ES2302546T3 - Peptidos asociados a tumores, que se enlazan a diferentes antigenos de leucocitos humanos (hla) de la clase ii. - Google Patents
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Abstract
Un péptido asociado a un tumor de entre 9 y 30 aminoácidos que comprende una secuencia conforme a la SEQ ID 43.
Description
Péptidos asociados a tumores, que se enlazan a
diferentes antígenos de leucocitos humanos (HLA) de la clase II.
La presente invención se refiere a métodos
inmunoterapéuticos y a moléculas y a células para su uso en métodos
inmunoterapéuticos. En concreto, la presente invención se refiere a
la inmunoterapia del cáncer y, en particular, al cáncer renal y de
colon. La presente invención se refiere, además, a epítopos
peptídicos de linfocitos T cooperadores asociados a tumores, solos
o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, que actúan
como ingredientes activos de vacunas que estimulan las respuestas
inmunitarias contra los tumores. En particular, la presente
invención se refiere a novedosas secuencias peptídicas derivadas de
moléculas HLA de clase II de líneas celulares tumorales humanas,
que pueden ser usadas en la composición de vacunas para provocar
respuestas inmunitarias antitumorales.
La estimulación de una respuesta inmunitaria
depende de la presencia de antígenos, reconocidos como extraños por
el sistema inmunitario huésped. El descubrimiento de la existencia
de antígenos asociados a tumores ha abierto la posibilidad de
utilizar un sistema inmunitario del huésped para intervenir en el
crecimiento del tumor. En la inmunoterapia del cáncer, actualmente
se están explorando diversos mecanismos que utilizan las ramas
humorales y celulares del sistema inmunitario.
Determinados elementos de la respuesta
inmunitaria celular son capaces de reconocer y destruir de forma
específica células tumorales. El aislamiento de linfocitos T
citotóxicos de poblaciones de células destructoras de tumores o de
sangre periférica sugiere que estos linfocitos tienen un papel
importante en la defensa inmunitaria natural contra el cáncer
(Cheever y col, "Annals N.Y. Acad. Sci." 1993 690:
101-112). En particular, los linfocitos T CD8^{+}
(TCD8^{+}), que reconocen péptidos que alojan moléculas de clase I
del complejo principal de histocompatibilidad (MHC) de,
normalmente, 8 a 10 residuos derivados de proteínas ubicadas en el
citosol, tienen un papel importante en esta respuesta. Las
moléculas MHC humanas también se conocen como antígenos de
leucocito humano (HLA).
Existen dos clases de moléculas MHC: las
moléculas MHC de clase I, que se encuentran en la mayoría de las
células con un núcleo con péptidos resultantes de la división
proteolítica de proteínas endógenas y péptidos más largos; las
moléculas MHC de clase II, que sólo se encuentran en células
profesionales presentadoras de antígenos (APC). Presentan péptidos
de proteínas exógenas que son absorbidos por las APC durante el
proceso de endocitosis y, posteriormente, son procesadas. Los
complejos de péptido y los MHC de clase I son reconocidos por
linfocitos T citotóxicos CD8^{+}. Los complejos de péptido y los
MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T cooperadores
CD4^{+}.
Los linfocitos T cooperadores CD4^{+} tienen
un papel importante en la organización de las funciones efectoras
de las respuestas antitumorales de los linfocitos T y, por esta
razón, la identificación de epítopos de linfocitos T CD4^{+}
derivados de antígenos asociados a tumores (TAA) puede ser de gran
importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos que
desencadenen respuestas inmunitarias antitumorales (Kobayashi H, R.
Omiya, M. Ruiz, E. Huarte, P. Sarobe, J. J. Lasarte, M. Herraiz, B.
Sangro, J. Prieto, F. Borras-Cuesta y E. Celis;
2002; Identification of an antigenic epitope for helper T
lymphocytes from carcinoembryonic antigen; "Clin. Cancer
Res"; 8: 3219-3225. Gnjatic, S, D. Atanackovic,
E. Jäger, M. Matsuo, A. Selvakumar, N. K. Altorki, R. G. Maki, B.
Dupont, G. Ritter, Y. T. Chen, A. Knuth y L. J. Old; 2003; Survey
of naturally occurring CD4+ T-cell responses
against NY-ESO-1 in cancer
patients: Correlation with antibody responses; "Proc.
Natl. Acad. Sci. U.S.A"; 100 (15): 8862-7).
En muestras de mamíferos como, por ejemplo,
ratones, se demostró que, incluso en ausencia de linfocitos T
citotóxicos (CTL) efectores (es decir, de linfocitos T CD8^{+}),
los linfocitos T CD4^{+} son suficientes para inhibir la
visualización de tumores por medio de la inhibición de la
angiogénesis por secreción de interferón-\gamma
(IFN\gamma) (Qin, Z. y T. Blankenstein; 2000; CD4+
T-cell-mediated tumor rejection
involves inhibition of angiogenesis that is dependent on IFN gamma
receptor expression by nonhematopoietic cells; "Immunity";
12: 677-686). Adicionalmente, se demostró que los
linfocitos T CD4^{+} que reconocen péptidos de antígenos
asociados a tumores presentados por moléculas HLA de clase II pueden
contrarrestar la progresión del tumor por medio de la inducción de
un anticuerpo (Ab) (Kennedy, R. C, M. H. Shearer, A. M. Watts y R.
K. Bright; 2003; CD4^{+} T lymphocytes play a critical role in
antibody production and tumor immunity against simian virus 40
large tumor antigen. "Cancer Res." 63:
1040-1045). A diferencia de los péptidos asociados
a tumores unidos a moléculas HLA de clase I, hasta ahora sólo se han
descrito un pequeño número de ligandos de TAA de clase II
(www.cancerimmunity.org, www.syfpeithi.de). Debido a que la
expresión constitutiva de moléculas HLA de clase II normalmente
está limitada a células del sistema inmunitario (Mach, B, V.
Steimle, E. Martinez-Soria y W. Reith; 1996;
Regulation of MHC class II genes: lessons from a
disease; "Annu. Rev. Immunol."; 14:
301-331), no se consideró posible el aislamiento de
péptidos de clase II directamente de tumores primarios. Por lo
tanto, se han descrito numerosas estrategias para concentrar
antígenos en la vía de procesamiento de clase II de células
presentadoras de antígenos (APC). Por ejemplo, la incubación de APC
con el antígeno en cuestión para permitir que sea absorbido,
procesado y presentado (Chaux, P, V. Vantomme, V. Stroobant, K.
Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon y P.
van der Bruggen; 1999; Identification of MAGE-3
epitopes presented by HLA-DR molecules to CD4(+) T
lymphocytes; "J. Exp. Med."; 189:
767-778); o la transfección de células con genes o
minigenes codificantes del antígeno en cuestión y fusionados con la
cadena invariante, que media en la translocación de antígenos al
compartimento lisosomal de procesamiento y unión del MHC de clase
II (MIIC).
Para que un péptido provoque una respuesta
inmunitaria celular, debe estar unido a una molécula MHC. Este
proceso depende del alelo de la molécula MHC y de polimorfismos
específicos de la secuencia de los aminoácidos del péptido. Los
péptidos de unión a moléculas MHC de clase I suelen tener una
longitud de 8 a 10 residuos y contienen dos residuos
("anclaje") conservados en su secuencia que interaccionan con
el surco de unión correspondiente de la molécula MHC.
En ausencia de inflamación, la expresión de
moléculas MHC de clase II está restringida principalmente a células
del sistema inmunitario, especialmente a células profesionales
presentadoras de antígenos (APC) como, por ejemplo, monocitos,
células derivadas de monocitos,, macrófagos o células
dendríticas.
Los antígenos que son reconocidos por los
linfocitos T citotóxicos específicos del tumor, es decir, sus
epítopos, pueden ser moléculas derivadas de cualquier tipo de
proteína como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc.
Además, los antígenos asociados a tumores, por ejemplo, pueden estar
presentes sólo en células tumorales, como productos de genes
mutados o a partir de marcos de lectura abiertos (ORF) alternativos
o del empalme de proteínas (Vigneron, N, V. Stroobant, J. Chapiro,
A, Ooms, G. Degiovanni, S. Morel, P. van der Bruggen, T. Boon, B.
J. van den Eynde; An antigenic peptide produced by peptide
splicing in the proteasome; "Science"; 23 de abr. 2004;
304 (5670): 587-90). Otra clase importante de
antígenos asociados a tumores son las estructuras específicas de
tejidos, como los antígenos CT (testículo canceroso) que son
expresados en distintos tipos de tumor y en tejido sano del
testículo.
testículo.
Se han identificado diversos antígenos asociados
a tumores. Además, se están dedicando muchos esfuerzos a la
identificación de antígenos adicionales asociados a tumores. Algunos
grupos de antígenos asociados a tumores, también llamados por los
expertos "antígenos específicos tumorales", son específicos de
los tejidos. Algunos ejemplos incluyen, sin limitarse a ellos, la
tirosinasa para el melanoma, el PSA y PSMA para el cáncer de
próstata y los cruzamientos cromosómicos, como el bcr/abl, en el
linfoma. Sin embargo, muchos de los antígenos asociados a tumores
que se han identificado tienen lugar en muchos tipos de tumores y,
algunos, como las proteínas oncógenas y/o los genes supresores
tumorales (los genes supresores tumorales para el cáncer renal, por
ejemplo, son analizados en Linehan, W. M, M. M. Walther, B. Zbar;
The genetic basis of cancer of the kidney; "J Urol";
dic. 2003;170 (6 Pt 1): 2163-72), que son los que
realmente causan el evento de transformación, tienen lugar en casi
todos los tipos de tumores. Por ejemplo, las proteínas celulares
normales que controlan el crecimiento y la diferenciación celular,
como las p53 (que es un ejemplo de gen supresor tumoral), ras,
c-met, myc, pRB, VHL y HER-2/neu,
pueden acumular mutaciones y resultar en una regulación hacia arriba
de la expresión de estos productos genéticos, transformándolos así
en oncógenos (McCartey y col; "Cancer Research"; 1998; 15: 58
2601-5. Disis y col; "Ciba Found. Symp"; 1994;
187: 198-211). Estas proteínas mutantes pueden ser
el blanco de una respuesta inmunitaria específica tumoral en muchos
tipos de cáncer.
Para que las proteínas puedan ser reconocidas
por los linfocitos T citotóxicos como antígenos específicos
tumorales y para que se puedan utilizar en una terapia, deben
cumplirse una serie de requisitos previos. El antígeno debe estar
expresado principalmente por células tumorales, y no por tejidos
sanos normales o en cantidades más bien pequeñas. También es
deseable, no sólo que el antígeno correspondiente esté presente en
un tipo de tumor, sino que, además, aparezca en concentraciones
altas (en número de copias por célula, por ejemplo). La presencia
de epítopos en la secuencia de aminoácidos del antígeno es esencial,
ya que el péptido ("péptido inmunógeno") que deriva de un
antígeno asociado a un tumor debe inducir una respuesta de los
linfocitos T in vitro o in vivo.
Hasta ahora, se han descrito numerosas
estrategias para concentrar antígenos en la vía de procesamiento de
clase II. Es posible incubar células presentadoras de antígenos
(APC) con el antígeno deseado para que sea absorbido y procesado
(Chaux, P, V. Vantomme, V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R.
Luiten, A. M. Eggermont, T. Boon y P. van der Bruggen; 1999; J.
Exp. Med; 189, 767-778). Otras estrategias usan
las proteínas de fusión, que contienen secuencias blanco
lisosomales. Expresadas en APC, estas proteínas de fusión dirigen a
los antígenos al compartimento de procesamiento de clase II (Marks,
M. S, P. A. Roche, E. van Donselaar, L. Woodruff, P. J. Peters y J.
S. Bonifacino; 1995; J. Cell Biol; 131,
351-369. Rodriguez, F, S. Harkins, J. M. Redwine,
J. M. de Pereda y J. L. Whitton; 2001; J. Virol; 75,
10421-10430).
El documento WO 03/068940 describe complejos de,
al menos, dos polipéptidos, así como métodos de utilización de los
mismos para, por ejemplo, ocultar agentes que deterioran a los
complejos de polipéptidos, métodos de determinación de la expresión
alterada de un polipéptido en un sujeto y métodos de tratamiento y
prevención de trastornos relacionados con niveles alterados de
complejo o polipéptido. La estrategia general del documento WO
03/068940 es identificar interacciones críticas de proteínas
hospedadoras del VPH, ya que éste es el agente causante del
carcinoma de cuello uterino. Éste documento no describe la SEQ. ID
n.º 55 como antígeno asociado a un tumor.
En la inmunización contra los tumores, los
linfocitos T colaboradores desempeñan una función importante en la
organización de la función efectora de los CTL. Los epítopos de
linfocitos T colaboradores que desencadenan una respuesta de los
linfocitos T colaboradores del tipo TH1 apoyan las funciones
efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8^{+}, que incluyen
funciones citotóxicas dirigidas contra células tumorales que
presentan complejos MHC/péptidos asociados a tumores en sus
superficies. De esta forma, los epítopos peptídicos de linfocitos T
cooperadores asociados a tumores, solos o en combinación con otros
péptidos asociados a tumores, pueden actuar como ingredientes
activos de las vacunas que estimulen las respuestas inmunitarias
contra los tumores.
La tarea principal en el desarrollo de una
vacuna tumoral es, por tanto, la identificación y caracterización
de nuevos antígenos asociados a tumores y epítopos inmunógenos de
linfocitos T colaboradores derivados de ellos que puedan ser
reconocidos por linfocitos T citotóxicos CD4^{+}. Un objeto de la
presente invención es, por tanto, proporcionar novedosas secuencias
de aminoácidos para el péptido que tiene la habilidad de unirse a
una molécula del complejo principal de histocompatibilidad (MHC)
humano de clase II.
Conforme a la presente invención, este objetivo
se consigue con un péptido asociado a un tumor de entre 9 y 30
aminoácidos que comprenda una secuencia conforme a la SEQ ID n.º 43
de la lista de secuencias adjunta, en donde el péptido tiene la
habilidad de unirse a una molécula del complejo mayor de
histocompatibilidad (MHC) humano de clase II, siempre que el
péptido no sea el polipéptido asociado a un tumor humano
intacto.
En la presente invención, los inventores
demuestran que es posible aislar y caracterizar péptidos unidos a
moléculas HLA de clase II directamente, a partir de tumores de
mamíferos, preferiblemente humanos y sólidos como, por ejemplo, de
carcinomas de células renales y carcinomas de colon. Los monocitos
infiltrados expresaban moléculas MHC de clase II así como células
tumorales y, además, las células tumorales mostraban una regulación
hacia arriba de varios productos génicos inducidos por citocina o
quimiocina como, por ejemplo, productos génicos inducidos por
interferón-\gamma.
La presente invención proporciona péptidos
provenientes de antígenos asociados a la oncogenia y con la
habilidad de unirse a moléculas HLA de clase II para desencadenar
una respuesta inmunitaria de leucocitos humanos, especialmente
linfocitos T o linfocitos T CD4^{+} o linfocitos T CD4^{+}
mediadores de respuestas inmunitarias de tipo TH1. Los péptidos
provienen de antígenos asociados a tumores, especialmente con
funciones en los procesos de, por ejemplo, proteólisis,
angiogénesis, crecimiento celular, regulación de ciclo celular,
división celular, regulación de la transcripción, regulación del
traslado o invasión tisular. Se describen otros péptidos asociados
a tumores a partir de la metaloproteinasa 7 de la matriz (MMP7; SEQ
ID No. 1) y de la proteína de unión 3 del factor de crecimiento
similar a la insulina (IGFBP3; SEQ ID No. 25).
En la presente invención, los inventores también
proporcionan pruebas definitivas de que los péptidos asociados a
tumores enlazados de forma indiscriminada moléculas HLA de clase II,
especialmente a los alelos HLA de clase II codificados
genéticamente por locus HLA-DR del genoma humano,
son capaces de provocar respuestas inmunitarias mediadas por
linfocitos T CD4^{+} humanos. Se han aislado linfocitos T
CD4^{+} de sangre periférica humana, demostrándose que los
péptidos en cuestión son adecuados para desencadenar respuestas de
linfocitos T del sistema inmunitario humano contra péptidos
seleccionados del peptidoma de la célula tumoral. Teniendo en cuenta
que los péptidos pueden ser sintetizados químicamente y usados como
ingredientes activos de preparaciones farmacéuticas, los péptidos
proporcionados por la presente invención pueden ser usados para
inmunoterapia, preferiblemente para inmunoterapia del cáncer.
Con el fin de identificar ligandos de HLA de
clase II de TAA para el desarrollo de la inmunoterapia basada en
péptidos, los inventores intentaron aislar péptidos presentados por
HLA-DR directamente a partir de tumores sólidos
diseccionados, en particular de carcinoma de células renales (RCC),
de los que se ha informado que pueden expresar moléculas de clase
II (Gastl, G, T. Ebert, C. L. Finstad, J. Sheinfeld, A. Gomahr, W.
Aulitzky y N. H. Bander; 1996; Major histocompatibility complex
class I and class II expression in renal cell carcinoma and
modulation by interferon gamma; "J. Urol." 155:
361-367). Incluso si la mayoría de las células
tumorales fueran de clase II negativa, los espectómetros de masas
más modernos deberían proporcionar la sensibilidad requerida para
identificar péptidos de clase II a partir de números mínimos de
células tumorales o de leucocitos de infiltración que puedan
presentar de forma cruzada TAA o de células del estroma en el
perímetro del tumor en crecimiento.
Las razones para centrarse en el RCC para
demostrar técnicamente el concepto fueron las siguientes: alrededor
de 150.000 personas en todo el mundo son diagnosticadas cada año de
RCC. La enfermedad está asociada a una elevada tasa de mortalidad
que resulta en, aproximadamente, 78.000 muertes al año (C. P.
Pavlovich y L. S. Schmidt; 2004; Searching for the hereditary
causes of renal-cell carcinoma; "Nat. Rev.
Cancer" 4: 381-393). Si se diagnostican
metástasis, el índice de supervivencia de un año disminuye a,
aproximadamente, un 60% (A. Jemal, R. C. Tiwari, T. Murray, A.
Ghafoor, A. Samuels, E. Ward, E. J. Feuer y M. J. Thun; 2004;
Cancer statistics, 2004; "CA Cancer J. Clin." 54:
8-29), lo que subraya la gran necesidad médica sin
cubrir. Debido a que el RCC parece ser un tumor inmunógeno (Oliver
R. T. D, A. Mehta, M. J. Barnett; A phase 2 study of
surveillance in patients with metastatic renal cell carcinoma and
assessment of response of such patients to therapy on
progression; "Mol Biother"; 1988; 1: 14-20.
Gleave, M, M. Elhilali, Y. Frodet y col; Interferon
gamma-1b compared with placebo in metastatic renal
cell carcinoma; "N Engl J Med"; 1998; 338: 1265), como
indica la existencia de CTL reactivos ante tumores y destructores
de tumores (Finke, J. H, P. Rayman, J. Alexander, M. Edinger, R. R.
Tubbs, R. Connelly, E. Pontes y R. Bukowski; 1990;
Characterization of the cytolytic activity of
CD4-positiveand CD8-positive
tumor-infiltrating lymphocytes in human renal cell
carcinoma; "Cancer Res"; 50: 2363-2370), se
han iniciado ensayos clínicos para desarrollar vacunas contra
tumores basadas en péptidos (Wierecky J, M. Mueller y P. Brossart;
Dendritic cell-based cancer immunotherapy
targeting MUC-1; "Cancer Immunol
Immunother"; 28 de abr. 2005). Sin embargo, debido a la falta de
epítopos de linfocitos T colaboradores de TAA, las vacunas definidas
molecularmente suelen comprender péptidos que funcionan sólo como
ligandos de clase I.
Durante el trabajo científico de preparación de
la presente invención, los inventores pudieron aislar ligandos de
clase II de diez muestras de RCC, tres carcinomas colorrectales
(CCA) y un carcinoma de células transicionales (TCC, carcinoma
urotelial). Solo algunos ligandos seleccionados de TAA identificados
por medio de este enfoque poseen la capacidad de:
- 1.
- provenir de antígenos con una asociación tumoral conocida;
- 2.
- estar unidos al alelo HLA-DR de clase II más común, el HLA DRB1*0101; y
- 3.
- tener características que les diferencian de la mayoría de los ligandos de HLA de clase II, de forma que cumplen con los criterios con respecto a su secuencia de aminoácidos primaria que les permite unirse promiscuamente a moléculas HLA-DR a partir de, al menos, dos alelos diferentes.
Tal y como se ejemplificó con un péptido de
MMP7 (SEQ ID n.º 1), se descubrió que estos péptidos asociados a
tumores y unidos promiscuamente a HLA-DR son
reconocidos por linfocitos T CD4^{+}.
Un primer aspecto de la invención proporciona un
péptido que comprende una secuencia de entre 9 y 30 aminoácidos y
que comprende una secuencia conforme a la SEQ ID n.º 43.
Tal y como se describe más abajo, los péptidos
que forman la base de la presente invención han sido identificados
como presentados por células portadoras de MHC de clase II (RCC).
Por tanto, estos péptidos en particular, así como otros péptidos
que contengan la secuencia (a saber, péptidos derivados), provocarán
muy probablemente una respuesta específica de los linfocitos T, si
bien el alcance de dicha respuesta podría variar de un péptido a
otro. Podrían producirse diferencias debido a mutaciones en los
mencionados péptidos, por ejemplo (véase más abajo). El experto en
la materia conoce bien los métodos que se pueden aplicar para
determinar el alcance de una respuesta inducida por un péptido
individual, en particular con respecto a los ejemplos contenidos
aquí y en la literatura sobre la materia.
Preferentemente, un péptido conforme a la
presente invención consiste esencialmente en una secuencia de
aminoácidos conforme a cualquiera de las SEQ ID n.º 43.
"Consistir esencialmente en" significa que
un péptido conforme a la presente invención contiene, además de la
secuencia según la SEQ ID n.º 43, cadenas de aminoácidos adicionales
localizadas en el N-terminal y/o el
C-terminal que no necesariamente forman parte del
péptido que actúa como secuencia central del péptido que comprende
el motivo de unión y como epítopo inmunógeno de linfocito T
colaborador.
Sin embargo, estas cadenas pueden ser
importantes para proporcionar una introducción eficiente del péptido
en las células conforme a la presente invención. En una de las
modalidades de la invención, el péptido comprende los 80
aminoácidos N-terminales de la cadena invariante
asociada al antígeno HLA-DR (p33, en la siguiente
Ii), como se deriva del NCBI (National Center for Biotechnology
Information), número de registro del GenBank X00497 (Strubin,
M, B. Mach y E. O. Long; The complete sequence of the mRNA for
the HLA-DR-associated invariant
chain reveals a polypeptide with an unusual transmembrane
polarity; "EMBO J"; 1984; 3 [4],
869-872).
Por "variante" de la secuencia de
aminoácidos dada los inventores quieren decir que las cadenas
laterales de, por ejemplo, uno o dos de los residuos aminoácidos son
alteradas (reemplazándolas, por ejemplo, con la cadena lateral de
otro residuo natural de aminoácido u otra cadena lateral) de forma
que el péptido todavía puede unirse a una molécula HLA básicamente
de la misma forma que un péptido que consista en la secuencia de
aminoácidos dada. Por ejemplo, un péptido puede modificarse de forma
que al menos mantenga, o incluso mejore, la habilidad para
interactuar y unir una molécula MHC apropiada, como la
HLA-A, y de forma que al menos mantenga, o incluso
mejore, la habilidad para generar CTL activado que reconozca y mate
células que expresen un polipéptido que contiene una secuencia de
aminoácidos como la definida en los aspectos de la invención. Como
puede derivarse de la base de datos aquí descrita, determinadas
posiciones de péptidos de unión de HLA-A son
claramente residuos de anclaje conservados que forman una secuencia
central que se ajusta al motivo de unión del surco de unión del
HLA.
Los residuos de aminoácidos que no son
esenciales para interactuar con el receptor del linfocito T pueden
ser modificados mediante el reemplazo por otro aminoácido cuya
incorporación no afecte de forma sustancial a la reactividad del
linfocito T ni elimine la unión con el MHC relevante. Por lo tanto,
aparte de la condición dada, el péptido de la invención podrá ser
cualquier péptido (en cuya definición los inventores incluyen a los
oligopéptidos y a los polipéptidos) que incluya las secuencias de
aminoácidos o una porción o variante de las mismas, tal y como se
ha especificado.
Se sabe, además, que los péptidos presentados
por MHC de clase II están compuestos de una "secuencia
central" con un determinado motivo de aminoácidos específico de
HLA y, opcionalmente, extensiones N- y/o
C-terminales que no interfieren con la función de la
secuencia central (es decir, son consideradas irrelevantes en la
interacción del péptido y el linfocito T). Las extensiones N- y/o
C-terminales pueden tener una longitud de entre 1 y
10 aminoácidos, respectivamente. Por lo tanto, un péptido preferido
de la presente invención exhibe una longitud total de entre 9 y 30
aminoácidos. Este péptido puede ser usado o bien directamente, para
cargar moléculas MHC de clase II, o bien la secuencia puede ser
clonada en los vectores según la descripción que se detalla más
abajo. Teniendo en cuenta que estos péptidos forman el producto
final del procesamiento de péptidos más largos dentro de la célula,
también pueden usarse péptidos más largos.
Si un péptido que es mayor de unos 12 residuos
de aminoácidos es usado directamente para unirse a una molécula
MHC, se prefiere que los residuos que flanquean la región central de
unión de HLA sean los que no afecten de forma sustancial a la
habilidad del péptido de unirse específicamente al surco de unión de
la molécula MHC o de presentar al péptido al CTL. Sin embargo, tal
y como se indicó anteriormente, se apreciará que pueden usarse
péptidos más largos, especialmente si están codificados por un
polinucleótido, ya que estos péptidos más largos pueden ser
fragmentados por células presentadoras de antígenos adecuadas.
Se pueden derivar ejemplos de péptidos de
variantes, motivos y ligandos de MHC, así como determinados ejemplos
de extensiones N- y/o C-terminales derivadas de la
base de datos SYFPEITHI (Rammensee H, J. Bachmann, N. P. Emmerich,
O. A. Bachor y S. Stevanovic; SYFPEITHI: database for MHC
ligands and peptide motifs; "Immunogenetics"; noviembre de
1999; 50 [3-4]: 213-9) en
http://syfpeithi.bmi-heidelberg.com y en las
referencias allí citadas.
Algunos ejemplos de péptidos para el
HLA-DR en la base de datos son: K H K V
Y A C E V T
H Q G L S S derivado de la cadena Ig kappa
188-203 (Kovats y col; "Eur J Immunol"; abril
de 1997; 27 [4]: 1014-21); K V Q W
K V D N A L Q S G N S
derivado de la cadena Ig kappa 145-159 (Kovats y
col; "Eur J Immunol"; abril de 1997; 27 [4]:
1014-21); L P R L I A F T S
E H S H F derivado de
GAD65 270-283 (Endl y col; "J Clin Invest";
mayo de 1997; 15, 99 [10]: 2405-15) o F
F R M V I S
N P A A T H Q D I D F L I derivado de
GAD65 556-575 (Endl y col; "J Clin Invest";mayo
de 1997; 15, 99 [10]: 2405-15). Además, los
péptidos también pueden derivarse de secuencias mutadas de
antígenos, como en el caso del A T G F K Q
S S K A L Q R P V A S, derivado de la
proteína de fusión bcr-abl de 210 kD (Bosch y col;
"Blood"; noviembre de 1996; 1, 88 [9]:
3522-7), G Y K V
L V L N P
S V A A T, derivado de HCV-1 NS3
28-41 (Diepolder y col; "J Virol"; agosto de
1997; 71 [8]: 6011-9), o F R K Q N
P D I V I Q Y M D D L Y V G,
derivado de HIV-1 (HXB2) RT 326-345
(van der Burg y col; "J Immunol"; enero de 1999; 1, 162 [1]:
152-60). Todos los aminoácidos de "anclaje"
(como ejemplos de HLA-DR4, véase Friede y col;
"Biochim Biophys Acta"; Junio de 1996; 7, 1316 [2]:
85-101. Sette y col; "J Immunol"; septiembre
de 1993; 15, 151 [6]: 3163-70. Hammer y col;
"Cell"; julio de 1993; 16, 74 [1]: 197-203.
Hammer y col; "J. Exp. Med"; mayo de 1995; 1, 181 [5]:
1847-55) se han indicado en negrita y las supuestas
secuencias centrales se han subrayado.
Todos los péptidos descritos anteriormente están
englobados en el término "variantes" de la secuencia de
aminoácidos dada.
En el concepto "péptido" los inventores no
sólo incluyen moléculas en las que los residuos de aminoácidos
están unidas por enlaces peptídicos (-CO-NH-), sino
también moléculas en las que el enlace peptídico está invertido.
Estas formas retro-inverso pueden hacerse
usando métodos conocidos por los especialistas en la materia, como
los descritos por Meziere y col. (1997); "J. Immunol"; 159,
3230-3237; incluidos aquí como referencia. Este
enfoque implica hacer pseudopéptidos que contengan modificaciones en
el esqueleto y no en la orientación de las cadenas laterales.
Meziere y col. (1997) muestran que, al menos para respuestas de
linfocitos T colaboradores y MHC de clase II, estos pseudopéptidos
son útiles. Los péptidos de tipo
retro-inverso, que contienen uniones
NH-CO en lugar de uniones peptídicas
CO-NH, son mucho más resistentes a la
proteinólisis.
Normalmente, el péptido de la invención es aquel
que, si está expresado en una célula presentadora de antígenos,
puede ser procesado de forma que se produce un fragmento capaz de
unirse a una molécula MHC adecuada y puede ser presentado por la
célula apropiada y provocar una respuesta de linfocitos T adecuada.
Se apreciará que un fragmento producido a partir del péptido puede
ser también un péptido de la invención. Convenientemente, el
péptido de la invención contiene una porción que incluye la
secuencia de aminoácidos dada o una porción o variante de la misma
y otra porción más que le confiere alguna propiedad deseable. Por
ejemplo, la porción añadida puede incluir otro epítopo de linfocito
T (independientemente de que derive o no del mismo polipéptido que
la primera porción que contiene el epítopo de linfocito T) o una
proteína o un péptido portadores. Por lo tanto, en una modalidad,
el péptido de la invención es una proteína humana truncada o una
proteína de fusión de un fragmento proteínico y otra porción de
polipéptido, siempre que la porción humana incluya una o más
secuencias de aminoácidos de invención.
En una modalidad especialmente preferida, el
péptido de la invención incluye la secuencia de aminoácidos de la
invención y, al menos, un epítopo de linfocito T más, en donde el
epítopo de linfocito T es capaz de facilitar la producción de una
respuesta del linfocito T dirigida al tipo de tumor que expresa de
forma aberrante un antígeno asociado a un tumor. Por lo tanto, los
péptidos de la invención incluyen las llamadas "cadenas perladas
de polipéptidos" que también pueden ser usadas como vacunas.
Se apreciará que, en algunas aplicaciones, los
péptidos de la invención pueden usarse directamente (es decir, no
son producidos por expresión de un polinucleótido en una célula del
paciente o en una célula dada al paciente). En tales aplicaciones,
se prefiere que el péptido tenga menos de 100 o 50 residuos. Un
péptido preferido en la presente invención exhibe una longitud
total de entre 9 y 30 aminoácidos.
Se prefiere que los péptidos de la invención
puedan unirse al HLA-DR. En particular, se prefiere
que los péptidos se unan de forma selectiva al
HLA-DRB1*0101.
En otro aspecto, similar a la situación
explicada anteriormente para moléculas MHC de clase II, los péptidos
descritos pueden usarse para desencadenar una repuesta de
linfocitos T específica de MHC de clase I. Un péptido específico de
MHC de clase I preferido exhibe una longitud total de entre 9 y 16
aminoácidos, preferentemente de entre 9 y 12 aminoácidos. Debe
entenderse que esos péptidos podrían usarse (por ejemplo, en una
vacuna) como péptidos más largos, similares a los péptidos MHC de
clase II. Los expertos en la materia conocen los métodos para
identificar "secuencias centrales" específicas de MHC de clase
I con un determinado motivo de aminoácido específico de HLA para
moléculas HLA de clase I, que pueden predecirse por medio de
programas informáticos como, por ejemplo, el PAProC
(http://www.uni-tuebingen.de/uni/kxi/) o el
SYFPEITHI (http://www.syfpeithi.de).
El péptido de la invención es particularmente
útil en métodos inmunoterapéuticos para detectar y destruir células
que expresan de forma aberrante polipéptidos que forman la base de
los péptidos de la presente invención. Debido a que estos péptidos
específicos consistentes en las secuencias de aminoácidos dadas se
unen al HLA-DR, se prefiere que los péptidos de la
invención sean aquellos que se unan a HLA-DR y que,
una vez formado, el complejo
HLA-DR-péptido, cuando esté presente
en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada,
sea capaz de provocar la producción de un CTL que reconozca una
célula que exprese de forma aberrante un polipéptido que comprenda
la secuencia de aminoácidos dada.
En una modalidad de la presente invención, el
péptido de la presente invención comprende los 80 aminoácidos
N-terminales de la cadena invariante asociada al
antígeno HLA-DR (p33, en la siguiente Ii), como se
deriva del NCBI, número de registro del GenBank X00497 (véase
también más adelante).
En el término "expresado de forma
aberrante" incluimos el significado de que el polipéptido está
sobreexpresado en comparación con los niveles normales de expresión
o que el gen es silencioso en el tejido del que deriva el tumor
pero sí se expresa en el tumor. Con el término "sobreexpresado"
queremos decir que el polipéptido está presente a un nivel al menos
1,2 veces mayor que en tejido normal. Preferentemente a un nivel 2
veces mayor y, más preferentemente, a un nivel 5 ó 10 veces mayor
que en el tejido normal.
Los péptidos (al menos los que contienen enlaces
peptídicos entre residuos de amino ácidos) pueden ser sintetizados
por el modo de poliamida Fmoc de síntesis de péptidos de fase
sólida, tal y como describen Lu y col. (1981) "J. Org. Chem"
46, 3433 y las referencias ahí contenidas. La protección temporal
del grupo N-amino se debe al grupo
9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La división
repetitiva de este grupo altamente protector, lábil en medio básico
se lleva a cabo utilizando piperidina al 20% en N,
N-dimetilformamida. Las funcionalidades de la
cadena lateral pueden estar protegidas como sus éteres butílicos (en
el caso de la serina, treonina y tirosina), ésteres butílicos (en
el caso del ácido glutámico y del ácido aspártico), derivado del
butiloxicarbonilo (en el caso de la lisina y la histidina),
derivado del tritilo (en el caso de la cisteína) y de
4-methoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonilo
(en el caso de la arginina). En donde la glutamina o la asparagina
son residuos C-terminales, se hace uso del grupo
4,4'-dimetoxibencihidrilo para la protección de las
funcionalidades amido de la cadena lateral. El soporte de fase
sólida se basa en un polímero polidimetil-acrilamido
constituido a partir de tres monómeros dimetilacrilamido (monómero
esqueleto), bisacriloiletileno-diamina (reticulador)
y éster metílico acriloilsarcosina (agente activador). El agente
ligado divisible péptido-resina usado es el derivado
del ácido
4-hidroximetil-fenoxiacético lábil
en medio ácido. Todos los derivados aminoácidos se añaden como sus
derivados anhídridos simétricos preformados, con la excepción de la
asparagina y la glutamina, que se añaden usando un procedimiento
inverso de acoplamiento mediado por N,
N-diciclohexil-carbodiimida/1hidroxibenzotriazol.
Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección son
controladas usando procedimientos analíticos de isotina, ácido
trinitrobencenosulfónico o ninhidrina. Al completarse la síntesis,
los péptidos se separan del soporte de la resina con la eliminación
concomitante de los grupos de protección de la cadena lateral por
medio del tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% que
contiene una mezcla antioxidante al 50%. Los antioxidantes
utilizados normalmente son etanoditiol, fenol, anisol y agua. La
elección exacta depende de los aminoácidos constituyentes del
péptido que se esté sintetizando. También es posible una
combinación de metodologías de fase sólida y solución para la
síntesis de péptidos (véase, por ejemplo, Bruckdorfer T, O. Marder,
F. Albericio F; From production of peptides in milligram amounts
for research to multi-tons quantities for drugs of
the future "Curr Pharm Biotechnol." Feb. de 2004; 5 (1):
29-43 y las referencias citadas en dicho
documento).
El ácido trifluoroacético se elimina por
evaporación al vacío, con la posterior trituración con éter
dietílico, proporcionando el péptido crudo. Los antioxidantes
presentes se eliminan por un procedimiento de extracción simple
que, con la liofilización de la fase acuosa, proporciona un péptido
crudo libre de antioxidantes. Los reactivos para la síntesis de
péptidos se pueden adquirir en
Calbiochem-Novabiochem (UK) Ltd, Nottingham NG7
2QJ, UK.
La purificación se puede realizar mediante
técnicas, o combinación de técnicas, como la cromatografía de
exclusión por tamaños, la cromatografía de intercambio iónico, la
cromatografía de interacción hidrofóbica y (normalmente) la
cromatografía líquida de alto rendimiento en fase invertida, usando
la separación por gradiente de agua/acetonitrilo.
El análisis de los péptidos puede llevarse a
cabo por medio de la cromatografía en capa fina, la cromatografía
líquida de alto rendimiento en fase invertida, el análisis de los
aminoácidos después de la hidrólisis ácida, el análisis por
espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos y el
análisis por espectrometría de masas MALDI y
ESI-Q-TOF.
Un aspecto más de la invención proporciona un
ácido nucleico (es decir, un polinucleótido) que codifica un
péptido de la invención. El polinucleótido puede ser ADN, ADNc, PNA,
CNA, ARN o combinaciones de los mismos y puede contener o no
contener intrones. Naturalmente, sólo son codificables por el
polinucleótido los péptidos que contienen residuos de aminoácidos
naturales unidos por enlaces peptídico naturales. Un aspecto más de
la invención proporciona un vector de expresión capaz de expresar un
polipéptido según la invención.
Se han desarrollado una variedad de métodos para
ligar polinucleótidos, especialmente ADN, con vectores; por
ejemplo, mediante extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo,
se pueden añadir extensiones complementarias del homopolímero al
segmento de ADN que se vaya a insertar en el vector ADN. El vector y
el segmento de ADN se unen entonces, mediante un enlace de
hidrógeno, entre las colas homopoliméricas complementarias para
formar moléculas de ADN recombinante.
Los enlazadores sintéticos que contienen uno o
más secuencias de restricción proporcionan un método alternativo
para unir el segmento de ADN a los vectores. El segmento de ADN,
generado por digestión de restricción de endonucleasa como se
describió anteriormente, es tratado con la ADN polimerasa T4
bacteriófaga o la ADN polimerasa I de E. coli, enzimas que
eliminan los extremos 3' monocatenarios con sus actividades
exonucleolíticas 3'-5' y rellenan los extremos 3'
con sus actividades de polimerización.
La combinación de estas actividades genera, por
tanto, segmentos de ADN de extremo romo. Los segmentos de extremo
romo se incuban entonces con exceso molar de moléculas de conexión,
en presencia de una enzima que es capaz de catalizar la unión de
moléculas de ADN de extremo romo, como la ADN ligasa T4
bacteriófaga. Por tanto, los productos de la reacción son segmentos
de ADN que portan secuencias del enlazador polimérico en sus
extremos. Estos segmentos de ADN son escindidos entonces con la
enzima de restricción apropiada y ligados a un vector de expresión
que ha sido escindido con una enzima que produce extremos
compatibles con los del segmento de ADN.
Los enlazadores sintéticos que contienen una
variedad de secuencias de endonucleasa de restricción se pueden
adquirir de diversas fuentes, incluyendo International
Biotechnologies Inc, New Haven, CN, EE. UU.
Una forma deseable de modificar el ADN
codificante del polipéptido de la invención es usar la reacción en
cadena de la polimerasa descrita por Saiki y col. (1988)
"Science" 239, 487-491. Este método puede
usarse para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo
manipulando las secuencias de restricción apropiadas, o puede
usarse para modificar en ADN de otras formas útiles conocidas por
los expertos en la materia. En este método, para que el ADN sea
amplificado enzimáticamente es flanqueado por dos cebadores
específicos que se incorporan al ADN amplificado. Estos cebadores
específicos pueden contener secuencias de reconocimiento de
endonucleasa de restricción que pueden ser usados para la clonación
en vectores de expresión mediante métodos conocidos por los
expertos en la
materia.
materia.
El ADN (o, en el caso de los vectores
retrovirales, el ARN) se expresa entonces en un huésped apropiado
para producir un polipéptido que comprende el compuesto de la
invención. Así, el ADN que codifica el polipéptido que constituye
el compuesto de la invención puede ser usado de acuerdo con técnicas
conocidas, modificadas convenientemente en vista de las enseñanzas
contenidas en la presente invención, para construir un vector de
expresión que entonces es usado para transformar una célula huésped
apropiada para la expresión y producción del polipéptido de la
invención. Dichas técnicas incluyen las descritas en las patentes de
EE. UU. n.º 4.440.859, concedida el 3 de abril de 1984 a Rutter y
col; 4.530.901, concedida el 23 de julio de 1985 a Weissman;
4.582.800, concedida el 15 de abril de 1986 a Crowl; 4.677.063,
concedida del 30 de junio de 1987 a Mark y col; 4.678.751,
concedida el 7 de julio de 1987 a Goeddel; 4.704.362, concedida el 3
de noviembre de 1987 a Itakura y col; 4.710.463, concedida el 1 de
diciembre de 1987 a Murray; 4.757.006, concedida el 12 de julio de
1988 a Toole Jr. y col; 4.766.075, concedida el 23 de agosto de
1988 a Goeddel y col. y 4.810.648, concedida el 7 de marzo de 1989
a Stalker, todas incluidas en la presente invención como
referencia.
El ADN (o, en el caso de los vectores
retrovirales, el ARN) que codifica el polipéptido que constituye el
compuesto de la invención puede unirse a una amplia variedad de
secuencias de ADN para su introducción en el huésped adecuado. El
ADN acompañante dependerá de la naturaleza del huésped, de la forma
de introducción del ADN en el huésped y de si se desea la
integración o el mantenimiento episomal.
Generalmente, el ADN se inserta en un vector de
expresión como, por ejemplo, un plásmido, con la orientación
adecuada y el marco de lectura correcto para la expresión. Si es
necesario, el ADN puede unirse a las secuencias adecuadas de
nucleótidos de control regulador de traslación y transcripción
reconocidas por el huésped deseado, aunque tales controles suelen
estar disponibles en el vector de expresión. El vector se introduce
entonces en el huésped mediante las técnicas habituales.
Generalmente, no todos los huéspedes serán transformados por el
vector. Por lo tanto, será necesario seleccionar las células huésped
transformadas. Una de las técnicas de selección implica la
incorporación en el vector de expresión de una secuencia de ADN con
los elementos de control necesarios, que codifique un carácter
seleccionable en la célula transformada como, por ejemplo, la
resistencia a antibióticos.
De forma alternativa, el gen para dicho carácter
seleccionable puede estar en otro vector, que es usado para
cotransformar la célula huésped deseada.
Las células huésped que han sido transformadas
por el ADN recombinante de la invención son cultivadas entonces
durante el tiempo necesario y en las condiciones apropiadas,
conocidas por los expertos en la materia en vista de las enseñanzas
descritas en la presente invención, para permitir la expresión del
polipéptido, que entonces puede ser recuperado.
Se conocen muchos sistemas de expresión, entre
los que se encuentran bacterias (E. coli y Bacillus
subtilis, por ejemplo), levaduras (Saccharomyces
cerevisiae, por ejemplo), hongos filamentosos
(Aspergillus, por ejemplo) y células de plantas, animales e
insectos. Con preferencia, el sistema puede ser un carcinoma de
células renales (RCC) o células Awells.
Un promotor es un elemento de control de la
expresión formado por una secuencia de ADN que permite que tengan
lugar la unión de la ARN polimerasa y la transcripción. Las
secuencias de promotores compatibles con huéspedes bacterianos se
encuentran normalmente en los vectores plasmídicos que contienen
secuencias de restricción adecuadas para la inserción de un
segmento de ADN de la presente invención. Algunos vectores plásmidos
procarióticos típicos son pUC18, pUC19, pBR322 y pBR329, que se
pueden adquirir en Biorad Laboratories, (Richmond, CA, EE. UU.); y
pTrc99A y pKK223-3, que se pueden adquirir en
Pharmacia, Piscataway, NJ, EE. UU.
Un vector plásmido típico de células de
mamíferos es el pSVL, que se puede adquirir en Pharmacia,
Piscataway, NJ, EE. UU. Este vector usa el promotor tardío SV40
para llevar a cabo la expresión de los genes clonados, habiéndose
encontrado el mayor nivel de expresión en las células productoras de
antígenos T, como las células COS-1. Un ejemplo de
vector de expresión inducible de mamífero es el pMSG, que también
puede adquirirse en Pharmacia. Este vector usa el promotor inducido
por glucocorticoide del duplicado del terminal largo del virus del
tumor mamario del ratón para llevar a cabo la expresión del gen
clonado. Los vectores plásmidos de levadura
pRS403-406 y pRS413-416 son útiles
y, normalmente, pueden adquirirse en Stratagene Cloning Systems, La
Jolla, CA 92037, EE. UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y
pRS406 son plásmidos de integración de levadura (YIps) e incorporan
los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3.
Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos de
centrómero de levadura (Ycps). Se conocen otros vectores y sistemas
de expresión para ser usados con una variedad de células
huésped.
La presente invención también hace referencia a
una célula huésped transformada con un vector que consta de un
polinucleótido de la presente invención. La célula huésped puede ser
procariótica o eucariótica. En algunas circunstancias, las células
bacterianas pueden ser preferentemente células huésped procarióticas
y, normalmente, son una cepa de E. coli como, por ejemplo,
las cepas E. coli DH5, que pueden adquirirse en Bethesda
Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE. UU., y RR1, que se
puede adquirir en la American Type Culture Collection (ATCC)
de Rockville, MD, EE. UU. (No ATCC 31343). Las células huésped
eucarióticas preferidas incluyen células de levadura, insectos y
mamíferos y, con preferencia, células de vertebrados como, por
ejemplo, de ratón, rata, mono o líneas celulares humanas de riñón o
fibroblásticas. Las células huésped de levadura incluyen las
YPH499, YPH500 y YPH501, que normalmente pueden adquirirse en
Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE. UU. Las células
huésped de mamíferos preferidas incluyen células de ovario de
hámster chino (CHO), disponibles en la ATCC, como CCL61; células
embrionarias de ratón suizo NIH NIH/3T3, disponibles en la ATCC,
como CRL 1658; células COS-1 derivadas de riñón de
mono, disponibles en la ATCC, como CRL 1650 y 293 células de riñón
embrionario humano. Las células de insecto preferida son las células
Sf9 que pueden sufrir transfección con vectores de expresión
de
baculovirus.
baculovirus.
La transformación de los huéspedes celulares
apropiados con un ADN de la presente invención se lleva a cabo con
métodos bien conocidos que suelen depender del tipo de vector usado.
Con respecto a la transformación de las células huésped
procarióticas, véase, por ejemplo, Cohen y col. (1972) "Proc.
Natl. Acad. Sci." EE. UU, 69, 2110 y Molecular Cloning, A
Laboratory Manual de Sambrook y col. (1989) "Cold Spring
Harbor Laboratory", Cold Spring Harbor, NY. La transformación de
las células de levadura se describe en Methods In Yeast
Genetics, A Laboratory Manual de Sherman y col. (1986) "Cold
Spring Harbor" NY. También es útil The method of Beggs
(1978) "Nature" 275, 104-109. Con respecto a
las células de vertebrados, los reactivos útiles para la
transfección de dichas células como, por ejemplo, el fosfato
cálcico y el dextran DEAE o las formulaciones de liposomas, se
pueden adquirir en Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies
Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE. UU. La electroporación también es
útil para la transformación y/o transfección de las células, y se
conoce bien su uso para la transformación de células de levadura,
bacterias, insectos y vertebrados.
Las células transformadas con éxito, es decir,
las que contienen un vector de ADN de la presente invención, pueden
ser identificadas por medio de técnicas conocidas. Por ejemplo, las
células resultantes de la introducción de un vector de expresión de
la presente invención pueden cultivarse para producir un polipéptido
de la invención. Las células pueden ser cultivadas y lisadas, y el
contenido de su ADN puede ser examinado en busca de la presencia de
ADN usando un método como el descrito por Southern (1975), "J.
Mol. Biol." 98,503 o por Berent y col. (1985), "Biotech."
3,208. De forma alternativa, la presencia de proteína en el
sobrenadante puede ser detectada usando anticuerpos, como se
describe más abajo.
Además del análisis directo de la presencia de
ADN recombinante, la transformación puede confirmase por medio de
métodos inmunológicos bien conocidos cuando el ADN recombinante es
capaz de dirigir la expresión de la proteína. Por ejemplo, las
células transformadas con un vector de expresión producen proteínas
que presentan la antigenicidad apropiada. Las muestras de células
que puedan haber sufrido transformación se cultivan y analizan en
busca de la proteína utilizando los anticuerpos adecuados. Así,
además de las propias células huésped transformadas, la presente
invención también considera el cultivo de dichas células,
preferentemente monoclonal (clonalmente homogéneo) o derivado de un
cultivo monoclonal, en un medio de nutrientes.
Se apreciará que algunas células huésped de la
invención son útiles en la preparación de péptidos de la invención
como, por ejemplo, células de bacterias, levadura e insectos. Sin
embargo, también podrán ser útiles para ciertos métodos
terapéuticos otras células huésped. Por ejemplo, las células
presentadora de antígenos, como las células dendríticas, pueden ser
usadas para expresar los péptidos de la invención de forma que sean
cargadas en las moléculas MHC adecuadas.
Otro aspecto de la invención proporciona un
método para producir un péptido para su inyección intravenosa
(i.v.), subcutánea (s.c.), intradermal (i.d.), intraperitoneal
(i.p.) e intramuscular (i.m.). Las formas preferidas de inyección
del péptido son las s.c, i.d, i.p, i.m e i.v. Las formas preferidas
de inyección de ADN son las i.d, i.m, s.c, i.p e i.v. Se usarán
dosis de entre 1 y 500 mg de péptido o ADN.
Otro aspecto de la invención se refiere al uso
en medicina de un péptido asociado a un tumor conforme a la
invención, un ácido nucleico conforme a la invención o un vector de
expresión conforme a la invención.
Otro aspecto de la invención proporciona un
método para matar células diana en un paciente cuyas células diana
expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos de la invención. El método comprende la
administración al paciente de una cantidad efectiva de un péptido
según la invención, o una cantidad efectiva de un polinucleótido o
un vector de expresión que codifique dicho péptido, en la que la
cantidad de dicho péptido o la cantidad de dicho polinucleótido o
vector de expresión es efectiva para provocar una respuesta
inmunitaria contra la célula diana en el paciente. La célula diana
es una célula de cancerosa o tumoral.
El péptido o el ácido nucleico codificador del
péptido constituye una vacuna contra el tumor o el cáncer. Puede
administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o
sistémicamente; o aplicarse ex vivo en células del paciente
o en una línea celular humana que después se administra al paciente;
o usarse in vitro para seleccionar una subpoblación de
células inmunitarias del paciente, al que luego se le vuelven a
administrar. Si el ácido nucleico se administra in vitro en
las células, puede ser útil para las células su transfección para
coexpresar citocinas como la interleucina-2. El
péptido podrá ser sustancialmente puro; o estar combinado con un
adyuvante que estimule la respuesta inmunitaria como Detox; o usado
en combinación con citocinas estimuladoras de la respuesta
inmunitaria; o ser administrado con un sistema de liberación
apropiado como, por ejemplo, liposomas. El péptido también podrá
conjugarse a portador apropiado como la hemocianina de lapa
californiana (KLH) o el manano (véase el documento WO 95/18145 y
Longenecker y col. (1993) "Ann. NY Acad. Sci."
690,276-291). El péptido también podrá estar
etiquetado, o ser una proteína de fusión o ser una molécula híbrida.
Los péptidos cuya secuencia se da en la presente invención han de
estimular el linfocito T citotóxico CD4. Sin embargo, la
estimulación es más eficiente con la ayuda de linfocitos T
CD4^{+}. Así, las secciones de fusión de una molécula híbrida
proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4^{+}.
Estos epítopos son conocidos por los expertos en la materia e
incluyen a los identificados en el toxoide tetánico. El
polinucleótido puede ser substancialmente puro o estar contenido en
un vector o en un sistema de liberación adecuados.
Entre los vectores y los sistemas de liberación
adecuados se encuentran los virales, como los sistemas basados en
adenovirus, virus de la vaccinia, retrovirus, virus del herpes,
virus adenoasociados o híbridos que contengan elementos de más de
un virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos
catiónicos y polímeros catiónicos, conocidos por los expertos en la
liberación de ADN. La liberación física por medio de una "pistola
genética", por ejemplo, también puede usarse. El péptido o el
péptido codificado por el ácido nucleico puede ser una proteína de
fusión, con un epítopo que estimule los linfocitos T CD4^{+}, por
ejemplo.
El péptido para una vacuna contra el cáncer
puede ser cualquier péptido apropiado. En particular, puede ser un
péptido apropiado de 7, 8, 9, 10, 11 ó 12 meros. Los péptidos más
largos también pueden ser apropiados, pero se prefieren los de 9 ó
10 meros, tal y como se describe en la tabla 1 adjunta.
Cualquier ácido nucleico administrado al
paciente es estéril y apirógeno. El ADN desnudo puede ser
administrado por vía intramuscular, intradérmica o subcutánea. Los
péptidos pueden administrarse por vía intramuscular, intradérmica,
intraperitoneal, intravenosa o subcutánea (véase también más arriba
el método de producción de un péptido). Preferentemente, los
péptidos, como compuestos farmacéuticos activos son administrados en
combinación con un adyuvante como, por ejemplo, el
IL-2, el IL-12, el
GM-CSF, adyuvante de Freund incompleto, el
adyuvante de Freund completo o formulaciones liposomales. Los
adyuvantes preferidos pueden encontrarse, por ejemplo, en Brinkman
JA, Fausch SC, Weber JS, Kast WM. Peptide-based
vaccines for cancer immunotherapy. "Expert Opin Biol
Ther." 2004 Feb;4(2):181-98.
La vacunación resulta en una respuesta de los
linfocitos T citotóxicos estimulados por células presentadoras de
antígenos. Una vez que los linfocitos T citotóxicos han sido
sensibilizados, puede resultar ventajoso el aumento de la expresión
del MHC en las células tumorales.
También puede ser útil la direccionalización de
la vacuna hacia poblaciones específicas de células como, por
ejemplo, hacia células presentadoras de antígenos, bien por medio de
inyecciones, vectores de direccionalización y sistemas de
liberación; o por purificación selectiva de dicha población de
células del paciente y administración ex vivo del péptido o
del ácido nucleico (las células dendríticas, por ejemplo, pueden
clasificarse tal y como se describe en Zhoy y col. [1995]
"Blood" 86,3295-3301; o en Roth y col. [1996]
"Scand. J. Immunology" 43,646-651). Por
ejemplo, los vectores de direccionalización pueden comprender un
promotor específico de tumor o de tejido que dirige la expresión
del antígeno al lugar adecuado.
\newpage
Otro aspecto de la invención, por tanto,
proporciona una vacuna efectiva contra el cáncer o las células
tumorales o cancerosas, que comprende una cantidad efectiva de un
péptido según la invención o un ácido nucleico que codifica dicho
péptido. Asimismo, se prefiere que la vacuna sea una vacuna de
ácidos nucleicos. Se sabe que la inoculación de una vacuna de
ácidos nucleicos - -como una vacuna de ADN- - que
codifique un polipéptido provoca una respuesta de los linfocitos T.
La vacuna preferida comprende un péptido o péptidos (sintéticos) (es
decir, o sólo o en combinación con 1, 2, 3, 4, 5 o 6, 11 o incluso
más péptidos. Véase más abajo).
Convenientemente, la vacuna de ácidos nucleicos
puede comprender cualquier medio de liberación adecuado del ácido
nucleico. El ácido nucleico, preferentemente ADN, puede estar
desnudo (es decir, sin ningún otro componente sustancial para ser
administrado) o puede ser liberado en un liposoma o como parte de un
sistema de liberación de un vector vírico.
Se cree que la absoción del ácido nucleico y la
expresión del polipéptido codificado por parte de las células
dendríticas puede ser el mecanismo de sensibilización de la
respuesta inmunitaria. Sin embargo, aunque las células dendríticas
pueden no sufrir la transfección, siguen siendo importantes porque
detectan el péptido expresado de las células tisulares que hayan
sufrido la transfección.
Se prefiere que la vacuna -como, por ejemplo, la
vacuna de ADN- sea administrada en el músculo. También se prefiere
que sea administrada en la piel. La vacuna de ácidos nucleicos puede
administrarse sin adyuvante. La vacuna de ácidos nucleicos también
puede administrarse con un adyuvante como BCG o aluminio. Otros
adyuvantes adecuados son el estimulón QS21 de Aquila (Aquila
Biotech, Worcester, MA, EE. UU.), derivado de la saponina;
extractos micobacterianos y pared bacteriana mimética sintética y
adyuvantes registrados como el Detox. Quil A, otro adyuvante
derivado de la saponina, también puede ser usado (Superfos,
Dinamarca). Se prefiere que la vacuna de ácidos nucleicos se
administre sin adyuvantes. Otros adyuvantes, como el adyuvante de
Freund, también pueden ser útiles. También puede ser útil
administrar el péptido conjugado con la hemocianina de lapa
californiana, preferiblemente también con un adyuvante.
La terapia de inmunización contra el cáncer por
medio de un polinucleótico se describe en Conry y col. (1996)
"Seminars in Oncology" 23,135-147; Condon y
col. (1996) "Nature Medicine" 2,1122-1127;
Gong y col. (1997) "Nature Medicine" 3,558-561;
Zhai y col. (1996) "J. Immunol." 156,700-710;
Graham y col. (1996) "Int J. Cancer"
65,664-670; y Burchell y col. (1996) pp
309-313 In: Breast Cancer, Advances in
biology and therapeutics, Calvo y col. (eds), John Libbey
Eurotext, todos ellos incluidos aquí íntegramente como
referencia.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona el uso de un péptido según la invención, o de un
polinucleótido o un vector de expresión que codifique dicho
péptido, en la fabricación de un medicamento para matar células
diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante
un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la
invención.
Otro aspecto de la presente invención
proporciona el uso de un péptido conforme a la invención, o de un
polinucleótido o vector de expresión que codifique dicho péptido,
para la fabricación de un medicamento para inducir una respuesta
inmunitaria, concretamente una respuesta inmunitaria celular y, más
concretamente, una respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T
contra células de tumores sólidos que expresan una molécula humana
MHC de clase II en su superficie y presentan un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos de la invención. En el
contexto de la presente invención se ha descubierto de forma
inesperada que las células tumorales sólidos, en comparación con
las células sanas del mismo tejido, expresan la molécula humana HLA
de clase II en su superficie.
Otro aspecto de la invención proporciona, por lo
tanto, un método para producir linfocitos T citotóxicos (CTL)
activados in vivo o in vitro, método que comprende el
contacto in vitro de los CTL con moléculas humanas MHC de
clase II con carga de antígenos, expresadas en la superficie de una
célula presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de
tiempo suficiente para activar, de una forma propia de los
antígenos, dichos CTL, en donde el antígeno es un péptido según la
invención.
Tal como corresponde, los CTL son linfocitos
colaboradores CD4^{+}, con preferencia de tipo TH1. Las moléculas
MHC de clase II pueden ser expresadas en la superficie de cualquier
célula adecuada. Se prefiere que dicha célula no exprese de forma
natural moléculas MHC de clase II (en cuyo caso, se realiza la
transfección en la célula para que exprese dicha molécula) o, si lo
hace, sea defectuosa en las vías de procesamiento o de presentación
de los antígenos. En este sentido, es posible que la célula que
expresa la molécula MHC de clase II sea sensibilizada completamente
con un antígeno del péptido antes de activar los CTL.
La célula presentadora de antígenos (o célula
estimulante) se caracteriza por tener en su superficie una molécula
MHC de clase II y, preferentemente, no ser capaz de cargar por sí
misma dicha molécula con el antígeno seleccionado. Tal y como se
describe más abajo, la molécula MHC de clase II puede cargarse
fácilmente in vitro con el antígeno seleccionado.
Preferentemente, la célula del mamífero carece o
tiene un nivel o función reducida del transportador peptídico TAP.
Entre las células adecuadas que carecen del transportador TAP se
incluyen las T2, RMA-s y Drosophilia. TAP es el
transportador asociado al procesamiento antigénico.
La línea celular humana T2 con carga peptídica
defectuosa está disponible en la ATCC, 12301 Parklawn Drive,
Rockville, Maryland 20852, EE. UU., con el n.º de catálogo CRL 1992.
La línea 2 de Drosophila de Schneider está disponible en la ATCC,
con el número de catálogo CRL 19863. La línea celular del ratón
RMA-S se describe en Karre y Ljunggren (1985),
"J. Exp. Med.", 162, 1745.
Convenientemente, la célula huésped, antes de la
transfección, no expresa moléculas MHC de clase I de forma
sustancial. También se prefiere que la célula estimulante exprese
una molécula importante para la estimulación conjunta del linfocito
T como, por ejemplo, cualquiera de las B7.1, B7.2,
ICAM-1 y LFA 3.
Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas
moléculas MHC de clase II, así como las moléculas de estimulación
conjunta, están disponibles públicamente en las bases de datos
GenBank y EMBL.
En otra modalidad, también pueden usarse
combinaciones de moléculas de HLA como, por ejemplo, moléculas MHC
de clase II como las aquí descritas en las tablas A y B. El uso de
vacunas de poliepítopos recombinantes para la liberación de
linfocitos T citotóxicos CD8^{+} múltiples se describe en Thomson
y col. (1996) "J. Immunol." 157, 822-826 y en
el documento WO 96/03144, ambos incluidos aquí como referencia. En
relación con la presente invención, puede ser deseable incluir en
una única vacuna un péptido (o un ácido nucleico que codifique un
péptido) que incluya, en cualquier orden, una secuencia de
aminoácidos de la presente invención y otro epítopo estimulador de
los linfocitos T CD8^{+}. Esta vacuna sería particularmente útil
en el tratamiento del cáncer. Estas vacunas "perladas" son
características de las vacunas de ADN. El desencadenamiento
simultáneo de una respuesta inmunitaria dependiente del MHC de clase
II junto con una respuesta inmunitaria dependiente del MHC de clase
I tiene la ventaja de resultar en una reacción de tipo TH_{1} de
linfocitos T CD4^{+} que apoya a los linfocitos T CD8^{+}
dependientes del MHC de
clase I.
clase I.
Pueden usarse otros métodos para generar
linfocitos T citotóxicos in vitro. Por ejemplo, los métodos
descritos en Peoples y col. (1995) "Proc. Natl. Acad. Sci.",
EE. UU., 92,432-436 y en Kawakami y col. (1992)
"J. Immunol." 148,638643 usan linfocitos autólogos destructores
de tumores en la generación de linfocitos T citotóxicos. En
Plebanski y col. (1995) "Eur. J. Immunol."
25,1783-1787, se hace uso de linfocitos autólogos
de sangre periférica (PLB) en la preparación de linfocitos T
citotóxicos. En Jochmus y col. (1997) "J. Gen. Virol."
78,1689-1695, se describe la producción de
linfocitos T citotóxicos autólogos por medio de la utilización de
células dendríticas sensibilizadas de forma reiterada con péptidos
o polipéptidos o por medio de la infección con un virus
recombinante. Hill y col. (1995) "J. Exp. Med."
181,2221-2228 y Jerome y col. (1993) "J.
Immunol." 151,1654-1662, usan linfocitos B en la
producción de linfocitos T citotóxicos autólogos. Adicionalmente,
también pueden usarse macrófagos sensibilizados de manera repetida
con péptidos o polipéptidos, o infectados con virus recombinante. S.
Walter y col. (Walter S, Herrgen L, Schoor O, Jung G, Wernet D,
Buhring HJ, Rammensee HG, Stevanovic S. Cutting edge:
predetermined avidity of human CD8 T cells expanded on
calibrated MHC/anti-CD28-coated
microspheres. "J Immunol." 2003 Nov
15;171(10):4974-8) describen la
sensibilización in vitro de células T por medio de células
presentadoras de antígenos artificiales, que también es adecuado
para generar linfocitos T contra el péptido
elegido.
elegido.
Las células alogénicas también pueden ser usadas
en la preparación de linfocitos T citotóxicos. Este método se
describe en detalle en el documento WO 97/26328, incluido aquí como
referencia. Por ejemplo, además de las células de Drosophilia y T2,
pueden usarse otras células para presentar antígenos, como las
células CHO, las células de insecto infectadas por baculovirus o
células diana de bacterias, levadura o infectadas por vaccinia.
Adicionalmente, pueden usarse virus de plantas. Véase, por ejemplo,
Porta y col. (1994) "Virology" 202, 449-955,
en donde se describe el desarrollo del virus del mosaico del
garbanzo como un sistema de alto rendimiento para la presentación
de péptidos foráneos.
Los linfocitos T citotóxicos activados, que son
dirigidos contra los péptidos de la invención, son útiles para
terapia. Así, otro aspecto de la invención proporciona linfocitos T
citotóxicos activados que pueden obtenerse por los métodos
anteriores.
Otro aspecto de la invención proporciona
linfocitos T citotóxicos (CTL) que reconocen de forma selectiva a
una célula que exprese de forma aberrante un polipéptido que
comprenda una secuencia de aminoácidos de la invención. Con
preferencia, el CTL reconoce a la mencionada célula por interacción
con el complejo de péptidos/HLA (por ejemplo, de unión). Los CTL
son útiles en un método para matar células diana en un paciente
cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos de la invención, en el que
al paciente se le administra un número efectivo de los CTL
activados. Los CTL administrados al paciente pueden derivar del
paciente y se activados tal y como se describe más arriba (es decir,
son CTL autólogos) De forma alternativa, los CTL pueden no ser del
paciente, sino de otro individuo. Evidentemente, se prefiere que se
trate de un individuo sano. Por "individuo sano" los inventores
entienden un individuo con buena salud en general, preferentemente
con un sistema inmunitario competente y, más preferentemente, que
no sufra ninguna enfermedad que pueda ser fácilmente detectable.
Los CTL activos expresan un receptor de
linfocitos T (TCR) que reconoce a las células que expresan el
polipéptido aberrante. Resulta de utilidad que el ADNc que codifica
el TCR sea clonado del CTL activado y transferido a otro CTL para
su expresión.
In vivo, las células diana para el CTL
CD4^{+} conforme a la presente invención pueden ser células del
tumor (que, a veces, expresa MHC de clase II) y/o células del
estroma que rodean al tumor (células tumorales) (que, a veces,
también expresan MHC de clase II).
Los TCR de clones de CTL de la invención
específicos para los péptidos de la invención son clonados. El uso
de los TCR en los clones de CTL se determina usando (i) anticuerpos
monoclonales específicos de región variable y (ii) RT PCR con
cebadores específicos para las familias de genes Va y Vp. Se prepara
una genoteca de ADNc a partir de ARNm poli-A
extraído de los clones de CTL. Se usan los cebadores específicos
para la porción C-terminal de las cadenas a y P de
TCR y para la porción N-terminal de los segmentos Va
y P identificados. El ADNc completo para la cadena a y b de TCR se
amplifica con una ADN-polimerasa de alta fidelidad y
los productos amplificados son clonados a un vector de clonación
adecuado. Los genes clonados de las cadenas a y P pueden ser unidos
en un TCR de cadena única por medio del método descrito por Chung y
col. (1994) "Proc. Natl. Acad. Sci." EE. UU. 91,
12654-12658. En este constructo de cadena única, el
segmento VaJ está seguido por el segmento V DJ, seguido a su vez
por el segmento Cp, seguido a su vez por el segmento citoplasmático
y la transmembrana de la cadena CD3. Este TCR de cadena única se
inserta entonces en un vector de expresión retroviral (puede usarse
un panel de vectores basado en su habilidad para infectar linfocitos
T CD8^{+} humanos maduros y para mediar en la expresión génica:
El sistema retroviral de vectores Kat es una de las posibilidades
preferidas [véase Finer y col. (1994) "Blood" 83, 43]). Los
retrovirus anfotróficos de alta valoración son usados para infectar
linfocitos T CD8^{+} o CD4^{+} purificados, aislados de las
sangre periférica de pacientes con tumor (siguiéndose el protocolo
publicado por Roberts y col. (1994) en "Blood" 84,
2878-2889, incorporado aquí como referencia). Los
anticuerpos Anti-CD3 son usados para desencadenar la
proliferación de linfocitos T CD8^{+} purificados, lo que
facilita la integración retroviral y expresión estable de TCR de
cadena única. La eficacia de la transducción retroviral se determina
por coloración de los linfocitos T CD8^{+} infectados con
anticuerpos específicos específicos del TCR de cadena única. El
análisis in vitro de los linfocitos T CD8^{+} transducidos
establece que muestran la misma toxicidad específica de tumor que
con el clon de CTL allo-restringido del que
originalmente se clonaron las cadenas de TCR. Las poblaciones de
linfocitos T CD8^{+} transducidos con la especificidad esperada
pueden ser usadas en la inmunoterapia adoptiva de los pacientes con
tumores. Los pacientes pueden ser tratados con entre 10^{8} y
10^{11} CTL autólogos transducidos. De forma análoga a los
CD8^{+}, se pueden generar linfocitos T colaboradores CD4^{+}
transducidos con constructos relacionados.
Otros sistemas adecuados para introducir geness
en CTL se describen en Moritz y col (1994), "Proc. Natl. Acad.
Sci." EE. UU., 91, 4318-4322, incluidos aquí como
referencia. Eshhar y col. (1993) "Proc. Natl. Acad. Sci." EE.
UU. 90, 720-724 y Hwu y col. (1993) "J. Exp.
Med." 178, 361-366 también describen la
transfección de CTL. Por tanto, otro aspecto de la invención
proporciona un TCR que reconoce una célula que expresa de forma
aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
de la invención. El TCR se obtiene del CTL activado.
Además del TCR, se incluyen en la presente
invención moléculas funcionalmente equivalentes al TCR. Éstas
incluyen cualquier molécula funcionalmente equivalente a un TCR,
que puede realizar la misma función que el TCR. En particular,
dichas moléculas incluyen TCR modificados genéticamente de cadena
única y tres dominios, fabricadas por el método descrito por Chung
y col. (1994) "Proc. Natl. Acad. Sci." EE. UU. 91,
12654-12658; incorporado aquí como referencia y
mencionado anteriormente. La invención también incluye un
polinucleótido que codifica el TCR o la molécula funcionalmente
equivalente, y un vector de expresión que codifica el TCR o una
molécula funcionalmente equivalente. Los vectores de expresión
adecuados para la expresión del TCR de la invención incluyen los
descritos más arriba en relación a la expresión de los péptidos de
la invención.
Se prefiere, sin embargo, que los vectores de
expresión sean capaces de expresar el TCR en un CTL después de la
transfección.
Otro aspecto más de la invención proporciona un
método para matar células diana en un paciente cuyas células diana
expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos de la invención. El método comprende los
siguientes pasos: (1) obtención de CTL del paciente; (2)
introducción en dichas células de un polinucleótido que codifique
un TCR o una molécula funcionalmente equivalente, como se definió
más arriba, y (3) introducción al paciente de las células
producidas en el paso (2).
Otro aspecto de la invención proporciona un
método para matar células diana en un paciente cuyas células diana
expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos como la definida en los otros aspectos de
la invención. El método comprende los siguientes pasos: (1)
obtención de células presentadoras de antígenos, como células
dendríticas, del paciente; (2) contacto de dichas células
presentadoras de antígenos con un péptido, como se definió en los
otros aspectos de la invención, o con un polinucleótido que
codifique dicho péptido, ex vivo y (3) reintroducción en el
paciente de las células presentadoras de antígenos así
tratadas.
Preferentemente, las células presentadoras de
antígenos son células dendríticas. Las células dendríticas son
células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera reiterada con
un péptido antigénico. El péptido antigénico puede ser cualquier
péptido antigénico adecuado que desencadene una respuesta adecuada
de los linfocitos T. La terapia de linfocitos T con células
dendríticas autólogas sensibilizadas de manera repetida con péptidos
de un antígeno asociado a un tumor se describe en Murphy y col.
(1996) "The Prostate" 29, 371-380 y en Tjua y
col. (1997) "The Prostate" 32, 272-278.
En otra modalidad, las células presentadoras de
antígenos, como las células dendríticas, son contactadas con un
polinucleótido que codifica un péptido de la invención. El
polinucleótido puede ser cualquier polinucleótido adecuado y se
prefiere que sea capaz de transducir la célula dendrítica resultante
en la presentación de un péptido e inducción de inmunidad.
Convenientemente, el polinucleótido puede estar
comprendido en un polinucleótido vírico o en un virus. Por ejemplo,
se ha demostrado que las células dendríticas transducidas por
adenovirus inducen inmunidad antitumoral específica de antigen en
relación con MUC1 (véase Gong y col. [1997] "Gene Ther".
4,1023-1028). De forma similar, pueden usarse
sistemas basados en adenovirus (véase, por ejemplo, Wan y col.
[1997] "Hum. Gene Ther." 8, 1355-1363);
sistemas retrovirales (Specht y col. [1997] "J. Exp. Med." 186,
1213-1221 y Szabolcs y col. [1997]); transferencia
sanguínea mediada por partícula a células dendríticas (Tuting y
col. [1997] "Eur. J. Immunol." 27, 2702-2707) y
ARN (Ashley y col. [1997] "J. Exp. Med." 186,
1177-1182).
Se apreciará que, con respecto a los métodos
para matar células diana en un paciente, se prefiere especialmente
que las células diana sean células cancerosas y, más aún, que sean
células cancerosas renales o de colon.
Se prefiere especialmente que los pacientes que
sean tratados con los métodos de la invención tengan un haplotipo
HLA-DR. Así, en una modalidad preferida, el
haplotipo HLA del paciente se habrá determinado antes del
tratamiento. El análisis del haplotipo HLA del paciente puede
efectuarse mediante los métodos adecuados, conocidos por los
expertos en la materia.
La invención incluye en particular el uso de
péptidos de la invención (o polinucleótidos que los codifiquen)
para la vacunación activa in vivo; para la manipulación in
vitro de células dendríticas autólogas seguida de la
introducción de dichas células para activar repuestas de CTL; para
activar CTL autólogos in vitro seguido de terapia adoptiva
(es decir, los CTL así manipulados son introducidos en el paciente);
y para activar CTL de donantes sanos (MHC apareado o desapareado)
in vitro seguido por terapia adoptiva.
En una modalidad preferida, las vacunas de la
presente invención se administran a un huésped tanto solas como en
combinación con otras terapias contra el cáncer para inhibir o
suprimir la formación de tumores.
La vacuna de péptidos puede administrarse sin
adyuvante. La vacuna de péptidos también puede administrarse con
un adyuvante como BCG o aluminio. Otros adyuvantes adecuados son el
estimulón QS21 de Aquila (Aquila Biotech, Worcester, MA, EE. UU.),
derivado de la saponina; extractos micobacterianos y pared
bacteriana mimética sintética y adyuvantes registrados como el
Detox. Quil A, otro adyuvante derivado de la saponina, también puede
ser usado (Superfos, Dinamarca). También pueden ser útiles otros
adjuvantes como los oligonucleótidos CpG, el ARN estabilizado,
Imiquimod (comercializado con el nombre registrado Aldara^{TM} por
3M Pharma, EE. UU.), el adyuvante incompleto de Freund
(comercializado como Montanide ISA-51 por Seppic
S.A, Paris, Francia), las formulaciones liposomales o el
GM-CSF. También puede ser útil dar el péptido
conjugado con la hemocianina de lapa californiana, preferentemente
también con un adyuvante.
Los péptidos conformes a la invención también
pueden ser usados como reactivos diagnósticos. Con ellos puede
analizarse si, en una población de CTL, aparecen CTL dirigidos
específicamente contra un péptido o inducidos por una terapia.
Además, el aumento de linfocitos T precursores puede ser analizado
con los péptidos que tengan reactividad contra el péptido definido.
Además, el péptido puede ser usado como marcador para controlar la
progresión de la enfermedad de un tumor que expresa el antígeno
mencionado del que el péptido deriva.
En la tabla 1 adjunta, se enumeran los péptidos
identificados. Además, en la tabla se nombran las proteínas de las
que deriva el péptido así como la posición respectiva del péptido en
la proteína correspondiente. Además, se dan los números de registro
respectivos vinculados al Genbank del National Centre for
Biotechnology Information del National Institute of
Health (véase http: www.ncbi.nlm.nih.gov).
En otra modalidad preferida, los péptidos son
usados para la coloración de leucocitos, en particular de linfocitos
T. Este uso es particularmente ventajoso si se prueba que en una
población de CTL aparecen CTL específicos dirigidos contra un
péptido. Además, el péptido puede usarse como marcador para
determinar la evolución de una terapia contra una enfermedad o
trastorno tumoral.
En otra modalidad preferida, los péptidos son
usados para la producción de un anticuerpo. Los anticuerpos
policlonales pueden obtenerse de forma estándar con la inmunización
de animales, por medio de la inyección del péptido y la
subsiguiente purificación de la globulina inmunitaria. Los
anticuerpos monoclonales pueden producirse siguiendo los protocolos
estándar, como los descritos, por ejemplo, en "Methods
Enzymol." (1986), 121, Hybridoma technology and monoclonal
antibodies.
En otro aspecto, la invención se refiere a una
composición farmacéutica que contiene uno o más de los mencionados
péptidos conformes a la invención. Esta composición se administra
por vía parenteral como, por ejemplo, subcutánea, intradérmica,
intramuscular o por vía oral. Para ello, los péptidos son disueltos
o suspendidos en un vehículo farmacéuticamente aceptable y
preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener
excipientes como soluciones reguladoras, aglutinantes, agentes
blásticos, diluyentes, aromas, lubricantes, etc. Los péptidos
también pueden administrase junto con substancias estimulantes de la
respuesta inmunitaria, como las citocinas. Una lista completa de
excipientes que pueden usarse para esta composición aparece, por
ejemplo, en A. Kibbe, "Handbook of Pharmaceutical Excipients",
3. Ed., 2000, American Pharmaceutical Association and
pharmaceutical press. La composición puede usarse para la
prevención, profilaxis y/o terapia de enfermedades tumorales.
La preparación farmacéutica con al menos uno de
los péptidos de la presente invención que comprenda cualquiera de
las ID de SEQ n.º 1 a ID de SEQ n.º 49 es administrada a un paciente
que sufra una enfermedad tumoral que esté asociada al péptido o
antígeno respectivo. Así puede desencadenarse una respuesta
inmunitaria específica de CTL.
En otro aspecto de la presente invención, una
combinación de dos o varios péptidos conformes a la presente
invención pueden usarse como vacuna, tanto en combinación directa
como dentro del mismo régimen de tratamiento. Además, pueden usarse
combinaciones con otros péptidos como, por ejemplo, péptidos
específicos de MHC de clase I. El experto en la materia será capaz
de seleccionar las combinaciones preferidas de péptidos inmunógenos
por medio del análisis, por ejemplo, de la generación de linfocitos
T in vitro así como su eficacia y presencia global, la
proliferación, afinidad y expansión de determinados linfocitos T
para determinados péptidos, y la funcionalidad de los linfocitos T;
por ejemplo, analizando la producción de
IFN-\gamma (véanse también los ejemplo más
abajo), IL-12 o perforina. Normalmente, los péptidos
más eficaces son entonces combinados como vacuna para los
propósitos descritos más arriba.
Una vacuna adecuada contendrá 2, 3, 4, 5, 6, 7,
8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 ó 15 péptidos distintos, preferiblemente
4, 5, 6 ó 7 péptidos distintos y, más preferiblemente, 6 péptidos
diferentes.
Finalmente, la vacuna puede depender del tipo de
cáncer específico que el paciente sufra así como del estado de la
enfermedad, regímenes de tratamiento anteriores, el estado
inmunitario del paciente y, naturalmente, el haplotipo HLA del
paciente.
Se ha comprobado que los 80 aminoácidos
N-terminales de la Ii son suficientes para dirigir a
las proteínas a la vía de procesamiento de clase II (S. Sanderson,
K. Frauwirth y N. Shastri (1995), "Proc. Natl. Acad. Sci. U. S.
A", 92, 7217-7221; R. F. Wang, X. Wang, A.C.
Atwood, S.L. Topalian y S.A. Rosenberg (1999) "Science", 284,
1351-1354).
La identificación de epítopos de linfocitos T
colaboradores de antígenos asociados a tumores sigue siendo una
tarea importante en la inmunoterapia contra los tumores. En este
sentido, los inventores aportan un método de aplicación general y
péptidos que derivados del análisis diferencial de péptidos por
espectrometría de masas para identificar ligandos MHC de clase II,
presentados y procesados de forma natural, de antígenos asociados a
tumores. Este enfoque combina por primera vez la transfección de APC
con un vector que codifica una proteína de fusión entre la cadena
invariante y el antígeno de interés, la elución de péptidos unidos a
HLA y la identificación por espectrometría de masas de los péptidos
derivados del antígeno presentados por el agente de transfección,
por comparación con las células no transfectadas. Además, los
inventores pudieron validar el método demostrando que los
linfocitos T inducidos contra el péptido identificado reconoce
específicamente a los agentes de transfección que sobreexpresan el
antígeno cognado. Aunque todavía se tiene que probar la
inmunogenicidad in vivo de los péptidos identificados,
nuestro enfoque conduce a la caracterización exacta de los ligandos
MHC de clase II procesados de forma natural. Así, los inventores
evitan probar péptidos sintéticos solapados de antígenos asociados
a tumores o un intervalo amplio de péptidos seleccionados por
predicción de epítopos, ya que es menos exacto que la predicción de
epítopos de clase I. En comparación con laboriosos ensayos de
linfocitos T que podrían conducir a la identificación de crípticos
epítopos de linfocitos T incapaces de inducir la activación de los
linfocitos T in vivo (S. M. Anderton, N. J. Viner, P.
Matharu, P. A. Lowrey y D. C. Wraith (2002), "Nat.
Immunol.", 3, 175-181), el trabajo puede
centrarse en los pocos péptidos que se encuentran para ser
presentados. Además, con este método no es necesario producir el
antígeno recombinante o disponer de líneas celulares tumorales que
expresen el antígeno para probar que los péptidos se procesan de
forma
natural.
natural.
Los inventores usaron el
N-terminal de Ii para dirigir antígenos asociados a
tumores al compartimento de procesamiento de clase II de células B
transformadas por el VEB. Para conseguir esto, los inventores
construyeron un vector versátil con el que se puede expresar
cualquier antígeno como una proteína de fusión con Ii y que ayuda a
determinar el nivel de expresión de la proteína en células
transfectadas mediante el análisis de transferencia Western. Ya se
ha demostrado que el N-terminal de Ii es suficiente
para dirigir proteínas al compartimento de procesamiento de clase
II. Pero, hasta ahora, esto sólo se ha descrito en un modelo que
utiliza ovalbúmina (S. Sanderson, D. Frauwirth y N. Shastri (1995)
"Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A" 92, 7217-7221)
para identificar antígenos desconocidos usando genotecas de ADNc
que codifican proteínas de fusión (R. F. Wang, X. Wang, A. C.
Atwood, S. L. Topalian y S. A. Rosenberg (1999) "Science" 284,
1351-1354) o para confirmar la especificidad de
clones de linfocitos T conocidos (P. Chaux, V. Vantomme, V.
Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M. Eggermont,
T. Boon y B. P. van der Bruggen (1999) "J. Exp. Med." 189,
767-778). Los inventores no tienen conocimiento de
que este método se haya usado antes para identificar péptidos
unidos a MHC de clase II, presentados de forma natural, de antígenos
asociados a tumores conocidos. El análisis diferencial de ligandos
de clase II de células transfectadas y no transfectadas por
espectrometría de masas MALDI y la posterior caracterización por
espectrometría de masas ESI de los péptidos expresados
diferencialmente tiene como resultado un método directo para
identificar ligandos de clase II de los antígenos de interés. La
transfección de las células con proteínas de fusión queratina 18
demostró que el método de los inventores es de aplicación general
para los antígenos de interés. Los inventores también pudieron
describir un péptido presentado por HLA-DR a partir
de un transgén modelo, la queratina 18.
La identificación de epítopos de linfocitos T
colaboradores de TAA sigue siendo una tarea importante en la
inmunoterapia contra los tumores. Hasta ahora, se han llevado a cabo
distintas estrategias para la identificación de péptidos de clase
II a partir de TAA, desde la incubación de APC con el antígeno de
interés para que sea absorbido y procesado (P. Chaux, V. Vantomme,
V. Stroobant, K. Thielemans, J. Corthals, R. Luiten, A. M.
Eggermont, T. Boon, y B. P. van der Bruggen; 1999;
Identification of MAGE-3 epitopes presented by
HLA-DR molecules to CD4(+) T lymphocytes. "J.
Exp. Med." 189:767-778) hasta diversas
estrategias de transfección con proteínas de fusión (J. Dengjel, P.
Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee y
S. Stevanovic; 2004; Identification of a naturally processed
cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination
of HLA class II targeting and differential mass spectrometry;
"Eur. J. Immunol." 34: 3644-3651). Todos estos
métodos llevan mucho tiempo y muchas veces no queda claro si los
ligandos de HLA identificados son realmente presentados in
vivo por tejido humano. Los inventores pudieron demostrar por
primera vez que es posible aislar ligandos de HLA de clase II
directamente, a partir de tumores sólidos diseccionados,
identificando así los péptidos que son presentados por los tumores
y el tejido circundante in vivo que, por tanto, pueden ser
reconocidos por linfocitos T con el receptor de linfocitos T
adecuado y que expresan simultáneamente el ligando CD4
co-estimulante en su superficie. Entre la proteínas
que actúan como una fuente de ligandos de HLA de clase II
procesados de forma endógena, se identificaron varias proteínas de
mantenimiento e inmunorelevantes. Sin embargo, también se
detectaron péptidos de TAA, lo que desemboca en un enfoque directo
para la identificación de relevantes ligandos de clase II in
vivo de TAA.
Los inventores identificaron tres ligandos para
una secuencia central de IGFBP3 y un ligando de MMP7. Los
inventores descubrieron que estas proteínas están sobreexpresadas en
los carcinomas de células renales. Además, se han descrito como
asociadas a tumores (S. Miyamoto, K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T.
Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M. Goya, T. Chiba, y A. Ochiai; 2004;
Matrix metalloproteinase-7 facilitates
insulin-like growth factor bioavailability through
its proteinase activity on insulin-like growth
factor binding protein 3; "Cancer Res."
64:665-671. T. Sumi, T. Nakatani, H. Yoshida, Y.
Hyun, T. Yasui, Y. Matsumoto, E. Nakagawa, K. Sugimura, H.
Kawashima y O. Ishiko; 2003; Expression of matrix
metalloproteinases 7 and 2 in human renal cell carcinoma.
"Oncol. Rep." 10:567-570. C. W. Cheung, D. A.
Vesey, D. L. Nicol y D. W. Johnson; 2004; The roles of
IGF-I and IGFBP-3 in the regulation
of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell
proliferation; "Kidney Int." 65:1272-1279).
Estos péptidos se unían promiscuamente a moléculas HLA de clase II
y eran capaces de activar linfocitos T CD4^{+} de diferentes
donantes sanos. Por lo tanto, el enfoque de los inventores ayudará
en la identificación de nuevos péptidos candidatos de clase II de
TAA para su uso en protocolos de vacunación clínica.
La invención en otro de sus aspectos describe un
método para matar células diana en un paciente cuyas células diana
expresan un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
como la dada en la presente invención. El método comprende la
administración al paciente de una cantidad efectiva de un péptido
según la presente invención o un ácido nucleico según la presente
invención o un vector de expresión según la presente invención, en
donde la cantidad del mencionado péptido, ácido nucleico o vector de
expresión es lo suficientemente efectiva para provocar una
respuesta inmunitaria contra la célula diana en el mencionado
paciente.
La invención en otro de sus aspectos describe un
método para matar células diana en un paciente cuyas células diana
expresan un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos
según la presente invención. El método comprende la administración
al paciente de un número efectivo de linfocitos T citotóxicos (CTL),
tal y como se ha definido en la presente invención.
La invención, en otro de sus aspectos, describe
un método para matar células diana en un paciente cuyas células
diana expresan un polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos según la presente invención. El método comprende los
siguientes pasos: (1) obtención de linfocitos T citotóxicos (CTL)
del paciente; (2) introducción en dichas células de un ácido
nucleico que codifique un receptor de linfocitos T (TCR) o una
molécula funcionalmente equivalente, tal y como se ha definido en
la presente invención y (3) la introducción en el paciente de las
células producidas en el paso (2).
Preferentemente, las células diana son células
cancerosas. Más preferiblemente, el cáncer es leucemia o linfoma
que expresa el polipéptido que comprende una secuencia de
aminoácidos como se ha dado conforme a la presente invención.
En el contexto de la presente invención se ha
descubierto de forma inesperada que las células de tumores sólidos,
en comparación con las células sanas del mismo tejido, expresan la
molécula humana HLA de clase II en su superficie. Este hecho sólo
ha sido descrito una vez por Brasanac y col. (D. Brasanac, J.
Markovic-Lipkovski, J. Hadzi-Djokic,
G. A. Muller, C. A. Muller; Immunohistochemical analysis of HLA
class II antigens and tumor infiltrating mononuclear cells in renal
cell carcinoma: correlation with clinical and
histopathological data. "Neoplasma" 1999; 46(3):
173-8), en el que se estudiaron secciones de
criostato de 37 carcinomas de células renales (RCC) -25 de células
claras, 10 granulares y 2 cromófobas- con el método indirecto de
inmunoperoxidasa, aplicándose anticuerpos monoclonales (AcMo) a los
antígenos HLA-DR, -DP y -DQ para el análisis de
antígenos HLA de clase II, y AcMo anti-CD14, -CD3,
-CD4 y -CD8 para células mononucleares destructoras de tumores
(TIM). El número de células positivas se calculó
semi-cuantitativamente y se estableció una
correlación entre los resultados de la investigación
inmunohistoquímica y las características clínicas (edad y sexo del
paciente, tamaño del tumor y clasificación TNM) e histopatológicas
(citología, histología, grado) del RCC. Todos los RCC expresaron
antígenos HLA-DR, un 92% de -DQ y un 73% de -DP con
una jerarquía en el nivel de expresión de -DR>-DQ>-DP, pero
no se pudo establecer una correlación de importancia estadística con
ninguno de los parámetros clínicos o histopatológicos analizados.
Los monocitos fueron más abundantes que los linfocitos T y los
linfocitos T CD4^{+} más que los CD8^{+}, mientras que los
tumores con predominancia de linfocitos T y con aproximadamente el
mismo número de linfocitos T CD4^{+} y CD8^{+} tuvieron el mayor
diámetro medio. La activación inadecuada de los linfocitos T por
células tumorales (a pesar de su capacidad para presentar antígenos)
pudo ser la razón para una asociación de parámetros que indica un
comportamiento tumoral más agresivo con expresión aberrante del
antígeno HLA de clase II en RCC.
Debe comprenderse que las características de la
invención tal y como se describe aquí pueden ser usadas no sólo en
la combinación indicada, sino también de forma singular sin alejarse
del ámbito deseado de la presente invención.
Ahora se describirá la invención con mayor
detalle, haciéndose referencia a las siguientes figuras, al listado
de secuencias y a los ejemplos. Los siguientes ejemplos se ofrecen
sólo con fines ilustrativos y no pretenden limitar la
invención.
Las secuencias SEQ ID n.º 1 a SEQ ID n.º 49
muestran secuencias de péptidos de epítopos de linfocitos T que
contienen péptidos presentados por el MHC de clase II conforme a la
presente invención.
Las SEQ ID n.º 50 a SEQ ID n.º 79 muestran
secuencias de péptidos de la tabla 3.
La figura 1 muestra la expresión de moléculas
HLA de clase II en RCC de tres pacientes. Mientras en el tumor del
paciente RCC132 las células positivas HLA se localizaban
preferentemente en el margen (A, B), los modelos de expresión HLA
de clase II de los tumores de los pacientes RCC190 y RCC211 con una
estructura más papilar se habían propagado de forma más uniforme
(C, E, G). La visualización de macrófagos CD68^{+} (B, D, F) en
secciones seriadas de tejido ilustra una relación espacial cercana
entre las células inmunitarias mononucleares destructoras de
tumores y las células tumorales que expresan HLA II. La incubación
con IgG de ratón en lugar de anticuerpos específicos reveló
sistemáticamente resultados de coloración negativos (H). La T marca
el tumor.
La figura 2 muestra un análisis FACS de
linfocitos T CD4^{+} específicos para
IGFBP3_{169-181}, MMP7_{247-262}
y
CCND1_{198-212}. Se muestran transferencias de puntos representativas de coloración de IFN\gamma intracelular en contraste con CD4-FITC.
CCND1_{198-212}. Se muestran transferencias de puntos representativas de coloración de IFN\gamma intracelular en contraste con CD4-FITC.
La figura 3 muestra una ilustración esquemática
de linfocitos T CD4^{+} productores de IFN\gamma específico de
antígeno detectados en cada donante y para cada péptido. Se muestra
el porcentaje de linfocitos T CD4^{+} productores de IFN\gamma
para cada donante y péptido usado para la estimulación Las células
se incubaron en placas de 96 pocillos -7 pocillos por donante y
péptido. Los valores considerados positivos aparecen en un
recuadro: el porcentaje de linfocitos T CD4^{+} productores de
IFN\gamma fue más de dos veces mayor que el control negativo sin
péptido. Los porcentajes de linfocitos T CD4^{+} productores de
IFN\gamma detectados tras la estimulación con un péptido
irrelevante guardaban correlación con los valores tras la
estimulación sin péptido, con la excepción del donante 1 después de
la 3ª estimulación con IGFBP3_{169-181}. Sin
embargo, este efecto no se volvió a detectar después de la 4ª
estimula-
ción.
ción.
La figura 4 muestra la expresión de moléculas
HLA de clase II en CCA165 (adenocarcinoma del colon moderadamente
diferenciado). En la lámina propia de zonas con mucosa normal del
colon (panel c y lado izquierdo del panel a, marcados con
asterisco) normalmente se observan algunos macrófagos HLA positivos
de clase II pero las células epiteliales eran sistemáticamente
negativas para la expresión de HLA de clase II. En las células
epiteliales de zonas distintas del tumor, sin embargo, se observó
una expresión pronunciada de HLA II, tal y como se muestra en el
lado derecho del panel a y en los paneles b y d.
Las figuras 5a y 5b muestran la identificación
de secuencias de péptidos eluidos de moléculas HLA de clase II
aisladas del tejido tumoral humano principal por espectrometría de
masas. Figura 5a: fragmentos derivados de la fragmentación de
ligandos HLA de clase II procesados y presentados de forma natural
de MMP7 que corresponden a la secuencia de péptidos con SEQ ID n.º
1 (SQDDIKGIQKLYGKRS). Los fragmentos anotados se describen en la
tabla 5. Figura 5b: fragmentos derivados de la fragmentación del
péptido sintético con la secuencia de péptidos SEQ ID n.º 1. Las
fragmentaciones de los péptidos procesados tanto de forma natural
como sintética producen modelos de fragmentación equivalentes y
permiten la deducción y confirmación de la secuencia de aminoácidos
primaria de la secuencia de péptidos previamente sin caracterizar
(SEQ ID n.º 1) de este ligando HLA de clase II de MMP7
humano.
humano.
\global\parskip0.900000\baselineskip
Inmunohistología de MHC de clase II: los tumores
se fijaban en folmaldehído tamponado con fosfato al 4%, inmersos en
parafina, teñidos con hematoxilina y eosina y examinados por
microscopía óptico. El diagnóstico del RCC se realizaba conforme a
las investigaciones rutinarias histopatológicas e inmunohistológicas
(S. Fleming y M. O'Donnell; 2000; Surgical pathology of renal
epithelial neoplasms: recent advances and current status.
"Histopathology" 36: 195-202).
Para la detección inmunohistológica de moléculas
MHC de clase II o moléculas CD68, respectivamente, se trataban
previamente 5 \mum de corte histologico inmerso en parafina con
tampón citrato 10 mM, pH 6, seguido de la incubación con un mAb de
cadena alfa anti-HLA-DR de ratón
(clon TAL.1B5, 1:50) o CD68 Ab (clon PGM1, 1:50) (DAKO, Hamburgo,
Alemania) o IgG1 de ratón (2 \mug/ml, BD Biosciences Pharmingen,
San Diego, EE. UU.) y se visualizaban con el equipo de detección
Ventana iView DAB (Nexes System, Ventana Medical Systems, Illkirch,
Francia). Los cortes histológicos se sometían a una tinción de
contraste con hematoxilina y, finalmente, se sumergían en
Entellan.
Elución y análisis molecular de péptidos unidos
a HLA-DR: las muestras tumorales congeladas se
procesaban de la forma descrita anteriormente (T. Weinschenk, C.
Gouttefangeas, M. Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R.
Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic y H. G.
Rammensee; 2002; Integrated functional genomics approach for the
design of patient-individual antitumor vaccines;
"Cancer Res." 62: 5818-5827) y los péptidos se
aislaban conforme a los protocolos habituales (J. Dengjel, H. G.
Rammensee y S. Stevanovic; 2005; Glycan side chains on naturally
presented MHC class II ligands. "J. Mass Spectrom." 40:
100-104) usando el mAb L243 específico de
HLA-DR (L. A. Lampson y R. Levy; 1980; Two
populations of Ia-like molecules on a human B cell
line; "J. Immunol." 125: 293-299).
Las mezclas de péptidos naturales se analizaban
con un sistema de HPLC Ultimate en fase invertida (Dionex,
Amsterdam, Holanda) unido a un espectrómetro de masas
Q-TOF I (Waters, Eschborn, Alemania), o con un
sistema de HPLC CapLC en fase invertida unido a un
Q-TOF Ultima API (Waters), tal como se ha descrito
anteriormente (C. Lemmel, S. Weik, U. Eberle, J. Dengjel, T.
Kratt, H. D. Becker, H. G. Rammensee y S. Stevanovic; 2004;
Differential quantitative analysis of MHC ligands by mass
spectrometry using stable isotope labeling.
"Nat.Biotechnol." 22: 450-454). Los espectros
de los fragmentos se analizaban de forma manual y automática.
Análisis de la expresión génica por
micromatrices de oligonucleótidos de alta densidad: El aislamiento
del ARN de muestras tumorales y de riñón normal autólogo así como
el análisis de la expresión génica con micromatrices de
oligonucleótidos Affymetrix Human Genome U133 Plus 2.0 (Affymetrix,
Santa Clara, CA, EE. UU.) se efectuaban tal y como se ha descrito
anteriormente (T. Krüger, O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C.
Reichle, J. Dengjel, T. Weinschenk, M. Müller, J. Hennenlotter, A.
Stenzl, H. G. Rammensee y S. Stevanovic; 2004; Lessons to be
learned from primary renal cell carcinomas: novel tumor
antigens and HLA ligands for immunotherapy. "Cancer
Immunol.Immunother"). Los datos se analizaban con el software
GCOS (Affymetrix). Las comparaciones a pares entre el riñón normal
autólogo y el tumor se calculaban usando la matriz normal
correspondiente como valor de referencia. No se disponía de datos
de la matriz renal normal autóloga para RCC149 y RCC211. Por lo
tanto, el ARN del riñón humano sano se obtenía en el comercio
(Clontech, Heidelberg, Alemania) y se usaba como valor de
referencia para estos tumores.
Maduración de células dendríticas: Las células
dendríticas se prepararon usando sangre de donantes sanos.
Explicado brevemente, las PBMC se aislaban usando centrifugación en
gradiente estándar (Lymphocyte Separation Medium, PAA Laboratories
GmbH, Pasching, Austria) y se colocaban en placas a una densidad de
7 x 10^{6} células/ml en un medio X-Vivo 15.
Después de dos horas a 37ºC, se retiraban las células no adherentes
y los monocitos adherentes se cultivaban durante 6 días en un medio
X-Vivo con 100 ng/ml de GM-CSF y 40
ng/ml de IL-4 (AL-ImmunoTools,
Friesoythe, Alemania). El séptimo día, las células dendríticas
inmaduras se activaban con 10 ng/ml de TNF-\alpha
(R&D Systems, Wiesbaden, Alemania) y 20 \mug/ml de
poly(IC) (Sigma Aldrich, Steinheim, Alemania) durante 3
días.
Generación de linfocitos T CD4^{+} específicos
de antígeno: se estimulaban 10^{6} PBMC por pocillo con 2 x
10^{5} células dendríticas autólogas sensibilizadas de manera
repetida con péptidos (5\mug/ml). Las células se incubaban en
placas de 96 pocillos (7 pocillos por donante y péptido) con un
medio de linfocitos T: RPMI 1640 suplementado en presencia de 10
ng/ml de IL-12 (Promocell, Heidelberg, Alemania).
Después de tres a cuatro días de co-incubación a
37ºC, se añadía un medio fresco con 80 U/ml de IL-2
(Proleukin, Chiron Corporation, Emeryville, CA, EE. UU.) y 5 ng/ml
de IL-7 (Promocell). La reestimulaciones se
efectuaban con PBMC autólogas y péptidos con una frecuencia de
entre seis y ocho días.
Tinción de IFN\gamma intracelular: Después de
tres y cuatro rondas de estimulación, las PBMC se descongelaban,
lavaban dos veces en un medio X-Vivo 15, se volvían
a suspender a 10^{7} células/ml en medio de linfocitos T y se
cultivaban durante la noche. Al día siguiente, las PBMC,
sensibilizas de manera repetida con 5 \mug/ml de péptido, se
incubaban con células efectoras en una proporción de 1:1 durante 6
horas. Se añadía Golgi-Stop (Becton Dickinson,
Heidelberg, Alemania) para las últimas 4 horas de incubación.
Las células se analizaban usando un equipo
Cytofix/Cytoperm Plus (Becton Dickinson) y anticuerpos
CD4-FITC- (Immunotools),
IFN\gamma-PE- y CD8-PerCP clon SK1
(Becton Dickinson). Para los controles negativos se almacenaban e
incubaban células de siete pocillos sin péptidos o con una cantidad
irrelevante. Se usaban la estimulación con PMA/Ionomicina para el
control positivo. Las células se analizaban en un FACSCalibur de
tres colores (Becton Dickinson).
En condiciones normales no inflamatorias, las
moléculas HLA de clase II sólo deberían ser expresadas por células
del sistema hematopoyético y por el epitelio tímico (B. Mach, V.
Steimle, E. Martinez-Soria y W. Reith; 1996;
Regulation of MHC class II genes: lessons from a
disease. "Annu.Rev.Immunol." 14: 301-331).
La situación cambia durante la inflamación. La expresión de HLA de
clase II puede ser inducida en la mayoría de los tipos de células y
los tejidos mediante IFN\gamma (S. Leib und
Gut-Landmann, J. M. Waldburger, M. Krawczyk, L. A.
Otten, T. Suter, A. Fontana, H. Acha-Orbea y W.
Reith; 2004; Mini-review: Specificity and
expression of CIITA, the master regulator of MHC class II genes.
"Eur.J.Immunol." 34: 1513-1525). Debido a que
la incidencia de RCC viene a menudo acompañada de episodios
inflamatorios (J. Y. Blay, J. F. Rossi, J. Wijdenes, C.
Menetrier-Caux, S. Schemann, S. Negrier, T. Philip y
M. Favrot; 1997; Role of interleukin-6 in the
paraneoplastic inflammatory syndrome associated with
renal-cell carcinoma. "Int. J. Cancer" 72:
424-430. U. Elsässer-Beile, M.
Rindsfuser, T. Grussenmeyer, W. Schultze-Seemann y
U. Wetterauer; 2000; Enhanced expression of
IFN-gamma mRNA in CD4[+] or CD8[+]
tumor-infiltrating lymphocytes compared to
peripheral lymphocytes in patients with renal cell cancer.
"Br. J. Cancer" 83: 637-641), las moléculas de
clase II son expresadas en los alrededores de o por los tumores, tal
como se ha informado.
Los inventores analizaron la expresión de HLA de
clase II de diez muestras de RCC que comprendían carcinoma renal
histológico de células claras y papilar usando tinción
inmunohistoquímica y descubrieron que todas las muestras
investigadas revelaban células tumorales positivas de clase II. Tal
y como se ejemplifica en la figura 1A, a menudo se detectaba en el
margen del tumor una expresión pronunciada de HLA de clase II. En
éstas zonas, los inventores observaron un estrecha correlación
espacial de células tumorales positivas de HLA con células
inmunitarias destructoras de tumores, como se ilustra por la
visualización de macrófagos CD68^{+} en un corte histológico en
serie (figura 1B). En el RCC que revelaba una arquitectura más
papilar, la expresión de moléculas HLA de clase II se distribuía de
forma más uniforme por el tumor (figura 1 C, E, G). La comparación
de las muestras de tinción inmunohistoquímica de HLA de clase II y
CD68 en cortes histiológicos en serie demuestra claramente que,
además de los macrófagos, las células tumorales también expresan HLA
de clase II (figura 1 C, D y E, F). Se ha demostrado que los
linfocitos T_{H1} CD4^{+} productores de IFN\gamma así como
las células asesinas naturales (NK) se infiltrans en el RCC (J. M.
Cozar, J. Canton, M. Tallada, A. Concha, T. Cabrera, F. Garrido y
O. F. Ruiz-Cabello; 2005; Analysis of NK cells
and chemokine receptors in tumor infiltrating CD4 T lymphocytes in
human renal carcinomas. "Cancer Immunol.Immunother").
Teniendo en cuenta que se encontraron células tumorales positivas
de clase II predominantemente en las partes exteriores de los
tumores diseccionados, se podría especular que los leucocitos
atraídos por el tumor producen IFN\gamma que actúa en las células
malignas vecinas. La expresión anormal de moléculas HLA de clase II
en tejido neoplásico no está restringida al RCC. También puede
detectarse en el TCC y el CCA. La figura 4 muestra la tinción
inmunohistoquímica de tejido de muestra de adenocarcinoma humano
del colon.
Adicionalmente, los inventores investigaron la
expresión de HLA de clase II por medio del análisis comparativo de
la expresión génica, usando micromatrices de oligonucleótidos. Con
esta técnica, los inventores pudieron calcular la expresión total
de HLA de clase II en los tumores diseccionados independientemente
de los tipos de células de expresión. Los inventores analizaron la
expresión diferencial en cuatro tumores, RCC149, RCC180, RCC190 y
RCC211, en comparación con el riñón de referencia normal. En los
cuatro tumores, los genes codificadores de moléculas de HLA de
clase II se encontraron sobreexpresados (tabla 2). Una razón posible
de esto podría ser una expresión inducida por IFN\gamma y, por
ello, los inventores buscaron otros genes que se sabe son regulados
hacia arriba por interferones (N. A. Kolchanov, E. V. Ignatieva, E.
A. Ananko, O. A. Podkolodnaya, I. L. Stepanenko, T. I. Merkulova,
M. A. Pozdnyakov, N. L. Podkolodny, A. N. Naumochkin y A. G.
Romashchenko; 2002; Transcription Regulatory Regions Database
(TRRD): its status in 2002. "Nucleic Acids Res."
30: 312-317). Resulta interesante destacar que se
encontró un número considerable de estos genes sobreexpresado en
una o más muestras de tumores. La tabla 2 muestra genes inducibles
por interferón regulados hacia arriba de forma reproductiva en las
cuatro muestras, conforme a los descubrimientos anteriores de los
inventores (T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F.
Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler,
D. Wernet, S. Stevanovic y H. G. Rammensee; 2002; Integrated
functional genomics approach for the design of
patient-individual antitumor vaccines. "Cancer
Res." 62: 5818-5827). Entre ellos se encuentran
las proteínas LMP2, LMP7 y MECL1, que se intercambian por
subunidades constitutivas de la holoenzima proteolítica larga que
se encuentra en el citosol, la proteasoma, para formar la
inmuno-proteasoma. El intercambio de subunidades
proteolíticas expresadas de forma normal de la proteasoma por
subunidades inducidas por IFN\gamma constituye un proceso
distintivo en un medio rico en interferón. Adicionalmente, el
IFN\gamma se calculó directamente por PCR cuantitativo a tiempo
real (TaqMan). Los tumores de la tabla 2 mostraron una
sobreexpresión de IFN\gamma ARNm de 5 a 60 veces mayor en
comparación con las muestras autólogas de ARN normal del mismo
donante (no se muestran datos). De esta forma, los resultatos de los
inventores indican que el IFN\gamma podría tener un papel
importante en el RCC y ser la razón de la expresión abundante de
clase II.
\global\parskip1.000000\baselineskip
La expresión en las muestras de tumor se comparó
con riñones normales autólogos (RCC180, RCC190) o riñones sanos
mezclados (RCC149, RCC211). Todos los genes mostraron un
"aumento" en el algoritmo change-call
del software GCOS para los cuatro tumores y se han descrito como
inducibles por interferón.
\vskip1.000000\baselineskip
Conforme a datos disponibles al público, los
péptidos unidos por moléculas HLA de clase II expresados en tejido
de tumores sólidos hasta ahora no han sino aislados ni
identificados. Los inventores analizaron diez RCC distintos, tres
CCA y un TCC y pudieron aislar ligandos de HLA-DR de
todas las muestras, llegando a 453 péptidos en total (no se
muestran datos). Las secuencias de péptidos se determinaron uniendo
la separación cromatográfica y el análisis espectrométrico de masas
en tandem (LC-MS/MS), como se describió
anteriormente (T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M. Schirle, F.
Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K. H. Bichler,
D. Wernet, S. Stevanovic y H. G. Rammensee; 2002; Integrated
functional genomics approach for the design of
patient-individual antitumor vaccines.
"Cancer Res." 62: 5818-582. M. Schirle, W.
Keilholz, B. Weber, C. Gouttefangeas, T. Dumrese, H. D. Becker, S.
Stevanovic, H. G. Rammensee; Identification of
tumor-associated MHC class I ligands by a novel
T-cell-independent approach.
"Eur J Immunol."; 2000; 30(8): 2216-25).
En las figuras 5a y 5b se muestra un ejemplo de la secuenciación
de novo de péptidos por LC-MS/MS. Las
secuencias deducidas de aminoácidos primarios de fragmentos de
colisión anotadas en las figuras 5a y 5b se incluyen en la tabla 5.
Las muestras de tumor diferían en sus genotipos HLA, en su peso y en
el número total de ligandos de HLA identificados. La tabla 3
muestra una lista representativa de péptidos y las proteínas de
origen correspondientes identificados a partir de una muestra de
tumor, RCC190. Los péptidos se aislaron de moléculas HLA de clase
II de células, tal y como se describió anteriormente (J. Dengjel, P.
Decker, O. Schoor, F. Altenberend, T. Weinschenk, H. G. Rammensee y
S. Stevanovic; 2004; Identification of a naturally processed
cyclin D1 T-helper epitope by a novel combination
of HLA class II targeting and differential mass spectrometry.
"Eur.J.Immunol." 34: 3644-3651).
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
\vskip1.000000\baselineskip
(Tabla pasa a página
siguiente)
\newpage
Se muestran las secuencias centrales de ligandos
de HLA-DR aislados de RCC190
(HLA-DRB1*11, DRB1*15, DRB3, DRB5).
\vskip1.000000\baselineskip
No se encontró una correlación entre el peso del
tumor y el número de ligandos de HLA identificados. Las proteínas
de origen de los péptidos se pudieron dividir en dos grupos. Por una
parte se encontraron ligandos que deberían ser presentados por
leucocitos como péptidos de componentes de complementos (proteínas
alfa de unión a C4, C4A y C3, por ejemplo) y otras proteínas unidas
a funciones específicas de células del sistema inmunitario (CD14 y
proteína de unión al fragmento Fc de IgG, por ejemplo). Por otro
lado, los inventores pudieron revelar la naturaleza y
características de péptidos desconocidos presentados por células
tumorales de TAA sobreexpresado como, por ejemplo, de la vimentina,
la metaloproteinasa 7 de la matriz, el factor 1alfa de elongación de
traslación eucariótica y la nicotinamida
N-metiltransferasa. Esta observación coincide con
los datos inmunohistoquímicos (figuras 1 y 4) y demuestra que las
células tumorales positivas de HLA de clase II y los leucocitos
destructores estaban presentes en muestras analizadas y que los
péptidos eluídos provienen de antígenos sobreexpresados en estos
tipos definidos de
células.
células.
Con el fin de identificar péptidos de TAA, los
inventores compararon las proteínas de origen de los ligandos
individuales con los genes sobreexpresados detectados en análisis de
micromatrices de tumores (T. Weinschenk, C. Gouttefangeas, M.
Schirle, F. Obermayr, S. Walter, O. Schoor, R. Kurek, W. Loeser, K.
H. Bichler, D. Wernet, S. Stevanovic y H. G. Rammensee; 2002;
Integrated functional genomics approach for the design of
patient-individual antitumor vaccines.
"Cancer Res." 62: 5818-5827. T. Krüger,
O. Schoor, C. Lemmel, B. Kraemer, C. Reichle, J. Dengjel, T.
Weinschenk, M. Müller, J. Hennenlotter, A. Stenzl, H. G. Rammensee y
S. Stevanovic; 2004; Lessons to be learned from primary renal
cell carcinomas: novel tumor antigens and HLA ligands for
immunotherapy. "Cancer Immunol.Immunother"). Los inventores
identificaron un péptido, a partir de la proteína 3 de unión al
factor de crecimiento similar a la insulina,
IGFBP3_{166-181}, en el RCC190. Además, en el
TCC108 se encontraron dos variantes de este péptido,
IGFBP3_{169-181} y
IGFBP3_{169-184}, que contienen el mismo motivo
central de secuencia que es necesario y suficiente para permitir la
unión al HLA-DRB1*0101 (véase la tabla 1 como
referencia). A partir del mismo tumor se pudo aislar un péptido de
la metaloproteinasa 7 de la matriz, el
MMP7_{247-262}, (tabla 1). A nivel del ARNm, el
MMP7 y el IGFBP3 estaban sobreexpresados en 13 y 22 RCC de 23
analizados, respectivamente (no se muestran datos). En total, de 453
secuencias de péptidos identificadas inicialmente (no mostradas) se
han identificado los antígenoso de 49 péptidos (SEQ ID n.º 1 - 49)
como asociados a tumores, bien por experimentos de los inventores
(se incluyen los datos en este documento) o de otros (S. Miyamoto,
K. Yano, S. Sugimoto, G. Ishii, T. Hasebe, Y. Endoh, K. Kodama, M.
Goya, T. Chiba, y A. Ochiai; 2004; Matrix
metalloproteinase-7 facilitates
insulin-like growth factor bioavailability through
its proteinase activity on insulin-like growth
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Vesey, D. L. Nicol y D. W. Johnson; 2004; The roles of
IGF-I and IGFBP-3 in the regulation
of proximal tubule, and renal cell carcinoma cell
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Dunmire, Y. Feng, S. W. Zhang, H. Wang, C. Wu, H. Wang, G. N.
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Differential gene and protein expression in primary breast
malignancies and their lymph node metastases as revealed by
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Lin, J. M. Wen, S. H. Lau, L. Hu y X. Y. Guan; 2005; Oncogenic
role of clusterin overexpression in multistage colorectal
tumorigenesis and progression. "World J. Gastroenterol."
11: 3285-3289). El análisis de ejemplo del potencial
inmunoestimulatorio de péptidos unidos a alelos de
HLA-DR comunes revela la existencia de linfocitos T
CD4^{+} específicos de antígeno contra
IGFBP3_{169-181} y
MMP7_{247-262}.
MMP7_{247-262}.
La unión promiscua de la SEQ ID n.º 1 a varios
alelos de HLA-DR se puede revelar por varios
métodos: los ligandos de determinadas moléculas MHC/HLA transportan
aminoácidos relacionados químicamente en determinadas posiciones de
su secuencia primaria, lo que permite la definición de un motivo
peptídico para cada alelo de MHC/HLA (K. Falk, O. Rotzschke, S.
Stevanovic, G. Jung y H. G. Rammensee;
Allele-specific motifs revealed by sequencing of
self-peptides eluted from MHC molecules;
"Nature"; 1991; 351 (6324): 290-6). SYFPEITHI
utiliza matrices de motivos deducidas de motivos refinados basados
exclusivamente en el análisis de ligandos naturales por degradación
Edman y espectrometría de masas en tandem. Estas matrices permiten
la predicción de péptidos de una secuencia de proteínas dada que se
presenta en moléculas MHC de clase II o clase II (O. Rotzschke, K.
Falk, S. Stevanovic, G. Jung, P. Walden y H. G. Rammensee. Exact
prediction of a natural T-cell epitope; "Eur
J Immunol."; 1991; 21 (11): 2891-4).
Aplicando los principios de las predicciones
hechas por el algoritmo de SYFPEITHI (H. G. Rammensee, J. Bachmann
y S. Stevanovic; 1997; MHC Ligands and Peptide Motifs.
"Springer-Verlag", Heidelberg, Alemania. H.
Rammensee, J. Bachmann, N. P. Emmerich, O. A. Bachor, S. Stevanovic;
SYFPEITHI: database for MHC ligands and peptide
motifs; "Immunogenetics"; 1999; 50 (3-4):
213-9) a la mencionada secuencia peptídica de
ejemplo (SEQ ID n.º 1), se clasificó la unión de la SEQ ID n.º 1 a
varios alelos de HLA-DR comunes (véase tabla 7). El
algoritmo se ha usado con éxito para predecir epítopos de clase I y
clase II de varios antígenos como, por ejemplo, del TAA humano TRP2
(predicción de un ligando de HLA de clase I) (34) y SSX2
(predicción de un ligando de HLA de clase II) (Neumann F, Wagner C,
Stevanovic S, Kubuschok B, Schormann C, Mischo A, Ertan K, Schmidt
W y Pfreundschuh M; Identification of an
HLA-DR-restricted peptide epitope
with a promiscuous binding pattern derived from the cancer testis
antigen HOM-MEL-40/SSX2; "Int
J Cancer." 2004; 112 (4): 661-8). El umbral de
puntuación de 18 o más para una unión de importancia se definió en
base a los análisis de puntuaciones de uniones para ligandos
peptídicos de HLA-DR de unión promiscua publicadas
con anterioridad. La unión promiscua se define como la unión de un
péptido con buena fuerza de unión, revelada por una puntuación de
18 o más en el test SYFPEITHI, a dos o más alelos de
HLA-DR comunes. Los alelos de HLA-DR
más comunes se describen en la tabla 7. Los locus de
HLA-A y HLA-DR se encuentran en
combinaciones de desequilibrio de unión de HLA-A2 y
HLA-DR específico que se favorecen en comparación
con otros.Los genotipos de HLA-DR de los tumores de
origen se analizaron y se confirmó que, en ambos casos, se trataba
de los HLA-DRB1*11 y DRB1*15. En la tabla 4 se
describen los residuos de aminoácidos conservados preferidos para
los alelos de HLA de clase II más comunes (DRB1*0101, DRB1*0301,
DRB1*0401, DRB1*0701, DRB1*1101, and DRB1*1501). Por ejemplo, el
alelo de HLA de clase II DRB1*0301 enlaza preferentemente en su
surco de unión péptidos que muestran residuos específicos de
aminoácidos en las posiciones 1, 4, 6 y 9 del extremo N- a
C-terminal de la secuencia central de cualquier
péptido dado. Concretamente, el DRB1*0301 muestra una buena unión si
la secuencia central del péptido tiene un residuo de glutamato (D)
en la posición 4; L, I, F, M o V en la posición 1; K, R, E, Q o N en
la posición 6 y Y, L o F en la
posición 9.
posición 9.
\newpage
Se describen aminoácidos conservados o de
anclaje en un código de letras en las cavidades de unión
correspondientes.
Los resultados de los análisis in silicio
basados en algoritmos hechos por ordenador para la predicción de la
interacción entre moléculas de HLA y secuencias de péptidos
proporcionados a través de www.syfpeithi.de indican que el péptido
MMP7_{247-262} de SEQ ID n.º 1 se une de forma
promiscua a varios alelos de HLA-DR.
En conformidad con los resultados del análisis
predictivo, la puntuación de unión del péptido con SEQ ID n.º 1 es
alta para la interacción con DRB1*1101, DRB1*1501, DRB1*0401,
DRB1*0301 y DRB1*0101 (tabla 7). Los alelos de
HLA-DR analizados en este test para la interacción
con la secuencia de aminoácidos cubre, al menos, un 69,6% de la
población caucásica con HLA-A2 positivo (Mori M,
Beatty P. G, Graves M, Boucher K. M, Milford E. L; HLA gene and
haplotype frequencies in the North American population: the
National Marrow Donor Program Donor Registry;
"Transplantation"; 1997; 64 (7): 1017-27).
Teniendo en cuenta que no hay datos de frecuencia disponibles para
el HLA-DR15, el alelo no se tuvo en cuenta para
calcular la cobertura resultante de la población caucásica con
HLA-A2 positivo. Por lo tanto, es muy probable que
con la SEQ ID n.º 1, la cobertura de la población se aún mayor de
69,6%, lo que indica que el péptido tiene una excelente perspectiva
de servir como candidato para el desarrollo de preparaciones
farmacéuticas para la mayoría de pacientes de cáncer.
Sin embargo, la aplicación de los algoritmos de
predicción sólo lleva a resultados concluyentes si los resultados
de los análisis in silicio se combinan con la confirmación
experimental de la unión promiscua, como se ha demostrado con
estudios anteriores, que no pudieron mostrar respuestas inmunitarias
desencadenadas por una secuencia de péptidos que se suponía buen
agente de unión (Bohm C. M, Hanski M. L, Stefanovic S, Rammensee H.
G, Stein H, Taylor-Papadimitriou J, Riecken E. O,
Hanski C; Identification of
HLA-A2-restricted epitopes of the
tumor-associated antigen MUC2 recognized by human
cytotoxic T-cells; "Int J Cancer"; 1998;
75 (5): 688-93). La predicción de productos como los
mencionados en el caso anterior no puede descartarse, ya que los
algoritmos usados para la predicción no tienen en cuenta que una
secuencia de péptidos no se genera necesariamente en una situación
in vivo (dentro de células vivas). La confirmación
experimental se puede obtener mediante la recopilación de datos
in vitro de pruebas biológicas como, por ejemplo, la
demostración de la presencia o falta de inmunogenicidad de un
péptido. Por lo tanto, se obtuvo la confirmación experimental de la
unión promiscua de la SEQ ID n.º 1 mediante la recopilación de
dichos datos in vitro. Para probar la capacidad
inmuno-estimuladora de los péptidos por medio de
experimentos de sensibilización in vitro de linfocitos T, se
usaron las variantes más cortas ("secuencia central") de los
péptidos IGFBP3, IGFBP3_{169-181}, y del péptido
MMP7, MMP7_{247-262}.
Con el fin de generar linfocitos T CD4^{+}
específicos de antígeno y de probar la unión promiscua de los
péptidos, se estimularon PBMC de 4 donantes sanos con alelos
HLA-DR diferentes (figura 2), uno de ellos con
DRB1*1101, usando células dendríticas autólogas sensibilizadas de
forma reiterada con el péptido. Además, como control positivo se
usó el péptido CCND1_{198-212}, un conocido
epítopo de linfocito T (Dengjel J, Decker P, Schoor O, Altenberend
F, Weinschenk T, Rammensee H. G y Stevanovic S; 2004;
Identification of a naturally processed cyclin D1
T-helper epitope by a novel combination of HLA class
II targeting and differential mass spectrometry; "Eur. J.
Immunol." 34: 3644-3651). Como sistema de lectura
para la generación de linfocitos T CD4^{+} específicos de
antígeno, se calcularon los niveles de IFN\gamma mediante
citometría de flujo. Los linfocitos T se analizaron, después de las
estimulaciones semanales tercera y cuarta mediante tinción de
IFN\gamma intracelular, CD4-FITC y
CD8-PerCP, para determinar el porcentaje de células
productoras de IFN\gamma en subpoblaciones de linfocitos T
específicas. En todos los experimentos se efectuaron estimulaciones
con péptidos irrelevantes y sin péptidos como controles negativos.
La respuesta de IFN\gamma se consideró positiva cuando el
porcentaje de linfocitos T CD4^{+} productores de IFN\gamma fue
dos veces mayor en comparación con los controles negativos (Horton
H, Russell N, Moore E, Frank I, Baydo R,
Havenar-Daughton C, Lee D, Deers M, Hudgens M,
Weinhold K y Mc Elrath M. J; 2004; Correlation between
interferon- gamma secretion and cytotoxicity, in
virus-specific memory T-cells;
"J. Infect. Dis." 190: 1692-1696).
En tres de los cuatro donantes, los inventores
pudieron generar linfocitos T CD4^{+} específicos para ambos
péptidos (figura 2). Después de las estimulaciones, no se observaron
respuestas de linfocitos T en el donante 4. En el donante 1 se
detectó un porcentaje de 0,05 a 0,1 de linfocitos T CD4^{+}
productores de IFN\gamma (figura 3) en los siete intentos de
estimulación tras la tercera estimulación con el péptido
IGFBP3_{169-181}. Estos linfocitos T pudieron
expandirse, en la mayoría de los casos, a un porcentaje de entre
0,09 y 0,13 mediante una ronda adicional de estimulación. Los
linfocitos T CD4^{+} productores de IFN\gamma específicos para
el péptido IGFBP3_{169-181} también se observaron
en los donantes 2 y 3, con frecuencias máximas de linfocitos T
CD4^{+} productores de IFN\gamma de 0,05% y 0,07%.
Los donantes 1, 2 y 3 también mostraron
linfocitos T CD4^{+} reactivos al péptido
MMP7_{247-262}. Las frecuencias más altas de
linfocitos T CD4^{+} productores de IFN\gamma específicas para
el péptido MMP7 se encontraron en los donantes 1 y 2,
respectivamente. Los donantes 1, 2 y 3 mostraron respuestas
IFN\gamma al péptido CCND1_{198-212}, que ya
había sido descrito como un epítopo de linfocito T con restricción
de MHC de clase II (Dengjel J, Decker P, Schoor O, Altenberend F,
Weinschenk T, Rammensee H. G y Stevanovic S; 2004;
Identification of a naturally processed cyclin D1
T-helper epitope by a novel combination of HLA
class II targeting and differential mass spectrometry; "Eur.
J. Immunol." 34: 3644-3651).
Así, los péptidos de IGFBP3, MMP7 y CCND1 son
agentes de unión promiscuos de HLA de clase II capacer de provocar
respuestas de linfocitos T CD4^{+} en tres de cuatro donantes
sanos con alelos HLA DR diferentes. Si se comparan los alelos HLA
de los dos pacientes con tumor de los que derivan los péptidos
IGFBP3 y MMP7 con los de los cuatro donantes sanos, resulta obvio
que los péptidos son presentados por HLA-DRB1*01,
HLA-DRB1*04 y HLA-DRB1*11. Los tres
alotipos HLA DR mencionados anteriormente tienen un residuo de
glicina en la posición 86 y un residuo de ácido aspártico en la
posición 57 de sus cadenas \beta, respectivamente (véase
www.anthonynolan.com/HIG). Por lo tanto, sus características de
unión para las cavidades de unión P1 y P9 son muy similares
(Rammensee H. G, Bachmann J y Stevanovic S; 1997; MHC Ligands
and Peptide Motifs. "Springer-Verlag",
Heidelberg, Alemania). Ocurre lo mismo con el péptido
CCND1_{198-212}, un epítopo de linfocito T que se
sabe que es presentado por HLA-DRB1*0401 y
HLA-DRB1*0408 (Dengjel J, Decker P, Schoor O,
Altenberend F, Weinschenk T, Rammensee H. G y Stevanovic S; 2004;
Identification of a naturally processed cyclin D1
T-helper epitope by a novel combination of HLA
class II targeting and differential mass spectrometry; "Eur.
J. Immunol." 34: 3644-3651). El donante 4 lleva
HLA-DRB1*0318 y HLA-DRB1*1401,
alelos con motivos peptídicos que difieren en la secuencia primaria
de aminoácidos de sus cadenas \beta de las descritas más arriba.
Esto podría explicar por qué no fue posible provocar respuestas de
linfocitos T contra los dos péptidos usando células de este
donante.
Resulta interesante que los linfocitos T
citotóxicos CD8^{+} productores de IFN\gamma se detectasen en
dos donantes tras estimulaciones con los tres péptidos, en
particular en el donante 3, pero también, en menor medida, en el
donante 1 (no se muestran datos).
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Frecuencias de haplotipo de
población caucásica norteamericana. Se muestran los haplotipos
serológicos. "n.a." significa "no
asignado".
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Se muestran las puntuaciones de unión SYFPEITHI
de las SEQ ID n.º 1 y SEQ ID n.º 25 para los alelos
HLA-DRB1 más comunes en poblaciones caucásicas. Las
frecuencias de los correspondientes haplotipos serológicos de
caucásicos HLA-A2^{+} se dan entre paréntesis. Se
considera que los péptidos se unen suficientemente bien a una
molécula HLA de clase II si la puntuación es igual o mayor que
18.
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<110> Immatics biotechnologies GmbH
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<120> Péptidos asociados a tumores unidos
promiscuamente a moléculas de antígeno de leucocito humano (HLA) de
clase II
\vskip0.400000\baselineskip
<130> FB15795
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<160> 79
\vskip0.400000\baselineskip
<170> Versión PatentIn 3.3
1.
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<210> 1
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 1
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<210> 2
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<211> 17
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 2
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<210> 3
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<211> 16
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<400> 3
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<210> 4
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<213> Homo sapiens
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<211> 15
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<210> 48
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<211> 13
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<210> 50
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<210> 51
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<213> Homo sapiens
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<210> 52
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<213> Homo sapiens
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<213> Homo sapiens
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<400> 71
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<211> 15
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<212> PRT
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<400> 72
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<211> 16
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<213> Homo sapiens
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<400> 73
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<210> 74
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<211> 14
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<400> 74
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<400> 75
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<211> 19
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<213> Homo sapiens
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<210> 79
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<211> 16
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<212> PRT
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<213> Homo sapiens
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<400> 79
Claims (27)
1. Un péptido asociado a un tumor de entre 9 y
30 aminoácidos que comprende una secuencia conforme a la SEQ ID
43.
2. El péptido asociado a un tumor conforme a la
reivindicación 1, en donde el péptido consiste en la secuencia de
aminoácidos conforme a la SEQ ID n.º 43.
3. El péptido asociado a un tumor conforme a las
reivindicaciones 1 ó 2, que tiene la habilidad de unirse a una
molécula del complejo principal de histocompatibilidad humano (MHC)
de clase II, en particular al HLA-DRB1*0101.
4. El péptido asociado a un tumor conforme a la
reivindicación 3, con la habilidad de unirse a, al menos, una
molécula adicional del complejo principal de histocompatibilidad
humano (MHC) de clase II.
5. El péptido asociado a un tumor conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en donde el péptido
incluye enlaces no peptídicos.
6. El péptido asociado a un tumor conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en donde el péptido es
una proteína de fusión que, en particular, comprende aminoácidos
N-terminal de la cadena invariante (Ii) asociada a
un antígeno HLA-DR.
7. Un ácido nucleico que codifica,
exclusivamente, un péptido conforme a cualquiera de las
reivindicaciones de la 1 a la 6.
8. El ácido nucleico conforme a la
reivindicación 7 que es ADN, ADNc, ANP, ANC, ARN o combinaciones de
ellos.
9. Un vector de expresión capaz de expresar un
ácido nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8.
10. Una célula huésped que comprende un ácido
nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de
expresión conforme a la reivindicación 9.
11. La célula huésped conforme a la
reivindicación 10 que es un RCC recombinante o una célula
Awells.
12. Un método para producir un péptido asociado
a tumor conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6. El
método comprende el cultivo de la célula huésped conforme a la
reivindicación 10 ó 11 y el aislamiento del péptido de la célula
huésped o de su medio de cultivo.
13. Una composición farmacéutica que comprende
un péptido asociado a tumor conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico conforme a las
reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la
reivindicación 9 y un portador farmacéuticamente aceptable.
14. La composición farmacéutica conforme a la
reivindicación 13 que comprende, al menos, un péptido adicional
asociado a un tumor de entre 9 y 30 aminoácidos y que comprende, al
menos, una secuencia conforme a las SEQ ID n.º 1 a la SEQ ID n.º 42
y las SEQ ID n.º 44 a la SEQ ID n.º 49.
15. La composición farmacéutica conforme a las
reivindicaciones 13 y 14 en la forma de una vacuna contra el cáncer,
que opcionalmente comprende, al menos, un adyuvante apropiado.
16. Un péptido asociado a tumor conforme a
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, un ácido nucleico conforme
a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de expresión conforme a la
reivindicación 9 para su uso en medicina.
17. El uso de un péptido asociado a tumor
conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o un ácido
nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o un vector de
expresión conforme a la reivindicación 11 en la fabricación de un
medicamento para destruir células diana en un paciente cuyas células
diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos como la de cualquiera de las
reivindicaciones 1
a 4.
a 4.
18. El uso de un péptido asociado a un tumor
conforme a cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6 o de un ácido
nucleico conforme a las reivindicaciones 7 ó 8 o de un vector de
expresión conforme a la reivindicación 9 para la fabricación de un
medicamento para inducir una respuesta inmunitaria, en particular
una respuesta celular inmunitaria y, más particularmente, una
respuesta inmunitaria mediada por linfocitos T contra células de
tumores sólidos que expresan una molécula MHC humano de clase II en
su superficie y presentan un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos como las dadas en las reivindicaciones 1 a
4.
19. Un método para producir linfocitos T
citotóxicos (CTL) activados in vitro, método que comprende el
contacto in vitro de los CTL con moléculas humanas MHC de
clase II con carga de antígenos, expresadas en la superficie de una
célula presentadora de antígenos adecuada durante un periodo de
tiempo suficiente para activar, de una forma propia de los
antígenos, dichos CTL, en donde el antígeno es un péptido según
cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4.
20. El método conforme a la reivindicación 19,
en la que el antígeno se carga en moléculas MHC de clase II
expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno
adecuada por medio de la puesta en contacto de una cantidad
suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.
21. El método conforme a la reivindicación 19,
en la que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de
expresión conforme a la reivindicación 9.
22. El método conforme a cualquiera de las
reivindicaciones 19 a 21 en las que la molécula MHC de clase II es
HLA-DRB1*0101.
23. Los linfocitos T citotóxicos (CTL)
activados, producidos mediante el método conforme a cualquiera de
las reivindicaciones 19 a 22, que, de forma selectiva, reconocen
una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que
comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las
reivindicaciones 1 a 4.
24. Un receptor de linfocitos T (TCR) que
reconoce una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido
que comprende una secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de
las reivindicaciones 1 a 4, que se obtiene del linfocito T
citotóxico (CTL) de la reivindicación 23, o una molécula
funcionalmente equivalente al TCR.
25. Un ácido nucleico que codifica un receptor
de linfocitos T (TCR) conforme a la reivindicación 24.
26. Un vector de expresión capaz de expresar un
receptor de linfocitos T (TCR) conforme a la reivindicación 24.
27. El uso de linfocitos T citotóxicos como se
definió en la reivindicación 23 en la fabricación de un medicamento
para destruir células diana en un paciente cuyas células diana
expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una
secuencia de aminoácidos dada en cualquiera de las reivindicaciones
1 a 4.
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