ES2341802T3 - Peptidos asociados a tumores unidos promiscuamente a moleculas del antigeno de leucocito humano (hla) de clase ii. - Google Patents

Abstract

Un péptido asociado a tumor de entre 9 y 30 aminoácidos que comprende una secuencia conforme a la secuencia SEQ ID n.º 4.

Description

Péptidos asociados a tumores unidos promiscuamente a moléculas del antígeno de leucocito humano (HLA) de clase II.

La presente invención se refiere a métodos inmunoterapéuticos y a moléculas y a células para su uso en métodos inmunoterapéuticos. En concreto, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer y, en particular, al cáncer renal y de colon. La presente invención se refiere, además, a epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, que actúan como ingredientes activos de vacunas que estimulan las respuestas inmunológicas contra los tumores. En particular, la presente invención se refiere a una secuencia peptídica novedosa derivada de moléculas HLA de clase II de líneas celulares tumorales humanas, que pueden ser usadas en la composición de vacunas para provocar respuestas inmunológicas antitumorales.

Antecedentes de la invención

La estimulación de la respuesta inmunológica depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por el sistema inmune huésped. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de utilizar el sistema inmune del huésped para intervenir en el crecimiento del tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las ramas humorales y celulares del sistema inmune.

Determinados elementos de la respuesta inmunológica celular son capaces de reconocer y destruir células tumorales. El aislamiento de linfocitos T citotóxicos de poblaciones de células destructoras de tumores o de sangre periférica sugiere que estos linfocitos desempeñan una función importante en la defensa inmunológica natural contra el cáncer (Cheever y col, "Annals N.Y. Acad. Sci." 1993 690: 101-112). En particular, desempeñan una función importante en esta respuesta los linfocitos T CD8^{+} (TCD8^{+}), los cuales reconocen péptidos que alojan moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) que, en general, contienen entre 8 y 10 residuos y que derivan de proteínas ubicadas en el citosol. Las moléculas MHC humanas también se designan antígenos de leucocito humano (HLA).

Existen dos clases de moléculas MHC: las moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de las células con un núcleo con péptidos resultantes de la división proteolítica de proteínas endógenas y péptidos más largos; las moléculas MHC de clase II, que sólo se encuentran en células especializadas presentadoras de antígenos (APC). Presentan péptidos de proteínas exógenas que son absorbidos por las APC durante el proceso de endocitosis y procesadas posteriormente. Los complejos de péptido y MHC de clase I son reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD8^{+}. Los complejos de péptido y MHC de clase II son reconocidos por linfocitos T colaboradores CD4^{+}.

Los linfocitos T colaboradores CD4^{+} desempeñan un papel importante en la organización de las funciones efectoras de las respuestas antitumorales de los linfocitos T y, por esta razón, la identificación de epítopos de linfocitos T CD4^{+} derivados de antígenos asociados a tumores (TAA) puede ser de gran importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos que desencadenen respuestas inmunes antitumorales (Kobayashi H, R. Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B. Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta y E. Celis; 2002; Identification of an antigenic epitope for helper T lymphocytes from carcinoembryonic antigen; "Clin. Cancer Res"; 8: 3219-3225. Gnjatic, S, D. Atanackovic, E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N. K. Altorki, R. G. Maki, B. Dupont, G. Ritter, Y. T. Chen, A. Knuth y L. J. Old; 2003; Survey of naturally occurring CD4+ T-cell responses against NY-ESO-1 in cancer patients: Correlation with antibody responses; "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A"; 100 (15): 8862-7).

En muestras de mamíferos como, por ejemplo, ratones, se mostró que, incluso en ausencia de linfocitos T citotóxicos (CTL) efectores (es decir, de linfocitos T CD8^{+}), los linfocitos T CD4^{+} son suficientes para inhibir la visualización de tumores mediante la inhibición de la angiogénesis por secreción de interferón-á (IFNá) (Qin, Z. y T. Blankenstein; 2000; CD4+ T-cell-mediated tumor rejection involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma receptor expression by nonhematopoietic cells; "Immunity"; 12: 677-686). Adicionalmente, se mostró que los linfocitos T CD4^{+} que reconocen péptidos de antígenos asociados a tumores presentados por moléculas HLA de clase II pueden contrarrestar la progresión del tumor por medio de la inducción de un anticuerpo (Ac) (Kennedy, R. C, M. H. Shearer, A. M. Watts y R. K. Bright; 2003; CD4^{+} T lymphocytes play a critical role in antibody production and tumor immunity against simian virus 40 large tumor antigen. "Cancer Res." 63: 1040-1045). A diferencia de los péptidos asociados a tumores unidos a moléculas HLA de clase I, hasta ahora sólo se ha descrito un pequeño número de ligandos de TAA de clase II (www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Debido a que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II normalmente está limitada a células del sistema inmune (Mach, B, V. Steimle, E. Martinez-Soria y W. Reith; 1996; Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease; "Annu. Rev. Immunol."; 14: 301-331), no se consideró posible el aislamiento de péptidos de clase II directamente de tumores primarios. Por lo tanto, se han descrito numerosas estrategias para dirigir antígenos a la vía de procesamiento de clase II de las células presentadoras de antígenos (APC). Por ejemplo, la incubación de APC con el antígeno en cuestión para permitir que sea absorbido, procesado y presentado (Chaux, P, V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon y P. van der Bruggen; 1999; Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes; "J. Exp. Med."; 189: 767-778); o la transfección de células con genes o minigenes codificantes del antígeno en cuestión y fusionados con la cadena invariante, que media en el traslado de antígenos al compartimento lisosomal de procesamiento y unión del MHC de clase II (MIIC).

Para que un péptido desencadene una respuesta inmunológica celular, debe estar unido a una molécula MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos específicos de la secuencia de los aminoácidos del péptido. Los péptidos de unión a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 10 residuos y contienen dos residuos conservados en su secuencia, que interaccionan con el surco de unión correspondiente de la molécula MHC.

En ausencia de inflamación, la expresión de moléculas MHC de clase II está restringida principalmente a células del sistema inmune, especialmente a células especializadas presentadoras de antígenos (APC) como, por ejemplo, monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos o células dendríticas.

Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T citotóxicos específicos del tumor, es decir, sus epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier tipo de proteína como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc. Además, los antígenos asociados a tumores, por ejemplo, pueden estar presentes sólo en células tumorales, como productos de genes mutados o a partir de marcos de lectura abiertos (ORF) alternativos o del empalme de proteínas (Vigneron, N, V. Stroobant, J. Chapiro, A, Ooms, G. Degiovanni, S. Morel, P. van der Bruggen, T. Boon, B. J. van den Eynde; An antigenic peptide produced by peptide splicing in the proteasome; "Science"; 23 de abr. 2004; 304 (5670): 587-90). Otra clase importante de antígenos asociados a tumores son las estructuras específicas de tejidos, como los antígenos CT (testículo canceroso), que son expresados en distintos tipos de tumor y en tejido sano del
testículo.

Se han identificado diversos antígenos asociados a tumores. Además, se están dedicando muchos esfuerzos a la identificación de antígenos adicionales asociados a tumores. Algunos grupos de antígenos asociados a tumores, también llamados por los expertos "antígenos específicos de tumor", son específicos de tejidos. Algunos ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, la tirosinasa para el melanoma, el PSA y PSMA para el cáncer de próstata y los cruzamientos cromosómicos, como el bcr/abl, en el linfoma. Sin embargo, muchos de los antígenos asociados a tumores que se han identificado tienen lugar en muchos tipos de tumores y algunos, como las proteínas oncógenas y/o los genes supresores de tumores (los genes supresores de tumores para el cáncer renal, por ejemplo, son analizados en Linehan, W. M, M. M. Walther, B. Zbar; The genetic basis of cancer of the kidney; "J Urol"; dic. 2003;170 [6 Pt 1]: 2163-72), que son los que realmente causan la transformación, tienen lugar en casi todos los tipos de tumor. Por ejemplo, las proteínas celulares normales que controlan el crecimiento y la diferenciación celular, como las proteínas p53 (que son un ejemplo de gen supresor de tumor), ras, c-met, myc, pRB, VHL y HER-2/neu, pueden acumular mutaciones y resultar en una regulación ascendente de la expresión de estos productos genéticos, transformándolos así en oncógenos (McCartey y col; "Cancer Research"; 1998; 15: 58 2601-5. Disis y col; "Ciba Found. Symp"; 1994; 187: 198-211). Estas proteínas mutantes pueden ser el blanco de una respuesta inmune específica de tumor en muchos tipos de cáncer.

Para que las proteínas puedan ser reconocidas por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos de tumor y para que se puedan utilizar en terapia, deben cumplirse una serie de requisitos. El antígeno debe estar expresado principalmente por células tumorales y no por tejidos sanos normales o en pequeñas cantidades. También es deseable, no sólo que el antígeno correspondiente esté presente en un tipo de tumor, sino que, además, aparezca en concentraciones altas (en número de copias por célula, por ejemplo). La presencia de epítopos en la secuencia de aminoácidos del antígeno es esencial, ya que el péptido ("péptido inmunógeno") que deriva de un antígeno asociado a un tumor debe inducir una respuesta in vitro o in vivo de los linfocitos T.

Hasta ahora se han descrito numerosas estrategias para encauzar antígenos hacia la vía de procesamiento de clase II. Es posible incubar células presentadoras de antígenos (APC) con el antígeno deseado para que sea absorbido y procesado (Chaux, P, V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon y P. van der Bruggen; 1999; J. Exp. Med; 189, 767-778). Otras estrategias usan las proteínas de fusión, que contienen secuencias blanco lisosomales. Expresadas en APC, estas proteínas de fusión dirigen a los antígenos al compartimento de procesamiento de clase II (Marks, M. S, P. A. Roche, E. van Donselaar, L. Woodruff, P. J. Peters y J. S. Bonifacino; 1995; J. Cell Biol; 131, 351-369. Rodríguez, F, S. Harkins, J. M. Redwine, J. M. de Pereda y J. L. Whitton; 2001; J. Virol; 75, 10421-10430).

En la inmunización contra los tumores, los linfocitos T colaboradores desempeñan una función importante en la organización de la función efectora de los CTL. Los epítopos de linfocitos T colaboradores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T colaboradores del tipo TH1 apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8^{+}, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra células tumorales que presentan MHC/péptidos asociados a tumores en sus superficies. De esta forma, los epítopos peptídicos de linfocitos T colaboradores asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden actuar como ingredientes activos de vacunas que estimulen las respuestas inmunológicas contra los tumores.

El documento WO 99/19477 describe factores de crecimiento derivados de la cadherina (CDGF) que tienen una secuencia que corresponde a una secuencia parcial de una pre-pro-cadherina y donde la secuencia de CDGF comprende la pro-secuencia, y donde al menos uno de los otros dominios de la pre-pro-cadherina está ausente. De forma detallada, se describe un péptido CDGF con una longitud de 78 aminoácidos que comprende la secuencia SEQ ID n.º 4.

La tarea principal en el desarrollo de una vacuna tumoral es, por tanto, la identificación y caracterización de novedosos antígenos asociados a tumores y epítopos inmunógenos de linfocitos T colaboradores derivados de ellos que puedan ser reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD4^{+}. Uno de los objetivos de la presente invención es, por tanto, proporcionar secuencias de aminoácidos novedosas para el péptido que tiene la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase II.

Conforme a la presente invención, este objetivo se consigue proporcionando un péptido asociado a tumor compuesto por la secuencia SEQ ID n.º 4 de la lista de secuencias adjunta, en donde el péptido tiene la habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) humano de clase II.

En la presente invención, los inventores demuestran que es posible aislar y caracterizar péptidos unidos a moléculas HLA de clase II directamente de tumores de mamíferos, preferiblemente humanos y sólidos como, por ejemplo, de carcinomas de células renales y carcinomas de colon. Los monocitos de infiltración expresaron moléculas MHC de clase II así como células tumorales y, además, las células tumorales mostraron una regulación ascendente de varios productos génicos inducidos por citocina o quimiocina como, por ejemplo, productos génicos inducidos por interferón-á.

La presente invención proporciona un péptido que proviene de antígenos asociados a la génesis de tumores y con la habilidad de unirse a moléculas HLA de clase II para desencadenar una respuesta inmune de leucocitos humanos, especialmente linfocitos T o linfocitos T CD4^{+} o linfocitos T CD4^{+} mediadores de respuestas inmunes de tipo TH1. Los péptidos, tal y como se describe, provienen de antígenos asociados a tumores, especialmente con funciones en los procesos de, por ejemplo, proteólisis, angiogénesis, crecimiento celular, regulación de ciclo celular, división celular, regulación de la transcripción, regulación de la traducción o invasión de tejidos, como, por ejemplo, péptidos asociados a tumores a partir de la metaloproteinasa 7 de la matriz (MMP7; SEQ ID No. 1) y de la proteína de unión 3 del factor de crecimiento similar a la insulina (IGFBP3; SEQ ID No. 25).

En la presente invención, los inventores también proporcionan pruebas definitivas de que los péptidos asociados a tumores unidos de forma promiscua a moléculas HLA de clase II, especialmente a los alelos HLA de clase II codificados genéticamente por locus HLA-DR del genoma humano, son capaces de provocar respuestas inmunes mediadas por linfocitos T CD4^{+} humanos. Se aislaron linfocitos T CD4^{+} de sangre periférica humana, demostrándose que los péptidos en cuestión son adecuados para desencadenar respuestas de linfocitos T del sistema inmune humano contra péptidos seleccionados del peptidoma de la célula tumoral. Teniendo en cuenta que los péptidos pueden ser sintetizados químicamente y usados como ingredientes activos de preparaciones farmacéuticas, los péptidos proporcionados por la presente invención pueden ser usados para inmunoterapia, preferiblemente para inmunoterapia del cáncer.

Con el fin de identificar ligandos de HLA de clase II de TAA para el desarrollo de una inmunoterapia basada en péptidos, los inventores intentaron aislar péptidos presentados por HLA-DR directamente de tumores sólidos diseccionados, en particular de carcinoma de células renales (RCC), de los que se ha informado que pueden expresar moléculas de clase II (Gastl, G, T. Ebert, C. L. Finstad, J. Sheinfeld, A. Gomahr, W. Aulitzky y N. H. Bander; 1996; Major histocompatibility complex class I and class II expression in renal cell carcinoma and modulation by interferon gamma; "J. Urol." 155: 361-367). Incluso aunque la mayoría de las células tumorales sean de clase II negativa, los espectómetros de masas habituales deben proporcionar la sensibilidad requerida para identificar péptidos de clase II a partir de cantidades mínimas de células tumorales o a partir de leucocitos de infiltración que puedan presentar TAA de forma cruzada o a partir de células del estroma en el perímetro del tumor en crecimiento.

Las razones para centrarse en el RCC con el fin de demostrar la prueba técnica del concepto fueron las siguientes: alrededor de 150.000 personas en todo el mundo son diagnosticadas cada año de RCC. La enfermedad está asociada a una elevada tasa de mortalidad que resulta en, aproximadamente, 78.000 muertes al año (C. P. Pavlovich y L. S. Schmidt; 2004; Searching for the hereditary causes of renal-cell carcinoma; "Nat. Rev. Cancer" 4: 381-393). Si se diagnostica metástasis, el índice de supervivencia de un año disminuye a, aproximadamente, un 60% (A. Jemal, R. C. Tiwari, T. Murray, A. Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E. J. Feuer y M. J. Thun; 2004; Cancer statistics, 2004; "CA Cancer J. Clin." 54: 8-29), lo que subraya la gran necesidad médica sin cubrir. Debido a que el RCC parece ser un tumor inmunógeno (Oliver R. T. D, A. Mehta, M. J. Barnett; A phase 2 study of surveillance in patients with metastatic renal cell carcinoma and assessment of response of such patients to therapy on progression; "Mol Biother"; 1988; 1: 14-20. Gleave, M, M. Elhilali, Y. Frodet y col; Interferon gamma-1b compared with placebo in metastatic renal cell carcinoma; "N Engl J Med"; 1998; 338: 1265), como apunta la existencia de CTL reactivos ante tumores y destructores de tumores (Finke, J. H, P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R. R. Tubbs, R. Connelly, E. Pontes y R. Bukowski; 1990; Characterization of the cytolytic activity of CD4-positiveand CD8-positive tumor-infiltrating lymphocytes in human renal cell carcinoma; "Cancer Res"; 50: 2363-2370), se han iniciado ensayos clínicos para desarrollar vacunas contra tumores basadas en péptidos (Wierecky J, M. Mueller y P. Brossart; Dendritic cell-based cancer immunotherapy targeting MUC-1; "Cancer Immunol Immunother"; 28 de abr. 2005). Sin embargo, debido a la falta de epítopos de linfocitos T colaboradores de TAA, las vacunas definidas molecularmente suelen comprender péptidos que funcionan sólo como ligandos de clase I.

Durante el trabajo científico de preparación de la presente invención, los inventores pudieron aislar ligandos de clase II de diez muestras de RCC, tres carcinomas colorrectales (CCA) y un carcinoma de células transicionales (TCC). Solo algunos de los ligandos de TAA seleccionados, identificados por medio de este enfoque, poseen la capacidad de:

1.

provenir de antígenos con una asociación tumoral conocida;

2.

estar unidos al alelo HLA-DR de clase II más común, el HLA DRB1*0101; y

3.

tener características que les diferencian de la mayoría de los ligandos de HLA de clase II, de forma que cumplen con los criterios con respecto a su secuencia de aminoácidos primaria que les permite unirse promiscuamente a moléculas HLA-DR a partir de, al menos, dos alelos diferentes.

Se descubrió que el péptido asociado a tumor, unido promiscuamente a HLA-DR, de CDH3 (SEQ ID n.º 4) es reconocido por linfocitos T CD4^{+}.

Un primer aspecto de la invención proporciona un péptido compuesto por una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEQ ID n.º 4, donde el péptido no es el polipéptido humano intacto del que se deriva la secuencia de aminoácidos (a saber, una de las secuencias completas tal y como se enumeran en los ID de Locus Link). (Para los números de registro, véase la tabla adjunta más abajo.)

Tal y como se describe más abajo, el péptido que forma la base de la presente invención ha sido identificado por ser presentado por células portadoras de MHC de clase II (RCC). Por tanto, este péptido, así como otros péptidos que contengan la secuencia (a saber, péptidos derivados), provocará una respuesta específica de los linfocitos T, si bien el alcance de dicha respuesta podría variar de un péptido a otro. Podrían producirse, por ejemplo, diferencias por mutaciones en el mencionado péptido (véase más abajo). El experto en la materia conoce bien los métodos que se pueden aplicar para determinar el alcance de una respuesta inducida por un péptido individual, en particular con respecto a los ejemplos contenidos aquí y su correspondiente bibliografía.

Preferentemente, el péptido conforme a la presente invención consiste en una secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEQ ID n.º 4 o una variante de la misma.

En una de las formas de realización de la presente invención, el péptido de la presente invención comprende los 80 aminoácidos N-terminal de la cadena invariante asociada a antígeno HLA-DR (p33, en adelante "Ii"), como se deriva de la base de datos del NCBI, número de registro del GenBank X00497 (Strubin, M, B. Mach y E. O. Long; The complete sequence of the mRNA for the HLA-DR-associated invariant chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane polarity; "EMBO J"; 1984; 3 [4], 869-872).

El término "variante" de la secuencia de aminoácidos dada empleado por los inventores significa que las cadenas laterales de uno o dos de los residuos de aminoácidos son alteradas mediante el reemplazo de las mismas por la cadena lateral de otro residuo de aminoácido natural, de forma que el péptido todavía es capaz de unirse a una molécula HLA de la misma forma que un péptido compuesto por la secuencia de aminoácidos dada. Por ejemplo, un péptido puede modificarse de forma que al menos mantenga, o incluso mejore, la habilidad para interactuar y unir una molécula MHC apropiada, como la HLA-A, y de forma que al menos mantenga, o incluso mejore, la habilidad para generar CTL activados que reconozcan y destruyan células que expresen un polipéptido que contiene una secuencia de aminoácidos como la definida en los aspectos de la invención. Como puede derivarse de la base de datos descrita más adelante, determinadas posiciones de péptidos de unión de HLA-A son residuos conservados que forman una secuencia central que se ajusta al motivo de unión del surco de unión del HLA.

Se sabe, además, que los péptidos presentados por el MHC de clase II están compuestos de una "secuencia central" con un determinado motivo de aminoácidos específico de HLA y, opcionalmente, extensiones N- y/o C-terminal que no interfieren con la función de la secuencia central (es decir, son considerados irrelevantes en la interacción del péptido y el linfocito T). Las extensiones N- y/o C-terminal pueden tener una longitud de entre 1 y 10 aminoácidos, respectivamente. Por lo tanto, un péptido de la presente invención exhibe una longitud total de entre 9 y 30 aminoácidos. Estos péptidos pueden ser usados o bien directamente, para cargar moléculas MHC de clase II, o bien la secuencia puede ser clonada en los vectores según la descripción que se detalla más abajo.

Si un péptido que es mayor de unos 12 residuos de aminoácidos es usado directamente para unirse a una molécula MHC, se prefiere que los residuos que flanquean la región central de unión de HLA sean los que no afecten sustancialmente a la habilidad del péptido de unirse específicamente al surco de unión de la molécula MHC o de presentar al péptido al CTL.

Se pueden derivar ejemplos de péptidos de variantes, motivos y ligandos de MHC, así como determinados ejemplos de extensiones N- y/o C-terminal en la base de datos SYFPEITHI (Rammensee H, J. Bachmann, N. P. Emmerich, O. A. Bachor y S. Stevanovic; SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs; "Immunogenetics"; noviembre de 1999; 50 [3-4]: 213-9) en http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com y en las referencias allí citadas.

Algunos ejemplos de péptidos para el HLA-DR en la base de datos son: K H K V \underbar{Y A C E V T H Q G} L S S derivado de la cadena Ig kappa 188-203 (Kovats y col; "Eur J Immunol"; abril de 1997; 27 [4]: 1014-21); K V Q \underbar{W K V D N A L Q S} G N S derivado de la cadena Ig kappa 145-159 (Kovats y col; "Eur J Immunol"; abril de 1997; 27 [4]: 1014-21); L P R L I \underbar{A F T S E H S H F} derivado de GAD65 270-283 (Endl y col; "J Clin Invest"; mayo de 1997; 15, 99 [10]: 2405-15) o F \underbar{F R M V I S N P A} A T H Q D I D F L I derivado de GAD65 556-575 (Endl y col; "J Clin Invest"; mayo de 1997; 15, 99 [10]: 2405-15). Además, los péptidos también pueden derivarse de secuencias mutadas de antígenos, como en el caso del \underbar{A T G F K Q S S K} A L Q R P V A S, derivado de la proteína de fusión bcr-abl de 210 kD (Bosch y col; "Blood"; noviembre de 1996; 1, 88 [9]: 3522-7), G \underbar{Y K V L V L N P S} V A A T, derivado de HCV-1 NS3 28-41 (Diepolder y col; "J Virol"; agosto de 1997; 71 [8]: 6011-9), o \underbar{F R K Q N P D I V I} Q Y M D D L Y V G, derivado de HIV-1 (HXB2) RT 326-345 (van der Burg y col; "J Immunol"; enero de 1999; 1, 162 [1]: 152-60). Todos los aminoácidos de "anclaje" (como ejemplos de HLA-DR4, véase Friede y col; "Biochim Biophys Acta"; Junio de 1996; 7, 1316 [2]: 85-101. Sette y col; "J Immunol"; septiembre de 1993; 15, 151 [6]: 3163-70. Hammer y col; "Cell"; julio de 1993; 16, 74 [1]: 197-203. Hammer y col; "J. Exp. Med"; mayo de 1995; 1, 181 [5]: 1847-55) se han indicado en negrita y las supuestas secuencias centrales se han subrayado.

Todos los péptidos descritos anteriormente están englobados en el término "variantes" de la secuencia de aminoácidos dada.

En el concepto de "péptido", los inventores no sólo incluyen moléculas en las que los residuos de aminoácidos están unidas por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino también moléculas en las que el enlace peptídico está invertido. Estas formas retro-inverso pueden hacerse usando métodos conocidos por los especialistas en la materia, como los descritos por Meziere y col. (1997); "J. Immunol"; 159, 3230-3237. Este enfoque implica hacer pseudopéptidos que contengan modificaciones en el esqueleto y no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere y col. (1997) muestran que, al menos para respuestas de linfocitos T colaboradores y MHC de clase II, estos pseudopéptidos son útiles. Los péptidos de tipo retro-inverso, que contienen uniones NH-CO en lugar de uniones peptídicas CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis.

Normalmente, el péptido de la invención es aquel que, si está expresado en una célula presentadora de antígeno, puede ser procesado de forma que se produce un fragmento capaz de unirse a una molécula MHC adecuada y puede ser presentado por la célula apropiada y provocar una respuesta de linfocitos T adecuada. Se apreciará que un fragmento producido a partir del péptido puede ser también un péptido de la invención. Convenientemente, el péptido de la invención contiene una porción que incluye la secuencia de aminoácidos dada o una porción o variante de la misma y otra porción más que le confiere alguna propiedad deseable. Por ejemplo, la porción añadida puede incluir otro epítopo de linfocito T (independientemente de que derive o no del mismo polipéptido que la primera porción que contiene el epítopo de linfocito T) o puede incluir un péptido o una proteína vehículos. Por lo tanto, en una modalidad, el péptido de la invención es una proteína humana truncada o una proteína de fusión de un fragmento proteico y otra porción de polipéptido, siempre que la porción humana incluya una o más secuencias de aminoácidos de invención.

En una modalidad especialmente preferida, el péptido de la invención incluye la secuencia de aminoácidos de la invención y, al menos, un epítopo más de linfocito T, donde este epítopo de linfocito T es capaz de facilitar la producción de una respuesta del linfocito T dirigida al tipo de tumor que expresa de forma aberrante un antígeno asociado a un tumor. Por lo tanto, los péptidos de la invención incluyen cadenas perladas ("beads on a string") de polipéptidos que también pueden ser usadas como vacunas.

Se apreciará de lo siguiente que, en algunas aplicaciones, el péptido de la invención puede ser usado directamente (es decir, no es producido por expresión de un polinucleótido en la célula de un paciente o en una célula administrada a un paciente); en tales aplicaciones, se prefiere que el péptido tenga menos de 100 o 50 residuos. Un péptido preferido de la presente invención exhibe una longitud total de entre 9 y 30 aminoácidos.

El péptido de la invención es capaz de unirse al HLA-DR. En particular, se prefiere que el péptido se una de forma selectiva al HLA-DRB1*0101.

El péptido de la invención es particularmente útil en métodos inmunoterapéuticos para detectar y destruir células que expresan de forma aberrante polipéptidos que forman la base de los péptidos de la presente invención. Teniendo en cuenta que el péptido específico que está compuesto por la secuencia de aminoácidos dada se une a HLA-DR, se prefiere que los péptidos de la invención sean de tal forma que se unan a HLA-DR y que, una vez formado, el complejo HLA-DR-péptido, cuando esté presente en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada, sea capaz de provocar la producción de un CTL que reconozca una célula que exprese de forma aberrante un polipéptido que comprenda la secuencia de aminoácidos dada.

En una modalidad de la presente invención, el péptido de la presente invención comprende los 80 aminoácidos N-terminal de la cadena invariante asociada al antígeno HLA-DR (p33, en adelante "Ii"), como se deriva de la base de datos del NCBI, número de registro del GenBank X00497 (véase también más adelante).

En el término "expresado de forma aberrante" incluimos el significado de que el polipéptido está sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión o que el gen es silencioso en el tejido del que deriva el tumor pero sí se expresa en el tumor. Con el término "sobreexpresado" queremos decir que el polipéptido está presente a un nivel al menos 1,2 veces mayor que en tejido normal. Preferentemente a un nivel 2 veces mayor y, más preferentemente, a un nivel 5 ó 10 veces mayor que en el tejido normal.

Los péptidos (al menos los que contienen enlaces peptídicos entre residuos de amino ácidos) pueden ser sintetizados por el modo de poliamida Fmoc de síntesis de péptidos de fase sólida, tal y como describen Lu y col. (1981) "J. Org. Chem" 46, 3433 y las referencias ahí contenidas. La protección temporal del grupo N-amino se debe al grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La división repetitiva de este grupo de protección de alta base lábil se lleva a cabo utilizando piperidina al 20% en N, N-dimetilformamida. Las funcionalidades de la cadena lateral pueden estar protegidas como sus butil éteres (en el caso de la serina treonina y de la tirosina), butil ésteres (en el caso del ácido glutámico y del ácido aspártico), derivado del butiloxicarbonilo (en el caso de la lisina y la histidina), derivado del tritilo (en el caso de la cisteína) y de 4-methoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo (en el caso de la arginina). En donde la glutamina o la asparagina son residuos C-terminales, se hace uso del grupo 4,4'-dimetoxibencihidrilo para la protección de las funcionalidades amido de la cadena lateral. El apoyo de la fase sólida se basa en un polímero polidimetil-acrilamido constituido a partir de los tres monómeros dimetilacrilamido (monómero esqueleto), bisacriloiletileno diamino (interconector) y acriloilsarcosino metil éster (agente funcionalizador). El agente ligado divisible péptido-resina usado es el derivado del ácido 4-hidroximetil-fenoxiacético ácido lábil. Todos los derivados de aminoácidos se añaden como sus derivados anhídridos simétricos preformados, con la excepción de la asparagina y la glutamina, que se añaden usando un procedimiento inverso de acoplamiento mediado por N, N-diciclohexil-carbodiimida/1hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección son controladas usando procedimientos analíticos de isotina, ácido trinitrobencenosulfónico o ninhidrina. Al completarse la síntesis, los péptidos se separan de la resina con eliminación concomitante de los grupos de protección de la cadena lateral por medio del tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% que contenga una mezcla depuradora al 50%. Los depuradores utilizados normalmente son etanoditiol, fenol, anisol y agua. La elección exacta depende de los aminoácidos constituyentes del péptido que se esté sintetizando. También es posible una combinación de metodologías de fase sólida y solución para la síntesis de péptidos (véase, por ejemplo, Bruckdorfer T, O. Marder, F. Albericio F; From production of peptides in milligram amounts for research to multi-tons quantities for drugs of the future "Curr Pharm Biotechnol." Feb. de 2004; 5 (1): 29-43 y las referencias citadas en dicho documento).

El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación en vacío, con la posterior trituración con éter dietílico, proporcionando el péptido crudo. Los depuradores se eliminan por un procedimiento de extracción simple que, en la liofilización de la fase acuosa, proporciona un péptido crudo libre de depuradores. Los reactivos para la síntesis de péptidos se pueden adquirir en Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7 2QJ, UK.

La purificación se puede realizar mediante técnicas, o combinación de técnicas, como la cromatografía de exclusión, la cromatografía de intercambio de iones, la cromatografía de interacción hidrofóbica y, normalmente, la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida, usando la separación por gradiente de agua/acetonitril.

El análisis de los péptidos puede llevarse a cabo por medio de la cromatografía en capa delgada, la cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida, el análisis de los aminoácidos después de la hidrólisis ácida, el análisis de espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos y el análisis de espectrometría de masa MALDI y ESI-Q-TOF.

Un aspecto más de la invención proporciona un ácido nucleico (es decir, un polinucleótido) que codifica el péptido de la invención. El polinucleótido puede ser ADN, ADNc, PNA, CNA, ARN o combinaciones de los mismos y puede contener o no contener intrones. Naturalmente, sólo son codificables por el polinucleótido los péptidos que contienen residuos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídico naturales. Un aspecto más de la invención proporciona un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido según la invención.

Se han desarrollado una variedad de métodos para ligar polinucleótidos, especialmente ADN, con vectores; por ejemplo, mediante extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, se pueden añadir extensiones complementarias del homopolímero al segmento de ADN que se vaya a insertar en el ADN vector. El vector y el segmento de ADN se unen entonces, mediante un enlace de hidrógeno, entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinado.

Los conectores sintéticos que contengan uno o más sitios de restricción proporcionan un método alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN, generado por digestión de restricción de endonucleasa como se describió anteriormente, es tratado con la ADN polimerasa T4 bacteriófaga o la ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que eliminan los extremos 3' monocatenarios con sus actividades exonucleolíticas 3'-5' y rellenan los extremos 3' con sus actividades de polimerización.

La combinación de estas actividades genera, por tanto, segmentos de ADN de extremo romo. Los segmentos de extremo romo se incuban entonces con exceso molar de moléculas de conexión, en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la unión de moléculas de ADN de extremo romo, como la ADN ligasa T4 bacteriófaga. Por tanto, los productos de la reacción son segmentos de ADN que portan secuencias de ligador polimérico en sus extremos. Estos segmentos de ADN son divididos entonces con la enzima de restricción apropiada y ligados a un vector de expresión que ha sido dividido con una enzima que produce extremos compatibles con los del segmento de ADN.

Los ligadores sintéticos que contienen una variedad de sitios de endonucleasa de restricción se pueden adquirir de diversas fuentes, incluyendo International Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EE. UU.

Una forma deseable de modificar el ADN codificante del polipéptido de la invención es usar la reacción en cadena de la polimerasa descrita por Saiki y col. (1988) "Science" 239, 487-491. Este método puede usarse para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo manipulando los sitios de restricción apropiados, o puede usarse para modificar en ADN de otras formas útiles conocidas por los expertos en la materia. En este método, para que el ADN sea amplificado enzimáticamente es flanqueado por dos cebadores específicos que se incorporan al ADN amplificado. Estos cebadores específicos pueden contener sitios de reconocimiento de endonucleasa de restricción que pueden ser usados para la clonación en vectores de expresión mediante métodos conocidos por los expertos en la materia.

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El ADN (o, en el caso de los vectores retrovirales, el ARN) se expresa entonces en un huésped apropiado para producir un polipéptido de la invención. Así, el ADN que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención puede ser usado de acuerdo con técnicas conocidas, modificadas convenientemente en vista de las enseñanzas contenidas en la presente invención, para construir un vector de expresión que entonces es usado para transformar una célula huésped apropiada para la expresión y producción del polipéptido de la invención. Dichas técnicas incluyen las descritas en las patentes de EE. UU. n.º 4.440.859, concedida el 3 de abril de 1984 a Rutter y col; 4.530.901, concedida el 23 de julio de 1985 a Weissman; 4.582.800, concedida el 15 de abril de 1986 a Crowl; 4.677.063, concedida del 30 de junio de 1987 a Mark y col; 4.678.751, concedida el 7 de julio de 1987 a Goeddel; 4.704.362, concedida el 3 de noviembre de 1987 a Itakura y col; 4.710.463, concedida el 1 de diciembre de 1987 a Murray; 4.757.006, concedida el 12 de julio de 1988 a Toole Jr. y col; 4.766.075, concedida el 23 de agosto de 1988 a Goeddel y col. y 4.810.648, concedida el 7 de marzo de 1989 a Stalker.

El ADN (o, en el caso de los vectores retrovirales, el ARN) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención puede unirse a una amplia variedad de secuencias de ADN para su introducción en el huésped adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del huésped, de la forma de introducción del ADN en el huésped y de si se desea la integración o el mantenimiento episomal.

Generalmente, el ADN se inserta en un vector de expresión como, por ejemplo, un vector plasmídico, con la orientación adecuada y el marco de lectura correcto para la expresión. Si es necesario, el ADN puede unirse a las secuencias adecuadas de nucleótidos de control regulador de traducción y transcripción reconocidas por el huésped deseado, aunque tales controles suelen estar disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce entonces en el huésped mediante las técnicas habituales. Generalmente, no todos los huéspedes serán transformados por el vector. Por lo tanto, será necesario seleccionar las células huésped transformadas. Una de las técnicas de selección implica la incorporación en el vector de expresión de una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios, que codifique un carácter seleccionable en la célula transformada como, por ejemplo, la resistencia a antibióticos.

De forma alternativa, el gen para dicho carácter seleccionable puede estar en otro vector, que es usado para cotransformar la célula huésped deseada.

Las células huésped que han sido transformadas por el ADN recombinado de la invención son cultivadas entonces durante el tiempo necesario y en las condiciones apropiadas, conocidas por los expertos en la materia en vista de las enseñanzas descritas en la presente invención, para permitir la expresión del polipéptido, que entonces puede ser recuperado.

Se conocen muchos sistemas de expresión, entre los que se encuentran bacterias (E. coli y Bacillus subtilis, por ejemplo), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, por ejemplo), hongos filamentosos (Aspergillus, por ejemplo) y células de plantas, animales e insectos. Con preferencia, el sistema puede ser un carcinoma de células renales (RCC) o células Awells.

Un promotor es un elemento de control de la expresión formado por una secuencia de ADN que permite que tengan lugar la unión de la ARN polimerasa y la trascripción. Las secuencias de promotores compatibles con huéspedes bacterianos se encuentran normalmente en los vectores plasmídicos que contienen sitios de restricción adecuados para la inserción de un segmento de ADN de la presente invención. Algunos vectores plasmídicos procarióticos típicos son pUC18, pUC19, pBR322 y pBR329, que se pueden adquirir en Biorad Laboratories, (Richmond, CA, EE. UU.); y pTrc99A y pKK223-3, que se pueden adquirir en Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. UU.

Un vector plasmídico típico de células de mamíferos es el pSVL, que se puede adquirir en Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. UU. Este vector usa el promotor tardío SV40 para llevar a cabo la expresión de los genes clonados, habiéndose encontrado el mayor nivel de expresión en las células productoras de antígenos T, como las células COS-1. Un ejemplo de vector de expresión inducible de mamífero es el pMSG, que también puede adquirirse en Pharmacia. Este vector usa el promotor inducido por glucocorticoide del duplicado del terminal largo del virus del tumor mamario del ratón para llevar a cabo la expresión del gen clonado. Los vectores plasmídicos de levadura pRS403-406 y pRS413-416 son útiles y, normalmente, pueden adquirirse en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos de integración de levadura (YIps) e incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos de centrómero de levadura (Ycps). Se conocen otros vectores y sistemas de expresión para ser usados con una variedad de células huésped.

La presente invención también hace referencia a una célula huésped transformada con un constructo vector polinucleótido de la presente invención. La célula huésped puede ser procariótica o eucariótica. En algunas circunstancias, las células bacterianas pueden ser preferentemente células huésped procarióticas y, normalmente, son una cepa de E. coli como, por ejemplo, las cepas E. coli DH5, que pueden adquirirse en Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE. UU., y RR1, que se puede adquirir en la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EE. UU. (No ATCC 31343). Las células huésped eucarióticas preferidas incluyen células de levadura, insectos y mamíferos y, con preferencia, células de vertebrados como, por ejemplo, de ratón, rata, mono o líneas celulares humanas de riñón o fibroblásticas. Las células huésped de levadura incluyen las YPH499, YPH500 y YPH501, que normalmente pueden adquirirse en Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Las células huésped de mamíferos preferidas incluyen células de ovario de hámster chino (CHO), disponibles en la ATCC, como CCL61; células embrionarias de ratón suizo NIH NIH/3T3, disponibles en la ATCC, como CRL 1658; células COS-1 derivadas de riñón de mono, disponibles en la ATCC, como CRL 1650 y 293 células de riñón embrionario humano. Las células de insecto preferida son las células Sf9 que pueden sufrir transfección con vectores de expresión de baculovirus.

La transformación de los huéspedes celulares apropiados con un constructo de ADN de la presente invención se lleva a cabo con métodos bien conocidos que suelen depender del tipo de vector usado. Con respecto a la transformación de las células huésped procarióticas, véase, por ejemplo, Cohen y col. (1972) "Proc. Natl. Acad. Sci." EE. UU, 69, 2110 y Molecular Cloning, A Laboratory Manual de Sambrook y col. (1989) "Cold Spring Harbor Laboratory", Cold Spring Harbor, NY. La transformación de las células de levadura se describe en Methods In Yeast Genetics, A Laboratory Manual de Sherman y col. (1986) "Cold Spring Harbor" NY. También es útil The method of Beggs (1978) "Nature" 275, 104-109. Con respecto a las células de vertebrados, los reactivos útiles para la transfección de dichas células como, por ejemplo, el fosfato cálcico y el DEAE dextrano o las formulaciones de liposomas, se pueden adquirir en Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o transfección de las células, y se conoce bien su uso para la transformación de células de levadura, bacterias, insectos y vertebrados.

Las células transformadas satisfactoriamente, es decir, las que contienen un constructo de ADN de la presente invención, pueden ser identificadas por medio de técnicas conocidas. Por ejemplo, las células resultantes de la introducción de un constructo de expresión de la presente invención pueden cultivarse para producir el polipéptido de la invención. Las células pueden ser cultivadas y lisadas, y el contenido de su ADN puede ser examinado en busca de la presencia de ADN usando un método como el descrito por Southern (1975), "J. Mol. Biol." 98,503 o por Berent y col. (1985), "Biotech." 3,208. De forma alternativa, la presencia la proteína en el sobrenadante puede ser detectada usando anticuerpos, como se describe más abajo.

Además del análisis directo de la presencia de ADN recombinado, la transformación puede confirmase por medio de métodos inmunológicos bien conocidos cuando el ADN recombinado es capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, las células transformadas con un vector de expresión producen proteínas que presentan la antigenicidad apropiada. Las muestras de células que puedan haber sufrido transformación se cultivan y analizan en busca de la proteína utilizando los anticuerpos adecuados. Así, además de las propias células huésped transformadas, la presente invención también considera el cultivo de dichas células, preferentemente monoclonal (clonalmente homogéneo) o derivado de un cultivo momoclonal, en un medio de nutrientes.

Se apreciará que algunas células huésped de la invención son útiles en la preparación de péptidos de la invención como, por ejemplo, células de bacterias, levadura e insectos. Sin embargo, también podrán ser útiles para ciertos métodos terapéuticos otras células huésped. Por ejemplo, las células presentadora de antígenos, como las células dendríticas, pueden ser usadas para expresar los péptidos de la invención de forma que sean cargadas en las moléculas MHC adecuadas.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir un péptido para su inyección intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intradermal (i.d.), intraperitoneal (i.p.) e intramuscular (i.m.). Las formas preferidas de inyección del péptido son las s.c, i.d, i.p, i.m e i.v. Las formas preferidas de inyección de ADN son las i.d, i.m, s.c, i.p e i.v. Se usarán dosis de entre 1 y 500 mg de péptido o ADN.

Otro aspecto de la invención se refiere al uso en medicina de un péptido asociado a un tumor conforme a la invención, un ácido nucleico conforme a la invención o un vector de expresión conforme a la invención.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención. El método comprende la administración al paciente de una cantidad efectiva de un péptido según la invención, o una cantidad efectiva de un polinucleótido o un vector de expresión que codifique dicho péptido, en la que la cantidad de dicho péptido o la cantidad de dicho polinucleótido o vector de expresión es efectiva para provocar una respuesta inmune contra la célula diana en el paciente. La célula diana es una célula de cáncer o de tumor.

El péptido o el ácido nucleico codificador del péptido constituye una vacuna contra el tumor o el cáncer. Puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o sistémicamente; o aplicarse ex vivo en células del paciente o de una línea celular humana que después se administra al paciente; o usada in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunes del paciente, al que luego se le vuelven a administrar. Si el ácido nucleico se administra in vitro en las células, puede ser útil para las células su transfección para coexpresar citocinas como la interleucina-2. El péptido podrá ser sustancialmente puro; o estar combinado con un adyuvante que estimule la respuesta inmune como Detox; o usado en combinación con citocinas estimuladoras de la respuesta inmune; o ser administrado con un sistema de liberación apropiado como, por ejemplo, liposomas. El péptido también podrá conjugarse con un vehículo apropiado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el manano (véase el documento WO 95/18145 y Longenecker y col. (1993) "Ann. NY Acad. Sci." 690,276-291). El péptido también podrá estar etiquetado, o ser una proteína de fusión o ser una molécula híbrida. Los péptidos cuya secuencia se da en la presente invención han de estimular el linfocito T citotóxico CD4. Sin embargo, la estimulación es más eficiente con la ayuda de linfocitos T CD4^{+}. Así, las secciones de fusión de una molécula híbrida proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4^{+}. Estos epítopos son conocidos por los expertos en la materia e incluyen a los identificados en el toxoide tetánico. El polinucleótido puede ser substancialmente puro o estar contenido en un vector o en un sistema de liberación adecuados.

Entre los vectores y los sistemas de liberación adecuados se encuentran los virales, como los sistemas basados en adenovirus, virus de la vaccinia, retrovirus, virus del herpes, virus adenoasociados o híbridos que contengan elementos de más de un virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos, conocidos por los expertos en la liberación de ADN. La liberación física por medio de una "pistola genética", por ejemplo, también puede usarse. El péptido o el péptido codificado por el ácido nucleico puede ser una proteína de fusión con un epítopo que estimule los linfocitos T CD4^{+}, por ejemplo.

Cualquier ácido nucleico administrado al paciente es estéril y apirógeno. El ADN desnudo puede ser administrado por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea. Los péptidos pueden administrarse por vía intramuscular, intradérmica, intraperitoneal, intravenosa o subcutánea (véase también más arriba el método de producción de un péptido). Preferentemente, los péptidos, como compuestos farmacéuticos activos son administrados en combinación con un adyuvante como, por ejemplo, el IL-2, el IL-12, el GM-CSF, adyuvante de Freund incompleto, el adyuvante de Freund completo o formulaciones liposomales. Los adyuvantes preferidos pueden encontrarse, por ejemplo, en Brinkman JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WM. Peptide-based vaccines for cancer immunotherapy. "Expert Opin Biol Ther." 2004 Feb;4(2):181-98.

La vacunación resulta en una respuesta de los linfocitos T citotóxicos estimulados por células presentadoras de antígenos. Una vez que los linfocitos T citotóxicos han sido sensibilizados, puede resultar ventajoso el aumento de la expresión del MHC en las células tumorales.

También puede ser útil la direccionalización de la vacuna hacia poblaciones específicas de células como, por ejemplo, hacia células presentadoras de antígenos, bien por medio de inyecciones, vectores de direccionalización y sistemas de liberación; o por purificación selectiva de dicha población de células del paciente y administración ex vivo del péptido o del ácido nucleico (las células dendríticas, por ejemplo, pueden clasificarse tal y como se describe en Zhoy y col. [1995] "Blood" 86,3295-3301; o en Roth y col. [1996] "Scand. J. Immunology" 43,646-651). Por ejemplo, los vectores de direccionalización pueden comprender un promotor específico de tumor o de tejido que dirige la expresión del antígeno al lugar adecuado.

Otro aspecto de la invención, por tanto, proporciona una vacuna efectiva contra el cáncer o las células tumorales o cancerosas, que comprende una cantidad efectiva del péptido conforme a la invención o un ácido nucleico que codifica dicho péptido. Asimismo, se prefiere que la vacuna sea una vacuna de ácidos nucleicos. Se sabe que la inoculación de una vacuna de ácidos nucleicos - -como una vacuna de ADN - - que codifique un polipéptido provoca una respuesta de los linfocitos T. La vacuna preferida comprende un péptido o péptidos (sintéticos) (es decir, o sólo o en combinación con 1, 2, 3, 4, 5 o 6, 11 o incluso más péptidos. Véase más abajo).

Convenientemente, la vacuna de ácidos nucleicos puede comprender cualquier medio de liberación adecuado del ácido nucleico. El ácido nucleico, preferentemente ADN, puede estar desnudo (es decir, sin ningún otro componente sustancial para ser administrado) o puede ser liberado en un liposoma o como parte de un sistema de liberación de un vector viral.

Se cree que la absoción del ácido nucleico y la expresión del polipéptido codificado por parte de las células dendríticas puede ser el mecanismo de sensibilización de la respuesta inmune. Sin embargo, aunque las células dendríticas pueden no sufrir la transfección, siguen siendo importantes porque detectan el péptido expresado de las células del tejido que hayan sufrido la transfección.

Se prefiere que la vacuna -como, por ejemplo, la vacuna de ADN- sea administrada en el músculo. También se prefiere que sea administrada en la piel. La vacuna de ácidos nucleicos puede administrarse sin adyuvante. La vacuna de ácidos nucleicos también puede administrarse con un adyuvante como BCG o alum. Otros adyuvantes adecuados son el estimulón QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, EE. UU.), derivado de la saponina; extractos micobacterianos y pared bacteriana mimética sintética y adyuvantes registrados como el Detox. Quil A, otro adyuvante derivado de la saponina, también puede ser usado (Superfos, Dinamarca). Se prefiere que la vacuna de ácidos nucleicos se administre sin adyuvantes. Otros adyuvantes, como el adyuvante de Freund, también pueden ser útiles. También puede ser útil administrar el péptido conjugado con la hemocianina de lapa californiana, preferentemente también con un adyuvante.

La terapia de inmunización contra el cáncer por medio de un polinucleótido se describe en Conry y col. (1996) "Seminars in Oncology" 23,135-147; Condon y col. (1996) "Nature Medicine" 2,1122-1127; Gong y col. (1997) "Nature Medicine" 3,558-561; Zhai y col. (1996) "J. Immunol." 156,700-710; Graham y col. (1996) "Int J. Cancer" 65,664-670; y Burchell y col. (1996) pp 309-313 In: Breast Cancer, Advances in biology and therapeutics, Calvo y col. (eds), John Libbey Eurotext.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un péptido según la invención, o de un polinucleótido o un vector de expresión que codifique dicho péptido, en la fabricación de un medicamento para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención.

Otro aspecto de la presente invención proporciona el uso de un péptido conforme a la invención, o de un polinucleótido o vector de expresión que codifique dicho péptido, para la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta inmune, concretamente una respuesta inmune celular y, más concretamente, una respuesta inmune mediada por linfocitos T contra células de tumores sólidos que expresan una molécula humana MHC de clase II en su superficie y presentan un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención. En el contexto de la presente invención se ha descubierto de forma inesperada que las células de tumores sólidos, en comparación con las células sanas del mismo tejido, expresan la molécula humana HLA de clase II en su superficie.

Otro aspecto de la invención proporciona, por lo tanto, un método para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados in vivo o in vitro, método que comprende el contacto in vitro de los CTL con moléculas humanas MHC de clase II con carga de antígenos, expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar, de una forma propia de los antígenos, dichos CTL, en donde el antígeno es un péptido según la invención.

Apropiadamente, los CTL son linfocitos colaboradores CD4^{+}, con preferencia de tipo TH1. Las moléculas MHC de clase II pueden ser expresadas en la superficie de cualquier célula adecuada. Se prefiere que dicha célula no exprese de forma natural moléculas MHC de clase II (en cuyo caso, se realiza la transfección en la célula para que exprese dicha molécula) o, si lo hace, sea defectuosa en las vías de procesamiento o de presentación de los antígenos. En este sentido, es posible que la célula que expresa la molécula MHC de clase II sea sensibilizada completamente con un antígeno del péptido antes de activar los CTL.

La célula presentadora de antígeno (o célula estimulante) se caracteriza por tener en su superficie una molécula MHC de clase II y, preferentemente, no ser capaz de realizar por sí misma la carga de dicha molécula con el antígeno seleccionado. Tal y como se describe más abajo, la molécula MHC de clase II puede cargarse fácilmente in vitro con el antígeno seleccionado.

Preferentemente, la célula del mamífero carece o tiene un nivel o función reducida del transportador peptídico TAP. Entre las células adecuadas que carecen del transportador TAP se incluyen las T2, RMA-s y Drosophilia. TAP es el transportador asociado al procesamiento antigénico.

La línea celular humana T2 con carga peptídica defectuosa está disponible en la ATCC, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, EE. UU., con el n.º de catálogo CRL 1992. La línea 2 de Drosophila de Schneider está disponible en la ATCC, con el número de catálogo CRL 19863. La línea celular del ratón RMA-S se describe en Karre y Ljunggren (1985), "J. Exp. Med.", 162, 1745.

Convenientemente, la célula huésped, antes de la transfección, no expresa moléculas MHC de clase I de forma sustancial. También se prefiere que la célula estimulante exprese una molécula importante para la estimulación conjunta del linfocito T como, por ejemplo, cualquiera de las B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA 3.

Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase II, así como las moléculas de estimulación conjunta, están disponibles públicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.

En otra modalidad, también pueden usarse combinaciones de moléculas de HLA como, por ejemplo, moléculas MHC de clase II como las aquí descritas en las tablas A y B. El uso de vacunas de poliepítopos recombinados para la liberación de linfocitos T citotóxicos CD8^{+} múltiples se describe en Thomson y col. (1996) "J. Immunol." 157, 822-826 y en el documento WO 96/03144. En relación con la presente invención, puede ser deseable incluir en una única vacuna un péptido (o un ácido nucleico que codifique un péptido) que incluya, en cualquier orden, una secuencia de aminoácidos de la presente invención y otro epítopo estimulador de los linfocitos T CD8^{+}. Esta vacuna sería particularmente útil en el tratamiento del cáncer. Estas vacunas "perladas" son características de las vacunas de ADN. El desencadenamiento simultáneo de una respuesta inmune dependiente del MHC de clase II junto con una respuesta inmune dependiente del MHC de clase I tiene la ventaja de resultar en una reacción de tipo TH_{1} de linfocitos T CD4^{+} que apoya a los linfocitos T CD8^{+} dependientes del MHC de clase I.

Pueden usarse otros métodos para generar linfocitos T citotóxicos in vitro. Por ejemplo, los métodos descritos en Peoples y col. (1995) "Proc. Natl. Acad. Sci.", EE. UU., 92,432-436 y en Kawakami y col. (1992) "J. Immunol." 148,638643 usan linfocitos autólogos destructores de tumores en la generación de linfocitos T citotóxicos. En Plebanski y col. (1995) "Eur. J. Immunol." 25,1783-1787, se hace uso de linfocitos autólogos de sangre periférica (PLB) en la preparación de linfocitos T citotóxicos. En Jochmus y col. (1997) "J. Gen. Virol." 78,1689-1695, se describe la producción de linfocitos T citotóxicos autólogos por medio de la utilización de células dendríticas sensibilizadas de forma reiterada con péptidos o polipéptidos o por medio de la infección con un virus recombinado. Hill y col. (1995) "J. Exp. Med." 181,2221-2228 y Jerome y col. (1993) "J. Immunol." 151,1654-1662, usan linfocitos B en la producción de linfocitos T citotóxicos autólogos. Adicionalmente, también pueden usarse macrófagos sensibilizados de manera repetida con péptidos o polipéptidos, o infectados con virus recombinado. S. Walter y col. (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D, Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge: predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on calibrated MHC/anti-CD28-coated microspheres. "J Immunol." 2003 Nov 15;171(10):4974-8) decriben la sensibilización in vitro de células T por medio de células presentadoras de antígenos artificiales, que también es adecuado para generar linfocitos T contra el péptido elegido.

Las células alogénicas también pueden ser usadas en la preparación de linfocitos T citotóxicos. Este método se describe en detalle en el documento WO 97/26328. Por ejemplo, además de las células de Drosophilia y T2, pueden usarse otras células para presentar antígenos, como las células CHO, las células de insecto infectadas por baculovirus o células diana de bacterias, levadura o infectadas por vaccinia. Adicionalmente, pueden usarse virus de plantas. Véase, por ejemplo, Porta y col. (1994) "Virology" 202, 449-955, en donde se describe el desarrollo del virus del mosaico del garbanzo como un sistema de alto rendimiento para la presentación de péptidos foráneos.

Los linfocitos T citotóxicos activados, que son dirigidos contra el péptido de la invención, son útiles para terapia. Así, otro aspecto de la invención proporciona linfocitos T citotóxicos activados que pueden obtenerse por los métodos anteriores.

Otro aspecto de la invención proporciona linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen de forma selectiva a una célula que exprese de forma aberrante un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos de la invención. Con preferencia, el CTL reconoce a la mencionada célula por interacción con el complejo de péptidos/HLA (por ejemplo, de unión). Los CTL son útiles en un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, en el que al paciente se le administra un número efectivo de los CTL activados. Los CTL administrados al paciente pueden derivar del paciente y se activados tal y como se describe más arriba (es decir, son CTL autólogos) De forma alternativa, los CTL pueden no ser del paciente, sino de otro individuo. Evidentemente, se prefiere que se trate de un individuo sano. Por "individuo sano" los inventores entienden un individuo con buena salud en general, preferentemente con un sistema inmune competente y, más preferentemente, que no sufra ninguna enfermedad que pueda ser fácilmente detectable.

Los CTL activos expresan un receptor de linfocitos T (TCR) que reconoce a las células que expresan el polipéptido aberrante. Resulta de utilidad que el ADNc que codifica el TCR esté clonado del CTL activado y transferido a otro CTL para su expresión.

In vivo, las células diana para el CTL CD4^{+} conforme a la presente invención pueden ser células del tumor (que, a veces, expresa MHC de clase II) y/o células del estroma que rodean al tumor (células tumorales) (que, a veces, también expresan MHC de clase II).

Los TCR de clones de CTL de la invención específicos para el péptido de la invención son clonados. El uso de los TCR en los clones de CTL se determina usando (i) anticuerpos monoclonales específicos de región variable y (ii) RT PCR con cebadores específicos para las familias de genes Va y Vp. Se prepara una genoteca de ADNc a partir de ARNm poli-A extraído de los clones de CTL. Se usan los cebadores específicos para la porción C-terminal de las cadenas a y P de TCR y para la porción N-terminal de los segmentos Va y P identificados. El ADNc completo para la cadena a y b de TCR se amplifica con una ADN-polimerasa de alta fidelidad y los productos amplificados son clonados a un vector de clonación adecuado. Los genes clonados de las cadenas a y P pueden ser unidos en un TCR de cadena única por medio del método descrito por Chung y col. (1994) "Proc. Natl. Acad. Sci." EE. UU. 91, 12654-12658. En este constructo de cadena única, el segmento VaJ está seguido por el segmento V DJ, seguido a su vez por el segmento Cp, seguido a su vez por el segmento citoplasmático y la transmembrana de la cadena CD3. Este TCR de cadena única se inserta entonces en un vector de expresión retroviral (puede usarse un panel de vectores basado en su habilidad para infectar linfocitos T CD8^{+} humanos maduros y para mediar en la expresión génica: El sistema retroviral de vectores Kat es una de las posibilidades preferidas [véase Finer y col. (1994) "Blood" 83, 43]). Los retrovirus anfotróficos de alta valoración son usados para infectar linfocitos T CD8^{+} o CD4^{+} purificados, aislados de las sangre periférica de pacientes con tumor (siguiéndose el protocolo publicado por Roberts y col. (1994) en "Blood" 84, 2878-2889). Los anticuerpos Anti-CD3 son usados para desencadenar la proliferación de linfocitos T CD8^{+} purificados, lo que facilita la integración retroviral y expresión estable de TCR de cadena única. La eficacia de la transducción retroviral se determina por coloración de los linfocitos T CD8^{+} infectados con anticuerpos específicos específicos del TCR de cadena única. El análisis in vitro de los linfocitos T CD8^{+} transducidos establece que muestran la misma toxicidad específica de tumor que con el clon de CTL allo-restringido del que originalmente se clonaron las cadenas de TCR. Las poblaciones de linfocitos T CD8^{+} transducidos con la especificidad esperada pueden ser usadas en la inmunoterapia adoptiva de los pacientes con tumores. Los pacientes pueden ser tratados con entre 10^{8} y 10^{11} CTL autólogos transducidos. De forma análoga a los CD8^{+}, se pueden generar linfocitos T colaboradores CD4^{+} transducidos con constructos relacionados.

Otros sistemas adecuados para introducir genes en CTL se describen en Moritz y col (1994), "Proc. Natl. Acad. Sci." EE. UU., 91, 4318-4322. Eshhar y col. (1993) "Proc. Natl. Acad. Sci." EE. UU. 90, 720-724 y Hwu y col. (1993) "J. Exp. Med." 178, 361-366 también describen la transfección de CTL. Por tanto, otro aspecto de la invención proporciona un TCR que reconoce una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención. El TCR se obtiene del CTL activado.

Se prefiere, sin embargo, que los vectores de expresión sean capaces de expresar el TCR en un CTL después de la transfección.

Otro aspecto más de la invención proporciona un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la invención. El método comprende los siguientes pasos: (1) obtención de CTL del paciente; (2) introducción en dichas células de un polinucleótido que codifique un TCR, o una molécula funcionalmente equivalente, tal y como se define más arriba; y (3) introducción en el paciente de las células producidas en el paso (2).

Otro aspecto más de la invención proporciona un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como la definida en los otros aspectos de la invención. El método comprende los siguientes pasos: (1) obtención de células presentadoras de antígenos, como células dendríticas, del paciente; (2) contacto de dichas células presentadoras de antígenos con un péptido, como se definió en los otros aspectos de la invención, o con un polinucleótido que codifique dicho péptido, ex vivo y (3) reintroducción en el paciente de las células presentadoras de antígenos así tratadas.

Preferentemente, las células presentadoras de antígenos son células dendríticas. Las células dendríticas son células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetid con un péptido antigénico. El péptido antigénico puede ser cualquier péptido antigénico adecuado que desencadene una respuesta adecuada de los linfocitos T. La terapia de linfocitos T con células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetida con péptidos de un antígeno asociado a un tumor se describe en Murphy y col. (1996) "The Prostate" 29, 371-380 y en Tjua y col. (1997) "The Prostate" 32, 272-278.

En otra modalidad, las células presentadoras de antígenos, como las células dendríticas, son contactadas con un polinucleótido que codifica un péptido de la invención. El polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido adecuado y se prefiere que sea capaz de transducir la célula dendrítica resultante en la presentación de un péptido e inducción de inmunidad.

Convenientemente, el polinucleótido puede estar comprendido en un polinucleótido viral o en un virus. Por ejemplo, se ha demostrado que las células dendríticas transducidas por adenovirus inducen inmunidad antitumoral específica de antigen en relación con MUC1 (véase Gong y col. [1997] "Gene Ther". 4,1023-1028). De forma similar, pueden usarse sistemas basados en adenovirus (véase, por ejemplo, Wan y col. [1997] "Hum. Gene Ther." 8, 1355-1363); sistemas retrovirales (Specht y col. [1997] "J. Exp. Med." 186, 1213-1221 y Szabolcs y col. [1997]); transferencia sanguínea mediada por partícula a células dendríticas (Tuting y col. "Eur. J. Immunol." 27, 2702-2707) y ARN (Ashley y col. [1997] "J. Exp. Med." 186, 1177-1182).

Se apreciará que, con respecto a los métodos para destruir células diana en un paciente, se prefiere especialmente que las células diana sean células cancerosas y, más aún, que sean células cancerosas renales o de colon.

Se prefiere especialmente que los pacientes que sean tratados con los métodos de la invención tengan un haplotipo HLA-DR. Así, en una modalidad preferida, el haplotipo HLA del paciente se habrá determinado antes del tratamiento. El análisis del haplotipo HLA del paciente puede efectuarse mediante los métodos adecuados, conocidos por los expertos en la materia.

La invención incluye en particular el uso del péptido de la invención (o polinucleótidos que los codifiquen) para la vacunación activa in vivo; para la manipulación in vitro de células dendríticas autólogas seguida de la introducción de dichas células para activar repuestas de CTL; para activar CTL autólogos in vitro seguido de terapia adoptiva (es decir, los CTL así manipulados son introducidos en el paciente); y para activar CTL de donantes sanos (MHC apareado o desapareado) in vitro seguido por terapia adoptiva.

En una modalidad preferida, las vacunas de la presente invención se administran a un huésped tanto solas como en combinación con otras terapias contra el cáncer para inhibir o suprimir la formación de tumores.

La vacuna de péptidos puede administrarse sin adyuvante. La vacuna de péptidos también puede administrarse con un adyuvante como BCG o alum. Otros adyuvantes adecuados son el estimulón QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, EE. UU.), derivado de la saponina; extractos micobacterianos y pared bacteriana mimética sintética y adyuvantes registrados como el Detox. Quil A, otro adyuvante derivado de la saponina, también puede ser usado (Superfos, Dinamarca). También pueden ser útiles otros adjuvantes como los oligonucleótidos CpG, el ARN estabilizado, Imiquimod (comercializado con el nombre registrado Aldara^{TM} por 3M Pharma, EE. UU.), el adyuvante incompleto de Freund (comercializado como Montanide ISA-51 por Seppic S.A, Paris, Francia), las formulaciones liposomales o el GM-CSF. También puede ser útil dar el péptido conjugado con la hemocianina de lapa californiana, preferentemente también con un adyuvante.

El péptido conforme a la invención también puede ser usado como reactivo diagnóstico. Con el péptido puede analizarse si, en una población de CTL, aparecen CTL dirigidos específicamente contra un péptido o si son inducidos por una terapia. Además, el aumento de linfocitos T precursores puede ser analizado con aquellos péptidos que tengan reactividad contra el péptido definido. Además, el péptido puede ser usado como marcador con el fin de controlar la progresión de la enfermedad de un tumor que expresa el antígeno mencionado del que el péptido deriva.

En la tabla 1 adjunta, se enumeran los péptidos identificados. Además, en la tabla se nombran las proteínas de las que deriva el péptido así como la posición respectiva del péptido en la proteína correspondiente. Además, se dan los números de registro respectivos vinculados al Genbank del National Centre for Biotechnology Information del National Institute of Health (véase http: www.ncbi.nlm.nih.gov).

En otra modalidad preferida, el péptido es usado para la coloración de leucocitos, en particular de linfocitos T. Este uso es particularmente ventajoso si se prueba que en una población de CTL aparecen CTL específicos dirigidos contra un péptido. Además, el péptido puede usarse como marcador para determinar la evolución de una terapia contra una enfermedad o trastorno tumoral.

En otra modalidad preferida, el péptido es usado para la producción de un anticuerpo. Los anticuerpos policlonales pueden obtenerse de forma estándar con la inmunización de animales, por medio de la inyección del péptido y la subsiguiente purificación de la globulina inmune. Los anticuerpos monoclonales pueden producirse siguiendo los protocolos estándar, como los descritos, por ejemplo, en "Methods Enzymol." (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal antibodies.

En otro aspecto, la invención se refiere a una composición farmacéutica que contiene uno o más de los mencionados péptidos conformes a la invención. Esta composición se administra por vía parenteral como, por ejemplo, subcutánea, intradérmica, intramuscular o por vía oral. Para ello, los péptidos son disueltos o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable y preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes como soluciones reguladoras, aglutinantes, agentes blásticos, diluyentes, aromas, lubricantes, etc. Los péptidos también pueden administrase junto con substancias estimulantes de la respuesta inmune, como las citocinas. Una lista completa de excipientes que pueden usarse para esta composición aparece, por ejemplo, en A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients", 3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and pharmaceutical press. La composición puede usarse para la prevención, profilaxis y/o terapia de enfermedades tumorales.

La preparación farmacéutica con el péptido de la presente invención compuesto por la secuencia SEQ ID n.º 4 es administrada a un paciente que sufra una enfermedad tumoral que esté asociada al péptido o antígeno respectivo. Así puede desencadenarse una respuesta inmune específica de CTL.

En otro aspecto de la presente invención, una combinación de dos o varios péptidos, como se describe aquí, puede usarse como vacuna, tanto en combinación directa como dentro del mismo régimen de tratamiento. Además, pueden usarse combinaciones con otros péptidos como, por ejemplo, péptidos específicos de MHC de clase I. El experto en la materia será capaz de seleccionar las combinaciones preferidas de péptidos inmunógenos por medio del análisis, por ejemplo, de la generación de linfocitos T in vitro así como su eficacia y presencia global, la proliferación, afinidad y expansión de determinados linfocitos T para determinados péptidos, y la funcionalidad de los linfocitos T; por ejemplo, analizando la producción de IFN-\gamma (véanse también los ejemplo más abajo), IL-12 o perforina. Normalmente, los péptidos más eficaces son entonces combinados como vacuna para los propósitos descritos más arriba.

Una vacuna adecuada contendrá 2, 3, 4, 5, 6, 7, 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 péptidos distintos, preferiblemente 4, 5, 6 ó 7 péptidos distintos y, más preferiblemente, 6 péptidos diferentes.

Finalmente, la vacuna puede depender del tipo de cáncer específico que el paciente sufra así como del estado de la enfermedad, regímenes de tratamiento anteriores, el estado inmune del paciente y, naturalmente, el haplotipo HLA del paciente.

Se ha comprobado que los 80 aminoácidos N-terminales de la Ii son suficientes para dirigir a las proteínas a la vía de procesamiento de clase II (S. Sanderson, K. Frauwirth y N. Shastri (1995), "Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A", 92, 7217-7221; R. F. Wang, X. Wang, A.C. Atwood, S.L. Topalian y S.A. Rosenberg (1999) "Science", 284, 1351-1354).

La identificación de epítopos de linfocitos T colaboradores de antígenos asociados a tumores sigue siendo una tarea importante en la inmunoterapia contra los tumores. En este sentido, los inventores aportan un método de aplicación general y péptidos que derivados del análisis diferencial de péptidos por espectrometía de masas para identificar ligandos MHC de clase II, presentados y procesados de forma natural, de antígenos asociados a tumores. Este enfoque combina por primera vez la transfección de APC con un vector que codifique una proteína de fusión entre la cadena invariante y el antígeno de interés, la elución de péptidos unidos a HLA y la identificación por espectrometría de masas de los péptidos derivados del antígeno presentados por el agente de transfección, por comparación con las células no transfectadas. Además, los inventores pudieron validar el método mostrando que los linfocitos T inducidos contra el péptido identificado reconoces específicamente a los agentes de transfección que sobreexpresan el antígeno cognado. Aunque todavía se tiene que probar la inmunogenicidad in vivo de los péptidos identificados, nuestro enfoque conduce a la caracterización exacta de los ligandos MHC de clase II procesados de forma natural. Así, los inventores evitan probar péptidos sintéticos solapados de antígenos asociados a tumores o un intervalo amplio de péptidos seleccionados por predicción de epítopos, ya que es menos exacto que la predicción de epítopos de clase I. En comparación con laboriosos ensayos de linfocitos T que podrían conducir a la identificación de crípticos epítopos de linfocitos T incapaces de inducir la activación de los linfocitos T in vivo (S. M. Anderton, N. J. Viner, P. Matharu, P. A. Lowrey y D. C. Wraith (2002), "Nat. Immunol.", 3, 175-181), el trabajo puede centrarse en los pocos péptidos que se encuentran para ser presentados. Además, con este método no es necesario producir el antígeno recombinado o disponer de líneas celulares tumorales que expresen el antígeno para probar que los péptidos se procesan de forma natural.

Los inventores usaron el N-terminal de Ii para dirigir antígenos asociados a tumores al compartimento de procesamiento de clase II de células B transformadas por el VEB. Para conseguir esto, los inventores construyeron un vector versátil con el que se puede expresar cualquier antígeno como una proteína de fusión con Ii y que ayuda a determinar el nivel de expresión de la proteína en células transfectadas mediante el análisis de transferencia Western. Ya se ha mostrado que el N-terminal de Ii es suficiente para dirigir proteínas al compartimento de procesamiento de clase II. Pero, hasta ahora, esto sólo se ha descrito en un modelo que utiliza ovalbúmina (S. Sanderson, D. Frauwirth y N. Shastri (1995) "Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A" 92, 7217-7221) para identificar antígenos desconocidos usando genotecas de ADNc que codifican proteínas de fusión (R. F. Wang, X. Wang, A. C. Atwood, S. L. Topalian y S. A. Rosenberg (1999) "Science" 284, 1351-1354) o para confirmar la especificidad de clones de linfocitos T conocidos (P. Chaux, V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon y B. P. van der Bruggen (1999) "J. Exp. Med." 189, 767-778). Los inventores no tienen conocimiento de que este método se haya usado antes para identificar péptidos unidos a MHC de clase II, presentados de forma natural, de antígenos asociados a tumores conocidos. El análisis diferencial de ligandos de clase II de células transfectadas y no transfectadas por espectrometría de masas MALDI y la posterior caracterización por espectrometría de masas ESI de los péptidos expresados diferencialmente tiene como resultado un método directo para identificar ligandos de clase II de los antígenos de interés. La transfección de las células con proteínas de fusión queratina 18 mostró que el método de los inventores es de aplicación general para los antígenos de interés. Los inventores también pudieron describir un péptido presentado por HLA-DR a partir de un transgén modelo, la queratina 18.

La identificación de epítopos de linfocitos T colaboradores de TAA sigue siendo una tarea importante en la inmunoterapia contra los tumores. Hasta ahora, se han llevado a cabo distintas estrategias para la identificación de péptidos de clase II a partir de TAA, desde la incubación de APC con el antígeno de interés para que sea absorbido y procesado (P. Chaux, V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon, y B. P. van der Bruggen; 1999; Identification of MAGE-3 epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. "J. Exp. Med." 189:767-778) hasta diversas estrategias de transfección con proteínas de fusión (J. Dengjel, P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee y S. Stevanovic; 2004; Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry; "Eur. J. Immunol." 34: 3644-3651). Todos estos métodos llevan mucho tiempo y muchas veces no queda claro si los ligandos de HLA identificados son realmente presentados in vivo por tejido humano. Los inventores pudieron mostrar por primera vez que es posible aislar ligandos de HLA de clase II directamente de tumores sólidos diseccionados, identificando así los péptidos que son presentados por los tumores y el tejido circundante in vivo que, por tanto, pueden ser reconocidos por linfocitos T con el receptor de linfocitos T adecuado y que expresan simultáneamente el ligando CD4 co-estimulante en su superficie. Entre la proteínas que actúan como una fuente de ligandos de HLA de clase II procesados de forma endógena, se identificaron varias proteínas de mantenimiento e inmunorelevantes. Sin embargo, también se detectaron péptidos de TAA, lo que desemboca en un enfoque directo para la identificación de relevantes ligandos de clase II in vivo de TAA.

Los inventores identificaron tres ligandos para una secuencia central de IGFBP3 y un ligando de MMP7. Los inventores descubrieron que estas proteínas están sobreexpresadas en los carcinomas de células renales. Además, se han descrito como asociadas a tumores (S. Miyamoto, K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, y A. Ochiai; 2004; Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulin-like growth factor binding protein 3; "Cancer Res." 64:665-671. T. Sumi, T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima y O. Ishiko; 2003; Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. "Oncol. Rep." 10:567-570. C. W. Cheung, D. A. Vesey, D. L. Nicol y D. W. Johnson; 2004; The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regulation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell proliferation; "Kidney Int." 65:1272-1279). Estos péptido se unieron promiscuamente a moléculas HLA de clase II y fueron capaces de activar linfocitos T CD4^{+} de diferentes donantes sanos. Por lo tanto, el enfoque de los inventores ayudará en la identificación de nuevos péptidos candidatos de clase II de TAA para su uso en protocolos de vacunación clínica.

La invención, en uno más de sus aspectos, hace referencia a un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan un polipéptido que comprende la secuencia de aminoácidos tal y como se indica en la presente invención. El método comprende la administración al paciente de una cantidad efectiva de un péptido según la presente invención o un ácido nucleico según la presente invención o un vector de expresión según la presente invención, en donde la cantidad del mencionado péptido, ácido nucleico o vector de expresión es lo suficientemente efectiva para provocar una respuesta inmune contra la célula diana en el mencionado paciente.

La invención, en uno más de sus aspectos, hace referencia a un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos según la presente invención. El método comprende la administración al paciente de un número efectivo de linfocitos T citotóxicos (CTL), tal y como se ha definido en la presente invención.

La invención, en uno más de sus aspectos, hace referencia a un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos según la presente invención. El método comprende los siguientes pasos: (1) obtención de linfocitos T citotóxicos (CTL) del paciente; (2) introducción en dichas células de un ácido nucleico que codifique un receptor de linfocitos T (TCR) o una molécula funcionalmente equivalente, tal y como se ha definido en la presente invención y (3) la introducción al paciente de las células producidas en el paso (2).

Preferentemente, las células diana son células cancerosas. Con más preferencia, el cáncer es leucemia o linfoma que expresa el polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como se ha dado conforme a la presente invención.

En el contexto de la presente invención se ha descubierto de forma inesperada que las células de tumores sólidos, en comparación con las células sanas del mismo tejido, expresan la molécula humana HLA de clase II en su superficie. Este hecho sólo ha sido descrito una vez por Brasanac y col. (D. Brasanac, J. Markovic-Lipkovski, J. Hadzi-Djokic, G. A. Muller, C. A. Muller; Immunohistochemical analysis of HLA class II antigens and tumor infiltrating mononuclear cells in renal cell carcinoma: correlation with clinical and histopathological data. "Neoplasma" 1999; 46(3): 173-8), en el que se estudiaron secciones de criostato de 37 carcinomas de células renales (RCC) -25 de células claras, 10 granulares y 2 cromófobas- con el método indirecto de inmunoperoxidasa, aplicándose anticuerpos monoclonales (AcMo) a los antígenos HLA-DR, -DP y -DQ para el análisis de antígenos HLA de clase II, y AcMo anti-CD14, -CD3, -CD4 y -CD8 para células mononucleares destructoras de tumores (TIM). El número de células positivas se calculó semi-cuantitativamente y se estableció una correlación entre los resultados de la investigación inmunohistoquímica y las características clínicas (edad y sexo del paciente, tamaño del tumor y clasificación TNM) e histopatológicas (citología, histología, grado) del RCC. Todos los RCC expresaron antígenos HLA-DR, un 92% de -DQ y un 73% de -DP con una jerarquía en el nivel de expresión de -DR>-DQ>-DP, pero no se pudo establecer una correlación de importancia estadística con ninguno de los parámetros clínicos o histopatológicos analizados. Los monocitos fueron más abundantes que los linfocitos T y los linfocitos T CD4^{+} más que los CD8^{+}, mientras que los tumores con predominancia de linfocitos T y con aproximadamente el mismo número de linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} tuvieron el mayor diámetro medio. La activación inadecuada de los linfocitos T por células tumorales (a pesar de su capacidad para presentar antígenos) pudo ser la razón para una asociación de parámetros que indica un comportamiento tumoral más agresivo con expresión aberrante del antígeno HLA de clase II en RCC.

Ahora se describirá la invención en más detalle, haciéndose referencia a las siguientes figuras, al listado de secuencias y a los ejemplos. Los siguientes ejemplos se ofrecen sólo con fines ilustrativos y no pretenden limitar la invención.

Las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 49 muestran secuencias de péptidos de epítopos de linfocitos T que contienen péptidos presentados por el MHC de clase II.

Las SEQ ID n.º 50 a SEQ ID n.º 79 muestran secuencias de péptidos de la tabla 3.

La figura 1 muestra la expresión de moléculas HLA de clase II en RCC de tres pacientes. Mientras en el tumor del paciente RCC132 las células positivas HLA se localizaban preferentemente en el margen (A, B), los modelos de expresión HLA de clase II de los tumores de los pacientes RCC190 y RCC211 con una estructura más papilar se habían propagado de forma más uniforme (C, E, G). La visualización de macrófagos CD68^{+} (B, D, F) en secciones seriadas de tejido ilustra una relación espacial cercana entre las células inmunes mononucleares destructoras de tumores y las células tumorales que expresan HLA II. La incubación con IgG de ratón en lugar de anticuerpos específicos reveló sistemáticamente resultados de coloración negativos (H). La T marca el tumor.

La figura 2 muestra un análisis FACS de linfocitos T CD4^{+} específicos para IGFBP3_{169-181}, MMP7_{247-262} y
CCND1_{198-212}. Se muestran transferencias de puntos representativas de coloración de IFNá intracelular en contraste con CD4-FITC.

La figura 3 muestra una ilustración esquemática de linfocitos T CD4^{+} productores de IFNá específico de antígeno detectados en cada donante y para cada péptido. Se muestra el porcentaje de linfocitos T CD4^{+} productores de IFNá para cada donante y péptido usado para la estimulación Las células se incubaron en placas de 96 pocillos -7 pocillos por donante y péptido. Los valores considerados positivos aparecen en un recuadro: el porcentaje de linfocitos T CD4^{+} productores de IFNá fue más de dos veces mayor que el control negativo sin péptido. Los porcentajes de linfocitos T CD4^{+} productores de IFNá detectados tras la estimulación con un péptido irrelevante guardaban correlación con los valores tras la estimulación sin péptido, con la excepción del donante 1 después de la 3ª estimulación con IGFBP3_{169-181}. Sin embargo, este efecto no se volvió a detectar después de la 4ª estimulación.

La figura 4 muestra la expresión de moléculas HLA de clase II en CCA165 (adenocarcinoma del colon diferenciado moderadamente). En la lámina propia de zonas con mucosa normal del colon (panel c y lado izquierdo del panel a, marcados con asterisco) normalmente se observan algunos macrófagos HLA positivos de clase II pero las células epiteliales eran sistemáticamente negativas para la expresión de HLA de clase II. En las células epiteliales de zonas distintas del tumor, sin embargo, se observó una expresión pronunciada de HLA II, tal y como se muestra en el lado derecho del panel a y en los paneles b y d.

Las figuras 5a y 5b muestran la identificación de secuencias de péptidos eluidos de moléculas HLA de clase II aisladas del tejido tumoral humano principal por espectrometría de masas. Figura 5a: fragmentos derivados de la fragmentación de ligandos HLA de clase II procesados y presentados de forma natural de MMP7 que corresponden a la secuencia de péptidos con SEQ ID n.º 1 (SQDDIKGIQKLYGKRS). Los fragmentos anotados se describen en la tabla 5. Figura 5b: fragmentos derivados de la fragmentación del péptido sintético con la secuencia de péptidos SEQ ID n.º 1. Las fragmentaciones de los péptidos procesados tanto de forma natural como sintética producen modelos de fragmentación equivalentes y permiten la deducción y confirmación de la secuencia de aminoácidos primaria de la secuencia de péptidos previamente sin caracterizar (SEQ ID n.º 1) de este ligando HLA de clase II de MMP7 humano.

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Ejemplos Material y métodos

Inmunohistología de MHC de clase II: los tumores fueron fijados en folmaldehído tamponado con fosfato al 4%, adheridos en parafina, teñidos con hematoxilina y eosina y examinados por microscopio óptico. El diagnóstico del RCC se efectuó conforme a las investigaciones rutinarias histopatológicas e inmunohistológicas (S. Fleming y M. O'Donnell; 2000; Surgical pathology of renal epithelial neoplasms: recent advances and current status. "Histopathology" 36: 195-202).

Para la detección inmunohistológica de moléculas MHC de clase II o moléculas CD68, respectivamente, se trataron previamente 5 \mum de secciones de tejido adherido en parafina con 10 mM de tampón de citrato, pH 6, seguido de la incubación con AcMo cadena alfa anti-HLA-DR de ratón (clon TAL.1B5, 1:50) o Ac CD68 (clon PGM1, 1:50) (DAKO, Hamburgo, Alemania) o IgG1 de ratón (2 \mug/ml, BD Biosciences Pharmingen, San Diego, EE. UU.) y se visualizaron con el kit de detección Ventana iView DAB (Nexes System, Ventana Medical Systems, Illkirch, Francia). Las secciones de tejido se sometieron a una contracoloración con hematoxilina y, finalmente, se adhirieron en Entellan.

Elución y análisis molecular de péptidos unidos a HLA-DR: se procesaron muestras congeladas de tumor de la forma descrita anteriormente (T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic y H. G. Rammensee; 2002; Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines; "Cancer Res." 62: 5818-5827) y los péptidos se aislaron conforme a los protocolos habituales (J. Dengjel, H. G. Rammensee y S. Stevanovic; 2005; Glycan side chains on naturally presented MHC class II ligands. "J. Mass Spectrom." 40: 100-104) usando el AcMo específico de HLA-DR L243 (L. A. Lampson y R. Levy; 1980; Two populations of Ia-like molecules on a human B cell line; "J. Immunol." 125: 293-299).

Las mezclas de péptidos naturales se analizaron con un sistema de HPLC Ultimate en fase invertida (Dionex, Amsterdam, Holanda) unido a un espectrómetro de masas Q-TOF I (Waters, Eschborn, Alemania), o con un sistema de HPLC CapLC en fase invertida unido a un Q-TOF Ultima API (Waters), como se describió anteriormente (C. Lemmel, S. Weik, U. Eberle, J. Dengjel, T. Kratt, H. D. Becker, H. G. Rammensee y S. Stevanovic; 2004; Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass spectrometry using stable isotope labeling. "Nat. Biotechnol." 22: 450-454). Los espectros de los fragmentos se analizaron de forma manual y automática.

Análisis de la expresión génica por micromatrices de oligonucleótidos de alta densidad: El aislamiento del ARN de muestras de riñón normal autólogo y tumoral así como el análisis de la expresión génica con micromatrices de oligonucleótidos Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix, Santa Clara, CA, EE. UU.) se efectuaron tal y como se describió anteriormente (T. Krüger, O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Müller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H. G. Rammensee y S. Stevanovic; 2004; Lessons to be learned from primary renal cell carcinomas: novel tumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. "Cancer Immunol. Immunother"). Los datos se analizaron con el software GCOS (Affymetrix). Las comparaciones de pares entre el riñón normal autólogo y el tumoral se calcularon usando el la matriz normal correspondiente como fondo. No se encontraron datos de matriz de riñón normal autólogo disponibles para RCC149 y RCC211. Por lo tanto, el ARN mezclado de riñón humano sano se obtuvo comercialmente (Clontech, Heidelberg, Alemania) y se usó como fondo para estos tumores.

Maduración de células dendríticas: Las células dendríticas se prepararon usando sangre de donantes sanos. Explicado brevemente, las PBMC se aislaron usando centrifugación en gradiente estándar (Lymphocyte Separation Medium, PAA Laboratories GmbH, Pasching, Austria) y se colocaron en placas a una densidad de 7 x 10^{6} células/ml en medio X-Vivo 15. Después de dos horas a 37ºC, se quitaron las células no adherentes y los monocitos adherentes se cultivaron durante 6 días en medio X-Vivo con 100 ng/ml de GM-CSF y 40 ng/ml de IL-4 (AL-ImmunoTools, Friesoythe, Alemania). El séptimo día, las células dendríticas inmaduras se activaron con 10 ng/ml de TNF-á (R&D Systems, Wiesbaden, Alemania) y 20 \mug/ml de poly(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania) durante 3 días.

Generación de linfocitos T CD4^{+} específicos de antígeno: se estimularon 10^{6} PBMC por pocillo con 2 x 10^{5} células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetida con péptidos (5 \mug/ml). Las células se incubaron en placas de 96 pocillos (7 pocillos por donante y péptido) con medio de linfocitos T: RPMI 1640 suplementado en presencia de 10 ng/ml de IL-12 (Promocell, Heidelberg, Alemania). Después de tres a cuatro días de co-incubación a 37ºC, se añadió medio fresco con 80 U/ml de IL-2 (Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, EE. UU.) y 5 ng/ml de IL-7 (Promocell). La reestimulaciones se efectuaron con PBMC autólogas y péptidos con una frecuencia de entre seis y ocho días.

Tinción de IFNá intracelular: Después de tres o cuatro rondas de estimulación, las PBMC fueron descongeladas, lavadas dos veces en medio X-Vivo 15, resuspendidas a 10^{7} células/ml en medio de linfocitos T y cultivadas durante la noche. Al día siguiente, las PBMC, sensibilizas de manera repetida con 5 \mug/ml de péptido, se incubaron con células efectoras en un ratio de 1:1 durante 6 horas. Se añadió Golgi-Stop (Becton Dickinson, Heidelberg, Alemania) para las últimas 4 horas de incubación.

Las células se analizaron usando un kit Cytofix/Cytoperm Plus (Becton Dickinson) y anticuerpos CD4-FITC- (Immunotools), IFNá-PE- y CD8-PerCP clon SK1 (Becton Dickinson). Para los controles negativos se mezclaron e incubaron células de siete pocillos sin péptidos o con una cantidad irrelevante. Se usó la estimulación con PMA/Ionomicina para el control positivo. Las células se analizaron en un FACSCalibur de tres colores (Becton Dickinson).

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Ejemplos Expresión de HLA de clase II por el RCC

En condiciones normales no inflamatorias, las moléculas HLA de clase II sólo deberían ser expresadas por células del sistema hematopoyético y por el epitelio tímico (B. Mach, V. Steimle, E. Martinez-Soria y W. Reith; 1996; Regulation of MHC class II genes: lessons from a disease. "Annu. Rev. Immunol." 14: 301-331). La situación cambia durante la inflamación. La expresión de HLA de clase II puede ser inducida en la mayoría de los tipos de células y los tejidos mediante IFNá (S. Leib und Gut-Landmann, J. M. Waldburger, M. Krawczyk, L. A. Otten, T. Suter, A. Fontana, H. Acha-Orbea y W. Reith; 2004; Mini-review: Specificity and expression of CIITA, the master regulator of MHC class II genes. "Eur.J.Immunol." 34: 1513-1525). Debido a que la incidencia de RCC viene a menudo acompañada de eventos inflamatorios (J. Y. Blay, J. F. Rossi, J. Wijdenes, C. Menetrier-Caux, S. Schemann, S. Negrier, T. Philip y M. Favrot; 1997; Role of interleukin-6 in the paraneoplastic inflammatory syndrome associated with renal-cell carcinoma. "Int. J. Cancer" 72: 424-430. U. Elsässer-Beile, M. Rindsfuser, T. Grussenmeyer, W. Schultze-Seemann y U. Wetterauer; 2000; Enhanced expression of IFN-gamma mRNA in CD4[+] or CD8[+] tumor-infiltrating lymphocytes compared to peripheral lymphocytes in patients with renal cell cancer. "Br. J. Cancer" 83: 637-641), las moléculas de clase II son expresadas en los alrededores de o por los tumores, según hay constancia.

Tinción inmunohistoquímica de moléculas HLA de clase II

Los inventores analizaron la expresión de HLA de clase II de diez muestras de RCC que comprendían carcinoma renal histológico de células claras y papilar usando tinción inmunohistoquímica y descubrieron que todas las muestras investigadas revelaban células tumorales positivas de clase II. Tal y como se ejemplifica en la figura 1A, a menudo se detectaba en el margen del tumor una expresión pronunciada de HLA de clase II. En éstas zonas, los inventores observaron un estrecha correlación espacial de células tumorales positivas de HLA con células inmunes destructoras de tumores, como se ilustra por la visualización de macrófagos CD68^{+} en una sección e tejido seriada (figura 1B). En el RCC que revelaba una architectura más papilar, la expresión de moléculas HLA de clase II se distribuía de forma más uniforme por el tumor (figura 1C, E, G). La comparación de las muestras de tinción inmunohistoquímica de HLA de clase II y CD68 en secciones de tejido seriadas demuestra claramente que, además de los macrófagos, las células tumorales también expresan HLA de clase II (figura 1 C, D y E, F). Se ha demostrado que los linfocitos T_{H1} CD4^{+} productores de IFNá así como las células asesinas naturales (NK) se infiltran en el RCC (J. M. Cozar, J. Canton, M. Tallada, A. Concha, T. Cabrera, F. Garrido y O. F. Ruiz-Cabello; 2005; Analysis of NK cells and chemokine receptors in tumor infiltrating CD4 T lymphocytes in human renal carcinomas. "Cancer Immunol. Immunother"). Teniendo en cuenta que se encontraron células tumorales positivas de clase II predominantemente en partes exteriores de los tumores diseccionados, se podría especular que los leucocitos atraídos por el tumor producen IFNá que actúa en las células malignas vecinas. La expresión anormal de moléculas HLA de clase II en tejido neoplásico no está restringida al RCC. También puede detectarse en el TCC y el CCA. La figura 4 muestra la tinción inmunohistoquímica de tejido de muestra de adenocarcinoma humano del colon.

Análisis de la expresión de IFNá y transcritos génicos inducibles por IFNá

Adicionalmente, los inventores investigaron la expresión de HLA de clase II por medio del análisis comparativo de la expresión génica, usando micromatrices de oligonucleótidos. Con esta técnica, los inventores pudieron calcular la expresión total de HLA de clase II en los tumores diseccionados independientemente de los tipos de células de expresión. Los inventores analizaron la expresión diferencial de cuatro tumores, RCC149, RCC180, RCC190 y RCC211, en comparación con el riñón de referencia normal. En los cuatro tumores, los genes codificadores de moléculas de HLA de clase II se encontraron sobreexpresados (tabla 2). Una razón posible de esto podría ser una expresión inducida por IFNá y, por ello, los inventores buscaron otros genes que se sabe son regulados hacia arriba por interferones (N. A. Kolchanov, E. V. Ignatieva, E. A. Ananko, O. A. Podkolodnaya, I. L. Stepanenko, T. I. Merkulova, M. A. Pozdnyakov, N. L. Podkolodny, A. N. Naumochkin y A. G. Romashchenko; 2002; Transcription Regulatory Regions Database (TRRD): its status in 2002. "Nucleic Acids Res." 30: 312-317). Resulta interesante destacar que se encontró un número considerable de estos genes sobreexpresado en una o más muestras de tumores. La tabla 2 muestra genes inducibles por interferón regulados hacia arriba de forma reproductiva en las cuatro muestras, conforme a los descubrimientos anteriores de los inventores (T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic y H. G. Rammensee; 2002; Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. "Cancer Res." 62: 5818-5827). Entre ellos se encuentran las LMP2, LMP7 y MECL1, proteínas que se intercambian por subunidades constitutivas de la holoenzima proteolítica larga que se encuentra en el citosol, la proteasoma, para formar la inmuno-proteasoma. El intercambio de subunidades proteolíticas expresadas de forma normal de la proteasoma por subunidades inducidas por IFNá constituye un proceso distintivo en un medio rico en interferón. Adicionalmente, el IFNá se calculó directamente por PCR cuantitativo a tiempo real (TaqMan). Los tumores de la tabla 2 mostraron una sobreexpresión de IFNá ARNm de 5 a 60 veces mayor en comparación con las muestras autólogas de ARN normal del mismo donante (no se muestran datos). De esta forma, los resultatos de los inventores indican que el IFNá podría tener una función importante en el RCC y ser la razón de la expresión abundante de clase II.

TABLA 2 Expresión de ARNm de genes inducibles por interferón

La expresión en las muestras de tumor se comparó con riñones normales autólogos (RCC180, RCC190) o riñones sanos mezclados (RCC149, RCC211). Todos los genes mostraron un "aumento" en el algoritmo change-call del software GCOS para los cuatro tumores y se han descrito como inducibles por interferón.

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Ligandos de HLA-DR aislados de tejido canceroso

Conforme a datos disponibles al público, los péptidos unidos por moléculas HLA de clase II expresados en tejido de tumores sólidos hasta ahora no han sino aislados ni identificados. Los inventores analizaron diez RCC distintos, tres CCA y un TCC y pudieron aislar ligandos de HLA-DR de todas las muestras, llegando a 453 péptidos en total (no se muestran datos). Las secuencias de péptidos se determinaron uniendo separación cromatográfica y análisis espectrométrico de masas en tandem (LC-MS/MS), como se describió anteriormente (T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic y H. G. Rammensee; 2002; Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. "Cancer Res." 62: 5818-582. M. Schirle, W. Keilholz, B. Weber, C. Gouttefangeas, T. Dumrese, H. D. Becker, S. Stevanovic, H. G. Rammensee; Identification of tumor-associated MHC class I ligands by a novel T-cell-independent approach. "Eur J Immunol."; 2000; 30(8): 2216-25). En las figuras 5a y 5b se muestra un ejemplo de la secuenciación de novo de péptidos por LC-MS/MS. Las secuencias deducidas de aminoácidos primarios de fragmentos de colisión anotadas en las figuras 5a y 5b se incluyen en la tabla 5. Las muestras de tumor difirieron en sus genotipos HLA, en su peso y en el número total de ligandos de HLA identificados. La tabla 3 muestra una lista representativa de péptidos y las proteínas de origen correspondientes identificados a partir de una muestra de tumor, RCC190. Los péptidos se aislaron de moléculas HLA de clase II de células, tal y como se describió anteriormente (J. Dengjel, P. Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee y S. Stevanovic; 2004; Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry. "Eur. J. Immunol." 34: 3644-3651).

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TABLA 3 Lista de ejemplo de ligandos de HLA-DR aislados de RCC190

Se muestran las secuencias centrales de ligandos de HLA-DR aislados de RCC190 (HLA-DRB1*11, DRB1*15, DRB3, DRB5).

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No se encontró una correlación entre el peso del tumor y el número de ligandos de HLA identificados. Las proteínas de origen de los péptidos se pudieron dividir en dos grupos. Por una parte se encontraron ligandos que deberían ser presentados por leucocitos como péptidos de componentes de complementos (proteínas alfa de unión a C4, C4A y C3, por ejemplo) y otras proteínas unidas a funciones específicas de células del sistema inmune (CD14 y proteína de unión al fragmento Fc de IgG, por ejemplo). Por otro lado, los inventores pudieron revelar la naturaleza y características de péptidos desconocidos presentados por células tumorales de TAA sobreexpresado como, por ejemplo, de la vimentina, la metaloproteinasa 7 de la matriz, el factor 1alfa de elongación de traducción eucariótica y la nicotinamida N-metiltransferasa. Esta observación coincide con los datos inmunohistoquímicos (figuras 1 y 4) y demuestra que las células tumorales positivas de HLA de clase II y los leucocitos destructores estaban presentes en muestras analizadas y que los péptidos eluídos provienen de antígenos sobreexpresados en estos tipos definidos
de células.

Con el fin de identificar péptidos de TAA, los inventores compararon las proteínas de origen de los ligandos individuales con los genes sobreexpresados detectados en análisis de micromatrices de tumores (T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic y H. G. Rammensee; 2002; Integrated functional genomics approach for the design of patient-individual antitumor vaccines. "Cancer Res." 62: 5818-5827. T. Krüger, O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Müller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H. G. Rammensee y S. Stevanovic; 2004; Lessons to be learned from primary renal cell carcinomas: novel tumor antigens and HLA ligands for immunotherapy. "Cancer Immunol. Immunother"). Los inventores identificaron un péptido de la proteína 3 de unión al factor de crecimiento similar a la insulina, IGFBP3_{166-181,} en el RCC190. Además, en el TCC108 se encontraron dos variantes de este péptido, IGFBP3_{169-181} y IGFBP3_{169-184}, que contienen el mismo motivo central de secuencia que es necesario y suficiente para permitir la unión al HLA-DRB1*0101 (véase la tabla 1 como referencia). Un péptido de la metaloproteinasa 7 de la matriz, el MMP7_{247-262}, del mismo tumor se pudo aislar (tabla 1). A nivel del ARNm, el MMP7 y el IGFBP3 estaban sobreexpresados en 13 y 22 RCC de 23 analizados, respectivamente (no se muestran datos). En total, de 453 secuencias de péptidos identificadas inicialmente (no mostradas) se han identificado los antígenoso de 49 péptidos (SEQ ID n.º 1 - 49) como asociados a tumores, bien por experimentos de los inventores (se incluyen los datos en este documento) o de otros (S. Miyamoto, K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, y A. Ochiai; 2004; Matrix metalloproteinase-7 facilitates insulin-like growth factor bioavailability through its proteinase activity on insulin-like growth factor binding protein 3; "Cancer Res." 64:665-671. T. Sumi, T. Nakatani, H. Yoshida, Y. Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H. Kawashima y O. Ishiko; 2003; Expression of matrix metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma. "Oncol. Rep." 10:567-570. C. W. Cheung, D. A. Vesey, D. L. Nicol y D. W. Johnson; 2004; The roles of IGF-I and IGFBP-3 in the regulation of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell proliferation; "Kidney Int." 65: 1272-1279. X. Hao, B. Sun, L. Hu, H. Lahdesmaki, V. Dunmire, Y. Feng, S. W. Zhang, H. Wang, C. Wu, H. Wang, G. N. Fuller, W. F. Symmans, I. Shmulevich y W. Zhang; 2004; Differential gene and protein expression in primary breast malignancies and their lymph node metastases as revealed by combined cDNA microarray and tissue microarray analysis. "Cancer", 100: 1110-1122. B. M. Helmke, M. Polychronidis, A. Benner, M. Thome, J. Arribas y M. Deichmann; 2004; Melanoma metastasis is associated with enhanced expression of the syntenin gene. "Oncol. Rep." 12: 221-228. H. S. Hofmann, G. Hansen, G. Richter, C. Taege, A. Simm, R. E. Silber y S. Burdach; 2005; Matrix metalloproteinase-12 expression correlates with local recurrence and metastatic disease in non-small cell lung cancer patients. "Clin. Cancer Res." 11: 1086-1092. T. Kamai, T. Yamanishi, H. Shirataki, K. Takagi, H. Asami, Y. Ito y K. Yoshida; 2004; Overexpression of RhoA, Rac1, and Cdc42 GTPases is associated with progression in testicular cancer. "Clin. Cancer Res." 10: 4799-4805. J. Koninger, N. A. Giese, F. F. di Mola, P. Berberat, T. Giese, I. Esposito, M. G. Bachem, M. W. Buchler y H. Friess; 2004; Overexpressed decorin in pancreatic cancer: potential tumor growth inhibition and attenuation of chemotherapeutic action. "Clin. Cancer Res." 10: 4776-4783. M. Mori, H. Shimada, Y. Gunji, H. Matsubara, H. Hayashi, Y. Nimura, M. Kato, M. Takiguchi, T. Ochiai y N. Seki; 2004; S100A11 gene identified by in-house cDNA microarray as an accurate predictor of lymph node metastases of gastric cancer. "Oncol. Rep.", 11: 1287-1293. D. K. Nagler, S. Kruger, A. Kellner, E. Ziomek, R. Menard, P. Buhtz, M. Krams, A. Roessner y U. Kellner; 2004; Up-regulation of cathepsin X in prostate cancer and prostatic intraepithelial neoplasia. "Prostate", 60: 109-119. A. Nanda, P. Buckhaults, S. Seaman, N. Agrawal, P. Boutin, S. Shankara, M. Nacht, B. Teicher, J. Stampfl, S. Singh, B. Vogelstein, K. W. Kinzler y C. B. St; 2004; Identification of a binding partner for the endothelial cell surface proteins TEM7 and TEM7R. "Cancer Res." 64: 8507-8511. I. S. Patel, P. Madan, S. Getsios, M. A. Bertrand y C. D. MacCalman; 2003; Cadherin switching in ovarian cancer progression. "Int. J. Cancer" 106: 172-177. G. Santelli, D. Califano, G. Chiappetta, M. T. Vento, P. C. Bartoli, F. Zullo, F. Trapasso, G. Viglietto y A. Fusco; 1999; Thymosin beta-10 gene overexpression is a general event in human carcinogenesis. "Am. J. Pathol." 155: 799-804. D. Schneider, J. Kleeff, P. O. Berberat, Z. Zhu, M. Korc, H. Friess y M. W. Buchler; 2002; Induction and expression of betaig-h3 in pancreatic cancer cells. "Biochim. Biophys. Acta" 1588: 1-6. J. B. Welsh, L. M. Sapinoso, S. G. Kern, D. A. Brown, T. Liu, A. R. Bauskin, R. L. Ward, N. J. Hawkins, D. I. Quinn, P. J. Russell, R. L. Sutherland, S. N. Breit, C. A. Moskaluk, H. F. Frierson Jr. y G. M. Hampton; 2003; Large-scale delineation of secreted protein biomarkers overexpressed in cancer tissue and serum. "Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A.", 100: 3410-3415. D. Xie, J. S. Sham, W. F. Zeng, L. H. Che, M. Zhang, H. X. Wu, H. L. Lin, J. M. Wen, S. H. Lau, L. Hu y X. Y. Guan; 2005; Oncogenic role of clusterin overexpression in multistage colorectal tumorigenesis and progression. "World J. Gastroenterol." 11: 3285-3289). El análisis de ejemplo del potencial inmunoestimulatorio de péptidos unidos a alelos de HLA-DR comunes revela la existencia de linfocitos T CD4^{+} específicos de antígeno contra IGFBP3_{169-181}
y MMP7_{247-262}.

La unión promiscua de la SEQ ID n.º 1 a varios alelos de HLA-DR se puede revelar por varios métodos: los ligandos de determinadas moléculas MHC/HLA portan aminoácidos relacionados químicamente en determinadas posiciones de su secuencia primaria, lo que permite la definición de un motivo peptídico para cada alelo de MHC/HLA (K. Falk, O. Rotzschke, S. Stevanovic, G. Jung y H. G. Rammensee; Allele-specific motifs revealed by sequencing of self-peptides eluted from MHC molecules; "Nature"; 1991; 351 (6324): 290-6). SYFPEITHI matrices de motivos deducidas de motivos refinados basados exclusivamente en el análisis de ligandos naturales por degradación Edman y espectrometría de masas en tandem. Estas matrices permiten la predicción de péptidos de una secuencia de proteínas dada presentada moléculas MHC de clase II o clase II (O. Rotzschke, K. Falk, S. Stevanovic, G. Jung, P. Walden y H. G. Rammensee. Exact prediction of a natural T-cell epitope; "Eur J Immunol."; 1991; 21
(11): 2891-4).

Aplicando los principios de las predicciones hechas con el algoritmo SYFPEITHI (H. G. Rammensee, J. Bachmann y S. Stevanovic; 1997; MHC Ligands and Peptide Motifs. "Springer-Verlag", Heidelberg, Alemania. H. Rammensee, J. Bachmann, N. P. Emmerich, O. A. Bachor, S. Stevanovic; SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide motifs; "Immunogenetics"; 1999; 50 (3-4): 213-9) a la mencionada secuencia peptídica de ejemplo (SEQ ID n.º 1), se clasificó la unión de la SEQ ID n.º 1 a varios alelos de HLA-DR comunes (véase tabla 7). El algoritmo se ha usado satisfactoriamente para predecir epítopos de clase I y clase II de varios antígenos como, por ejemplo, del TAA humano TRP2 (predicción de un ligando de HLA de clase I) (34) y SSX2 (predicción de un ligando de HLA de clase II) (Neumann F, Wagner C, Stevanovic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt W y Pfreundschuh M; Identification of an HLA-DR-restricted peptide epitope with a promiscuous binding pattern derived from the cancer testis antigen HOM-MEL-40/SSX2; "Int J Cancer." 2004; 112 (4): 661-8). El umbral de puntuación de 18 o más para una unión de importancia se definió en base a los análisis de puntuaciones de uniones para ligandos peptídicos de HLA-DR de unión promiscua publicadas con anterioridad. La unión promiscua se define como la unión de un péptido con buena fuerza de unión, revelada por una puntuación de 18 o más en el test SYFPEITHI, a dos o más alelos de HLA-DR comunes. Los alelos de HLA-DR más comunes se describen en la tabla 7. Los locus de HLA-A y HLA-DR se encuentran en combinaciones de desequilibrio de unión de HLA-A2 y HLA-DR específico que se favorecen en comparación con otros. Los genotipos de HLA-DR de los tumores de origen se analizaron y se confirmó que, en ambos casos, se trataba de los HLA-DRB1*11 y DRB1*15. En la tabla 4 se describen los residuos de aminoácidos conservados preferidos para los alelos de HLA de clase II más comunes (DRB1*0101, DRB1*0301, DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, and DRB1*1501). Por ejemplo, el alelo de HLA de clase II DRB1*0301 une preferentemente en su surco de unión péptidos que muestran residuos específicos de aminoácidos en las posiciones 1, 4, 6 y 9 del extremo N- a C-terminal de la secuencia central de cualquier péptido dado. Concretamente, el DRB1*0301 muestra una buena unión si la secuencia central del péptido tiene un residuo de glutamato (D) en la posición 4; L, I, F, M o V en la posición 1; K, R, E, Q o N en la posición 6 y Y, L o F en la
posición 9.

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TABLA 4 Motivos peptídicos de alelos HLA-DR comunes

Se describen aminoácidos conservados en un código de letras en las cavidades de unión correspondientes.

8

9

Los resultados de los análisis in silicio basados en algoritmos hechos por ordenador para la predicción de la interacción entre moléculas de HLA y secuencias de péptidos proporcionados a través de www.syfpeithi.de indican que el péptido MMP7_{247-262} de SEQ ID n.º 1 se une de forma promiscua a varios alelos de HLA-DR. En conformidad con los resultados del análisis predictivo, la puntuación de unión del péptido con SEQ ID n.º 1 es alta para la interacción con DRB1*1101, DRB1*1501, DRB1*0401, DRB1*0301 y DRB1*0101 (tabla 7). Los alelos de HLA-DR analizados en este test para la interacción con la secuencia de aminoácidos cubre, al menos, un 69,6% de la población caucásica con HLA-A2 positivo (Mori M, Beatty P. G, Graves M, Boucher K. M, Milford E. L; HLA gene and haplotype frequencies in the North American population: the National Marrow Donor Program Donor Registry; "Transplantation"; 1997; 64 (7): 1017-27). Teniendo en cuenta que no hay datos de frecuencia disponibles para el HLA-DR15, el alelo no se tuvo en cuenta para calcular la cobertura resultante de la población caucásica con HLA-A2 positivo. Por lo tanto, es muy probable que con la SEQ ID n.º 1, la cobertura de la población se aún mayor de 69,6%, lo que indica que el péptido tiene una excelente perspectiva de servir como candidato para el desarrollo de preparaciones farmacéuticas para la mayoría de pacientes de cáncer.

Sin embargo, la aplicación de los algoritmos de predicción sólo lleva a resultados concluyentes si los resultados de los análisis in silicio se combinan con la confirmación experimental de la unión promiscua, como se ha demostrado con estudios anteriores, que no pudieron mostrar respuestas inmunes desencadenadas por una secuencia de péptidos que se suponía buen agente de unión (Bohm C. M, Hanski M. L, Stefanovic S, Rammensee H. G, Stein H, Taylor-Papadimitriou J, Riecken E. O, Hanski C; Identification of HLA-A2-restricted epitopes of the tumor-associated antigen MUC2 recognized by human cytotoxic T-cells; "Int J Cancer"; 1998; 75 (5): 688-93). La predicción de productos como los mencionados en el caso anterior no puede descartarse, ya que los algoritmos usados para la predicción no tienen en cuenta que una secuencia de péptidos no se genera necesariamente en una situación in vivo (dentro de células vivas). La confirmación experimental se puede obtener mediante la recopilación de datos in vitro de pruebas biológicas como, por ejemplo, la demostración de la presencia o falta de inmunogenicidad de un péptido. Por lo tanto, se obtuvo la confirmación experimental de la unión promiscua de la SEQ ID n.º 1 mediante la recopilación de dichos datos in vitro. Para probar la capacidad inmuno-estimuladora de los péptidos por medio de experimentos de sensibilización in vitro de linfocitos T, se usaron las variantes más cortas ("secuencia central") de los péptidos IGFBP3, IGFBP3_{169-181}, y del péptido MMP7, MMP7_{247-262}.

Con el fin de generar linfocitos T CD4^{+} específicos de antígeno y de probar la unión promiscua de los péptidos, se estimularon PBMC de 4 donantes sanos con alelos HLA-DR diferentes (figura 2), uno de ellos con DRB1*1101, usando células dendríticas autólogas sensibilizadas de forma reiterada con el péptido. Además, como control positivo se usó el péptido CCND1_{198-212}, un conocido epítopo de linfocito T (Dengjel J, Decker P, Schoor O, Altenberend F, Weinschenk T, Rammensee H. G y Stevanovic S; 2004; Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry; "Eur. J. Immunol." 34: 3644-3651). Como sistema de lectura para la generación de linfocitos T CD4^{+} específicos de antígeno, se calcularon los niveles de IFNá mediante citometría de flujo. Los linfocitos T se analizaron, después de las estimulaciones semanales tercera y cuarta mediante tinción de IFNá intracelular, CD4-FITC y CD8-PerCP, para determinar el porcentaje de células productoras de IFNá en subpoblaciones de linfocitos T específicas. En todos los experimentos se efectuaron estimulaciones con péptidos irrelevantes y sin péptidos como controles negativos. La respuesta de IFNá se consideró positiva cuando el porcentaje de linfocitos T CD4^{+} productores de IFNá fue dos veces mayor en comparación con los controles negativos (Horton H, Russell N, Moore E, Frank I, Baydo R, Havenar-Daughton C, Lee D, Deers M, Hudgens M, Weinhold K y Mc Elrath M. J; 2004; Correlation between interferon- gamma secretion and cytotoxicity, in virus-specific memory T-cells; "J. Infect. Dis." 190: 1692-1696).

En tres donantes de cuatro, los inventores pudieron generar linfocitos T CD4^{+} específicos para ambos péptidos (figura 2). Después de las estimulaciones, no se observaron respuestas de linfocitos T en el donante 4. En el donante 1 se detectó un porcentaje de 0,05 a 0,1 de linfocitos T CD4^{+} productores de IFNá (figura 3) en los siete intentos de estimulación tras la tercera estimulación con el péptido IGFBP3_{169-181}. Estos linfocitos T pudieron expandirse, en la mayoría de los casos, a un porcentaje de entre 0,09 y 0,13 mediante una ronda adicional de estimulación. Los linfocitos T CD4^{+} productores de IFNá específicos para el péptido IGFBP3_{169-181} también se observaron en los donantes 2 y 3, con frecuencias máximas de linfocitos T CD4^{+} productores de IFNá de 0,05% y 0,07%.

Los donantes 1, 2 y 3 también mostraron linfocitos T CD4^{+} reactivos al péptido MMP7_{247-262}. Las frecuencias más altas de linfocitos T CD4^{+} productores de IFNá específicas para el péptido MMP7 se encontraron en los donantes 1 y 2, respectivamente. Los donantes 1, 2 y 3 mostraron respuestas IFNá al péptido CCND1_{198-212}, que ya había sido descrito como un epítopo de linfocito T con restricción de MHC de clase II (Dengjel J, Decker P, Schoor O, Altenberend F, Weinschenk T, Rammensee H. G y Stevanovic S; 2004; Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry; "Eur. J. Immunol." 34: 3644-3651).

Así, los péptidos de IGFBP3, MMP7 y CCND1 son agentes de unión promiscuos de HLA de clase II capacer de provocar respuestas de linfocitos T CD4^{+} en tres de cuatro donantes sanos con alelos HLA DR diferentes. Si se comparan los alelos HLA de los dos pacientes con tumor de los que derivan los péptidos IGFBP3 y MMP7 con los de los cuatro donantes sanos, resulta obvio que los péptidos son presentados por HLA-DRB1*01, HLA-DRB1*04 y HLA-DRB1*11. Los tres alotipos HLA DR mencionados anteriormente tienen un residuo de glicina en la posición 86 y un residuo de ácido aspártico en la posición 57 de sus cadenas \hat{a}, respectivamente (véase www.anthonynolan.com/HIG). Por lo tanto, sus características de unión para las cavidades de unión P1 y P9 son muy similares (Rammensee H. G, Bachmann J y Stevanovic S; 1997; MHC Ligands and Peptide Motifs. "Springer-Verlag", Heidelberg, Alemania). Ocurre lo mismo con el péptido CCND1_{198-212}, un epítopo de linfocito T que se sabe que es presentado por HLA-DRB1*0401 y HLA-DRB1*0408 (Dengjel J, Decker P, Schoor O, Altenberend F, Weinschenk T, Rammensee H. G y Stevanovic S; 2004; Identification of a naturally processed cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination of HLA class II targeting and differential mass spectrometry; "Eur. J. Immunol." 34: 3644-3651). El donante 4 porta HLA-DRB1*0318 y HLA-DRB1*1401, alelos con motivos peptídicos que difieren en la secuencia primaria de aminoácidos de sus cadenas \hat{a} de las descritas más arriba. Esto podría explicar por qué no fue posible provocar respuestas de linfocitos T contra los dos péptidos usando células de este donante.

Resulta interesante que los linfocitos T citotóxicos CD8^{+} productores de IFNá se detectasen en dos donantes tras estimulaciones con los tres péptidos, en particular en el donante 3, pero también, en menor medida, en el donante 1 (no se muestran datos).

TABLA 5

10

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TABLA 6

11

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Tabla 6: Frecuencias de haplotipo de población caucásica norteamericana. Se muestran los haplotipos serológicos. "n.a." significa "no asignado".

Tabla 7: Puntuaciones de unión de la SEQ ID n.º 1 a alelos comunes HLA-DR.

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Se muestran las puntuaciones de unión SYFPEITHI de las SEQ ID n.º 1 y SEQ ID n.º 25 para los alelos HLA-DRB1 más comunes en poblaciones caucásicas. Las frecuencias de los correspondientes haplotipos serológicos de caucásicos HLA-A2^{+} se dan entre paréntesis. Se considera que los péptidos se unen suficientemente bien a una molécula HLA de clase II si la puntuación es igual o mayor que 18.

12

<110> Immatics biotechnologies GmbH

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<120> Péptidos asociados a tumores unidos promiscuamente a moléculas de antígeno de leucocito humano (HLA) de clase II

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<130> FB15795ES/B

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<160> 79

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<170> Versión PatentIn 3.3

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<210> 1

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 1

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13

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<210> 2

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 2

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14

\hskip1.1cm

140

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<210> 3

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 3

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15

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<210> 4

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 4

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16

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<210> 5

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 5

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17

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<210> 6

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 6

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18

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<210> 7

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 7

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19

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<210> 8

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<211> 21

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 8

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20

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<210> 9

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 9

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21

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<210> 10

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 10

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22

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<210> 11

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 11

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23

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<210> 12

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<211> 20

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 12

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24

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<210> 13

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 13

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25

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<210> 14

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<211> 13

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 14

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26

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<210> 15

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<211> 15

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 15

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27

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<210> 16

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 16

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28

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<210> 17

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 17

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29

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<210> 18

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 18

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30

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<210> 19

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<211> 12

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 19

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31

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<210> 20

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 20

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32

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<210> 21

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<211> 14

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 21

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33

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<210> 22

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 22

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34

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<210> 23

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 23

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35

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<210> 24

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 24

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36

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<210> 25

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 25

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37

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<210> 26

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 26

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38

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<210> 27

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<211> 18

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 27

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<210> 28

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<211> 16

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 28

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<210> 29

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<211> 17

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<212> PRT

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<213> Homo sapiens

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<400> 29

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<210> 30

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<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 30

\hskip1cm

42

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 31

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 31

\hskip1cm

43

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 32

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 32

\hskip1cm

44

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 33

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 33

\hskip1cm

45

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 34

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 34

\hskip1cm

46

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 35

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 35

\hskip1cm

47

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 36

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 36

\hskip1cm

48

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 37

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 37

\hskip1cm

49

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 38

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 38

\hskip1cm

50

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 39

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 39

\hskip1cm

51

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 40

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 40

\hskip1cm

52

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 41

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 17

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 41

\hskip1cm

53

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 42

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 42

\hskip1cm

54

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 43

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 43

\hskip1cm

55

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 44

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 44

\hskip1cm

56

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 45

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 45

\hskip1cm

57

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 46

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 46

\hskip1cm

58

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 47

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 47

\hskip1cm

59

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 48

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 48

\hskip1cm

60

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 49

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 49

\hskip1cm

61

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 50

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 50

\hskip1cm

62

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 51

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 51

\hskip1cm

63

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 52

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 52

\hskip1cm

64

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 53

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 53

\hskip1cm

65

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 54

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 54

\hskip1cm

66

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 55

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 55

\hskip1cm

67

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 56

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 56

\hskip1cm

68

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 57

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 20

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 57

\hskip1cm

69

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 58

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 58

\hskip1cm

70

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 59

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 59

\hskip1cm

71

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 60

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 23

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 60

\hskip1cm

72

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 61

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 61

\hskip1cm

73

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 62

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 62

\hskip1cm

74

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 63

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 63

\hskip1cm

75

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 64

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 64

\hskip1cm

76

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 65

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 65

\hskip1cm

77

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 66

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 66

\hskip1cm

78

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 67

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 12

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 67

\hskip1cm

79

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 68

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 13

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\newpage

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 68

\hskip1cm

80

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 69

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 25

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 69

\hskip1cm

81

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 70

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 22

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 70

\hskip1cm

82

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 71

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 71

\hskip1cm

83

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 72

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 72

\hskip1cm

84

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 73

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 73

\hskip1cm

85

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 74

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 74

\hskip1cm

86

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 75

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 14

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 75

\hskip1cm

87

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 76

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 19

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 76

\hskip1cm

88

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 77

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 21

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 77

\hskip1cm

89

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 78

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 15

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 78

\hskip1cm

90

\vskip0.400000\baselineskip

<210> 79

\vskip0.400000\baselineskip

<211> 16

\vskip0.400000\baselineskip

<212> PRT

\vskip0.400000\baselineskip

<213> Homo sapiens

\vskip1.000000\baselineskip

\vskip0.400000\baselineskip

<400> 79

\hskip1cm

91

Claims (22)

1. Un péptido asociado a tumor de entre 9 y 30 aminoácidos que comprende una secuencia conforme a la secuencia SEQ ID n.º 4.

2. Un péptido asociado a tumor de entre 9 y 30 aminoácidos que comprende una secuencia conforme a la secuencia SEQ ID n.º 4, en donde uno o dos de los residuos de aminoácido son alterados mediante el reemplazo de la cadena lateral del mismo con la cadena lateral de otro residuo natural de aminoácido, de forma que el péptido todavía es capaz de unirse a una molécula HLA de la misma forma que el mencionado péptido conforme a la secuencia SEQ ID n.º 4.

3. El péptido asociado a tumor conforme a la reivindicación 1, donde el péptido consta de la secuencia de aminoácidos conforme a la secuencia SEQ ID n.º 4.

4. El péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el péptido incluye enlaces no peptídicos.

5. El péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde el péptido es una proteína de fusión que, en particular, comprende aminoácidos N-terminal de la cadena invariante (Ii) asociada a un antígeno HLA-DR.

6. Un ácido nucleico constituido por una secuencia que codifica un péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5.

7. El ácido nucleico conforme a la reivindicación 6 que es ADN, ADNc, PNA, CNA, RNA o combinaciones de los mismos.

8. Un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 6 ó 7.

9. Una célula huésped que comprende un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 6 ó 7 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 8.

10. La célula huésped conforme a la reivindicación 9 que es un RCC recombinado o una célula Awells.

11. Un método de producción de un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, método que comprende el cultivo de la célula huésped conforme a la reivindicaciones 9 o 10, y de aislamiento del péptido de la célula huésped mencionada o de su medio de cultivo.

12. Una composición farmacéutica que comprende un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, un ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 6 ó 7 o un vector de expresión conforme a la reivindicación 8, y un portador farmacéuticamente aceptable.

13. La composición farmacéutica conforme a la reivindicación 12 que comprende al menos un péptido adicional asociado a tumor de entre 9 y 30 aminoácidos que comprende al menos una secuencia conforme a las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 3 y SEQ ID n.º 5 a SEQ ID n.º 49.

14. La composición farmacéutica conforme a las reivindicaciones 12 o 13 en forma de una vacuna contra el cáncer, que opcionalmente comprende, al menos, un adyuvante apropiado.

15. Un método in vitro para producir linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, método que comprende el contacto de los CTL in vitro con moléculas humanas MHC de clase II con carga de antígenos expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada durante un periodo de tiempo suficiente para activar los mencionados CTL de una forma específica de antígeno, donde el antígeno mencionado es un péptido conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

16. El método conforme a la reivindicación 15, donde el antígeno mencionado se carga en moléculas MHC de clase II expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada mediante el contacto de una cantidad suficiente del antígeno mencionado con una célula presentadora de antígeno.

17. El método conforme a la reivindicación 15, donde la célula presentadora de antígeno mencionada comprende un vector de expresión conforme a la reivindicación 8.

18. El método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 15 a 17 donde la molécula MHC de clase II es HLA-DRB1*0101.

19. Los linfocitos T citotóxicos (CTL) activados, producidos mediante el método conforme a cualquiera de las reivindicaciones 15 a 18, que reconocen de forma selectiva una célula que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3.

20. Un receptor de linfocitos T (TCR) que reconoce una célula que expresa de manera aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, o pudiéndose obtener el TCR del linfocito T citotóxico (CTL) de la reivindicación 19.

21. Un ácido nucleico que codifica un receptor de linfocitos T (TCR) conforme a la reivindicación 20.

22. Un vector de expresión capaz de expresar un receptor de linfocitos T (TCR) conforme a la reivindicación 20.