CN117210561A

CN117210561A - Rnf106在食管鳞癌检测、治疗和预后靶点及应用

Info

Publication number: CN117210561A
Application number: CN202310516252.9A
Authority: CN
Inventors: 武静; 周海燕; 张业慧; 李瑞杰; 梁倩; 李岩; 李欣; 张建明; 齐洪昊
Original assignee: First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University
Current assignee: First Affiliated Hospital of Shandong First Medical University
Priority date: 2023-05-09
Filing date: 2023-05-09
Publication date: 2023-12-12

Abstract

本发明提供RNF106在食管鳞癌检测、治疗和预后靶点及应用，属于生药医药和分子生物学技术领域。本发明通过研究分析发现RNF106在食管鳞癌组织中表达量明显高于正常脑组织。同时本发明利用CO‑IP技术检测与RNF106结合的蛋白质，发现RNF106可与LATS2结合，并促进LATS2 k48相关的泛素化和降解，从而抑制YAP磷酸化，促进YAP在ESCC中的致癌功能，进而影响食管鳞癌的发生发展。本发明最终证实RNF106可通过LATS2‑Hippo‑YAP通路促进食管鳞癌的发生发展，并有望成为食管鳞癌诊断及治疗中的新靶点。

Description

RNF106在食管鳞癌检测、治疗和预后靶点及应用

技术领域

本发明涉及生药医药和分子生物学技术领域，特别涉及RNF106在食管鳞癌检测、治疗和预后靶点及应用。

背景技术

尽管食管鳞癌在诊断、治疗及发病机制等方面的研究取得诸多进展，但其5年生存率一直低于30％，且其发病率及病死率仍有逐年升高的趋势。病理进展迅速及治疗手段有限一直是食管鳞癌困扰临床多年的医学难题，因此全面深入地了解食管鳞癌的发生发展机制，寻找精准有效的诊断及治疗方法，对改善预后、提高患者生活质量具有重要意义。

Hippo信号通路由丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶的复杂级联反应组成，当感受到胞外环境的生长抑制信号后，经过一系列激酶磷酸化反应，作用于下游效应因子YAP和TAZ，参与细胞增殖、凋亡、控制器官大小以及肿瘤发生等生物功能。新近的基因组测序和分子研究表明，Hippo信号通路和食管鳞癌之间可能存在联系：Hippo信号通路抑制因子或Hippo中关键因子YAP的基因组扩增突变在食管鳞癌样本中普遍存在。这提示Hippo通路的过度激活可能在食管鳞癌的癌变过程中起重要作用。因此，揭示Hippo信号通路激活的分子机制对食管鳞癌治疗具有重要意义。

泛素样含PHD和环指域蛋白1(ubiquitin-like with PHD and ring fingerdomains 1)又称为RNF106，是新发现的与细胞生长有关的核蛋白基因，参与细胞增殖、周期调控、凋亡等重要的生物学过程。RNF106由泛素样结构域(UBL)、串联TUDOR结构域(TTD)、SET and RING associated结构域(SRA)和RING结构域组成。RNF106蛋白可与细胞DNA甲基转移酶1(DNMT1)结合，维持DNA的低甲基化状态。RNF106还能调节组蛋白的泛素化和染色质结构。除了调控基因组的功能外，最近的研究还表明，RNF106还可能参与多种细胞信号通路如P53信号等的修饰。

发明内容

本发明为了弥补现有技术的不足，提供了RNF106在食管鳞癌检测、治疗和预后靶点及应用。本发明首次发现RNF106的表达与食管鳞癌及Hippo信号通路紧密相关，同时研究证实RNF106可以通过调控Hippo/LATS1/2/YAP信号通路促进食管鳞癌的发生发展。因此，RNF106作为食管鳞癌的预测诊断标志物和潜在治疗靶点。基于上述研究成果，从而完成本发明。

具体的，本发明涉及以下技术方案：

本发明的第一个方面，提供RNF106作为标志物在制备食管鳞癌诊断或辅助诊断产品中的应用。

本发明通过生物信息分析发现，RNF106在食管鳞癌组织中表达量明显高于正常食管组织，且PCR及Western blot在食管鳞癌细胞系的实验结果也证实了这一现象，因此RNF106可作为食管鳞癌的诊断标志物。

本发明的第二个方面，提供一种产品，所述产品包含上述用于检测RNF106的物质，所述产品用于诊断或辅助诊断食管鳞癌。

其中，检测RNF106的物质包括但不限于用于RT-PCR、Western blot、实时定量PCR、免疫组化、基因芯片和基因测序检测RNF106的表达水平的物质。

所述产品包括但不限于检测待测样本中所述RNF106表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂、试剂盒或生物传感器。

所述待测样本可为人源样本，更具体的，所述待测样本包括受试者食管鳞癌细胞和/或食管鳞癌组织。

本发明的第三个方面，提供一种用于诊断或辅助诊断食管鳞癌的系统，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述RNF106表达水平的检测物质；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述RNF106表达水平判断所述受试者是否患有食管鳞癌；

所述步骤ii)评估单元具体评估流程包括：

与参照相比，所述受试者的待测样品中的RNF106表达水平上调，则所述受试者为或候选为食管鳞癌患者；反之，则所述受试者不为或不候选为食管鳞癌患者。

本发明的第四个方面，提供一种诊断或辅助诊断食管鳞癌的方法，所述方法包括：

a)从受试者分离待测样品；

b)在所述受试者的待测样品中检测上述RNF106表达水平，以及；

c)将样品中的表达水平与参照中的表达水平进行比较；

其中，与参照中的水平相比，样品中表达水平的上调，则所述受试者为或候选为食管鳞癌患者；反之，则所述受试者不为或不候选为食管鳞癌患者。

本发明的第五个方面，提供所述RNF106作为靶点在食管鳞癌治疗和/或筛选食管鳞癌药物中的应用。

本发明的第六个方面，提供抑制所述RNF106的表达水平的方法在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)抑制食管鳞癌细胞增殖；

(a2)抑制食管鳞癌细胞的侵袭和/或迁移；

(a3)延长食管鳞癌细胞G0/G1周期；

(a4)抑制Hippo/LATS1/2/YAP信号通路；

(a5)抑制食管鳞癌生长；

(a6)预防和/或治疗食管鳞癌。

本发明的第七个方面，提供一种产品，其活性成分包括抑制所述lncRNA的表达水平的物质；所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)抑制食管鳞癌细胞增殖；

(a2)抑制食管鳞癌细胞的侵袭和/或迁移；

(a3)延长食管鳞癌细胞G0/G1周期；

(a4)抑制Hippo/LATS1/2/YAP信号通路；

(a5)抑制食管鳞癌生长；

(a6)预防和/或治疗食管鳞癌。

上述第六至第七方面中的产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂可供基础研究使用。

本发明的第八个方面，提供一种治疗食管鳞癌的方法，所述方法包括：向受试者施用上述抑制所述RNF106的表达水平的物质。

与现有技术相比，本发明的有益技术效果：

本发明首次发现RNF106的表达量与食管鳞癌及Hippo信号通路紧密相关，进一步研究证实了RNF106与食管鳞癌中肿瘤细胞的增殖、侵袭和转移机制相关，并且阐明了RNF106通过直接集合并泛素化降解LATS1/2，促进YAP因子入核，从而转录调控相关因子，提供了完整的通路研究。最后，本发明通过对RNF106的敲除证实了敲除RNF106对食管鳞癌的治疗切实有效，有望开发为新型的治疗药物，弥补目前药物选择的不足。

综上，RNF106作为食管鳞癌的预测诊断标志物和潜在治疗靶点，从而在食管鳞癌的诊断、治疗中发挥重要作用，因此具有良好的实际应用之价值。

附图说明

构成本发明的一部分的说明书附图用来提供对本发明的进一步理解，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。

图1为实施例中食管鳞癌细胞及组织中RNF106表达情况；

其中，图1A为生物信息学分析在食管鳞癌中RNF106高表达，RNF106 mRNA表达数据来自TCGA数据库；

图1B为生物信息学分析食管鳞癌中RNF106表达与Hippo/YAP靶基因CTGF的相关性分析；

图1C为生物信息学分析食管鳞癌中RNF106表达与Hippo/YAP靶基因CYR61的相关性分析；

图1D为裸鼠荷瘤实验评估RNF106促进肿瘤生长；

图1E为裸鼠荷瘤实验评估RNF106增加肿瘤重量；

图1F为裸鼠荷瘤实验评估RNF106增加肿瘤体积；

图1G为qRT-PCR示RNF106在裸鼠肿瘤中的敲除效率。

图1H为qRT-PCR示敲除RNF106增加裸鼠肿瘤中YAP靶基因CTGF和CYR61的表达。

图2为实施例中RNF106促进食管鳞癌细胞的增殖；

其中，图2A为Western blot评估在EC9706和NEC细胞系，两种siRNA对RNF106的敲除效率；

图2B为qRT-PCR评估EC9706细胞系，两种siRNA对RNF106的敲除效率；

图2C为qRT-PCR评估NEC细胞系，两种siRNA对RNF106的敲除效率；

图2D为CCK8实验评估敲除RNF106对EC9706细胞的增殖的影响；

图2E为CCK8实验评估敲除RNF106对NEC细胞的增殖的影响；

图2F为流式细胞术实验评估敲除RNF106对EC9706细胞周期的影响；

图3为实施例中RNF106促进食管鳞癌细胞侵袭和迁移；

其中，图3A Transwell实验评估RNF106对食管鳞癌细胞EC9706的侵袭能力；

图3B Transwell实验评估RNF106对食管鳞癌细胞NEC细胞的侵袭能力；

图3C划痕实验评估RNF106对食管鳞癌细胞EC9706的迁移能力；

图3C划痕实验评估RNF106对食管鳞癌细胞NEC的迁移能力；

图4为实施例中RNF106对Hippo信号活性的调控作用；

其中，图4A为Western blot评估小鼠肿瘤中RNF106、LATS2、YAP和磷酸化YAP的蛋白表达水平；

图4B为Western blot评估敲除RNF106后，EC9706细胞中RNF106、LATS2、YAP和磷酸化YAP的蛋白表达水平；

图4C为Western blot评估敲除RNF106后，NEC细胞中RNF106、LATS2、YAP和磷酸化YAP的蛋白表达水平；

图4D为qRT-PCR评估敲除RNF106后，EC9706细胞中YAP靶基因CTGF和CYR61的mRNA表达水平；

图4E为qRT-PCR评估敲除RNF106后，NEC细胞中YAP靶基因CTGF和CYR61的mRNA表达水平；

图4E为荧光素酶报道基因实验评估RNF106对EC9706细胞中TEAD萤光素酶报告基因活性的影响；

图4F为荧光素酶报道基因实验评估RNF106对NEC细胞中TEAD萤光素酶报告基因活性的影响；

图5为实施例中RNF106调控Hippo/LATS2/YAP轴促进食管鳞癌进展；

其中，图5A为Western blot评估敲低RNF106增加的LATS2蛋白水平和磷酸化YAP水平能通过耗尽LATS2来挽救；

图5B为qRT-PCR评估敲除RNF106降低了Hippo靶基因CTGF和CYR61的mRNA水平，并被LATS2敲低所逆转；

图5C为荧光素酶报道基因实验评估RNF106缺失抑制EC9706细胞中的TEAD萤光素酶报告基因活性，通过敲低LATS2来挽救；

图5D为Transwell实验评估敲低RNF106增加了EC9706细胞的侵袭能力，通过敲低LATS2来逆转；

图5E为划痕实验评估敲低RNF106促进EC9706细胞的迁移能力，通过LATS2敲低来逆转。

图6为实施例中RNF106通过其SRA结构域与LATS2结合；

其中，图6A为免疫荧光实验评估，LATS2与RNF106在细胞中的定位；

图6B为内源性免疫共沉淀实验评估RNF106与LATS2在EC9706细胞中的相关性；

图6C为免疫共沉淀实验评估RNF106与LATS2的关联主要存在于细胞质；

图6D为分析确定RNF106的作用结构域，由UBL结构域、TTD结构域、PHD结构域和SRA结构域组成；

图6E为分析确定LATS2的作用结构域，由n端UBA结构域和c端STK结构域组成；

图6F-G为免疫沉淀检测RNF106与LATS2的相互作用域：SRA结构域，而中心结构域(301AA-600AA)负责LATS2与RNF106的关联。

图7RNF106促进LATS2泛素化和降解

其中，图7A为蛋白稳定性实验表明，沉默RNF106显著增强EC9706细胞中LATS2的稳定性；

图7B为RNF106沉默降低LATS2蛋白水平而蛋白酶体抑制剂MG132挽救了LATS2蛋白降低。

图7C为内源性泛素化实验表明RNF106沉默显著降低ESCC细胞中LATS2总泛素化水平；

图7D为内源性泛素化实验表明RNF106过表达显著增强HEK293细胞中LATS2总泛素化水平；

图7E-F内源性泛素化实验表明RNF106促进了k48相关的LATS2泛素化。

具体实施方式

应该指出，以下详细说明都是例示性的，旨在对本申请提供进一步的说明。除非另有指明，本文使用的所有技术和科学术语具有与本申请所属技术领域的普通技术人员通常理解的相同含义。

需要注意的是，这里所使用的术语仅是为了描述具体实施方式，而非意图限制根据本申请的示例性实施方式。如在这里所使用的，除非上下文另外明确指出，否则单数形式也意图包括复数形式，此外，还应当理解的是，当在本说明书中使用术语“包含”和/或“包括”时，其指明存在特征、步骤、操作、器件、组件和/或它们的组合。下列具体实施方式中如果未注明具体条件的实验方法，通常按照本领域技术内的分子生物学的常规方法和条件，这种技术和条件在文献中有完整解释。参见例如Sambrook等人，《分子克隆：实验手册》中所述的技术和条件，或按照制造厂商所建议的条件。

结合具体实例对本发明作进一步的说明，以下实例仅是为了解释本发明，并不对其内容进行限定。如果实施例中未注明的实验具体条件，通常按照常规条件，或按照销售公司所推荐的条件；实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可通过商业途径购买得到。

本领域中已知的RNF106 mRNA的表达数据，应理解，RNF106 mRNA表达数据来自TCGA数据库。

术语“表达水平”是指在特定的时间点体内或样品中存在的基因产物的量。表达水平可以例如通过由基因表达的蛋白质或mRNA来测量/量化/检测。可以例如如下量化表达水平：用相同样品或参考样品(例如，在相同时间从同一个体得到的样品或相同样品的相同尺寸(重量、体积)的部分)中相同类型基因产物的总量(总蛋白质或mRNA)归一化样品中存在的目的基因产物的量，或者确定目的基因产物的量/限定的样品尺寸(重量、体积等)。可以通过本领域已知的任何方法来测量或检测表达水平，所述方法例如用于目的基因产物的直接检测和量化的方法(例如质谱)，或者通常通过目的基因产物与对目的基因产物具有特异性的一种或更多种不同分子或检测装置(例如，引物、探针、抗体、蛋白质支架)结合而工作的用于间接检测和测量目的基因产物的方法。技术人员还已知的是确定基因拷贝的水平，其还包括确定一个或更多个片段的不存在或存在(例如，通过核酸探针或引物，例如定量PCR、多重连接依赖性探针扩增(Multiplex ligation-dependent probe amplification，MLPA)PCR)。

术语“蛋白质水平”指的是物质中蛋白质含量的高低；蛋白质水平可以通过Western Blot进行检测。Western Blot是一种常用于检测蛋白质的分子量和表达水平的实验方法。它可以通过蛋白质在电泳分离后的迁移行为，利用特异性抗体来识别目标蛋白质。Western Blot广泛应用于分子生物学、细胞生物学、免疫学等领域，可用于检测蛋白质的表达、鉴定、定量、纯化以及亚细胞定位等

术语“指标”和“标志”在本发明中可互换使用，并且是指病症的体征或信号或者用于监测病症。这样的“病症”是指细胞、组织或器官的生物状态，或者是指个体的健康和/或疾病状态。指标可以是包括但不限于肽、蛋白质和核酸的分子的存在或不存在，或者可以是细胞、或组织、器官或个体中这样的分子的表达水平或模式变化。指标可以是个体中疾病的发生、发展或存在或者这样的疾病的进一步进展的体征。指标也可以是在个体中发生疾病的风险的体征。

术语指标的水平“上调”、“升高”或“提高”是指与参照相比，样品中这样的指标的水平降低。

术语指标的水平“下调”、“降低”或“下降”是指与参照相比，样品中这样的指标的水平降低。

在原理上，可以通过应用标准统计学方法基于给定RNF106的平均值或中值来对本发明所指定的对象组或群组计算参考量。

如本发明所使用的术语“试剂盒”是指优选地单独提供或提供在单个容器内的上述组分的集合。容器还优选地包含有用于实施本发明方法的说明。在本说明书中已经给出了试剂盒的这些组分的实例及其使用方法。优选地，试剂盒包含在即用型制剂中的上述组分。优选地，试剂盒可另外地包括说明书，例如用于调节组分(例如，检测剂的浓度)以及用于解释关于通过本发明方法所提供诊断的任何测定的结果的用户手册。特别地，这样的手册可以包括用于将确定基因产物的量分配至诊断类型的信息。细节见于本说明书的别处。此外，这样的用户手册可以提供关于正确地使用试剂盒组分用于确定相应生物标志物的量的说明。用户手册可以以纸质或电子形式提供(例如，存储在CD或CD ROM上)。本发明还涉及所述试剂盒在根据本发明的任何方法中的用途。

如本发明所使用的术语“系统”涉及至少包含有效地互相联系以允许进行诊断的上述装置的装置系统。在上文结合本发明的方法公开了优选的用于确定基因产物之甲基化状态或量的装置和用于进行比较的装置。如何以操作方式联系装置将取决于设备中包括的装置的类型。例如，在应用用于自动化确定基因产物的甲基化状态或量的装置的情况下，可以通过例如计算机程序来处理由所述自动化操作装置获得的数据以建立诊断。优选地，在这种情况下，装置包含在单设备中。因此，所述设备可以包括用于确定样品中基因产物的甲基化状态或量的分析单元以及用于处理所得数据用于诊断的评估单元。在上文结合涉及本发明方法的实施方案公开了优选的检测装置。在这种情况下，使装置有效地连接，使得系统的使用者由于手册中给出的说明和解释将量的确定结果及其诊断值结合在一起。在这样的实施方案中装置可以呈现为单独的设备并且优选地作为试剂盒包装在一起。本领域技术人员将了解如何联系装置而无需进一步的创造性技能。优选的设备是可以在没有专业临床医师的特定知识的情况下应用的那些，例如仅需要加载样品的测试条或电子设备。结果可以作为参数诊断原始数据的输出，优选地作为绝对或相对量给出。应理解，这些数据将需要由临床医师解释。然而，还设想了专家系统设备，其中输出包含经处理的诊断原始数据，其解释不需要专业的临床医师。另一些优选设备包含分析单元/设备(例如，生物传感器、阵列、与特异性识别多肽的配体偶联的固体支持物、等离子体表面共振设备、NMR光谱仪、质谱仪等)或上文根据本发明方法提及的评估单元/设备。

本发明的一个具体实施方式中，用于RNF106作为标志物在制备食管鳞癌诊断或辅助诊断产品中的应用。

本发明食管鳞癌生物信息学分析发现，RNF106在食管鳞癌组织中表达量明显高于正常脑组织，且细胞实验结果也证实了这一现象，因此RNF106可作为食管鳞癌的诊断标志物。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，所述产品包含上述用于检测RNF106的物质，该产品用于诊断或辅助诊断食管鳞癌。

其中，检测RNF106的物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测RNF106的表达水平的物质。

所述产品包括但不限于检测待测样本中所述RNF106表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂或试剂盒。

所述待测样本可为人源样本，更具体的，所述待测样本包括受试者(食管鳞癌细胞和/或食管鳞癌组织)。同时，通过配合其他食管鳞癌标志物的联合使用，从而进一步提高检测的特异性和灵敏度。

更进一步的，所述除上述RNF106生物标志物之外，所述产品还可以包括目前适于检测食管鳞癌的其他生物标志物及其组合的物质。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种用于诊断或辅助诊断食管鳞癌的系统，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自上述lncRNA表达水平的检测物质；

ii)评估单元，所述评估单元包含：根据i)中确定的所述RNF106表达水平判断所述受试者是否患有食管鳞癌。

所述待测样品包括受试者食管鳞癌细胞和/或食管鳞癌组织。

本发明的又一具体实施方式中，以上所述检测物质包括但不限于用于RT-PCR、实时定量PCR、原位杂交、基因芯片和基因测序检测RNF106的表达水平的物质。

本发明的又一具体实施方式中，所述评估单元具体评估流程包括：

其中，“参照”可以是合适的对照样品，例如来自正常健康受试者的样品，其没有食管鳞癌相关症状并且没有异常的生理及病理学发现，参照也可以是来自同一受试者的在表现出病症或疾病症状之前或在诊断出食管鳞癌之前的样品。参照可以是经标化的样品，例如，包含来自若干健康受试者样品的材料或数据的样品，这些健康受试者没有食管鳞癌症状，也没有相关生理及病理学发现。

本发明的用于诊断或辅助诊断食管鳞癌的系统，可以是虚拟装置，只要能实现所述分析单元以及评估单元的功能即可。所述的分析单元可以是包括各种检测试剂材料和/或检测仪器设备等；所述评估单元可以是任何可以实现对分析单元的检测结果进行分析处理而得出食管鳞癌患病风险评估状况的运算仪器、模块或是虚拟设备，例如可以是预先将各种可能的检测结果与对应的患病风险情况制定相应的数据图表，将检测单元的检测结果对照该数据图表即能得出食管鳞癌发病风险评估结果。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种诊断或辅助诊断食管鳞癌的方法，所述方法包括：

a)从受试者分离待测样品；

c)将样品中的表达水平与参照中的表达水平进行比较；

与参照中的水平相比，样品中表达水平的上调，则所述受试者为或候选为食管鳞癌患者；反之，则所述受试者不为或不候选为食管鳞癌患者。

本发明的又一具体实施方式中，提供上述RNF106作为靶点在食管鳞癌治疗和/或筛选食管鳞癌药物中的应用。

本发明的又一具体实施方式中，所述食管鳞癌药物为预防和/或治疗食管鳞癌的药物。

本发明的又一具体实施方式中，所述筛选食管鳞癌药物的方法包括：

1)采用候选物质处理表达和/或含有所述RNF106的体系；设置不采用候选物质处理的平行对照；

2)完成步骤1)后，检测体系中所述RNF106的表达水平；与平行对照相比，如果采用候选物质处理的体系中所述蛋白的表达量显著降低，所述候选物质可作为候选的食管鳞癌药物。

本发明的又一具体实施方式中，所述体系可为细胞体系、亚细胞体系、溶液体系、组织体系、器官体系或动物体系。

本发明的又一具体实施方式中，所述细胞体系中的细胞可以为食管鳞癌细胞；

本发明的又一具体实施方式中，所述组织体系中的组织可以为食管鳞癌组织；

本发明的又一具体实施方式中，所述器官体系中的器官可以为食管；

本发明的又一具体实施方式中，所述动物体系中的动物可以为非人哺乳动物，包括但不限于大鼠、小鼠、豚鼠、兔、猴、猩猩等。

本发明的又一具体实施方式中，提供抑制所述RNF106的表达水平的物质在制备产品中的应用；

所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)抑制食管鳞癌细胞增殖；

(a2)抑制食管鳞癌细胞的侵袭和/或迁移；

(a3)促进食管鳞癌细胞凋亡；

(a4)抑制Hippo/LAST2/YAP信号通路；

(a5)抑制食管鳞癌生长；

(a6)提高受试者生存率；

(a7)预防和/或治疗食管鳞癌。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种产品，其活性成分包括抑制所述RNF106的表达水平的物质；所述产品的功能为如下任意一种或多种：

(a1)抑制食管鳞癌细胞增殖；

(a2)抑制食管鳞癌细胞的侵袭和/或迁移；

(a3)促进食管鳞癌细胞凋亡；

(a4)激活Hippo/LAST2/YAP信号通路；

(a5)抑制食管鳞癌生长；

(a6)提高受试者生存率；

(a7)预防和/或治疗食管鳞癌。

本发明的又一具体实施方式中，所述抑制RNF106的表达水平的物质可以以上述RNF106为靶序列且能够抑制所述RNF106表达的干扰分子，具体可包括shRNA(小发夹RNA)、小干扰RNA(siRNA)，dsRNA、微小RNA、反义核酸，或，能表达或形成所述shRNA、小干扰RNA，dsRNA、微小RNA、反义核酸的构建物；还可以包括化合物类小分子抑制剂。

本发明的又一具体实施方式中，上述产品可以为药物或试验试剂，所述试验试剂可供基础研究使用。

当所述产为药物时，所述药物还可包括药学上可接受的载体。所述药学上可接受的载体可为缓冲剂、乳化剂、悬浮剂、稳定剂、防腐剂、赋形剂、填充剂、凝结剂与调和剂、界面活性剂、扩散剂或消泡剂。

所述药物还可包括可药用载体。所述可药用载体可为病毒、微囊、脂质体、纳米颗粒或聚合物及其任意组合。所述可药用载体的递送载剂可为脂质体、生物相容性聚合物(包括天然聚合物和合成聚合物)、脂蛋白、多肤、多糖、脂多糖、人工病毒包膜、无机(包括金属)颗粒、以及细菌或病毒(例如杆状病毒、腺病毒和逆转录病毒)、噬菌体、黏粒或质粒载体。

所述药物还可与其他预防和/或治疗食管鳞癌的药物联用，其他预防和/或治疗性化合物可以与主要的活性成分同时给药，甚至在同一组合物中同时给药。

所述药物还可以以单独的组合物或与主要的活性成分不同的剂量形式单独给予其它预防和/或治疗性化合物。主要成分的部分剂量可以与其它治疗性化合物同时给药，而其它剂量可以单独给药。在治疗过程中，可以根据症状的严重程度、复发的频率和治疗方案的生理应答，调整本发明药物的剂量。

本发明的药物可通过已知的方式施用至体内。例如通过静脉全身递送或者局部注射递送到感兴趣组织中。可选地经由静脉内、经皮、鼻内、粘膜或其他递送方法进行施用。这样的施用可以经由单剂量或多剂量来进行。本领域技术人员理解的是，本发明中有待施用的实际剂量可以在很大程度上取决于多种因素而变化，如靶细胞、生物类型或其组织、待治疗受试者的一般状况、给药途径、给药方式等等。

本发明的又一具体实施方式中，提供一种治疗食管鳞癌的方法，所述方法包括：向受试者施用上述抑制所RNF106的表达水平的物质。

以下通过实施例对本发明做进一步解释说明，但不构成对本发明的限制。应理解这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例

1.材料及方法

1.1细胞培养

实验所用食管鳞癌细胞系NEC、EC9706、HEK293细胞株购自美国型培养标本。EC9706细胞在含有10％胎牛血清(Gibco)和100U mL^-1青霉素/链霉素(Invitrogen)的RPMI-1640(R8758,sigma)中培养。NEC和HEK-293细胞在含10％胎牛血清和100U mL^-1青霉素/链霉素的DMEM培养基(D6429,sigma)中培养。细胞在37℃、5％ CO₂的细胞培养箱中培养。

1.2裸鼠异种移植瘤模型

采用shControl或shRNF106慢病毒载体转导，构建稳定敲除的EC9706细胞细胞系。转导48h后，用1μg/ml嘌呤霉素筛选细胞7d。每只NSG小鼠皮下注射大约1×10⁶个EC9706细胞和Matrigel溶液。每7d测量一次肿瘤大小。6周后，小鼠被处死，并对肿瘤进行称重和拍照。异种移植瘤模型。shControl序列为：5’-GGTTTCCAACCAGGGGGTAA-3’，shRNF106序列为：5’-GGTGTCAGGGTGACGCGGAA-3’。实验在山东第一医科大学附属第一医院&山东省千佛山医院伦理委员会批准的方案下进行。

1.3质粒转染

将人食管鳞癌细胞RNF106 cDNA插入pCMV-Script载体中，构建Myc-RNF106过表达质粒。将LATS2 cDNA插入pCMV-Script载体，构建FLAG-LATS2过表达质粒。HA标记的泛素质粒和HA-K48 Ubi质粒均购自Addgene(#17608，#17605)。Lipofectamine 2000(1662298,Invitrogen)用于质粒转染。

1.4 SiRNA转染

SiRNAs被用来敲除特定基因。RNF106 siRNA序列为：GCGACAUGGCCUUCCACAUdTdT；GGACGAAGUCUUCAAGAUUdTdT。LATS2 siRNA序列为GCUCAUUCCUCUCCAGCUUdTdT。阴性对照siRNA序列为:UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT。使用Lipofectamine^TMRNAiMAX转染试剂(13778075，invitrogen)进行siRNA转染。

1.5提取细胞RNA

为防止RNA降解，全程操作在冰上进行。取出呈对数增长的细胞，弃培养基，用不含RNA酶的冰PBS冲洗细胞，重复一次；对于组织，在液氮下用研杵研磨至粉末状。每5×10⁶个细胞加入1mL Trizol(全式金，中国上海)，静置5min，用移液器反复吹打细胞，待细胞裂解后，移入提前标记好的无RNA酶的EP管内。每1mL Trizol加入20μL氯仿，盖紧EP管并充分震荡混匀，直到液体呈现粉红色。4℃，12000r离心15min，可以看到液体分成上中下三层。取上层水相记录体积，此层含有RNA，千万不要触碰到中间层DNA和下层有机相以免造成RNA污染。加入和上清等体积的异丙醇，轻柔混匀，冰上静置5min。4℃，12000r离心15min，可看到EP管底部有白色沉淀，就是总RNA。弃上清，加入和异丙醇等体积的75％乙醇，轻轻吹打清洗RNA沉淀，4℃，12000r离心3min。重复此步骤一次。弃去上清，打开EP管，将RNA晾干。加入适量DEPC水将RNA沉淀彻底溶解。使用NanoDrop2000分光光度计测RNA浓度，标记好，存放于-80℃。

1.6qRT-PCR

cDNA的合成采用PrimeScript RT试剂盒(Takara)。qRT-PCR使用的试剂和仪器设备：SYBR Green PCR kit(Applied Takara，Japan)，ABI 7300(Applied Biosystems，Carlsbad，CA，USA)。按两步法PCR扩增程序进行qRT-PCR。预变性反应：单一循环为95℃30sec；PCR反应：95℃5sec-60℃20sec，循环数：40。数据处理。根据各样本CT值，取三个复孔平均数为该样品CT值。计算△CT＝CT(目的)-CT(内参)，△△CT＝SCT(实验组)-△CT(对照组)。计算目的基因相对量，然后按照相对表达量结果运用t检验分析，以P<0.05为有统计学意义。

1.7蛋白提取

搜集贴壁细胞后PBS重悬清洗一次，离心后加入适量RIPA细胞及组织裂解液，并加入1％体积蛋白酶抑制剂，冰上裂解30min，12000rpm，4℃离心15min，取上清用BCA法(Vazyme，中国江苏)测蛋白浓度，剩余上清加入上样缓冲液金属浴98℃加热10min，放入-20℃冰箱备用。

1.8Western blot

提取细胞总蛋白，取10％凝胶配置试剂，用1.0mm的玻璃板配置电泳所需凝胶，待胶凝固好后放置于电泳槽内，加入电泳液，拔掉梳子，加入蛋白Marker和待测样品。甲醇中浸泡20s来激活PVDF膜，按照Marker指示条带切取所需凝胶片段，按照黑胶白膜的标准放置于转膜的夹子上，把激活的PVDF膜覆盖于凝胶上，300mA转膜。将转好的PVDF膜用1xTBST摇床洗3min，用5％的脱脂牛奶封闭，室温摇床孵育1.5h。根据说明书配置一抗：RNF106,LATS2,Anti-HA和anti-Myc抗体购自proteintech。YAP,phospho-YAP127和β-Actin抗体购自Cell Signaling Technology。Anti-Flag购自sigma。MG132蛋白抑制剂(HY-13259)购自MCE。Cycloheximide(CHX,01810)购自Sigma-Aldrich。随后将配置好的一抗覆盖PVDF膜，4℃摇床孵育过夜。1×TBST清洗，室温摇床洗5min×3次。按1：1000的比例用5％的牛奶配置一抗相对应来源的二抗，室温摇床孵育1h。弃掉二抗，1×TBST洗，5min×3次。1:1的比例配置Amersham ECL发光液，每张膜有蛋白的一面均匀加上200μL发光液，将PVDF膜放入凝胶成像仪内进行成像并记录。

1.9CCK-8实验

将EC9706和NEC细胞转染siRNF106或siControl 24孔板。转染24h后，细胞计数，将5000个细胞接种到96孔板中，继续培养2h。分别于24h、48h、72h用酶标仪检测450nm处的吸光度。收集数据并分析细胞增殖情况。

1.10流式细胞术检测

采用流式细胞术进行细胞周期分析。收集2×10⁵-1×10⁶个EC9706细胞，离心弃上清。将EC9706转染50μM siControl或siRNF106。细胞去血清饥饿24h。24h后，用70％乙醇固定细胞，碘化丙啶染色。室温避光孵育30分钟。选择最低上样速度，在流式细胞仪上进行检测。

1.11细胞划痕实验

先用marker笔在6孔板背后用直尺均匀划出横线，大约每隔0.5～1cm一道，横穿过孔。每孔至少穿过5条线，在每孔中加入约5×10⁵个细胞，具体数量因细胞不同而不同，掌握为过夜能铺满。第二天用枪头比着直尺，尽量垂直于背后的横线划痕，用PBS洗细胞3次，去除划下的细胞，加入无血清培养基，放入细胞培养箱培养，按0、6、12、24h取样拍照。

1.12Transwell小室检测细胞侵袭

细胞无血清饥饿12h，制备细胞悬液，调整细胞密度为5×10⁵。取200μL细胞悬液种于提前处理好的Transwell小室上室。下室加入500μL含血清的完全培养基。继续常规培养细胞8h。弃掉上、下层培养基，用棉签擦去基质胶和上层的细胞，PBS冲洗两遍，用0.1％的结晶紫染色10min，弃掉结晶紫，PBS洗10min二遍。取出小室，倒置显微镜下拍照。

1.13免疫荧光

将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次，用4％多聚甲醛固定后的细胞，在加入抗体孵育前，Triton X-100对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。通透的时间一般在5-15min。通透后用PBS洗涤3min,重复5次。使用5％ BSA封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min。加入稀释好的一抗(RNF106、LATS2一抗按照1：200稀释，抗体均来自Abcam,美国)室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min。间接免疫荧光需要使用荧光偶联二抗(Invitrogen,Carlsbad,CA)。室温避光孵育1h。PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。细胞用DAPI(Life Technology)反染色。在用假定的淬火试剂处理后，用共聚焦激光扫描显微镜捕获图像。

1.14免疫共沉淀(Co-IP)

细胞转染后24～48h收蛋白，将细胞培养皿放于冰上，用预冷PBS洗三次。加入适量IP细胞裂解缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上裂解10min。用细胞刮轻轻刮下细胞，用移液枪将细胞裂解液转移至干净EP管中，冰上轻轻吹打，避免气泡产生。然后于4℃13000g离心10min后取上清。取少量裂解液转移至干净EP管中，以备Western blot分析。剩余裂解液加40μL相应的带有抗体的琼脂糖珠加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜。免疫沉淀反应后，在4℃以1000g速度离心5min，将琼脂糖珠离心至管底；将上清小心吸去，管底的琼脂糖珠用预冷PBS洗三次。然后加入50μL裂解缓冲液，最后加入12.5μL的5×SDS上样缓冲液，沸水煮5分钟,以游离抗原、抗体、珠子。4℃离心机，最大转速离心10min，取上清，并进行蛋白免疫印迹实验。

1.15体内泛素化实验

分别用Myc-RNF106、Flag-LATS2和HA-Ub表达载体转染细胞24h，然后用MG132(10μM)处理细胞6h。检测Flag-LATS2的泛素化水平：收集细胞，加入适量细胞IP后缓冲液(含蛋白酶抑制剂)，冰上或者4℃裂解30min,12000g离心30min后取上清；取少量裂解液以备Western blot分析，剩余裂解液将1μg相应的抗体和10-50μl来protein A/G-beads加入到细胞裂解液，4℃缓慢摇晃孵育过夜；免疫沉淀反应后，在4℃以3000g速度离心5min，将protein A/G-beads离心至管底；将上清小心吸去，protein A/G-beads用1ml裂解缓冲液洗3-4次；最后加入15μl的2×SDS加样缓冲液，沸水煮10分钟；Western blotting分析，检测Flag-LATS2的泛素化水平。

1.16荧光素酶报告分析

将TEAD荧光素酶报告载体与siRNF106或siControl一起转染EC9706或NEC细胞系，24h后，收集细胞进行检测。荧光素酶报告检测使用双荧光素酶检测试剂盒(Promega)进行。表达Renilla荧光素酶的pRL-TK载体作为内部对照。

1.17统计分析

使用GraphPad Prism 9软件进行统计分析。两个独立组之间的差异用Student'st检验进行检验。生存分析采用Kaplan-Meier分析，log-rank检验。所有其他结果均以三次独立实验的均数±标准差(SD)表示。

1.18统计分析

利用GraphPad Prism 9软件数据分析。两个独立组间的差异采用t检验。生存分析采用Kaplan-Meier分析和log-rank检验。所有数据均以三个独立实验的平均值±SD表示。p<0.05被认为具有统计学意义。(*P<0.05；**P<0.01；***P<0.001；****P<0.0001)

2.1在食管鳞癌组织中RNF106呈高表达状态

首先本发明研究了RNF106在临床样本中的表达情况。来自TCGA数据库的数据显示，与正常组织(11例)相比，RNF106在食管鳞癌组织(82例)中升高(图1A)。此外，RNF106在食管鳞癌患者中的表达与Hippo/YAP靶基因CYR61和CTGF(图1B-C)呈正相关。随后建立了RNF106敲除小鼠模型，与对照组相比，shRNF106组小鼠的肿瘤图像更小(图1D)，小鼠的肿瘤重量和肿瘤体积显著降低(图1E-F)。接下来，本发明检测了对照组和shRNF106组小鼠样品中的mRNA水平。结果显示，与对照组相比，RNF106敲除小鼠中，RNF106和经典Hippo靶基因CTGF和CYR61的表达显著降低(图1G-H)。以上数据提示RNF106在食管鳞癌体内具有促癌作用。

2.2RNF106促进食管鳞癌细胞的增殖

接下来，本发明研究了RNF106在食管鳞癌细胞系EC9706和NEC中的功能。本发明通过siRNAs敲低RNF106的表达，并通过Western blot验证了其干扰效率(图2A-C)。CCK-8实验显示RNF106缺失可抑制EC9706食管鳞癌细胞的增殖(图2C)，也可以抑制NEC食管鳞癌细胞增殖(图2D)。此外，还采用FACS方法检测EC9706细胞的细胞周期。结果表明，RNF106缺失的EC9706细胞G0/G1期延长，说明RNF106有利于细胞有丝分裂，促进细胞增殖(图2F)。

2.3RNF106促进食管鳞癌细胞的侵袭和转移

本发明使用transwell实验进一步检测了两种食管鳞癌细胞的侵袭能力。结果发现，RNF106沉默显著抑制食管鳞癌细胞EC9706和NEC的侵袭能力(图3A-B)。此外，划痕实验发现，沉默RNF106能够阻碍了两种食管鳞癌细胞的迁移能力(图3C-D)。

2.4RNF106能够调控Hippo信号活性

本发明进一步研究了RNF106在Hippo信号通路中的作用。本发明用western blot方法检测小鼠Hippo信号通路中的关键蛋白。结果表明，敲低RNF106可以增强LATS2的表达，磷酸化YAP，但在体内不能磷酸化YAP(图4A)。在NEC和EC9706细胞中，RNF106缺失均未改变YAP蛋白水平，但磷酸化YAP(S127)蛋白水平升高。此外，RNF106缺失导致食管鳞癌细胞LATS2蛋白水平升高(图4B和4c)。此外，RNF106缺失可显著降低NEC和EC9706细胞中CTGF和CYR61的表达(图4D-E)。荧光素酶报告实验表明，RNF106的沉默抑制了TEAD响应元件的活性(图4F-G)。这些结果表明RNF106可以调节Hippo信号的活性。

2.5RNF106通过Hippo/LATS2/YAP轴调控食管鳞癌进展

为了探索食管鳞癌进展与Hippo信号与RNF106功能之间的联系，本发明进行了一些救援实验。Western blotting实验表明，在EC9706细胞中，由于RNF106缺失而升高的LATS2蛋白被LATS2缺失进一步抑制(图5A)。此外，在EC9706细胞中，RNF106的缺失降低了CTGF和CYR61,LATS2的敲除挽救了CTGF和CYR61(图5B)。荧光素酶报告实验显示，通过LATS2沉默，被RNF106缺失抑制的TEAD响应元件的活性得到了恢复(图5C)。此外，transwell实验表明，在EC9706细胞中，LATS2沉默可以挽救RNF106缺失导致的肿瘤细胞侵袭减少(图5D)。划痕实验也表明，LATS2干扰挽救了食管鳞癌细胞的迁移能力(图5E)。

2.6RNF106通过其SRA结构域与LATS2相互作用

进一步研究RNF106在Hippo信号通路中的作用机制。探讨RNF106和LATS2在食管鳞癌细胞中的亚细胞定位。图6A显示LATS2主要定位于细胞质中，而RNF106同时定位于细胞质和细胞核中。内源性免疫共沉淀实验显示，食管鳞癌细胞中RNF106与LATS2相关(图6B)。本发明进一步进行了核质分离结合免疫共沉淀分析。LATS2定位于细胞质，而RNF106在细胞质和细胞核中均有表达。免疫共沉淀实验表明，RNF106与LATS2主要在细胞质中相关(图6C)。然后本发明确定了RNF106和LATS2的相互作用域。RNF106由UBL结构域、TTD结构域、PHD结构域和SRA结构域组成，LATS2由n端UBA结构域和c端STK结构域组成(图6D-E)。本发明建立了缺失结构，并通过免疫沉淀检测了相互作用域。结果显示，RNF106与LATS2的相互作用需要SRA结构域，而中心结构域(301AA-600AA)则负责LATS2与RNF106的关联(图6F-G)。

2.7RNF106促进LATS2的多泛素化和降解

本发明进一步研究了RNF106-LATS2相互作用的生理作用。蛋白质稳定性实验表明，RNF106敲除显著增强了EC9706细胞中LATS2的稳定性(图7A)。此外，敲除RNF106可以降低LATS2蛋白水平，而蛋白酶体抑制剂MG132可以挽救LATS2蛋白水平(图7B)。提示URHF1可能影响LATS2的稳定性。本发明探索了RNF106对LATS2泛素化的作用。内源性泛素化实验表明，在食管鳞癌细胞中，RNF106敲除可以显著降低LATS2的总泛素化(图7C)。这一结果也通过RNF106过表达在HEK293细胞中得到了证实(图7D)。由于k48连接的泛素化能够促进蛋白质的降解，本发明测试了RNF106对LATS2的k48连接泛素化作用。通过转染k48特异性泛素质粒，本发明发现RNF106促进了LATS2的k48连接泛素化(图7E-F)。

最后应说明的是：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，尽管参照前述实施例对本发明进行了详细的说明，对于本领域的技术人员来说，其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分技术特征进行等同替换。凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.RNF106作为标志物在制备食管鳞癌诊断或辅助诊断产品中的应用。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品包括但不限于检测待测样本中RNF106表达水平的引物、探针、芯片、核酸膜条、制剂、试剂盒或生物传感器。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述产品能够通过检测样本中RNF106的表达水平来诊断食管鳞癌，RNF106在食管鳞癌组织中表达量上调。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述产品包括通过基于免疫组化方法、基于定量PCR方法、基于Western blot方法检测样品中RNF106表达的物质以诊断食管鳞癌的产品。

5.一种用于诊断或辅助诊断食管鳞癌的系统，其特征在于，所述系统包括：

i)分析单元，所述分析单元包含：用于确定受试者的待测样品中选自RNF106表达水平的检测物质；

所述评估单元具体评估流程包括：

6.RNF106作为靶点在食管鳞癌治疗、筛选食管鳞癌药物中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于，所述药物包括RNF106和/或其表达产物的抑制剂。