JPH10506004A - ポリエピトープワクチン - Google Patents

Abstract

(57)【要約】 本発明は、組み換えポリペプチド細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンに関する。このワクチンは、１つ又はそれ以上の病原からの複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを含む少なくとも１つの組み換えタンパク質を含有し、少なくとも１つの組み換えタンパク質が、前記細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される配列を実質的に含まない。さらに本発明は、１つ又はそれ以上の病原からの複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープをエンコードする少なくとも１つの配列を含むポリヌクレオチドも提供する。

Description

【発明の詳細な説明】 ポリエピトープワクチン 本発明は、複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを含むワクチン、及び複数の 細胞毒性Ｔリンパ球エピトープをエンコードする配列を含むポリヌクレオチドに 関する。 ＣＤ８＋αβ細胞毒性Ｔリンパ球（ＣＴＬ）は、クラスＩ主要組織適合性複合 体¹（ＭＨＣ）の特異的対立遺伝子を持つ短いペプチド（エピトープ、通常８− １０アミノ酸長）を認識する。ペプチドエピトープは、主に細胞質ゾルタンパク 質からタンパク質分解によって生成され、その過程は多重触媒プロテオソーム(p roteosome)複合体を含むと考えられている^2-7。適当な長さのペプチドは、特異 的なエピトープがＭＨＣと結合する小胞体に運ばれる。次いで、ＭＨＣ／エピト ープ複合体は、ＣＴＬに認識されるために細胞表面に運ばれる。ＣＴＬエピトー プのフランキング（隣接する）配列の、これらのエピトープのタンパク質分解過 程への影響は議論を残している^8-12。しかし、配列中に９個のＣＤ８ＣＴＬエピ トープを含む人工的ポリペプチドタンパク質をコードする組み換えワクシニアを 構成することにより、本発明者等は、ＣＴＬエピトープの天然フランキング配列 はクラスＩ過程には必要でないこと、即ち、ポリエピトープタンパク質内の各エ ピトープは常に効率的に加工され、オートロガスなポリエピトープワクシニアに 感染した標的細胞によって適当なＣＴＬクローンに提示されることを決定した。 従って、第１の態様において、本発明は、１つ又はそれ以上の病原からの複数 の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを含む少なくとも１つの組み換えタンパク質を 含有する、組み換えポリペプチド細胞毒性Ｔリンパ球ワクチンであり、少なくと も１つの組み換えタンパク質が、前記細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して (flank)天然に見出される配列を実質的に含まないことを特徴とするワクチンで ある。 好ましくは、少なくとも１つの組み換えタンパク質が、細胞毒性Ｔリンパ球エ ピトープに隣接して天然に見出される配列を含まない。しかし、細胞毒性Ｔリン パ球エピトープに隣接して天然に見出される長さの短い配列（例えば、１−５ア ミノ酸）は含まれていてもよい。「細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天 然に見出される配列を実質的に含まない」という表現は、そのような長さの短い フランキング配列は含むものと解される。 第２の態様では、本発明は、１つ又はそれ以上の病原からの複数の細胞毒性Ｔ リンパ球エピトープをエンコードする少なくとも１つの配列を含むポリヌクレオ チドであって、少なくとも１つの配列が、前記細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに 隣接して天然に見出されるペプチド配列をエンコードする配列を実質的に含まな いことを特徴とするポリヌクレオチドである。 ここでも、「細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される配列 を実質的に含まない」という表現は、細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して 天然に見出される長さの短い配列（例えば、１−５アミノ酸）を含む可能性があ ると解される。 第３の態様では、本発明は核酸ワクチンであり、このワクチンは、本発明の第 ２の態様のポリヌクレオチドと、許容されうるキャリアとからなる。 第４の態様では、本発明はワクチン製剤であり、このワクチンは、本発明の第 １の態様の組み換えタンパク質と、許容されうるキャリア及び／またはアジュバ ントを含む。 本発明の好ましい実施態様では、少なくとも１つの組み換えタンパク質が、少 なくとも３つの細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを含み、少なくとも１つの配列が 少なくとも３つの細胞毒性Ｔリンパ球エピトープをエンコードする。 さらに好ましい実施態様では、エピトープが、多重病原(multiple pathogen) からのものである。 また、本発明のワクチンは、（シトキンなどの）イムノドゥレートリ(immunod ulatory)化合物、他のタンパク質／化合物（メリチンまたは調節タンパク質）及 び／またはアジュバントを含んでも良いとされる。このワクチンは、ヘルパーエ ピトープ／ＣＤ４エピトープ及びタンパク質、Ｂ細胞エピトープまたは例えば破 傷風毒素などのそのようなエピトープを含むタンパク質を含んでも良い。本発明 のワクチンの他の例は、組み換えワクチン構造体からなり、ＣＴＬエピトープを 含むポリペプチドは、細胞外糖タンパク質、または、Ｂ細胞及び／またはＣＤ４ エピトープ含有糖タンパク質に結合している。 本発明のワクチンは、例えば、ワクシニアベクター、アビポックス(avipox)ウ イルスベクター、細菌ベクター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及びラブドウイル スといった種々のベクターによって、または、核酸ワクチン化技術によって誘導 してよい。ポリとーぷタンパク質は、製造及び／または漿液注入中にタンパク質 分解を受けやすいので、我々は、そのようなワクチンを誘導する最善の方法は、 核酸ワクチン化技術¹²、ベクター系またはポリトープタンパク質をタンパク質分 解から保護するアジュバント系を用いることであると考える。ベクターに関する さらなる情報は、Chatfield，等，Vaccine，7，495-498，1989; Taylor，等，Va ccine，13，539-549，1995; Hodson 農業におけるワクチン(Vaccines in Aglicu lture)の中の、「細菌ワクチンベクター(Bacterial Vaccine Vectors)」に見ら れる。 本発明のポリトープワクチンは、標的集団のＨＬＡ多様性をカバーするように 、一つの病原からの多数のエピトープ（例えば１０以上）を含んでもよい。例え ば、ＨＬＡ Ａ１、Ａ２、Ａ３、Ａ１１、及びＡ２４に制限されたエピトープを 含むワクチンは、コーカサス集団の約９０％をカバーする。 本発明のポリトープワクチンは、多数のエピトープが単一のＨＬＡ対立遺伝子 によって制限されるように構成されてもよい。 本発明の第四の態様の好ましい実施態様では、ワクチン製剤はＩＳＣＯＭを含 んでいる。ＩＳＣＯＭに関する情報は、オーストラリア特許第５５８２５８号、 欧州特許尾０１９９４２号、米国特許４５７８２６９号、及び米国特許４７４４ ９８３号に見られ、これらの開示を参考として取り入れる。 本発明の性質をさらに明瞭に理解するために、ここで、図面を添付して、以下 の実施例を参照しながら好ましい形態を説明する。 図１．配列中に９個のＣＴＬエピトープを含有するポリトープタンパク質をコ ードする合成ＤＮＡ挿入断片を発現する組み換えワクシニアの構造。ボックスで 囲った配列は、線形Ｂ細胞エピトープを発現する。 図２．組み換えポリトープワクシニア構造体で発現された各エピトープのＣＴ Ｌ認識。 図３．ポリトープワクシニアは、エピトープ特異的反応をリコール(recall)す る。ドナー（Ａ）ＣＭ−Ａ２４、Ａ１１、Ｂ７、Ｂ４４；（Ｂ）ＹＷ−Ａ２、Ｂ ８、Ｂ３８、及び、（Ｃ）ＮＢ−Ａ２、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ３５からのバルクエフ ェクターは、ポリトープワクシニアを持つ末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）で、０ ．０１のＭＯＩで２時間感染させ、次いで２回洗浄することによって生成された 。１０％ＦＣＳ／１６４０ＲＰＭＩでの１０日培養の後、バルクエフェクターは 、標準的な５時間クロム放出アッセイ¹⁴において、示したペプチド（１０μＭ） で過敏化したオートロガスなフィトヘマグルチニンＴ細胞芽球標的細胞（Ｅ：Ｔ ２０：１）に対して使用された。照射したオートロガスＡタイプＬＣＬ¹⁴の添 加によって生成したバルクエフェクターは、上記と同様の結果を与えた。 図４は、１０個のマウスＣＴＬエピトープを含むポリトープＤＮＡ挿入断片(i nsert)の構造を示す。 図５は、図１のポリトープＤＮＡ挿入断片の配列を示す。 図６は、図３のＤＮＡ挿入断片を含む組み換えワクシニアでワクチン化された マウスから取り出した脾臓細胞に行ったＣＴＬアッセイの結果を与える。 図７は、ポリトープワクシニアワクチン化の５週間後、及び、ＭＣＭＶチャレ ンジの４日後の脾臓ＭＣＭＶタイター（±標準誤差）の比較を示す。Ｐ値−非対 スチューデントｔ−テスト。 図８．Ｂａｌｂ／ｃマウス中の異なるプラスミドでのＤＮＡワクチン化。 図９．これらの株（Ｂａｌｂ／ｃ、ＣＢＡ、Ｃ５６ＢＬ／６）からのマウスの ポリトープワクシニア免疫化（ＩＰ）マウスは、移植された脾臓を持ち、脾臓細 胞は、ペプチド（例えば、Ａ’に対してＡ）で再刺激された。エフェクターは、 インフルエンザＮＰペプチド”ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ”での刺激によって生成され た。エフェクターは、次いで、ペプチド被覆標的（Ａ−Ｊ）、ウイルス感染標的 （Ａ’−Ｊ’）、及び、腫瘍標的（Ｉ’）に用いられた。ウイルス感染標的は、 負の対照としての尿膜液(allantoic fluid)（Ａ’、Ｆ’）、または、マウスポ リトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｍｕ ＰＴ）（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）のい ずれかで、負の対照としてヒトポリトープワクシニア（Ｖａｃｃ Ｈｕ ＰＴ） で 感染した。 実施例１ ９個の、クラスＩ制限された、数種のエプスタイン・バールウイルス各抗原（ ＥＢＮＡ）からのＣＴＬエピトープを、ＣＴＬクローンを用いて予め決定した^{10 、18-20} 。クローンは、通常の健常エプスタイン・バールウイルス（ＥＢＶ）セロ ポジティブなドナーから単離し、異なるＨＬＡ対立遺伝子で制限した（表１）。 これらのＣＴＬエピトープの９個全てを含む単一の人工タンパク質をコードする 組み換えポリペプチドワクシニア（ポリトープワクシニア）を構成した（図１） 。このタンパク質をコードするＤＮＡ配列は、オーバーラップ延長によるスプラ イシング（ＳＯＥｉｎｇ）、及び、６個のオーバーラップしたオリゴヌクレオチ ドを結合するポリメラゼ連鎖反応（ＰＣＲ）を用いて製造した。挿入断片は、ｐ Ｂｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩにクローンされ、配列をチェックされ、ｐＳＴＰＴ １を生成するワクシニアプロモーターの後ろで、ｐＢＣＢＯ７¹⁵に移入された。 このプラスミドは、次いで、マーカー救援組み換え¹⁶によって、ポリトープワク シニアウイルスを生成させるために用いた。このワクシニアに表現された人工ポ リトープタンパク質は、従って、その起源のタンパク質のＣＴＬエピトープに隣 接して天然に見いだされる配列を含んでいない（図１）。 ポリトープのアミノ酸配列をコードするＤＮＡ配列は、ほ乳類で最もしばしば 用いられるコドンで設計され、コザック(Kozac)配列¹³及び開始コドンの上流側 のＢａｍＨＩ部位を組み込んだ。６個の７０ｍｅｒの２０塩基対がオーバーラッ プしたオリゴヌクレオチドは、ともにオーバーラップ延長によるスプライシング （ＳＯＥｉｎｇ）¹⁴を用いてスプライシングした。これは、標準ＰＣＲバッファ ー、２ｍＭのＭｇＣｌ₂、０．２ｍＭｄＮＴＰｓ、１．５ＵのＴａｑ ポリメラ ーゼ（９４℃で加熱開始）を含む２０μｌ反応で、以下の温度プログラムに従っ て行なわれた。９４℃で１０秒、４５℃で２０秒、及び７２℃で２０秒（４０サ イクル）。各ゲル精製ダイマーサンプルの半分を、さらに０．５μｌのα³²ｐ ｄＣＴＰを添加した第２のＰＣＲ反応（１２サイクル）に結び付けた。反応は、 ６％アクリルアミドゲル上で行い、ヘキサマー生成物に相当する位置のスライス を単離した。２つの２０ｍｅｒオリゴヌクレオチドは、温度５６℃での２５サイ クルのアニーリングを用いたヘキサマーのＰＣＲ増幅に用いられる。ゲル精製さ れたフラグメントはｐＢｌｌｕｅｓｃｒｉｐｔ ＩＩ ＫＳ−のＥｃｏＲＶ部位 にクローンされ、配列をチェックされ、ｐＳＴＰＴ１を生成するためにワクシニ アプラスミドベクターｐＢＣＢ０７¹⁵のＢａｍＨｉ／ＳａＩＩ部位を用いて、ワ クシニアｐ７．５早期／晩期プロモーターの後ろにクローンされた。ＴＫ−組み 換えウイルスの構成は、ｐＳＴＰＴ１とＶＶ−ＷＲ−Ｌ９２９との間の前記マー カー救済結合を用いて行われた¹⁶。プラーク精製ウイルスは、ＴＫ表現型及び適 当なゲノム配列に対して、細菌ＤＮＡのサザンブロットによって試験した¹⁶。 各エピトープがポリトープタンパク質から効率的に加工されるか否かを確認す るために、ポリトープワクシニアを、各エピトープを制限するＨＬＡ対立遺伝子 を表現した標的細胞のパネルの感染に使用した。対で、各エピトープに特異的な オートロガスＣＴＬクローンを、標準クロム放出アッセイにおけるエフェクター 細胞として使用した。試験した全てのケースで、ＣＴＬクローンは、ポリトープ ワクシニア及び適当な（表１）ＥＢＮＡワクシニア（正の対照）で感染したＨＬ Ａ適合標的細胞を認識して殺傷したが、ＴＫ−ワクシニア（負の対照）はしなか った（図２）。 図２は、ポリトープワクシニア構造体に表現された各エピトープのＣＴＬ認識 を示す。エフェクターＣＴＬは、表１に挙げた（Ｅ：Ｔ比５：１）。標的細胞（ 下記）は、（ｉ）ＣＴＬクローンで認識されるＥＰＶ核光源（ＥＢＮＡ）（表１ 参照）（正の対照）、または（ｉｉ）ポリトープ構造体（例えば、ポリトープワ クシニア）を発現する組み換えワクシニアで感染させた。標的細胞のワクシニア 感染は、５：１の多重感染においておこない、次いで３７℃で１４−１６時間イ ンキュベーションし、その後、５時間、標準⁵¹Ｃｒ放出アッセイを用いた。クロ ーンＬＸ１は、アッセイの時点で得られなかった。標的細胞；２タイプのＥＢＶ 、Ａ及びＢ−タイプがあり、これらのＥＢＮＡタンパク質配列はかなり個となっ ている。ＣＴＬクローンＬＣ１３、ＬＣ１５、ＣＭ４、ＮＢ２６、ＪＳＡ２、及 びＣＭ９は、Ａ−タイプＥＢＶで形質転換した細胞は認識するが、Ｂ−タイプＥ ＢＶでは認識せず、ＣＴＬクローンＣＳ３１及びＹＷ２２は、Ａ−タイプＥＢＶ 及びＥＢＶで形質転換された細胞を認識する^10、18-20。Ａ−タイプ特異的ＣＴＬ に対して用いる標的細胞は、従って、Ｂ−タイプウイルスで形質転換したオート ロガスなリンパ芽球細胞系（Ｂ−タイプＬＣＬ）である。ＣＳ３１及びＹＷ２２ に対する標的細胞は、抗−ＣＤ４０抗体及びｒＩＬ−４で確立されたＥＢＶネガ ティブなＢ細胞芽球である²¹。 さらなる一連の実験は、ポリトープワクシニアを、インビトロでの、健常ＥＢ Ｖセロポジティブドナーから得た抹消血液単核細胞（ＰＢＭＣ）からの二次的Ｃ ＴＬ反応の刺激に用いた。その結果得られたバルクＣＴＬ培地は、次いで、標準 的なクロム放出アッセイにおける、オートロガスＰＨＡ芽球に過敏化されたペプ チドエピトープに対するエフェクターとして用いられる。このポリトープワクシ ニアは、各ドナーによって発現されたＨＬＡ対立遺伝子に制限されたエピトープ に特異的なＣＴＬ反応をリコールすることができる。 図３は、エピトープ特異的反応をリコールできるポリトープワクシニアを示す 。ドナー（Ａ）ＣＭ−Ａ２４、Ａ１１、Ｂ７、Ｂ４４；（Ｂ）ＹＷ−Ａ２、Ｂ８ 、Ｂ３８、及び、（Ｃ）ＮＢ−Ａ２、Ａ２４、Ｂ７、Ｂ３５からのバルクエフェ ク ターは、ポリトープワクシニアを持つ末梢血液単核細胞（ＰＢＭＣ）で、０．０ １のＭＯＩで２時間感染させ、次いで２回洗浄することによって生成された。１ ０％ＦＣＳ／１６４０ＲＰＭＩでの１０日培養の後、バルクエフェクターは、標 準的な５時間クロム放出アッセイ¹⁹において、示したペプチド（１０μＭ）で過 敏化したオートロガスなフィトヘマグルチニンＴ細胞芽球標的細胞（Ｅ：Ｔ ２ ０：１）に対して使用された。照射したオートロガスＡタイプＬＣＬ¹⁹（ＬＣＬ のＰＢＭＣに対する比 １：５０）の添加によって生成したバルクエフェクター は、上記と同様の結果を与えた。 モノクローナル抗体（８Ｇ１０／４８²²及び８Ｅ７／５５²³）に認識された２ つの線形Ｂ細胞エピトープ（ＳＴＮＳ及びＮＮＬＶＳＧＰＥＨ）は、ポリトープ タンパク質の発現に従うために、各ポリトープ構造体の各末端に組み込まれた。 これらの抗体を用いたウェスタンブロット及びリンパ芽球細胞系（ＬＣＬｓ）で 感染したポリトープワクシニアの間接的免疫蛍光抗体染色、及び検出できるＴ２ 細胞列の加工^6、7は、ポリトープタンパク質精製物を検出しなかった（データは 示さず）。同じｐ７．５プロモーターを用いたワクシニアによって発現された組 み換えタンパク質は、通常は容易に検出でき²⁴、このポリトープタンパク質がほ 乳類細胞の細胞質中で容易に分解されることを意味している。Ｔ２細胞系はこれ らのプロテオース様(proteosome)をともなうエンドペプチダーゼを発現しないの で^6、7、この分解は、ＬＭＰ２及び７には依存しない。この現象は、ほ乳類細胞 における端を切り取ったタンパク質またはペプチドを説明する他の研究²⁵と一致 し、個のようなタンパク質が二次または三次構造に保持される可能性が無いこと を反映していると思われる。 ヒトのポリトープを含むグルタチオンＳ−トランスフェラーゼ・フュージョン ベクターを構成した。ヒトポリトープをコードするＤＮＡフラグメントは、ｐＢ Ｓポリトープから、ＢａｍＨＩＩ／ＨｉｎｃＩＩを用いて励起され、ｐＦｕｓｐ ｏｌｙを製造するためにｐＧｅｘ−３ｘ（ＧＳＴ遺伝子フュージョンシステムフ ァーマシア(Pharmacia)）のＢａｍＨＩ／ＡｍａＩ制限部位にクローンされた。 このプラスミドは、標準的な誘発プロトコールを用いて、細菌のポリトープフュ ージョンの発現に用いられた。細菌のアリコートは、ローディング・バッファー 中 に溶解し、寸法標識を備えた２０％ＳＤＳ ＰＡＧＥ下る上を走らせた。このゲ ルは、発現された約３８ｋＤ（ヒトポリトープ プラス ＧＳＴドメイン（２６ ｋＤ））のタンパク質が、プラスミドを含む細菌内で発現されたことを示した。 ２つのモノクローナル抗体８Ｇ１０／４８及びＥ７／５５のウェスタンブロット は、検出されたフュージョンが、ポリトープ構造体の各末端に組み込まれた２つ の線形Ｂ細胞エピトープ（各々、ＳＴＮＳ及びＮＮＬＶＳＧＰＥＨ）を有するヒ トポリトープを含んでいることを示した。このタンパク質は、リポソームまたは ＩＳＣＯＭｓに組み込まれてもよい。 グルタチオン寒天ビーズを使用したＧＳＴ精製を用いたフュージョンタンパク 質の精製の試みは、細菌抽出物の上澄み中にフュージョンタンパク質が無いので 失敗した。全てのフュージョンタンパク質は、細胞の破片とともに沈澱した。異 なる細菌においてそれ自体発現されたＧＳＴは、細胞抽出物の上澄み中にあり、 容易に精製できるので、プロトコールは誤っていなかった。これらのデータは、 フュージョンタンパク質が、細菌封入体に隔離することなく細菌中で即座に分解 されること、従って、ＧＳＴ系を用いた精製が困難なことを示している。 実施例２ 材料及び方法 マウスのポリトープタンパク質を発現する組み換えワクシニアの構成。種々の 疾患からのクラスＩマウスＣＴＬエピトープは、マウスの３つの株で表現される Ｈ−２Ｄｂ、Ｈ−２Ｋｂ、Ｈ−２Ｋｄ、Ｈ−２Ｋｋ及びＨ−２Ｌｄの各々に対し て２つのエピトープが存在するように選択された（表２参照）。これらのアミノ 酸配列は、各々の最初の５エピトープが異なるＨＬＡ対立遺伝子に制限され、続 いて第２のグループ６−１０に制限されるように配列した。エピトープの２つの グループは、母集団コドン利用データを用いてＤＮＡ配列に変換された。これら ２つのＤＮＡ配列は、ＳｐｅＩによって分離され、５’末端のＸｂａｌ制限部位 及び３’末端のＡｖｒＩＩ部位によってフランクされた。また、５’末端に組み 込まれたのは、ＢａｍＨＩ制限部位、Ｋｏｚａｃ配列¹³、及びメチオニン開始コ ドンである。３’末端に形質胞体ファルシファルム(falciparum)からのＢ細胞エ ピトープはあるが、停止コドン及びＳａＩＩ制限部位は図４及び５に見られる。 ５個の７５ｍｅｒのオリゴヌクレオチド及び２０塩基対がオーバーラップした７ ６ｍｅｒのオリゴヌクレオチドで、この３４１塩基対配列を表現するものは、オ ーバーラップ延長によるスプライシング（ＳＯＥｉｎｇ）¹⁴及びポリメラーゼ連 鎖反応（ＰＣＲ）を用いてともにスプライシングした。プライマーダイマーは、 プライマー１及び２、３及び４、５及び６（各０．４μｇ）から、標準１ｘＰｆ ｕ ＰＣＲバッファー、０．２ｍＭ ｄＮＴＰｓ及び１ＵのクローンしたＰｆｕ ＤＮＡポリメラーゼを含む４０μｌの反応中（９４℃で加熱開始）で、下記の 温度プログラムでプログラムされたパーキン・エルマー９６００ＰＣＲ装置を用 いて製造した。９４℃で１０秒間、４２℃で２０秒間、及び、７２℃で２０秒間 を５サイクル。ＰＣＲプログラムの５サイクルの最後に、７２℃で休止し、反応 ２及び３のアリコートを混合し（反応１はＰＣＲ装置に残す）、さらに５サイク ルを行った。サイクル１０において、プログラムを再度停止し、２０μｌの反応 １を、混合した反応２及び３に添加し、さらに５サイクルを完了した。混合した ４０μｌサンプルを、４％のＮｕｓｉｅｖｅ寒天ゲル（ＦＭＣ）上でゲル精製し 、集めた寸法のフラグメントに対応するゲルスライスを取り出し、Ｗｈａｔｍａ ｎｎ３ＭＭペーパーを通してスピンした。２つの２０ｍｅｒのオリゴヌクレオチ ドを、全長生成物の、上記標準反応混合物及び５０℃のアニール温度及び２５サ イクルを使用したＰＣＲ増幅に用いた。全長ＰＣＲフラグメントは、４％Ｎｕｓ ｉｅｖｅ寒天ゲル上でゲル精製し、ｐＢＳＭＰを製造するためにｐＢｌｕｅｓｃ ｒｉｐｔ ＩＩＫＳ^-のＥｃｏＲＶ部位にクローンし、配列によって突然変異を チェックした。正しい配列を含むＤＮＡ挿入片は、ＢａｍＨＩ／ＳａＩＩ制限酵 素を用いて励起し、ｐＳＴＭＯＵＳＥＰＯＬＹを生成するために、同じ酵素を用 いて、プラスミドシャトルベクターｐＢＣＢ０７¹⁵内のワクシニアｐ７．５早期 ／晩期プロモーターの後ろにクローンした。ＴＫ−組み換えウイルスの構成は、 ｐＳＴＭＯＵＳＥＰＯＬＹ及びＶＶ−ＷＲ−Ｌ９２９の間の上述した¹⁶マーカー 救済組み換えを用いて行った。プラーク精製ウイルスは、ＴＫ表現型、及び細菌 ＤＮＡ¹⁷のサザンブロットによる適当なゲノム配列に対して試験した。 マウスの組み換えマウスポリトープワクシニアでのワクチン化。組み換えワク シニアは、各々がマウスの３つの株、Ｂａｌｂ／ｃｖ、Ｃ５７ＢＬ／６、及びＣ ＢＡの、３匹のマウスのワクチン化に用いた。ワクチン化は、５ｘ１０⁷のワク シニアｐｆｕを含む５０μｌＩ．Ｖ．であり、マウスは３週間回復させた。この 実験では、ＴＫ−ワクシニアは、マウスの各株に対する負の対照として用いた。 細胞毒性Ｔ細胞アッセイ。脾臓細胞は、ワクチン化３週間後のワクチン化マウ スから取り出し、適当なペプチド（１μｇ／ｍｌ）で、印日吐露で再刺激した¹⁶ 。再刺激について、負の対照として用いたペプチドは無い。７日の培養の後、再 刺激したバルクエフェクターを取り出し、５時間、⁵¹Ｃｒ−放出アッセイに用い た。これらのアッセイで用いた標的は、その株によって表現されたペプチドの１ つで被覆された各株からのＣｏｎＡ芽球である。３種の標的対エフェクター比、 ５０：１、１０：１、及び２：１を用い、結果を図６に示した。 結果 マウス組み換えポリトープワクシニアの構成、マウスのポリトープに含まれるエ ピトープのリストを表２に挙げた。 ポリトープＤＮＡ挿入片の構成を、図４にまとめた。ポリトープ配列は図５に示 した。 ＣＴＬアッセイ ポリトープ内の各エピトープは、適当なＭＨＣ対立遺伝子で、マウスに主要な ＣＴＬ反応を誘発した。同じ対立遺伝子に制限された２つのエピトープ間の競合 は観察されなかった。（ＴＫ−対照を与えたＣＢＡマウスにおける高いｆｌｕ ＮＰ反応は、天然に獲得したインフルエンザによると思われる）。 種々のＭＨＣ対立遺伝子に制限された種々の疾患からの多重ＣＴＬエピトープ を含むポリトープ構造体は、ポリトープワクチン内の各エピトープに対して主要 なＣＴＬ反応を生じうる。これは、予防のためにＣＴＬ反応が必要なすべてのワ クチンにおいて明かな応用を有する。例えば、多重ＨＩＶ ＣＴＬエピトープは 治療ワクチンと組み合わせることができ、突然変異を避けることによって表現さ れる予示エピトープとすることができ、それによって疾患の進行を防止する。 マウスのポリペプチドマウスは、ＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＴＬを有し、インビ トロ及びインビボでオボアルブミン移入細胞系ＥＧ７を殺傷することができる。 インビトロで示されたＥＧ７腫瘍細胞を殺傷するＳＩＩＮＦＥＫＬ特異的ＣＴＬ マウスワクシニアで免疫化したマウスからの脾臓細胞を、ワクチン化４週間後 に収集し、インビトロで、１０μｇ／ｍｌのＳＩＩＮＦＥＫＬで７日間再刺激し た。エフェクターは、移入していない親系列ＥＬ４は溶解できないが、ＥＧ７腫 瘍細胞及びＳＩＩＮＦＥＫＬで過敏化したＥＬ４細胞は溶解した。 マウスのポリトーアで補助されたインビボでのＥＧ７腫瘍細胞に対する保護 マウス（Ｃ５７Ｂ６）が、ヒトポリトープワクシニア（Thomsom,ら，1995）ま たはマウスポリトープワクシニア（１０⁷ｐｆｕ／マウス／ｉｐ）のいずれかに 与えられ、４週間後に１０⁷ＥＬ４またはＥＧ７腫瘍細胞（Moore，ら，1988，Ce ll，54，777）を連続的（グループ当り１０−１１マウス）に受けた。 ９日目における、目に見える腫瘍（いずれも＞直径１ｃｍ）を持つマウスの数 を与える。 ＭＣＭＶに対する保護 ＢＡＬＢ／ｃマウスを、ポリトープワクシニアでのワクチン化の５週間後に、 ＭＣＭＶ（Ｋ１８１株、８ｘ１０³ＰＦＵ、１００μｌ 腹腔内）でチャレンジ した。チャレンジの４日後、脾臓グラム当りの細菌タイターを決定し、結果を図 ７に示した（Scalzo，らの方法）。 ＤＮＡプラスミドに誘導されたポリトープワクチンの評価 上記のポリトープタンパク質は、モノクローナル抗体に認識される線形抗体エ ピトープを含む。しかし上述のように、ポリトープタンパク質は、保持構造を持 たない配列のようにきわめて不安定なポリトープワクシニアで感染された細胞内 では検出されない。従って、ポリトープワクチンの輸送は、拡散ワクチン化技術 またはタンパク質分解から保護するアジュバントシステム（例えば、リポソーム またはＩＳＣＯＭ）を用いるのが最善である。 ｐＣＩＳ２．ＣＸＸＮＨからのＣＭＶプロモーターカセット（Easonら,（1986 ）Bioochemistry，25(26)，p8343）は、プラスミドｐＤＮＡＶａｃｃを製造する ために、ｐＵＣ８のＥｃｏＲＩ部位に、Ｌａｃｚ遺伝子と同じ方向でクローンさ れる（ＤＮＡワクチン化実験における対照プラスミドとして用いられる）。次い で、このプラスミドは（ｐＢＳＭＰからの）マウスのポリトープを持ち、多重ク ローニング部位のＸｈｏｌ部位に挿入されてｐＳＴＭＰＤＶを形成する。このプ ラスミドｐＲＳＶＧＭ／ＣＭＶＭＰは、多くの異なるプラスミドを起源とするフ ラグメントをもつ。ＲＳＶプロモーターは、ｐＲＳＶＨｙｇｒｏ（Long，ら,（1 991）Hum．Immunol.，31，229-235）、ｐＭＰＺｅｎからのマウスＧＭ−ＣＳＦ 遺伝子 （ＧＭ−ＣＳＦ）（Johnson，ら,（1989）EMBO，8，441-448）及びｐＣＳからの ＣＭＶプロモーターカセット（Kienzie，ら,（1992）Arch．Virol.，124，p123- 132）から励起される。ＣＭＶカセットの中に、マウスポリトープは多重クロー ニング部位のＳｍａＩ部位にクローンされる。両方の遺伝子、マウスＧＭ−ＣＳ Ｆ及びマウスポリトープは、ＳＶ４０からの２方向ｐｏｌｙＡを用いる。 ９個の６週齢雌Ｂａｌｂ／ｃマウスは、５０μｌのＰＢＳ中のｐＤＮＡＶａｃ ｃ（プラスミド対照）、ｐＳＴＭＰＤＶ（マウスプラスミドのみ）、またはｐＲ ＳＶＧＭ／ＣＭＶＭＰ（マウスＧＭ−ＣＳＦ及びマウスポリトープ）のいずれか ５０μｇをＩ．Ｍ．注入された（次図参照）。これらは、３週間において、他の 同じプラスミドにブースターを与えた。ワクチン化から８週目に、これらのマウ スを殺傷し、脾臓を取り出した。脾臓細胞は分離され、ワクシニアでのワクチン 化ほ乳類について既に述べたペプチドとともに培養した。これらのバルクエフェ クターは、Ｂａｌｂ／ｃに発現されたマウスポリトープのエピトープに対応する ペプチドで被覆されたｐ８１５細胞に対する⁵¹Ｃｒアッセイに用いられた。この アッセイは、Ｅ：Ｔ比２：１、１０：１、及び５０：１で６時間行った。 これらの実験の結果は図８に示す。 マウスポリトープワクシニアに誘発されたペプチド被覆または感染した標的に対 する特異的ＣＴＬ活性 方法 １．ワクチン化及びエフェクター細胞の調製。マウス（グループ当り３）は、５ ｘ１０⁷ＰＦＵのワクシニアで、腹腔内（ＩＰ）ワクチン化された。マウスは、 同じ量のワクシニア３週で、同じ経路でブースト(boost)された。最初のワクチ ン化後６週に脾臓を取り出し、脾臓細胞はＡＣＫバッファー（０．１５Ｍ ＮＨ₄ Ｃｌ、１ｍＭＫ ＨＣＯ₃、０．１ｍＭ Ｎａ₂ＥＤＴＡ）での白血球溶解の後に 単離した（「免疫学に於ける現在のプロトコール(Current Protocols in Immuno logy)」， Ed JE Coligan，AM Kruisbeek，DH Margulies，EM Shevach，W Strob er，1994， John Wiley and Sons Inc．USA.）。ウェル当り５ｘ１０⁶の脾臓細 胞は、バルク Ｔ細胞媒質（ＲＰＭＩ／１０％ ウシ胎児血清（ＦＣＳ）、２ｍＭグルタミン、 ５ｘ１０-⁵Ｍ ２−メルカプトエタノール）中で７日間ペプチド再刺激（１μｇ ／ｍｌ）された後、⁵¹クロム（⁵¹Ｃｒ）ラベルされた標的細胞上で細胞毒性Ｔリ ンパ球（ＣＴＬ）アッセイされた¹⁷。再刺激に用いたペプチドは、上記ＡからＪ に与えた。エフェクターは、ペプチド被覆標的Ａ−Ｊ、細菌感染標的（Ａ’−Ｊ ’）、または標的を発現する移入抗源（Ｉ’）のいずれかに対して用いた。 ２．標的細胞の調製。これらのアッセイで用いた細胞系は、Ｂａｌｂ／ｃ（Ｈ− ２^d）、Ｃ５７ＢＬ／６に対するＥＬ−４及びＥＧ７（Ｈ−２^b）、ＣＢＡに対す るＬ９２９（Ｈ−２^k）、または、各々Ｂａｌｂ／ｃ、Ｃ５７ＢＬ／６またはＣ ＢＡマウスから調製したｃｏｎＡ芽球であった¹。ＣＴＬ殺傷に必要なエピトー プを発現するために、標的細胞は、（ｉ）ペプチド（Ａ−Ｊ）、（ｉｉ）ワクシ ニア（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）、または（ｉｉｉ）インフルエンザ（Ａ’、Ｅ ’）で前インキュベートするか、（ｉｖ）ＳＩＩＮＦＥＫＬエピトープシステム （Ｉ’）の場合は、Ｅ１−４（ＥＧ７）のプラスミド移入物を発現するオボアル ブミンとして維持した。 （ｉ）ペプチド被覆標的（Ａ−Ｊ）：標的細胞は、１０００ｒｐｍ／５分で遠心 分離した。上澄みを約２００μｇ／ｍｌまで廃棄し、１０−２０ＰＲＭＩ（ペプ チド無し）またはＲＰＭＩ（ペプチド被覆）中２００μｍｇ／ｍｌストック溶液 （最終濃度１０μｇ／ｍｌ）のいずれかを細胞ペレットに添加した。１００マイ クロリットルの⁵¹Ｃｒを細胞ペレットに添加し、細胞を３７℃で１時間インキュ ベートした。次いで、ＦＣＳ下層を通してＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで細胞を２回 洗浄し、ＣＴＬアッセイの標的細胞用に１０⁵／ｍｌで再懸濁した。 （ｉｉ）ワクシニア（Ｖａｃｃ）感染標的（Ｂ’−Ｄ’、Ｆ’−Ｊ’）：ワクシ ウイルス感染標的に用いたワクシニアはマウスポリトープ（Ｖａｃｃ Ｍｕ Ｐ Ｔ）、及び、負の対照としてのヒトポリトープ（Ｖａｃｃ Ｈｕ ＰＴ）である 。ワクシニア感染された細胞系は、ｐ８１５（Ｂ’−Ｄ’）、Ｌ９２９（Ｆ’） 、 及びＥＬ−４（Ｇ’−Ｌ’）である。標的細胞は、１０００ｒｐｍ／５分で遠心 分離した。上澄みを約２００μｌまで廃棄し、細胞（約１０⁶細胞）を、２０μ ｌワクシニア（１０⁹ｐｆｕ／ｍｌ）を添加し、続いて３７℃で１時間インキュ ベーションすることによる１０：１の感染多重性(multiplicity of infection) （ＭＯＩ）においてワクシニアで感染させた。次いで、５ミリリットルのＲＰＭ Ｉ／１０％ＦＣＳを添加し、細胞を混合して３７℃で一昼夜インキュベートした 。これらの細胞を、引き続いて遠心分離し、上澄みをカムディン(camdyne)に廃 棄した。１００マイクロリットルの⁵¹Ｃｒを細胞ペレットに加え、細胞を３７℃ で１時間インキュベートした。次いで、ＦＣＳ下層を通してＲＰＭＩ／１０％Ｆ ＣＳで細胞を２回洗浄し、ＣＴＬアッセイの標的細胞用に１０⁵／ｍｌで再懸濁 した。 （ｉｉｉ）インフルエンザ感染標的（Ａ’、Ｅ’）：インフルエンザウイルスの Ａ／ＰＲ／８／３４株を、Ｂａｌｂ／ｃ標的（Ａ’）に、再組合せ(reassortant )Ａ／タイワン(Taiwan)／１／８６（ＩＶＲ−４０）をＣＢＡ標的（Ｅ’）にも ちいた。負の対照として尿膜液を用いた。インフルエンザで感染させた細胞系は 、ｐ８１５（Ａ’）及びＬ９２９（Ｅ’）である。標的細胞は、１０００ｒｐｍ ／５分で遠心分離し、上澄みを廃棄した。５００ミリリットル：インフルエンザ ウイルス（１０⁸ｍｌ ＥＩＤ）または尿膜液、５０μｌの⁵¹Ｃｒ、４００μｌ のＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを細胞ペレットに加え、３７℃で１時間インキュベー トした。１０ミリリットルのＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳを添加し、混合して、３７ ℃でさらに２時間インキュベートした。次いで、ＦＣＳ下層を通してＲＰＭＩ／ １０％ＦＣＳで細胞を２回洗浄し、ＣＴＬアッセイの標的細胞用に１０⁵／ｍｌ で再懸濁した。 （ｉｖ）標的を発現するオボアルブミン（Ｉ’）：ＥＧ７細胞は、チキンのオボ アルブミンｃＤＮＡで形質転換したＥＬ−４細胞である（Moore MW，Carbone FR 及び Bevan BJ（1988）「抗原加工及び表現のクラス１経路への可溶性タンパク 質の導入(Intruduction of soluble protein into Class 1 pathway of antigen processing and presentation)」，Cell，54: 777-785）。これらの細胞は、Ｒ ＰＭＩ／１０％ＦＣＳ、２０っＭ ヘペス、２っＭ グルタチオン、１っＭ ピ ルビン酸ナトリウム、１００１Ｕ／ｍｌ ペニシリン、及び１００μｇ／ｍｌ ストレプトマイシン中に維持した。プラスミドを選択し、１ヶ月に１回５００μ ｇ／ｍｌで、ケネチシン(Geneticin)（Ｇ−４１８）中で維持した。ペプチド無 しのＥＬ−４細胞（ＥＬ４ ｎｏ ｐｅｐ）は、負の対照として用いた。細胞は 、１０００ｒｐｍ／５分で遠心分離し、上澄みは約２００μｌまで廃棄した。１ ００マイクロリットルの⁵¹Ｃｒを細胞ペレットに加え、細胞を３７℃で１時間イ ンキュベートした。次いで、ＦＣＳ下層を通してＲＰＭＩ／１０％ＦＣＳで細胞 を２回洗浄し、ＣＴＬアッセイの標的細胞用に１０⁵／ｍｌで再懸濁した。 ３．ＣＴＬアッセイ。 再刺激した脾臓細胞（５ｘ１０⁶／ｍｌ）を、ＣＴＬア ッセイ用に、３種のエフェクター：標的比（５０、１０、２ｘ１０⁴エフェクタ ー細胞：１ｘ１０⁴標的細胞）で、３つ（１００μｌ）に分けた。標的細胞（１ ０⁵／ｍｌ）の１００マイクロリットルを、全てのエフェクター及び対照ウェル （自発放出＝１００、１μｌ媒質；最大放出＝１００μｌ ０．５％ＳＤＳ／Ｒ ＰＭＩ／１０％ＦＣＳ）に添加した。マイクロタイタープレートを、５００ｒｐ ｍで５分間遠心分離し、３７℃で６時間インキュベートした。プレートは５００ ｒｐｍ／５分で再度遠心分離し、２５μｌの上澄みの⁵¹Ｃｒ放出を計数した。特 異的溶解の比率（％）は、３回の計数の平均を表す：１００ｘ（試験ｃｐｍ−自 発ｃｐｍ）／（最大ｃｐｍ−自発ｃｐｍ）。 結果を図９に示す。 ＤＮＡワクチン化実験 最初のＤＮＡワクチン化実験は、ポリペプチドがＤＮＡワクチン化を用いて誘 導されることを示す。さらに、ワクチン化はシトキン遺伝子（ＧＭ−ＣＦＳ）と ともに誘導することによって促進されるが、この実験においては、この促進は満 足できるほど有意ではない。 現在のシステムは、明らかに最適に次ぐものである。同様の促進は、潜在的に よりよいプラスミドベクター、例えばＶｉｃａｌ、サンディエゴからのプラスミ ドの使用（Sedegah M，R Hendestrom，P Hobart，SL Hoffman，1994，「サーカ ムスポロゾイテタンパク質をエンコードするプラスミドＤＮＡでの免疫化による マラリアに対する保護(Protection against malaria by immunisation with pla smid DNA encoding circumsporozoite protein)」，PNAS，91，9866-9870）、及 び、遺伝子銃を用いた（ＩＭ注入に対して）よりよい誘導システム（SUn WH.，B urkholder JK.，Sun J.，Culp J.，Lu XG.，Pugh TO.，Ershler WB，Yang NS.， 「遺伝子銃によるインビボのシトキン遺伝子輸送がマウスにおける腫瘍成長を低 減させる(IN VIVO CYTOKINE GENE TRANSFER BY GENE GUN REDUCES TURMOUR GROW TH IN MICE)」，Proceedings of the National Academy of Sciences of United States of America)，92: 2889-2893，1995）。さらに、ＣＴＬエピトープに対 するプライミングはＣＤ４Ｔ細胞の助けを必要とし¹⁷、よって、構造体にヘルパ ーエピトープまたはタンパク質を含むことは、マウスＤＮＡワクチンポリトープ によるＣＴＬプライミングのレベル及び信頼性を向上させる。 「最初の抗原シン(sin)」の欠如、即ち、個体が既にエピトープの中の１つに反 応を得ていたときの、ポリトープがポリトープ中の全てのエピトープの免疫反応 を向上させる可能性。 導入 最初の抗原シンとは、抗原に基づく現象に与えられた用語であり、その現象に よって、エピトープに対して存在する抗体反応が、第２のエピトープに対する免 疫反応の発生を、そのエピトープがダイ１のエピトープと雄ねじタンパク質上に 存在する場合に防止する（Benjamini E.，Andria M.L.，Estin C.D.，Notron，F ．L．& Leung C.Y.（1988）「タンパク質抗原にエピトープに対する反応のクロ ーン性に関する研究。エピトープ認識クローン活性のランダム性及びクローナル 優勢の開発(Stdies on the clonality of the response to an epitope of a pr otein antigen．Randomness of activation of epitope-recognizing clones an d the development of clonal dominance.)」，J．Immunol.，141，55）。この 現象の原因は、第１のエピトープに特異的なプライムしたＢ細胞の大集団が、第 ２の 抗体に特異的な無垢のＢ細胞が、抗原と結合し、それを加工し、そしてそれをＴ ヘルパー細胞に提示する機会を持つ以前に、全ての抗原に結合して拭き取ってし まうことである。同様の状況は、個体が、彼／彼女がポリトープ中のエピトープ の１つに対する反応を既に有している場合に、ポリトープでワクチン化されると きにも起こりうる。存在するＣＴＬは、他のエピトープが向くのＴ細胞に提示さ れる前に、ポリトープ発現細胞の全てを殺傷するだろう。 方法 この可能性を試験するために、マウス（Ｂａｌｂ／ｃ）を１０⁴ｐｆｕのマウ スのシトメガロウイルス（ＭＣＭＶ）（Ｋ１８１株 − Scalzo．等，1995）で感 染させ、５週間放置し、その時点で、ＭＣＭＶエピトープ、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ に特異的な強いＣＴＬ反応を起こした（Scalzo，等，1995 − 図２Ａ）。これら のマウスは、次いで、マウスポリトープワクシニアを与えられ、脾臓細胞は、１ ０日後に、マウスのこの株のポリトープによって発現される他の３つのエピトー プ（ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ、リンパ球脈絡髄膜炎ウイルス核タンパク質、Ｈ−２Ｌ^d ；ＴＹＱＲＴＲＡＬＶ、インフルエンザ核タンパク質、Ｈ−２Ｋ^d、及び、ＳＹ ＩＰＳＡＥＫＩ、Ｐ．ベルグハイ(P．Berghei)サーカムスポロゾイテ、Ｈ−２Ｋ^d ）に特異的なＣＴＬに対して試験された。 結果 ３つの新しいエピトープの各々に対する反応は、以下のポリトープワクチン化 に見られ、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ特異的ＣＴＬは、ＲＰＱＡＳＧＶＹＭ、ＴＹＱＲ ＴＲＡＬＶ及びＳＹＩＰＳＡＥＩに特異的なＣＴＬのプライミングを、これら４ つのエピトープがポリトープ中にともに存在する場合は阻害しないことが示され た。（マウスポリトープワクシニアではなくヒトポリトープワクシニアを受けた 対照動物は、ＹＰＨＦＭＰＴＮＬ特異的ＣＴＬのみを示した。） この一連の実験は、例えば、ポリトープが種々の異なる疾患をカバーするよう に設計されれば、そのようなポリトープワクチンを受けた個体は、標的とする疾 患の１つに既に罹患していなければ、ポリトープ中の残ったＣＴＬエピトープに 対して免疫化されることを示している。 当業者には明らかなように、本発明者等は、クラスＩ加工にはＣＴＬエピトー プのフランキング配列は必要ないこと、即ち、ポリトープタンパク質内の各エピ トープは常に効率的に加工され、オートロガスなポリエピトープワクシニア感染 した標的細胞によって適当なＣＴＬクローンに提示されることを示した。ポリト ープが、エピトープに隣接して天然には見いだせない配列を含んでも良いことは 当業者にとって明白である。 上で議論したように、本発明はエピトープの範囲で使用できる。エピトープの 範囲は、Brusic，等，Nucleic Acids Research，1994，22; 3663-5 に記載され たインターネットのアドレスから知ることができる 特別な実施態様として示した本発明を、広く記載した精神または範囲から離れ ることなく種々の変形及び／または修飾を施すことは当業者には容易である。こ れらの実施態様は、全ての点において例示的であり、何ら制限するものではない 。

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (81)指定国 ＥＰ(ＡＴ，ＢＥ，ＣＨ，ＤＥ， ＤＫ，ＥＳ，ＦＲ，ＧＢ，ＧＲ，ＩＥ，ＩＴ，ＬＵ，Ｍ Ｃ，ＮＬ，ＰＴ，ＳＥ)，ＯＡ(ＢＦ，ＢＪ，ＣＦ，ＣＧ ，ＣＩ，ＣＭ，ＧＡ，ＧＮ，ＭＬ，ＭＲ，ＮＥ，ＳＮ， ＴＤ，ＴＧ)，ＡＰ(ＫＥ，ＭＷ，ＳＤ，ＳＺ，ＵＧ)， ＡＭ，ＡＴ，ＡＵ，ＢＢ，ＢＧ，ＢＲ，ＢＹ，ＣＡ，Ｃ Ｈ，ＣＮ，ＣＺ，ＤＥ，ＤＫ，ＥＥ，ＥＳ，ＦＩ，ＧＢ ，ＧＥ，ＨＵ，ＩＳ，ＪＰ，ＫＥ，ＫＧ，ＫＰ，ＫＲ， ＫＺ，ＬＫ，ＬＲ，ＬＴ，ＬＵ，ＬＶ，ＭＤ，ＭＧ，Ｍ Ｎ，ＭＷ，ＭＸ，ＮＯ，ＮＺ，ＰＬ，ＰＴ，ＲＯ，ＲＵ ，ＳＤ，ＳＥ，ＳＧ，ＳＩ，ＳＫ，ＴＪ，ＴＭ，ＴＴ， ＵＡ，ＵＧ，ＵＳ，ＵＺ，ＶＮ (71)出願人 コモンウェルス サイエンティフィック アンド インダストリアル リサーチ オ ーガニゼーション オーストラリア国 オーストラリアン キ ャピタル テリトリー 2601 キャンベル ライムストン アヴェニュー（番地な し) (71)出願人 ザ ユニバーシティ オブ メルボルン オーストラリア国 ヴィクトリア 3052 パークヴィル ロイヤル パレイド （番 地なし) (71)出願人 ザ ウォルター アンド エリザ ホール インスティテュート オブ メディカル リサーチ オーストラリア国 ヴィクトリア 3052 パークヴィル ロイヤル パレイド ロイ ヤル メルボルン ホスピタル（番地な し) (71)出願人 バイオテック オーストラリア ピーティ ワイ．リミテッド オーストラリア国 ニュー サウス ウェ ールズ 2069 ローズヴィル バークー ストリート 28 (71)出願人 シーエスエル リミテッド オーストラリア国 ヴィクトリア 3052 パークヴィル ポプラー ロード 45 (72)発明者 スービエ， アンドレアス オーストラリア国 クィーンズランド 4051 ニューマーケット マーク ストリ ート ９ (72)発明者 トムソン， スコット アンソニー オーストラリア国 クィーンズランド 4055 ファーニー ヒルズ バリル クレ セント 11 (72)発明者 カーナ， ラジヴ オーストラリア国 クィーンズランド 4006 ハーストン アバリー ロード 59 (72)発明者 バロウズ， スコット レントン オーストラリア国 クィーンズランド 4036 ボールド ヒルズ スモン コート ４ (72)発明者 クーパー， バーバラ エリザベス ハウ イソン オーストラリア国 ヴィクトリア 3219 イースト ギーロング スィアー ストリ ート 12 (72)発明者 モス， デニス ジェイムズ オーストラリア国 クィーンズランド 4054 アラナ ヒルズ ミッチェル スト リート 29

Claims (1)

1. 【特許請求の範囲】 １．１つ又はそれ以上の病原からの複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを含む 少なくとも１つの組み換えタンパク質を含有する組み換えポリペプチド細胞毒性 Ｔリンパ球ワクチンにおいて、少なくとも１つの組み換えタンパク質が、前記細 胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される配列を実質的に含まな いことを特徴とするワクチン。 ２．少なくとも１つの組み換えタンパク質が、前記細胞毒性Ｔリンパ球エピトー プに隣接して天然に見出される配列を含まないことを特徴とする請求項１記載の 組み換えポリペプチド細胞毒性Ｔリンパ球ワクチン。 ３．組み換えタンパク質が、少なくとも３つの細胞毒性Ｔリンパ球エピトープを 含むことを特徴とする請求項１または２記載の組み換えポリペプチド細胞毒性Ｔ リンパ球ワクチン。 ４．細胞毒性Ｔリンパ球エピトープが、多重病原からのものであることを特徴と する請求項１から３のいずれかに記載の組み換えポリペプチド細胞毒性Ｔリンパ 球ワクチン。 ５．１つ又はそれ以上の病原からの複数の細胞毒性Ｔリンパ球エピトープをエン コードする少なくとも１つの配列を含むポリヌクレオチドにおいて、少なくとも １つの配列が、前記細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天然に見出される ペプチド配列をエンコードする配列を実質的に含まないことを特徴とするポリヌ クレオチド。 ６．少なくとも１つの配列が、前記細胞毒性Ｔリンパ球エピトープに隣接して天 然に見出されるペプチド配列をエンコードする配列を含まないことを特徴とする 請求項５記載のポリヌクレオチド。 ７．少なくとも１つの配列が、少なくとも３つの細胞毒性Ｔリンパ球エピトープ をエンコードすることを特徴とする請求項５または６記載のポリヌクレオチド。 ８．細胞毒性Ｔ細胞エピトープをエンコードする少なくとも１つの配列が、多重 病原からのものであることを特徴とする請求項５から７のいずれかに記載のポリ ヌクレオチド。 ９．請求項５から８のいずれかに記載のポリヌクレオチドと、許容されうるキャ リアとからなることを特徴とする核酸ワクチン。 １０．請求項５から８のいずれかに記載のポリヌクレオチドを含むことを特徴と するベクター。 １１．ワクシニアベクター、アビポックス(avipox)ウイルスベクター、細菌ベク ター、ウイルス様粒子（ＶＬＰ）、及びラブドウイルスからなる群から選択され ることを特徴とする請求項１０記載のベクター。 １２．請求項１から４のいずれかに記載のワクチンと、許容されうるキャリア及 び／またはアジュバントを含むことを特徴とするワクチン製剤。 １３．ＩＳＣＯＭを含有することを特徴とする請求項１２記載のワクチン製剤。