е1'1х1, А., Яаттеикее, Н.С. аиб 8!еуаиоу1с, 8. 200Д. Ьеккоик !о Ье 1еагиеб Ггот рптагу геиа1 се11 сагстотак: иоуе1 !итог аийдеик аиб НЬА йдаибк Гог иптипоШегару. Саисег Iттиио1. Iттииоΐйе^). Данные анализировались программой ССО8 (АГГуте1пх). Для попарного сравнения опухолевых и аутологичных нормальных почек использовался соответствующий обычный анализ в качестве исходного. Для ЯСС1Д9 и ЯСС211 не имелось данных анализа аутологичной нормальной почки. Поэтому суммарная здоровая почечная РНК человека была куплена (С1ои!есй, Не1бе1Ьегд, Германия) и использовалась в качестве исходных данных для этих опухолей.

- 19 013876

Созревание дендритных клеток (ЭСк).

ЭСк были получены из крови здоровых доноров. Вкратце, МПК были изолированы с использованием стандартного градиентного центрифугирования (Ьутркосу!е 8ерагабоп Мебшт, РАА ЬаЬогаЮпек СтЬН, РаксЫпд, Аикбга) и высеивались с плотностью 7x10 клеток/мл в среду Х-Уй'о 15. После 2 ч при 37°С неадгезивные клетки были удалены, а адгезивные моноциты культивировались 6 дней в среде Х-Уй'о со 100 нг/мл ГМ-КСФ (гранулоцитарно-макрофагальный колониестимулирующий фактор) и 40 нг/мл ИЛ-4 (АЬ-ИптипоТооИ Рбекоу1ке, Германия). На 7-й день незрелые ЭСк были активированы 10 нг/мл ТЫР-а (К&И 8ук!етк, V^екЬабеη, Германия) и 20 мкг/мл ро1уДС) (81дта А1бпск, 8!е1пке1т, Германия) на 3 дня.

Получение антигенспецифических СЭ4-положительных Т-клеток.

10⁶ МПК на лунку были простимулированы 2х10⁵ аутологичными ЭСк (5 мкг/мл) с введенным импульсным методом пептидом. Клетки культивировались в 96-луночных планшетах (7 лунок на донора и пептид) в Т-клеточной среде: дополнительно КРМI 1640 в присутствии 10 нг/мл ИЛ-12 (Рготосе11, Не1бе1Ьегд, Германия). После 3-4 дней коинкубации при 37°С добавлялась свежая среда с 80 и/мл ИЛ-2 (Рго1еикт, СЫгоп Согрогабоп, ЕтегууШе, СА, США) и 5 нг/мл ИЛ-7 (Рготосе11). Рестимуляции производились аутологичными МНК плюс пептид каждые 6-8 дней.

Внутриклеточное окрашивание ΓΕΝ-γ.

После 3-4 циклов стимуляции МПК размораживались, промывались дважды в среде Х-^уо 15, ресуспендировались при 10⁷ клеток/мл в Т-клеточной среде и культивировались в течение ночи. На следующий день МПК с введенным импульсным способом пептидом 5 мкг/мл инкубировались с эффекторными клетками в соотношении 1:1 в течение 6 ч. Со1д1-81ор (Вес!оп Июкгпкоп, Не1бе1Ьегд, Германия) добавлялся для заключительных 4 ч инкубации.

Клетки анализировались с использованием комплекта СуЮбх/СуЮрегт Р1ик (Вес!оп Июкткоп) и СП4-ЕТГС- (Тттипо1оо18), ΣΕΝ-γ-РЕ- и антител СИ8-РегСР клон 8К1 (Вес!оп Июкткоп). Для отрицательного контроля были объединены клетки из семи лунок и инкубировались или с нерелевантным пептидом, или без пептида соответственно. Стимуляция ФМА/иономицин использовалась для положительного контроля. Клетки анализировались на трехцветном сортере с активацией флуоресценции РАС8СабЬиг (Вес!оп Июкткоп).

Экспрессия НЬА II класса при КСС.

При нормальных условиях и отсутствии воспаления молекулы НЬА класса II должны экспрессироваться только клетками кроветворной системы и тимусным эпителием (Маск В., 81е1т1е, V., Магкпех-8опа Е. апб Кейк V. 1996. Кеди1абоп о! МНС с1акк II депек: 1еккопк !гот а бйеаке. Аппи. КеуТттипок 14:301-331). Ситуация меняется во время воспаления. Экспрессия НЬА II класса может индуцироваться в большинстве видов клеток и тканей ΣΕΝ-γ (Ье1Ь ипб СибЬапбтапп, 8., Vа1бЬи^де^, ЕМ., Кгатесхук, М., Обеп, Ь.А., 8и1ег, Т., Роп!апа, А., Аска-ОгЬеа, Н. апб Кейк V. 2004. М1ш-геу1ете: 8респсйу апб ехргеккюп о! СИТА, (ке так(ег гедц1а!ог о! МНС с1акк II депек. Еиг. 1. Iттиηο1. 34:1513-1525). Так как возникновение КСС часто сопровождается воспалительными явлениями (В1ау, ЕУ., Кокку ЕР., ’№убепек, 1., Мепебтег-Саих, С., 8скетапп, 8., Ыедбег, 8., РкШр, Т. апб Рауго! М. 1997. Ко1е о! т!ег1еикт-6 ш (ке рагапеор1акбс б1Патта1огу купбготе аккоаа1еб тейк гепа1-се11 сагсшота. Ηΐ. 1. Сапсег 72:424-430; Е1каккег-Вейе, и., Ктбк!икег, М., Сгиккептеуег, Т., 8скик/е-8еетапп, V. апб и. Vейе^аие^. 2000. Епкапсеб ехргеккюп о! ШЫ-датта тКЫА т СИ4(+) ог СП8(+)1итоиг-1пбЙгабпд 1утркосу!ек сотрагеб !о ребркега1 1утркосу!ек ш рабейк тейк гепа1 се11 сапсег. Вг. 1. Сапсег 83:637-641), то, как сообщается, молекулы II класса действительно экспрессируются вблизи опухолей или самими опухолями.

Иммуногистохимическое окрашивание молекул НЬА II класса.

Изобретатели анализировали экспрессию НЬА II класса десяти проб КСС, включая гистологическую светло-клеточную и папиллярную почечную карциному, иммуногистохимическим окрашиванием и выявили, что все обследованные пробы обнаруживают положительные опухолевые клетки II класса. Как показано на примере фиг. 1А, названная экспрессия НЬА II класса часто обнаруживалась на границе опухоли. На этих участках изобретателями наблюдалась близкая пространственная взаимосвязь НЬА положительных опухолевых клеток с инфильтрующими опухоль иммунными клетками, как это иллюстрирует визуализация СИ68-положительных макрофагов в серийных тканевых срезах (фиг. 1В). В КСС, обнаруживающих более папиллярную структуру, экспрессия молекул НЬА II класса была распространена более равномерно по опухоли (фиг. 1С, Е, С). Сравнение образцов НЬА II класса и СЭ68 иммуногистохимического окрашивания в серийных тканевых срезах отчетливо демонстрирует, что, помимо макрофагов, опухолевые клетки также экспрессируют НЬА II класса (фиг. 1С, Ό и Е, Р). Было показано, что НЫ^-продуцирующие СЭ4-положительные клетки Т_Н1 в равной степени, как и естественные киллерные клетки (ЫК), инфильтрируют КСС (Сохаг ЕМ., Сайоп, 1., Та11аба, М., Сопска, А., СаЬгега, Т., Сатбо, Р. апб Ешх-СакеНо, О.Р. 2005. Апа1укй о! ЫК се11к апб скетокте гесерЮгк ш (итог шййгабпд СЭ4 Т 1утркосу!ек ш китап гепа1 сагстотак. Сапсег Iттиηο1. !ттипо1кег). Так как положительные опухолевые клетки II класса были обнаружены преимущественно во внешних частях вырезанных опухолей, можно

- 20 013876 спекулировать, что лейкоциты, привлеченные опухолью, вырабатывают ΓΕΝ-γ, который воздействует на соседние злокачественные клетки. Аномальная экспрессия молекул НЬА II класса в неопластической ткани не ограничивается ВСС, она может также быть обнаружена в ТСС (переходно-клеточная карцинома) и ССА (светло-клеточная аденокарцинома). На фиг. 4 представлено иммуногистохимическое окрашивание проб ткани аденокарциномы толстой кишки человека.

Анализ экспрессии ΣΡΝ-γ и транскриптов генов, индуцированных ΣΡΝ-γ.

Изобретатели исследовали также экспрессию НЬА II класса с помощью сравнительного анализа генной экспрессии с использованием олигонуклеотидных микрочипов. Благодаря этой технике изобретатели были в состоянии оценить общую экспрессию НЬА II класса в вырезанных опухолях независимо от типа экспрессирующих клеток. Изобретатели проанализировали дифференциальную экспрессию в четырех опухолях: ВСС149, ВСС180, ВСС190 и ВСС211 в сравнении с нормальной исходной почкой. Во всех четырех опухолях были обнаружены гиперэкспрессированные гены, кодирующие молекулы НЬА II класса (табл. 2). Одной из возможных причин этого может быть индуцированная ΣΡΝ-γ экспрессия, и по этой причине изобретатели искали другие гены, о которых известно, что они могут активироваться интерферонами (Ко1сйапоу. КА., [дпайеуа. Е.У., Апапко, Е.А., Робко1обпауа, Т.Ь. 8!ерапепко, Т.к МегкЫоуа. М.А. Рοζбηуакον, Ν.Β Робко1обпу, А.К №итос11кй1 О.А. апб Вотазйсйепко, А.О. 2002. Тгапзспрйоп Веди1а!огу Ведюпз Эа!аЬазе (ТВВЭ): йз з!а!из т 2002. №с1ею Ас1бз Вез. 30:312-317). Интересно то, что значительное число таких генов было обнаружено в гиперэкспрессированном состоянии в одной или более опухолевых пробах. В табл. 2 представлены интерферон-индуцируемые гены, которые были активированы достоверно во всех четырех пробах в соответствии с более ранними открытиями изобретателей (^етзсйепк, Т., СоийеГапдеаз, С., 8сЫг1е, М., ОЬегтауг, Ρ., ^айег, 8., 8сйоог, О., Кигек, В., Ьоезег, ^., Вюй1ег, К.Н., ХУегпек Ό., 81еуапоу1с, 8. апб Ваттепзее, Н.С. 2002. И-Цедн-Иеб Гипс1юпа1 депотюз арргоасй Гог !йе без1дп о! ра!1еп!-тбМбиа1 апШитог уасстез. Сапсег Вез. 62:58185827). Среди них находятся ЬМР2, ЬМР7 и МЕСЫ - белки, которые заменены на конститутивные субъединицы крупного протеолитического голоэнзима, находящегося в цитозоли, протеасоме, для формирования иммунопротеасомы. Замена нормально экспрессированных протеолитических субъединиц протеасомы на IΡN-γ-индуцируемые субъединицы представляет собой важнейший процесс в богатом интерфероном окружении. К тому же была произведена непосредственная оценка ΞΕΝ-γ с помощью количественного анализа в реальном времени (ВТ) РСВ (ТадМап). Опухоли, представленные в табл. 2, показывали в 5 и до 60 раз большую гиперэкспрессию ΖΕΝ-γ мРНК в сравнении с аутологичными нормальными пробами РНК того же донора (данные не приводятся). Таким образом, результаты, полученные изобретателями, указывают на то, что ΧΕΝ-γ может играть важную роль в ВСС и быть причиной избыточной экспрессии II класса.

Экспрессию в опухолевых пробах сравнивали с аутологичными нормальными почками (ВСС180, ВСС190) или объединенными здоровыми почками (ВСС149, ВСС211). Все гены показывали повышение в алгоритме сйапде-са11 программы ОСО8 для всех четырех опухолей и были описаны как интерферон-индуцируемые.

- 21 013876

Таблица 2

Экспрессия мРНК интерферон-индуцируемых генов

Символ гена	идснг. номер гена	Название гена	в раз, гиперэкспрессия, опухоль
против нормы	КСС211
НСС149	КСС180	КСС190
НЬА-РРА!	3113	главный комплекс гистосовместимости, II класса, РР а1рЬа 1	3,5	3,7	4,9	13,9
НЬА-РРВ1	3115	главный комплекс гистосовместимости, II класса, РР Ье1а 1	2,6	2,5	2,8	14,9
НЬА-РфВ!	3119	главный комплекс гистосовместимости, II класса, Рр Ьс1а 1	4,3	4,0	6,5	5,3
НЬА-РКВ!	3123	главный комплекс гистосовместимости, II класса, ПК Ье[а 1	1,2	1,9	2,8	4,3
СХСЫО	3627	хемокин (участок С-Х- С) лиганд 10	1,1	3,2	10,6	24,3
РССК1А	2209	Рс-фрагмент 1§С, высокоаффинный 1а, рецептор для (СР64)	6,5	2,6	12,1	29,9
ΙΓΙ16	3428	интерферон, гаммаиндуцируемый белок 16	8,6	3,0	4,3	11,3
ΙΡΙ44	10561	интерферониндуцированный белок 44	2,8	1,4	2,5	2,8
ОА81	4938	2',5'- о л и го адени латсинтетаз а 1, 40/46кРа	3,5	2,3	2,6	5,3
Р8МВ8	5696	протеасомная субъединица, типа бета, 8 (ЬМР7)	2,6	4,3	6,1	6,5
Р8МВ9	5698	протеасомная субъединица, типа бета, 9 (ЙМР7)	4,3	7,5	6,5	16,0
Р8МВ10	5699	протеасомная субъединица, типа бета, 10 (ЬМР7)	3,2	2,5	5,3	13,0
8Р100	6672	ядерный антиген 8р 100	4,0	1,1	1,5	2,8
ТАР1	6890	транспортер 1, АТФсвязывающая кассета, подсемейство В (МРК/ТАР)	2,5	2,8	6,5	8,0
УСАМ1	7412	васкулярная молекула адгезии 1	5,7	5,3	3,2	12,1

Лиганды НЬА-ЭК, изолированные из раковой ткани.

В соответствии с общедоступными данными пептиды, связанные молекулами НЬА II класса, экспрессированные в тканях солидных опухолей, до сих пор не были изолированы и идентифицированы другими. Изобретатели проанализировали десять различных опухолей КСС (почечно-клеточная карцинома), три ССА (светло-клеточная аденокарцинома) и одну ТСС (переходно-клеточная карцинома) и были в состоянии изолировать лиганды НЬА-ЭК из всех проб, общее количество достигает 453 пептидов (данные не приводятся). Пептидные последовательности были определены с помощью объединения хроматографической сепарации и тандемного масс-спектрометрического анализа (ЬС-М8/М8), как описывалось ранее (^01^1^1-11^ Т., СоийеГаидеак, С., 8сЫг1е, М., ОЬегтауг, Е., ^а1!ег, 8., 8сйоог, О., Кигек, К., Ьоекег, ^., ВтЫег, К.Н., ^егие!, Ό., 8!еуаиоу1с, 8. аий Каттеикее, Н.С. 2002. I Шедшей Гиисйоиа1 деиоткк арргоасй Гог (Не йеыди оГ райеи!-тй1У1йиа1 аЛйитог уасстек. Саисег Кек. 62:5818-582; 8сЫг1е, М., Кеййок, ^., ^еЬег, В., СоийеГаидеак, С., Эитгеке, Т., Вескег, Н.Э., 8!еνаηον^с, 8., Каттеикее, Н.С. Шеиййсайои оГ !итог-аккоаа!ей МНС с1акк I Ндаийк Ьу а иоуе1 Т-се11-тйереийеи! арргоасН. Еиг. 1. Iттииο1. 2000; 30(8):2216-25). Пример нового секвенирования пептидов на ЬС-М8/М8 показан на фиг. 5а и 5Ь. Установленные первичные аминокислотные последовательности фрагментов слияния, показанных на фиг. 5а и 5Ь, включены в табл. 5. Опухолевые пробы отличались по их НЬАгенотипам, весу и по общему числу идентифицированных лигандов НЬА. В табл. 3 представлен репрезентативный список пептидов и соответствующих белков-источников, идентифицированных из одной отдельной пробы опухоли, КСС190. Пептиды были изолированы из молекул клеток НЬА II класса, как

- 22 013876 было описано ранее (Пепде1, I., Оескег, Р., 8сйоог, О., А1!епЬегепб, Р., Аетксйепк, Т., Иаттепкее, Н.С. апб 8!еνаηον^с, 8. 2004. ШепбГкабоп оГ а па!ига11у ргосеккеб сусбп Ό1 Т-йе1рег ерйоре Ьу а ηονе1 сотЫпабоп оГНЬА с1акк II 1агдебпд апб бИГегепба такк крес!готе!гу. Еиг. I. Iшшиηο1. 34:3644-3651).

Таблица 3

Список примеров лигандов НЬА-ЭВ, изолированных из ВСС190. Представлены центральные последовательности лигандов НЬА-ЭВ, изолированных из ВСС190 (НЬАГОВВШ, ПВВ1*15, ОВВ3, РВВ5).

Символ гена	идент. номер гена	Пептидная последовательность (Идент. № посл-тн)	Название гена
АСТС1	71	А18КОЕУОЕ8СР81УНККСГ (8Е9 ГОХ» 50)	актин, гамма 1 пропептид
АЬВ	213	ΕΚΚΥΕΥΕΙΑΒΚΗΡ (5Ер ГОХ» 51)	предшественник альбумина
АЬВ	213	ΤΕνΕνδΒΝΕΟΚνΟ (8ЕО 10 № 52)	предшественник альбумина
АЬВ	213	ТРТЕУЕУ8ЮЧЬОКУС8 (8Е<} ГО № 53)	предшественник альбумина
АРОА2	336	ΕΚδΚΕφΣΤΡΕΙΚΚΑΟΤΕΕνΝΕ (8Еф ГО № 54)	предшественник аполипопротеина А-П
АРОВ	338	УРКЗЬНМУАМКЬЬОНК. (8Е0 ГО № 55)	предшественник аполипопротеина В
С1К	715	ΕΡΥΥΚΜ0ΤΚΑ68ΚΕ (8Еф ГО Ха 56)	дополняющий компонент 1, г субкомпонент
С4В	721	ΑΡΡδΟΟΡΟΡίδΙΕΚΡΟδΚΡΡ (8ЕС) ГО № 57)	дополняющий компонент 4В пропротеин
С4ВРА	722	ΓΟΡΙΥΝΥΚΏΤίνΕΚ (8Е0 ГО № 58)	дополняющий компонент 4 связывающий белок, альфа
САЬК	811	8ΡΟΡ8ΙΥΑΥΟΝΓ (8ЕО ГО № 59)	предшественник кальрети кулина
САЬК	811	ΕΡΡνίΟΝΡΕΥΚΟΕΑΚΡΒΟΙΟΝΡΟ (8Е<2 ГО № 60)	предшественник кальретикулина
СГЫ	1072	ονικνΡΝΟΜκνκ,κ (8Е0 ГО Ха 61)	кофилин I (немышечный)
СРЕ	1363	ΑΡΟΥΕΑΙΤΚΚνΑνΡΥ (5Е<2 ГО Ха 62)	предшественник карбоксипептидазы Е
ЕССВР	8857	АЗУОБКИТОКЕЕРЕТА (8ЕО ГО Ха 63)	Рс-фрагмент 1§С> связывающий белок
ΡΟΝ1	2219	ΟΝΗΟΡΑΚΥΒδΕΚνΑΏΕ (8Еф ГО Ха 64)	предшественник фиколин! 1
ΕΊΈ	2512	У8НРРК.ЕЬАЕЕККЕС (8ЕО ГО Ха 65)	ферритин^ легкий полипептид
ЕТЬ	2512	ТРОАМКААМАЬЕКК (8Еф ГО Ха 66)	ферритин^ легкий полипептид
ΟΑΡΩ	2597	ΡνΜΟνΝΗΕΚΥΟΝ (8Еф ГО Ха 67)	гл и церал ьде гид-3 -ф осфат дегидрогеназа
ΟΑΡϋ	2597	ТОУРТТМЕКАСАН (8Е(2 ГО Ха 68)	глицеральдегиД’З-фосфат дегидрогеназа
ΟΑΡϋ	2597	Ι8ΑΥ0ΝΕΡ6Υ8ΝΚ.νν0ΕΜΑΗΜΑ8	глицеральдегид-З-фосфат

КЕ дегидрогеназа (8Е<2 ГО № 69)

- 23 013876

ΗΙ8Τ1Η1	3006	ΟΤΟΑ8Ο8ΡΚΕΝΚΚΑΑ8ΟΕΑΚΡΚ	Н1 семейство гистоновых,
С		(8Еф ГО № 70)	член 2
НЬА- ϋ(}Β1	3119	ονανγκΑντρφοκρο (8ЕР ГО № 71)	главный комплекс гистосовместимости, II класса, Ор Ье!а 1, предшественник
НЕАϋΒΒΙ	3123	ОУОЕРК.АУТЕШКРО (8Е0 ГО № 72)	главный комплекс гистосовместимости, II класса, ОК Ье1а 1, предшественник
16РВРЗ	3486	НРБНЗКППККбНАК (8ЕО ГО № 73)	связывающий инсулиноподобный фактор роста белок 3
ΚΝΟ1	3827	ПКОЬРКАУОААЬКК (8ЕО ГО № 74)	кининоген 1
1ЧРС2	10577	ΚΟΚΤΥδΥΕΝΚΕΡνΚ (8Е<2 ГО № 75)	болезнь Ниманна-Пика, тип С2, предшественник
8100А8	6279	νΐΚΜθνΑΑΗΚΚ8ΗΕΕ8ΗΚΕ (8Е9 ГО № 76)	8100 кальцийсвязывающий белок А8
8ΕΚ.ΡΙΝ А1	5265	ΜϊΕΟΝΤΚδΡΕΡΜΟΚννΝΡΤΟΚ (ЗЕр ГО № 77)	серин (или цистеин) ингибитор протеиназы, ветвь кладограммы А (альфа-1 антипротеиназа, антитрипсин), член 1
8СЮ1	6647	ΟΡΗΡΝΡΕ8ΚΚΗ6ΟΡΚ (8Еф ГО № 78)	супероксиддисмутаза 1, растворимая
ТР	7018	ΟΡΟΤΡΥΥΑνΑννκΚΊ>8 (8ЕО ГО № 79)	трансферрин

Взаимосвязи между весом опухоли и числом идентифицированных лигандов НЬА не было. Пептидные белки-источники можно было разделить на две группы. С одной стороны, были обнаружены лиганды, которые должны презентироваться лейкоцитами, такие как пептиды из дополняющих компонентов, например С3, С4А, С4 связывающего белка альфа и других белков, сопряженных со специфическими функциями клеток иммунной системы, например 0Ό 14 и Ес-фрагмент связывающего белка. С другой стороны, изобретатели были в состоянии раскрыть природу и характеристики неизвестных прежде пептидов, презентируемых опухолевыми клетками из гиперэкспрессированного ТАА (опухолеассоциированного антигена), например из виментина, матричной металлопротеиназы 7, эукариотического трансляционного фактора элонгации 1 альфа 1 и никотинамид Ν-метилтрансферазы. Это наблюдение соответствует иммуногистохимическим данным (фиг. 1 и 4) и демонстрирует, что положительные опухолевые клетки НЬА II класса и инфильтрующие лейкоциты были представлены в проанализированных образцах и что элюированные пептиды происходят из антигенов, которые были обнаружены в гиперэкспрессированном состоянии в этих различных видах клеток.

С целью идентификации пептидов из ТАА изобретатели сравнили белки-источники для отдельных лигандов с гиперэкспрессированными генами, обнаруженными при анализе опухолей микрочипами (ХУетксНепк, Т., боийеГапдеак, С., 8сЫг1е, М., ОЬегтауг, Е., Уайег, 8., 8сйоог, О., Кигек, В., Ьоекег, У., ВюЫег, К.Н., ХУегпеТ Ό., 81еуапоу1с, 8. апб Ваттепкее, Н.С. 2002. ЫедгаГеб Гипс1юпа1 депотюк арргоасН Гог (Не бек1дп оГ райеп1-тб1У1биа1 апШитог уасстек. Сапсег Век. 62:5818-5827; Кгидег, Т., 8сНоог, О., Ьетте1,. С., Кгаетег, В., ВеюЫе, С., Эепд]е1, 1., Уетксйепк, Т., Ми11ег, М., Неппеп1ойег, 1., 81е^1, А., Ваттепкее, Н.С. апб 81еуапоую, 8. 2004. Ьеккопк !о Ье 1еатеб Ггот рптагу гепа1 се11 сагстотак: поуе1 (итог апйдепк апб НЬА Ндапбк Гог 1ттцпо1йегару. Сапсег Iттиио1. ^типоЛет). Изобретатели идентифицировали пептид из связывающего инсулиноподобный фактор роста белка 3, ЮЕВР3_166-181 в В00_!90. К тому же в ТСС108 были обнаружены два варианта этого пептида: ЮЕВР3_169-181 и ЮЕВР3_169-184, содержащие тот же самый фрагмент центральной последовательности, который является необходимым и достаточным для осуществления связи с НЬА-ОВВ1*0101 (для сравнения см. табл. 1). Из той же самой опухоли было возможно изолировать пептид из матричной металлопротеиназы 7, ММР_7247-262 (табл. 1). На уровне мРНК ММР7 был гиперэкспрессирован в 13 и ЮЕВР3 в 22 из 23 проанализированных В00 (данные не приводятся). В целом из 453 пептидных последовательностей, идентифицированных первоначально (не приводятся), лежащие в основе антигены для 49 пептидов (8ЕО ГО № 1-49) были идентифицированы как опухолеассоциированные как при экспериментах изобретателей (данные не включены в этот документ), так и у других (М1уато!о, 8., Υаио, К., 8ид1то!о, 8., Шт, С., НакеЬе, Т., ЕпбоН, Υ., Кобата, К., М. Соуа, Т. 0ЫЬа, апб А. ОсЫат 2004. Майгх те!а11орго1етаке-7 Гасййа1ек тки1т-11ке дгоМй Гас(ог ЬюауаПаЬййу Игоидй йк рго1етаке асйуйу оп тки1т-11ке дгоМй Гас(ог Ьтбтд рго!ет 3. Сапсег Век. 64:665-671; 8ит1, Т., Т. Nакаίаи^, Н. ΥокЫба, Υ. Нуип, Т. Уакиг Υ. Ма1кито1о, Е. Накад-пга, К. 8ид1тига,

- 24 013876

КатеакЛта Η., апб Шако, О. 2003. Ехргеккюп оГ тарах те1а11орго1ешакек 7 апб 2 ш Ритап гепа1 се11 сагсшота. Опсо1. Вер. 10:567-570; СРеипд, С.^., Уекеу, ^.А., №со1, ^.^, апб •ЛРпкоп, Ω.\ν. 2004. ТРе го1ек оГ 1СР-1 апб 1СРВР-3 ш Ле геди1аРоп оГ ргох1ша1 ЛЬи1е, апб гепа1 се11 сагсшоша се11 ргоРГегаРоп. К1бпеу 1п1. 65:1272-1279; Иао, X., 8ип, В., Ηυ, Ь., ЬаРбектак1, Н., ОттиНге, V., Репд, У., 2Рапд, 8.ν., Vапд, Η., νυ, С., ’№апд, Η., Ри11ег, С.К, 8уттапк, ν.Ρ., 8Рти1еуюР, I. апб 2Рапд, V. 2004. 01ГГегеп(1а1 депе апб рго1еш ехргеккюп ш рптагу Ьгеак! таВдпапаек апб Лей 1утрР побе те1ак1акек ак геуеа1еб Ьу сотЬшеб с^NЛ тюгоаггау апб Рккие тюгоаггау апа1ук1к. Сапсег 100:1110-1122; ^1тке, В.М., Ро1усЬгошб1к, М., Веппег, А., ТРоте, М., АтЬак, 1. апб ВейРта!·!!·!, М. 2004. Ме1апота те1ак1ак1к ίκ аккоЛИеб теВР епНапсеб ехргеккюп оГ Ле кугИепт депе. Опсо1. Вер. 12:221-228; ЫоГтапп, Η., Шпкеп, 8., ВюР1ег, С., Таеде, С., 81тт, А., 811Ьег, В.Е. апб ВигбасР, 8. 2005. МаРгх те1а11орго1етаке-12 ехргеккюп согге1а1ек ^РР 1оса1 гесиггепсе апб те1ак!аРс бкеаке ш поп-кта11 се11 1ипд сапсег раРегИк. СРп. Сапсег Век. 11:1086-1092; Ката1, Т., УаташкЫ, Т., 8Рйа1акг Η., Такад1, К., Акат1, Η., Во, У., апб УокР1ба, К. 2004. Охегехргеккюп оГ ВРоА, Вас1, апб Сбс42 СТРакек 1к аккоааЮб \\ВР ргодгеккюп ш 1екРси1аг сапсег. СРп. Сапсег Век. 10:4799-4805; Копшдег, Р, С1еке, КА., б1 Мо1а, Р.Р., ВегЬега! Р., С1еке, Т., ЕкрокВо, I., ВасРет, М.С., ВисР1ег, М^. апб Рпекк, Η. 2004. Оуегехргеккеб бесогш ш рапсгеаРс сапсег: ро!епРа1 (итог дгоМР шЫЬВюп апб аРепиаРоп оГ сРетоЛегареиРс асРоп. СРп. Сапсег Век. 10:4776-4783; Могг М., 8Р1таба, Η., Сипр, У., Ма1киЬага, Η., ШуакЫ, Η., Ν Ринга, У., Ка1о, М., Так1дисР1, М., ОсЫаг Т. апб 8ек1, N. 2004. 8100А11 депе 1беп(1Пеб Ьу ш-Роике с^NА тюгоаггау ак ап ассига(е ргебюЮг оГ 1утрР побе те1ак1акек оГ дак(г1с сапсег. Опсо1. Вер. 11:1287-1293; №д1ег, Э.К, Кгидег, 8., Ке11пег, А., 2ютек, Е., Мепагб, В., ВиР1х, Р., Кгатк, М., Воеккпег, А. апб Ке11пег, и. 2004. Ир-геди1аРоп оГ саЛеркш X ш ргок1а1е сапсег апб ргок1аПс шйаерВРе11а1 пеор1ак1а. Ргок1а1е 60:109-119; Nаηба, А., ВискРаиВк, Р., 8еатап, 8., Адгатеа1, Ν., ВоиРп, Р., 8Рапкага, 8., №юР1, М., ТеюРег, В., 81атрГГ Р, 8шдР, 8., ^де1к!еш, В., 1<Р1/1ег К.\\'. апб 81, С.В. 2004. ИепРГюаРоп оГ а Ьшбшд рагШег Гог Ле епбоЛеРа1 се11 кигГасе ргоЮРчк ТЕМ7 апб ТЕМ7В. Сапсег Век. 64:8507-8511; Ра(е1, Ι.8., Мабап, Р., Се1кюк, 8., ВегРапб, М.А. апб МасСа1тап, СБ. 2003. СабРепп к\\ВсРРчд ш охапап сапсег ргодгеккюп. 1п(. Р Сапсег 106:172-177; 8ап1е1Р, С., СаРГапо, Э, СЫарреВа, С., Vепΐо, М.Т., ВаВоР, Р.С., 2и11о, Р., Тгаракко, Р., ^дйеВо, С. апб Риксо, А. 1999. ТРутокш Ье!а-10 депе охегехргеккюп 1к а депега1 еуеп! ш Ритап сагсшодепекк. Ат. Г РаЛо1. 155:799-804; 8сРпе1бег, ^., К1ееГГ, Р, ВегЬегар Р.О., 2Ри, Ζ., Когс, М., Рпекк, Η. апб ВисР1ег, М/ν.

2002. ЛбисРоп апб ехргеккюп оГ Ье1а1д-Р3 ш рапсгеаРс сапсег се11к. ВюсЫт. ВюрРук. Ас(а 1588:1-6; Vе1κР, РВ., 8аршоко, Ь.М., Кет, 8.С., Вготеп, ^.А., Ыи, Т., Ваиккш, А.В., Vа^б. В.Ь., ШпхкРчк, Ν.Ρ, Ришп, ^.I., Викке11, Р.Р, 8иЛег1апб, В.Ь., ВгеВ, 8.Ν., Мокка1ик, С.А., Рпегкоп, ΗΕ., 1г. апб ВатрГоп, С.М.

2003. Ьагде-кса1е беРпеаРоп оГ кесге(еб рго!ет Ьютагкегк оуегехргеккеб ш сапсег Рккие апб кегит. Ргос. ΝοΛ Асаб. 8сг И.8.А. 100:3410-3415; Х1е, ^., 8Рат, 18., Ζепд, ν.Ε, СРе, Ь.И., ΖРапд, М., V, Η.Χ., Ьш, ΗΕ, Vеп, ГМ, Ьаи, 8.Η., Η и, Ь. апб Сиап, Х.У. 2005. Опсодешс го1е оГ с1икЮпп оуегехргеккюп ш ти1Рк!аде со1огес(а1Лтопдепекю апб ргодгеккюп. Vо^1б Р Сак1гоеп1его1. 11:3285-3289). Отдельный анализ иммуностимулирующего потенциала пептидов, связывающихся с распространенными аллелями Η^А-^В, обнаруживает существование антигенспецифических СБ4-положительных Т-клеток к ^1СРВР3169-181 ^{и ММР7}247-262.

Беспорядочное связывание отдельной последовательности 8 ЕС ГБ № 1 с различными аллелями Η^А-^В может быть обнаружено несколькими независимыми методами: лиганды определенных молекул МИСРИЕ-А несут химически соотносимые аминокислоты в определенных позициях их первичной последовательности, которая позволяет дефиницию пептидного фрагмента для каждого аллеля МΗС/Η^А (Ра1к, К., ВоМксРке, О., 81еуапоу1с, 8., Лпд, С., Ваттепкее, ΗΌ. А11е1е-кресйю тоРГк геуеа1еб Ьу кедиепсшд оГ ке1Г-рер(1бек е1и(еб Ггот МЫС то1еси1ек. №11иге. 1991; 351(6324):290-6). 8УРРЕ1ТШ использует матрицы фрагментов, полученные из очищенных фрагментов, основываясь исключительно на анализе естественных лигандов с помощью метода деградации Эдмана и тандемной масс-спектрометрии. Эти матрицы позволяют прогнозирование пептидов из заданной белковой последовательности, презентированной на молекулах МНС класса I или II (ВоМксРке, О., Ра1к, К., 81еуапоу1с, 8., Лпд, С., Vа1беп, Р., Ваттепкее, ΗΌ. Ехас! ргебюРоп оГ а па(ига1 Т-се11 ерВоре. Еиг Р Iттипо1. 1991; 21(11):2891-4).

Применяя принципы прогнозирования, сделанные по алгоритму 8ΥΡΡЕIΤΗI (Ваттепкее, ΗΌ, ВасРтапп, I апб 81еуапоу1с, 8. 1997. МНС Ыдапбк апб РерРбе МоРГк. 8рппдег^ег1ад, Ηе^бе1Ье^д, Германия; Ваттепкее, Η., ВасРтапп, 1, ЕттепсР, Ν.₽., ВасРог, О.А., 81еуапоу1с, 8. 8ΥΡΡЕIΤΗI: ба(аЬаке Гог МΗС Вдапбк апб рер(1бе тоРГк. РптиподепеРск. 1999; 50(3-4):213-9), к упомянутой ранее пептидной последовательности (8ЕО ГО № 1), был составлен рейтинг по связыванию последовательности 8ЕО ГО № 1 с несколькими распространенными аллелями Η^А-^В (см. табл. 7). Алгоритм успешно применялся для прогнозирования эпитопов I и II класса из различных антигенов, например из человеческого ТАА ТВР2 (прогнозирование лиганда Η БА I класса) (34) и 88X2 (прогнозирование лиганда Η БА II класса) (№итапи, Р., Vадпе^, С., 81еуапоу1с, 8., КиЬиксРок, В., 8сРогтапп, С., М1ксРо, А., ЕВап, К., 8сРпиб1 V., РГгеипбксРиР, М. ИепРГюаРоп оГ ап Η^А-^В-^еκί^^сΐеб рер(1бе ерВоре теВР а ргопиксиоик Ьшбшд раРет бепхеб Ггот Ле сапсег 1ек11к апрдеп ВОМ-МЕЕ-40/88Х2. Λΐ Г Сапсег. 2004; 112(4):661-8). Пороговое значение показателей 18 или выше для значительного связывания было определено на основе анализа показателей связывания для опубликованных ранее беспорядочно связывающихся пептидных лигандов

- 25 013876

НБА-БК. Беспорядочное связывание определяется как связывание пептида с хорошей связывающей силой, на что указывает показатель 18 или выше в тесте ЗУБРЕНЫ, с двумя или более различными распространенными аллелями НБА-БК. Наиболее распространенные аллели НБА БК приводятся в табл. 7. Локусы НБА-А и НБА-БК имеют неравномерное распределение (Ппкадс б^8е^и^1^Ь^^ит). что ведет к комбинациям НБА-А2 и специфических НБА-БК, которым отдается предпочтение по сравнению с другими. Генотипы НБА-БК исходных опухолей были проанализированы и получили подтверждение как НБА-БКВ1*11 и БКВ1*15 в обоих случаях. Предпочтительные доменные аминокислотные остатки для наиболее распространенных аллелей НьА II класса (БКВ1*0101, БКВ1*0301, БКВ1*0401, БКВ1*0701, БКВ1*1101 и БКВ1*1501) представлены в табл. 4. Например, аллель БКВ1*0301 НБА II класса предпочтительно связывает пептиды в их связывающей бороздке, которые обладают специфическими аминокислотными остатками в позициях 1, 4, 6, и 9 от Ν- до С-терминального конца центральной последовательности любого данного пептида. БКВ1*0301 показывает особенно хорошее связывание, если центральная последовательность пептида имеет остаток глютамата (Б) на позиции 4, так же как и Б, I, Б, М или V на позиции 1, так же как К, К, Е, р или N на позиции 6, так же как и Υ, Б или Б на позиции 9.

Таблица 4

Пептидные фрагменты распространенных аллелей НБА-БК.

Доменные аминокислоты обозначены буквенным кодом на соответствующих связывающих карманах.

аллель НЬА	---123 3 2 1	Позиция
4 5	ί 6 7 8	9 + + + 1 2 3
ϋΚΒ!*0	Υ	ь	А	Ь
101
	V	А	6	I
	ь	I	8	А
	I	V	Τ	V
	Ρ	Μ	С	N
	А	N	Ρ	Ρ
	Μ	Ω		Υ
	\ν
ϋΚΒ1*0	ь	ϋ	к	Υ
301
	I		к.	ь
	Ρ		Ε	Ρ
	Μ		Ω
	V		N
ϋΒΒ1*0	Ρ	ρ	Νϋ	0
401
	Υ		8 Ε	Ε
		I	ΤΗ	Η
	I	ь	ΩΚ	К
	ь	V	ΗΝ	N
	V	А	ΚΩ	Ω
	Μ	О	к	К
		Ε	8	8
			Τ	Τ
			Υ	Υ
			А	А
			С	С
			I	I
			ь	ь
			Μ	Μ
			V	V
ϋΚΒ1*0	Ρ	ϋ	N	V
701
	Υ	Ε	8	I
		Η	Τ	ь
	I	К		Υ
	ь	N		Ρ
	V	Ω
		К
		8
		Τ
		Υ
ЦЯВ1*1	ψ	ь	К	А
101
	Υ	I	К	Ο
	Ρ	V	Η	8
		Μ		Ρ
		А
		Ρ
		Υ
ϋΚΒΐ*ι	ь	Ρ	I
501
	V	Υ	ь
	I	I	V
			Μ
			Ρ

- 26 013876

Результаты анализа ίη кШсо, основанного на компьютерном алгоритме для прогнозирования взаимодействия между молекулами НЬА и пептидными последовательностями, представленном на сайте тетете.куЕрейЛ.йе, указывают на то, что пептид ММР7_247-262 8ЕО Ю № 1 беспорядочно связывается с несколькими аллелями НЬА-ЭК. В соответствии с результатами прогнозирования пептид с последовательностью 8Е0 Ш № 1 получает высокий показатель связывания для взаимодействия с ΌΚΒ1*1101, ΌΚΒ1*1501, ΌΚΒ1*0401, ΌΚΒ1*0301 и ΌΚΒ1*0101 (табл. 7). Аллели НЬА-ЭК, проанализированные в этом тесте на взаимосвязь аминокислотной последовательности пептида и силы связывания, покрывают по крайней мере 69,6% НЬА-А2-положнтельного населения европеоидной расы (Моп, М., ВеаРу, Р.6., Сгауек, М., Воисйег, К.М., МйРогй, Е.Ь. НЬА депе апй Нар1о1уре Ргедиепс1ек ίη !1е №г111 Атепсап рори1айоп: !1е №1Ропа1 Магготе Эопог Ргодгат Эопог Кед1кйу. Тгапкр1ап!аДоп. 1997; 64(7): 1017-27). Так как в настоящий момент не доступны данные по частотности НЬА-ЭК15, этот аллель не рассматривался для расчета результатов конечного покрытия НЬА-А2-положительного европеоидного населения. Таким образом, велика вероятность того, что покрытие населения 8ЕО Ш № 1 даже выше чем 69,6%, что указывает на то, что пептид обладает превосходной перспективой для того, чтобы служить кандидатом для разработки фармацевтических препаратов для большинства раковых пациентов.

Тем не менее, применение алгоритмов прогнозирования ведет только тогда к убедительным результатам, когда результаты анализов ίη кШсо комбинируются с экспериментальным подтверждением беспорядочного связывания, как было показано ранее в других работах, где не удалось продемонстрировать иммунные ответы, вызываемые пептидными последовательностями, которые по прогнозам должны были иметь хорошую связующую силу (Во1т, С.М., Напкк1, М.Ь., 8!еίаηον^с, 8., Каттепкее, Н.6., 8!ет, Н., Тау1ог-Рарай1тйпои, к, Шескеп, Е.О., Напкк1, С. !йеп(1Г1са(1оп оГ НЬА-А2-гек1пс!ей ерйорек оГ Ле !итог-аккоаа!ей апрдеп МИС2 гесодшхей Ьу 1штап су!о!охю Т-се11к. Л! к Сапсег. 1998; 75(5):688-93). Прогнозирование артефактов, как в рассмотренном выше случае, в принципе, не может быть исключено, так как используемые для прогнозирования алгоритмы не учитывают того, что пептидная последовательность не обязательно генерирована в условиях ίη νί\Ό (внутри живых клеток). Экспериментальное подтверждение может быть получено при сборе данных ίη νίίΐΌ из биологического теста, например, при демонстрации присутствия или недостатка иммуногенности пептида. Следовательно, экспериментальное подтверждение беспорядочного связывания 8ЕО Ш № 1 было получено сбором таких данных ίη νίΙΐΌ. Для проверки пептидов на их иммуностимулирующую способность с помощью экспериментов ίη хПго по Т-клеточному праймингу использовались наиболее короткие варианты (коровая последовательность) пептидов ЮРВР3, ЮРВР3_169-181 и пептидов ММР7, ММР7_247-262.

Для генерации антигенспецифических СО4-положительных Т-клеток и для проверки пептидов на беспорядочное связывание МПК 4 здоровых доноров с разными аллелями НЬА-ЭК (фиг. 2), один с ОКВ1*1101, были простимулированы с использованием аутологичных дендритных клеток с введенным импульсным методом пептидом. К тому же пептид ΟΟΝΏ1ΐ9_8-2ι₂, известный Т-клеточный эпитоп (Пепде1, I, Оескег, Р., 8сйоог, О., А1!епЬегепй, Р., ^етксйепк, Т., Каттепкее, Н.6. апй 8!еνаηον^с, 8.

2004. !йеп(1Г1са(1оп оГ а па!ига11у ргосеккей сусйп Ό1 Т-1е1рег ерйоре Ьу а ηονе1 сотЬта!юп оГ НЬА с1акк II 1агде(1пд апй й1ГГегеп(1а1 такк крес!готе!гу. Еиг. к Iттиηο1. 34:3644-3651), использовался в качестве положительного контроля. Для системы обработки данных для генерирования антигенспецифических СО4-положительных Т-клеток уровни ΣΡΝ-γ были оценены проточной цитометрией. Т-клетки были проанализированы после третьей и четвертой еженедельной стимуляции внутриклеточным окрашиванием ΛΝ-γ плюс окрашивание СП4-РГГС и СЭ8-РегСР для определения процентного выражения ΓΡΝ-γ-продуцирующих клеток в специфических Т-клеточных субпопуляциях. Во всех экспериментах стимуляции с нерелевантным пептидом и без пептида производились в качестве отрицательного контроля. ΣΡΝ-γ-ответ рассматривался как положительный, если процентное отношение IРN-γ-продуцирующнх СО4-положительных Т-клеток было более чем в 2 раза выше в сравнении с отрицательным контролем (Нойоп, Н., Кикке11, Ν., Мооге, Е., Ргапк, I., Вауйо, К., Науепаг-Паидй!оп, С., Ьее, Ό., Эеегк, М., Нийдепк, М., ХУеткоИ, К. апй Мс Е1гаЛ, М.к 2004. Согге1аРоп ЬеРхееп т!егГегоп-датта кесгеРоп апй су!о!охюйу, ίη νΟΜ^^αίί: тетогу Т-се11к. к ЛГес! Э1к. 190:1692-1696).

Изобретателям удалось генерировать в трех из четырех доноров специфические СО4-положительные Т-клетки для обоих пептидов (фиг. 2). Ни одна стимуляция не привела к Т-клеточным ответам у донора 4. У донора 1 было обнаружено от 0,05 до 0,1% (фиг. 3) IΡN-γ-продуцирующих СО4-положительных Т-клеток при всех семи попытках стимуляции после третьей стимуляции пептидом ЮРВР3_169-181. Число этих Т-клеток может быть увеличено в большинстве случаев при дополнительном цикле стимуляции до 0,09-0,13%. ΛΝ-γ-продуцирующие СО4-положительные Т-клетки, специфические для пептида ЮРВР3_169-181, наблюдались также у доноров 2 и донора 3 с максимальной частотностью в 0,05 и 0,07% ШЫ^-продуцирующих СЭ4' Т-клеток.

Доноры 1, 2 и 3 также имели ί.Ό4' Т-клетки, реагирующие на пептид ММР7_247-262. Наиболее высокие частотности ШИ^-продуцирующих СЭ4' Т-клеток, специфических для пептида ММР7, были обнаружены у доноров 1 и 2 соответственно. Доноры 1, 2 и 3 имели ШН^-ответы на пептид ССХОТ^^, который уже описывался как рестриктированный по МНС II класса Т-клеточный эпитоп (Оепд)е1, Σ.,

- 27 013876

Эескег, Р., 8сйоог, О., АНепЬегепб, Р., Уетксйепк, Т., Каттепкее, Н.С. апб 81еуапоу1с, 8. 2004. [беп(1Пса11оп оГ а па1ига11у ргосеккеб сусйп Ό1 Т-йе1рег ерйоре Ьу а поуе1 сотЫпайоп оГ НЬА с1акк II 1агдейпд апб бгГГегепйа1 такк кресйютейу. Еиг. 1. Iттиηо1. 34:3644-3651).

Таким образом, пептиды из ЮРВР3, ММР7 и ί’ί’ΝΟ1 беспорядочно связываются с НЬА II класса и в состоянии вызывать СО4-положительные Т-клеточные ответы у трех из четырех здоровых доноров, имеющих разные аллели НЬА ΌΚ. Если аллели НЬА двух опухолевых пациентов, от которых были получены пептиды ЮРВР3 и ММР7, сравниваются с аллелями четырех здоровых доноров, то становится очевидным, что пептиды презентируются НЬА-ОКВ1*01, НЬА-ОКВ1*04 и НЬА-ОКВ1*11. Все три ранее названных аллотипа НЬА ΌΚ имеют аминокислотный остаток глицина на позиции 86 и остаток аспарагиновой кислоты на позиции 57 их β-цепей соответственно (см. те^ет.апййопупо1ап.сот/НЮ). Поэтому они имеют очень похожие характеристики связывания для их связывающих карманов Р1 и Р9 (Каттепкее, Н.С., Васйтапп, 1., апб 81еуапоую, 8. 1997. МНС Ыдапбк апб Рерйбе МойГк. 8рппдег-Уег1ад, Не1бе1Ьегд, Германия). Для пептида ССN^1 _198-212, известного как Т-клеточный эпитоп, презентируемый НЬА-ОКВ1*0401 и НЬА-0КВ1*0408 (Эепд]е1, 1., Эескег, Р., 8сйоог, О., АНепЬегепб, Р., Уетксйепк, Т., Каттепкее, Н.С. апб 81еуапоую, 8. 2004. ЫепйДсайоп оГ а па(ига11у ргосеккеб сусйп Ό1 Т-йе1рег ерйоре Ьу а поуе1 сотЫпайоп оГ НЬА с1акк II 1агдейпд апб бгГГегепйа1 такк кресйютейу. Еиг. 1. Iттиηо1. 34:36443651), все остается в силе. Донор 4 имеет НЬА-ОКВ1*0318 и НЬА-ОКВ1*1401, аллели с пептидными фрагментами, которые отличаются первичной аминокислотной последовательностью их бета-цепей от тех, что были описаны выше. Это может объяснить, почему было невозможно вызвать Т-клеточные ответы против двух пептидов, используя клетки этого донора.

Интересно, что ΓΕΝ-γ-продуцирующие С'О8-положительные киллерные Т-клетки были обнаружены у двух доноров после стимуляций с тремя пептидами, в особенности у донора 3, но и также в меньшей мере у донора 1 (данные не приводятся).

Таблица 5

Фрагмент	Масса [М+Н1+	Аминокислотная последовательность
Ь2	216,1	8Ω
у4	447,3	СКК5
уб	723,4	ЬУСККЗ
у!	851,5	КЕУСКК8
У»	979,6	ОКЬУОКР.5
у9	1092,6	КЗКЬУОККЗ
у10	1149,7	<3Ι<2ΚΕΥΟΚΚ5
УН	1277,8	КОЮКЬУСКкЗ
у12	1390,8	ЖСКЗКЬУСККЗ
У13	1505,9	ЫКСЩКЬУОККЗ
у!4	1620,9	РР1К.С1<2КХУСКЕ.5

К 129,1 иммоний К

Таблица 6 Частота встречаемости гаплотипа Северно-американского европеоидного населения

Гаплотип Частота встречаемости НЬАНЬА-А РК[%1

2	1	8,8
2	2	14,9
2	3	6,1
2	4	21,3
2	5	1,2
2	6	15,2
2	7	13,0
2	8	4,2
2	9	1,2
2	10	1,4
2	11	8,7
2	12	2,6
2	п.а.	1,4

Представлены серологические гаплотипы.

п.а. - не определено.

- 28 013876

В табл.7 представлены последовательности 8ЕО ΙΌ № 1 и 8ЕО ΙΌ № 25 показателей связывания по 8ΎΕΡΕΙΤΗΙ для наиболее распространенных аллелей ΗΕΆ-ΌΒΒ1 среди европеоидного населения. Частота встречаемости соответствующих серологических гаплотипов НЕЛ-А2-положительных европеоидов дана в скобках. Пептиды рассматриваются как связывающиеся достаточно хорошо с молекулами НЬА II класса, если показатель равен или выше 18.

Таблица 7

Показатели связывания 8ЕО ΙΌ № 1 с распространенными аллелями НЬА-ОВ

Антиген	Аллель 1ШВ1*
	0101 (8,8%)	0301 (6,1%)	0401 (21,3%)	0701 (13,0%	1101 (8,7%)	1501 (п.а.%)
8ЕО Ю № 1	35	18	20	14	26	20
8ЕЦ ГО № 25	28	28	20	18	26	18

- 29 013876 <Ι10>

Перечень последовательностей

Имматикс Биотехнологии ГмбХ <120>

Опуколеассоциировакные пептиды, беспорядочно связывающиеся с молекулами класса II человеческого лейкоцитарного антигена (НЬА) <130>

130551РСТ <160>

<17 0>

РаСепЫп νθΓΒίοη

3.3 <210> <211=. <212> <213>

РЕТ

Ното варгепз <40С>

Азп Рго <31у

С1и Туг

Агд

Уа1

ТНг

А1а

Н18

А1а

С1и <31у

Туг

ТО г

Рго

Зег <210> <211> <212> <213 =

РКТ

Ното зартепз <400>

Аеп Ьуа С1п

Ьув Рго

Б

Не

ТЬг

Рго

О1и

ТНг

А1а

О1и

Ьуз

Ьеи

А1а

Агд

Авр <210>

<211>

<212>

<213>

РЕТ

Ното зартепэ <400>

Азр Аар Рго

Зег ТУ, г

Б

Не <31и

ЬуВ

Ьеи

А1а

Ьуа

Аеп

Ьуа

С1п

Ьуз

Рго <210> <211>

<212>

РЕТ

- 30 013876

<213>	Ното вархепв
<400>	4
Авп Ргс	1 Беи Був 11е РЬе Рго Зег
1	5
<210>	5
<211?	13
<212>	РКТ
<213>	Ното вархепа
<400>	5

С1и ТЬг С1у Тгр Беи Беи Беи Ави

Був Агд Не Беи Агд Агд Шз

15

1	5
<210>	б
<211>	13
<212>	рвт
<213>	Ното вартепв

<400> 6

Був Рго Беи Авр Агд

Авр Авп С1и Беи С1п С1и Мер Зег

1	Б
<210>	7
<211>	15
<212>	РЕТ
<213>	Ното заргепе
<400>	7

Авп С1п С1у Зег Був

А1а А1а С1у Беи Беи Зег Ткх Туг

1	5
<210>	8
<211>	21
<212о	РКТ
<213>	Ното заргепв
<400>	8

Агд А1а Рке Беи Зег Зег Н1в

15

А1а Рго Зег Беи Агд Рго Був Авр

5

Туг <31 и 7а1 Авр А1а ТЬг Беи Бу в

15

Зег Беи Азп Аеп. (31п <210> 9

- 31 013876 <211>17 <212> Р&Т <213> Ното зар1еп.з <400>9 <31у Рго Уа1 Аар <31и УаТ Агд (31ц Ьеи. С1п 1уз А1а Не <31у А1а Уа1

1015

Рго <210> 10 <211? 1Б <212> РЕТ <213> Ното заргепз <400> 10

11е Азп Н1з Уа1 Уа1 8ег νβΐ А1а С1у Тгр <31у 11е Зег Азр С1у

10 15 <210? 11 <211? 18 <212? РЕТ <213? Ното зархепз <400? 11

Уа1 Рго Азр Азр Агд Азр Р1ю 81и Рго Зег Ьеи С1у Рго Уа1 Суз Рго

10 15

РЕ.е Агд <210? 12 <211? 20 <212? РКТ

<213?	Ното 8ар1епз
<400?	12
Ьеи Рго	> С1п	Зег 11е Уа1 Туг Нуз	Туг МсЬ	Зег 11е Агд Зег Азр Агд
1		5	10	15
Зег Уа1	Рго	Зег
		20
<210?	13
<211?	16

- 32 013876

<212> <213>	РКТ Ното	зар1еп.з
<400>	13
11е Уа1	. Н13	Агд Туг Ме£ ТЬг Не
1		5
<210>	14
<211>	13
<212>	РКТ
<213?	Ното	зар1еп5
<400>	14

ТЬг Зег С1и Агд Зег Уа1 Рго А1а

15

Ьуз Азп С1у РЬе 7а 1 Уа1 Ъеи Ьув

1	5
<210>	15
<211>	15
<212>	РКТ
<213>	Ното	зар1еп;з
<400>	15

<31у Агд Рго Суз Ьуе

Не ТЬг <31у Туг 11е 11е Ьуз Туг

1	5
<210>	16
<211>	14
<212>	РКТ
<213>	Ното зар1епз
<400>	16
61у А1а ТЬг Туг Аеп 11е 11е Ча!
1	5
<210>	17
<211?·	16
<212>	РКТ
<213>	Ното зар1епз
<400>	17
Ней ТЬг (31у Туг Агд Уа1 Агд Уа1
1	5
<210>	18
<211>	16
<212>	РКТ
<213>	Ното вартепз

С1и Ьуз Рго 31у Зег Рго Рго

15

С1и А1а Неи Ьуе Азр С1п

ТЬг Рго Ьуз Н1и Ьуз ТЬг О1у Рго

15

- 33 013876

- 34 013876 <210> 23 <211> 16 <212> РКТ <213 > Ното зархепз <400> 23

ТИг А1а <31и 1

Не Беи <31и Беи А1а 61у 5

Аап А1а А1а Агд 10

Аер Авп Був 15

<210>

24

<211>

16

<212>

РКТ

<213>

Ното

вар1епд

<400>

24

Н1э Рго Беи

Ηίε Зег

Бу в

Не

Не

Не

Не

Був

Буе

61у

ΗΪ5

А1а

Був

1

5

10

15

<210>

25

<211>

16

<212>

РКТ

<213>

Ното

дар!епв

<400>

25

ΗΪ3 Зег Буз

Не 11е

Не

Не

Буе

Буз

С1у

1113

А1а

Буз

Аер

Зег

С1п

1

5

10

15

<210>

26

<211>

18

<212>

РКТ

<213>

Ното

вараепв

<400>

26

Агд Рго Буа

Ηίβ ТЬг

Агд

Не

Йег

αΐυ

Беи

Буе

А1а

С1и

А1а

Уа1

Був

1

5

10

15

Буд Αερ

<210> <211> <212> <213>	27 18 РКТ Ното вараепз
<400>	27

- 35 013876

С1у Ргс 51и Азр Азп Ча]. Уа1 11е 11е Туг Бен Зег Агд А1а <31у Азп 15 10 15

Рго С1и <210> 28 <211> 16 <212> РКТ <213 > Ното зархепз <400> 28

Зег Агд Рго 1

ν»1 11е 5

Азп

11е

С1п Був ТЬг 11е ТБ г Ча1 Ткг Рго Авп

10

15

<210>

29

<211>

17

<212>

РКТ

<213>

Ното

зархепв

<400>

29

Беи Азр

> Беи

Зег Рке

Азп

<31п

11е

А1а

Агд

Беи

Рго

5ег

<31у

Беи

Рго

1

5

10

15

Уа1

<210>	30
<211>	16
<212>	РКТ
<213>	Ното	йархепз
<400>	30
Буз Беи Рго	Зег Уа1	<31и С1у Беи Ηϊβ А1а 11е Ча1 Ча1	Зег Азр Агд
1		5	10	15

<210> <211> <212> <213>	31 14 РКТ Ното зартепз
<400>	31
Азр ТЪг Зег Ткг Беи С1и Мек Мек Н1в А1а Рго Агд Суз <31у

10 <210> 32

- 36 013876

<211> <212> <213>	17 РКТ Ното еар1еп5
<400>	32

Авр <31η Азп Т1гг 11е 51и ТЬг МеС Агд Ьуз

10

Рго Агд Суз 51у Ави Рго

Аер

<210? <211? <212? <213?	33 16 РЕТ Ното зарЬепе
<400?	33

Бег С1п Азр Азр Не Ьуз 31у 11е 61п Ьуз

10

Ьеи Туг <Э1у Ьуз Агд Бег

<210?	34
<211> <212? <213?	15 ΡΚΤ Ното вар1епв
<400?	34

Ьеи Азр РЬе Ьеи Ьуз А1а Уа.1

5

Азр ТНг Азп Агд А1а

Зег Уа1 С1у

<210? <211> <212? <213?	35 16 РЕТ Ното зархепв
<400?	35

Н13 С1у Азп С1п 11е А1а ТО г Азп С1у Уа1 Уа1

10

Η1Ξ Уа1

11е Азр Агд

<210? <211? <212? <213?	36 14 РРТ Ното эар1епа
<400?	36

Агд А1а 11е 51и А1а Ьеи Ηίε С1у Н1з

5

С1и Ьеи Агд рго С1у

- 37 013876

<210> <211> <212? <213?	37 17 РЕТ Ното заргепз
<400>	37

Авр Рго (31у Уа1 Ьеи. Авр Агд МеЬ ИеС Ьуз

10

Ьуз Ьеи Азр

Ткг Азп Бег

Азр

<210>	38
<211>	16
<212>	РКТ
<213?	Ното	еархепв
<400?	38
Азп С1и 01 и	О1и Не Агд А1а Азп
1		5
<210>	39
<211?	13
<212?	РКТ
<213?	Ното	заргепз
<400?	39

Уа1 А1а Уа1 Уа1 Зег <31у А1а Рго

15

Рго А1а Не Ьеи. Зег <31и А1а Зег

1	5
<210?	40
<211>	14
<212?	РКТ
<213?	Ното еаргене
<400?	40

А1а Рго 11е Рго Ηίβ

Ьуз Уа1 11е 31п А1а С1п ТЬг А1а

1	5
<210>	41
<211>	17
<212>	РЕТ
<213>	Ното эаргепэ

Рке Зег А1а Азп Рго А1а <400> 41

Азп <31у А1а Туг Ьуз А1а 11е Рго

Уа1 А1а 61п Азр Ьеи Аеп А1а Рго

- 38 013876

10 15

Зег <210> 42 <211> 16 <212> РКТ <213> Ното зараепз <400> 43

ТЬг Азη С1у Уа1 Уа1

Н1з 7а1

Не ТЬг

Авп Уа1 10

Беи 31т1 Рго Рго А1а 15

1

5

<210>

43

<211>

16

<212>

РКТ

<213>

Ното

зархепз

<400>

43

ТИг ТЬг

ТЬг

01п Бен

Туг

Т11Г

Азр

Агд

ТЪг

(31и

Буй

Беи

Агд

Рго

(31и

1

5

10

15

<210>

44

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

еархепз

<400>

44

С1у Був Буз

<31X1 Туг

Беи

Не

А1а

С1у

Буз

А1а

Н1Х1

<31у

Азр

<31у

1

5

10

15

<210>

45

<211>

15

<212>

ркт

<213>

Ното

зар1епз

<400>

45

МеС (Э1у С1и

Не А1а

Зег

РНе

Азр

Вуз

А1а

Буз

Беи

Буз

Буз

ТЬг

10 15

<210>	4€
<211> <212> <213>	14 РКТ Ното заргепз
<400>	46

- 39 013876

Мек А1а 01и Не О1и Ьуз	РНе Азр
1	5
<210»	47
<211>	15
<212 >	РЕТ
<213»	Ното	зархепз
<400»	47
Уа1 Уа1	Зег	Зег Ые	С1и	С1П	Ьуз
1		5
<210»	48
<211»	13
<212»	РЕТ
<213>	Ното	эархепз
<400»	46
Ηίε Зег Ьуз	11е 11е	Т1е	11е	Ьуз
1		5
<210>	4Э
<Ξ11>	15
<212>	РКТ
<213>	Ното	зархепз
<400>	49
Азп Рго Рго	Зег Мес	17а1	А1а	А1а
1		5
<210>	50
<211»	20
<212»	РКТ
<213»	Ното	зар1епз
<400»	50
Тгр 11е Зег	Ьуз О1п	С1и	туг	Авр
1		5
Ахд ьуз Суз	РИе
		20
<210»	51
<211>	13
<212>	РЕТ
< 213 >	Ното	зархепз

Ьуз Зег Ъув Ьеи Ьув Ьуз

Ткг О1и С1у А1а 01и Ьуз Ьуз

15

Ьуз О1у Н13 А1а Ьуз

О1у Зег Уа1 Уа1 А1а А1а Уа1

15

0111 Зег С1у Рго Зег Не Уа1 Н13

15

- 40 013876

<400>	51
Ьеи Ьуз	Ьуз Туг Ьеи Туг О1и Не А1а Агд Агд Н1з Рго
1	5 10
<210>	52
<2115.	13
<2125.	РЕТ
<213>	Ното заргепз
<400>	52
ТНг Теи Ча1 Е1и Уа1 Зег Агд Азп Ьеи <31у Ьуз Уа1 <31у

10 <210> 53 <211> 16 <212 > РЕТ <213 > Ното вархепв <400> 53

ТЬг	Рго ТЬг Ьеи ν&1 01и Уа1	Зег Агд Аеп Ьеи <31у Ьуз Уа1 С1у Зег
1	5	10	15

<210>	54
<211>	21
<212>	РЕТ
<213>	Ното	зар!епз
<4005·	54
С1и Ьуз Зег	Ьуз 01и С1п	Ьеи ТЬг Рго Ьеи	11е Ьуз Ьуз А1а С1у ТЬг
1		5	10	15

Е1и Ьеи Уа1 Азп РИе <210> 55 <211> 16 <212> РЕТ

<213?	Ното	зархепз
<400>	55
Туг Ргс	| Ьуз	Зег Ьеи Н1з	МеЬ Туг А1а Авп Агд	Ьеи Ьеи Азр Ηίβ Агд
1		5	10	15
<210>	56
<211>	14

- 41 013876 <212> РКТ <213> Ното зархепе <400> 56

С1и Рго Туг Туг Ьуа Мер <31п ТЬг Агд А1а С1у Зег Агд С1и
1	5	10
<210>	57
<211>	20
<212>	РКТ
<213>	Ното зартепз
<400>	57
А1а Рго	Рго Зег С1у С1у Рго	01у РЬе Ъеи Зег 11е <31и Агд Рго
1	5	10 15
Зег Агд	Рго Рго
	20
<210>	58
<211>	14
<212>	РЕТ
<213>	Ното зархепе
<400>	58
РНе <31у Рго 11е Туг Азп Туг	Ьуз Азр ТЬг Не ν^Ι РЬе Ьув
1	5	10
<210>	59
<211>	12
<212>	РКТ
<213>	Ното зар1епз
<400>	59
Зег Рго Азр Рго Зег Не Туг	А1а Туг Азр Авп РЬе
1	5	10
<210>	60
<211>	23
<212>	РКТ
<213>	Ното вараепв
<400>	60
О1и Рго Рго 7а 1 11е С1п Азп	Рго 61и Туг Ьуз <31у С1и Тгр Ьу£

10 15

- 42 013876

Агд 61η Не Азр Азп Рго Азр <210> 61 <211:. 13 <212> РКТ <213> Ното зархепз <400> 61

Б1у Уа1 1

11е

Ьуз Уа1 5

Р’пе Азп Авр МеЬ

Ьуз Уа1 Агд Вуз 10

<210>

62

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

зар1епв

<400>

62

А1а Ргс

С1у

Туг Ьеи

А1а

11е

ТЬг

Ьуз

Ьуз

Уа1

А1а

Уа1

Рго

Туг

1

5

10

15

<210>

63

<211>

16

<212>

РКТ

<213>

Ното

эархепз

<400>

63

А1а Зег Уа1

Азр Ьеи

Вуз

Азп

ТЬг

С1у

Агд

<31и

О1и

РЬе

Ьеи

ТЪг

А1а

1

5

10

15

<210>

64

<211>

16

<212>

РЕТ

<213>

Ното

Ββρίβηε

<400>

64

С1у Азп Шз

С1п РНе

А1а

Ьуз

Туг

Ьуз

Зег

РЬе

Ьуз

Уа1

А1а

Азр

С1и

1

5

10

15

<210>

65

<211>

15

<212>

РЕТ

<213>

Ното

вархепз

<=400>

65

Уа1 Зег Н13

РЬе РНе

Агд

С1и

Веи

А1а

01и

С1и

Ьуз

Агд

С1и

О1у

1

5

10

15

- 43 013876 <210>55 <211»14 <212» РЕТ <213» Ното вархепв <400»66

ГО г Ргс	| Αερ	А1а Ме£	Буе	А1а	А1а	Мер	А1а	Беи	01и	Буз	Буг
1		5					10
<210»	67
<211»	12
<212»	РЕТ
<213>	Ното	53.ρΪ6Π8
<40С>	67
Рке Уа1	Мак	О1у ν£1	Αεη	Н1й	О1и	Буе	Туг	Αερ	Авп
1		5					10
<210»	68
<211»	13
<212»	РЕТ
<213»	Ното	еар1епз
<400>	68
Ткг О1у Уа1	Рке Тйг	Ткг	Ме£	С1и	Бу а	А1а	О1у	А1а	ΗΪ3
1		5					10
<210»	69
<211»	25
<212»	РЕТ
<213>	Ното	бархепв
<400»	69
11е Зег Тгр	Туг Аер	Ави	01и	Рйе	<31у	Туг	Зег	Аеп	Агд	Уа1

10 15

Беи МеЬ А1а Ηΐε Мер А1а Зег Буе <31и

2025

<210» <211> <212> <213»	70 22 РЕТ Ното заргепв
<400>	70

- 44 013876

αίγ тъг 1

<31у

А1а Зег (31у 5

5ег

РЬ.е Буз Беи 10

Аз η Буз

Буз

А1а А1а Зег 15

□1у С1и

А1а

Був Рго 20

Був

<210>

71

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

зартепз

<400>

71

Азр Уа1

01у

Уа1 Туг

Агд

А1а

Уа1

Т11Г

Рго

е1п

61у

Агд

Рго

Азр

1

5

10

15

<210>

72

<211>

15

<212>

РКТ

<213>

Ното

вархепв

<400>

72

Авр Уа1

<Э1у

<31 и РЪе

Агд

А1а

Уа1

ТЬг

С1и

Беи

01у

Агд

Рго

Авр

1

5

10

15

<210>

73

<211>

16

<212>

РЕТ

<213>

Ното

вархепэ

<400>

73

Н1з Рго Беи

Н1в Зег

Був

11е

11е

Не

11е

Був

Був

С1у

Н16

А1а

Буз

1

5

10

15

<210>

74

<211>

14

<21Ξ>

РЕТ

<213>

Ното

вартепв

<400>

74

Авр Був Авр

Беи РЬе

Був

А1а

Уа1

Авр

А1а

А1а

Беи

Був

Буз

1

5

10

<210>	75
<211>	14
<212>	РКТ
<213>	Ното

- 45 013876 <400>75

Був Авр Був Ткг Туг Зег Туг Беи Авп Був Беи Рго Ча1 Був 1510

<210> <211> с212> <213>	76 19 РКТ Ното зар!епз
<400>	76

Ча1 Не Був Мек б1у Ча1 А1а А1а Ηίβ

Був Був Зет Ηίβ <31и О1и Зег

15

Ηίβ Був 01и <210>77 <211> 21 <212> РКТ <213> Ното вар1епв <400>77

МеЕ. 11е <31и С1п Авп ТЪг Був Зег Рго Беи РНе Мес <31у Був Ча1 Ча1

1015

Азп Рго ТНг С1п Був <210> 73 <211> 15 <212> РКТ

<213>

Ното

еархепэ

<400>

78

О1у Рго Н1з

РЬе Азп

Рго

Ьеи

Зег

Агд

Був

ΗΪ3

С1у

С1у

Рго

Буз

1

5

10

15

<210>

79

<211>

16

<212>

РКТ

<213>

Ното

вар1епв

<400>

79

Авр Рго С1п

Ткг РЬе

Туг

Туг

А1а

Ча!

А1а

Ча!

Ча!

Був

Був

Авр Зег

1

5

10

15

- 46 013876

Claims (33)

ФОРМУЛА ИЗОБРЕТЕНИЯ
1. (1) получение цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) от пациента;

   1. Опухолеассоциированный пептид, выбранный из группы пептидов, включающей по меньшей мере одну последовательность в соответствии с любой из БЕР ΙΌ № 33, БЕР ΙΌ № 42, БЕР ΙΌ № 43, БЕР ΙΌ № 31 и БЕр ΙΌ № 1-32, БЕр ΙΌ № 34-41 и БЕр ΙΌ № 44-49 или их вариант, при условии, что пептид не является интактным человеческим опухолеассоциированным полипептидом и обладает общей длиной между 9 и 30 аминокислотами.
2. (2) введение в указанные клетки нуклеиновой кислоты, кодирующей Т-клеточный рецептор (ТКР) или функционально эквивалентную молекулу, как определено; и (3) введение клеток, полученных на стадии (2), пациенту.

   2. Опухолеассоциированный пептид по п.1, причем пептид состоит преимущественно из аминокислотной последовательности в соответствии с любой из БЕр ΙΌ № 1-49 или их вариантом.
3. 3. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1, 2, состоящий из аминокислотной последовательности в соответствии с любой из БЕр ΙΌ № 1-49.
4. 4. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-3, имеющий способность связываться с молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса ΙΙ, в особенности с НЬА-БКВ1*0101.
5. 5. Опухолеассоциированный пептид по п.4, имеющий способность связываться по крайней мере с одной дополнительной молекулой главного комплекса гистосовместимости человека (МНС) класса ΙΙ.
6. 6. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-5, причем пептид включает непептидные связи.
7. 7. Опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-6, причем пептид является белком слияния, в особенности включающим Ν-терминальные аминокислоты НЬА-ЭВ антигенассоциированной инвариантной цепи (Ιί).
8. 8. Нуклеиновая кислота, кодирующая пептид по любому из пп.1-7.
9. 9. Нуклеиновая кислота по п.8, которая является ДНК, кДНК, ПНК, ЦНК, РНК или их комбинациями.
10. 10. Вектор экспрессии, способный экспрессировать нуклеиновую кислоту по п.8 или 9.
11. 11. Клетка-хозяин, включающая нуклеиновую кислоту по п.8 или 9 или вектор экспрессии по п.10.
12. 12. Клетка-хозяин по п.11, являющаяся рекомбинантной клеткой ЯСС или клеткой линии А\ус11з.
13. 13. Способ получения опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-7, включающий культивирование клетки-хозяина по п.12 и выделение пептида из клетки-хозяина или ее культуральной среды.
14. 14. Фармацевтическая композиция, содержащая опухолеассоциированный пептид по любому из пп.1-7 и фармацевтически приемлемый носитель.
15. 15. Фармацевтическая композиция, содержащая нуклеиновую кислоту по п.8 или 9 или вектор экспрессии по п.10 и фармацевтически приемлемый носитель.
16. 16. Фармацевтическая композиция по п.14 или 15 в форме противораковой вакцины, факультативно включающая по меньшей мере один приемлемый адъювант.
17. 17. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-7 в медицине.
18. 18. Применение нуклеиновой кислоты по п.8 или 9 или вектора экспрессии по п.10 в медицине.
19. 19. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5, включающий введение пациенту эффективного объема пептида по любому из пп.1-7, причем объем указанного пептида является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у указанного пациента.
20. 20. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5, включающий введение пациенту эффективного объема нуклеиновой кислоты по п.8 или 9 или вектора экспрессии по п.10, причем объем указанной нуклеиновой кислоты или объем указанного вектора экспрессии является эффективным для возбуждения иммунного ответа против клетки-мишени у указанного пациента.
21. 21. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-7 для получения лекарственного средства для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5.
22. 22. Применение нуклеиновой кислоты по п.8 или 9 или вектора экспрессии по п.10 для получения лекарственного средства для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5.
23. 23. Применение опухолеассоциированного пептида по любому из пп.1-7 для получения лекарственного средства для индуцирования иммунного ответа, в особенности клеточного иммунного ответа, более предпочтительно опосредованного Т-клетками иммунного ответа против клеток солидных опухолей, клетки которых экспрессируют молекулу ΙΙ класса МНС человека на их поверхности и презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5.
24. 24. Применение нуклеиновой кислоты по п.8 или 9 или вектора экспрессии по п.10 для производства медикамента для индуцирования иммунного ответа, в особенности клеточного иммунного ответа, бо

    - 47 013876 лее предпочтительно опосредованного Т-клетками иммунного ответа против клеток солидных опухолей, клетки которых экспрессируют молекулу II класса МНС человека на их поверхности и презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5.
25. 25. Способ получения активированных цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) ίη уйго, включающий контактирование ЦТЛ ίη уйго с нагруженными антигеном молекулами человека МНС II класса, экспрессированными на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки на период времени, достаточный для активации антигенспецифическим образом указанных ЦТЛ, причем указанный антиген является пептидом согласно любому из пп.1-7.
26. 26. Способ по п.25, примем антиген нагружен на молекулы МНС II класса, экспрессированные на поверхности подходящей антигенпрезентирующей клетки при контактировании достаточного количества антигена с антигенпрезентирующей клеткой.
27. 27. Способ по п.25, причем антигенпрезентирующая клетка включает вектор экспрессии по п.10.
28. 28. Способ по любому из пп.25-27, причем молекула МНС класса II является НТА-БКВ1*0101.
29. 29. Активированные цитотоксические Т-лимфоциты (ЦТЛ), полученные с помощью способа по любому из пп.25-27, которые селективно распознают клетку, которая аберрантно экспрессирует полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5.
30. 30. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клеткн-мншенн аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5, включающий введение пациенту эффективного числа цитотоксических Т-лимфоцитов (ЦТЛ) по п.29.
31. 31. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента, чьи клетки-мишени аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5, включающий следующие стадии:
32. 32. Способ уничтожения клеток-мишеней у пациента по любому из пп.20, 30 или 31, причем клетки-мишени являются раковыми клетками, в особенности клетками солидных опухолей, которые экспрессируют молекулу II класса МНС человека на их поверхности и презентируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5.
33. 33. Применение цитотоксических Т-лимфоцитов по п.29 для получения лекарственного средства для уничтожения клеток-мишеней у пациента, клетки-мишени которого аберрантно экспрессируют полипептид, включающий аминокислотную последовательность согласно любому из пп.1-5.

    МНС II ЯСС 132 СО68 Λ ν · У* '^г у' < 1 КССИ ВШ'й’ТГЧ - Л·-· : СО68 ' *. ^{ν г} ο, /?. СО68 'е ч γ\Ά НИ* У /' КСС211 изотигь контроль В Фиг. 1