KR102003449B1

KR102003449B1 - 바이오마커로서 rbp2 및 이의 용도

Info

Publication number: KR102003449B1
Application number: KR1020170042223A
Authority: KR
Inventors: 공구; 이정연; 최희주
Original assignee: 한양대학교 산학협력단
Priority date: 2017-03-08
Filing date: 2017-03-31
Publication date: 2019-07-25
Also published as: KR20180103644A

Abstract

본 발명의 바이오마커를 이용하면 에스트로겐 수용체 양성 유방암 환자에서 항 여성 호르몬 치료제에 대한 내성을 진단할 수 있고, 상기 바이오마커를 새로운 치료타겟으로 하여 항암치료 효과를 향상시킬 수 있다.

Description

바이오마커로서 RBP2 및 이의 용도{RBP2 AS A BIOMARKER AND USE THEREOF}

본 발명은 에스트로겐 수용체 양성 유방암에서 항 여성 호르몬 치료제에 대한 내성을 진단할 수 있는 신규한 바이오 마커로서 RBP2 단백질 및 이의 용도에 관한 것이다.

망막아세포종 결합 단백질(Retinoblastoma binding protein 2, RBP2, 또는 JARID1A/KDM5A라고도 불림)은 RB-결합 단백질¹로 처음 발견된 것으로, JARID(Jumonji/ARID domaincontaining protein) 패밀리 중 하나로, 이는 히스톤 H3 리신 4디- 및 트리메틸렌화(H3K4me2/3)² ^, ³를 특이적으로 탈메틸화한다. RBP2는 주로 여러 공동 억제자 복합체⁴ ^- ⁸와 협력하여 H3K4 탈메틸화를 통해 유전자 사일런서로 작용하지만 전사 활성화⁴ ^,9,10에도 관여한다. 많은 증거들이 RBP2가 암 발달에 중요한 역할을 한다는 것을 암시한다. RBP2 는 다양한 인간 종양에서 증폭되거나, 과발현된다¹⁰ ^-13. 또한, RBP2는 여러 종류의 암에서 탈메틸효소 활성-의존적 또는 -독립적인 방식으로 종양형성, 상피간 전이(epithelial-to-mesenchymal transition, EMT), 전이(metastasis) 및 혈관신생(angiogenesis)을 유도한다¹⁰ ^,12-17. 특히, 유방암 및 비소세포폐암(NSCLC)에서 약물 내성에 대한 RBP2 효과가 여러 연구에 의해 제안되었다¹¹ ^,15,18; 그러나 RBP2 약제 내성의 기본이 되는 분자 메커니즘에 대해서는 아직도 잘 이해되지 않고 있다.

호르몬 의존성 유방암 성장을 유도하는 에스트로겐 수용체(Estrogen receptor, ER)는 인간 유방암에서 가장 중요한 바이오 마커 및 치료 표적이다. 에스트로겐-의존적/-비의존적, 유전적 및 비유전적 경로와 같은 ER 활성화를 유도하는 몇 가지 별개의 경로가 있다¹⁹. 표준 경로에서 리간드-결합 ER은 동종 이합체를 형성하고, 핵으로 수송되며, co-활성자 또는 co-억제자의 모집에 의존하여 표적 유전자의 전사를 조절한다²⁰. 또한, DNA 메틸화, 히스톤 아세틸화/탈아세틸화, 히스톤 메틸화와 관련된 많은 후성적인 조절인자는 ER 전사 활성의 조절에 중요한 인자로 등장했다^20-24.

ER 양성(ER+) 유방암 환자의 내분비 치료에서 ER 신호는 에스트로겐 생합성 차단, ER 발현 억제 또는 에스트로겐과의 경쟁과 같은 다양한 경로를 통해 억제된다¹⁹. 타목시펜(Tamoxifen)은 ER에 대한 리간드 결합에 길항 작용을 하는 선택적 에스트로겐 수용체 조절제(SERM)이다. 그것은 에스트로겐 신호 전달 경로를 방해하여 ER+ 유방암의 성장을 억제한다. 이러한 이점에도 불구하고 많은 환자들이 내분비 내성과 암재발을 겪는다²⁵ ^,26. ER의 발현이나 활성 변화, 우회 신호 전달 경로의 활성화와 같은 내분비 치료에 대한 여러 가지 내성 매커니즘이 관찰되었다²⁵ ^,27,28. 또한, ErbB 수용체 패밀리와 IGF1R을 포함한 수용체 티로신 키나아제(receptor tyrosine kinase, ERKB) 경로의 과다 활성화가 ER+ 유방암의 내분비 치료 내성의 주요 원인으로 여겨지고 있다²⁷ ^,29,30. 그러나, ErbB 및 IGF1R 신호전달의 ER-의존적 또는 -비의존적 활성화의 기초가 되는 분자 메커니즘이 완전히 밝혀지지 않고 있다.

에스트로겐 수용체는 유방암에서 잘 알려진 바이오마커로 유방암의 대부분을 차하고 있는 에스트로겐 수용체 양성 유방암을 진단하며, 이를 타겟으로 하는 항 여성 호르몬 치료제에 대한 진단 마커가 되기도 한다. 하지만 에스트로겐 수용체의 양성여부를 진단하는 것만으로는 항-에스트로겐제에 대한 내성을 갖는 환자를 치료하는데 어려움이 있다. 이러한 문제를 해결하기 위해서, 본 발명자는 종래의 에스트로겐 수용체의 양성여부 진단에 더해 항-에스트로겐제에 대한 내성 여부를 진단할 수 있는 바이오 마커를 발굴하여, ER+ 유방암 환자에 대한 새로운 치료 전략을 제시한다. 구체적으로 ER 기능의 변화와 탈메틸효소 활성-의존적 및 -독립적인 방식의 IGF1R 및 ErbB 신호 전달의 활성화를 통해 ER+ 유방암에서 항-에스트로겐제에 대한 내성 촉진에 대한 바이오마커로서 RBP2의 중요한 역할을 확인했다. RBP2는 ER 및 그 보조-조절제(co-regulator)와 협력하여 항-에스트로겐제의 에스트로겐 아고니스트 활성을 유도하여 IGF1R 활성을 향상시킴을 확인했다. 또한, RBP2는 ErbB 수용체의 유비퀴틴 매개 단백질 분해를 억제하고 IGF1R과의 혼선(crosstalk)을 증가시켜 PI3K/AKT 신호전달을 활성화시킴을 확인 했다. 이를 통해 RBP2가 항-에스트로겐제 내성 유방암의 새로운 바이오 마커이자 유망한 치료 표적이 될 수 있음을 확인하여, 본 발명을 완성했다.

이러한 측면에서, 본 발명은 RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암에서 항-에스트로겐제에 대한 약제 내성 판별용 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 환자로부터 얻은 시료에서 RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것;을 포함하는 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 환자의 항-에스트로겐제에 대한 약제 내성 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법을 제공한다.

또한, 본 발명은 RBP2 유전자 발현 억제제; RBP2 단백질 발현 억제제; RBP2 단백질 활성 억제제; 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소(PI3-kinase) 단백질 활성 억제제; EGFR 단백질 활성 억제제; HER2 단백질 활성 억제제; 및 IGF1R 단백질 활성 억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 환자의 항-에스트로겐제에 대한 내성 억제 또는 개선용 약학 조성물을 제공한다.

또한, 본 발명은 RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 환자에 대한 동반진단용 키트에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 RBP2 단백질 및 이를 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는, 항-에스트로겐제에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제 스크리닝용 조성물에 관한 것이다.

또한, 본 발명은 후보물질과 RBP2 단백질 및 이를 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것을 접촉시키고, 상기 후보물질이 RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 억제하는지를 판단하는 것;을 포함하는 항-에스트로겐제에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.

본 발명의 바이오마커로서 RBP2는 유방암에서 항-에스트로겐제에 대한 반응의 유망한 예후 또는 예측인자로서 유방암 환자의 동반진단에 사용할 수 있는 것으로, RBP2의 발현 수준을 측정하여 항-에스트로겐제에 대한 내성을 판별할 수 있고, 상기 내성을 억제 또는 개선 할 수 있으며, RBP2가 항-에스트로겐제에 대한 저항성에 관여하는 경로의 신호전달을 조절함으로써, 기존 치료제의 효능을 향상시킬 수 있다.

도 1a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER+ 유방암에서 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, METABRIC 코호트에서 ER+ 유방암(ER+ case), 호르몬 치료(Hormone therapy+ case) 환자의 전체 생존률(OS) 및 무병 생존율(DFS)에 대한 RBP2의 발현 수준의 영향에 대하여 분석한 결과를 나타내며, 상기 데이터는 Kaplan-Meier 방법을 이용하여 log-rank test로 평가 하였다.
도 1b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER+ 유방암에서 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, 5일 동안 서로 다른 용량의 타목시펜으로 처리된 세포주와 대조군 세포의 생존능을 나타내며, 상기 데이터는 평균±s.d(n = 3)이고, CON 또는 shCON 대비 ** P <0.01, *** P <0.001; RBP2(post hoc LSD 테스트를 시행 한 RM ANOVA) 대비 ^† P <0.05 이며, CON(빈 벡터 대조군); shCON(shRNA 대조군); RBP2(RBP2 야생형 과발현); RBP2H483A(촉매적으로 비활성 RBP2 돌연변이 과다발현) 이다.
도 1c는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER+ 유방암에서 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, RBP2가 유방암 개체 내에서 타목시펜 반응에 미치는 영향을 나타내며, 데이터는 평균±표준편차이고, CON 또는 shCON 대비 ***P < 0.001; E2(post hoc LSD 테스트를 시행한 RM ANOVA) 대비†P < 0.05, ^††† P < 0.001 이다.
도 1d는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER+ 유방암에서 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, 마우스의 이종이식 종양에서 RBP2 및 Ki-67 발현 수준을 면역 조직 화학적으로 확인한 결과로, 스케일 바: 100 μm, 데이터는 평균±표준편차이고, shCON 대비 *P < 0.05, **P < 0.01; E2(post hoc LSD 테스트를 시행한 ANOVA) 대비 ^† P < 0.05 이다.
도 2a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 타목시펜의 E2 아고니트스 효과를 유도함으로써 ER 표적 유전자의 전사를 조절함을 확인한 결과로, MCF7 세포를 이용하여 얻은 ER ChIP-seq(ER ChIP-seq, GSE32222, 64 및 타목시펜-저항성 세포주에서 유전자 발현 어레이(TamR array, GSE14986;65)) 결과와 비교한 결과로서 RNA-seq로부터의 일반적인 유전자 수 및 일반적인 유전자를 나타내는 히트맵(Heatmap)과 벤다이어그램(Venn diagram)이다.
도 2b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 타목시펜의 E2 아고니트스 효과를 유도함으로써 ER 표적 유전자의 전사를 조절함을 확인한 결과로, RNA-seq 분석으로부터 얻은 RBP2 과발현군과 대조군 사이의 유전자 발현 프로파일의 GSEA(Gene Set Enrichment analysis) 결과를 나타낸다.
도 2c는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 타목시펜의 E2 아고니트스 효과를 유도함으로써 ER 표적 유전자의 전사를 조절함을 확인한 결과로, qRT-PCR 분석에 의해 RBP2 과발현 MCF7 세포의 mRNA 수준을 나타내는 것으로, 데이터는 3회 측정의 평균±표준편차이고, 2-tailed Student's t 검정에 기초하여 CON 대비 **P < 0.01, ***P < 0.001 이다.
도 2d는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 타목시펜의 E2 아고니트스 효과를 유도함으로써 ER 표적 유전자의 전사를 조절함을 확인한 결과로, RBP2-과발현(RBP2) MCF7세포 및 RBP2-넉다운(shRBP2) BT474 세포에서 ERE-루시퍼라제 분석결과는 나타내며, 데이터는 3회 측정의 평균±표준편차이고, CON 또는 shCON 대비 ***P < 0.001; RBP2 또는 shRBP2 대비 ^† P < 0.05(LSD post hoc 테스트 따라 ANOVA) 이다.
도 2e는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 타목시펜의 E2 아고니트스 효과를 유도함으로써 ER 표적 유전자의 전사를 조절함을 확인한 결과로, 대조군(CON) 또는 RBP2-과발현(RBP2) MCF7 세포에서 NRIP1 및 CCND1의 mRNA 수준을 qRT-PCR로 분석한 결과를 나타내며, 데이터는 3회 측정의 평균±표준편차이고, CON 대비 *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001; RBP2 대비 ^† P < 0.05(LSD post hoc 테스트 따라 ANOVA) 이다.
도 2f는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 타목시펜의 E2 아고니트스 효과를 유도함으로써 ER 표적 유전자의 전사를 조절함을 확인한 결과로, 각 세포에서 각 항체를 사용하여 공동 면역침전 분석을 수행한 결과를 나타낸다.
도 2g는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 타목시펜의 E2 아고니트스 효과를 유도함으로써 ER 표적 유전자의 전사를 조절함을 확인한 결과로, ERE 및 RBP2 결합 모티프를 함유하는 NRIP1 유전자좌의 프로모터 및 전사 개시 부위 (TSS)의 개략도(상단), NRIP1 프로모터 영역에서 각 단백질 또는 히스톤 마크(histone mark)의 배가 농축을 보여주는 ChIP-qPCR 분석결과(하단)이며, 데이터는 3회 측정의 평균±표준편차이고, CON 대비 ***P < 0.001(2-tailed Student's t 검정) 이다.
도 3a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER 및 NRIP1과 상호협력하고, 후생적으로 IGFBP4 및 IGFBP5를 억제함을 확인한 결과로, 대조군 또는 RBP2 과발현 MCF7 세포의 세포용해물에서 항RBP2, NRIP1 및 HDAC1 항체로 면역침전시킨 면역 블로팅 결과를 나타낸다.
도 3b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER 및 NRIP1과 상호협력하고, 후생적으로 IGFBP4 및 IGFBP5를 억제함을 확인한 결과로, RBP2-과발현 MCF7 세포 또는 대조군의 RNA-seq로부터 IGFBP4와 IGFBP5의 농축 깊이(depth enrichment)를 확인한 결과를 나타낸다.
도 3c는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER 및 NRIP1과 상호협력하고, 후생적으로 IGFBP4 및 IGFBP5를 억제함을 확인한 결과로, IGFBP4 및 IGFBP5 발현의 면역블로팅 결과(상단), qRT-PCR 결과(하단)을 나타내며, 데이터는 3회 측정의 평균±표준편차이고, CON 대비 *P < 0.05, ***P < 0.001; RBP2 대비 ^†† P < 0.01(LSD post hoc 테스트 따라 ANOVA), shCON 대비 ***P < 0.001(2-tailed Student's t 검정) 이다.
도 3d는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER 및 NRIP1과 상호협력하고, 후생적으로 IGFBP4 및 IGFBP5를 억제함을 확인한 결과로, 각 결합 모티프를 포함하는 IGFBP4 및 IGFBP5 유전자좌의 프로모터 및 전사 개시 부위 (TSS)의 개략도(왼쪽), 각 MCF7 안정세포주에서 IGFBP4 및 IGFBP5 프로모터 영역에서 각 단백질 및 히스톤 변형의 폴드 증가(fold enrichment)를 나타내는 ChIP-qPCR 분석(오른쪽)결과를 나타내며, 데이터는 평균±표준편차이고(n=3), CON 대비 ***P < 0.001(2-tailed Student's t 검정) 이다.
도 3e는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER 및 NRIP1과 상호협력하고, 후생적으로 IGFBP4 및 IGFBP5를 억제함을 확인한 결과로, IGFBP4 및 IGFBP5 프로모터 영역에서 표시된 단백질 또는 히스톤 마크의 폴드 농축을 나타내는 ChIP-qPCR 분석결과 이며, 데이터는 평균±표준편차이고(n=3), CON 대비 **P < 0.01, ***P < 0.001; RBP2 대비 ^†† P < 0.01, ^††† P < 0.001(LSD post hoc 테스트 따라 ANOVA) 이다.
도 3f는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER 및 NRIP1과 상호협력하고, 후생적으로 IGFBP4 및 IGFBP5를 억제함을 확인한 결과로, 단백질의 총 수준 및 인산화 수준을 면역블로팅으로 분석한 결과로 IGF1R 신호전달에 RBP2가 미치는 영향을 보여준다.
도 3g는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER 및 NRIP1과 상호협력하고, 후생적으로 IGFBP4 및 IGFBP5를 억제함을 확인한 결과로, RBP2에 의한 IGFBP4 및 IGFBP5 유전자 전사 조절을 나타내는 모식도이다.
도 4a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 IGF1R 및 EGFR/HER2-매개된 PI3K/AKT 경로를 활성화하여 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, 인간 phospho-RTK 어레이를 이용하여 RBP2 과발현 세포에서 phosphokinase 관련 유전자의 활성화를 분석한 결과를 나타낸다.
도 4b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 IGF1R 및 EGFR/HER2-매개된 PI3K/AKT 경로를 활성화하여 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, RBP2 안정화 세포에서 과발현 또는 억제 시 EGFR, HER2 및 IGF1R의 활성화 및 총 발현 수준을 보여주는 웨스턴블랏 및 qRT-PCR 결과이며, 평균±표준편차(n=3), CON 대비 ***P < 0.001(LSD post hoc 테스트에 따라 ANOVA), shCON 대비 ***P < 0.001(2-tailed Student's t 검정) 이다.
도 4c는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 IGF1R 및 EGFR/HER2-매개된 PI3K/AKT 경로를 활성화하여 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, 각 시간 동안 100 ㎍/ml CHX로 면역블로팅하여 단백질 안정성을 정량화하고, 그래프로 나타낸 것으로, 데이터는 평균±표준편차(n=3), CON 대비 **P < 0.01(LSD post hoc 테스트에 따라 RM ANOVA) 이다.
도 4d는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 IGF1R 및 EGFR/HER2-매개된 PI3K/AKT 경로를 활성화하여 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, MG132 (40 μM)의 유무에 따른 세포의 용해물에서 EGFR 및 HER2의 단백질 안정성을 확인한 결과를 나타낸다.
도 4e는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 IGF1R 및 EGFR/HER2-매개된 PI3K/AKT 경로를 활성화하여 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, 유비퀴틴 분석을 이용하여 RBP2 억제 BT474 세포 및 대조군에서 내인성 안정 EGFR 및 HER2 단백질의 유비퀴틴 수준을 분석한 결과를 나타낸다.
도 4f는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 IGF1R 및 EGFR/HER2-매개된 PI3K/AKT 경로를 활성화하여 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, 공동-면역침전분석에 의하여 각 단백질을 검출한 결과를 나타낸다.
도 4g는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 IGF1R 및 EGFR/HER2-매개된 PI3K/AKT 경로를 활성화하여 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, 타목시펜 5μM 및/또는 BKM120 1μM의 처리유무에 따른 RBP2-과발현 MCF7 세포에서 인사화된 AKT 수준을 웨스턴블롯으로 확인한 결과를 나타낸다.
도 4h는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 IGF1R 및 EGFR/HER2-매개된 PI3K/AKT 경로를 활성화하여 타목시펜 내성을 유도함을 확인한 결과로, 5 μM 타목시펜 (Tam), 0.5 μM BKM120 또는 BKM120 및 타목시펜(Tam+BKM120)으로 처리된 각 세포의 콜로니 형성(왼쪽) 및 SRB 분석(오른쪽) 결과를 나타내며, 각 데이터는 3회 실시 평균±표준편차, CON 대비 **P < 0.01, ***P < 0.001(two-tailed Student's t 검정); Tam 대비 ^††† P < 0.001(LSD post hoc 테스트에 따라 RM ANOVA) 이다.
도 5a는 유방암에서 RBP2에 의한 타목시펜 내성의 조절을 설명하는 모식도로, 히스톤 탈메틸화-독립적(왼쪽) 및 -의존적(오른쪽)인 ER 및 ER공동조절자(coregulatory)와 함께 RBP2에 의한 ER 표적 유전자의 조절을 보여주는 모식도이다.
도 5b는 유방암에서 RBP2에 의한 타목시펜 내성의 조절을 설명하는 모식도로, ER + 유방암에서 RBP2에 의한 IGF1R-ErbB-PI3K-AKT 신호전달의 조절을 설명하는 모식도이다.
도 6은 본 발명의 일 실시예에 따라 유방암 환자의 생존 결과에 RBP2 발현이 미치는 영향을 확인한 결과로, 데이터는 Kaplan-Meier 방법을 이용하여 log-rank test로 평가 하였다.
도 7a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER-결합 및 타목시펜내성- 관련 유전자의 발현을 조절함을 확인한 결과로, RNA-seq 분석으로부터 얻은 RBP2 과발현군과 대조군 사이의 차등 유전자 발현 프로파일의 GSEA 결과를 나타낸다.
도 7b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER-결합 및 타목시펜내성- 관련 유전자의 발현을 조절함을 확인한 결과로, 대조군 또는 RBP2 과발현 MCF7 세포의 RNA-seq로부터 RBP2 표적 유전자의 농축 깊이(depth enrichment)를 확인한 결과이다.
도 7c 및 7d는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 ER-결합 및 타목시펜내성- 관련 유전자의 발현을 조절함을 확인한 결과로, 10 nM E2 또는 5 μM 타목시펜(Tam) 존재/부존재 하에서 RBP2 과발현(RBP2) MCF7세포 및 RBP2-넉다운(shRBP2) BT474 세포의 RBP2 표적 유전자의 mRNA 발현 수준의 변화를 확인한 결과로, 평균±표준편차(n=3), CON 또는 shCON 대비 **P < 0.01, ***P < 0.001;RBP2 대비 ^† P < 0.05, ^†† P < 0.01, ^††† P < 0.001(LSD post hoc 테스트에 따라 ANOVA) 이다.
도 8a는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 디메틸화효소 활성-비의존적인 방법으로 NRIP1를 전사적으로 상향조절 함을 확인한 결과로, RIP1 프로모터에서 히스톤 H3K4 메틸화의 증가를 나타내는 ChIP-qPCR 분석 결과이며, 데이터는 3회 측정 평균±표준편차, CON 대비 ***P < 0.001(two-tailed Student's t 검정) 이다.
도 8b는 본 발명의 일 실시예에 따라 RBP2가 디메틸화효소 활성-비의존적인 방법으로 NRIP1를 전사적으로 상향조절 함을 확인한 결과로, 각 세포주에서의 면역블로팅 및 qRT-PCR를 이요하여 NRIP1 발현을 분석한 결과로, 데이터는 3회 측정 평균±표준편차, CON 또는 shCON 대비 ***P < 0.001(two-tailed Student's t 검정) 이다.

이하에서, 본 발명의 에 대하여 상세히 설명한다.

다만, 본 발명은 다양한 변경을 가할 수 있고 여러 가지 형태를 가질 수 있는 바, 이하에서 기술하는 특정 실시예 및 설명은 본 발명의 이해를 돕기 위한 것일 뿐, 본 발명을 특정한 개시 형태에 대해 한정하려는 것이 아니다. 본 발명의 범위는 본 발명의 사상 및 기술 범위에 포함되는 모든 변경, 균등물 내지 대체물을 포함하는 것으로 이해되어야 한다.

본 발명에서 특별히 다른 언급이 없는 한, "RBP2"로 지칭하는 경우는 RBP2 유전자 또는 RBP2 단백질을 모두 포함하는 의미로 해석된다(NCBI 서열 등록번호: NM_001042603.2). 또한, RBP2, RBP2 유전자 또는 RBP2 단백질은 이들과 실질적으로 동일한 활성을 갖는 이들의 단편이 포함되는 것으로 해석된다. 따라서, 본 발명에서 RBP2의 발현 수준은 RBP2 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 이로부터 발현되는 RBP2 단백질 발현 수준을 포함하는 의미이다.

본 발명에서 "mRNA 발현 수준을 측정하는 제제"는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명에서 "프로브"는 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미한다. 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태를 포함한다.

본 발명에서 "프라이머"는 짧은 자유 3'말단 수산화기(free 3'hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로서, 상보적인 주형(template)과 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형 가닥 복제를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응을 위한 시약(DNA 중합효소 또는 역전사효소) 및 상이한 4가지 dNTP(deoxynuleoside triphosphate)의 존재 하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다.

본 발명에서 프라이머는 RBP2 단백질을 코딩하는 유전자에 특이적으로 결합할 수 있는 프라이머로, 바람직하게 7개 내지 50개의 뉴클레오타이드 서열을 가진 센스(전향) 및 안티센스(후향) 핵산으로 구성될 수 있다. 프라이머는 DNA 합성의 개시점으로 작용하는 프라이머의 기본 성질을 변화시키지 않는 추가의 특징을 혼입할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머 핵산 서열은, 필요한 경우 분광학적, 광화학적, 생화학적, 면역화학적 또는 화학적 수단에 의해 직접적으로 또는 간접적으로 검출 가능한 표지를 포함할 수 있다.

한 구체예에서, 프라이머는 RBP2 단백질을 코딩하는 유전자의 mRNA에 상보적인 센스 및/또는 안티센스 프라이머일 수 있다. 센스 또는 안티센스 프라이머를 단독으로 포함할 수도 있고, 센스 및 안티센스 프라이머를 함께 포함할 수도 있다.

본 발명의 프라이머 또는 프로브는 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다.

본 발명에서 "단백질 수준을 측정하는 제제"는 단백질에 특이적으로 결합하는 항체일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

본 발명은 RBP2 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암에서 항-에스트로겐제에 대한 약제 내성 판별용 조성물에 관한 것이다.

본 발명에서 "항-에스트로겐제(anti-estrogenic agent)"는 에스트로겐의 생산, 분비, 전달 및 중추와 생식기에서의 모든 작용에 대해 억제 작용을 하는 물질을 모두 포함하는 의미이다. 상기 항-에스트로겐제는 항 여성 호르몬 치료제, 항에스트론제 또는 에스트로겐억제물질 등의 용어로 대체되어 사용될 수 있다.

상기 항에스트로겐제는 바람직하게 트리페닐에칠(triphenylethylene)계 화합물 일 수 있다. 상기 항에스트로겐제는 에스트로겐 수용체에 대해 에스트라디올과 결쟁적으로 결합하며, 에스트로겐 수용체에 결합 후, 핵 내 결합부로 이동하는 기작을 가지며, 에스트로겐 수용체의 구조적인 변형을 유도하여 RNA 전사를 양적 및 질적으로 변화시켜 세포 증식을 저해하는 역할을 한다.

그러나, ER 양성 유방암 환자의 1/3 정도가 항에스트로겐제에 대한 반응을 보이지 않는 내성을 가지고 있어, 내분비 치료의 실패 및 부정적인 예후가 나타난다. 따라서, 상기 항에스트로겐제에 대한 내성을 예측, 진단할 수 있는 바이오 마커의 개발이 필요하며, 이를 통해서 항-에스트로겐제를 이용한 내분비 치료의 예후를 예측할 수 있다. 본 발명의 발명자는 이와 관련하여 RBP2의 과발현이 ErbB 신호전달 활성화를 통한 PI3K/AKT 신호전달을 활성화하여 항에스트로겐제에 대한 내성을 유발함을 밝혔고, 또한, 상기 RBP2의 과발현을 억제하는 경우, 항에스트로겐제에 대한 내성을 억제 또는 개선할 수 있음을 실험적으로 확인 했다.

구체적인 예로, 상기 항에스트로겐제는 타목시펜(tamoxifen), 클로미펜(clomiphene), 나폭시딘(nafoxidine), 졸라덱스(Zoladex), 아나스트로졸(Anastrozole) 및 레트로졸(Letrozole)로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에 따른 바람직하게 예로 타목시펜 일 수 있다.

상기 RBP2 유전자 또는 RBP2 단백질 발현 억제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오티드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군에서 선택된 것 일 수 있다.

상기 RBP2 단백질 활성 억제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스(Peptide Minetics), 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

상기 타목시펜(tamoxifen)은 에스트로겐 수용체(ERα, ERβ)와 함상배위자의 일종으로, ERα, ERβ에 대해, 에스트로겐과 경합, 결합하여 수용체의 위치구조변화를 야기하는 성호르몬수용체 작용제 중 하나이다. 세포증식 억제성 및 세포독성 제제로, 호르몬 의존성 유방암 세포를 자극해 전환성장인자 베타(TGF beta)를 분비하여, 이 인자에 의한 유방암 세포를 억제할 수 있다.

상기 방법은 시료에서 RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현이 대조군 보다 높은 경우, 항-에스트로겐제에 대한 약제 내성이 있는 것으로 판별하는 것;을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 대조군 또는 대조시료는 동일 시료에 항-에스트로겐제 처리 전의 RBP2 발현 수준, 동일 개체에서 항-에스트로겐제의 처치 전의 RBP2 발현 수준이거나, 또는 ER+ 유방암 환자에서 평균적인 RBP2 발현 수준 일 수 있다. 또는, 암을 갖지 않는 정상 개체에서 평균적인 RBP2 발현 수준 일 수 있다.

일 구현예에 있어서, ER+ 종양이 있거나 호르몬 치료를 받은 환자의 시료에서 RBP2 mRNA 발현 수준을 측정 및 층화하여 과발현 여부를 판단 하였다. 구체적으로 일루미나 (Illumina)의 HT-12 v3 플랫폼 이용을 기준으로 하여 얻은 mRNA 발현 값의 log2 정규화한 세기에 따라, 상위 40%는 9.15 이상이었고, 하위 40%의 mRNA 발현 값의 log2 정규화한 세기(normalized intensity)가 8.36 이하 였다.

또한, 상기 방법은 약제 내성이 있는 것으로 판별된 시료의 개체에게 RBP2 유전자 발현 억제제; RBP2 단백질 발현 억제제; RBP2 단백질 활성 억제제; 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소(PI3-kinase) 단백질 활성 억제제; EGFR 단백질 활성 억제제; HER2 단백질 활성 억제제; 및 IGF1R 단백질 활성 억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상과 항-에스트로겐제를 함께 처방하는 것;을 더 포함할 수 있다.

본 발명에서 시료는 혈액 또는 생검조직일 수 있고, 구체적으로 암(종양)을 갖는 개체로부터 얻은 것 일 수 있으며, 더욱 구체적으로 ER 양성 유방암으로 의심되거나, 진단 또는 판별된 개체로부터 얻은 것 일 수 있다.

본 발명에서 "개체" 또는 "환자"는 척추동물일 수 있고, 구체적으로 포유동물 일 수 있으며, 상기 포유동물은 개, 말, 고양이, 소, 영장류, 마우스 및 랫트를 모두 포함하는 것으로, 바람직한 구현예에 따라 인간 일 수 있다.

예를 들어, 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하기 위한 방법으로 RT-PCR, 경쟁적 RT-PCR, RNase 보호 분석법, 노던 블랏팅, DNA 칩, 나노스트링, 또는 RNA 서열을 이용한 RNA 분석법 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 상기 검출 방법들을 통해서 약제 내성 판별 여부가 필요한 개체의 생물학적 시료의 mRNA 발현량과 대조시료에서의 mRNA 발현량을 확인할 수 있고, 또는 생물학적 시료의 mRNA 발현여부(과발현, 음성 또는 양성 여부)를 확인하여 항 에스트로겐제에 대한 약제 내성 여부를 판별할 수 있다.

한 구체예에서, 생물학적 시료의 RBP2 유전자의 mRNA 발현 또는 이로부터 발현되는 단백질의 발현이 증가 또는 과발현 된 경우가 항 에스트로겐제에 대한 약제 내성 판별의 지표일 수 있다. 또는, 항 에스트로겐제 처리/처치 후 RBP2 유전자의 mRNA 발현 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준이 항 에스트로겐제 처리/처치 전 RBP2 유전자의 mRNA 발현 또는 이로부터 발현되는 단백질 발현 수준 보다 높은 경우 약제 내성이 있는 것으로 판별할 수 있다.

또한, 본 발명은 RBP2 유전자 발현 억제제; RBP2 단백질 발현 억제제; RBP2 단백질 활성 억제제; 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소(phosphatidyl inositol 3-kinase) 단백질 활성 억제제; EGFR 단백질 활성 억제제; HER2 단백질 활성 억제제; 및 IGF1R 단백질 활성 억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하는, 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 환자의 항-에스트로겐제에 대한 내성 억제 또는 개선용 약학 조성물을 제공한다.

본 발명의 일 실시예에서, RBP2이 과발현 되는 경우, ErbB 신호전달을 활성화, IGF1R/EGFR/HER2 신호를 활성화하여 항에스트로겐제에 대한 약제 내성의 생성을 유도할 수 있음을 밝혔는바, RBP2 과발현 억제, ErbB 신호전달 저해, 또는 PI3k/AKT 신호전달 저해를 통해서, 항에스트로겐제에 대한 약제 내성을 개선 또는 억제할 수 있음을 확인 하였고, 타목시펜과 부파리십(Buparlisib)을 함께 처리한 경우, 항에스트로겐제에 대한 내성이 극복되었음을 확인하였다.

이러한 측면에서, 본 발명의 조성물은 항-에스트로겐제와 동시 또는 순차적으로 병용 투여되는 것일 수 있다. 상기 항-에스트로겐제와 병용하여 본 발명의 저항성 억제 또는 개선용 약학 조성물을 투여하는 경우, 상기 항-에스트로겐제에 의하여 유도된 저항성을 개선할 수 있고, 항-에스트로겐제에 의한 저항성의 생성을 억제할 수 있어, 종래 치료제의 효과를 개선할 수 있는 장점이 있다.

본 발명은 항-에스트로겐제;와 RBP2 유전자 발현 억제제; RBP2 단백질 발현 억제제; RBP2 단백질 활성 억제제; 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소(phosphatidyl inositol 3-kinase) 단백질 활성 억제제; EGFR 단백질 활성 억제제; HER2 단백질 활성 억제제; 및 IGF1R 단백질 활성 억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상;을 함께 처방함으로써 ER 양성 유방암 환자에서 항-에스트로겐제에 대한 내성 유발을 억제 및 내성을 개선할 수 있음을 밝힌데 그 의의가 있는 바, 본 발명의 항-에스트로겐제와 상기 단백질 활성 억제제는 본 발명의 기술 분야에서 사용되거나 억제 활성이 있는 것으로 밝혀진 것이라면 그 종류에 상관없이 본 발명에 적용될 수 있고, 구체적인 종류에 한정되는 것은 아니다.

상기 포스파티딜이노시톨 3-인산화효소(phosphatidyl inositol 3-kinase) 활성 억제제는 부파리십(Buparlisib), 아이데라리십 (Idelalisib), RG7604, IPI-145, 페리포신(periforsine), 두베리십(duvelisib), 아페리십(apelisib; Novel Agents Show Promise Against Endocrine-resistant Breast Cancer. July 2016), TGR1202(RP5264), 코판리십(copanlisib, BAY 80-6946), PX-866(Howes, AL; Chiang, GG; Lang, ES; Ho, CB; Powis, G; Vuori, K; Abraham, RT (2007). "The phosphatidylinositol 3-kinase inhibitor, PX-866, is a potent inhibitor of cancer cell motility and growth in three-dimensional cultures". Molecular cancer therapeutics. 6 (9): 2505-14. doi:10.1158/1535-7163.MCT-06-0698. PMID 17766839), 닥토리십(Dactolisib, Liu, TJ; Koul, D; Lafortune, T; Tiao, N; Shen, RJ; Maira, SM; Garcia-Echevrria, C; Yung, WK (2009). "NVP-BEZ235, a novel dual phosphatidylinositol 3-kinase/mammalian target of rapamycin inhibitor, elicits multifaceted antitumor activities in human gliomas". Molecular cancer therapeutics. 8 (8): 2204-10. doi:10.1158/1535-7163.MCT-09-0160. PMC 2752877Freely accessible. PMID 19671762), CUDC-907(Novel Agents Show Promise Against Endocrine-resistant Breast Cancer. July 2016), ME-401(New PI3K Delta Inhibitor to Treat Blood Cancers Shows Promise in Early Clinical Study May 2, 2016. Ines Martins), IPI-549(http://www.prnewswire.com/news-releases/infinity-provides-company-update-and-reports-first-quarter-2016-financial-results-300262893.html), SF1126(Definition of pan-PI3K/mTOR inhibitor SF1126 - National Cancer Institute Drug Dictionary. Cancer.gov. Retrieved on 2010-11-05.), RP6530(Rhizen Pharmaceuticals SA. "Rhizen Pharmaceuticals S.A. announces initiation of a "First in Human" Phase-1 trial of RP6530, a dual PI3K delta/gamma inhibitor, in patients with hematological malignancies". GlobeNewswire News Room.), INK1117(Sarker, D; Ang, JE; Baird, R; Kristeleit, R; Shah, K; Moreno, V; Clarke, PA; Raynaud, FI; Levy, G; Ware, JA; Mazina, K; Lin, R; Wu, J; Fredrickson, J; Spoerke, JM; Lackner, MR; Yan, Y; Friedman, LS; Kaye, SB; Derynck, MK; Workman, P; de Bono, JS. "First-in-human phase I study of pictilisib (GDC-0941), a potent pan-class I phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) inhibitor, in patients with advanced solid tumors". Clin Cancer Res. 21: 77-86. doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-0947. PMC 4287394Freely accessible. PMID 25370471.), 픽티리십(pictilisib; Sarker, D; Ang, JE; Baird, R; Kristeleit, R; Shah, K; Moreno, V; Clarke, PA; Raynaud, FI; Levy, G; Ware, JA; Mazina, K; Lin, R; Wu, J; Fredrickson, J; Spoerke, JM; Lackner, MR; Yan, Y; Friedman, LS; Kaye, SB; Derynck, MK; Workman, P; de Bono, JS. "First-in-human phase I study of pictilisib (GDC-0941), a potent pan-class I phosphatidylinositol-3-kinase (PI3K) inhibitor, in patients with advanced solid tumors". Clin Cancer Res. 21: 77-86. doi:10.1158/1078-0432.CCR-14-0947. PMC 4287394Freely accessible. PMID 25370471.), XL147(SAR245408, Clinical trial number NCT01042925 at ClinicalTrials.gov), XL765(SAR245409, Clinical trial number NCT00485719 at ClinicalTrials.gov), Palomid529(Clinical trial number NCT01033721 at ClinicalTrials.gov), GSK1059615(GSK Clinical Register: PIK111051), ZSTK474(A Safety Study of Oral ZSTK474 in Patients With Cancer, https://clinicaltrials.gov/ct2/show/NCT01280487), PWT33597(Pathway Receives $7.5M Boost to Take Lead PI3K/mTOR Inhibitor into Clinical Development. 25 May 2011), IC87114(Crabbe, T (2007). "Exploring the potential of PI3K inhibitors for inflammation and cancer". Biochemical Society Transactions. 35 (Pt 2): 253-6. doi:10.1042/BST0350253. PMID 17371252.), TG100-115, CAL263(Study to Investigate Effects of CAL-263 in Subjects With Allergic Rhinitis Exposed to Allergen in an Environmental Chamber), RP6503(http://www.atsjournals.org/doi/abs/10.1164/ajrccm-conference.2013.187.1_MeetingAbstracts.A3880, Preclinical Efficacy Of RP6503, A Novel, Dual PI3Kδ/γ Inhibitor In Airway Disorders), PI-103(Werzowa, J; Koehrer, S; Strommer, S; et al. (4 November 2010). "Vertical Inhibition of the mTORC1/mTORC2/PI3K Pathway Shows Synergistic Effects against Melanoma In Vitro and In Vivo". Journal of Investigative Dermatology. 131 (2): 495-503. doi:10.1038/jid.2010.327. PMID 21048785.; Fan (Nov 2010). "Akt and Autophagy Cooperate to Promote Survival of Drug-Resistant Glioma". Science Signaling. 3 (147): ra81. doi:10.1126/scisignal.2001017. PMC 3001107Freely accessible. PMID 21062993.), GNE-477 및 AEZS-136(http://www.marketwatch.com/story/aeterna-zentaris-presents-preclinical-data-for-its-anti-cancer-pi3k-erk-12-inhibitor-aezs-136-at-aacr-meeting-2012-04-03-73000)로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 EGFR 단백질 활성 억제제는 라파티닙(Lapatinib), 엘로티닙(Erlotinib), 제피티닙(Gefitinib) 및 세툭시맙(Cetuximab)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 HER2 단백질 활성 억제제는 허셉틴(Trastuzumab), 라파티닙(Lapatinib) 및 퍼투주맙(Pertuzumab)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 IGF1R 단백질 활성 억제제는 달로투주맙(Dalotuzumab), 가니투맙(Ganitumab) 및 피지투무팝(Figitumumab)으로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.

상기 RBP2 유전자 또는 RBP2 단백질 발현 억제제는 RBP2 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상 일 수 있다.

상기 단백질 활성 억제제는 상기 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 펩티드, 펩티드 미메틱스, 앱타머, 항체 및 천연물로 구성된 군으로부터 선택된 하나 이상일 수 있다.

본 발명은 또한, RBP2 단백질 및 RBP2 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는, 항-에스트로겐제에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제 스크리닝용 조성물 을 제공한다.

본 발명은 또한, 후보물질과 RBP2 단백질 및 RBP2 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것을 접촉시키고, 상기 후보물질이 접촉된 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 변화시키는지 확인하는 것을 포함하는 포함하는 항-에스트로겐제에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제를 스크리닝하는 방법을 제공한다.

상기 스크리닝 방법은 상기 후보물질이 접촉된 단백질 또는 유전자의 발현 수준을 후보물질과 접촉하기 전 보다 감소시키는 경우, 상기 후보물질은 항-에스트로겐제에 대한 내성 억제 또는 개선활성이 있는 것으로 판별하는 것;을 더 포함할 수 있다.

위에서 기술한 바와 같이, RBP2 단백질 또는 RBP2 단백질을 코딩하는 유전자의 발현이나 활성을 억제하면 항-에스트로겐제에 대한 저항성을 유발하는 ErbB 신호 전달의 활성화를 저해하여 내성의 유발을 억제 또는 개선할 수 있으므로, 상기 물질은 항-에스트로겐제에 대한 저항성 억제 또는 개선용 의약으로서 사용될 수 있다.

단백질 또는 mRNA와 후보물질 간의 반응 확인은 단백질-단백질, 단백질-화합물, DNA-DNA, DNA-RNA, DNA-단백질, DNA-화합물, RNA-단백질, RNA-화합물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다. 예를 들면, 생체 외부에서(in vitro) RBP2 유전자와 후보 물질 사이의 결합 여부를 확인하기 위한 혼성화 시험, 포유류세포와 시험대상물질을 반응시킨 후 노던 분석, 정량적 PCR, 정량적 실시간 PCR 등을 통한 상기 유전자의 발현율 측정 방법, 또는 상기 유전자에 리포터 유전자를 연결시켜 세포 내로 도입한 후 시험대상물질과 반응시키고 리포터 단백질의 발현율을 측정하는 방법, RBP2 또는 PI3k 단백질과 후보 물질을 반응시킨 후 활성을 측정하는 방법, 효모 이중 혼성법(yeast two-hybrid), RBP2 단백질에 결합하는 파지 디스플레이 펩티드 클론(phage-displayed peptide clone)의 검색, 천연물 및 화학물질 라이브러리(chemical library) 등을 이용한 HTS(high throughput screening), 드럭 히트 HTS(drug hit HTS), 세포 기반 스크리닝(cell-based screening), 또는 DNA 어레이(DNA array)를 이용하는 스크리닝법 등을 사용할 수 있다.

상기 스크리닝용 조성물은 유효성분 외에도, 핵산 또는 단백질의 구조를 안정하게 유지시키는 증류수 또는 완충액을 포함할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝용 조성물은 생체 내(in vivo) 실험을 위해, 상기 RBP2 또는 PI3k를 발현하는 세포, 또는 전사율을 조절할 수 있는 프로모터 하에 RBP2 또는 PI3k를 발현하는 플라스미드를 함유하는 세포 등을 포함할 수 있다. 또한, 상기 스크리닝용 조성물은 유효성분 외에도, 후보물질 간의 반응 확인 방법에 따라 Dvl을 추가로 포함할 수도 있다.

본 발명의 스크리닝 방법에서, 시험대상물질은 통상적인 선정방식에 따라 항-에스트로겐제에 대한 저항성 억제 또는 개선하는 의약으로서의 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 단백질, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있다.

본 발명은 또한, RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 유방암 환자에 대한 동반진단용 조성물, 키트 또는 동반 진단 시스템 제공한다.

상기 키트는 RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함할 수 있다. 또한, 에스트로겐 수용체(ER) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함할 수 있다.

일 구체예에서, 유방암 시료로부터 ER 양성여부를 확인 하고, RBP2의 mRNA 발현 수준을 확인하여, 항에스트로겐제에 대한 처방 여부를 결정할 수 있다.

본 발명에서 동반진단(Companion Diagnostic)이란, 특정 치료 약물을 특정 환자에 적용하기 위한 가능성을 확인하기 위한 진단 테스트 중 하나를 의미하는 것이다. 따라서, 이러한 측면에서 본 발명은 항-에스트로겐제에 대한 저항성 판별용 조성물, 키트 또는 시스템일 수 있다.

상기 키트는 통상적인 mRNA 및 단백질 정량 분석에 기반한 진단 키트를 제한 없이 포함한다. 예를 들어, 키트는 RT-PCR 키트, DNA 칩 키트, 단백질 키트 또는 어레이 키트일 수 있다. RT-PCR 키트의 경우, RBP2 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTP), Taq-폴리머라아제 및 역전사 효소와 같은 효소, DNase, RNase 억제제, 멸균수 등을 포함할 수 있다.

이하, 본 발명을 실시예 및 실험예를 통해 상세히 설명한다. 하기 실시예 및 실험예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐 본 발명의 범위가 이들에 한정되는 것은 아니다.

[실시예]

실험의 준비 및 방법

1. Survival Analysis using METABRIC

연관성을 분석 하였다. METABRIC 데이터베이스는 cbioportal(http://www.cbioportal.org)에서 다운로드 받아 OS와 DFS를 분석했다. ER+ 종양이 있거나 호르몬 치료를 받은 환자는 RBP2 mRNA 발현에 따라 상위 40 %와 하위 40 % 수준으로 층화시켰다.

2. RNA-sequencing Analysis and Data Collection

총 RNA는 TRIzol RNA Isolation 시약(Life technologies, Carlsbad, CA)을 사용하여 대조군 또는 RBP2 과발현 MCF7 세포에서 추출 하였다. RNA 무결성(integrity)은 Agilent RNA 6000 Pico Kit(Agilent, Santa Clara, CA)를 사용하여 바이오애널라이저(bioanalyzer) 확인했다. 분리 된 총 RNA는 제조사의 지침에 따라 TruSeq stranded mRNA 샘플 제조 키트(Illumina, San Diego, CA)를 사용하여 mRNA 시퀀싱 라이브러리를 준비하기위해 처리하였다. 모든 샘플은 75-bp 페어드-엔드 고처리 키트로 Illumina NextSeq 500 시퀀서를 사용하여 시퀀싱 되었다. 원본 이미지 데이터는 시퀀스 데이터로 염기-콜링(base-calling)에 의해 변환되고 FASTQ 형식으로 저장되었다. 6 개의 독립 샘플에 대한 페어드-엔드 리드는 Cutadapt 를 사용하여 PCR 및 시퀀싱 어댑터 모두에 맞게 조정되었다. 조정된(Trimmed) 리드는 STAR⁵⁹를 사용하여 hg19 인간 표준유전체(human reference genome)에 맞춰 얼라인하였다. 유전자 발현의 정량화는 커프스 링크를 사용하여 FPKM 값을 계산하였다⁶⁰. 유전자 발현 수준에서 Cuffdiff⁶¹을 사용하여 유의적으로 차이가나는 발현 여부를 결정 하였다. 모든 유전자는 대조군과 RBP2 과발현 군간에 적어도 1.5 배(fold)의 변화를 나타낸다. 이 데이터는 수령 번호 GSE92943로 Gene Expression Omnibus(GEO)에 기탁되었다.

R 언어를 사용하여 유전 발현 차이의 히트맵(heatmap)을 제작했다. 두 집단간에 발현된 유전자의 차이를 기능적으로 분류하기 위해, GSEA(gene set enrichment analysis)를 GSEA의 버전 2.2를 사용하여 Molecular Signatures Database의 5.2 버전에 있는 모든 유전자 세트에 대해 실행하고 다중 가설 테스트를 수정했다; FDR 임계값은 ≤0.25⁶²로 설정되었다. 두 유전자 세트에서 공통적인 유전자 세트를 평가하기 위해 Fisher's 정확 검정을 사용했다. RNA-seq에 의해 동정된 RBP2 표적 유전자와 비교하기 위해, MCF7 야생형 세포(GSE32222)의 ER ChIP-seq 프로파일 및 타목시펜 내성 유방암 세포(GSE14986)의 유전자 발현 마이크로어레이 프로파일을 GEO 데이터베이스로부터 다운로드하여 재분석 하였다.

3. 포스포-RTK 어레이

여러 RTK의 인산화 수준은 제조사의 지침(R&D 시스템)에 따라 Human Phospho-RTK 어레이 키트를 사용하여 평가하였다. 대조군 또는 RBP2 과발현 MCF7 세포로부터의 희석된 용해물을 인간 포스포키나아제 어레이 멤브레인과 함께 인큐베이션하고, 결합된 포스포단백질을 키트와 함께 제공된 지침에 따라 분석 하였다. 각각의 멤브레인은 키나아제 특이적 및 참조 대조군 항체를 함유하고 있다. 각 스팟은 픽셀 밀도를 표준화함으로써 정량화되었다.

4. 동소 이종이식(Orthotopic Xenograft)

모든 동물실험은 한양대학교 실험동물운영위원회(서울, 대한민국)의 승인을 받아 수행되었다. 5 주령 암컷 NOD/SCID 마우스는 KOATECH(평택, 대한민국)에서 구입하였다. 타목시펜 내성에 대한 RBP2의 효과를 결정하기 위해, 암세포 주입 전에 E2 펠렛(0.72 mg/펠렛, 60 일 방출)을이 마우스에 이식 하였다. 1 주 후, 인산염 완충 생리 식염수(PBS)에 현탁된 4x10⁶ 대조군 또는 RBP2 과발현 MCF7 세포 및 2x10⁶ 대조군 또는 RBP2-결핍 BT474 세포를 Matrigel(BD bioscience, USA)과 혼합하고, 마우스의 유방 지방 패드의 양쪽에 주입하였다. 1 주일 후, 상기 마우스에 공지된 방법에 따라⁶³ 플라세보 또는 타목시펜 펠렛(5mg/펠렛; 60 일 방출)을 피하 주사로 주입했다. 종양 성장은 일주일에 두 번 맹검 방식으로 관찰하고 종양 부피는 1/2 x(긴 직경) x(짧은 직경)²로 계산되었다.

5. 통계

SPSS(버전 12.0; SPSS, Inc., Chicago, IL, USA)를 사용하여 unpaired Student's t 검정을 사용하여 실험군과 대조군 간의 통계적 유의성을 분석하였다. 여러 그룹 비교 및 반복 측정의 경우, Welch ANOVA 및 반복 측정 ANOVA 다음에 불균등 분산에 대한 사후 LSD 검정을 사용했다. P 값 < 0.05인 경우 통계적 유의성을 나타냈다.

6. 세포 배양 및 약물 처리

MCF7, T47D 및 BT474를 포함한 인간 유방암 세포주는 American Type Culture Collection(ATCC, Manassas, VA, USA)에서 구입하였고, 10% 태아 소혈청을 함유한 페놀레드-프리 Dulbecco's 수정 Eagle's 배지(DMEM)에서 배양하였다(Welgene, Daegu, Republic of Korea). 호르몬 결핍 상태에서 E2 및 4-하이드록시타목시펜 처리를 위해, 상기 세포를 40시간 동안 10% 숯/덱스트란-처리된 FBS가 보충된 페놀레드-프리 DMEM 에서 배양되었다. 다음의 약물을 사용 하였다: Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)의 E2 및 4- 하이드록시타목시펜; Calbiochem(San Diego, CA, USA)의 CHX 및 MG132; 액티브 바이오 케미칼(Active Biochemicals, Wanchai, HongKong)의 BKM120.

7. 렌티바이러스 감염 및 안정화 세포(Stable Cell) 제조

RBP2 과발현 세포주를 확립하기 위해, pcDNA3/HA-FLAG-RBP2와 pcDNA3/HAFLAG-RBP2 H483A를 William Kaelin(Addgene plasmid #14800, #14801)으로부터 받아 사용하였다. 인간 RBP2 cDNA의 렌티 바이러스 입자는 렌티바이러스 pLVX-puro 벡터(Clontech, USA)로 클론되었고, RBP2 shRNA(cat#: RHS4531-EG5927, CloneID : V2LHS_240312, V2LHS_390196)이 삽입된 pGIPZ 벡터(Open Biosystems, Huntsville, AL, USA)를 [Cho et al., 2015]에 개시된 방법에 따라 제조하였다. RBP2-과발현 및 -결핍 안정화 세포주를 제조하기 위해, 8㎍/ml 폴리 브렌(Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA)을 사용하여 각 세포주에 렌티바이러스로 형질도입시켰다. 감염된 세포를 2㎍/ml 퓨로마이신(puromycin)이 함유 된 배지에서 배양하여 안정한 세포주를 선별하였다

8. 술포로다민 B(Sulforhodamine B, SRB) 비색 분석

in vitro 독성 시험 분석 키트(Sulforhodamine B based, TOX 6)는 Sigma-Aldrich(St Louis, MO, USA)에서 구입했다. 96-웰 플레이트에서 10% FBS(Welgene)를 함유하고 페놀레드가 없는 DMEM에서 세포(5 x 10³ cells/well)를 배양하였고, 5 일 동안 E2 또는 타목시펜을 보충하거나/보충하지 않았다. 상기 세포를 TCA 용액에 고정시키고, 4 ℃에서 1 시간 동안 인큐베이션하였다. 고정 후, 세포를 냉각된 멸균 증류수로 세척하고, 0.4% 술포로다민 B 용액으로 30 분 동안 염색 하였다. 상기 염색 된 세포를 1% 아세트산 용액으로 제거하고, 565 nm에서 OD 측정을 위해 10mM Tris 염기 용액에 용해시켰다.

9. 콜로니 형성 분석(Colony Formation Assay)

세포(1x10⁴ cells/well)를 24-웰 플레이트에서 10% FBS(Welgene)를 함유하는 페놀 레드가 없는 DMEM에서 배양하고, 3일 동안 타목시펜 및/또는 BKM120으로 처리하였다. 처리 후, 상기 세포에 10% FBS가 함유된 페놀 레드가 없는 신선한 DMEM을 2 주간 공급하였다. 상기 세포를 실온에서 5 분간 4% 포름알데히드 용액으로 고정시키고 PBS로 세척하였다. 그 다음, 상기 세포를 실온에서 1 시간 동안 0.02% 크리스탈 바이올렛(C0775, Sigma-Aldrich)으로 염색하고 멸균 증류수로 제거 하였다.

10. 정략적 역전사(Reverse-transcription) PCR

종래 알려진 방법에 따라서 총 RNA 추출 및 역전사 PCR(RT-PCR)을 수행했다². SYBR Green Master Mix(Applied Biosystems, Foster City, CA, USA)를 사용하여 7300 Real-Time PCR 시스템을 사용하여 표적 유전자의 mRNA 발현 수준을 정량화 하였다. 데이터는 GAPDH mRNA 수준에 의해 정규화되었다.

다음의 특이 프라이머를 qRT-PCR 분석에 사용 하였다:

RBP2(5'-CAACGGAAAGGCACTCTCTC-3' 및 5'-CAAAGCTTCTCGAGGTTTG-3'), GAPDH(5'-CATGTTCCAATATGATTCCA-3' 및 5'-CCTGGAAGATGGTGATG-3'), NRIP1(5'-GCATGAAAAGTGCATGGGGG-3' 및 5'-AGACGTCATGTCCAGAAATGGAA-3'), IGFBP4(5'-TGTGGTCACAGCCATGAAGTC-3' 및 5'-GGAGGTGTAGGGGAAGGAGATA-3'), IGFBP5(5'-CCGAATCTAAGTGCTGCCCA-3' 및 5'-CGTGGGAAAGACAGAGGCAT-3'), CCND1(5'-AGAGGGCYGTCGGCGCAGTA-3' 및 5'-GGCCGTCAGGGGGATGGTCT-3'), KRT13(5'-GGACGCCAAGAAGCGTCAG-3' 및 5'-AGTTCCTGGACGACTGTTGC-3'), KCNF1(5'-AGTTCCTGGACGACTGTTGC-3' 및 5'-CAGGAACTTCCAGACGCACT-3'), HSPA5(5'-GAACGTCTGATTGGCGATGC-3' 및 5'-ACCACCTTGAACGGCAAGAA-3'), SP1(5'-CAGGACCCCCTTGAGCTTG-3' 및 5'-AAGGCACCACCACCATTACC-3'), SMAD7(5'-CCCCTTTTCAAATCCACAGCA-3' 및 5'-AATTGAGCTGTCCGAGGCAA-3'), 그리고 JUN(5'-TGAGTGACCGCGACTTTTCA-3' 및 5'-TTTCTCTAAGAGCGCACGCA -3').

11. 크로마틴면역침강(Chromatin Immunoprecipitation, ChIP) 분석

ChIP은 제조사의 지침(Upstate Biotechnology, Lake Placid, NY, USA)에 따라 ChIP 분석 키트를 사용하여 수행하였다. ChIP 신호에 대한 강도은 정량적 실시간 PCR(qPCR)에 의해 검출되고 입력 및 정상 IgG 신호에 기초하여 분석되었다.

ChIP-qPCR은 다음의 특정 프라이머를 이용하여 수행하였다: NRIP1(5'-TGCTCCTGGGTCCTACGTCT-3' 및 5'-TCCCCTTCACCCCACAACAC-3'), IGFBP4(5'-TGTACGCTTTACCCCACCTC-3' 및 5'-CCTCAGTCTCCCACCGAGA-3') 그리고 IGFBP5(5'-AAGCTGCTCACCCTACCATT-3' 및 5'-TGGGGGATACAGTTGTGTGG-3'). 상기 프라이머는 ERE 모티프와 RBP-결합 모티프 모두를 함유하는 코어 프로모터 또는 근위 프로모터를 증폭 시키도록 설계되었다.

12. 루시퍼라제 리포터(Luciferase Reporter) 분석

ERE 루시퍼라제의 구조는 한양대학교(서울, 한국;³)의 신인철로부터 받아 사용하였다. ERE 프로모터 활성을 분석하기 위하여, 세포를 ERE-포함하는 루시퍼 레이즈 리포터 구조체와 β-갈락토시다아제 발현 벡터로 동시-형질감염시키고, 호르몬 결핍 상태에서 E2 또는 4-하이드록시타목시펜으로 처리하였다. Promega(Promega, Madison, WI, USA)로부터 구입한 루시퍼라제 분석 키트를 이용하여 루시퍼 라제 활성을 [Choi et al., 2015]에 기재된 방법에 따라 분석하였다. 루시퍼라제 활성은 상대적 광 단위(relative light units, RLUs)로 나타내었고, γ- 갈락토시다 아제의 활성에 기초하여 정규화되었다.

13. In vivo 유비퀴틴화(ubiquitination) 분석

EGFR 및 HER2 단백질 유비퀴틴화(ubiquitination)를 검출하기 위해, in vivo ubiquitination assay를 종래 알려진 방법에 따라 수행했다². 대조군 또는 RBP2-억제(knockdown) BT474 세포를 48시간 동안 HA-유비퀴틴 플라스미드로 형질 감염시켰다. EGFR과 HER2 단백질 유비퀴틴화(ubiquitination)를 검출하기 위해 두 세포를 40μM MG132로 6시간 동안 처리하였다. 세포 용해물은 EGFR 또는 HER2 항체를 사용하여 면역침전시켰다. 그 다음, 상기 시료를 항-유비퀴틴 항체를 사용하여 면역블로팅 하였다.

14. 면역블로팅 및 동시-면역침전(Co-immunoprecipitation, IP) 분석

프로테아제 및 포스파타아제 억제제가 첨가된 방사면역침전분석(RIPA) 완충액에 세포를 용해시켰다. 종래에 알려진 방법에 따라 적절한 항체를 사용하여 면역 블로팅 및 co-IP 분석을 수행하였다[Choi et al., 2015].

하기 항체를 사용 하였다: RBP2(A300-897A)는 Bethyl Laboratories, Inc.(Montgomery, TX, USA)로부터 수득; Flag(F3165)는 시그마 알드리치(Sigma Aldrich; HER2(sc-33684)로부터 수득; ER(sc-543), EGFR(sc-03), HER2(sc-33684), NRIP1(sc-8997), HDAC1, IGF1R(sc-81464), IGFBP5(sc-13093), normal mouse IgG(sc-2025), 및 normal rabbit IgG(sc-2027)는 Santa Cruz로부터 수득; phospho-EGFR(Tyr1173, #2236s), phosphor-IGF1R(#3021s), phospho-AKT(Ser473, #4060s), Ubiqutin(#3936) 및 AKT(#9272s)는 Cell Signaling Technology(Beverly, MA, USA)로부터 수득; IGFBP4(GTX102298)는 GeneTex, Inc.(Irvine, CA, USA)로부터 수득; H3K4me2(ab-32356) 및 H3K4me3(ab8580)는 Abcam(Cambridge, UK)으로부터 수득; β-actin(MAB1501R), H3 acetylation(06-599), 및 phospho-HER2(06-229)는 Millipore(EMD Millipore corporation, Billerica, MA, USA)로부터 수득.

15. 면역조직화학(Immunohistochemistry, IHC)

유방암 환자 또는 이종 이식 종양에서 얻은 조직 시료에서 RBP2 발현 수준을 분석하기 위해, 파라핀이 삽입된 블록의 종양 절편을 자동화 시스템(Leica Bond III(Leica Biosystems, Nusslock, Germany) 및 Bond Polymer Refine Detection Kit(Leica Biosystems))을 사용하여 RBP2(1:50, Santa Cruz, sc-365993)에 대한 1 차 항체로 면역 염색하였다. 세포 증식의 분석을 위해, 이종 이식된 마우스의 종양 절편을 상기 한 바와 같이 Ki-67 항체(1:200, MIB-1, Dako, Glostrup, Denmark)로 염색하였다. 발현은 종양 세포의 양성 핵 염색의 강도 및 백분율에 따라 등급을 매겼다. 염색의 강도는 각각 다음에 따라 기록되었다: 0(염색되지 않음), 1(약함), 2(보통) 및 3(강함).

염색 크기는 다음에 따라서 등급화되었다: 0(0 %-5 %), 1(6 %-25 %), 2(26 %-50 %), 3(51 %-75 %), 및 4(> 75%). 종합적인 면역반응 점수(IRS)를 얻기 위해, 강도 점수에 크기 점수를 곱하여 계산했다. 이중 코어의 평균 IRS를 평가했다. RBP2 발현은 음성(IRS = 0)과 양성(IRS ≥≥ 1)으로 분류되었다.

[시험예]

결과

1. 유방암에서 타목시펜과 RBP2의 관련성 확인

최근 RBP2/JARID1A의 고도로 보존된 동족체인 JARID1B는 내분비 내성³¹과 관련된 내강(luminal) 혈통(lineage)-특이적 암유전자로 밝혀졌다. RBP2가 ER⁹와 물리적으로 상호작용하는 것으로 알려져 있지만, ER-유발 유방암에서의 역할은 아직 명확하게 정의되지 않았다. ER+ 유방암에서 RBP2의 역할을 밝히기 위해, 먼저 인간의 원발성 유방암에서 RBP2의 임상적 관련성을 조사했다. METABRIC³²를 이용한 유방암 환자 생존의 메타-분석에서 ERP+ 유방암에서 RBP2의 높은 발현 수준은 ER+ 유방암(P0.0003 및 0.014, 각각, log-순위 검정), 특히 내분비 치료를 받는 환자들에서(P=0.023과 0.004; 도 1a)에서 전체 생존율(overall survival, OS) 및 무병 생존율(DFS)의 저하와 관련이 있었다. 또한, 높은 RBP2 발현은 모든 케이스의 유방암에서 OS 및 DFS가 낮은 것과 관련있는 것으로 나타났다(P=0.0036 및 0.0009, 각각, 도 6)

도 1b, 1c 및 1d에 나타낸 바와 같이, 임상적 증거와 동일하게, RBP2 과발현은 타목시펜 내성을 유도하였고, shRNA-매개 RBP2 억제는 ER+ 유방암 세포주에서 타목시펜에 대한 민감도를 증가시켰다(도 1b). 촉매 비활성 RBP2 H483A 돌연변이 체는 세포에서 타목시펜 감수성을 완전히 회복할 수 없었고(도 1b, 상단), 이는 RBP2의 탈메틸효소 활성이 부분적으로 타목시펜 내성에 관여한다는 것을 의미한다. 또한, ER과 HER2 발현을 모두 갖는 타목시펜 내성 BT474 세포²⁹에서 RBP2 억제는 타목시펜 감수성을 회복시켰다(도 1b, 하단). 마찬가지로, RBP2 과발현 MCF7 종양의 동소 이종이식된 마우스는 타목시펜 처리(도 1c, 상단)에 상관없이 종양 성장을 촉진하는 반면, RBP2-억제 BT474 세포가 주입된 마우스는 타목시펜에 대해 회복된 민감성을 보였다(도 1c, 하단). 이러한 결과는 각 그룹의 BT474 이종 이식 종양 조직에서 Ki-67 염색에 의해 확인되었다(도 1d). 종합적으로 상기 결과를 통해서 RBP2가 ER+ 유방암에서 타목시펜 내성을 매개한다는 것을 확인하였다.

2. ER-의존성 전사에 대해서 RBP2가 유도하는 타목시펜의 E2 아고니스트 효과

RBP2에 의한 타목시펜 내성의 분자 기작을 연구하기 위해, RNA 시퀀싱(RNA-seq)을 사용하여 MCF7 세포주에서 RBP2 과발현 후 유전자 발현의 변화를 분석했다.

도 2a, 2b, 2c, 7a 및 7b에 나타낸 바와 같이, RBP2에 반응하여 2,703 개가 상당히 상향 조절되었고, 776 개가 하향 조절되었다(도 2a). 특히, RBP2 표적 유전자의 약 60%가 ER-결합 및/또는 타목시펜 내성 관련 유전자와 겹쳤다(도 2a). GSEA(Gene set enrichment analysis)는 또한 대조군과 RBP2 과발현 세포 사이의 차별적으로 발현된 유전자가 에스트라디올 반응과 타목시펜 내성과 관련된 유전자 세트와 유의적으로 연관되어 있음을 보여 주었다(도 2b 및 도 7a). 실제로, NRIP1, CCND1 및 IGFBP4를 포함하는 공지된 ER 표적 유전자의 발현 수준은 정량적 역전사 PCR(qRT-PCR)에 의해 평가 된 바와 같이 MCF7 세포에서 RBP2 과발현에 의해 변형되었다(도 2c 및 도 7b).

또한, ER+ 유방암에서 ER 의존성 전사에 RBP2가 미치는 영향을 더 확인했다.

도 2d, 2e 및 7c 에 나타낸 바와 같이, RBP2 과발현 MCF7 세포에서 17β- 에스트라다올(E2) 또는 타목시펜 처리(도 2d)에 반응하여 에스트로겐-반응 요소(ERE)-루시퍼라제 활성이 자극되었다. 타목시펜의 이러한 E2-아고니스트 작용은 또한 RBP2 H383A 돌연변이-발현 세포에서도 유지되었다. NRIP1 및 CCND1을 포함하는 ER 표적 유전자의 발현 수준은 이 조건 하에서 나중에 상향 조절되었다(도 2e 및 도 7c). 유사하게, RBP2 억제는 타목시펜 내성 BT474 세포에서 ER-의존성 전사에 대한 타목시펜의 억제 효과를 회복시켰다(도 2d 및 도 7d). 우리는 RBP2가 E2 또는 타목시펜 처리에 반응하여 ER, p300 및 HDAC1과 상호 작용한다는 것을 확인했다(도 2f).

도 2g, 8a 및 도 8b에 나타낸 바와 같이, RBP2 및 ER은 다중 RBP2-결합 모티프 'CCGCCC'³³ 및 EREs를 포함하는 NRIP1의 코어 프로모터에 직접 결합하고, 상기 부위에서 p300 결합증가(recruitment)에 의하여 매개되는 히스톤 H3 아세틸화(histone H3 acetylation, H3ac)를 유도하였다(도 2g). 그러나, H3K4me2/3의 수준은 이 유전자 프로모터 영역에서 RBP2의 결합에도 불구하고 오히려 증가 하였다(도 8a). RBP2의 촉매적으로 불활성 돌연변이체(H483A)는 RBP2-의존성 NRIP1 발현을 역전시키지 않았으며(8b), 이는 RBP가 그것의 디메틸화효소 활성에 관계없이 NRIP1에 대한 ER-의존성 전사 활성을 강화 시킨다는 것을 의미한다. 이러한 결과를 통해 RBP2가 ER+ 유방암에서 ER 의존성 전사 활성을 변화시킴으로써 E2 안타고니스트에서 E2 아고니스트로 타목시펜의 기능을 전환 시킨다는 것을 의미한다.

3.IGF1R 신호 전달에 대한 RBP2-ER-NRIP1 복합체의 역할 확인

RBP2는 ER-의존성 전사 활성화 이외에, IGFBP4 및 IGFBP5를 비롯한 ER 표적 유전자의 전사 억제에도 관여하기 때문에(도 2a, 도 7c 및 표 1), RBP2가 ER-의존성 전사적 활성을 억제하는 분자 수준의 기작을 확인했다. NRIP1은 ER-의존성 전사에서 주요한 ER 동시-억제자로 알려져 있으며³⁴, ER 기능의 조절에서 RBP2와 NRIP1 사이의 협력 가능성을 높였다. 실제로, RBP2에 대한 반응으로 NRIP1 발현의 증가는 RBP2 과발현 MCF7 세포(도 3a)에서 RBP2, ER, NRIP1 및 HDAC1 사이의 상호작용을 촉진시켜, 전사 억제성 RBP2-ER-NRIP 복합체를 형성하게 한다. NRIP1 발현 양상과는 대조적으로, 표적 유전자 IGFBP4 및 IGFBP5의 RBP2-매개 하향조절은 RBP2 디메틸효소 활성에 의존적이었다(도 3b, 3c). 크로마틴면역침강(ChIP) 분석 결과는 RBP2가 ER-NRIP1-HDAC1 복합체와 함께 RBP2- 및 ER-결합 부위를 모두 포함하는 IGFBP4와 IGFBP5의 프로모터 부위에 직접적으로 모집되어, H3K4me2/me3와 H3ac의 억제를 유도하였음을 보여준다(도 3d). RBP2 H483A 돌연변이체는 그들의 프로모터 부위에서 H3K4me2/3 및 H3ac를 회복시켰고, 이는 IGFBP4와 IGFBP5가 RBP2-매개 히스톤 디메틸화의 직접적인 표적 유전자임을 의미한다(도 3e).

IGF1R35에 대한 리간드 결합을 파괴시킴으로써 IGFBP가 IGF-1R 활성화를 차단하기 때문에, RBP2가 IGF1R 신호 전달의 활성화에 미치는 영향을 조사 하였다. RBP2에 반응하여 감소된 IGFBP4 및 IGFBP5 발현은 IGF1R 인산화를 증가시켰고 하류 PI3K/AKT 경로를 활성화시켰다(도 3f). 흥미롭게도 RBP2 H483A 돌연변이체의 발현에 의해 인산화된 AKT(p-AKT)가 불완전하게 탈인산화된 반면에 강화된 IGF1R 활성은 완전히 저해되었고(도 3f), 이는 RBP2-매개된 AKT 활성화가 IGF1R 신호 전달과 RBP2 촉매 활성에 부분적으로 의존한다는 것을 의미한다. 따라서, 상기 결과를 통해서, RBP2는 히스톤 메틸화-의존적 방식으로 ER-NRIP1-HDAC1과 협력하여 IGFBP4 및 IGFBP5 전사를 음성적으로 조절하여 IGFR1R 신호 전달을 활성화 시킨다는 것을 새롭게 발견했다(도 3g).

4. RBP2의 IGF1R / EGFR / HER2 신호를 활성화에 의한 타목시펜 내성 유도 기작 확인

PI3K/AKT 경로에 대한 RBP2의 조절 효과를 담당하는 메커니즘을 더 확인하기 위해, RBP2 과발현 후 다중 수용체 티로신 키나아제(RTK)의 활성 변화를 분석 하였다.

도 4a, 4b, 4c, 4d 및 4e에 나타낸 바와 같이, RBP2 발현과 EGF 신호 전달(도 7a) 사이에 양의 상관 관계가 있음을 보여주는 GSEA 결과와 동일하게, 포스포-RTK 배열의 분석은 IGF1R뿐만 아니라 ErbB 패밀리 수용체가 또한 MCF7 세포에서 RBP2 과발현에 의해 현저하게 활성화되었음을 보여 주었다(도 4a 및 4b). 일관적으로, HER2+ BT474 세포에서 RBP2 억제는 EGFR과 HER2 인산화를 감소시켰다(도 4b). 또한, RBP2는 면역블랏팅 및 qRT-PCR 평가와 동일하게, 탈메틸효소 활성-독립적인 방식으로 전사 후 수준에서 EGFR 및 HER2의 발현을 증가시켰다(도 4b). 단백질 합성 억제제인 cycloheximide(CHX) 또는 프로테아좀억제제 MG-132로 처리 한 후 이들 ErbB 수용체의 단백질 안정성을 분석함으로써, RBP2가 EGFR과 HER2의 프로테아좀(proteasomal) 분해를 억제한다는 것을 확인했다(도 4c, 4d). RBP2에 의한 EGFR 및 HER2 단백질의 안정화는 RBP2 H483A 돌연변이체의 발현에 의해 역전되지 않았고(도 4c), RBP2의 소실은, 생체 내 유비퀴틴화 분석에 의해 측정된 바와 같이, BT474 세포에서 내인성으로 유비퀴틴화된 EGFR 및 HER2 단백질을 유도하였다(도 4e). 상기 결과를 통해서 RBP2는 디메틸효소 활성과 독립적인 방식으로 EGFR 및 HER2 단백질의 안정화를 통해 ErbB 신호전달을 활성화시킴을 확인하였다.

이전 연구에서 IGF1R과 ErbB 패밀리 사이의 크로스토크(crosstalk)가 하류 신호전달 경로를 활성화시킨다는 사실이 입증되었다³⁶ ^,37. 따라서, RBP2가 PI3K/AKT 경로를 활성화하기 위해 크로스토크에 영향을 미칠 수 있는지를 더 조사했다.

도 4f, 도 4g 및 4h에 나타낸 바와 같이, IGF1R 및 ErbB 패밀리의 수준이 증가된 BT474 세포에서 IGF1R, EGFR 및 HER2 사이의 상호작용은 RBP2 억제에 의해 억제되었다(도 4f). 이러한 결과는 RBP2가 디메틸효소 활성-의존적 및 -비의존적 방식 모두에서 IGF1R과 EGFR/HER2 사이의 크로스토크를 촉진함으로써 PI3K/AKT 신호전달을 활성화 시켰음을 의미한다. PI3K/AKT 경로의 과활성화는 ER+ 유방암 내분비 치료 내성을 유도 할 수 있는 가능성이 있는 메커니즘으로 여겨져 왔다³⁸. RBP2 과발현 MCF7 세포는 PI3K 억제제에는 민감하지만 타목시펜에는 감작되지 않았는데, 이는 콜로니 형성 및 SRB 분석 결과와 동일하다(도 4g 및 4h). 또한, RBP2에 의한 타목시펜에 대한 내성은 타목시펜 및 BKM120과의 조합 치료에 의해 회복되었다. 이러한 결과를 통해서, RBP2에 의한 타목시펜 내성은 히스톤 메틸화-의존적 및 메틸화-독립적인 IGF1R 및 ErbB 신호전달 활성화를 통해서 PI3K/AKT 경로를 활성화하는데 기인한 것으로, 이를 통해, RBP2가 과발현하는 유방암에서 PI3K/AKT 신호 전달을 차단하여 타목시펜 내성을 극복 할 수 있음을 실험적으로 확인하고, 새롭게 밝혔다.

REFERENCES

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2. Christensen, J., et al. RBP2 belongs to a family of demethylases, specific for tri-and dimethylated lysine 4 on histone 3. Cell 128, 1063-1076(2007).

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Claims

RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암에서 타목시펜에 대한 약제 내성 판별용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것인, 약제 내성 판별용 조성물.
제1항에 있어서,
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 RBP2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인, 약제 내성 판별용 조성물.
에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 환자로부터 얻은 시료에서 RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 것;을 포함하는 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 환자의 타목시펜에 대한 약제 내성 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법.
제4항에 있어서,
상기 시료에서 RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 발현 수준이 대조군 보다 높은 경우, 타목시펜에 대한 약제 내성이 있는 것으로 판별하는 것;을 포함하는, 약제 내성 판별에 필요한 정보를 제공하는 방법.
RBP2 유전자 발현 억제제 및 RBP2 단백질 발현 억제제로 이루어진 군에서 선택된 하나 이상을 유효성분으로 포함하며,
상기 유전자 또는 단백질 발현 억제제는 RBP2의 mRNA에 상보적으로 결합하는 안티센스 뉴클레오타이드, 작은 간섭 RNA(small interfering RNA; siRNA) 및 짧은 헤어핀 RNA(short hairpin RNA; shRNA)로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상인, 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 환자의 타목시펜에 대한 내성 억제 또는 개선용 약학 조성물.
삭제
제6항에 있어서,
상기 조성물은 타목시펜과 동시 또는 순차적으로 병용 투여되는 것인, 에스트로겐 수용체(ER) 양성 유방암 환자의 타목시펜에 대한 내성 억제 또는 개선용 약학 조성물.
RBP2 단백질 또는 이를 코딩하는 유전자의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, 유방암 환자에 대한 동반진단용 키트.
제9항에 있어서,
에스트로겐 수용체(ER) 유전자의 mRNA 발현 수준 또는 상기 유전자가 코딩하는 단백질 발현 수준을 측정하는 제제를 더 포함하는, 유방암 환자에 대한 동반진단용 키트.
제9항에 있어서,
상기 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 유전자의 mRNA에 상보적으로 결합하는 센스 프라이머, 안티센스 프라이머 및 프로브로 이루어진 군에서 선택된 것인, 유방암 환자에 대한 동반진단용 키트.
제9항에 있어서,
상기 단백질 수준을 측정하는 제제는 RBP2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체인, 유방암 환자에 대한 동반진단용 키트.
RBP2 단백질 및 RBP2 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것을 포함하는 타목시펜에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제 스크리닝용 조성물.
후보물질과 RBP2 단백질 및 RBP2 단백질을 코딩하는 유전자로 이루어진 군에서 선택된 것을 접촉시키고,
상기 후보물질이 접촉된 단백질 또는 유전자의 활성 또는 발현 수준을 변화시키는지 확인하는 것;을 포함하는 타목시펜에 대한 내성 억제 또는 개선용 제제를 스크리닝하는 방법.
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