ES2946584T3 - Nuevos péptidos y nuevas combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de ovario y otros tipos de cáncer - Google Patents

Abstract

La presente invención se refiere a péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y células para uso en métodos inmunoterapéuticos. En particular, la presente invención se refiere a la inmunoterapia del cáncer. La presente invención además se refiere a epítopos de péptidos de células T asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores que pueden servir, por ejemplo, como ingredientes farmacéuticos activos de composiciones de vacunas que estimulan respuestas inmunitarias antitumorales, o para estimular células T ex vivo y transferirlas a pacientes. Los péptidos unidos a moléculas del complejo principal de histocompatibilidad (MHC), o los péptidos como tales, también pueden ser objetivos de anticuerpos, receptores de células T solubles y otras moléculas de unión. (Traducción automática con Google Translate, sin valor legal)

Description

DESCRIPCIÓN

Nuevos péptidos y nuevas combinaciones de péptidos para el uso en la inmunoterapia contra el cáncer de ovario y otros tipos de cáncer

En términos generales, la presente invención concierne al campo de los péptidos, proteínas, ácidos nucleicos y células destinados a la utilización en métodos inmunoterapéuticos. Por lo tanto, la presente invención concierne al campo de la inmunoterapia contra el cáncer. La presente invención se refiere asimismo en general a epítopos peptídicos para linfocitos T asociados a tumores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores que, por ejemplo, pueden servir como principios activos farmacéuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales, o a estimular ex vivo linfocitos T que después serán transferidos a los pacientes. Los péptidos unidos a moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC), o los péptidos como tales, también pueden ser dianas de anticuerpos, de receptores de linfocitos T solubles, y de otras moléculas de unión.

En la presente memoria se describen varias secuencias peptídicas novedosas y sus variantes derivadas de moléculas HLA de las clases I y II de células tumorales humanas que pueden ser utilizadas en composiciones vacunales para desencadenar respuestas inmunitarias antitumorales o como dianas para el desarrollo de compuestos y células farmacéutica o inmunológicamente activos.

Antecedentes de la invención

Cáncer de ovario

Con cálculos que cifran en 239.000 los nuevos casos en 2012, el cáncer de ovario constituye el séptimo tipo más común de tumor en las mujeres, lo cual supone el 4% de todos los casos de cáncer que afectan a la población femenina. El índice de mortalidad del cáncer de ovario tiende a ser relativamente alto con respecto a otros tipos de tumores que afectan al aparato reproductor femenino, siendo la mortalidad más alta en contextos de escasos recursos. Por consiguiente, el cáncer de ovario es la octava causa de muerte por cáncer en la población femenina, con 152.000 decesos. En 2012, casi el 55% de los nuevos casos se produjeron en países con un nivel de desarrollo alto o muy alto; el 37% de los nuevos casos y el 39% de las muertes se concentran en Europa y Norteamérica. La incidencia alcanza su máximo en Europa septentrional y oriental, Norteamérica y Oceanía, y tiende a ser relativamente baja en África y gran parte de Asia. Los porcentajes de incidencia han descendido en algunos países con muy alto grado de desarrollo, especialmente en Europa y Norteamérica.

El cáncer de ovario más frecuente es el carcinoma ovárico, que es también una de las neoplasias malignas ginecológicas más mortíferas. A tenor de su histopatología y de la genética molecular, el carcinoma de ovario se divide en cinco grandes tipos: seroso de alto grado (70%), endometrioide (10%), de células claras (10%), mucinoso (3%), y seroso de bajo grado (< 5%), que juntos suman más del 95% de los casos. Mucho menos frecuentes son los tumores malignos de células germinales (disgerminomas, tumores del saco vitelino y teratomas inmaduros) con el 3% de todos los casos de cáncer de ovario, y los tumores estromales del cordón sexual potencialmente malignos, con un 1 o 2%, el más frecuente de los cuales es el tumor de células de la granulosa.

Los carcinomas de ovario afectan con más frecuencia a las mujeres nulíparas y con menos frecuencia a las mujeres cuya ovulación está inhibida, ya sea por el embarazo o por la toma de anticonceptivos orales. En general, se considera que tales tumores se originan en las células que tapizan la superficie del ovario o el peritoneo pélvico.La transformación maligna de este mesotelio ha sido explicada por la teoría de la «ovulación incesante» (La, 2001).

Los antecedentes familiares de cáncer de ovario explican el 10% de los casos; el riesgo se triplica cuando dos o más familiares de primer grado han sido afectadas. Las portadoras de mutaciones germinales en BRCA1 o BRCA2 presentan un riesgo del 30% al 70% de sufrir cáncer de ovario, principalmente de carcinomas serosos de alto grado a los 70 años de edad (Risch et al., 2006).

La resección quirúrgica es el tratamiento de elección tanto en el carcinoma de ovario inicial como avanzado. El objetivo último es la extirpación completa de la masa tumoral con tejido circundante sano. A la extirpación le sigue la quimioterapia sistémica con análogos del platino, excepto en los tumores ováricos de grado muy bajo (estadio IA, grado 1), para los que no está indicada la quimioterapia posquirúrgica. En el cáncer de ovario avanzado, la quimioterapia de primera línea comprende una combinación de carboplatino con paclitaxel, que se puede complementar con bevacizumab. El tratamiento habitual contra los tumores ováricos resistentes al platino consiste en la monoterapia con los siguientes quimioterápicos: doxorrubicina pegilada liposómica, topotecán, gemcitabina o paclitaxel (S3-Leitlinie maligne Ovarialtumore, 2013).

La inmunoterapia parece ser una estrategia prometedora para mejorar el tratamiento de las pacientes con cáncer de ovario, como la presencia de linfocitos infiltrantes en el tumor proinflamatorios, sobre todo los linfocitos T CD8-positivos, se correlaciona con un buen pronóstico y es posible aislar del tejido canceroso linfocitos T específicos para antígenos asociados a tumor.

Por consiguiente, se están invirtiendo mucho esfuerzo en la investigación de inmunoterapias contra el cáncer de ovario. Ya se ha llevado a cabo un considerable número de estudios preclínicos y clínicos y hay más estudios en curso en estos momentos. Hay disponibles datos clínicos de la terapia con citocinas, vacunación, anticuerpos monoclonales, trasplante de células e inmunomodulación.

La terapia con citocinas con interleucina-2, interferón-alfa, interferón-gamma o el factor estimulador de las colonias de granulocitos (GMC-SF) persiguen potenciar la respuesta inmunitaria antitumoral del paciente y han mostrado resultados prometedores en pequeñas cohortes de estudios.

Los estudios de vacunación de fase I y II, con uno ovarios péptidos, derivados de varias proteínas asociadas a tumores (Her2/neu, NY-ESO-1, p53, tumor de Wilms-1) o antígenos tumorales enteros, derivados de células tumorales autólogas han revelado un buen perfil de seguridad y tolerabilidad, pero con escaso o moderado efecto clínico.

Se cree que los anticuerpos monoclonales que reconocen específicamente proteínas asociadas a tumores potencian la destrucción de las células tumorales a manos de las células inmunitarias. Los anticuerpos anti-CA-125 oregovomab y abagovomab así como el anticuerpo anti-EpCAM catumaxomab han conseguido resultados prometedores en estudios de fase II y III. En cambio, el anticuerpo anti-MUC1 HMFG1 no logró mejorar claramente la supervivencia en un estudio de fase III.

Otra estrategia alternativa recurre a anticuerpos monoclonales para reconocer y bloquear factores de crecimiento de receptores de supervivencia de las células tumorales. Si bien la administración de trastuzumab (anticuerpo anti-HER2/neu) con MOv18 y MORAb-003 (anticuerpos anti-receptor de folato alfa) solo confirió un escaso beneficio clínico a los pacientes con cáncer de ovario, la adición de bevacizumab (anticuerpo anti-VEGF) a la quimioterapia estándar en el cáncer de ovario avanzado parece ser beneficiosa.

La administración de células inmunitarias de donante se ha saldado con resultados variopintos en ensayos clínicos. La transferencia de linfocitos T infiltrantes del tumor autólogos cultivados in vitro ha demostrado ser un enfoque prometedor en un ensayo piloto. En cambio, la transferencia de linfocitos T portadores de un receptor antigénico quimérico específico del receptor del folato alfa no indujo una respuesta clínica significativa en un ensayo de fase I. La estimulación de las células dendríticas con un lisado de células tumorales o con proteínas asociadas a tumor in vitro potenció la respuesta de los linfocitos T antitumorales tras su transferencia, pero la magnitud de la activación de dichos linfocitos no se correlacionó con efectos clínicos. La transferencia de células NK causó toxicidades significativas en un estudio de fase II.

Tanto la inmunidad antitumoral intrínseca como la inmunoterapia se ven obstaculizadas por el microentorno inmunosupresor del tumor. Para vencer ese obstáculo se han probado fármacos inmunomoduladores como la ciclofosfamida, así como anticuerpos anti-CD25 y doxorrubicina pegilada liposómica en combinación con la inmunoterapia. Los datos más fiables disponibles a día de hoy corresponden al ipilimumab, un anticuerpo anti-CTLA4, que potencia la actividad de los linfocitos T. El ipilimumab ha ejercido efectos antitumorales significativos en pacientes con cáncer de ovario (Mantia-Smaldone et al., 2012).

A la vista de los graves efectos secundarios y del coste que comporta el tratamiento del cáncer, existe la necesidad de descubrir factores que puedan ser usados para el tratamiento del cáncer en general y, en particular, del cáncer de ovario. Existe asimismo la necesidad de descubrir factores que puedan servir como biomarcadores del cáncer en general y del cáncer de ovario en particular, con vistas a mejorar el diagnóstico, la valoración del pronóstico y la predicción del éxito terapéutico.

La inmunoterapia antitumoral representa una opción de tratamiento dirigido contra la células cancerosas que reduce los efectos secundarios. La inmunoterapia antitumoral aprovecha la existencia de los antígenos asociados a tumores. La clasificación actual de los antígenos asociados a tumores (TAA) comprende los siguientes grupos principales:

a) Antígenos cáncer-testículo: Los primeros TAA descubiertos que pueden ser reconocidos por linfocitos T pertenecen a esta clase, que inicialmente se denominó antígenos cáncer-testículo (CT) porque sus miembros se expresan en tumores humanos histológicamente diferentes y en los tejidos normales solo se encuentran en los espermatocitos/espermatogonias del testículo y ocasionalmente en la placenta. Como las células del testículo no expresan moléculas HLA de clase I y II, estos antígenos no pueden ser reconocidos por los linfocitos T de los tejidos normales y, por tanto, se consideran como específicos de tumor desde el punto de vista inmunológico. Ejemplos conocidos de antígenos CT son los miembros de la familia MAGE y el NY-ESO-1.

b) Antígenos de diferenciación: Estos TAA son compartidos por los tumores y por el tejido normal del que deriva el tumor. La mayoría de los antígenos de diferenciación conocidos se halla en los melanomas y en los melanocitos normales. Muchas de esas proteínas relacionadas con el linaje melanocítico participan en la biosíntesis de la melanina y no son específicas de tumor, lo que no impide que sean muy utilizadas en la inmunoterapia contra el cáncer. Algunos ejemplos son la tirosinasa y Melan-NMART-1 en el melanoma y el PSA en el cáncer de próstata. c) TAA sobreexpresados: Se han detectado genes que codifican TAA de amplia expresión en tumores histológicamente distintos y en numerosos tejidos normales, en general con niveles de expresión más bajos. Es posible que muchos de los epítopos procesados y posiblemente presentados por los tejidos normales lo sean por debajo del límite necesario para ser reconocidos por los linfocitos T, pero que la sobreexpresión por parte de las células tumorales rompa la tolerancia vigente hasta ese momento y desencadene la respuesta antitumoral. Ejemplos destacados de esta clase de TAA son Her-2/neu, survivina, telomerasa o WT1.

d) Antígenos específicos de tumor: Estos TAA únicos son fruto de mutaciones de genes normales (como pcatenina, CDK4, etc.) Algunos de esos cambios moleculares están relacionados con la transformación neoplásica y/o su progresión. Los antígenos específicos de tumor generalmente son capaces de inducir potentes respuestas inmunitarias sin riesgo de reacciones autoinmunitarias contra los tejidos normales. Por otro lado, casi siempre estos TAA solo son relevantes para el mismo tumor exacto en el que fueron identificados y normalmente no se encuentran en muchos otros tumores de su tipo. La especificidad (o asociación) tumoral de un péptido también puede surgir si el péptido procede de un exón del (asociado con) tumor en el caso de proteínas con isoformas específicas de tumor (asociadas con el mismo).

e) TAA resultantes de modificaciones postraduccionales anormales: Estos TAA pueden surgir a partir de proteínas que no son específicas ni se sobreexpresan en los tumores, pese a lo cual aparecen asociados a tumores por procesos postraduccionales que se activan principalmente en los tumores. Ejemplos de este tipo surgen a raíz de patrones de glucosilación alterados que generan epítopos nuevos en tumores, tal y como sucede con MUC1, o de fenómenos como el ayuste de proteínas durante la degradación, que en algunos casos pueden ser específicos de tumor.

f) Proteínas de oncovirus: Estos TAA son proteínas virales que podrían desempeñar un papel crítico en el proceso oncogénico y que, como extrañas a causa de su origen no humano, pueden desencadenar una respuesta de los linfocitos T. Ejemplos de tales proteínas son las proteínas E6 y E7 del virus del papiloma humano de tipo 16, que se expresan en el carcinoma de cuello uterino.

La inmunoterapia basada en los linfocitos T tiene como diana los epítopos peptídicos procedentes de proteínas específicas del tumor o asociadas al mismo, que son presentados por moléculas del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC). Los antígenos que son reconocidos por los linfocitos T específicos del tumor, esto es, los epítopos, pueden ser moléculas derivadas de todo tipo de proteínas, tales como enzimas, receptores, factores de transcripción, etc., que son expresadas y que, en comparación con células inalteradas del mismo origen, están reguladas al alza en las células del tumor correspondiente.

Existen dos tipos de moléculas MHC: Las MHC de clase I y las MHC de clase II. Las moléculas MHC de clase I están compuestas por una cadena pesada alfa y una beta-2-microglobulina, y las moléculas de clase II por una cadena alfa y otra beta. Su conformación tridimensional da como resultado una hendidura de unión que interviene en la interacción no covalente con los péptidos.

Las moléculas MHC de clase I se encuentran en la mayoría de las células nucleadas. Presentan péptidos procedentes de la proteólisis mayoritariamente de proteínas endógenas, productos ribosómicos defectuosos (DRIP) y péptidos grandes. No obstante, los péptidos derivados de compartimentos endosómicos o de fuentes exógenas también se encuentran con frecuencia ligados a moléculas MHC de clase I. Esta vía no clásica de presentación por la clase I se denomina presentación cruzada en la bibliografía (Brossart and Bevan, 1997; Rock et al., 1990). Las moléculas MHC de clase II, que se encuentran mayoritariamente en las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, presentan principalmente péptidos de proteínas exógenas o transmembrana que son captadas por las APC mediante endocitosis y después procesadas por las mismas.

Los complejos constituidos por péptidos y moléculas MHC de clase I son reconocidos por los linfocitos T CD8-positivos portadores del receptor de linfocito T (TCR) adecuado, mientras que los complejos formados por péptidos y moléculas MHC de clase II son reconocidos por los linfocitos T cooperadores CD4-positivos portadores del TCR apropiado. Es bien sabido que el TCR, el péptido y el MHC están presentes en una relación estequiométrica de 1:1:1.

Los linfocitos T cooperadores CD4-positivos desempeñan un papel importante en la inducción y en el mantenimiento de respuestas eficaces por parte de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos. La identificación de los epítopos reconocidos por los linfocitos T CD4-positivos derivados de los antígenos asociados a tumor (TAA) reviste gran importancia para el desarrollo de productos farmacéuticos que desencadenen respuestas inmunitarias antitumorales (Gnjatic et al., 2003). Los linfocitos T cooperadores generan en el seno del tumor un entorno de citocinas que es propicio para los linfocitos T citotóxicos (CTL) (Mortara et al., 2006) que atrae a las células efectoras, como por ejemplo los propios CTL, células NK, macrófagos o granulocitos.

En ausencia de inflamación, la expresión de las moléculas MHC de clase II se circunscribe principalmente a las células del sistema inmunitario, en concreto a las células presentadoras de antígeno (APC) especializadas, como por ejemplo monocitos, células derivadas de monocitos, macrófagos y células dendríticas. En pacientes con cáncer se ha descubierto que las células del tumor expresan moléculas MHC de clase II (Dengjel y cols., 2006).

Los péptidos alargados pueden actuar como epítopos activos para las MHC de clase II.

Los linfocitos T cooperadores, activados por epítopos de MHC de clase II, desempeñan un papel importante en la coordinación de la función efectora de los CTL en la inmunidad antitumoral. Los epítopos reconocidos por los linfocitos T cooperadores que desencadenan una respuesta de los linfocitos T cooperadores del tipo TH1 apoyan las funciones efectoras de los linfocitos T citotóxicos CD8-positivos, que incluyen funciones citotóxicas dirigidas contra las células tumorales que muestran en su superficie complejos de MHC/péptido asociado a tumor. De esta forma, los epítopos de los péptidos asociados a tumores que son reconocidos por los linfocitos T cooperadores, solos o en combinación con otros péptidos asociados a tumores, pueden servir como principios activos farmacéuticos en composiciones vacunales destinadas a estimular respuestas inmunitarias antitumorales.

En modelos de mamífero como el ratón se ha demostrado que los linfocitos T CD4-positivos pueden inhibir la manifestación de los tumores aun sin el concurso de los linfocitos T CD8-positivos a través de la inhibición de la angiogenia mediante la secreción de interferón gamma (IFN-^y) (Beatty and Paterson, 2001; Mumberg et al., 1999). Existen indicios de que los linfocitos T CD4 actúan directamente como agentes efectores antitumorales (Braumuller et al., 2013; Tran et al., 2014).

Dado que la expresión constitutiva de las moléculas HLA de clase II suele ser exclusiva de las células inmunitarias, la posibilidad de aislar péptidos de clase II directamente de tumores primarios no se consideraba factible. Pero Dengjel y cols. descubrieron varios epítopos de MHC de clase II directamente en tumores (WO 2007/028574, EP 1760 088 B1).

Dado que ambos tipos de respuesta, la dependiente de CD8 y la de CD4, contribuyen conjunta y sinérgicamente al efecto antitumoral, la identificación y caracterización de los antígenos asociados a tumor reconocidos por los linfocitos T CD8+ (ligando: moléculas de MHC de clase I epítopo peptídico) o por los linfocitos T colaboradores CD4+ (ligando: moléculas de MHC de clase II epítopo peptídico) es importante para el desarrollo de vacunas antitumorales.

Para desencadenar la respuesta inmunitaria celular el péptido de MHC de clase I ha de unirse a una molécula de MHC. Este proceso depende del alelo de la molécula m Hc y de los polimorfismos específicos de la secuencia de aminoácidos del péptido. Los péptidos que se unen a las MHC de clase I suelen tener una longitud de 8 a 12 residuos de aminoácidos y suelen contener dos residuos conservados (“anclaje”) en su secuencia que interactúan con la hendidura de unión correspondiente de la molécula de MHC. De este modo cada alelo MHC posee un “motivo de unión” que determina qué péptidos se pueden unir específicamente a la hendidura de unión.

En la reacción inmunitaria dependiente de las MHC de clase I, los péptidos no solo tienen que ser capaces de unirse a ciertas moléculas MHC de clase I expresadas por las células tumorales, también tienen que ser reconocidos por linfocitos T portadores de receptores TCR específicos.

Para que las proteínas sean reconocidas por los linfocitos T como antígenos específicos o asociados a tumor y puedan ser empleadas como tratamiento, deben cumplir ciertos prerrequisitos. El antígeno debe ser expresado principalmente por células tumorales y no por tejidos sanos normales o, de hacerlo, debe serlo en cantidades comparativamente pequeñas. En una forma de realización preferida, el péptido debe ser presentado en exceso por las células tumorales con respecto a los tejidos sanos normales. Y no sólo es conveniente que el antígeno de interés esté presente únicamente en un tipo de tumor, sino que lo esté también en altas concentraciones (número de copias del péptido por célula). Los antígenos específicos de tumor y asociados a tumor proceden a menudo de proteínas que intervienen directamente en la transformación de una célula normal en una tumoral a causa de su función, por ejemplo porque intervienen en el control del ciclo celular o en la supresión de la apoptosis. Además, también las dianas ulteriores de las proteínas que son las causantes directas de la transformación pueden estar reguladas al alza y, por tanto, estar asociadas indirectamente al tumor. Tales antígenos asociados indirectamente a los tumores también pueden ser las dianas para una estrategia de vacunación (Singh-Jasuja et al., 2004). En ambos casos es esencial que la secuencia de aminoácidos del antígeno contenga epítopos, puesto que el péptido («péptido inmunogénico») derivado de un antígeno asociado a tumor debe desencadenar una respuesta de los linfocitos T en condiciones in vitro o in vivo.

Básicamente, cualquier péptido capaz de unirse a una molécula de MHC puede actuar como un epítopo de linfocito T. Un prerrequisito para la inducción de una respuesta de linfocitos T in vitro o in vivo es la presencia de un linfocito T dotado del correspondiente TCR y la ausencia de tolerancia inmunitaria hacia ese epítopo en particular.

Por consiguiente, los TAA son un punto de partida para el desarrollo de una terapia basada en linfocitos T incluidas, entre otras, las vacunas antitumorales. Los métodos para identificar y caracterizar los TAA están basados en el uso de linfocitos T que pueden aislarse de pacientes o de individuos sanos, o están basados en la generación de perfiles de transcripción diferenciales o patrones de expresión peptídica diferenciales entre los tumores y los tejidos normales. No obstante, la identificación de genes sobreexpresados o expresados selectivamente en tejidos tumorales o en estirpes de células tumorales humanas no aporta información precisa acerca del uso de los antígenos transcritos de esos genes en la inmunoterapia. Ello se explica porque solo una subpoblación individual de epítopos de esos antígenos resulta adecuada para aplicaciones de ese tipo, puesto que ha de haber un linfocito T con el TCR correspondiente y la inmunotolerancia hacia ese epítopo concreto ha de ser mínima o nula. Por tanto, es importante seleccionar únicamente aquellos péptidos que sean presentados en exceso o de forma selectiva contra los cuales se encuentre un linfocito T funcional y/o proliferativo. Un linfocito T funcional se define como un linfocito T que tras la estimulación con un antígeno específico puede sufrir una expansión clonal y ser capaz de ejecutar funciones efectoras («linfocito T efector»).

En el caso de dirigir la acción contra complejos péptido-MHC a través de TCR específicos (p. ej., TCR solubles) y de los anticuerpos u otras moléculas de unión (soportes) conformes a la invención, la inmunogenicidad de los péptidos subyacentes es secundaria. En tales casos, la presentación es el factor determinante.

Resumen de la invención

La presente invención concierne a un péptido consistente en la SEQ ID N.° 53 (MEHPGKLLF) o a una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

En una forma de realización, dicho péptido tiene la capacidad para unirse a una molécula MHC de clase I o II, y dicho péptido, cuando está unido a dicho m Hc , es capaz de ser reconocido por linfocitos T CD4 y/o CD8.

La presente invención concierne, además, a un anticuerpo, preferentemente a un anticuerpo monoclonal o a un fragmento del mismo, que reconoce específicamente el péptido acorde con la invención, preferentemente el péptido acorde con la invención cuando está unido a una molécula del MHC.

La presente invención concierne, además, a un receptor de linfocito T o a un fragmento del mismo, que reconoce específicamente un ligando del MHC, en que dicho ligando es el péptido acorde con la invención cuando está unido a una molécula del MHC.

En una forma de realización de la invención, dicho receptor de linfocito T se provee como una molécula soluble y opcionalmente está dotado de otra función efectora como es un dominio inmunoestimulador o una toxina.

La presente invención concierne, además, a una célula hospedadora recombinante que comprende el péptido acorde con la invención, el anticuerpo o fragmento del mismo acorde con la invención, el receptor de linfocito T o fragmento del mismo acorde con la invención, en que dicha célula hospedadora se selecciona preferentemente de una célula presentadora de antígeno, como una célula dendrítica, un linfocito T o una célula NK.

La presente invención concierne, además, a un método in vitro para producir linfocitos T activados, método que comprende la puesta en contacto de linfocitos T in vitro con antígeno cargado en moléculas MHC de clase I o II humanas que se expresan en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada o en un constructo artificial que emula a una célula presentadora de antígeno durante un período de tiempo suficiente para activar dichos linfocitos T de un modo específico de antígeno, siendo dicho antígeno un péptido acorde con la invención.

La presente invención concierne, además, a un linfocito T activado, producido con el método acorde con la invención, que reconoce selectivamente una célula que presenta un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en la invención.

La presente invención concierne, además, a una composición farmacéutica que comprende al menos un ingrediente activo seleccionado del grupo consistente en el péptido acorde con la invención, el anticuerpo o fragmento del mismo acorde con la la invención, el receptor de linfocito T o fragmento del mismo acorde con la invención, la célula hospedadora acorde con la invención, o el linfocito T activado acorde con la invención, o un ingrediente activo marcado o conjugado, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente, excipientes y/o estabilizantes farmacéuticamente aceptables.

La presente invención concierne, además, a un método para producir el péptido acorde con la invención, el anticuerpo o un fragmento del mismo acorde con la invención, o el receptor de linfocito T o un fragmento del mismo acorde con la invención, método que comprende el cultivo de la célula hospedadora acorde con la invención, y el aislamiento del péptido, del anticuerpo o de un fragmento del mismo o del receptor de linfocito T o de un fragmento del mismo a partir de dicha célula hospedadora y/o de su medio de cultivo.

De forma similar, la presente invención concierne al péptido acorde con la invención, al anticuerpo o a un fragmento del mismo acorde con la invención, al receptor de linfocito T o a un fragmento del mismo acorde con la invención, a la célula hospedadora acorde con la invención, o al linfocito T activado acorde con la invención para el uso en medicina. La presente invención concierne, además, al péptido acorde con la invención, al anticuerpo o a un fragmento del mismo acorde con la invención, al receptor de linfocito T o a un fragmento del mismo acorde con la invención, a la célula hospedadora acorde con la invención o al linfocito T activado acorde con la invención para el uso en el diagnóstico y/o el tratamiento del cáncer.

La presente invención concierne, además, a un equipo, que comprende: (a) un envase que contiene una composición farmacéutica que contiene el péptido acorde con la invención, el anticuerpo o un fragmento del mismo acorde con la invención, el receptor de linfocito T o un fragmento del mismo acorde con la invención, la célula hospedadora acorde con la invención, o el linfocito T activado acorde con la invención, en forma de solución o liofilizado;

(b) opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o solución de reconstitución para la formulación liofilizada;

(c) opcionalmente, (I) instrucciones de uso de la solución o (II) de la reconstitución y/o de uso de la formulación liofilizada.

En una forma de realización de la invención, el equipo puede comprender además uno o más de los siguientes componentes: (III) un tampón, (IV) un diluyente, (V) un filtro, (VI) una aguja, o (VII) una jeringa.

En la presente memoria se da a conocer un péptido que comprende una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID N.° 1 a la SEQ I^d N.° 52 y en la SEQ ID N.° 54 a la SEQ ID N.° 772 o a una secuencia variante de la misma que es homóloga al menos en un 77%, preferiblemente al menos un 88% (preferiblemente idéntica al menos en un 77% o al menos en un 88%) a las SEQ iD N.° 1 a SEQ ID N.° 52 y a las SEQ ID N.° 54 a SEQ ID N.° 772, en que dicha variante se une a MHC y/o estimula linfocitos T que presentan reactividad cruzada con dicho péptido, o con una sal farmacéuticamente aceptable del mismo, no siendo dicho péptido el polipéptido entero del que derivaría.

En la presente memoria se da a conocer también un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en la SEQ ID N.° 1 a la SEQ ID N.° 52 y en la SeQ ID N.° 54 a la SEQ ID N.° 772 o una variante de las mismas, que es homóloga al menos en un 77%, preferiblemente al menos en un 88% (preferiblemente idéntica al menos en un 77% o al menos en un 88%) a las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 52 y a las SEQ ID N.° 54 a SEQ ID N.° 772, en que dicho péptido o una variante del mismo tiene una longitud total de entre 8 y 100, preferiblemente de entre 8 y 30, y más preferiblemente de entre 8 y 14 aminoácidos.

Las tablas siguientes muestran el péptido acorde con la presente invención y otros péptidos dados a conocer en la presente memoria, sus respectivas s Eq ID N.°, y los probables genes originarios (subyacentes) de tales péptidos. En la Tabla 1, los péptidos con las SEQ ID N.° 1 a la SEQ ID N.° 9 se unen a HLA-A*02, los péptidos con la SEQ ID N.° 10 a la SEQ ID n.° 19 se unen a HLA-A*24, los péptidos con la SEQ ID N.° 20 a la SEQ ID N.° 30 se unen a HLA-A*03, el péptido con la SEQ ID N.° 31 se une a HLA-A*01, los péptidos con la SEQ ID N.° 32 a la SEQ ID N.° 41 se unen a HLA-B*07, los péptidos con la SEQ ID N.° 42 a la SEQ iD N.° 51 se unen a HLA-B*08, los péptidos con la SEQ ID N.° 52 a la SEQ ID N.° 59 se unen a HLA-B*44. En la Tabla 2, los péptidos con las SEQ ID N.° 60 a la SEQ ID N.° 75 se unen a HLA-A*02, los péptidos con la SEQ ID N.° 76 a la SEQ ID n.° 82 se unen a HLA-A*24, los péptidos con la SEQ ID N.° 83 a la SEQ ID N.° 111 se unen a HLA-A*03, los péptidos con la SEQ ID N.° 112 a la SeQ ID n.° 116 se unen a HLA-A*01, los péptidos con la SEQ ID N.° 117 a la ^s E^q ID N.° 149 se unen a HLA-B*07, los péptidos con la SEQ ID N.° 150 a la SEQ ID N.° 172 se unen a HLA-B*08, los péptidos con la SEQ ID N.° 173 a la SEQ ID N.° 215 se unen a HLA-B*44. En la Tabla 3, los péptidos con las SEQ ID N.° 216 a la SEQ ID N.° 245 se unen a HLA-A*02, los péptidos con la SEQ ID N.° 246 a la SEQ ID n.° 255 se unen a HLA-A*24, los péptidos con la SEQ ID N.° 256 a la SEQ ID N.° 287 se unen a HLA-A*03, los péptidos con la SEQ ID N.° 288 a la s Eq ID n.° 292 se unen a HLA-A*01, los péptidos con la SEQ ID N.° 293 a la SEQ ID N.° 392 se unen a HLA-B*07, los péptidos con la SEQ ID N.° 393 a la SEQ ID N.° 395 se unen a HLA-B*08, los péptidos con la SEQ ID N.° 396 a la ^s E^q ID N.° 438 se unen a HLA-B*44. En la Tabla 4, los péptidos con las SEQ iD N.° 439 a la SEQ ID N.° 551 se unen a varios alelos HLA de clase I, el péptido con la SEQ ID N.° 773 se une a HLA-A*02, el péptido con la SEQ ID N.° 774 se une a HLA-A*24. En la Tabla 5, los péptidos con las SEQ ID N.° 552 a la SEQ ID N.° 772 se unen a varios alelos HLA de clase II.

T l 1: El i nf rm l r n inv n i n r i n r n l r n m m ri .

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T l 2: P i i i n l n r n l r n m m ri .

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T l : P i i i n l n r n l r n m m ri .

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T l 4: P i HLA l I n r n l r n m m ri .

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La presente invención, además, concierne en general al péptido acorde con la presente invención para el uso en medicina, como en el tratamiento de enfermedades proliferativas, como, por ejemplo, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, glioblastoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica, linfoma no hodgkiniano, leucemia mieloide aguda, cáncer de vesícula biliar y colangiocarcinoma, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, y mesotelioma.

La presente invención concierne al péptido acorde con la invención (véase la Tabla 1) y a sus usos en la inmunoterapia del cáncer de ovario, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, glioblastoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica, linfoma no hodgkiniano, leucemia mieloide aguda, cáncer de vesícula biliar y colangiocarcinoma, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, mesotelioma, y preferentemente el cáncer de ovario.

Así pues, otro aspecto de la presente invención concierne al uso del péptido acorde con la presente invención para el uso en medicina. En formas de realización preferidas, dicho uso medicinal concierne al tratamiento de una enfermedad proliferativa seleccionada entre el grupo formado por cáncer de ovario, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, glioblastoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica, linfoma no hodgkiniano, leucemia mieloide aguda, cáncer de vesícula biliar y colangiocarcinoma, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, y mesotelioma.

La presente invención se refiere, además, al péptido acorde con la presente invención que tiene la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o -en una forma más larga-, como variante de longitud, a una molécula MHC de clase II.

La presente invención se refiere, además, al péptido acorde con la presente invención en que dicho péptido consiste en una secuencia de aminoácidos conforme a las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 53.

La presente invención se refiere, además, al péptido conforme a la presente invención, en que dicho péptido está modificado y/o incluye enlaces no peptídicos.

La presente invención se refiere, además, al péptido conforme a la presente invención, en que dicho péptido es parte de una proteína de fusión, en particular fusionado con los aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (Ii), o fusionado con (o integrado en la secuencia de) un anticuerpo, como por ejemplo, un anticuerpo que es específico de células dendríticas.

La presente invención se refiere, además, a un ácido nucleico, que codifica el péptido acorde con la presente invención. La presente invención se refiere, además, al ácido nucleico acorde con la presente invención que es ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los anteriores.

La presente invención se refiere, además, a un vector de expresión capaz de expresar y/o que expresa un ácido nucleico conforme a la presente invención.

La presente invención se refiere, además, al péptido acorde con la presente invención, un ácido nucleico acorde con la presente invención o un vector de expresión acorde con la presente invención para el uso en el tratamiento de enfermedades y en medicina, en concreto para el tratamiento del cáncer.

La presente invención concierne, además, a anticuerpos específicamente dirigidos contra el péptido acorde con la presente invención o contra complejos formados por dichos péptidos con el MHC, así como métodos para fabricarlos.

La presente invención concierne, además, a receptores de linfocitos T (TCR), en concreto de TCR solubles (sTCR) y TCR clonados y sintetizados en linfocitos T autólogos o alogénicos, y a fragmentos funcionales de los mismos, y a métodos para fabricarlos, así como con linfocitos citolíticos naturales (o células NK) u otro tipo de células que sean portadoras de dichos TCR o reaccionen de forma cruzada con dichos TCR.

Los anticuerpos y los TCR constituyen formas de realización adicionales del uso inmunoterapéutico del péptido acorde con la presente invención.

La presente invención se refiere, además, a una célula hospedadora que contiene un ácido nucleico acorde con la presente invención o un vector de expresión tal y como se ha descrito antes. La presente invención se refiere, además, a una célula hospedadora acorde con la presente invención que es una célula presentadora de antígeno, y preferiblemente es una célula dendrítica.

La presente invención se refiere, además, a un método para producir el péptido acorde con la presente invención, el cual comprende el cultivo de la célula hospedadora acorde con la presente invención y el aislamiento del péptido de dicha célula hospedadora o de su medio de cultivo.

La presente invención se refiere, además, al método acorde con la presente invención en que el antígeno es cargado en moléculas de MHC de clase I o II expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada o de una célula presentadora de antígeno artificial mediante la puesta en contacto de una cantidad suficiente de antígeno con la célula presentadora de antígeno.

La presente invención se refiere, además, al método acorde con la presente invención, en que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión capaz de expresar dicho péptido que contiene la SEQ ID N.° 53 acorde con la invención.

La presente invención se refiere, además, a linfocitos T activados, producidos con el método acorde con la presente invención, que reconocen selectivamente una célula que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la presente invención.

En la presente memoria se da a conocer un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos conformes a la presente descripción, comprendiendo el método la administración al paciente de un número eficaz de linfocitos T producidos conforme a la presente descripción.

La presente invención se refiere, además, al uso del péptido de la invención, del ácido nucleico conforme a la presente invención, del vector de expresión conforme a la presente invención, de la célula conforme a la presente invención, del linfocito T activado, del receptor de linfocitos T o del anticuerpo o de otras moléculas que se unan al péptido o al complejo péptido-MHC acordes con la presente invención. Preferiblemente, dicho medicamento es activo contra el cáncer.

Preferiblemente, dicho medicamento servirá como terapia celular, como vacuna o como proteína basada en un TCR soluble o un anticuerpo.

La presente invención concierne, además, a un uso acorde con la presente invención, en que dichas células cancerosas son de cáncer de ovario, carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, glioblastoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica, linfoma no hodgkiniano, leucemia mieloide aguda, cáncer de vesícula biliar y colangiocarcinoma, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, y mesotelioma, pero preferentemente células de cáncer de ovario.

La presente invención se refiere, además, a biomarcadores basados en el péptido acorde con la presente invención, aquí denominados «dianas», que pueden ser utilizados para el diagnóstico del cáncer, preferiblemente del cáncer de ovario. El marcador puede ser una sobrepresentación del péptido o péptidos en cuestión, o la sobreexpresión del gen o genes correspondientes. Los marcadores también podrían ser utilizados para predecir la probabilidad de éxito de un tratamiento, preferiblemente una inmunoterapia, y más preferiblemente de una inmunoterapia dirigida contra la misma diana que es identificada con el biomarcador. Por ejemplo, se puede usar un anticuerpo o un TCR soluble para teñir cortes histológicos del tumor con el fin de detectar la presencia de un péptido de interés unido en complejo con un MHC.

Opcionalmente el anticuerpo puede estar dotado de otra función efectora, como es un dominio inmunoestimulante o una toxina.

La presente invención también se refiere al uso de estas nuevas dianas en el contexto del tratamiento del cáncer.

En la siguiente descripción detallada de los productos de expresión subyacentes (polipéptidos) del péptido conforme a la invención se dan a conocer diversas aplicaciones contra otros tipos de cáncer, tanto terapéuticas como diagnósticas.

El ESR1 codifica un receptor de estrógenos, un factor de transcripción activado por ligando que es importante para la unión de hormonas, la unión al ADN y la activación de la transcripción, que es esencial para el desarrollo sexual y la función reproductora (RefSeq, 2002). Se han vinculado mutaciones y polimorfismos mononucleotídicos del ESR1 con el riesgo de contraer distintos tipos de cáncer como son los de hígado, próstata, vesícula biliar o mama. La regulación al alza de la expresión del ESR1 está vinculada con la proliferación celular y el crecimiento tumoral pero la supervivencia global de los pacientes con tumores positivos para ESR1 es mejor debido al tratamiento exitoso con moduladores selectivos de los receptores de estrógenos (Sun et al., 2015; Hayashi et al., 2003; Bogush et al., 2009; Miyoshi et al., 2010; Xu et al., 20l1; Yakimchuk et al., 20l3; Fuqua et al., 2014). La vía de transducción del ESR1 interfiere con distintas vías responsables de la transformación, el crecimiento y la supervivencia celular, como son las vías de EGFR/IGFR, PI3K/Akt/mTOR, p53, HER2, NFkappaB y TGF-beta (Frasoret al., 2015; Band and Laiho, 2011; Berger et al., 2013; Skandalis et al., 2014; Mehta and Tripathy, 2014; Ciruelos Gil, 2014).

Descripción detallada de la invención

La estimulación de una respuesta inmunitaria depende de la presencia de antígenos que sean reconocidos como extraños por el sistema inmunitario del hospedador. El descubrimiento de la existencia de antígenos asociados a tumores ha suscitado la posibilidad de utilizar el sistema inmunitario del hospedador para intervenir sobre el crecimiento de los tumores. Actualmente se están explorando diversos mecanismos para aprovechar las defensas humorales y celulares del sistema inmunitario en la inmunoterapia contra el cáncer.

Ciertos elementos de la respuesta inmunitaria celular son capaces de reconocer específicamente y de destruir las células tumorales. El aislamiento de linfocitos T entre las células infiltradas en los tumores o en la sangre periférica hace pensar en que tales células desempeñan un papel importante en las defensas inmunitarias naturales contra el cáncer. Los linfocitos T CD8-positivos en particular, que reconocen las moléculas de clase I del complejo mayor de histocompatibilidad (MHC) portadoras de péptidos que suelen tener de 8 a 10 residuos de aminoácidos derivados de proteínas o de productos ribosómicos defectuosos (DRIPS) localizados en el citosol, desempeñan un importante papel en esta respuesta. Las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos (HLA).

El término «respuesta de linfocitos T» define la proliferación y la activación específicas de las funciones efectoras inducidas por un péptido in vitro o in vivo. En el caso de los linfocitos T citotóxicos restringidos a MHC de clase I, las funciones efectoras pueden consistir en la lisis de células diana presentadoras naturales de péptido o bien sensibilizadas de manera repetida con un péptido o con un precursor del mismo; la secreción de citocinas, preferiblemente de interferón gamma, TNF-alfa o IL-2 inducida por péptido; la secreción de moléculas efectoras, preferiblemente granzimas o perforinas inducidas por péptido; o la desgranulación.

El término «péptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Los péptidos tienen preferiblemente 9 aminoácidos de longitud, pero pueden tener solo 8 aminoácidos de longitud, pero también hasta 10, 11, o 12 o más aminoácidos, y en el caso de los péptidos de MHC de clase II (variantes alargadas del péptido de la invención) pueden tener hasta 13, 14, 15, 16, 17, 18, 19 o 20 o más aminoácidos de longitud.

Además, el término «péptido» incluye sales de una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. Preferentemente las sales son sales farmacéuticamente aceptables de los péptidos, como por ejemplo, sales de cloruro o acetato (trifluoroacetato). Se ha de destacar que las sales de los péptidos conformes a la presente invención difieren sustancialmente de los péptidos en su estado o estados in vivo, puesto que los péptidos no se hallan en forma de sal en tales condiciones in vivo.

El término «péptido» incluye también «oligopéptido». El término «oligopéptido» designa aquí una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente mediante enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del oligopéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantenga el epítopo o epítopos adecuados. Los oligopéptidos suelen tener una longitud inferior a unos 30 aminoácidos y mayor de 15, aproximadamente.

El término «polipéptido» designa una serie de residuos de aminoácidos conectados entre sí típicamente por enlaces peptídicos entre los grupos amino-alfa y carbonilo de los aminoácidos adyacentes. La longitud del polipéptido no es crucial en la invención, siempre que se mantengan los epítopos adecuados. En contraste con los términos «péptido» y «oligopéptido», el término «polipéptido» se refiere a las moléculas de más de unos 30 residuos de aminoácidos de longitud.

Un péptido, oligopéptido, proteína o polinucleótido que codifica dicha molécula es «inmunogénico» (y, por lo tanto, un «inmunógeno» en la presente invención), si es capaz de inducir una respuesta inmunitaria. En el caso de la presente invención, la inmunogenicidad se define más específicamente como la capacidad para desatar una respuesta por parte de los linfocitos T. Por lo tanto, un «inmunógeno» sería una molécula que es capaz de inducir una respuesta inmunitaria y, en el caso de la presente invención, una molécula capaz de inducir una respuesta de los linfocitos T. En otro aspecto, el inmunógeno puede ser el péptido, el complejo del péptido con MHC, el oligopéptido y/o la proteína que es utilizado para generar anticuerpos o t Cr específicos contra él.

Un «epítopo» de clase I de un linfocito T requiere un péptido corto que esté unido a un receptor MHC de clase I, formando un complejo ternario (cadena alfa de MHC de clase I, beta-2-microglobulina y péptido) que puede ser reconocido por un linfocito T que lleve un receptor de linfocito T que coincida y que se una al complejo MHC/péptido con la afinidad adecuada. Los péptidos que se unen a moléculas MHC de clase I suelen tener una longitud de entre 8 y 14 aminoácidos, y más habitualmente de 9 aminoácidos.

En el ser humano hay tres locus genéticos diferentes que codifican las moléculas MHC de clase I (las moléculas MHC del ser humano también se denominan antígenos leucocitarios humanos [HLA]): HLA-A, HLA-B y HLA-C. HLA-A, HLA B y HLA-C. HLA-A*01, HLA-A*02 y HLA-B*07 son ejemplos de distintos alelos MHC de clase I que se pueden expresar a partir de estos locus.

Tabla 6: Frecuencias de expresión (F) de los serotipos HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 y HLA-B*44. Las frecuencias haplotípicas (Gf) derivan de un estudio que usó los datos de tipado de HLA procedentes de un registro con más de 6,5 millones de donantes voluntarios de EE.UU. (Gragert et al., 2013). La frecuencia haplotípica es la frecuencia de un alelo dado en un cromosoma individual. Debido a la dotación cromosómica diploide propia de las células de mamífero, la frecuencia genotípica de este alelo es superior y se calcula em leando la le de Hard -Weinber F = 1 - 1-Gf 2.

(continuación)

El péptido de la invención, preferiblemente cuando figuren incluidos en una vacuna de la invención tal y como se describe en la presente memoria se unirán a A*02, A*01, A*03, A*24, B*07, B*08 o B*44. Una vacuna también podría incluir péptidos que se unan a cualquier MHC de clase II. Por consiguiente, la vacuna de la invención puede ser usada para tratar el cáncer en pacientes que sean A*02, A*01, A*03, A*24, B*07, B*08 o B*44 positivos, mientras que la no selección para los alotipos de MHC de clase II es necesaria debido a la naturaleza panunionista de esos péptidos.

Combinar péptidos A*02 de la invención con péptidos que se unen a otro alelo, por ejemplo el A*24, tiene la ventaja de que se puede tratar a un porcentaje mayor de cualquier población de pacientes que si ésta solo se dirigiera contra un único alelo MHC de la clase I. Mientras que en la mayoría de poblaciones solo se podría tratar a menos del 50% si se optara por uno solo de los alelos, una vacuna que comprenda epítopos HLA-A*24 y HLA-A*02 de la invención permite tratar como mínimo al 60% de los pacientes de cualquier población relevante. En concreto, los porcentajes de pacientes positivos para al menos uno de tales alelos en diversas regiones son los siguientes: EE. UU. 61%, Europa occidental 62%, China 75%, Corea del Sur 77%, Japón 86% (calculados a partir de www.allelefrequencies.net).

Ta l 7: r r l l l HLA n l l i n i r l l rir r r l. 2 13)).

En una forma de realización preferida, el término «secuencia nucleotídica» hace referencia a un heteropolímero de desoxirribonucleótidos.

La secuencia nucleotídica que codifica un péptido, oligopéptido o polipéptido en particular puede ser natural o estar construida de forma sintética. Generalmente, los segmentos de ADN que codifican los péptidos, polipéptidos y proteínas de la presente invención se ensamblan a partir de fragmentos de ADNc y de oligonucleótidos cortos de enlace, o a partir de una serie de oligonucleótidos, con el fin de proporcionar un gen sintético capaz de ser expresado en una unidad transcripcional recombinante que comprenda elementos reguladores derivados de un operón microbiano o vírico.

Tal y como se utiliza en la presente memoria el término «un nucleótido que codifica un péptido» se refiere a una secuencia de nucleótidos que codifica el péptido y que incluye codones artificiales (sintetizados por el hombre) de inicio y terminación compatibles con el sistema biológico en el que la secuencia va a ser expresada por, por ejemplo, una célula dendrítica u otro sistema celular útil para la producción de TCR.

En la presente memoria, la referencia a una secuencia de ácido nucleico incluye tanto el ácido nucleico monocatenario como bicatenario. Por lo tanto, en lo que concierne por ejemplo al ADN, la secuencia específica, a menos que el contexto indique otra cosa, se refiere al ADN monocatenario de dicha secuencia, a la doble cadena formada por dicha secuencia con su complementaria (ADN bicatenario) y a la cadena complementaria de dicha secuencia.

El término «región codificante» hace referencia a la porción de un gen que, o bien de forma natural o normal, codifica el producto de expresión de dicho gen en su ambiente genómico natural, por ejemplo, la región que codifica in vivo el producto de expresión natural del gen.

La región codificante puede derivar de un gen no mutado («normal»), mutado o alterado, o incluso puede provenir de una secuencia de ADN, o gen, sintetizada íntegramente en el laboratorio con métodos bien conocidos para los expertos en la síntesis de ADN.

El término «producto de expresión» define al polipéptido o a la proteína que es el producto natural de la traducción del gen y cualquier secuencia de ácidos nucleicos que codifiquen los equivalentes resultantes de la degeneración del código genético y, por tanto, que codifican el mismo aminoácido o aminoácidos.

El término «fragmento», cuando se refiere a una secuencia de codificación, define una porción de ADN que no comprende la región codificante entera, cuyo producto de expresión conserva esencialmente la misma actividad o función biológica que el producto de expresión de la región codificante entera.

El término «segmento de ADN» hace referencia a un polímero de ADN, en forma de un fragmento separado o como componente de un constructo de ADN mayor, que deriva de ADN aislado por lo menos una vez en una forma sustancialmente pura, es decir, exento de materiales endógenos contaminantes y en una cantidad o concentración que permite la identificación, la manipulación y la recuperación del segmento y de sus secuencias nucleotídicas constituyentes mediante métodos bioquímicos estándar como, por ejemplo, mediante un vector de clonación. Dichos segmentos se suministran en forma de un marco de lectura abierto sin interrupciones por secuencias internas no traducidas, o intrones, que suelen estar presentes en los genes eucariotas. Las secuencias de ADN no traducidas pueden estar presentes corriente abajo (downstream) desde el marco de lectura abierto, donde no interfieren con la manipulación o la expresión de las regiones codificantes.

El término «cebador» define una secuencia corta de ácidos nucleicos que puede aparearse con una cadena de ADN y que proporciona un extremo 3'-OH libre en el que una polimerasa de ADN puede comenzar la síntesis de una cadena de desoxirribonucleótidos.

El término «promotor» define una región de ADN implicada en la unión de la polimerasa de ARN para iniciar la transcripción.

El término «aislado» define el material que se extrae de su entorno original (por ejemplo, el entorno natural, si ocurre de forma natural). Por ejemplo, un polinucleótido o un polipéptido natural presente en un animal vivo no está aislado, pero ese mismo polinucleótido o polipéptido lo estará si es separado de parte o de todos los materiales coexistentes en el sistema natural. Tales polinucleótidos podrán formar parte de un vector y/o tales polinucleótidos o polipéptidos podrán formar parte de una composición, y seguir estando aislados en dicho vector o composición puesto que estos no forman parte de su entorno natural.

Los polinucleótidos, y los polipéptidos recombinantes o inmunógenos, descritos de acuerdo con la presente invención también pueden presentarse en forma «purificada». El término «purificado» no implica pureza absoluta; más bien, se utiliza como definición relativa y puede incluir preparaciones altamente purificadas o preparaciones tan sólo parcialmente purificadas, tal y como los expertos en la materia entienden dichos términos. Por ejemplo, los clones individuales aislados de una genoteca de ADNc se han purificado de manera convencional hasta obtener una homogeneidad electroforética. Se contempla expresamente la purificación del material de inicio o del material natural hasta, al menos, un orden de magnitud; preferiblemente, dos o tres órdenes de magnitud; y, con mayor preferencia, cuatro o cinco órdenes de magnitud. Además, se contempla expresamente el polipéptido reivindicado que tiene una pureza de, preferiblemente, el 99,999%, o, al menos, del 99,99% o el 99,9%; y, más convenientemente, del 99% por peso o mayor.

Los productos de expresión de los polipéptidos y los ácidos nucleicos descritos conforme a la presente invención, así como los vectores de expresión que contienen dichos ácidos nucleicos y/o dichos polipéptidos, pueden utilizarse en «forma enriquecida». Tal y como se usa aquí, el término «enriquecido» significa que la concentración del material es, al menos, unas 2, 5, 10, 100 o 1000 veces su concentración natural (por ejemplo), más ventajosamente 0,01% por peso, y, preferiblemente, aproximadamente de 0,1% al menos, por peso. También se contemplan preparaciones enriquecidas de alrededor del 0,5%, 1%, 5%, 10% y 20% por peso. Las secuencias, constructos, vectores, clones y otros materiales que comprenden la presente invención pueden utilizarse, según convenga, en su forma enriquecida o aislada. El término «fragmento activo» define un fragmento, normalmente un péptido, polipéptido o secuencia de ácidos nucleicos, que genera una respuesta inmunitaria (es decir, que posee actividad inmunógena) cuando se administra -solo u, opcionalmente, con un adyuvante adecuado o en un vector- a un animal, que puede ser un mamífero como, por ejemplo, un conejo o un ratón, sin excluir a un ser humano; dicha respuesta inmunitaria adopta la forma de estimulación de una respuesta de linfocitos T en el animal receptor como, por ejemplo, el ser humano. De forma alternativa, el “fragmento activo” también se puede usar para inducir una respuesta de linfocitos T in vitro.

Tal y como se usan en la presente memoria, los términos «porción», «segmento» y «fragmento», cuando se utilizan en relación a los polipéptidos, hacen referencia a una secuencia continua de residuos, como residuos de aminoácidos, secuencia que es un subconjunto de una secuencia mayor. Por ejemplo, si un polipéptido se somete a un tratamiento con cualquiera de las endopeptidasas habituales, como la tripsina o la quimiotripsina, los oligopéptidos resultantes de dicho tratamiento representarán porciones, segmentos o fragmentos del polipéptido inicial. Utilizados en relación con los polinucleótidos, estos términos se refieren a los productos producidos por el tratamiento de dichos polinucleótidos con cualquiera de las endonucleasas.

Conforme a la presente invención, el término «identidad porcentual» o «porcentaje de identidad», al referirse a una secuencia, significa que una secuencia se compara con una secuencia reivindicada o descrita después de alinear la secuencia que se va a comparar (la «secuencia comparada») con la secuencia descrita o reivindicada (la «secuencia de referencia»). La identidad porcentual se determina entonces con la siguiente fórmula:

Identidad porcentual = 100 [1 -(C/R)]

donde C es el número de diferencias entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada a lo largo de la alineación entre la secuencia de referencia y la secuencia comparada, donde

(I) cada base o aminoácido de la secuencia de referencia que no tiene una base o aminoácido alineados en la secuencia comparada y

(II) cada hueco (gap) de la secuencia de referencia y

(NI) cada base o aminoácido alineado de la secuencia de referencia que difiere de una base o aminoácido alineado de la secuencia comparada, constituye una diferencia; y

(IV) la alineación tiene que comenzar en la posición 1 de las secuencias alineadas;

y R es el número de bases o aminoácidos de la secuencia de referencia a lo largo de la alineación con la secuencia comparada con cualquier hueco creado en la secuencia de referencia, también contabilizado como una base o un aminoácido.

Si existe una alineación entre la secuencia comparada y la secuencia de referencia para la que la identidad porcentual, calculada como se ha especificado arriba, es aproximadamente igual o mayor que una identidad porcentual mínima especificada, entonces la secuencia comparada guarda la identidad porcentual mínima especificada con la secuencia de referencia, aunque puedan existir alineaciones en las que la identidad porcentual calculada arriba resulte menor que la identidad porcentual especificada.

Tal y como se ha dicho antes, la presente descripción se refiere por tanto a un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 52 y las SEQ ID N.° 54 a SEQ ID N.° 772 o una variante de las mismas que es un 88% homóloga a las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 52 y las SEQ ID N.° 54 a SEQ ID N.° 772, o una variante de las mismas que induce la reacción cruzada de linfocitos T con dicho péptido. Los péptidos de la presente descripción tienen la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o, en el caso de las versiones alargadas de dichos péptidos, a una molécula de la clase II.

En la presente invención el término «homólogo» se refiere al grado de identidad (véase antes Identidad porcentual) entre las secuencias de dos secuencias de aminoácidos, es decir secuencias peptídicas o polipeptídicas. La susodicha «homología» se determina comparando las dos secuencias alineadas en condiciones óptimas con las secuencias a comparar. La homología de secuencia se puede calcular creando una alineación con el algoritmo ClustalW, por ejemplo. Habitualmente las bases de datos públicas proporcionan software para el análisis de secuencias, en concreto, Vector NTI, GENETYX u otras herramientas.

Una persona versada en la materia será capaz de valorar si los linfocitos T inducidos por una variante del péptido específico serán capaces de reaccionar con el propio péptido (Appay et al., 2006; Colombetti et al., 2006; Fong et al., 2001; Zaremba etal., 1997).

Por «variante» de la secuencia de aminoácidos dada, los inventores quieren decir que las cadenas laterales de, por ejemplo, uno o dos de los residuos de aminoácidos están alteradas (por ejemplo, sustituyéndolas con la cadena lateral de otro residuo de aminoácido natural o alguna otra cadena lateral) de modo que el péptido sigue siendo capaz de unirse a una molécula HLA básicamente de la misma manera que un péptido que consiste en la secuencia de aminoácidos indicadas en las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 772. Por ejemplo, un péptido se puede modificar para que mejore o al menos mantenga la capacidad para interaccionar y unirse a la hendidura de unión de una molécula MHC adecuada, como HLA-A*02 o -DR, y de un modo que mejore o al menos mantenga la capacidad para unirse al TCR de linfocitos T activados.

Estos linfocitos T pueden después reaccionar con células y matar las que expresen un polipéptido que contenga la secuencia de aminoácidos natural del péptido afín definido en los aspectos de la invención. Como se puede deducir de la bibliografía y de las bases de datos científicas, ciertas posiciones de los péptidos de unión a HLA son normalmente residuos de anclaje que forman una secuencia central que encaja en el motivo de unión del receptor HLA, que está definida por las propiedades polares, electrofísicas, hidrofóbicas y espaciales de las cadenas polipeptídicas que constituyen la hendidura de unión. Así pues, una persona versada en la técnica será capaz de modificar las secuencias de aminoácidos expuestos en las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 772, manteniendo los residuos de anclaje conocidos, y será capaz de determinar si tales variantes mantienen la capacidad de unión a moléculas MHC de clase I o II. Las variantes de los péptidos dados a conocer en la presente memoria conservan la capacidad para unirse a los TCR de los linfocitos T activados, que después pueden reaccionar con células y matar las que expresan un polipéptido que contenga la secuencia natural de aminoácidos del péptido afín definido entre los péptidos dados a conocer en la presente memoria.

Los péptidos originales (sin modificar) descritos aquí se pueden modificar mediante la sustitución de uno o más residuos en sitios diferentes, posiblemente selectivos, dentro de la cadena peptídica, si no se especifica de otra manera. Preferentemente tales sustituciones estarían situadas al final de la cadena de aminoácidos. Dichas sustituciones pueden ser de naturaleza conservadora como, por ejemplo, si un aminoácido es reemplazado por un aminoácido de estructura y características similares, como en el caso de un aminoácido hidrofóbico que es sustituido por otro aminoácido hidrofóbico. Aún más conservador sería el reemplazo de aminoácidos de tamaño y naturaleza química igual o similar como, por ejemplo, si una leucina se reemplaza por isoleucina. En diversos estudios de variaciones de secuencias en familias de proteínas homólogas naturales, determinadas sustituciones de aminoácidos se toleran con más frecuencia que otras, y éstas muestran a menudo una correlación con similitudes de tamaño, carga, polaridad e hidrofobicidad entre el aminoácido original y su reemplazo, siendo ésta la base para la definición de las “sustituciones conservadoras”.

Las sustituciones conservadoras se definen en la presente invención como intercambios dentro de uno de los cinco grupos siguientes: Grupo 1: residuos alifáticos pequeños, no polares o ligeramente polares (Ala, Ser, Thr, Pro y Gly); Grupo 2: residuos polares cargados negativamente y sus amidas (Asp, Asn, Glu y Gln); Grupo 3: residuos polares cargados positivamente (His, Arg y Lys); Grupo 4: residuos alifáticos grandes no polares (Met, Leu, Ile, Val y Cys); y Grupo 5: residuos grandes aromáticos (Phe, Tyr y Trp).

Las sustituciones menos conservadoras pueden implicar el reemplazo de un aminoácido por otro con características similares pero diferenciado de alguna manera en el tamaño, como en el reemplazo de un residuo de isoleucina por alanina. Los reemplazos muy poco o nada conservadores pueden implicar la sustitución de un aminoácido ácido por otro polar, o incluso por uno de carácter básico. Estas sustituciones “radicales” no se pueden descartar, sin embargo, como potencialmente inefectivas, ya que los efectos químicos no son totalmente predecibles y las sustituciones radicales bien pueden provocar efectos inesperados imposibles de predecir de otra forma a partir de principios químicos simples.

Naturalmente, dichas sustituciones pueden implicar otras estructuras distintas de los aminoácidos L habituales. De esta forma, aminoácidos D podrían sustituir a los aminoácidos L que habitualmente se encuentran en los péptidos antigénicos de la invención y, aún así, quedar englobados en la descripción del presente documento. Además, se pueden usar también otros aminoácidos no convencionales (distintos de los aminoácidos naturales que constituyen las proteínas) con fines de sustitución para producir inmunógenos y polipéptidos inmunogénicos acordes con la presente invención.

Si se descubre que las sustituciones en más de una posición resultan en un péptido con actividad antigénica sustancialmente equivalente o mayor, como se define más abajo, entonces las combinaciones de dichas sustituciones se probarán para determinar si las sustituciones combinadas provocan efectos aditivos o sinérgicos en la antigenicidad del péptido. Como máximo, se sustituirán hasta cuatro posiciones simultáneamente dentro del péptido.

Un péptido consistente esencialmente en la secuencia de aminoácidos indicada puede tener intercambiados uno o dos aminoácidos que no formen parte del anclaje (véase más adelante el motivo de anclaje) sin que la capacidad de unión a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o clase II cambie sustancialmente o resulte negativamente afectada, en comparación con el péptido sin modificar. En otra forma de realización, un péptido consistente esencialmente en la secuencia de aminoácidos indicada en la presente memoria puede tener cambiados uno o dos aminoácidos que no formen parte del anclaje (véase más adelante el motivo de anclaje) por sus pares conservadores (véase más adelante) sin que la capacidad de unión a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o clase II cambie sustancialmente o resulte negativamente afectada, en comparación con el péptido sin modificar.

Aquellos residuos de aminoácidos que no contribuyen sustancialmente a las interacciones con el receptor del linfocito T pueden ser modificados sustituyéndolos por otro aminoácido cuya incorporación no afecte sustancialmente a la reactividad de los linfocitos T y no suprima la unión al MHC pertinente. Así pues, aparte de la condición indicada, el péptido de la descripción puede ser cualquier péptido (en cuyo término los inventores incluyen oligopéptidos o polipéptidos), que incluya las secuencias de aminoácidos o una porción o una variante de las mismas tal y como se indican.

Tabla 8: Variantes y motivos de los péptidos acordes con las SEQ ID N.° 3, 225, 13, 17, 84, 108, 113, 114, 147, 36,

1 172 4 7. . . . . . .

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

(continuación)

También pueden ser adecuados péptidos más largos (alargados). También es posible que los epítopos de MHC de clase I, aunque suelen tener entre 8 y 11 aminoácidos de longitud, sean generados por el procesamiento de péptidos más largos o proteínas que incluyan el epítopo real. Se prefiere que los residuos que flanquean el epítopo de interés sean residuos que no afecten sustancialmente a la digestión proteolítica necesaria para exponer el epítopo durante el procesamiento.

El péptido de la invención y los otros péptidos dados a conocer en la presente memoria se pueden alargar hasta cuatro aminoácidos, es decir, se pueden añadir 1, 2, 3 o 4 aminoácidos en cualquier combinación entre 4:0 y 0:4. A continuación en la Tabla 9 se exponen combinaciones de las elongaciones como las dadas a conocer en la presente memoria.

T l : m in i n l l n i n l i

Los aminoácidos para la elongación/extensión pueden ser los péptidos de la secuencia original de la proteína o cualquier otro aminoácido. La elongación tiene por finalidad mejorar la estabilidad o la solubilidad de los péptidos.

Así pues, los epítopos de la presente invención pueden ser idénticos a los epítopos específicos de tumor o asociados a tumor naturales o pueden incluir epítopos que difieran como máximo en cuatro residuos del péptido de referencia, siempre que conserven básicamente la misma actividad antigénica.

En una forma de realización alternativa, el péptido se alarga por uno o ambos lados más de 4 aminoácidos, preferiblemente hasta una longitud total de hasta 30 aminoácidos. Esto puede dar como resultado péptidos que se unen a MHC de clase II. La unión a MHC de clase II se puede analizar con métodos conocidos en la materia.

En consecuencia, la presente descripción también proporciona péptidos y variantes de epítopos de MHC de clase I en los que el péptido o variante tienen una longitud total de entre 8 y 100, preferiblemente entre 8 y 30, y más preferiblemente entre 8 y 14, esto es 8, 9, 10, 11, 12, 13, 14 aminoácidos, que en el caso de los péptidos de unión de clase II también puede ser de 15, 16, 17, 18, 19, 20, 21, 22, 23, 34 o 25 aminoácidos.

Por supuesto, el péptido conforme a la presente invención tendrá la capacidad para unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II. La unión de un péptido o una variante a un complejo MHC se puede analizar con métodos conocidos en la técnica.

Preferiblemente, cuando los linfocitos T específicos para un péptido acorde con la presente invención se prueben contra los péptidos sustituidos, la concentración de péptido a la cual los péptidos sustituidos consiguen la mitad del aumento máximo de la lisis respecto al valor de fondo es como máximo de alrededor de 1 mM, preferiblemente como máximo de alrededor de 1 μM, más preferiblemente como máximo de alrededor de 1 nM, y aún más preferentemente como máximo de alrededor de 100 μM, y más preferentemente como máximo de alrededor de 10 μM. También se prefiere que el péptido sustituido sea reconocido por los linfocitos T de más de un individuo, de al menos dos, y más preferiblemente de tres individuos.

En una forma de realización preferida de la invención el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos conforme a las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 53.

«Consiste esencialmente en» significa que un péptido, además de la secuencia conforme a cualquiera de las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 772 o una variante de las mismas contiene segmentos adicionales de aminoácidos localizados en los extremos N- y/o C-terminal que no forman parte necesariamente del péptido que funciona como un epítopo para el epítopo de moléculas MHC.

No obstante, dichos segmentos pueden ser importantes para facilitar la introducción eficaz del péptido conforme a la presente invención en las células. En una forma de realización de la presente invención, el péptido es una parte de una proteína de fusión que comprende, por ejemplo, los 80 aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (p33, en lo sucesivo “ Ii”) tal y como aparece en el NCBI, número de acceso de GenBankX00497.

En otras fusiones, el péptido de la presente invención se puede fusionar con un anticuerpo tal y como se describe en la presente memoria, o con una parte funcional del mismo, en particular integrándolo en la secuencia del anticuerpo, para que vaya dirigido específicamente por dicho anticuerpo, o por ejemplo, con un anticuerpo que sea específico para las células dendríticas tal y como se describe en la presente memoria.

Además, el péptido o variante pueden ser modificados aún más para mejorar la estabilidad y/o la unión a las moléculas de MHC con el fin de desencadenar una respuesta inmunitaria más potente. Los métodos para conseguir esa optimización de una secuencia peptídica son bien conocidos en la técnica e incluyen, por ejemplo, la introducción de enlaces peptídicos inversos o enlaces no peptídicos.

En un enlace peptídico inverso los residuos de aminoácido no están unidos por enlaces peptídicos (-CO-NH-) sino que el enlace peptídico está invertido. Estos peptidomiméticos retro-inversos pueden sintetizarse con métodos conocidos en la técnica, como por ejemplo los descritos por Meziere y cols. (1997) (Meziere et al., 1997). Esta estrategia implica la síntesis de seudopéptidos que contengan cambios en la estructura principal, pero no en la orientación de las cadenas laterales. Meziere y cols. (Meziere et al., 1997) demuestran que estos seudopéptidos resultan útiles para la unión al MHC y las respuestas de los linfocitos T cooperadores. Los péptidos retro-inversos, que contienen enlaces NH-CO en lugar de enlaces peptídicos CO-NH, son mucho más resistentes a la proteólisis.

Enlaces no peptídicos son, por ejemplo: -CH₂-NH, -CH₂S-, -CH₂CH₂-, -CH=CH-, -COCH₂-, -CH(OH)CH₂- y -CH₂SO-. La patente de EE. UU. 4.897.445 proporciona un método para la síntesis en fase sólida de enlaces no peptídicos (-CH₂-NH) en cadenas polipeptídicas que implica la obtención de polipéptidos con procedimientos estándar y la síntesis del enlace no peptídico mediante la reacción de un aminoaldehído y un aminoácido en presencia de NaCNBH3.

Péptidos que comprenden las secuencias descritas arriba pueden ser sintetizados con otros grupos químicos añadidos en los extremos amino y/o carboxi, con el fin de mejorar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la afinidad de los péptidos. Por ejemplo, grupos hidrofóbicos como los grupos carbobenzoxilo, dansilo, o t-butiloxicarbonilo pueden añadirse a los extremos amino de los péptidos. De manera similar, se puede colocar un grupo acetilo o un grupo 9-fluorenilmetoxi-carbonilo en los extremos amino de los péptidos. Asimismo, p. ej., el grupo hidrofóbico tbutiloxicarbonilo, o un grupo amido pueden ser añadidos en los extremos carboxi de los péptidos.

Adicionalmente, el péptido de la invención puede ser sintetizado para alterar su configuración estérica. Por ejemplo, puede utilizarse el D-isómero de uno o más de los residuos de aminoácidos del péptido en lugar del L-isómero habitual. Y aún más, al menos uno de los residuos de aminoácidos de los péptidos dados a conocer en la presente memoria puede ser sustituido por uno de los consabidos residuos de aminoácidos no naturales. Alteraciones como éstas pueden servir para aumentar la estabilidad, la biodisponibilidad y/o la capacidad de unión del péptido de la invención.

De manera similar, el péptido de la invención puede ser modificado químicamente mediante la reacción con aminoácidos específicos antes o después de la síntesis del péptido. Ejemplos de tales modificaciones son bien conocidos en la técnica y aparecen resumidos por ejemplo en R. Lundblad, Chemical Reagents for Protein Modification, 3rd ed. carcinoma colorrectal Press, 2004 (Lundblad, 2004). La modificación química de aminoácidos incluye, sin ánimo limitativo, la modificación por acilación, amidinación, piridoxilación de lisina, alquilación reductora, trinitrobencilación de grupos amino con ácido 2,4,6-trinitrobencenosulfónico (TNBS), transformación de grupos carboxilo en grupos amida y oxidación del grupo sulfhidrilo con ácido perfórmico para convertir la cisteína en ácido cisteico, formación de derivados mercuriales, formación de disulfuros mixtos con otros compuestos tiol, reacción con maleimida, carboximetilación con ácido yodoacético o yodoacetamida y carbamoilación con cianato a pH alcalino, aunque sin limitación a ello. A este respecto, se remite a las personas versadas en la técnica al Capítulo 15 de Current Protocols In Protein Science, Eds. Coligan et al. (John Wiley and Sons NY 1995-2000) (Coligan et al., 1995), donde hallarán una metodología más extensa relacionada con la modificación química de proteínas.

En resumen, la modificación de p. ej., los residuos arginilo de las proteínas se basa a menudo en la reacción de compuestos dicarbonilo adyacentes como fenilglioxal, 2,3-butanodiona y 1,2-ciclohexanodiona para formar un aducto. Otro ejemplo es la reacción del metilglioxal con residuos de arginina. La cisteína se puede modificar sin la modificación simultánea de otros sitios nucleofílicos como sucede con la lisina y la histidina. Así pues, para la modificación de la cisteína hay disponible un gran número de reactivos. Las páginas web de empresas como Sigma-Aldrich (http://www.sigma-aldrich.com) ofrecen información sobre reactivos concretos.

La reducción selectiva de los puentes disulfuro de las proteínas también es habitual. El tratamiento térmico al cual se someten los productos biofarmacéuticos a veces genera y oxida puentes disulfuro. El reactivo K de Woodward se puede utilizar para modificar residuos de ácido glutámico concretos. Se puede emplear N-(3-(dimetilamino)propil)-N'-etilcarbodiimida para formar enlaces cruzados intramoleculares entre un residuo de lisina y un residuo de ácido glutámico. Por ejemplo, el dietilpirocarbonato es un reactivo empleado para la modificación de residuos histidilo en proteínas. La histidina también puede ser modificada con 4-hidroxi-2-nonenal. La reacción de los residuos de lisina y otros grupos alfa-amino es útil, por ejemplo, para la unión de péptidos a superficies o para la formación de enlaces cruzados entre proteínas/péptidos. La lisina es el sitio de fijación del poli(etilen)glicol y el principal sitio de modificación en la glucosilación de proteínas. Los residuos de metionina de las proteínas se pueden modificar por ejemplo, con yodoacetamida, bromoetilamina y cloramina T.

Los residuos tirosilo se pueden modificar con tetranitrometano y N-acetilimidazol. La formación de enlaces cruzados por medio de la formación de ditirosina se puede consumar con peróxido de hidrógeno/iones de cobre.

Estudios recientes sobre la modificación del triptófano han usado N-bromosuccinimida, 2-hidroxi-5-nitrobencilbromuro o 3-bromo-3-metil-2-(2-nitrofenilmercapto)-3H-indol (BPNS-escatol).

La modificación de proteínas y péptidos terapéuticos con PEG se asocia a menudo con una prolongación de la semivida en circulación, mientras que la unión por entrecruzamiento de proteínas con glutaraldehído, diacrilato de polietilenglicol y formaldehído se emplea en la preparación de hidrogeles. La modificación química de alérgenos con fines de inmunoterapia se consigue a menudo mediante la carbamilación con cianato potásico.

Un péptido que está modificado o que incluye enlaces no peptídicos es una forma de realización preferida de la invención.

Otra forma de realización de la presente invención se refiere a un péptido no presente en la naturaleza en la que dicho péptido consiste en una secuencia de aminoácidos conforme a la SEQ ID N.° 53 y ha sido producido sintéticamente

(p. ej. sintetizado) como una sal aceptable desde el punto de vista farmacéutico. Los métodos para la síntesis de péptidos son bien conocidos en la materia. Las sales del péptido conforme a la presente invención difieren sustancialmente de los péptidos en su estado o estados in vivo, puesto que los péptidos no se hallan en forma de sal en las condiciones in vivo. De la forma artificial de sal del péptido depende su solubilidad, en particular en el contexto de composiciones farmacéuticas que comprenden péptidos, como, por ejemplo, las vacunas peptídicas que se dan a conocer en la presente memoria. Para que los péptidos se puedan suministrar de modo eficaz al sujeto a tratar, es preciso que el péptido o péptidos tengan la suficiente solubilidad, por lo menos sustancial. Preferiblemente, las sales de los péptidos deben ser sales farmacéuticamente aceptables. Estas sales conformes a la invención incluyen sales alcalinas y alcalinotérreas como las sales de la serie de Hofmeister que comprenden aniones como PO₄3', SO₄2', CH₃COO-, Cl-, Br, NO3-, ClO₄‘, I-, SCN- y cationes como NH4+, Rb+, K+, Na+, Cs+, Li+, Ba2+. Sales particulares se seleccionan entre las siguientes NH4)₃PO4, (NH4)₂HPO₄, (NH4)H₂PO4, (NH4)₂SO4, NH4CH₃COO, NH4Cl, NH4Br, NH4NO3, NH4CIO₄, NH4I, NH4SCN, Rb3PO4, Rb2HPO₄, RbH₂PO₄, Rb2SO4, Rb4CH₃COO, Rb4Cl, Rb4Br, Rb4NO3, Rb4CIO₄, Rb4l, Rb4SCN, K3PO4, K₂HPO4, KH₂PO4, K₂SO4, KCH₃COO, KCl, κΒr, KNO₃, KClO4,

KI, KSCN, Na3PO4, Na₂HPO4, NaH₂PO4, Na2SO4, NaCH₃COO, NaCl, NaBr, NaNO₃, NaClO₄, Nal, NaSCN, ZnCh Cs3PO₄, Cs2HPO₄, CsH₂PO₄, Cs2SO4, CsCH₃COO, CsCl, CsBr, CsNO₃, CsCIO₄, CsI, CsSCN, Li3PO4, Li2HPO4, UH₂PO₄, U2SO4, UCH₃COO, LiCl, LiBr, LiNO3, LiClO₄, Lil, LiSCN, Cu2SO₄, Mg3(PO₄)₂, Mg2HPO4, Mg(H₂PO₄)₂, Mg2SO₄, Mg(CH₃COO)₂, MgCl2, MgBr2, Mg(NO₃)₂, Mg(ClO₄)₂, Mgl2, Mg(SCN)₂, MnCl2, Ca3(PO₄),, Ca2HPO4, Ca(H₂PO₄)₂, CaSO₄, Ca(CH₃COO)₂, CaCl2, CaBr2, Ca(NO₃)₂, Ca(ClO₄)₂, CaI2, Ca(SCN)₂, Ba3(PO4)₂, Ba2HPO4, Ba(H₂PO₄)₂, BaSO₄, Ba(CH₃COO)₂, BaCl2, BaBr2, Ba(NO3)₂, Ba(ClO4)₂, Bal2y Ba(SCN)₂. En particular se prefieren el

NH acetato, MgCh, KH₂PO₄, Na2SO4, KCl, NaCl y CaCh, como, por ejemplo, las sales de cloruro o acetato (trifluoroacetato).

En general, péptidos y variantes (al menos aquellas que contiene enlaces peptídicos entre los residuos de aminoácidos) pueden ser sintetizados p. ej., utilizando la síntesis de péptidos en fase sólida por el método de Fmocpoliamida, como muestra Lukas y cols. (Lukas etal., 1981) y las referencias que aparecen en el mismo. La protección provisional del grupo N-amino se consigue con el grupo 9-fluorenilmetiloxicarbonilo (Fmoc). La escisión repetida de este grupo protector muy sensible al pH básico se lleva a cabo con piperidina al 20% en N,N-dimetilformamida. Los grupos funcionales de las cadenas laterales se podrían proteger si se transformaran en éteres de butilo (en el caso de la serina, treonina y tirosina), ésteres de butilo (en el caso del ácido glutámico y aspártico), derivados butiloxicarbonílicos (en el caso de la lisina y la histidina), derivados tritilados (en el de la cisteína) y derivados 4-metoxi-2,3,6-trimetilbencenosulfonílicos (en el de la arginina). Cuando los residuos C-terminales son glutamina o asparragina se utiliza el grupo 4,4'-dimetoxibenzhidrilo para proteger los grupos funcionales amido de la cadena lateral. El soporte en fase sólida se basa en un polímero de polidimetil-acrilamida constituido por los tres monómeros dimetilacrilamida (monómero estructural), bisacriloiletilendiamina (entrelazante) y acriloilsarcosina metiléster (funcionalizador). El agente escindible que mantiene unido el péptido a la resina es un derivado del ácido 4-hidroximetilfenoxiacético, sensible a pH ácido. Todos los derivados de aminoácidos se añaden en forma de derivados anhídridos simétricos preformados salvo la asparragina y la glutamina, que se añaden utilizando un procedimiento de acoplamiento inverso con N,N-diciclohexil-carbodiimida/1-hidroxibenzotriazol. Todas las reacciones de acoplamiento y desprotección se controlan con procedimientos de ensayo con ninhidrina, ácido trinitrobencenosulfónico o isotina. Una vez completada la síntesis, los péptidos se separan del soporte de resina y al mismo tiempo se eliminan los grupos protectores de las cadenas laterales mediante el tratamiento con ácido trifluoroacético al 95% con una mezcla de capturadores (scavengers) al 50%. Los capturadores (scavengers) utilizados normalmente son etanditiol, fenol, anisol y agua, dependiendo de la elección exacta de los aminoácidos constituyentes del péptido que se está sintetizando. La síntesis de péptidos también es posible combinando metodologías de fase sólida y de fase en solución (véase por ejemplo (Bruckdorfer et al., 2004) y las referencias citadas en la misma).

El ácido trifluoroacético se elimina por evaporación en vacío y se procede a la trituración con dietiléter para obtener el péptido bruto. Todos los capturadores (scavengers) se eliminan con un procedimiento de extracción simple que con la liofilización de la fase acuosa proporciona el péptido bruto exento de ellos. Los reactivos para la síntesis de péptidos

se pueden conseguir en general por ejemplo de Calbiochem-Novabiochem (Nottingham, Reino Unido).

La purificación puede llevarse a cabo mediante cualquier técnica o combinación de técnicas como la recristalización, cromatografía por exclusión de tamaño, cromatografía de intercambio iónico, cromatografía por interacción hidrofóbica, y (normalmente) cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa utilizando p. ej., la separación con gradiente de acetonitrilo/agua.

El análisis de los péptidos puede efectuarse utilizando cromatografía de capa fina, electroforesis, en particular electroforesis capilar, extracción en fase sólida (CSPE), cromatografía de líquidos de alto rendimiento con fase inversa, análisis de aminoácidos tras hidrólisis ácida y análisis con espectrometría de masas por bombardeo con átomos rápidos (FAB), así como análisis con espectrometría de masas MALDI y ESI-Q-TOF.

Para la identificación de los ligandos HLA mediante espectrometría de masas se purificaron moléculas HLA de muestras de tejido criogenizadas y se aislaron los péptidos asociados a HLA. Los péptidos aislados se separaron y se identificaron sus secuencias mediante cromatografía de líquidos-espectrometría de masas con ionización por nanoelectronebulización (nanoESI) en línea. Las secuencias peptídicas resultantes se verificaron comparando el patrón de fragmentación de los péptidos asociados a tumor natural (TUMAP) registrados a partir de muestras de cáncer de ovario (> 80 muestras positivas para A*02) con los patrones de fragmentación de péptidos sintéticos de referencia de secuencia idéntica. Dado que los péptidos se identificaron directamente como ligandos de moléculas HLA de células primarias, estos resultados proporcionan pruebas directas del procesamiento y de la presentación de los péptidos identificados en tejido de cáncer primario obtenido de > 80 pacientes con cáncer de ovario (véase el Ejemplo 1).

La plataforma para el descubrimiento de fármacos patentada XPRESIDENT® v2.1 (véase, por ejemplo, US 2013­ 0096016) permite la identificación y la selección de candidatos a vacuna peptídica que están sobrepresentados en función de la cuantificación relativa de los niveles de péptidos restringidos a HLA en tejidos cancerosos respecto a diversos tejidos y órganos normales. Ello se consiguió mediante el desarrollo de la cuantificación diferencial sin marcador con los datos adquiridos de CL-EM procesados con una plataforma de análisis de datos patentada que combina algoritmos para la identificación de secuencias, agrupamiento de espectros, recuento iónico, alineamiento del tiempo de retención, deconvolución del estado de carga y normalización.

Los complejos HLA-péptido de muestras de tejido de cáncer de ovario se purificaron y los péptidos asociados al HLA se aislaron y se analizaron con cromatografía de líquidos y espectrometría de masas en tándem (CL-EM) (véase el ejemplo 1). Todos los TUMAP contenidos en la presente solicitud se identificaron con esta estrategia en muestras de cáncer de ovario primario, que confirman su presentación en el cáncer de ovario primario.

Además de la presentación del péptido, se analizó la expresión del ARNm del gen originario. Los datos del ARNm se obtuvieron mediante análisis RNASeq de tejidos normales y tejidos cancerosos (véanse el ejemplo 2), Figura 1). Los péptidos derivados de proteínas cuyo ARNm codificante se expresa con profusión en el tejido canceroso, pero en cambio su expresión es ínfima o nula en los tejidos normales vitales, quedaron preferentemente incluidos en la presente invención.

La presente invención proporciona un péptido que es útil para el tratamiento de cánceres/tumores, preferentemente del cáncer de ovario, que sobrepresentan o presentan exclusivamente el péptido de la invención. La espectrometría de masas ha revelado que ese péptido es presentado de forma natural por moléculas HLA en muestras humanas de cáncer de ovario primario.

Se ha demostrado que el gen o genes/proteína o proteínas originarios (también denominadas «proteínas enteras» o «proteínas subyacentes») del cual derivan los péptidos aparecen notablemente sobreexpresados en los tejidos cancerosos con respecto a los tejidos normales -en la presente invención «tejidos normales» significa que son células sanas del ovario o células de otros tejidos normales- lo cual demuestra el alto grado de relación con el tumor de los genes originarios (véase el Ejemplo 2). Asimismo, los propios péptidos son presentados en el tejido tumoral - «tejido tumoral» significa en relación con la presente invención una muestra procedente de una paciente aquejada de cáncer de ovario.

Los péptidos de unión a HLA pueden ser reconocidos por el sistema inmunitario, específicamente por los linfocitos T. Los linfocitos T pueden destruir las células que presentan el complejo HLNpéptido reconocido, por ejemplo células de cáncer de ovario que presenten los péptidos derivados.

El péptido de la presente invención ha demostrado su capacidad para estimular las respuestas de los linfocitos T y/o está sobrepresentado y, por tanto, puede ser utilizado para la producción de anticuerpos y/o TCR, en concreto ^t C^r solubles, conforme a la presente invención (véanse el Ejemplo 3 y el Ejemplo 4). Asimismo, cuando los péptidos están formando un complejo con el MHC correspondiente pueden ser utilizados también para la producción de anticuerpos y/o TCR, en concreto TCR solubles, conforme a la presente invención. Los métodos pertinentes son conocidos por los expertos y también se pueden hallar en la bibliografía pertinente (véase también más adelante). Así pues, el péptido de la presente invención es útil para generar en un paciente una respuesta inmunitaria con la que destruir células tumorales. La respuesta inmunitaria se puede inducir en el paciente con la administración directa de los péptidos descritos o de sustancias precursoras adecuadas (p. ej., péptidos alargados, proteínas o ácidos nucleicos que codifiquen dichos péptidos), idealmente en combinación con un agente que potencie la inmunogenicidad (un adyuvante). Cabe esperar que la respuesta inmunitaria generada por esa vacunación terapéutica sea muy específica contra las células tumorales porque los tejidos normales no contienen el péptido diana de la presente invención en un número comparable de copias, lo cual evita el riesgo de reacciones autoinmunitarias perjudiciales contra las células normales del paciente.

La presente descripción se refiere también a receptores de linfocitos T (TCR) que comprenden una cadena alfa y una cadena beta (“TCR alfa/beta”). Asimismo, proporciona el péptido conforme con la invención capaz de unirse a TCR y anticuerpos cuando es presentado por una molécula del MHC.

La presente descripción concierne, además, a fragmentos de los TCR acordes con la invención que son capaces de unirse a un antígeno peptídico acorde con la presente invención cuando es presentado por una molécula del HLA. El término se refiere en particular a fragmentos de TCR solubles, por ejemplo, TCR desprovistos de partes del dominio transmembrana y/o de regiones constantes, TCR monocatenarios, y fusiones de los anteriores, por ejemplo, con Ig.

La presente descripción también se refiere a ácidos nucleicos, vectores y células hospedadoras para expresar los TCR y los péptidos de la presente descripción, así como métodos para el uso de los mismos.

El término “receptor de linfocito T” (abreviado TCR) se refiere a una molécula heterodimérica que comprende una cadena polipeptídica alfa (cadena alfa) y una cadena polipeptídica beta (cadena beta), en que el receptor heterodimérico es capaz de unirse a un antígeno peptídico presentado por una molécula HLA. El término también incluye a los llamados TCR gamma y delta.

En una forma de realización la descripción proporciona un método para producir un TCR como el descrito en la presente memoria, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula hospedadora capaz de expresar el TCR en las condiciones idóneas para promover la expresión de dicho receptor.

La descripción en otro aspecto concierne a métodos acordes con la descripción, en que el antígeno se carga en moléculas MHC de clase I o II que se expresan en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada o en una célula presentadora de antígeno artificial mediante la puesta en contacto de una cantidad suficiente de antígeno con una célula presentadora de antígeno o bien el antígeno se carga en tetrámetros MHC de clase I o II mediante la tetramerización de los monómeros del complejo MHC de clase I o II/antígeno.

Las cadenas alfa y beta de los TCR alfa/beta, y las cadenas gamma y delta de los TCR gamma/delta, se consideran en general dotadas de dos “dominios”, esto es, dominios variable y constante. El dominio variable consiste en la concatenación de la región variable (V) con la región de unión (J). El dominio variable también puede incluir una región líder (L). Las cadenas beta y delta también pueden incluir una región de diversidad (D). Los dominios constantes alfa y beta también pueden incluir dominios transmembrana (TM) C-terminales que anclan las cadenas alfa y beta a la membrana celular.

Con respecto a los TCR gamma/delta, el término «dominio variable de cadena gamma de TCR» tal y como se emplea en la presente memoria se refiere a la concatenación de la región V de la cadena gamma del TCR sin región líder (L) (TRGV) con la región J de la cadena gamma del TCR (TRGJ), y el término «dominio constante de cadena gamma de TCR» se refiere a la región extracelular TRGC, o a una secuencia TRGC truncada en su extremo C-terminal. De modo similar, el término «dominio variable de cadena delta de TCR» se refiere a la concatenación de la región V de la cadena delta del TCR (TRDV) sin la región líder (L) con la región D/J de la cadena delta del TCR (TRDD/TRDJ), y el término «dominio constante de cadena delta de TCR» se refiere a la región extracelular TRDC, o a una secuencia TRDC truncada en su extremo C-terminal.

Los TCR de la presente descripción se unen preferentemente a un complejo de péptido-molécula de HLA con una afinidad de unión (K^d ) de aproximadamente 100 μM o menos, aproximadamente 5o μM o menos, aproximadamente 25 μM o menos, o aproximadamente 10 μM o menos. Se prefieren más los TCR con alta afinidad dotados de una afinidad de unión de aproximadamente 1 μM o menos, aproximadamente 100 nM o menos, aproximadamente 50 nM o menos, aproximadamente 25 nM o menos. Algunos ejemplos sin ánimo de limitación de intervalos de afinidad de unión preferidos para los TCR de la presente invención son: aproximadamente 1 nM a aproximadamente 10 nM; aproximadamente 10 nM a aproximadamente 20 nM; aproximadamente 20 nM a aproximadamente 30 nM; aproximadamente 30 nM a aproximadamente 40 nM; aproximadamente 40 nM a aproximadamente 50 nM; aproximadamente 50 nM a aproximadamente 60 nM; aproximadamente 60 nM a aproximadamente 70 nM; aproximadamente 70 nM a aproximadamente 80 nM; aproximadamente 80 nM a aproximadamente 90 nM; y aproximadamente 90 nM a aproximadamente 100 nM.

Tal y como se usa en relación con los TCR de la presente descripción, «unión específica» y las variantes gramaticales de dicho término se emplean para designar un TCR dotado de una afinidad de unión (KD) hacia un complejo de péptido-molécula HLA igual o inferior a 100 μM.

Los TCR heterodiméricos alfa/beta de la presente descripción pueden incorporar un enlace disulfuro introducido entre sus dominios constantes. Los TCR preferidos de este tipo incluyen aquellos dotados con una secuencia de dominio constante TRAC y con una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2, excepto porque la Thr 48 de TRAC y la Ser 57 de TRBC1 o TRBC2 son sustituidas por residuos de cisteína, y dichas cisteínas forman un enlace disulfuro entre la secuencia de dominio constante TRAC y la secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 del TCR.

Con o sin el susodicho enlace intercatenario introducido, los TCR heterodiméricos alfa/beta de la presente descripción pueden tener una secuencia de dominio constante TRAC y una secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2, y la secuencia de dominio constante TRAC y la secuencia de dominio constante TRBC1 o TRBC2 del TCR pueden estar enlazadas mediante el enlace disulfuro nativo establecido entre la Cys4 del exón 2 de TRAC y la Cys2 del exón 2 de TRBC1 o TRBC2.

Los TCR de la presente descripción pueden comprender un marcador detectable seleccionado del grupo consistente en radionúclidos, fluoróforos o biotina. Los TCR de la presente descripción pueden estar conjugados con un principio terapéuticamente activo, como un radionúclido, un agente quimioterápico o una toxina.

En una forma de realización, un TCR de la presente descripción portador de al menos una mutación de la cadena alfa y/o de al menos una mutación de la cadena beta presenta una glucosilación modificada en comparación con el TCR no mutado.

En una forma de realización, un TCR que contiene al menos una mutación en su cadena alfa del TCR y/o en su cadena beta del TCR posee una afinidad de unión y/o una semivida de unión con un complejo de péptido-molécula HLA, que al menos duplica la de un TCR cuya cadena alfa de TCR y/o beta de TCR no está(n) mutada(s). La potenciación de la afinidad de los TCR específicos de tumor, y su aprovechamiento, depende de la existencia de una franja de afinidades óptimas de tales receptores. La existencia de tal franja se basa en las observaciones de que los TCR específicos para patógenos restringidos a HLA-A2 presentan valores KD que en general son unas 10 veces menores que los TCR específicos para los autoantígenos asociados a tumor restringidos a HLA-A2. Ahora sabemos que a pesar de que los antígenos tumorales tienen el potencial de ser inmunogénicos, puesto que los tumores se originan a partir de las propias células del individuo, solo las proteínas mutadas o las proteínas con un procesamiento traduccional alterado serán detectadas como extrañas por el sistema inmunitario. Los antígenos que están regulados al alza o sobreexpresados (llamados autoantígenos) no inducen necesariamente una respuesta inmunitaria funcional contra el tumor: Los linfocitos T que expresen TCR que sean altamente reactivos contra dichos antígenos serán seleccionados negativamente en el timo en un proceso conocido como tolerancia central, lo que significa que solo pervivirán los linfocitos T cuyos TCR presenten una baja afinidad hacia los autoantígenos. Así pues, la afinidad de los TCR o de las variantes de la presente descripción hacia los péptidos puede ser potenciada mediante métodos bien conocidos en la técnica.

La presente descripción concierne, además, a un método para identificar y aislar un TCR acorde con la presente descripción, el cual comprende: la incubación de PBMC procedentes de donantes sanos negativos para HLA-A*02 con monómeros de, por ejemplo, A2/péptido, la incubación de los PBMC con tetrámeros marcados con ficoeritrina (PE) y el aislamiento de los linfocitos T dotados de gran avidez mediante el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS)-Calibur.

La presente descripción concierne, además, a un método para identificar y aislar un TCR conforme a la presente descripción, el cual comprende: la obtención de un ratón transgénico con los locus enteros del gen TCRap humano (1,1 y 0,7 Mb), cuyos linfocitos T expresen un repertorio diverso de TCR humanos que compense la deficiencia de TCR murinos; la inmunización del ratón con un péptido; la incubación de los PBMC obtenidos de los ratones transgénicos con tetrámeros marcados con ficoeritrina (PE); y el aislamiento de los linfocitos T con gran avidez mediante el análisis de selección de células activadas por fluorescencia (FACS)-Calibur.

En un aspecto, con el fin de obtener los linfocitos que expresan los TCR de la presente descripción, los ácidos nucleicos que codifican las cadenas TCR-alfa y/o TCR-beta de la presente descripción se clonan en vectores de expresión, como retrovirus gamma o lentivirus. Se crean los virus recombinantes y se analiza su funcionalidad, como la especificidad antigénica y la avidez funcional. A continuación se toma una alícuota del producto final para transducir a la población destinataria de linfocitos T (generalmente purificada a partir de los PBMC del paciente), que se expande antes de administrarla vía infusión al paciente.

En otro aspecto, para obtener linfocitos T que expresen TCR de la presente descripción, los ARN del TCR se sintetizan con técnicas conocidas en la técnica, como por ejemplo, sistemas de transcripción in vitro. A continuación, los ARN del TCR sintetizados in vitro se introducen mediante electroporación en linfocitos T CD8+ primarios procedentes de donantes sanos para reexpresar las cadenas TCR-alfa y/o TCR-beta específicas del tumor.

Con el fin de potenciar la expresión, los ácidos nucleicos que codifican los TCR de la presente descripción pueden enlazarse funcionalmente con promotores potentes, como repeticiones terminales largas de retrovirus (LTR), citomegalovirus (CMV), virus de citoblastos murino (MSCV) U3, fosfoglicerato cinasa (PGK), p-actina, ubiquitina y un promotor compuesto de virus simiesco 40 (SV40)/CD43, el factor de elongación (EF)-1a y el promotor del virus formador de focos en el bazo (SFFV). En una forma de realización preferida, el promotor es heterólogo con respecto al ácido nucleico que se expresa.

Además de promotores potentes, los casetes de expresión del TCR de la presente descripción pueden contener otros elementos adicionales para potenciar la expresión del transgén, como un tracto central polipurínico (cPPT), el cual promueve la traslocación nuclear de los contructos lentivíricos (Follenzi et al., 2000), o el elemento regulador postrancripcional del virus de la marmota (wPRE), que aumenta el nivel de expresión del transgén al reforzar la estabilidad del ARN (Zufferey et al., 1999).

Las cadenas alfa y beta de un TCR de la presente invención pueden ser codificadas por ácidos nucleicos insertados en vectores separados, o pueden serlo por polinucleótidos insertados en un mismo vector.

Alcanzar un alto nivel de expresión del TCR en la superficie celular exige que tanto las cadenas TCR-alfa como TCR-beta del TCR introducido se transcriban en abundancia. Con ese fin, las cadenas TCR-alfa y TCR-beta de la presente descripción se pueden clonar en constructos bicistrónicos en un mismo vector, los cuales han demostrado ser capaces de superar ese obstáculo. La inserción de un sitio de entrada intrarribosómico del virus (IRES) entre las cadenas TCR-alfa y TCR-beta da pie a la expresión coordinada de ambas cadenas, porque ambas cadenas TCR-alfa y TCR-beta son generadas a partir de un único transcrito que se escinde en dos proteínas durante la traducción, asegurando así la producción equimolar de ambas cadenas (Schmitt et al. 2009).

Los codones de los ácidos nucleicos que codifican los TCR de la presente descripción pueden ser optimizados para potenciar la expresión en la célula hospedadora. La redundancia del código genético permite que algunos aminoácidos sean codificados por más de un codón, pero ciertos codones son menos 'idóneos' que otros por la disponibilidad relativa de los ARNt correspondientes, entre otros factores (Gustafsson et al., 2004). Se ha demostrado que la modificación de las secuencias génicas de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta de modo tal que cada aminoácido sea codificado por el codón más idóneo para la expresión génica en mamíferos, así como la supresión de los motivos que provocan inestabilidad en el ARNm o de los sitios de escisión ocultos mejora notablemente la expresión génica de ambas cadenas (Scholten et al., 2006).

Además, el emparejamiento erróneo entre las cadenas de TCR introducidas y las endógenas puede derivar en la adquisición de especificidades que supongan un riesgo significativo para la autoinmunidad. Por ejemplo, la formación de dímeros mixtos de las cadenas del TCR puede reducir el número de moléculas CD3 disponibles para formar complejos TCR correctamente aparejados, y por tanto reducir notablemente la avidez funcional de las células que expresan el TCR introducido (Kuball et al., 2007).

A fin de reducir el emparejamiento erróneo se puede modificar el dominio C-terminal de las cadenas introducidas de TCR de la presente descripción para promover la afinidad entre las cadenas, al tiempo que reducir las posibilidades de que las cadenas introducidas se emparejen con los TCR endógenos. Tales estrategias pueden consistir en: la sustitución de los dominios C-terminales de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta humanas con sus contrapartidas murinos (dominio C-terminal murinizado); la creación de un segundo enlace disulfuro entre las cadenas en el dominio C-terminal mediante la introducción de un segundo residuo de cisteína tanto en las cadenas TCR-alfa como TCR-beta del TCR introducido (modificación con cisteína); cambiar los residuos que interactúan de los dominios C-terminales de las cadenas TCR-alfa y TCR-beta («knob-in-hole», ojal en botón); y la fusión directa de los dominios variables de ambas cadenas con el CD3Z (fusión con CD3Z) (Schmitt et al., 2009).

En una forma de realización, se modifica con técnicas de ingeniería genética una célula hospedadora para que exprese un TCR de la presente descripción. En formas de realización preferidas, la célula hospedadora es un linfocito T humano o una célula progenitora de linfocito T humana. En algunas formas de realización el linfocito T o la célula progenitora de linfocito T se obtienen de un paciente con cáncer. En otras formas de realización el linfocito T o la célula progenitora de linfocito T se obtienen de un donante sano. Las células hospedadoras de la presente descripción pueden ser alogénicas o autólogas con respecto al paciente que va a ser tratado. En una forma de realización, la hospedadora es un linfocito T gamma/delta transformado para expresar un TCR alfa/beta.

Una «composición farmacéutica» es una composición apta para la administración a un ser humano en un contexto médico. Preferiblemente, dicha composición farmacéutica es estéril y se fabrica conforme a las directrices de Buenas Prácticas de Fabricación (BPF).

Las composiciones farmacéuticas pueden comprender los péptidos en forma libre o en forma de una sal farmacéuticamente aceptable (véase también más arriba). Tal y como se utiliza en la presente memoria, «sal farmacéuticamente aceptable» se refiere a un derivado de los péptidos descritos en el que el péptido es modificado para obtener sales ácidas o básicas del agente. Por ejemplo, las sales ácidas se preparan a partir de la base libre (normalmente la forma neutra del fármaco posee un grupo -NH₂ neutro) haciéndola reaccionar con un ácido adecuado. Ácidos adecuados para la preparación de sales ácidas incluyen tanto ácidos orgánicos, p. ej., ácido acético, ácido propiónico, ácido glicólico, ácido pirúvico, ácido oxálico, ácido málico, ácido malónico, ácido succínico, ácido maleico, ácido fumárico, ácido tartárico, ácido cítrico, ácido benzoico, ácido cinnámico, ácido mandélico, ácido metanosulfónico, ácido etanosulfónico, ácido p-toluensulfónico, ácido salicílico y similares, como ácidos inorgánicos, como por ejemplo ácido clorhídrico, ácido bromhídrico, ácido sulfúrico, ácido nítrico, ácido fosfórico y similares. A la inversa, la preparación de sales básicas a partir de grupos ácidos que pueden estar presentes en un péptido se preparan empleando una base farmacéuticamente aceptable como hidróxido de sodio, hidróxido de potasio, hidróxido de amonio, hidróxido de calcio, trimetilamina o similares.

En una forma de realización especialmente preferida, las composiciones farmacéuticas comprenden los péptidos en forma de sales de ácido acético (acetatos), trifluoroacetatos o ácido clorhídrico (cloruros).

Preferiblemente, el medicamento de la presente invención es un agente inmunoterapéutico como una vacuna. La vacuna puede administrarse directamente al paciente, en el órgano afectado o por vía sistémica de forma i.d., i.m, s.c., 1. p. e i.v., o aplicarse ex vivo a células derivadas del paciente o a una línea celular humana que después se administra al paciente, o utilizarse in vitro para seleccionar una subpoblación de células inmunitarias derivadas del paciente que después se le vuelven a administrar. Si el ácido nucleico se administra a células in vitro, puede ser útil que estas células sean transfectadas para que expresen simultáneamente citocinas inmunoestimuladoras, como la interleucina-2. El péptido puede ser sustancialmente puro, o combinarse con un adyuvante inmunoestimulador (véase abajo) o utilizarse en combinación con citocinas inmunoestimuladoras, o bien administrarse mediante otro sistema de liberación adecuado, como por ejemplo liposomas. El péptido también se puede conjugar con un transportador adecuado como la hemocianina de lapa californiana (KLH) o el manano (véase WO 95/18145 y (Longenecker et al., 1993)).El péptido también puede estar marcado, o ser una proteína de fusión, o ser una molécula híbrida. Se espera que los péptidos cuya secuencia se ofrece en la presente invención estimulen a los linfocitos T CD4 o CD8. No obstante, la estimulación de los linfocitos T CD8 es más eficiente si cuentan con la ayuda de los linfocitos T cooperadores CD4. Así pues, en el caso de los epítopos de MHC de clase I que estimulan a los linfocitos T CD8 la pareja de fusión o las secciones de una molécula híbrida adecuada proporcionan epítopos que estimulan a los linfocitos T CD4-positivos. Los epítopos estimuladores de los CD4 y los CD8 son bien conocidos en la técnica e incluyen los identificados en la presente invención.

En un aspecto, la vacuna comprende al menos un péptido dotado de la secuencia de aminoácidos expuesta en las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 772 y al menos otro péptido adicional, preferiblemente dos a 50, más preferiblemente dos a 25, incluso más preferiblemente dos a 20 y más preferiblemente aún dos, tres, cuatro, cinco, seis, siete, ocho, nueve, diez, once, doce, trece, catorce, quince, dieciséis, diecisiete o dieciocho péptidos. Los péptidos pueden derivar de uno o más TAA específicos y se pueden unir a moléculas MHC de clase I.

Otro aspecto de la invención proporciona un ácido nucleico (por ejemplo un polinucleótido) que codifica el péptido de la invención. El polinucleótido puede ser, por ejemplo, ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los mismos, monocatenarios y/o bicatenarios, o formas nativas o estabilizadas de polinucleótidos, como por ejemplo, polinucleótidos con un esqueleto de fosforotioato y que pueden contener intrones siempre que codifique el péptido. Por supuesto, sólo los péptidos que contengan residuos de aminoácidos naturales unidos por enlaces peptídicos naturales pueden ser codificados por un polinucleótido. Otro aspecto más de la invención proporciona un vector de expresión capaz de expresar un polipéptido conforme a la invención.

Se han desarrollado diversos métodos para unir polinucleótidos, especialmente ADN, a vectores, por ejemplo a través de extremos cohesivos complementarios. Por ejemplo, al segmento de ADN se le pueden añadir prolongaciones de homopolímeros complementarios para insertarlo en el vector de ADN. El vector y el segmento de ADN se unen a continuación por medio de puentes de hidrógeno entre las colas homopoliméricas complementarias para formar moléculas de ADN recombinante.

Otro método alternativo para unir el segmento de ADN a los vectores son los ligadores sintéticos que contienen uno o más sitios de restricción. Existen ligadores sintéticos comerciales que contienen diversas dianas para las endonucleasas de restricción que facilitan varios proveedores como International Biotechnologies Inc. New Haven, CN, EE.UU.

Un método deseable para modificar el ADN que codifica el polipéptido de la invención emplea la reacción en cadena de la polimerasa tal y como exponen Saiki RKy cols. (Saiki et al., 1988).Este método puede ser utilizado para introducir el ADN en un vector adecuado, por ejemplo diseñando las dianas de restricción adecuadas, o puede ser empleado para modificar el ADN de otros modos útiles conocidos en la técnica. Si se opta por vectores virales, son preferibles los vectores poxvíricos o adenovíricos.

El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) se puede expresar en un hospedador adecuado para producir un polipéptido que comprenda el péptido de la invención. Así pues, el ADN que codifica el péptido de la invención puede ser utilizado conforme a técnicas conocidas, modificado adecuadamente siguiendo las enseñanzas contenidas en la presente memoria para construir un vector de expresión que se emplee para transformar una célula hospedadora a fin de que exprese y produzca el polipéptido de la invención. Tales técnicas incluyen las dadas a conocer en las patentes de EE.UU. N.° 4.440.859, 4.530.901, 4.582.800, 4.677.063, 4.678.751, 4.704.362, 4.710.463, 4.757.006, 4.766.075 y 4.810.648.

El ADN (o ARN en el caso de los vectores retrovíricos) que codifica el polipéptido que constituye el compuesto de la invención se puede unir con una amplia variedad de secuencias de ADN distintas para introducirlo en un hospedador adecuado. El ADN acompañante dependerá de la naturaleza del hospedador, el modo de introducir el ADN en su interior y de si se pretende que se integre o que se mantenga como un episoma.

En general, el ADN se inserta en un vector de expresión, como un plásmido, con la orientación apropiada y el marco de lectura correcto para asegurar la expresión. Si es necesario, el ^a Dⁿ se puede enlazar con secuencias nucleotídicas de control que regulan la transcripción o la traducción y que son reconocidas por el hospedador deseado, aunque en general tales controles ya suelen estar incluidos en el propio vector de expresión. A continuación, el vector se introduce en el hospedador mediante técnicas estándar. En general, el vector no consigue transformar todos los hospedadores, lo que hará necesario seleccionar las células hospedadoras que hayan quedado transformadas. Una técnica de selección consiste en incorporar en el vector de expresión una secuencia de ADN con los elementos de control necesarios que codifique un rasgo seleccionable en la célula transformada, como por ejemplo de resistencia a antibióticos.

Otra alternativa consiste en incorporar el gen de ese rasgo seleccionable en otro vector con el que se cotransforma la célula hospedadora.

Las células hospedadoras que hayan sido transformadas con el ADN recombinante de la invención se cultivarán durante el tiempo suficiente y en las condiciones apropiadas que las personas versadas en la técnica conocen a la vista de las enseñanzas descritas en la presente memoria para que el polipéptido pueda expresarse y, finalmente, ser recuperado.

Son muchos los sistemas de expresión conocidos, como bacterias (E. coli, Bacillus subtilis, etc.), levaduras (Saccharomyces cerevisiae, etc.), hongos filamentosos (género Aspergillus, etc.), células vegetales, animales o de insectos. Preferiblemente el sistema consistirá en células de mamífero, como las células CHO disponibles de la ATCC Cell Biology Collection.

Un típico vector plasmídico de expresión constitutiva para células de mamífero comprende el promotor del CMV o el del SV40 con una cola poli-A adecuada y un marcador de resistencia como la neomicina. Un ejemplo es el pSVL que ofrece Pharmacia, Piscataway, NJ, EE.U^u . Un ejemplo de vector de expresión inducible para mamífero es el μMSG, también suministrado por Pharmacia. Otros vectores plasmídicos de levadura son pRS403-406 y pRS413-416, en general proveídos por Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Los plásmidos pRS403, pRS404, pRS405 y pRS406 son plásmidos integrativos de levadura (YIp) que incorporan los marcadores seleccionables de levadura HIS3, TRP1, LEU2 y URA3. Los plásmidos pRS413-416 son plásmidos centroméricos de levadura (Ycp). Los vectores dotados del promotor del CMV (por ejemplo de Sigma-Aldrich) proporcionan una expresión transitoria o estable, expresión en el citoplasma o secreción, y marcador de los extremos N-terminal o C-terminal en varias combinaciones de FLAG, 3xFLAG, c-myc o MAT. Estas proteínas de fusión permiten la detección, la purificación y el análisis de la proteína recombinante. Las fusiones con doble etiqueta aportan flexibilidad a la detección.

La potente región reguladora promotora del citomegalovirus (CMV) humano ofrece niveles de expresión constitutiva de la proteína muy elevados, de hasta 1 mg/l en células COS. En estirpes celulares menos potentes los niveles de proteínas suelen rondar ~0,1 mg/l. La presencia del origen de replicación del SV40 genera niveles elevados de replicación del ADN en células COS que toleran la replicación del SV40. Los vectores de CMV, por ejemplo, pueden contener el origen μMB1 (derivado del pBR322) para la replicación en células bacterianas, el gen de la b-lactamasa para la selección por resistencia a la ampicilina, hGH poliA, y el origen f1. Los vectores que contienen la secuencia líder de la preprotripsina (PPT) pueden canalizar la secreción de las proteínas de fusión FLAG hacia el medio de cultivo, donde se pueden purificar por medio de anticuerpos anti-FLAG, resinas y placas. En la técnica se conocen otros vectores y sistemas de expresión aptos para el uso con una variedad de células hospedadoras.

En otra forma de realización dos o más péptidos de la invención se codifican y se expresan en orden sucesivo (similar a constructos de «collar de cuentas»). Al hacerlo, los péptidos o los variantes peptídicas se pueden enlazar o fusionar juntas mediante segmentos de aminoácidos enlazantes, como por ejemplo l LlLl L, o se pueden unir sin ningún otro péptido adicional entre ellos. Estos constructos también pueden ser utilizados para la terapia contra el cáncer, y podrían inducir respuestas inmunitarias en las que intervengan tanto el MHC I como el MHC II.

La presente invención también se refiere a una célula hospedadora transformada con un vector polinucleotídico de la presente invención. La célula hospedadora puede ser procariota o eucariota. Las células bacterianas pueden ser las células hospedadoras procariotas más adecuadas en determinadas circunstancias; normalmente son cepas de E. coli, como por ejemplo las cepas DH5 disponibles de Bethesda Research Laboratories Inc., Bethesda, MD, EE.UU., y RR1 disponibles de la American Type Culture Collection (ATCC) de Rockville, MD, EE.UU. (N.° ATCC 31343).Las células hospedadoras eucariotas preferidas son células de levadura, de insecto y de mamífero, preferiblemente células de vertebrado como estirpes celulares de colon y de fibroblastos de ratón, rata, mono o ser humano. Las células hospedadoras de levadura incluyen YPH499, YPH500 y YPH501, que en general pueden obtenerse de Stratagene Cloning Systems, La Jolla, CA 92037, EE.UU. Las células hospedadoras de mamífero preferidas incluyen las células de ovario de hámster chino (CHO) disponibles de la ATCC como CCL61, las células embrionarias de ratón suizo NIH/3T3 disponibles de la ATCC como CRL 1658, las células COS-1 de riñón de mono disponibles de la ATCC como CRL 1650 y las células 293 que son células renales embrionarias humanas. Las células de insecto preferidas son las células Sf9 que se pueden transfectar con vectores de expresión baculovíricos. Se puede encontrar una revisión general referente a la elección de las células hospedadoras más adecuadas por ejemplo en el manual de Paulina Balbás y Argelia Lorence “Methods in Molecular Biology Recombinant Gene Expression, Reviews and Protocols,” Part One, Second Edition, ISBN 978-1-58829-262-9, y otra bibliografía conocida por las personas versadas.

La transformación de las células hospedadoras adecuadas con el constructo de ADN de la presente invención se consuma con métodos consabidos que normalmente dependen del tipo de vector utilizado. En lo referente a la transformación de células hospedadoras procariotas, véanse por ejemplo Cohen y cols. (Cohen et al., 1972) y (Green and Sambrook, 2012). La transformación de células de levadura se describe en Sherman y cols. (Sherman et al., 1986). El método de Beggs (Beggs, 1978) también resulta útil. En lo que concierne a los reactivos adecuados para transfectar las células de vertebrados, por ejemplo el fosfato de calcio y el DEAE-dextrano o las formulaciones con liposomas, se pueden adquirir de Stratagene Cloning Systems, o Life Technologies Inc., Gaithersburg, MD 20877, EE.UU. La electroporación también es útil para la transformación y/o transfección de las células y es perfectamente conocida su aplicación en la transformación de células de levadura, bacteria, insecto y vertebrado.

Las células transformadas con éxito, es decir, las que contengan un constructo de ADN de la presente invención, se pueden identificar con técnicas bien conocidas como la PCR. Otra alternativa consiste en detectar la presencia de la proteína en el sobrenadante por medio de anticuerpos.

Se apreciará que ciertas células hospedadoras de la invención son útiles para la preparación del péptido de la invención, por ejemplo las células bacterianas, de levadura e insecto. Con todo, para ciertos métodos terapéuticos pueden ser útiles otras células hospedadoras. Por ejemplo, se pueden utilizar células presentadoras de antígeno como las células dendríticas para expresar los péptidos de la invención de tal forma que puedan ser cargados en las moléculas MHC oportunas. Así pues, la presente invención proporciona una célula hospedadora que comprende un ácido nucleico o un vector de expresión conforme a la invención.

En una forma de realización preferida la célula hospedadora es una célula presentadora de antígeno, en particular una célula dendrítica o célula presentadora de antígeno. Las APC cargadas con una proteína de fusión recombinante que contiene fosfatasa ácida prostática (PAP) fueron aprobadas por la Administración de Alimentos y Fármacos de los EE.UU. (FDA) el 29 de abril de 2010 para tratar el cáncer de próstata hormonorrefractario metastásico asintomático o mínimamente sintomático (Sipuleucel-T) (Rini et al., 2006; Small et al., 2006).

Otro aspecto de la invención proporciona un método para la producción del péptido de la invención, comprendiendo dicho método el cultivo de una célula hospedadora y el aislamiento del péptido a partir de dicha célula o de su medio de cultivo.

En otra forma de realización, el péptido, el ácido nucleico o el vector de expresión de la invención se emplean en medicina. Por ejemplo, el péptido o su variante pueden ser preparados para la inyección por vía intravenosa (i.v.), subcutánea (s.c.), intradérmica (i.d.), intraperitoneal (i.p.) o intramuscular (i.m.). Los métodos preferidos para la inyección del péptido incluyen s.c., i.d., i.p., i.m. e i.v. Los métodos preferidos para la inyección del ADN incluyen i.d., i.m., s.c., i.p. e i.v. Según el péptido o ADN de que se trate se pueden administrar dosis de, por ejemplo, entre 50 |jg y 1,5 mg, preferiblemente de 125 jg a 500 jg de péptido o ADN. Dosis en esos intervalos se han empleado con éxito en varios ensayos (Walter et al., 2012).

El polinucleótido usado para la vacunación activa puede ser sustancialmente puro, o estar contenido en un vector o en un sistema de liberación adecuado. El ácido nucleico puede ser ADN, ADNc, APN, ARN o una combinación de los mismos. Los métodos para diseñar e introducir ese ácido nucleico son bien conocidos por los expertos en la materia. Una perspectiva general se puede consultar por ejemplo en Teufel y cols.(Teufel et al., 2005).Las vacunas polinucleotídicas son fáciles de preparar, pero el mecanismo por el cual tales vectores inducen la respuesta inmunitaria no se conoce con exactitud. Los vectores y sistemas de liberación adecuados incluyen los de ADN y/o ARN viral, como los sistemas basados en adenovirus, virus vacunal, retrovirus, herpesvirus, virus adeno-asociados o híbridos que contienen elementos de varios virus. Los sistemas de liberación no virales incluyen lípidos catiónicos y polímeros catiónicos que son bien conocidos como técnicas para la introducción de ADN. Los métodos de introducción físicos, como la “pistola génica”, también pueden utilizarse. El péptido o péptidos codificados por el ácido nucleico pueden ser una proteína de fusión, por ejemplo con un epítopo que estimule los linfocitos T para el respectivo CDR opuesto tal y como se ha indicado antes.

El medicamento de la invención también puede incluir uno o varios adyuvantes. Los adyuvantes son sustancias que potencian o estimulan de forma inespecífica la respuesta inmunitaria (p. ej., respuestas inmunitarias mediadas por linfocitos T CD8-positivos y linfocitos T cooperadores (TH) contra un antígeno, por lo que podrían ser considerados útiles en el medicamento de la presente invención. Entre los adyuvantes adecuados se incluyen, entre otros: 1018 ISS, sales de aluminio, AMPLIVAX®, AS15, BCG, CP-870.893, CpG7909, CyaA, dSLIM, ligandos de flagelina o TLR5 derivados de flagelina, ligando de FLT3, GM-CSF, IC30, IC31, imiquimod (AlDARA®), resiquimod, ImuFact IMP321, interleucinas como IL-2, IL-13, IL-21, interferón alfa o beta o derivados pegilados de los mismos, IS Patch, ISS, ISCOMATRIX, ISCOMs, JuvImmune®, LipoVac, MALP2, MF59, lípido monofosforilo A, Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, emulsiones de agua en aceite y de aceite en agua, OK-432, OM-174, OM-197-MP-EC, ONTAK, OspA, sistema de vectores PepTel®, micropartículas de dextrano y poli(láctido co-glicólido) [PLG], talactoferrina SRL172, virosomas y otras partículas similares a virus, YF-17D, VEGF trap, R₈48, beta-glucano, Pam3Cys, estimulón QS21 de Aquila, que deriva de la saponina, extractos de micobacterias y miméticos sintéticos de la pared bacteriana, y otros adyuvantes patentados como Detox de Ribi, Quil o Superfos. Se prefieren los adyuvantes como el adyuvante de Freund o el GM-CSF. Con anterioridad se han descrito varios adyuvantes inmunológicos (p. ej., MF59) específicos para las células dendríticas, así como la preparación de los mismos (Allison and Krummel, 1995).También pueden utilizarse citocinas. A varias citocinas se les ha atribuido una influencia directa en la migración de las células dendríticas hacia los tejidos linfoides (p. ej., el TNF-), como parte de un proceso que acelera su maduración hasta convertirlas en células presentadoras antígeno de los linfocitos T (p. ej., GM-CSF, IL-1 e IL-4) (Patente de EE.UU. N.° 5.849.589) y en el que actúan como inmunoadyuvantes (p. ej., la IL-12, IL-15, IL-23, IL-7, IFN-alfa, IFN-beta) (Gabrilovich et al., 1996).

También se ha descrito que los oligonucleótidos de CpG inmunoestimuladores potencian los efectos de los adyuvantes en las vacunas. Sin limitarse a la teoría, los oligonucleótidos de CpG actúan activando el sistema inmunitario innato (no adaptativo) a través de los receptores de tipo Toll (TLR), principalmente el TLR9. La activación del TLR9 desencadenada por los CpG potencia las respuestas humorales y celulares específicas de antígeno contra una amplia gama de antígenos, incluidos antígenos peptídicos o proteicos, virus vivos o muertos, vacunas de células dendríticas, vacunas de células autólogas y conjugados de polisacáridos, tanto en vacunas profilácticas como terapéuticas. Más importante aún, potencian la maduración y la diferenciación de las células dendríticas, lo cual resulta en una mayor activación de los linfocitos TH1 y una generación más potente de linfocitos T citotóxicos (CTL), incluso sin la ayuda de los linfocitos T CD4. La tendencia hacia la respuesta TH1 provocada por la estimulación del TLR9 se mantiene incluso en presencia de adyuvantes vacunales como el aluminio o el adyuvante de Freund incompleto (IFA) que normalmente promueven un sesgo hacia la respuesta TH₂. Los oligonucleótidos de CpG muestran incluso una mayor actividad adyuvante cuando se formulan o administran conjuntamente con otros adyuvantes o en formulaciones como micropartículas, nanopartículas, emulsiones de lípidos o formulaciones similares, que son especialmente necesarias para inducir una respuesta potente cuando el antígeno es relativamente débil. También aceleran la respuesta inmunitaria y permiten reducir las dosis de antígeno aproximadamente en dos órdenes de magnitud, y se han obtenido en algunos experimentos respuestas de anticuerpos comparables a las conseguidas con la dosis completa de vacuna sin CpG (Krieg, 2006). La patente de EE. UU. N.° 6.406.705 B1 describe el uso combinado de oligonucleótidos de CpG, adyuvantes sin ácidos nucleicos y un antígeno para inducir una respuesta inmunitaria específica de antígeno. Un componente preferido de la composición farmacéutica de la presente invención es un antagonista CpG del TLR9 conocido como dSLIM (inmunomodulador en horquilla doble), fabricado por Mologen (Berlín, Alemania). También se pueden utilizar otras moléculas que se unen a los TLR como ARN que se unen a TLR 7, TLR 8 y/o TLR 9.

Entre los ejemplos de adyuvantes útiles también se incluyen CpG modificados químicamente (p. ej., CpR, Idera), análogos de ARNdc como poli(I:C) y derivados de los mismos (p. ej., AmpliGen®, Hiltonol®, poli-(ICLC), poli(IC-R), poli(I:C12U), ARN o ADN bacteriano sin CpG, así como anticuerpos y moléculas pequeñas inmunoactivas como ciclofosfamida, sunitinib, Bevacizumab®, celebrex, NCX-4016, sildenafilo, tadalafilo, vardenafilo, sorafenib, temozolomida, temsirolimús, XL-999, CP-547632, pazopanib, VEGF Trap, ZD2171, AZD2171, anti-CTLA4, otros anticuerpos que reconocen estructuras clave del sistema inmunitario (p. ej., anti-CD40, anti-TGF-beta, anti-receptor TNF-alfa) y SC58175, que pueden actuar de forma terapéutica y/o como adyuvantes. Las cantidades y concentraciones de adyuvantes y de aditivos útiles en el contexto de la presente invención pueden ser determinadas fácilmente por las personas versadas en la técnica sin demasiada experimentación.

Los adyuvantes preferidos son anti-CD40, imiquimod, resiquimod, GM-CSF, ciclofosfamida, sunitinib, bevacizumab, interferón-alfa, oligonucleótidos CpG y derivados, poli-(I:C) y derivados, ARN, sildenafilo, y formulaciones de partículas con PLG o virosomas.

En una forma de realización preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención el adyuvante es seleccionado del grupo consistente en factores estimuladores de colonias, como el factor estimulador de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod, resimiquimod e interferón-alfa.

En una forma de realización preferida la composición farmacéutica conforme a la invención el adyuvante es seleccionado del grupo consistente en factores estimuladores de colonias, como el factor estimulador de las colonias de granulocitos-macrófagos (GM-CSF, sargramostim), ciclofosfamida, imiquimod y resiquimod. En otra forma de realización preferida de la composición farmacéutica conforme a la invención, el adyuvante es ciclofosfamida, imiquimod o resiquimod. Los adyuvantes más preferidos son: Montanide IMS 1312, Montanide ISA 206, Montanide ISA 50V, Montanide ISA-51, poli-ICLC (Hiltonol®) y AcM anti-CD40 o combinaciones de los anteriores.

Esta composición está destinada a la administración parenteral, como por vía subcutánea, intradérmica o intramuscular, o bien para la administración oral. Para ello, los péptidos y opcionalmente otras moléculas se disuelven o se suspenden en un vehículo farmacéuticamente aceptable, preferiblemente acuoso. Además, la composición puede contener excipientes, tales como tampones, aglutinantes, disgregantes, diluyentes, sabores, lubricantes, etc. Los péptidos también se pueden administrar junto con sustancias inmunoestimuladoras, como citocinas. En una composición tal se puede usar una amplia lista de excipientes, como por ejemplo, los tomados de A. Kibbe, Handbook of Pharmaceutical Excipients, (Kibbe, 2000). La composición se puede utilizar para la prevención, profilaxis y/o tratamiento de enfermedades adenomatosas o cancerosas. Las formulaciones preferidas se pueden encontrar en EP2112253, por ejemplo.

Es importante tener presente que la respuesta inmunitaria desencadenada por la vacuna conforme a la invención ataca el cáncer en diferentes estadios celulares y en diferentes estadios de desarrollo. Además, se atacan diferentes vías de señalización relacionadas con el cáncer. Esto supone una ventaja con respecto a las vacunas que solo van dirigidas contra una o pocas dianas, que pueden permitir que el tumor se adapte con facilidad al ataque (evasión tumoral). Además, no todos los tumores expresan el mismo patrón de antígenos, por lo que la combinación de varios péptidos asociados a tumor asegura que el tumor en cuestión contenga al menos alguna de las dianas. La composición ha sido diseñada de modo tal que se espera que exprese varios de los antígenos y abarque varias vías independientes necesarias para el crecimiento y el mantenimiento del tumor. Así pues, la vacuna puede ser utilizada con facilidad en la forma ya preparada (off-the-shelf) para una población de pacientes más amplia. Esto significa que no será preciso ninguna otra evaluación de biomarcadores de la expresión de los antígenos aparte del tipado del ^h L^a para seleccionar a los pacientes que acabarán siendo tratados con la vacuna, pero que, aun así, está asegurado que la respuesta inmunitaria estimulada atacará simultáneamente a varias dianas, lo que es importante para la eficacia (Banchereau et al., 2001; Walteret al., 2012).

Tal y como se emplea en la presente memoria, el término «soporte» se refiere a una molécula que se une específicamente a un determinante (p. ej., antigénico). En una forma de realización, un soporte es capaz de dirigir la entidad a la que se ha unido (p. ej., una (segunda) porción unida a antígeno) a un sitio diana, por ejemplo a un tipo específico de célula tumoral o de estroma tumoral portador del determinante antigénico (p. ej., el complejo de un péptido conforme a la presente solicitud). En otra forma de realización un soporte es capaz de activar la señalización mediante su antígeno diana, por ejemplo un antígeno del complejo del receptor del linfocito T. Los soportes incluyen, entre otros, anticuerpos y fragmentos de los mismos, los dominios de unión a antígeno de un anticuerpo, que comprenden una región variable de la cadena pesada del anticuerpo y otra región variable de la cadena ligera del anticuerpo, proteínas de unión que comprenden al menos un motivo repetido de anquirina y moléculas con un solo dominio de unión a antígeno (SDAB), aptámeros, TCR (solubles) y células (modificadas) como linfocitos T alógenos o autólogos. Para evaluar si una molécula es un soporte que se une a una diana, se pueden efectuar ensayos de unión.

Unión «específica» significa que el soporte se une al complejo péptido-MHC de interés mejor que a otros complejos de péptido-MHC naturales, hasta el punto de que un soporte dotado de una molécula activa que es capaz de matar una célula portadora de la diana específica no puede matar otra célula que carezca de esa diana específica aunque presente otro u otros complejos péptido-MHC. La unión a otros complejos péptido-MHC es irrelevante si el péptido del complejo péptido-MHC que reacciona de forma cruzada no es natural, es decir, no deriva del peptidoma-HLA humano. Las pruebas para evaluar la destrucción de las células diana son perfectamente conocidas en la materia. Deben realizarse con células diana (células primarias o estirpes celulares) con una presentación intacta de péptido-MHC, o células cargadas con péptidos de tal modo que se alcancen los niveles de péptido-MHC naturales.

Cada soporte puede comprender un marcador que permita detectarlo una vez unido mediante la determinación de la presencia o la ausencia de una señal generada por dicho marcador. Por ejemplo, el soporte puede ser marcado con un colorante fluorescente o cualquier otra molécula marcadora celular adecuada. Tales moléculas marcadoras son bien conocidas en la técnica. Por ejemplo en el caso del marcador por fluorescencia, como el facilitado por un colorante fluorescente, la visualización del aptámero unido se puede lograr mediante microscopía de fluorescencia o de barrido láser o por citometría de flujo.

Cada soporte se puede conjugar con una segunda molécula activa, como por ejemplo IL-21, anti-CD3 y anti-CD28. Para más información sobre los soportes polipeptídicos véase por ejemplo el apartado de información general de WO2014/071978A1 y las referencias citadas en la misma.

La presente descripción se refiere, además, a aptámeros. Los aptámeros (véase por ejemplo WO 2014/191359 y la bibliografía citada en ella) son moléculas de ácidos nucleicos monocatenarios cortas, que se pueden plegar hasta adoptar estructuras tridimensionales definidas y que reconocen estructuras diana específicas. Parecen ser alternativas adecuadas para el desarrollo de terapias dirigidas. Los aptámeros han demostrado su unión selectiva a una gama de dianas complejas con elevada afinidad y especificidad.

En la pasada década han sido descubiertos aptámeros que reconocen moléculas situadas en la superficie celular que constituyen un medio para el desarrollo de estrategias diagnósticas y terapéuticas. La toxicidad y la inmunogenicidad de los aptámeros es, hasta donde se sabe, prácticamente nula, por lo que son candidatos prometedores a aplicaciones biomédicas. Y son aptámeros, por ejemplo aptámeros que reconocen el antígeno de membrana específico de la próstata, los que han sido empleados con éxito en terapias dirigidas y han demostrado su funcionalidad en modelos de xenoinjerto in vivo. Además, se han descubierto aptámeros que reconocen estirpes de células tumorales específicas.

Es posible seleccionar aptámeros de ADN para desvelar propiedades de reconocimiento de amplio espectro contra varias células cancerosas, y particularmente las derivadas de tumores sólidos, en tanto que las células sanas primarias y no oncogénicas no son reconocidas. Si los aptámeros descubiertos reconocieran no solo un subtipo de tumor concreto sino que interaccionaran con una serie de tumores, se convertirían en una herramienta aplicable para el diagnóstico y la terapéutica de amplio espectro.

Además, las investigaciones de su unión a células mediante la citometría de flujo ha demostrado que los aptámeros presentan una excelente afinidad aparente en la escala nanomolar.

Los aptámeros resultan útiles para fines diagnósticos y terapéuticos. Además, ha sido posible demostrar que algunos aptámeros son captados por las células tumorales y pueden actuar, así como vehículos moleculares para la administración dirigida de agentes antineoplásicos como ARNsi en las células tumorales.

Se pueden seleccionar aptámeros que vayan dirigidos contra dianas complejas tales como células y tejidos y complejos de péptidos que comprendan, y que preferiblemente consistan en, una secuencia acorde con cualquiera de las SeQ ID N.° 1 a SeQ ID N.° 772 con la molécula MHC, mediante la técnica cell-SELEX (acrónimo de Systematic Evolution of Ligands by Exponential enrichment, Evolución sistemática de los ligandos mediante enriquecimiento exponencial).

El péptido de la presente invención puede usarse para generar y desarrollar anticuerpos específicos contra complejos MHc/péptido. Estos pueden ser utilizados como terapia, dirigiendo toxinas o sustancias radiactivas contra el tejido enfermo. Otra aplicación de estos anticuerpos consistiría en dirigir radionúclidos contra el tejido enfermo en aplicaciones de diagnóstico por la imagen como la TEP. Este uso puede ayudar a detectar metástasis pequeñas o determinar el tamaño y la ubicación precisa de los tejidos enfermos.

Por tanto, existe otro aspecto de la invención que proporciona un método para producir un anticuerpo recombinante que se une específicamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA (preferentemente un péptido acorde con la presente invención), comprendiendo dicho método: inmunizar un mamífero no humano genéticamente modificado que comprenda células que expresen dicho complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II con una forma soluble de una molécula MHC de clase I o II unida a dicho antígeno restringido a HLA; aislamiento de moléculas de ARNm a partir de células productoras de anticuerpos de dicho mamífero no humano; producción de una fagoteca que contenga moléculas proteicas codificadas por dichas moléculas de ARNm; y aislamiento de al menos un fago de dicha fagoteca, en que al menos ese fago contenga dicho anticuerpo que se une específicamente al citado complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II unido con dicho antígeno restringido a HLA.

Existe por tanto otro aspecto más de la invención que proporciona un anticuerpo que se une específicamente a un complejo mayor de histocompatibilidad humano (MHC) de clase I o II que forma un complejo con un antígeno restringido a HLA, en el que el anticuerpo es preferentemente un anticuerpo policlonal, anticuerpo monoclonal, anticuerpo biespecífico y/o un anticuerpo quimérico.

En WO 03/068201, WO 2004/084798, WO 01/72768, WO 03/070752, y en publicaciones (Cohen et al., 2003a; Cohen et al., 2003b; Denkberg et al., 2003) se dan a conocer métodos para producir tales anticuerpos y complejos mayores de histocompatibilidad de clase I monocatenarios, así como otras herramientas para la producción de tales anticuerpos.

Preferiblemente el anticuerpo se une al complejo con una afinidad de unión inferior a 20 nanomolar, preferentemente inferior a 10 nanomolar, lo cual se considera «específico» en el contexto de la presente invención.

La presente invención concierne a un péptido consistente en la SEQ ID N.° 53 de la invención que induce la reacción cruzada de los linfocitos T con dicho péptido.

Además, en la presente memoria se da a conocer un péptido que comprende una secuencia seleccionada del grupo consistente en las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 52 y las SeQ ID N.° 54 a Se Q ID N.° 772 o a una variante de las mismas que es al menos un 88% homóloga (preferiblemente idéntica) a las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 52 y las SEQ ID N.° 54 a SEQ ID N.° 772, péptido o variante que tiene una longitud total de entre 8 y 100, preferentemente de entre 8 y 30, y más preferentemente de entre 8 y 14 aminoácidos.

La presente invención se refiere, además, al péptido acorde con la presente invención que tiene la capacidad de unirse a una molécula del complejo mayor de histocompatibilidad humana (MHC) de clase I.

La presente invención se refiere, además, al péptido acorde con la presente invención en que el péptido consiste en una secuencia de aminoácidos conforme a las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 53.

La presente invención se refiere, además, al péptido conforme a la presente invención, en que dichos péptidos están modificados (químicamente) y/o incluyen enlaces no peptídicos.

La presente invención se refiere, además, al péptido conforme a la presente invención, en que dicho péptido es parte de una proteína de fusión, en particular comprende aminoácidos N-terminales de la cadena invariable asociada al antígeno HLA-DR (Ii), o en que el péptido está fusionado con (o en la secuencia de) un anticuerpo, como por ejemplo, un anticuerpo que es específico de células dendríticas.

La presente invención se refiere, además, a un ácido nucleico, que codifica el péptido acorde con la presente invención, siempre que el péptido no sea la proteína humana completa (entera).

La presente invención se refiere, además, al ácido nucleico acorde con la presente invención que es ADN, ADNc, APN, ARN o combinaciones de los anteriores.

La presente invención se refiere, además, a un vector de expresión capaz de expresar un ácido nucleico conforme a la presente invención.

La presente invención se refiere, además, al péptido acorde con la presente invención, el ácido nucleico acorde con la presente invención o el vector de expresión acorde con la presente invención para el uso en medicina, en concreto para el tratamiento del cáncer de ovario.

La presente invención se refiere, además, a una célula hospedadora que comprende el ácido nucleico acorde con la presente invención o un vector de expresión acorde con la invención.

La presente invención se refiere, además, a una célula hospedadora acorde con la presente invención que es una célula presentadora de antígeno, y preferiblemente una célula dendrítica.

La presente invención se refiere, además, a un método para producir un péptido acorde con la presente invención, que comprende el cultivo de la célula hospedadora acorde con la presente invención y el aislamiento del péptido de la célula hospedadora o de su medio de cultivo.

La presente invención se refiere, además, al método acorde con la presente invención en que el antígeno es cargado en moléculas de MHC de clase I o II expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno mediante la puesta en contacto de una cantidad de antígeno suficiente con una célula presentadora de antígeno.

La presente invención se refiere, además, al método acorde con la invención, en que la célula presentadora de antígeno comprende un vector de expresión capaz de expresar dicho péptido que contiene la SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 53.

La presente invención se refiere, además, a linfocitos T activados, producidos con el método acorde con la presente invención, que reconocen selectivamente una célula que expresa un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos conforme a la presente invención.

En la presente memoria también se da a conocer un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende cualquiera de las secuencias de aminoácidos conformes a la presente invención, comprendiendo el método la administración al paciente de un número eficaz de linfocitos T conforme a la presente invención.

La presente invención concierne, además,al uso en medicina del péptido de la SEQ ID N.° 53 de la presente invención, del ácido nucleico conforme a la presente invención, del vector de expresión conforme a la presente invención, de la célula conforme a la presente invención, o del linfocito T citotóxico activado conforme a la presente invención. En ciertas formas de realización, el uso del péptido de la presente invención concierne al uso como medicamento o en el proceso de fabricación de un medicamento. La presente invención se refiere, además, al péptido de la presente invención para el uso conforme a la presente invención, en el que el medicamento es activo contra el cáncer.

La presente invención se refiere, además, al péptido de la SEQ ID N.° 53 para el uso conforme a la presente invención en el que dicho medicamento es una vacuna. La presente invención se refiere, además, a dicho péptido para el uso conforme a la invención en el que el medicamento es activo contra el cáncer.

La presente invención concierne, además, al péptido con la SEQ ID N.° 53 para un uso acorde con la invención, en que dichas células cancerosas son células de cáncer de ovario o células de otros tumores sólidos o hematológicos, tales como carcinoma hepatocelular, carcinoma colorrectal, glioblastoma, cáncer gástrico, cáncer de esófago, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de pulmón microcítico, cáncer de páncreas, carcinoma de células renales, cáncer de próstata, melanoma, cáncer de mama, leucemia linfocítica crónica, linfoma no hodgkiniano, leucemia mieloide aguda, cáncer de vesícula biliar y colangiocarcinoma, cáncer de vejiga urinaria, cáncer de útero, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, y mesotelioma.

La presente invención se refiere, además, a biomarcadores basados en los péptidos acordes con la presente invención, aquí denominados «dianas», que pueden ser utilizados para el diagnóstico del cáncer, preferiblemente del cáncer de ovario. Además, la presente invención se refiere a una diana de la SEQ ID N.° 53 acorde con la invención para el uso en el tratamiento del cáncer.

El término «anticuerpo» o «anticuerpos» se utiliza en la presente memoria en sentido amplio e incluye tanto anticuerpos policlonales como monoclonales. Además de las moléculas de inmunoglobulina intactas o «enteras», el término «anticuerpos» también incluye los fragmentos (p. ej., fragmentos CDRs, Fv, Fab y Fc) o polímeros de esas moléculas de inmunoglobulina y versiones humanizadas de las mismas, siempre que exhiban alguna de las propiedades deseadas (p. ej., unión específica de un polipéptido marcador del cáncer de ovario que exprese un gen marcador del cáncer con un nivel elevado, y/o que inhiba la actividad de un polipéptido marcador del cáncer de ovario conforme a la invención.

Si es posible los anticuerpos de la invención se podrán adquirir de fuentes comerciales. Los anticuerpos de la invención también se pueden fabricar con métodos consabidos. La persona versada en la técnica entiende que para fabricar los anticuerpos de la invención se pueden emplear tanto polipéptidos marcadores enteros de cáncer de ovario, como fragmentos de los mismos. El polipéptido necesario para generar un anticuerpo de la invención se puede purificar parcial o completamente de una fuente natural o se puede producir con técnicas de ADN recombinante.

Por ejemplo, un ADNc que codifique un péptido acorde con la presente invención, como un péptido acorde con las SEQ ID N.°53 o fragmento del mismo, se puede expresar en células procariotas (p. ej., bacterias) o eucariotas (p. ej., células de levadura, insecto o mamífero), a partir de las cuales se purificará la proteína recombinante con la que se generará una preparación de anticuerpo monoclonal o policlonal que se una específicamente al polipéptido marcador del cáncer de ovario utilizado para generar el anticuerpo conforme a la invención.

Una persona versada en la técnica sabrá que la generación de dos o más conjuntos diferentes de anticuerpos monoclonales o policlonales maximiza la probabilidad de obtener un anticuerpo dotado de la especificidad y la afinidad necesarias para el uso previsto (p. ej., ELISA, inmunohistoquímica, técnicas de imagen in vivo, tratamiento con inmunotoxinas). Los anticuerpos son analizados para buscar la actividad deseada con métodos conocidos, de acuerdo con el fin previsto para los anticuerpos (p. ej., ELISA, inmunohistoquímica, inmunoterapia, etc.; para más detalles sobre la generación y el análisis de anticuerpos, véase por ejemplo, Greenfield, 2014 (Greenfield, 2014). Por ejemplo, los anticuerpos pueden ser analizados con pruebas ELISA, inmunotransferencia (Western blot), tinción inmunohistoquímica de cortes de tejido tumoral congelados o fijados en formol. Después de la caracterización inicial in vitro, los anticuerpos destinados a uso terapéutico o diagnóstico in vivo se analizan con métodos de ensayo clínicos conocidos.

El término «anticuerpo monoclonal» tal y como se utiliza en la presente memoria se refiere a un anticuerpo obtenido a partir de una población notablemente homogénea de anticuerpos, es decir, los anticuerpos individuales que comprenden la población son idénticos excepto por mutaciones posiblemente naturales que pueden estar presentes en pequeño número. Los anticuerpos monoclonales de la presente memoria incluyen específicamente anticuerpos «quiméricos» en los que una parte de la cadena pesada y/o ligera es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de una especie concreta o pertenecientes a una clase o subclase concreta de anticuerpos, mientras que el resto de la cadena o cadenas es idéntica u homóloga a secuencias correspondientes en anticuerpos derivados de otras especies o pertenecientes a otra clase o subclase de anticuerpos, así como a fragmentos de tales anticuerpos, en tanto que exhiban la actividad antagonista deseada (N.° pat. de EE.UU.

4.816.567).

Los anticuerpos monoclonales de la invención se pueden preparar con métodos basados en hibridomas. En el método del hibridoma, un ratón u otro animal hospedador adecuado es vacunado con un agente inmunizante que estimula a los linfocitos para que produzcan o sean capaces de producir anticuerpos que se unan específicamente al agente inmunizante. Otra alternativa consiste en inmunizar los linfocitos in vitro.

Los anticuerpos monoclonales también se pueden fabricar con métodos de ADN recombinante, como los descritos en la Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567. El ADN que codifica los anticuerpos monoclonales de la invención puede ser fácilmente aislado y secuenciado con procedimientos convencionales (p. ej., con sondas oligonucleotídicas capaces de unirse específicamente a los genes que codifican las cadenas pesadas y ligeras de anticuerpos de ratón).

Los métodos in vitro también son adecuados para la preparación de anticuerpos monovalentes. La digestión de anticuerpos para producir fragmentos de los mismos, en particular fragmentos Fab, se puede llevar a cabo con técnicas ordinarias conocidas por los expertos en la materia. Por ejemplo, la digestión se puede realizar con papaína. Ejemplos de la digestión con papaína aparecen descritos en WO 94/29348 y en la Pat. de EE. UU. N.° 4.342.566. La digestión de anticuerpos con papaína normalmente produce dos fragmentos de unión a antígeno idénticos llamados fragmentos Fab, cada uno dotado de un sitio de unión al antígeno, así como un fragmento residual Fc. El tratamiento con pepsina da como resultado un fragmento F(ab')₂ y un fragmento pFc'.

Los fragmentos de anticuerpo, estén unidos a otras secuencias o no, también pueden incluir inserciones, deleciones, sustituciones y otras modificaciones seleccionadas de regiones particulares o de residuos de aminoácidos específicos, siempre que la actividad de los fragmentos no se vea significativamente alterada o afectada respecto al anticuerpo o el fragmento de anticuerpo intactos. Estas modificaciones pueden ofrecer alguna propiedad adicional, como eliminar o añadir aminoácidos capaces de establecer puentes de sulfuro para aumentar la biolongevidad, alterar las características de secreción, etc. En cualquier caso el fragmento de anticuerpo debe poseer una propiedad bioactiva, como actividad de unión, regulación de unión al dominio de unión, etc. Las regiones activas o funcionales del anticuerpo pueden ser identificadas por mutagenia de una región específica de la proteína, seguida por la expresión y el análisis del polipéptido expresado. Tales métodos son obvios para toda persona versada en la técnica y pueden incluir la mutagenia dirigida del ácido nucleico que codifica el fragmento de anticuerpo.

Los anticuerpos de la invención también pueden comprender anticuerpos humanizados o anticuerpos humanos. Las formas humanizadas de anticuerpos no humanos (p. ej., de ratón) son formas quiméricas de inmunoglobulinas, de cadenas de inmunoglobulina o de fragmentos de las mismas (como Fv, Fab, Fab' u otras secuencias de unión a antígeno de los anticuerpos) que contienen una pequeña secuencia derivada de inmunoglobulinas no humanas. Los anticuerpos humanizados incluyen inmunoglobulinas humanas (anticuerpo receptor) en las que los residuos de una región determinante de complementariedad (CDR) del receptor son sustituidos por residuos de una CDR de una especie no humana (anticuerpo donante) como ratón, rata o conejo que está dotada de la especificidad, la afinidad y la capacidad deseadas. En algunos casos, los residuos estructurales (FR) del fragmento Fv de la inmunoglobulina humana son sustituidos por residuos no humanos correspondientes. Los anticuerpos humanizados también pueden comprender residuos que no están presentes ni en el anticuerpo receptor ni en el CDR importado o en las secuencias estructurales. En general, el anticuerpo humanizado comprenderá prácticamente la totalidad de al menos uno, y normalmente de dos dominios variables, en los que todas o casi todas las regiones CDR corresponderán a las de la inmunoglobulina no humana y todas o casi todas las regiones FR serán las de una secuencia consenso de la inmunoglobulina humana. El anticuerpo humanizado idealmente también comprenderá al menos una porción de una región constante de la inmunoglobulina (Fc), normalmente de una inmunoglobulina humana.

Los métodos para humanizar anticuerpos no humanos son bien conocidos en la técnica. En general, un anticuerpo humanizado tiene uno o varios residuos de aminoácidos de origen no humano. Estos residuos de aminoácidos no humanos con frecuencia son denominados residuos «importados», que normalmente se extraen del dominio variable «importado». La humanización se puede llevar a cabo básicamente sustituyendo las CDR o las secuencias de CDR de roedor por las secuencias correspondientes de un anticuerpo humano. Por tanto, tales anticuerpos «humanizados» son anticuerpos quiméricos (Pat. de EE.UU. N.° 4.816.567), en los que una parte notablemente más pequeña que un dominio variable humano intacto ha sido sustituida por la secuencia correspondiente de una especie no humana. En la práctica, los anticuerpos humanizados normalmente son anticuerpos humanos en los que se han sustituido algunos residuos de CDR y posiblemente algunos residuos de FR por residuos de sitios análogos de anticuerpos de roedor.

Se pueden emplear animales transgénicos (p. ej., ratones) que tras la inmunización sean capaces de producir un repertorio completo de anticuerpos humanos sin producir inmunoglobulinas endógenas. Por ejemplo, se ha descrito que la deleción homocigota del gen de la región de unión de la cadena pesada del anticuerpo en ratones quiméricos y mutantes germinales provoca la inhibición completa de la producción endógena de anticuerpos. La transferencia de la matriz génica de la inmunoglobulina de la línea germinal humana a dichos ratones mutantes de la línea germinal dará como resultado la producción de anticuerpos humanos tras la exposición al antígeno. También se pueden producir anticuerpos humanos en fagotecas.

Los anticuerpos de la invención se administran preferiblemente a un sujeto incorporándolos en un vehículo farmacéuticamente aceptable. Normalmente a la formulación se le añade una cantidad apropiada de una sal farmacéuticamente aceptable para que sea isotónica. Ejemplos de vehículos farmacéuticamente aceptables son solución salina, solución de Ringer y solución de dextrosa. Es preferible que el pH de la solución está situado aproximadamente entre 5 y 8, y más preferiblemente entre 7 y 7,5 aproximadamente. Otros vehículos incluyen preparaciones de liberación prolongada como matrices semipermeables de polímeros hidrofóbicos sólidos que contengan el anticuerpo, en matrices con forma modelada, p. ej., películas, liposomas o micropartículas. Para las personas versadas en la técnica será evidente que son preferibles ciertos vehículos dependiendo, por ejemplo, de la vía de administración y de la concentración del anticuerpo que se va a administrar.

Los anticuerpos se pueden administrar al sujeto, al paciente o a las células mediante inyección (intravenosa, intraperitoneal, subcutánea, intramuscular, etc.), o con otros métodos como la infusión que aseguren su liberación efectiva en el torrente sanguíneo. Los anticuerpos también se pueden administrar por vía intratumoral o peritumoral para ejercer un efecto terapéutico a la par sistémico y local. Se prefiere la inyección local o intravenosa.

Las dosis y pautas de administración más adecuadas se pueden determinar empíricamente; la toma de decisiones a este respecto forma parte de los conocimientos de la materia. Las personas versadas en la materia saben que la dosis de anticuerpos a administrar depende, por ejemplo, del sujeto que va a recibir al anticuerpo, la vía de administración, el tipo concreto de anticuerpo y de otros medicamentos que se le estén administrando. La dosis diaria típica de anticuerpo cuando se utiliza solo puede oscilar entre 1 μg/kg y 100 mg/kg de peso corporal o más por día, dependiendo de los susodichos factores. Tras la administración del anticuerpo, preferiblemente para tratar el cáncer de ovario, la eficacia del anticuerpo terapéutico se puede evaluar de varios modos bien conocidos por el médico especialista. Por ejemplo se puede controlar el tamaño, el número y/o la distribución del cáncer en el sujeto receptor del tratamiento utilizando técnicas de imagen oncológicas estándar. Todo anticuerpo administrado con fines terapéuticos que detenga el crecimiento del tumor, reduzca su extensión y/o impida la aparición de nuevos tumores en contraste con la evolución de la enfermedad si no se produjera la administración del anticuerpo, es un anticuerpo eficaz para el tratamiento del cáncer.

Otro aspecto de la invención proporciona un método para producir un receptor de linfocito T soluble (sTCR) que reconoce un complejo de péptido-MHC específico. Dichos receptores de linfocitos T solubles se pueden generar a partir de clones de linfocitos T específicos, cuya afinidad se puede incrementar por mutagenia dirigida a las regiones determinantes de complementariedad. Para la selección del receptor de linfocito T se puede utilizar una fagoteca (US 2010/0113300, (Liddy et al., 2012)). A fin de estabilizar los receptores de linfocito T en la fagoteca y en caso de uso práctico como fármaco, las cadenas alfa y beta se pueden enlazar por ejemplo mediante enlaces disulfuro no nativos, otros enlaces covalentes (receptor de linfocito T monocatenario), o mediante dominios de dimerización (Boulter et al., 2003; Card et al., 2004; Willcox et al., 1999). El receptor de linfocito T se puede enlazar con toxinas, fármacos, citocinas (véase, por ejemplo, US 2013/0115191), y con dominios que recluten células efectoras como un dominio anti-CD3, etc., con el fin de ejecutar funciones particulares en células diana. Asimismo, se puede expresar en linfocitos T destinados a la transferencia a un receptor. Se puede encontrar más información en WO 2004/033685A1 y WO 2004/074322A1.En WO 2012/056407A1 se describe una combinación de sTCR. Otros métodos de producción se revelan en WO 2013/057586A1.

Además, los péptidos y/o los TCR o anticuerpos u otras moléculas de unión de la presente invención se pueden utilizar para verificar el diagnóstico histopatológico de cáncer basado en una muestra de biopsia.

Los anticuerpos o TCR también se pueden utilizar para ensayos diagnósticos in vivo. En general, el anticuerpo se marca con un radionúclido (como 111In, 99Tc, 14C, 131I, 3H, 32P o 35S) de modo que el tumor puede ser localizado con inmunogammagrafía. En una forma de realización, anticuerpos o fragmentos de los mismos se unen a los dominios extracelulares de dos o más dianas de una proteína seleccionada del grupo consistente en las susodichas proteínas, y el valor de afinidad (Kd) es inferior a 1 x 10 μM.

Los anticuerpos para uso diagnóstico pueden ser marcados con sondas adecuadas para posibilitar la detección con diferentes métodos ópticos. Los métodos para la detección de sondas incluyen, entre otros, microscopía de fluorescencia, óptica, confocal y electrónica; resonancia magnética y espectroscopía; radioscopia, tomografía computadorizada y tomografía por emisión de positrones. Las sondas adecuadas incluyen, entre otras, fluoresceína, rodamina, eosina y otros fluoróforos, radioisótopos, oro, gadolinio y otros lantánidos, hierro paramagnético, flúor-18 y otros radionúclidos emisores de positrones. Además, las sondas pueden ser bi o multifuncionales y ser detectables por más de uno de los métodos enumerados. Los anticuerpos pueden marcarse directa o indirectamente con dichas sondas. La fijación de sondas a los anticuerpos incluye la unión covalente de la sonda, la incorporación de la sonda en el anticuerpo, y la unión covalente de un compuesto quelante para unir la sonda, entre otros métodos consabidos en la técnica. Para las técnicas de inmunohistoquímica, la muestra de tejido patológico puede ser fresca o congelada o puede estar incluida en parafina y fijada con un conservante como formol. El corte fijado o incluido que contiene la muestra se pone en contacto con un anticuerpo primario marcado y un anticuerpo secundario, de modo que el anticuerpo se emplea para detectar la expresión in situ de las proteínas.

Otro aspecto de la presente invención incluye un método in vitro para producir linfocitos T activados, comprendiendo dicho método la puesta en contacto en condiciones in vitro de linfocitos T con moléculas MHC humanas cargadas con antígeno expresadas en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada por tiempo suficiente para activar los linfocitos T de una manera específica de antígeno, siendo el antígeno el péptido conforme a la invención. Preferentemente se emplea una cantidad suficiente del antígeno con una célula presentadora de antígeno.

Preferiblemente, la célula de mamífero carece del transportador de péptidos TAP o bien este se presenta en un nivel reducido o funciona defectuosamente. Las células adecuadas que carecen del transportador de péptidos TAP incluyen las células T2, RMA-S y de Drosophila. TAP es el transportador relacionado con el procesamiento de los antígenos.

La estirpe celular humana deficiente en carga de péptidos T2 está disponible en la American Type Culture Collection, 12301 Parklawn Drive, Rockville, Maryland 20852, Ee .UU. con el N.° de catálogo CRL 1992; la estirpe de células de Drosophila Schneider line 2 está disponible en la ATCC con el N.° de catálogo CRL 19863; la estirpe de células de ratón RMA-S está descrita en Ljunggren y cols. (Ljunggren and Karre, 1985).

Preferentemente, la célula hospedadora no expresa sustancialmente moléculas MHC de clase I antes de la transfección. También es preferible que la célula estimuladora exprese una molécula importante que proporcione una señal coestimuladora para los linfocitos T, como B7.1, B7.2, ICAM-1 y LFA 3.Las secuencias de ácidos nucleicos de numerosas moléculas MHC de clase I y de las moléculas co-estimuladoras están disponibles públicamente en las bases de datos GenBank y EMBL.

Si se utiliza como antígeno un epítopo de MHC de clase I, los linfocitos T serán linfocitos T CD8-positivos.

Si una célula presentadora de antígeno es transfectada para expresar un epítopo de ese tipo, la célula comprenderá preferentemente un vector de expresión capaz de expresar un péptido que contenga las SEQ ID N.° 1 a SEQ ID N.° 772, o una secuencia de aminoácidos variante de las mismas.

Existen otros métodos para generar linfocitos T in vitro. Por ejemplo, emplear linfocitos autólogos infiltrados en el tumor para generar los CTL. Plebanski et al. (Plebanski et al., 1995) utilizan linfocitos de sangre periférica autóloga (PLB) para la preparación de los linfocitos T.

Asimismo, es posible la producción de linfocitos T autólogos estimulando células dendríticas con el péptido o el polipéptido, o a través de la infección con virus recombinantes. También se pueden usar linfocitos B para la producción de linfocitos T autólogos. Asimismo, para la preparación de linfocitos T autólogos se pueden usar macrófagos estimulados con péptido o polipéptido o infectados con virus recombinantes. S. Walter y cols. (Walter et al., 2003) describen la estimulación in vitro de linfocitos T con células presentadoras de antígeno (aAPC), que también es una forma adecuada de generar linfocitos T contra el péptido de elección. En la presente invención, las aAPC se generaron adhiriendo complejos MHC:péptido preformados a la superficie de partículas de poliestireno (microperlas) con biotina:estreptavidina. Este sistema permite controlar con exactitud la densidad de MHC en las aAPC, lo que permite desencadenar respuestas de linfocitos T específicas de antígeno con una avidez alta o baja a partir de muestras de sangre, de una forma selectiva y altamente eficaz. Además de los complejos MHC:péptido, las aAPC deben incorporar acopladas en su superficie otras proteínas con actividad co-estimuladora como anticuerpos anti-CD28. Tales sistemas de aAPC también precisan a menudo el concurso de factores solubles adecuados, por ejemplo citocinas, como la interleucina-12.

Para la preparación de linfocitos T también se pueden utilizar células alogénicas; en WO 97/26328 se describe detalladamente un método. Por ejemplo, además de células de Drosophila y de células T2, para presentar antígenos se pueden usar otras células tales como células CHO, células de insecto infectadas con baculovirus, bacterias, levaduras y células diana infectadas con virus vacunal. Asimismo se pueden usar virus vegetales (véase, por ejemplo, Porta y cols. (Porta et al., 1994) que describen el desarrollo del virus del mosaico del chícharo como una sistema de alto rendimiento para la presentación de péptidos foráneos.

Los linfocitos T activados que están dirigidos contra el péptido de la invención son útiles como tratamiento. Así pues, otro aspecto de la invención proporciona linfocitos T activados obtenibles por los susodichos métodos de la invención.

Los linfocitos T activados producidos con el susodicho método reconocerán selectivamente una célula que expresa de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos de la SEQ ID N.° 1 a la SEQ ID N.° 772.

Preferiblemente el linfocito T reconoce la célula interaccionando a través de su TCR con el complejo HLNpéptido, por ejemplo uniéndosele. Los linfocitos T son útiles en un método para destruir células diana en un paciente cuyas células diana expresen de forma aberrante un polipéptido que comprenda una secuencia de aminoácidos de la invención y al cual se le administre un número eficaz de linfocitos T activados. Los linfocitos T que se le administren pueden proceder del mismo paciente y ser activados del modo antes descrito, es decir, ser linfocitos T autólogos. Otra alternativa consiste en que los linfocitos T no sean del paciente y procedan de otro individuo. Por supuesto, es preferible que dicho individuo esté sano. Por «individuo sano» los inventores entienden un individuo que goce de buen estado de salud general, preferentemente con un sistema inmunitario competente y, más preferentemente, no sufra ninguna enfermedad que pueda detectarse mediante análisis.

En condiciones in vivo, las células diana de los linfocitos T CD8-positivos conformes a la presente invención pueden ser células del tumor (que a veces expresan MHC de clase II) y/o células estromales circundantes al tumor (células tumorales) (que en ocasiones también expresan MHC de clase II; (Dengjel et al., 2006)).

Los linfocitos T de la presente invención se pueden usar como principios activos de una composición terapéutica. Además se da a conocer un método para destruir células diana de un paciente que expresan de forma aberrante un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos como las dadas a conocer en la presente memoria, comprendiendo dicho método la administración al paciente de un número eficaz de linfocitos T como los definidos arriba.

Por «expresado de forma aberrante» los inventores también quieren decir que el polipéptido está sobreexpresado en comparación con los niveles de expresión en los tejidos normales o que el gen está reprimido en el tejido del cual deriva el tumor pero sí se expresa en el tumor. Por «sobreexpresado» los inventores quieren decir que el nivel del polipéptido es como mínimo 1,2 veces mayor que el nivel en el tejido normal; preferiblemente como mínimo 2 veces mayor, y más preferiblemente como mínimo 5 o 10 veces mayor que el del tejido normal.

Los linfocitos T se pueden obtener por métodos conocidos en la materia, como, por ejemplo, los antes descritos.

Los protocolos para la llamada transferencia de linfocitos T a un receptor son perfectamente conocidos. Se pueden encontrar revisiones en: Gattioni y cols. y Morgan y cols. (Gattinoni et al., 2006; Morgan et al., 2006).

Otro aspecto de la presente invención incluye el uso de los péptidos formando un complejo con MHC para generar un receptor de linfocito T cuyo ácido nucleico se clona y se introduce en una célula hospedadora, preferiblemente un linfocito T. Ese linfocito T modificado se puede entonces transferir a un paciente como tratamiento contra el cáncer.

Cualquier molécula de la invención, ya sea péptido, ácido nucleico, anticuerpo, vector de expresión, célula, linfocito T activado, receptor de linfocito T o el ácido nucleico que lo codifique es útil para el tratamiento de trastornos caracterizados por células que eluden la respuesta inmunitaria. Por consiguiente, cualquier molécula de la presente invención puede ser utilizada como medicamento o en la fabricación de un medicamento. La molécula puede ser utilizada sola o combinada con otra molécula o moléculas de la invención o con cualquier o cualesquier moléculas conocidas.

La presente invención también contempla un equipo que comprende:

(a) un envase con una composición farmacéutica como la descrita más arriba, en forma de solución o liofilizada; (b) opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o solución de reconstitución para la formulación liofilizada; y

(c) opcionalmente, (I) instrucciones de uso de la solución o (II) de la reconstitución y/o uso de la formulación liofilizada.

El equipo puede comprender, además, uno o más de los siguientes componentes: (III) un tampón, (IV) un diluyente, (V) un filtro, (VI) una aguja, o (V) una jeringa. El envase es preferiblemente un frasco, un vial, una jeringa o un tubo de ensayo; puede ser un envase multiusos. Se prefiere que la composición farmacéutica esté liofilizada.

Los equipos de la presente invención comprenden, preferiblemente, una formulación liofilizada de la presente invención en un envase adecuado e instrucciones para su reconstitución y/o uso. Los envases adecuados incluyen, por ejemplo, frascos, viales (p. ej., viales con doble cámara), jeringas (como jeringas con doble cámara) y tubos de ensayo. El envase puede estar formado por materiales diversos como vidrio o plástico. Preferiblemente el kit y/o envase contienen o van acompañados de instrucciones de reconstitución y/o uso. Por ejemplo, el prospecto puede indicar que la formulación liofilizada debe reconstituirse para obtener ciertas concentraciones de péptidos como las descritas en páginas precedentes. La etiqueta puede indicar, además, que la formulación puede administrarse o está destinada a la administración subcutánea.

El envase que contiene la formulación puede ser un vial multiuso que permita varias administraciones (p. ej., de 2 a 6 administraciones) de la formulación reconstituida. El equipo puede comprender, además, un segundo envase que contenga un diluyente adecuado (p. ej., una solución de bicarbonato sódico).

Después de mezclar el diluyente y la formulación liofilizada, la concentración final del péptido en la formulación reconstituida es preferiblemente como mínimo de 0,15 mg/ml/péptido (=75 |jg) y preferiblemente como máximo de 3 mg/ml/péptido (=1500 jg). El equipo puede incluir además otros materiales deseables desde el punto de vista comercial y del usuario, tales como otros tampones, diluyentes, filtros, agujas, jeringas y prospectos con instrucciones de uso.

Los equipos de la presente invención pueden tener un solo envase que contenga la formulación de las composiciones farmacéuticas acordes con la presente invención, acompañado o no de otros componentes (p. ej., otros compuestos o composiciones farmacéuticas de estos otros compuestos) o pueden contar con un envase distinto para cada componente.

Preferiblemente, los equipos de la invención incluyen una formulación de la invención acondicionada para ser utilizada y administrada conjuntamente con un segundo compuesto (como adyuvantes (p. ej., GM-CSF), un agente de quimioterapia, un producto natural, una hormona o un antagonista, un inhibidor o agente anti-angiogenia, un inductor de la apoptosis o un quelante) o una composición farmacéutica de los mismos. Los componentes del equipo pueden estar preagrupados o cada componente puede estar en un envase separado antes de la administración al paciente. Los componentes del equipo pueden proporcionarse en una o varias soluciones líquidas, preferiblemente en una solución acuosa y, con mayor preferencia, en una solución acuosa estéril. Los componentes del equipo también pueden facilitarse en forma de sólidos, y pueden convertirse en líquidos añadiendo los disolventes adecuados, que preferiblemente se proporcionan en otro envase distinto.

El envase de un equipo terapéutico puede ser un vial, tubo de ensayo, matraz, frasco, jeringa, o cualquier otro medio para contener un sólido o líquido. Si hay más de un componente, normalmente el equipo contendrá un segundo vial u otro envase para permitir la dosificación por separado. El equipo también puede contener otro envase para un líquido farmacéuticamente aceptable. Preferiblemente el equipo terapéutico contendrá un aparato (p. ej., una o varias agujas, jeringas, cuentagotas, pipeta, etc.) para permitir la administración de los agentes de la invención que son componentes del presente equipo.

La presente formulación puede ser toda aquella que sea adecuada para la administración de los péptidos a través de cualquier vía aceptable como la oral (enteral), nasal, oftálmica, subcutánea, intradérmica, intramuscular, intravenosa o transdérmica. Se prefiere la administración subcutánea y, con mayor preferencia, la intradérmica tal vez a través de una bomba de infusión.

Puesto que los péptidos de la invención se aislaron del cáncer de ovario, el medicamento de la invención se usa preferentemente para tratar ese tipo de cáncer.

La presente invención se refiere, además, a un método para producir una producto farmacéutico personalizado para un paciente concreto, que comprende la fabricación de una composición farmacéutica que consta como mínimo de un péptido escogido de un archivo (base de datos) de TUMAP preseleccionados, en la que por lo menos un péptido de la composición farmacéutica es seleccionado por su idoneidad para ese paciente. En una forma de realización, la composición farmacéutica es una vacuna. El método también se puede adaptar para producir clones de linfocitos T para aplicaciones destinadas a la obtención del producto acabado, como son el aislamiento de TCR, o de anticuerpos solubles y otras opciones de tratamiento.

Un «producto farmacéutico personalizado» significa concretamente terapias personalizadas para un paciente que solo serán utilizadas para tratarlo a él, tales como vacunas contra el cáncer personalizadas y terapias celulares adoptivas con tejido autólogo del paciente.

Tal y como se utiliza en la presente memoria, el término «archivo» (warehouse) designa un grupo de péptidos que han sido preseleccionados por su inmunogenicidad y/o sobrepresentación en un tipo concreto de tumor. El término «archivo» no implica que los péptidos concretos incluidos en la vacuna hayan sido prefabricados y almacenados en un lugar físico, aunque contempla esa posibilidad. Se contempla expresamente que los péptidos puedan ser fabricados de novo para cada vacuna individualizada producida, o que puedan ser prefabricados y guardados. El archivo (p. ej., en forma de una base de datos) está compuesto por péptidos asociados a tumor que se sobreexpresan fuertemente en el tejido tumoral de pacientes con cáncer de ovario que presentan varios alelos HLA-A, HLA-B y HLA-C. Puede contener péptidos de MHC de clase I y de clase II o péptidos alargados de MHC de clase I. Además de los péptidos asociados a tumor obtenidos de varias muestras de tejido de cáncer de ovario, el archivo puede contener péptidos marcadores HLA-A*02, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-A*24, HLA-B*07, HLA-B*08 y HLA-B*44. Estos péptidos permiten comparar cuantitativamente la magnitud de la inmunidad dependiente de los linfocitos T inducida por los TUMAP y, por consiguiente, extraer importantes conclusiones sobre la capacidad de la vacuna para desencadenar respuestas antitumorales. En segundo lugar, actúan como importantes péptidos de control positivo procedentes de un antígeno exógeno en el supuesto de que no se observe ninguna respuesta de linfocitos T inducida por la vacuna contra los TUMAP derivados de autoantígenos del paciente. Y tercero, a veces permite extraer conclusiones en cuanto al estado de inmunocompetencia del paciente.

Los TUMAP del archivo se identifican por medio de una estrategia que combina la genómica funcional integrada con el análisis de la expresión génica, la espectrometría de masas y la inmunología de linfocitos T (XPresident®). La estrategia asegura que solo los TUMAP realmente presentes en un alto porcentaje de tumores sean escogidos para proseguir el análisis, descartando los que no se expresan o lo hacen muy poco en el tejido normal. Para la selección inicial de los péptidos, se analizaron de forma escalonada muestras procedentes de pacientes con cáncer de ovario, así como sangre de donantes sanos.

1. Se identificaron ligandos HLA del material maligno con espectrometría de masas

2. Con un análisis hologenómico de la expresión del ácido ribonucleico mensajero (ARNm) se identificaron genes sobreexpresados en el tejido maligno (cáncer de ovario) con respecto a una gama de órganos y tejidos normales.

3. Los ligandos HLA identificados se compararon con los datos de expresión génica. Los péptidos presentados por el tejido tumoral, preferiblemente los codificados por genes sobreexpresados o expresados selectivamente como los detectados en el segundo paso se consideraron TUMAP candidatos para la vacuna multipeptídica.

4. Se llevó a cabo una búsqueda bibliográfica para hallar datos adicionales que avalaran la relevancia de los péptidos identificados como TUMAP.

5. La relevancia de la sobreexpresión al nivel del ARNm se confirmó volviendo a detectar en el tejido tumoral los TUMAP seleccionados en el paso 3 y comprobando que no se detectaban (o lo eran muy poco) en los tejidos sanos

6. Para evaluar si era factible que los péptidos seleccionados indujeran respuestas de linfocitos T in vivo, se llevaron a cabo pruebas de inmunogenicidad in vitro con linfocitos T humanos procedentes de donantes sanos y de pacientes con cáncer de ovario.

En otro aspecto, los péptidos son preseleccionados por su inmunogenicidad antes de ser incluidos en el archivo. A modo de ejemplo y sin ánimo de limitación, la inmunogenicidad de los péptidos incluidos en el archivo se determina con un método que comprende la estimulación reiterada in vitro de linfocitos T CD8+ de donantes sanos con células presentadoras de antígeno artificiales cargadas con los complejos de péptido/MHC y anticuerpo anti-CD28.

Este método es preferido para cánceres raros y pacientes con un perfil de expresión inusual. En contraste con los cócteles multipeptídicos de composición fija que se están desarrollando el archivo permite una concordancia significativamente mayor de la expresión real de antígenos en el tumor con la vacuna. Se puede usar un péptido o combinaciones de varios péptidos «off-the-shelf» para cada paciente como parte de una estrategia multidiana. En teoría una estrategia basada en la selección de, pongamos, 5 péptidos antigénicos distintos de una librería de 50 generaría unos 17 millones de composiciones farmacéuticas posibles.

En un aspecto, los péptidos son seleccionados para la inclusión en la vacuna en función de su idoneidad para cada paciente según un método acorde con la presente invención, tal y como se expone en la presente memoria y a continuación.

Se recopilan los datos del fenotipo del HLA, transcriptómicos y peptidómicos del material tumoral y de muestras de sangre del paciente para identificar los péptidos más adecuados que contengan TUMAP contenidos en el «archivo» y exclusivos del paciente (es decir, mutados). Se escogerán los péptidos que se expresen de forma selectiva o que se sobreexpresen en el tumor del paciente y, si es posible, que presenten una potente inmunogenicidad in vitro si se prueban con los PBMC del paciente.

Preferentemente, los péptidos incluidos en la vacuna se identificarán con el método consistente en: (a) identificación de los péptidos asociados a tumor (TUMAP) presentes en una muestra tumoral del paciente en cuestión; (b) comparación de los péptidos identificados con (a) un archivo (base de datos) de péptidos como el descrito antes; y (c) selección de al menos un péptido de la base de datos que presente correlación con un péptido asociado a tumor identificado en el paciente. Por ejemplo, los TUMAP presentados por la muestra del tumor se identifican mediante: (a1) comparación de los datos de expresión de la muestra tumoral con los datos de expresión de una muestra de tejido normal del mismo tipo de tejido de la muestra tumoral para identificar proteínas que se sobreexpresen o se expresen de modo aberrante en la muestra tumoral; y (a2) correlación de los datos de expresión con secuencias de ligandos MHC unidos a moléculas MHC de clase I y/o clase II en la muestra tumoral para identificar ligandos MHC derivados de proteínas que son sobreexpresadas o expresadas de modo aberrante por el tumor. Preferentemente, las secuencias de los ligandos MHC se identifican eluyendo los péptidos unidos de las moléculas MHC aisladas de la muestra tumoral y secuenciando los ligandos eluidos. Preferentemente, la muestra tumoral y el tejido normal se obtienen del mismo paciente.

Además de, o como alternativa a, la selección de péptidos con el modelo del archivo (base de datos), los TUMAP también se pueden identificar en el paciente de novo e incluirse después en la vacuna. A modo de ejemplo, los TUMAP candidatos se pueden identificar en el paciente mediante (a) comparación de los datos de expresión de la muestra tumoral con los datos de expresión de una muestra de tejido normal que corresponde al tipo de tejido de la muestra del tumor para identificar proteínas que se sobreexpresan o se expresan de modo aberrante en la muestra tumoral; y (a2) correlación de los datos de expresión con secuencias de ligandos MHC unidos a moléculas MHC de clase I y/o clase II en la muestra tumoral para identificar ligandos MHC derivados de proteínas que son sobreexpresadas o expresadas de modo aberrante por el tumor. Como otro ejemplo, se pueden identificar proteínas portadoras de mutaciones que sean exclusivas de la muestra tumoral en comparación con el correspondiente tejido normal del paciente, así como encontrar TUMAP que permitan reconocer específicamente la mutación. Por ejemplo, el genoma del tumor y el del tejido normal correspondiente se pueden secuenciar mediante secuenciación hologenómica: Para descubrir mutaciones que no sean sinónimas en las regiones codificadoras de las proteínas de los genes, se extraen el ADN y el ARN genómicos de tejidos tumorales y el ADN genómico germinal normal y no mutado de células mononucleares de sangre periférica (PBMC). La estrategia de secuenciación de nueva generación (NGS) aplicada queda limitada a la re-secuenciación de las regiones codificantes de proteínas (re-secuenciación del exoma). Con este objeto, se captura el ADN exónico de muestras humanas con equipos de enriquecimiento dirigido suministrados por el proveedor y se procede a la secuenciación con p. ej., un secuenciador HiSeq2000 (Illumina). Además, se secuencia el ARNm del tumor para determinar la cuantificación directa de la expresión génica y la validación de que los genes mutados se expresan en los tumores del paciente. Los millones de lecturas de secuencia resultantes se procesan con algoritmos informáticos. La lista de resultados contiene mutaciones y la expresión génica. Las mutaciones somáticas específicas del tumor se determinan comparándolas con las variaciones germinales derivadas de las PBMC y se priorizan. Los péptidos identificados de novo pueden ser analizados para determinar su inmunogenicidad según lo descrito antes con el archivo, y los TUMAP candidatos que posean la inmunogenicidad adecuada se escogen para la inclusión en la vacuna.

En una forma de realización indicada a título de ejemplo, los péptidos incluidos en la vacuna se identifican mediante: (a) identificación de los péptidos asociados a tumor (TUMAP) presentes en una muestra tumoral del paciente en cuestión mediante el método antes descrito; (b) comparación de los péptidos identificados en a) el archivo (base de datos) de péptidos que han sido preseleccionados por su inmunogenicidad y su sobrepresentación en tumores respecto al correspondiente tejido normal; (c) selección de al menos un péptido de la base de datos que presente correlación con un péptido asociado a tumor identificado en el paciente; y (d) opcionalmente, selección de al menos un péptido identificado de novo en el paso (a) para confirmar su inmunogenicidad.

En una forma de realización indicada a título de ejemplo, los péptidos incluidos en la vacuna se identifican mediante: (a) identificación de los péptidos asociados a tumor (TUMAP) presentes en una muestra tumoral del paciente en cuestión; y (b) opcionalmente, selección de al menos un péptido identificado de novo en el paso (a) para confirmar su inmunogenicidad.

Una vez escogidos los péptidos para la vacuna basada en péptidos personalizados, se fabrica la vacuna. La vacuna preferiblemente es una formulación líquida consistente en los péptidos individuales disueltos en DMSO entre el 20% y el 40%, preferiblemente DMSO entre el 30% y el 35%, como aproximadamente DMSO al 33%.

Cada péptido se disuelve en DMSO antes de formar parte del producto. La concentración de cada solución de péptido se escoge dependiendo del número de péptidos que formarán parte del producto. Cada solución de péptido y DMSO se mezcla en partes iguales para obtener una solución que contenga todos los péptidos del producto con una concentración de ~2,5 mg/ml por péptido. La solución mezclada se diluye a 1:3 con agua para inyectables hasta alcanzar una concentración de 0,826 mg/ml por péptido en DMSO al 33%. La solución diluida se filtra con un filtro estéril de 0,22 μm. Se obtiene la solución final a granel.

La solución final a granel se envasa en viales y se conserva a -20°C hasta su uso. Un vial contiene 700 μl de solución que contiene 0,578 mg de cada péptido. De los cuales 500 j l (aprox. 400 |jg por péptido) se aplicarán con la inyección intradérmica.

Además de ser útiles para el tratamiento del cáncer, el péptido de la presente invención también es útil para el diagnóstico. Dado que los péptidos son generados a partir de células de cáncer de ovario y se ha determinado que tales péptidos no están presentes o lo están en niveles bajos en los tejidos normales, pueden ser utilizados para diagnosticar la presencia de un cáncer.

La presencia de los péptidos reivindicados en las biopsias de tejido puede ayudar al histopatólogo a diagnosticar un cáncer. La detección de ciertos péptidos por medio de anticuerpos, espectrometría de masas u otros métodos conocidos en la técnica puede advertir al histopatólogo de que la muestra es maligna o está inflamada o enferma en general, o puede ser utilizada como un biomarcador del cáncer de ovario. La presencia de grupos de péptidos puede permitir la clasificación o subclasificación de los tejidos enfermos.

La detección de los péptidos en una muestra de tejido enfermo puede ayudar a decidir si los tratamientos que implican al sistema inmunitario pueden ser beneficiosos, sobretodo si se sabe o se prevé que los linfocitos T estén implicados en el mecanismo de acción. La pérdida de expresión de MHC es un mecanismo conocido con el que las células infectadas o cancerosas logran eludir la vigilancia del sistema inmunitario. Así pues, la presencia de los péptidos indica que dicho mecanismo no es utilizado por las células analizadas.

El péptido de la presente invención puede ser utilizado para analizar las respuestas de los linfocitos contra él, como son las respuestas de los linfocitos T o las respuestas de anticuerpos contra el péptido o el péptido unido a moléculas de MHC. Estas respuestas de los linfocitos pueden ser utilizadas como marcadores pronósticos para decidir los pasos posteriores del tratamiento. Dichas respuestas también pueden ser utilizadas como marcadores indirectos en las estrategias de inmunoterapia destinadas a estimular respuestas linfocitarias a través de diferentes medios, como, por ejemplo, la vacunación con proteínas, ácidos nucleicos, materiales autólogos, o la transferencia de linfocitos de donantes. En el ámbito de la terapia génica, las respuestas de los linfocitos contra los péptidos pueden tenerse en cuenta para la evaluación de efectos secundarios. El control regular de las respuestas de los linfocitos también puede ser una herramienta valiosa para el seguimiento en trasplantes, por ejemplo con el fin de detectar enfermedades del injerto contra el hospedador y del hospedador contra el injerto.

A continuación se describirá la presente invención con los ejemplos siguientes con alusión a las figuras adjuntas que describen las formas de realización preferidas de los mismos, sin que con ello se pretenda limitar la invención.

Figuras

Las Figuras 1A a 1S muestran, a título de ejemplo, perfiles de expresión de genes originarios de la presente invención que aparecen sobreexpresados en distintas muestras oncológicas. Las muestras tumorales (puntos negros) y normales (puntos grises) se agrupan según el órgano de origen; las gráficas de cajas y bigotes representan la mediana, los percentiles 25 y 75 (caja) así como los valores de RPKM mínimo y máximo (bigotes). Los órganos normales aparecen ordenados según las categorías de riesgo. RPKM = lecturas por kilobase por cada millón de lecturas cartografiadas. Muestras normales: vasos sang. (vasos sanguíneos), cerebro, corazón, hígado, pulmón, tej. adiposo (tejido adiposo), gl. supraren. (glándula suprarrenal), vía biliar, vejiga, médula ósea, cartílago, esófago, ojo, vesíc. biliar (vesícula biliar), cab. y cuello (cabeza y cuello), riñón, intest. gr. (intestino grueso), G. linfático (ganglio linfático), nervio, páncreas, gl. paratir. (glándula paratiroidea), hipófisis, músc. esq. (músculo esquelético), piel, intest. delg. (intestino delgado), bazo, estómago, tiroides, tráquea, vejiga, mama, ovario, placenta, próstata, testículo, timo y útero. Muestras tumorales: AML: leucemia mieloide aguda; BRCA: cáncer de mama; CLL: leucemia linfocítica crónica; CRC: cáncer colorrectal; GBC: cáncer de vesícula biliar; GBM: glioblastoma; GC: cáncer gástrico; HCC: carcinoma hepatocelular; HNSCC: carcinoma epidermoide de cabeza y cuello; MEL: melanoma; NHL: linfoma no hodgkiniano; NSCLC: cáncer de pulmón amicrocítico; OC: cáncer de ovario, OSC_GC: cáncer de esófago/gástrico; OSCAR: cáncer de esófago; PC: cáncer de páncreas; PCA: cáncer de próstata; RCC: carcinoma de células renales; SCLC: cáncer de pulmón microcítico; UBC: carcinoma de vejiga urinaria; UEC: cáncer de endometrio y uterino. Figura 1A) Símbolo del gen: CT45A2, Péptido: KYEKIFEML (SEQ ID N.°: 12), Figura 1B) Símbolo del gen: NLRP2, Péptido: VLYGPAGLGK (SEQ ID N.°27), Figura 1C) Símbolo del gen: NLRP7, Péptido: LLDEGAMLLY (SEQ ID N.° 31), Figura 1D) Símbolo del gen: HTR3A, Péptido: GLLQELSSI (SEQ ID N.° 66), Figura 1E) Símbolo del gen: VTCN1, Péptido: KVVSVLYNV (SEQ ID N.° 75), Figura 1F) Símbolo del gen: CYP2W1, Péptido: RYGPVFTV (SEQ ID N.° 98), Figura 1G) Símbolo del gen: MMP11, Péptido: LLQPPPLLAR (SEQ ID N.° 98), Figura 1H) Símbolo del gen: MMP12, Péptido: FVDNQYWRY (SEQ ID N.° 115), Figura 1I) Símbolo del gen: CTAG2, Péptido: APLPRPGAVL (SEQ ID N.° 119), Figura 1J) Símbolo del gen: FAM111B, Péptido: KPSESIYSAL (SEQ ID N.° 123), Figura 1K) Símbolo del gen: CCNA1, Péptido: HLLLKVLAF (SEQ ID N.° 151), Figura 1L) Símbolo del gen: FAM83H, Péptido: HVKEKFLL (SEQ ID N.° 156), Figura 1M) Símbolo del gen: MAGEA11, Péptido: KEVDPTSHSY (SEQ ID N.° 194), Figura 1N) Símbolo del gen: MMP11, Péptido: YTFRYPLSL (SEQ ID N.° 227), Figura 1O) Símbolo del gen: ZNF560, Péptido: VFVSFSSLF (SEQ ID N.° 255), Figura 1P) Símbolo del gen: IGF2BP1, Péptido: ISYSGQFLVK (SEQ ID N.° 266), Figura 1Q) Símbolo del gen: CLDN6, Péptido: LPMWKVTAF (SEQ ID N.° 303), Figura 1R) Símbolo del gen: IGF2BP3, Péptido: IEALSGKIEL (SEQ ID N.° 413), Figura 1S) Símbolo del gen: PRAME, Péptido: EEQYIAQF (SEQ ID N.° 432).

Las Figuras 1T a 1V muestran, a título de ejemplo, perfiles de expresión de genes originarios de la presente invención que aparecen sobreexpresados en distintas muestras oncológicas. Las muestras tumorales (puntos negros) y normales (puntos grises) se agrupan según el órgano de origen. Los diagramas de cajas y bigotes representan el valor mediano de FPKM, los percentiles 25° y 75° (caja) más los bigotes que se extienden desde el punto de dato inferior dentro del intervalo intercuartílico 1,5 (IQR) del cuartil inferior hasta el punto de dato superior dentro del IQR 1,5 del cuartil superior. Los órganos normales aparecen ordenados según las categorías de riesgo. FPKM = fragmentos por kilobase por millón de lecturas mapeadas. Muestras normales: cél. sang. (células sanguíneas), vasos sang. (vasos sanguíneos), cerebro, corazón, hígado, pulmón, tej. adiposo (tejido adiposo), gl. supraren. (glándula suprarrenal), vía biliar, vejiga, médula ósea, esófago, ojo, vesíc. biliar (vesícula biliar), cab. y cuello (cabeza y cuello), intest. gr. (intestino grueso), intest. delg. (intestino delgado), riñón, g. linfático (ganglio linfático), nervio perif. (nervio periférico), páncreas, gl. paratir. (glándula paratiroidea), peritoneo, hipófisis, pleura, músc. esq. (músculo esquelético), piel, bazo, estómago, tiroides, tráquea, uréter, mama, ovario, placenta, próstata, testículo, timo y útero. Muestras tumorales: AML: leucemia mieloide aguda; BRCA: cáncer de mama; CCC: carcinoma colangiocelular; CLL: leucemia linfocítica crónica; CRC: cáncer colorrectal; GBC: cáncer de vesícula biliar; GBM: glioblastoma; GC: cáncer gástrico; HCC: carcinoma hepatocelular; HNSCC: carcinoma epidermoide de cabeza y cuello; MEL: melanoma; NHL: linfoma no hodgkiniano; NSCLCadeno: adenocarcinoma de pulmón amicrocítico; NSCLCotro: muestras de NSCLC que no pueden asignarse inequívocamente a los tipos NSCLCadeno o NSCLCsquam; NSCLCsquam: cáncer epidermoide de pulmón amicrocítico; OC: cáncer de ovario, OSCAR: cáncer de esófago; PACA: cáncer de páncreas; PRCA: cáncer de próstata; RCC: carcinoma de células renales; SCLC: cáncer de pulmón microcítico; UBC: carcinoma de vejiga urinaria; UEC: cáncer de endometrio y uterino. Figura 1T) Símbolo del gen: MAGEA4, Péptido: SPDAESLFREALSNKVDEL (SEQ ID N.° 597), Figura 1U) Símbolo del gen: MAGEA4, Péptido: LSNKVDELAHFLLRK (SEQ ID N.° 601), Figura 1V) Símbolo del gen: MAGEB3, Péptido: KLITQDLVKLKYLEYRQ (SEQ ID N.°604).

La Figura 2 muestra resultados a título de ejemplo de respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de péptido procedentes de un donante sano HLA-A*02+ en condiciones in vitro. Los linfocitos T CD8+ fueron estimulados con APC artificiales cubiertas con AcM anti-CD28 y HLA-A*02 formando un complejo con el péptido de SEQ ID N.° 773 (ALYGKLLKL, SEQ ID N.° 773) (A, recuadro izquierdo). Al cabo de tres ciclos de estimulación, las células que reaccionaron al péptido se detectaron mediante la tinción 2D con multímeros con A*02/SEQ ID N.° 773 (A). El recuadro de la derecha (A) muestra la tinción de control de células estimuladas con complejos A*24/péptido irrelevantes. Los linfocitos CD8+ se seleccionaron entre las células en singlete viables. La aplicación de operadores booleanos ayudó a excluir los falsos positivos detectados con los multímeros específicos para diferentes péptidos. Se indican las frecuencias de células multímero+ específicas entre los linfocitos CD8+.

La Figura 3 muestra resultados a título de ejemplo de respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de péptido procedentes de un donante sano HLA-A*24+ en condiciones in vitro. Los linfocitos T CD8+ fueron estimulados con APC artificiales cubiertas con AcM anti-CD28 y HLA-A*24 formando un complejo con el péptido de SEQ ID N.° 774 (A, recuadro izquierdo). Al cabo de tres ciclos de estimulación, las células que reaccionaron al péptido se detectaron mediante la tinción 2D de los multímeros con A*24/SEQ ID N.° 774 (VYVDDIYVI, SEQ ID N.° 774) (A). El recuadro de la derecha (A) muestra la tinción de control de células estimuladas con complejos A*24/péptido irrelevantes. Los linfocitos CD8+ se seleccionaron entre las células en singlete viables. La aplicación de operadores booleanos ayudó a excluir los falsos positivos detectados con los multímeros específicos para diferentes péptidos. Se indican las frecuencias de células multímero+ específicas entre los linfocitos CD8+.

La Figura 4 muestra resultados a título de ejemplo de respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de péptido procedentes de un donante sano HLA-A*02+ en condiciones in vitro. Los linfocitos T CD8+ fueron estimulados con APC artificiales cubiertas con AcM anti-CD28 y HLA-A*02 formando un complejo con el péptido de SEQ ID N.° 67 SLLLPSIFL (A, recuadro izquierdo) o el péptido de SEQ ID N.° 75 kVv Sv LYNV (B, recuadro izquierdo), respectivamente. Al cabo de tres ciclos de estimulación, las células que reaccionaron al péptido se detectaron mediante la tinción 2D de los multímeros con A*02/SEQ ID N.° 67 (A) o A*02/SEQ ID N.° 75 (B). Los recuadros de la derecha (A y B) muestran la tinción de control de células estimuladas con complejos A*02/péptido irrelevantes. Los linfocitos CD8+ se seleccionaron entre las células en singlete viables. La aplicación de operadores booleanos ayudó a excluir los falsos positivos detectados con los multímeros específicos para diferentes péptidos. Se indican las frecuencias de células multímero+ específicas entre los linfocitos CD8+.

La Figura 5 muestra resultados a título de ejemplo de respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de péptido procedentes de un donante sano HLA-A*24+ en condiciones in vitro. Los linfocitos T CD8+ fueron estimulados con APC artificiales cubiertas con AcM anti-CD28 y HLA-A*24 formando un complejo con el péptido de SEQ ID N.° 11 SYSDLHYGF (A, recuadro izquierdo) o el péptido de SEQ ID N.° 79 s Yn EhWNYL (B, recuadro izquierdo), respectivamente. Al cabo de tres ciclos de estimulación las células que reaccionaron al péptido se detectaron mediante la tinción 2D de los multímeros con A*24/SEQ ID N.° 11 (A) o A*24/SEQ ID N.° 79 (B). Los recuadros de la derecha (A y B) muestran la tinción de control de células estimuladas con complejos A*24/péptido irrelevantes. Los linfocitos CD8+ se seleccionaron entre las células en singlete viables. La aplicación de operadores booleanos ayudó a excluir los falsos positivos detectados con los multímeros específicos para diferentes péptidos. Se indican las frecuencias de células multímero+ específicas entre los linfocitos CD8+.

La Figura 6 muestra resultados a título de ejemplo de respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de péptido procedentes de un donante sano HLA-B*07+ en condiciones in vitro. Los linfocitos T CD8+ fueron estimulados con APC artificiales cubiertas con AcM anti-CD28 y HLA-B*07 formando un complejo con el péptido de SEQ ID N.° 33 SPTFHLTL (A, recuadro izquierdo) o el péptido de SEQ ID N.° 40 KPGTSYRVTL (B, recuadro izquierdo), respectivamente. Al cabo de tres ciclos de estimulación, las células que reaccionaron al péptido se detectaron mediante la tinción 2D de los multímeros con B*07/SEQ ID N.° 33 (A) o B*07/SEQ ID N.° 40 (B). Los recuadros de la derecha (A y B) muestran la tinción de control de células estimuladas con complejos B*07/péptido irrelevantes. Los linfocitos CD8+ se seleccionaron entre las células en singlete viables. La aplicación de operadores booleanos ayudó a excluir los falsos positivos detectados con los multímeros específicos para diferentes péptidos. Se indican las frecuencias de células multímero+ específicas entre los linfocitos CD8+.

La Figura 7 muestra resultados a título de ejemplo de respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de péptido procedentes de un donante sano HLA-A*01+ en condiciones in vitro. Los linfocitos T CD8+ fueron estimulados con APC artificiales cubiertas con AcM anti-CD28 y HLA-A*02 formando un complejo con el péptido de SEQ ID N.° 113 QLDSNRLTY (A, recuadro izquierdo) o el péptido de SEQ ID N.° 115 FVDNQYWRY (^b , recuadro izquierdo), respectivamente. Al cabo de tres ciclos de estimulación, las células que reaccionaron al péptido se detectaron mediante la tinción 2D de los multímeros con A*01/SEQ ID N.° 113 (A) o A*01/SEQ ID N.° 115 (B). Los recuadros de la derecha (Ay B) muestran la tinción de control de células estimuladas con complejos A*01/péptido irrelevantes. Los linfocitos CD8+ se seleccionaron entre las células en singlete viables. La aplicación de operadores booleanos ayudó a excluir los falsos positivos detectados con los multímeros específicos para diferentes péptidos. Se indican las frecuencias de células multímero+ específicas entre los linfocitos CD8+.

La Figura 8 muestra resultados a título de ejemplo de respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de péptido procedentes de un donante sano HLA-A*03+ en condiciones in vitro. Los linfocitos T CD8+ fueron estimulados con APC artificiales cubiertas con AcM anti-CD28 y HLA-A*03 formando un complejo con el péptido de SEQ ID N.° 23 GMMKGGIRK (A, recuadro izquierdo) o el péptido de SEQ ID N.° 90 KVAGERYVYK (B, recuadro izquierdo), respectivamente. Al cabo de tres ciclos de estimulación, las células que reaccionaron al péptido se detectaron mediante la tinción 2D de los multímeros con A*03/SEQ ID N.° 23 (A) o A*03/SEQ ID N.° 90 (B). Los recuadros de la derecha (A y B) muestran la tinción de control de células estimuladas con complejos A*03/péptido irrelevantes. Los linfocitos CD8+ se seleccionaron entre las células en singlete viables. La aplicación de operadores booleanos ayudó a excluir los falsos positivos detectados con los multímeros específicos para diferentes péptidos. Se indican las frecuencias de células multímero+ específicas entre los linfocitos CD8+.

La Figura 9 muestra resultados a título de ejemplo de respuestas de linfocitos T CD8+ específicos de péptido procedentes de un donante sano HLA-B*44+ en condiciones in vitro. Los linfocitos T CD8+ fueron estimulados con APC artificiales cubiertas con AcM anti-CD28 y HLA-B*44 formando un complejo con el péptido de SEQ ID N.° 200 AESIPTVSF (A, recuadro izquierdo) o el péptido de SEQ ID N.° 211 e EkVf PSPlW (B, recuadro izquierdo), respectivamente. Al cabo de tres ciclos de estimulación, las células que reaccionaron al péptido se detectaron mediante la tinción 2D de los multímeros con B*44/SEQ ID N.° 200 (A) o B*44/SEQ ID N.° 211 (B). Los recuadros de la derecha (Ay B) muestran la tinción de control de células estimuladas con complejos B*44/péptido irrelevantes. Los linfocitos CD8+ se seleccionaron entre las células en singlete viables. La aplicación de operadores booleanos ayudó a excluir los falsos positivos detectados con los multímeros específicos para diferentes péptidos. Se indican las frecuencias de células multímero+ específicas entre los linfocitos CD8+.

EJEMPLOS

EJEMPLO 1

Identificación de los péptidos asociados a tumor presentados en la superficie celular

Muestras de tejido

Los tejidos tumorales y los tejidos normales se obtuvieron del Hospital Universitario de Tubinga, Alemania. Los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito antes de la intervención quirúrgica o la autopsia. Los tejidos se criogenizaron en nitrógeno líquido inmediatamente después de la extirpación y permanecieron a -70°C hasta el aislamiento de los TUMAP.

Aislamiento de los péptidos HLA de las muestras de tejido

Las mezclas de péptidos HLA de las muestras de tejido congeladas instantáneamente se obtuvieron por inmunoprecipitación de tejidos sólidos siguiendo un protocolo ligeramente modificado (Falk et al., Nature 351 (1991): 290-296; Seeger et al., Immunogenetics 49 (1999): 571-576) con el anticuerpo específico de HLA-A*02 BB7.2, el anticuerpo específico de HLA-A, B y C W6/32, el anticuerpo específico de HLA-DR l243 y el anticuerpo específico de todos los HLA de clase II Tü39, sefarosa activada con CNBr, tratamiento con ácido y ultrafiltración.

Análisis por espectrometría de masas

Las mezclas de péptidos HLA obtenidas se separaron en función de su hidrofobicidad con cromatografía en fase invertida (sistema Ultimate 3000 RSLC Nano UHPLC, Dionex) y los péptidos eluidos se analizaron con espectrómetros de masas híbridos LTQ-Orbitrap y Fusion Lumos (ThermoElectron) equipados con una fuente ESI. Las muestras de péptidos se cargaron con un 3% de disolvente B (H₂O al 20%, acetonitrilo (ACN) al 80% y ácido fórmico al 0,04%) en una columna PeμMap 100 C18 Nanotrap de 2 cm (Dionex) con un caudal de 4 μl/min durante 10 min. La separación se llevó a cabo en columnas C18 PeμMap de 25 o 50 cm con un tamaño de partícula de 2 μm (Dionex) montadas en un horno de columna operando a 50 °C. El gradiente aplicado varió entre el 3% y el 32% en el caso del disolvente B en el plazo de 90 minutos con un caudal de 300 nl/min (en las columnas de 25 cm) o de 140 min con un caudal de 175 nl/min (en las columnas de 50 cm). (Disolvente A: H₂O al 99%, ACN al 1% y ácido fórmico al 0,1%; Disolvente B: H₂O al 20%, ACN al 80% y ácido fórmico al 0,1%).

Se efectuó un análisis por espectrometría de masas en modo de adquisición dependiente de datos empleando el llamado método de los cinco primeros (es decir, durante cada barrido de exploración se seleccionaron para la fragmentación los cinco iones precursores más abundantes). Como alternativa, se empleó el método TopSpeed para el análisis en los espectrómetros Fusion Lumos,

Los barridos de exploración se registraron en el Orbitrap con una resolución de 60.000 en el Orbitrap XL y de 120.000 en el Orbitrap Fusion Lumos. El análisis por EM/EM se llevó a cabo mediante disociación inducida por colisión (CID, energía de colisión normalizada 35%, tiempo de activación 30 ms, amplitud de aislamiento 1,3 m/z) con análisis en un cuadrupolo de confinamiento lineal (LTQ). El intervalo de masas correspondiente a los ligandos de HLA de clase I se limitó a 400-650 m/z con estados de carga posibles de 2+ y 3+ seleccionados para la fragmentación. En lo referente al intervalo de masas de los ligandos del HLA de clase II este se ajustó a 300-1500 m/z permitiendo la fragmentación con estados de carga positivos > 2.

Los espectros de masas en tándem se interpretaron con MASCOT o SEQUEST con una tasa de descubrimiento falso fija (q < 0,05) y control manual adicional. En los casos en que la secuencia peptídica identificada era incierta esta se confirmó comparando el patrón de fragmentación generado por el péptido natural con el patrón de fragmentación de un péptido de referencia sintético de idéntica secuencia.

La Tabla 19 muestra la presentación en varias entidades tumorales, y por ende la relevancia concreta de los péptidos mencionados en el diagnóstico o el tratamiento de los cánceres indicados (p. ej. el péptido de la SEQ ID N.° 1 para el cáncer colorrectal, el cáncer de vesícula biliar, el linfoma no hodgkiniano, el cáncer de pulmón no microcítico y el cáncer de endometrio y uterino, el péptido de la SEQ ID N.° 2 para el cáncer de mama, el carcinoma colangiocelular, el cáncer colorrectal, cáncer de vesícula biliar, cáncer gástrico, carcinoma epidermoide de cabeza y cuello, melanoma, linfoma no hodgkiniano, cáncer de pulmón amicrocítico, cáncer de esófago, cáncer de páncreas, cáncer de próstata, carcinoma de células renales, cáncer de pulmón microcítico y cáncer de endometrio y uterino).

Tabla 19: Resumen de la presentación de péptidos asociados a tumor seleccionados de la presente invención en distintos ti os de tumores.

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EJEMPLO 2

Perfiles de expresión de los genes que codifican el péptido de la invención y otros péptidos dados a conocer en la presente memoria

La sobrepresentación o la presentación específica de un péptido en las células tumorales con respecto a las células normales es suficiente para que sea de utilidad en la inmunoterapia, y algunos péptidos son específicos de tumor aunque la proteína de la que proceden esté presente también en los tejidos normales. Además, la obtención de los perfiles de expresión del ARNm añade otro nivel de seguridad a la selección de las dianas peptídicas para la inmunoterapia. Concretamente para las opciones terapéuticas sujetas a un alto riesgo de seguridad, como los TCR madurados por afinidad, el péptido diana ideal será todo aquel derivado de una proteína que sea exclusiva del tumor y no se halle en los tejidos normales.

Fuentes de ARN y preparación

Las muestras de tejido extirpado fueron facilitadas por diversas instituciones (véase el Ejemplo 1); todos los pacientes otorgaron su consentimiento informado por escrito. Las muestras de tejido tumoral se congelaron rápidamente en nitrógeno líquido inmediatamente después de la operación y se homogeneizaron a mano en un mortero con nitrógeno líquido. El ARN total se preparó a partir de estas muestras con TRI Reagent (Ambion, Darmstadt, Alemania) y después se purificó con RNeasy (QIAGEN, Hilden, Alemania); ambos métodos se efectuaron siguiendo las instrucciones del fabricante.

El ARN total procedente de tejidos humanos sanos para los experimentos de RNASeq se obtuvo de: Asterand (Detroit, MI, EE.UU. y Royston, Herts, RU); Bio-Options Inc. (Brea, CA, EE.UU.); Geneticist Inc. (Glendale, CA, EE.UU.); ProteoGenex Inc. (CulverCity, CA, EE.UU.); Tissue Solutions Ltd (Glasgow, RU).

El ARN total procedente de tejidos tumorales para los experimentos de RNASeq se obtuvo de: Asterand (Detroit, MI, EE.UU. y Royston, Herts, RU); BioCat GmbH (Heidelberg, Alemania); BioServe (Beltsville, MD, EE.UU.); Geneticist Inc. (Glendale, CA, EE.UU.); Istituto Nazionale Tumori "Pascale" (Nápoles, Italia); ProteoGenex Inc. (Culver City, CA, EE.UU.); Hospital Universitario de Heidelberg (Heidelberg, Alemania).

La calidad y la cantidad de las muestras de ARN se valoró con Agilent 2100 Bioanalyzer (Agilent, Waldbronn, Alemania) y el RNA 6000 Pico LabChip Kit (Agilent).

Experimentos de RNAseq

El análisis de la expresión génica de las muestras de ARN procedentes de tejidos tumorales y normales se efectuó con secuenciación de nueva generación (RNAseq) en CeGaT (Tübingen, Alemania). En resumen, se prepararon bibliotecas de secuenciación con el kit de reactivos Illumina HiSeq v4 siguiendo el protocolo del fabricante (Illumina Inc, San Diego, CA, EE.UU.), que incluye la fragmentación del ARN, su conversión a ADNc y la adición de adaptadores de secuenciación. Las bibliotecas derivadas de múltiples muestras se mezclaron equimolarmente y se secuenciaron en un secuenciador Illumina HiSeq 2500 siguiendo las instrucciones del fabricante, dando como resultado lecturas desde un solo extremo de 50 bp. Las lecturas procesadas se cartografiaron en el genoma humano (GRCh38) con el software STAR. Los datos de expresión se proporcionan a nivel de transcrito en forma de RPKM (lecturas por kilobase por cada millón de lecturas cartografiadas, generadas con el software Cufflinks) y a nivel de exón (lecturas totales, generadas con el software Bedtools), basada en anotaciones de la base de datos de secuencias Ensembl (Ensembl77). Las lecturas de los exones se normalizaron para la longitud del exón y el tamaño de alineación para obtener los valores en RPKM.

En la Figura 1 se exponen ejemplos de perfiles de expresión de genes originarios que aparecen muy sobreexpresados o que se expresan exclusivamente en el cáncer de ovario. La Tabla 10 muestra las puntuaciones de expresión de otros genes mostrados a título de ejemplo.

Tabla 10: Puntuaciones de expresión. La tabla enumera péptidos derivados de genes que se sobreexpresan muchísimo más en los tumores de ovario que en el grupo de tejidos normales (+++), se sobreexpresan mucho más en los tumores de ovario que en el grupo de tejidos normales (++), y se sobreexpresan más en los tumores de ovario que en el grupo de tejidos normales (+). El valor inicial de esta puntuación se calculó con las mediciones de los siguientes tejidos normales pertinentes: tejido adiposo, glándula suprarrenal, vía biliar, células sanguíneas, vasos sanguíneos, médula ósea, cerebro, cartílago, esófago, ojo, vesícula biliar, corazón, cabeza y cuello, riñón, intestino grueso, hígado, pulmón, ganglio linfático, nervio, glándula paratiroidea, páncreas, hipófisis, músculo esquelético, piel, intestino delgado, bazo, estómago, glándula tiroides, tráquea y vejiga urinaria. Si existían datos de expresión de varias muestras del mismo ti o de teido el cálculo se hizo con la media aritmética de todas las muestras.

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EJEMPLO 3

Inmunogenicidad in vitro de los péptidos presentados por MHC de clase I

A fin de recabar información sobre la inmunogenicidad de los TUMAP de la presente invención, los inventores llevaron a cabo estudios con un ensayo de sensibilización in vitro de linfocitos T basado en estimulaciones reiteradas de linfocitos T CD8+ con células presentadoras de antígeno artificiales (aAPC) cargadas con complejos péptido/MHC y anticuerpo anti-CD28. De este modo los inventores han podido demostrar la inmunogenicidad de TUMAp restringidos a HLA-A*0201, HLA-A*24:02, HLA-A*01:01, HLA-A*03:01, HLA-B*07:02 y HLA-B*44:02 de la invención, lo cual demuestra que estos péptidos son epítopos de linfocitos T contra los cuales existen linfocitos T precursores CD8+ en humanos (Tabla 11).

Sensibilización in vitro de linfocitos T CD8+

Para realizar las estimulaciones in vitro con células presentadoras de antígenos artificiales cargadas con el complejo péptido-MHC (pMHC) y el anticuerpo anti-CD28, los inventores aislaron primero los linfocitos T CD8+ de productos de leucoféresis frescos HLa -A*02, HlA-A*24, HLA-A*01, HLA-A*03, HLA-B*07 o HLA-B*44 mediante la selección positiva con microperlas con CD8 (Miltenyi Biotec, Bergisch-Gladbach, Alemania) procedentes de donantes sanos obtenidas de la Clínica Universitaria de Mannheim, Alemania, tras obtener el consentimiento informado.

Los linfocitos CD8+ o PBMC aislados se incubaron hasta su utilización en medio para linfocitos T (TCM) consistente en RPMI-Glutamax (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania) complementado con suero AB humano termoinactivado al 10% (PAN-Biotech, Aidenbach, Alemania), penicilina 100 U/ml / estreptomicina 100 μg/ml (Cambrex, Colonia, Alemania), piruvato sódico 1 mM (CC Pro, Oberdorla, Alemania), gentamicina 20 |jg/ml (Cambrex). En este paso al medio TCM también se le añadieron IL-7 2,5 ng/ml (PromoCell, Heidelberg, Alemania) e IL-2 10 U/ml (Novartis Pharma, Núremberg, Alemania).

La fabricación de las microperlas tapizadas con pMHC/anti-CD28, la estimulaciones de los linfocitos T y la lectura se llevaron a cabo en un sistema in vitro muy definido con cuatro moléculas pMHC distintas en cada condición de estimulación y 8 moléculas pMHC distintas en cada condición de lectura.

El anticuerpo coestimulador purificado Ab 9.3, una IgG2a de ratón anti-CD28 humano (Jung et al., 1987) se biotiniló químicamente con sulfo-N-hidroxisuccinimidobiotina siguiendo las recomendaciones del fabricante (Perbio, Bonn, Alemania). Las microperlas utilizadas consistían en partículas de poliestireno de 5,6 jm de diámetro recubiertas de estreptavidina (Bangs Laboratories, Illinois, EE.UU.).

Los pMHC usados en las estimulaciones de control positivo y negativo fueron A*0201/MLA-001 (péptido ELAGIGILTV (SEQ ID N.° 775) de Melan-A modificado/MART-1) y A*0201/DDX5-001 (YLLPAIVHI de DDX5, SEQ ID N.° 776), respectivamente.

Placas de 96 pocillos se tapizaron con 800.000 microperlas / 200 j l en presencia de 4 x 12,5 ng de diferentes pMHC biotinilados, se lavaron y después se les añadió 600 ng de anti-CD28 biotinilado en un volumen de 200 jl. Las estimulaciones se iniciaron en placas de 96 pocillos en las que se incubaron simultáneamente 1x106 linfocitos T CD8+ con 2x105 microperlas recubiertas y lavadas en 200 j l de TCM suplementado con IL-125 ng/ml (PromoCell) durante 3 días a 37 °C. La mitad del medio se renovó con TCM fresco suplementado con IL-280 U/ml y la incubación continuó otros 4 días a 37 °C. Este ciclo de estimulación se efectuó en total tres veces. Para la lectura de los multímeros pMHC con 8 moléculas pMHC distintas por condición se empleó una estrategia de codificación combinatoria bidimensional según lo descrito en otro lugar(Andersen et al., 2012), con pequeñas modificaciones que comprenden el acoplamiento con 5 fluorocromos distintos. Por último, los análisis de los multímeros se llevaron a cabo tiñendo las células con el colorante vital Live/dead® del IR cercano (Invitrogen, Karlsruhe, Alemania), con anticuerpo anti-CD8-FITC clon SK1 (BD, Heidelberg, Alemania) y multímeros pMHC fluorescentes. Para el análisis se equipó un citómetro BD LSRII SORP con los filtros y láseres adecuados. Las células específicas de péptido se calcularon en forma de porcentaje respecto al total de linfocitos T CD8+. La evaluación del análisis multimérico se efectuó con el software FlowJo (Tree Star, Oregón, EE. UU.). La sensibilización in vitro de los linfocitos CD8+ multímero+ específicos se detectó comparando los resultados con las estimulaciones del control negativo. La inmunogenicidad para un antígeno dado quedaba confirmada si al menos un pocillo estimulado in vitro y evaluable de un donante sano contenía una línea de linfocitos T CD8+ específica después de la estimulación in vitro (esto es, el pocillo contenía al menos un 1% de multímero+ específico entre los linfocitos T CD8+ y el porcentaje de células multímero+ específicas era al menos 10x de la mediana de las estimulaciones del control negativo).

Inmunogenicidad in vitro de péptidos del cáncer de ovario

En el caso de los péptidos de HLA de clase I analizados, la inmunogenicidad in vitro se puede demostrar con la generación de líneas de linfocitos T específicos de ese péptido. En las Figuras 2 a 9 se muestran a título de ejemplo los resultados de la citometría de flujo de 14 péptidos de la invención tras la tinción de multímeros específicos de TUMAP junto con la de los controles negativos correspondientes. Los resultados de 118 péptidos de la invención se resumen en la Tabla 11a y la Tabla 11b.

Tabla 11a: Inmunogenicidad in vitro de los péptidos HLA de clase I dados a conocer en la presente memoria. Resultados a título de ejemplo de los experimentos de inmunogenicidad in vitro llevados a cabo por el solicitante de < = - = + - = ++ >= = +++

Tabla 11b: Inmunogenicidad in vitro de los péptidos HLA de clase I de la invención y de otros péptidos mostrados en la presente memoria. Resultados a título de ejemplo de los experimentos de inmunogenicidad in vitro llevados a cabo por el solicitante con los péptidos de la invención y otros péptidos mostrados en la presente memoria. <20 % =

20 % - 49 % = + 50 % - 69 %= ++ >= 70 % = +++

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EJEMPLO 4

Síntesis de péptidos

Todos los péptidos se sintetizaron mediante síntesis en fase sólida estándar con el contrastado método de Fmoc. La identidad y la pureza de cada péptido se determinaron con espectrometría de masas y RP-HPLC analítica. Se obtuvieron los péptidos en forma de liofilizados blancos o blancuzcos (sal de trifluoroacetato) con una pureza superior al 50%. Todos los TUMAP se administraron preferiblemente como sales de trifluoroacetato o de acetato, aunque también es factible con otros tipos de sales.

Ensayo de unión a MHC

Los péptidos candidatos para los tratamientos a base de linfocitos T acordes con la presente invención fueron sometidos a ensayos para determinar su capacidad de unión a las moléculas del MHC (afinidad). Se produjeron complejos individuales de péptidos-MHC por medio del intercambio de ligandos facilitado por UV, técnica en la cual un péptido sensible a los rayos UV es escindido por la irradiación con tales rayos y se intercambia por el péptido de interés que es analizado. Solo aquellos péptidos candidatos que se unen y estabilizan de forma efectiva las moléculas del MHC a las que se acoplan impiden la disociación de tales complejos MHC. Para determinar el rendimiento de la reacción de intercambio se efectuó un ELISA basado en la detección de la cadena ligera (p2m) de los complejos MHC estabilizados. El ensayo se llevó a cabo siguiendo la descripción general de Rodenko y cols. (Rodenko et al., 2006).

Placas MAXISorp de 96 pocillos (NUNC) se incubaron toda la noche con estreptavidina 2 μg/ml en PBS a temperatura ambiente, se lavaron 4 veces y se bloquearon durante 1 hora a 37 °C con un tampón de bloqueo que contenía BSA al 2%. Los monómeros replegados de HLA-A*02:01/MLA-001 sirvieron como patrones, abarcando el intervalo de 15 a 500 ng/ml. Los monómeros de péptido-MHC resultantes de la reacción de intercambio facilitada por los UV se diluyeron 100X con tampón de bloqueo. Las muestras se incubaron durante 1 h a 37 °C, se lavaron cuatro veces, se incubaron con anticuerpo anti-p2m conjugado con HRP 2 μg/ml durante 1 h a 37 °C, se lavaron de nuevo y se revelaron con solución de TMB que se detuvo con NH₂SO₄. La absorción se midió a 450 nm. Por norma general, para la creación y producción de anticuerpos o de fragmentos de los mismos, o de receptores de linfocitos T o fragmentos de los mismos se prefieren los péptidos candidato que muestran un alto porcentaje de intercambio (preferentemente superior al 50%, aún más preferentemente superior al 75%), puesto que presentan una afinidad suficiente hacia las moléculas del MHC que evita la disociación de los complejos ^m H^c .

Tabla 12: Puntuaciones de unión a las moléculas del MHC de clase I. Según el porcentaje del intercambio de péptidos, la unión de los péptidos restringidos a HLA de clase I al HLA-A*02:01 varió entre: >10% = ; >20% = +;

>50 = ++; >75% = +++

(continuación)

Tabla 13: Puntuaciones de unión a las moléculas del MHC de clase I. Según el porcentaje del intercambio de péptidos, la unión de los péptidos restringidos a HLA de clase I al HLA-A*24:02 varió entre: >10% = ; >20% = +;

>50 = ++; >75% = +++

(continuación)

Tabla 14: Puntuaciones de unión a las moléculas del MHC de clase I. Según el porcentaje del intercambio de péptidos, la unión de los péptidos restringidos a HLA de clase I al HLA-A*01:01 varió entre: >10% = ; >20% = +;

>50 = ++; >75% = +++

Tabla 15: Puntuaciones de unión a las moléculas del MHC de clase I. Según el porcentaje del intercambio de péptidos, la unión de los péptidos restringidos a HLA de clase I al HLA- A*03:01 varió entre: >10% = ; >20% = +;

>50 = ++; >75% = +++

(continuación)

(continuación)

Tabla 16: Puntuaciones de unión a las moléculas del MHC de clase I. Según el porcentaje del intercambio de péptidos, la unión de los péptidos restringidos a HLA de clase I al HLA-B*07:02 varió entre: >10% = ; >20% = +;

>50 = ++; >75% = +++

(continuación)

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(continuación)

Tabla 17: Puntuaciones de unión a las moléculas del MHC de clase I. Según el porcentaje del intercambio de péptidos, la unión de los péptidos restringidos a HLA de clase I al HLA-B*44:02 varió entre: >10% = ; >20% = +;

>50 = ++; >75% = +++

(continuación)

(continuación)

E JE M P L O 6

Estabilidad de los complejos de péptido-MHC de clase I

Se efectuaron ensayos de estabilidad de los complejos de péptido-MHC con el HLA-B*08:01. Los datos se obtuvieron con un ensayo en tiempo real, homogéneo, basado en la proximidad, con el fin de medir la disociación de los péptidos de las moléculas HLA de clase I. En primer lugar, se procedió a expresar la b2m y el HLA-B*08:01 humanos en bacterias E. coli mediante técnicas de ADN recombinante y a continuación se purificaron mediante cromatografía de líquidos en varias etapas (Ferre et al., 2003; Ostergaard et al., 2001). A continuación, se determinó la estabilidad de un complejo de péptido-MHC (pMHC) midiendo la cantidad de b2m que permanecía unida a la cadena pesada del MHC a lo largo del tiempo a 37 °C (Harndahl et al., 2012). La estabilidad de cada pMHC, expresada como la semivida de la asociación de la b2m con la cadena pesada correspondiente, se calculó mediante el ajuste de los datos con una ecuación de disociación monofase.

La estabilidad de los complejos pMHC se midió en tres experimentos independientes y se comprobó que los péptidos en cuestión mostraban un abanico de afinidad muy amplio, hacia el alelo HLA- B*08:01, que abarcaba desde ligandos débiles (+) hasta sumamente estables (++++). En la Tabla 18 se muestra la media de la semivida (T1/2).

Tabla 18: Media de la semivida (T1/2) resultando de tres mediciones individuales. T1/2 > 2 h = ; T1/2 > 4 h = +;

T1/2 > 6 h = ++ T1/2 > 10 h = +++

(continuación)

EJEMPLO 7

Puntuaciones de unión de péptidos seleccionados a alotipos HLA de clase II

Las moléculas del complejo principal de histocompatibilidad de clase II (MHC-II) se expresan mayoritariamente en la superficie de las células presentadoras de antígenos especializadas, donde se encargan de mostrar péptidos a los linfocitos T cooperadores, que orquestan el inicio y el desenlace de muchas respuestas inmunitarias del hospedador. Así pues, averiguar qué péptidos serán presentados por una molécula del MHC-II reviste importancia para conocer la activación de los linfocitos T cooperadores y puede servir para identificar epítopos de linfocitos T. Los péptidos que presentan las molécula del MHC de clase II se acoplan a una hendidura de unión formada por los residuos de las cadenas a y p de la MHC. La afinidad de unión del péptido-MHC está determinada principalmente por la secuencia de aminoácidos de la parte central que se une al péptido. Solo se dispone de algoritmos predictivos de la unión a moléculas HLA de clase II para los alelos más importantes de esta clase, por lo que han sido analizados con el algoritmo SYFPEITHI (Rammensee et al., 1999). El algoritmo ha sido utilizado con éxito para identificar epítopos de clase I y II en una amplia gama de antígenos, por ejemplo en los antígenos asociados a tumores humanos TRP2 (clase I) (Sun et al., 2000)y SSX2 (clase II) (Sun et al., 2000). La Tabla 20 muestra los alotipos HLA de clase II que probablemente reconocen y se unen a los péptidos seleccionados. Se consideró que el péptido se unía a una molécula HLA si la puntuación de SYFPEITHI era igual o superior a 18.

Tabla 20: Unión de los péptidos de clase II a varios alotipos HLA de clase II. Basándose en la predicción hecha por el algoritmo SYFPEITHI, los péptidos seleccionados tienen bastante probabilidades de unirse al menos a 4 de los alotipos HLA de clase II con motivo de unión conocido. En la lista figuran todos los alelos HLA de clase II de los l i n n m riz r i i n YFPEITHI.

(co n tin u a c ió n )

(co n tin u a c ió n )

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(co n tin u a c ió n )

(co n tin u a c ió n )

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Claims (14)

REIVINDICACIONES

1. Péptido consistente en la SEQ ID N.° 53 (MEHPGKLLF) o una sal farmacéuticamente aceptable del mismo.

2. El péptido conforme a la reivindicación 1, en que dicho péptido tiene la capacidad para unirse a una molécula MHC de clase I o II, y en que dicho péptido, cuando está unido a dicho MHC, es capaz de ser reconocido por linfocitos T CD4 y/o CD8.

3. Anticuerpo, en particular un anticuerpo monoclonal o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente el péptido de las reivindicaciones 1 o 2, preferiblemente el péptido acorde con la reivindicación 1 o 2 cuando está unido a una molécula del MHC.

4. Receptor de linfocito T o un fragmento del mismo, que reconoce específicamente un ligando del HLA, en que dicho ligando es el péptido acorde con la reivindicación 1 o 2 cuando está unido a una molécula del MHC.

5. El receptor de linfocito T acorde con la reivindicación 4, en que dicho receptor de linfocito T se provee como una molécula soluble y opcionalmente está dotado de otra función efectora como es un dominio inmunoestimulador o una toxina.

6. Célula hospedadora recombinante que comprende el péptido de la reivindicación 1 o 2, el anticuerpo o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 3, el receptor de linfocito T o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 4 o 5, en que dicha célula hospedadora se selecciona preferiblemente de una célula presentadora de antígeno, como una célula dendrítica, un linfocito T o una célula NK.

7. Método in vitro para producir linfocitos T activados, método que comprende la puesta en contacto de linfocitos T in vitro con antígeno cargado en moléculas MHC de clase I o II humanas que se expresan en la superficie de una célula presentadora de antígeno adecuada o en un constructo artificial que emula a una célula presentadora de antígeno durante un período de tiempo suficiente para activar dichos linfocitos T de un modo específico de antígeno, siendo dicho antígeno un péptido de la reivindicación 1 o 2.

8. Linfocito T activado, producido con el método acorde con la reivindicación 7, que reconoce selectivamente una célula que presenta un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos dada en la reivindicación 1 o 2.

9. Composición farmacéutica que comprende al menos un ingrediente activo seleccionado del grupo consistente en el péptido de la reivindicación 1 o 2, el anticuerpo o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 3, el receptor de linfocito T o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 4 o 5, la célula hospedadora acorde con la reivindicación 6, el linfocito T activado acorde con la reivindicación 8, o un ingrediente activo marcado o conjugado, y un vehículo farmacéuticamente aceptable, y opcionalmente, excipientes y/o estabilizantes farmacéuticamente aceptables.

10. Método para producir el péptido de la reivindicación 1 o 2, el anticuerpo o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 3, o el receptor de linfocito T o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 4 o 5, el método que comprende el cultivo de la célula hospedadora acorde con la reivindicación 6, y el aislamiento del péptido, del anticuerpo o de un fragmento del mismo o del receptor de linfocito T o de un fragmento del mismo a partir de dicha célula hospedadora y/o de su medio de cultivo.

11. El péptido de la reivindicación 1 o 2, el anticuerpo o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 3, el receptor de linfocito T o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 4 o 5, la célula hospedadora acorde con la reivindicación 6, o el linfocito T activado acorde con la reivindicación 8 para el uso en medicina.

12. El péptido de la reivindicación 1 o 2, el anticuerpo o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 3, el receptor de linfocito T o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 4 o 5, la célula hospedadora acorde con la reivindicación 6 o el linfocito T activado acorde con la reivindicación 8 para el uso en el diagnóstico y/o el tratamiento del cáncer.

13. Un equipo que comprende: (a) un envase que comprende una composición farmacéutica que contiene el péptido de la reivindicación 1 o 2, el anticuerpo o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 3, el receptor de linfocito T o fragmento del mismo acorde con la reivindicación 4 o 5, la célula hospedadora acorde con la reivindicación 6, o el linfocito T activado acorde con la reivindicación 8, en forma de solución o liofilizado;

(b) opcionalmente, un segundo envase que contiene un diluyente o una solución de reconstitución para la formulación liofilizada;

(c) opcionalmente, (I) instrucciones de uso para la solución o (II) para la reconstitución y/o el uso de la formulación liofilizada.

14. El equipo acorde con la reivindicación 13, que además comprende uno o más de los siguientes componentes: (III) un tampón, (IV) un diluyente, (V) un filtro, (VI) una aguja, o (VII) una jeringa.