KR20240026431A - 암의 진단, 전이 가능성 또는 예후 예측용 바이오 마커 및 이의 용도 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 선택적 스플라이싱에 의한 LRRFIP2 이소형2 또는 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준을 확인하여, 암의 전이 또는 예후를 예측하거나, 약물에 대한 환자의 감수성을 예측하는 방법에 관한 것으로, 본 발명은 암 환자의 진단, 전이 또는 예후 예측, 치료 및 CARM1 억제제에 대한 치료 감수성 예측에 유용하다.
Description
본 발명은 LRRFIP2 이소형을 이용한 암의 전이 또는 예후 예측 방법에 관한 것으로, 보다 구체적으로는 시료에서 선택적 스플라이싱에 의한 LRRFIP2 이소형2 또는 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준을 확인하여, 암의 전이 또는 예후를 예측하거나, CARM1 저해제에 대한 대상의 감수성을 예측하는 방법에 관한 것이다.
선택적 스플라이싱(Alternative splicing)은 단일 유전자에서 여러 단백질 이소형을 생성하여 단백질의 다양성을 생성할 수 있는 생체 내 주요한 유전자 발현 메커니즘이다. 다양한 유전자 스플라이싱은 pre-mRNA에서 선택적 스플라이싱 부위의 선택 및 활용을 통해 단일 유전자로부터 여러 이소형 mRNA를 생성할 수 있다(Nat. Rev. Genet. 11, 345-355 (2010)). 생체 내에서 선택적 스플라이싱은 많은 요인에 의해 엄격하게 통제되며, 암을 비롯한 다양한 암에서 스플라이싱 조절 장애가 발생하는 것으로 보고되고 있다.
상피 스플라이싱 조절 단백질(Epithelial splicing regulatory protein, ESRP1)은, 종양 운동성과 침습성을 감소시켜 전이에 중요한 역할을 수행하는 상피 -중간엽 전환(epithelial-mesenchymal transition, EMT)에 관여하는 여러 유전자의 선택적 스플라이싱을 조절하는 유전자로 알려져 있다(PLoS Genet. 7, e1002218 (2011); Cancer Res. 9, 1608-1620 (2011)). ESRP1은 섬유아세포 성장인자 수용체 2(FGFR2) 스플라이싱의 필수 조절자로 보고되었으며, 중간엽에서 상피 이소형으로의 내인성 FGFR2 스플라이싱의 전환을 유도한다(Mol. Cell 33, 591-601 (2009)) 또한, 세포 표면 단백질인 CD44는 ESRP1의 또 다른 주요표적으로 ESRP1에 의해 조절되는 가변 엑손을 포함하는 CD44 변이 이소형(CD44v)에서 가변 엑손이 제거된 CD44 표준 이소형(CD44s)으로의 이소형 전환이 유방암의 상피-중간엽 전환(EMT)에 필수적인 역할을 수행하는 것으로 보고된다(J. Biol. Chem. 287, 36435-36442 (2012); J. Clin. Invest. 121, 1064-1074 (2011)). 이외에도 ESRP1은 여러 유형의 암에서 EMT동안 p120-카테닌(CTNND1)및 hMena(ENAH)의 스플라이싱을 조절한다(J. Biol. Chem. 283, 18344-18354 (2008)). 이러한 많은 문헌에서 종양 진행 및 전이에서 ESRP1의 중요성 및 이의 선택적 스플라이싱 타겟을 보고하나, 위암에서 ESRP1에 의해 조절되는 선택적 스플라이싱 타겟은 보고된 바 없다.
위암은 전 세계적으로 5번째로 흔한 암으로, 전세계의 모든 암 중 두 번째로 높은 사망원인이다(CA Cancer J. Clin. 68, 394-424 (2018)). 이에 위암의 조기 발견, 진단 및 치료 기술이 지속적으로 개발 및 발전되어 왔으나, 전반적인 예후가 좋지 않으며 위암 환자의 5년 생존율은 수술 후 재발 및 전이로 인해 약 30%에 불과하다(CA Cancer J. Clin. 67, 7-30 (2017)). 또한, 전체 위암 환자의 35%는 원격 전이 환자로서, 생존율이 5.2% 로 급격하게 감소한다. 따라서, 위암의 치료 및 생존율을 높이기 위해서는 위암의 전이에 대한 기본적 분자 메커니즘에 대한 상세한 이해가 필요하다. 전이성 세포가 나타내는 표현형 가소성의 주요한 원인이 선택적 스플라이싱으로 보고되고 있으며, 최근 TCGA(The Cancer Genome Atlas database)에 포함된 32종의 암 유형에서 30% 높은 선택적 스플라이싱이 발생하는 것을 고려할 때(Cancer Cell 34, 211-224.e6 (2018)), 위암의 진행 및 전이에서 발생하는 선택적 스플라이싱의 조절 장애에 관여하는 스플라이싱 이소형 및 스플라이싱 인자에 대한 연구가 강력하게 요구된다.
이러한 기술배경아래에서, 본 발명자들은 위암의 진행 및 전이에 관여하는 선택적 스플라이싱 및 이의 구체적인 메커니즘과 연관성을 확인하기 위해 예의 노력한 결과, 위암 세포에서 ESRP1의 선택적 스플라이싱 타겟으로서 LRRFIP2 (Leucine-rich repeat Fli-1-interacting protein 2)유전자를 동정하고, LRRFIP2의 이소형 중 엑손 7이 스킵되지 않은 LRRFIP2 이소형 3 (NCBI Gene ID: NM_001134369.2)의 발현과 위암 세포의 진행 및 간으로의 전이성이 유의하게 연관되어 있는 것을 확인하였으며, 위암의 간 전이에서 LRRFIP2의 이소형에 따른 메커니즘 및 경로에서 유전자 발현 억제 또는 단백질 활성 억제가 암의 전이성을 현저하게 감소시키는 것을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 LRRFIP2 이소형 기반의 암의 전이 또는 예후 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 목적은 LRRFIP2 이소형 기반의 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7 서열의 결실 또는 발현 억제를 이용한 암의 치료 또는 전이억제 방법에 관한 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명은 또한, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질 또는 LRRFIP2 이소형 3의 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측용 조성물을 제공한다.
본 발명은 또한, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
본 발명은 또한, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질 또는 LRRFIP2 이소형 3의 단백질 에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 조성물 및 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, 서열번호 5로 표시되는 LRRFIP2의 엑손 7을 결실 또는 발현 억제하기 위한 제제를 포함하는 암의 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물 및 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, LRRFIP2의 서열번호 5로 표시되는 엑손 부위를 결실 또는 발현 억제시키는 단계를 포함하는 암의 치료방법 또는 전이억제 방법 및 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, LRRFIP2 이소형 2 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 암의 치료용 또는 전이 억제용 약학적 조성물 및 용도를 제공한다.
본 발명은 또한, LRRFIP2 이소형 2 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법 또는 전이 억제 방법 및 용도를 제공한다.
본 발명은 LRRFIP2 이소형에 근거하여 암의 진행성 및/또는 전이성을 정확하게 예측할 수 있으며, 나아가 CARM1 억제제를 이용한 암의 치료에 대한 감수성 예측에도 유용하게 사용될 수 있다. 따라서, 본 발명은 암 환자의 진단, 전이 또는 예후 예측, 치료 및 CARM1 억제제에 대한 치료 감수성 예측에 유용하다.
도 1은 ESRP1 발현과 위암 환자의 전체 생존 시간의 관계를 나타낸 공개 메타 분석 데이터에서 ESRP1 발현 수준에 따른 전체 생존을 나타내는 Kaplan-Meier 분석 결과이다(N=875). P 값은 log-rank 테스트를 사용하여 계산되었다.
도 2는 LRRFIP2 선택적 스플라이싱 상대빈도와 인간 위암 세포주 및 위암 환자 조직에서의 ESRP1의 발현 수준과의 연관성을 나타낸 것이다. 도 2a는 위암 세포주에서 차별적으로 발현되는 ESRP1의 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 도 2b, 2c는 ESRP1-low(b) 및 ESRP1-high(c) 조건에서 선택적으로 발현된 20개의 스플라이싱 변형의 상대적 TPM을 나타내는 히트맵이다. 도 2d, 2e는 ESRP1-low 세포주(b) 및 ESRP1-high 세포주(c)에서 상향 조절된 차별적으로 발현된 유전자가 풍부한 KEGG 경로 및 GO terms을 나타낸 것이다. 도 2f는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 차별적으로 표현되는 인간 LRRFIP2 이소형을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 2g는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 LRRFIP2의 엑손 사용 및 스플라이싱을 나타낸 사시미 플롯이다. 아치와 숫자는 엑손-엑손 접합에서 RNA-seq read를 나타낸다. 도 2h는 위암 세포주에서 LRRFIP2 엑손 7의 PSI에서의 도트플롯을 나타낸다. 데이터는 ESRP1-low (N=5) 및 ESRP1-high (N=13)에서 개별 세포주의 평균 PSI±SD이다. 도 2i는 동일한 프라이머 세트를 사용하는 LRRFIP2 변이체의 PCR 분석결과를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 2j는 18개의 위암 세포주에서 LRRFIP2 이소형 2(빨간색으로 표시) 및 이소형 3(파란색으로 표시)의 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 및 RT-PCR 결과이다. 도 2k 내지 2n은 공개 TCGA 데이터 세트의 위암 조직에서 ESRP1 및 LRRFIP2 이소형 3 발현 수준을 나타낸 박스플롯이다. k, l: 암 단계 I-IV 및 m, n: 비전이성 위암 및 전이성 위암. 중심선은 중앙값이다. 박스는 25번째에서 75번째 백분위이다. 위/아래 whisker는 위쪽 및 아래쪽에 대한 힌지에서 각각 1.5 x IQR(1사분위수와 3사분위수 사이의 거리) 힌지까지 확장된다. 도 2o는 일치하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 LRRFIP2 이소형 3(LRRFIP2-V3) 발현 수준이 고도로 상향조절된 환자(≥2배)(N=12) 및 IV기 위암 데이터세트의 다른 환자(N=25 사이의 생존 차이를 나타내는 Kaplan-Meier 곡선 플롯을 나타낸 것이다. 전체생존기간은 4기 진단일로부터 사망까지의 시간(개월)으로 정의하였다. 도 1h에 대한 P 값은 unpaired two-tailed Student's t-tests로 계산하였다. 1k 내지 1o에 대한 P 값은 log-rank test에서 계산되었다.
도 3는 ESRP1 발현 및 위암 세포에서 EMT 마커의 발현의 상관관계를 나타낸 것으로 ESRP1-low 위암 세포주(SNU668, SNU5 및 MKN1), 및 ESRP1-high 위암 세포주(KATOIII, MKN74 및 MKN28)에서 EMT 마커의 면역블롯 분석결과이다. 본 도의 결과는 적어도 두 번의 독립실험 결과이다.
도 4는 CCDC50 및 BICD2의 스플라이싱 변이는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 엑손 스킵핑 이벤트를 차등적으로 나타낸다. 도 4a는 도 3b 및 도 3c로부터 CCDC50(NM_178335) 엑손 6와 ESRP1(TPM)의 연관성을 피어슨 상관관계 분석으로 나타낸 것이다(R=0.6562,P0.0031). 도 4c 및 4d는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 차등적으로 발현되는 인간 CCDC50(c) 및 BICD2 (d) 이소형을 도식화 한 것이다. 화살표는 선택적 스플라이싱 빈도가 ESRP1의 발현수준과 관련된 엑손을 나타낸다. 도 4e, 4f는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 CCDC50(e) 및 BICD2 (f)의 엑손 사용 및 스플라이싱을 나타낸 것이다. 아치와 숫자는 엑손-엑손 접합부에서 RNA-seq reads를 나타낸다.
도 5은 위암 조직에서 LRRFIP2 스플라이싱의 상대빈도와 ESRP1의 발현 수준의 연관성을 나타낸 것이다. 도 5a는 위암 조직에서 차별적으로 발현되는 ESRP의 발현 수준을 나타낸 막대 그래프이다. 도 5b 및 5c는 ESRP1-low(b) 및 ESRP1-high(c) 조건에서 선택적으로 발현된 20 개의 스플라이싱 변형의 상대적 TPM을 나타낸 히트맵이다. 도 5d 및 5e는 도 5b 및 5c에서 상향 조절 발현된 유전자가 풍부화된 KEGG 경로 및 GO terms를 나타낸 것이다. 도 5f는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 LRRFIP2의 엑손 사용 및 스플라이싱을 나타낸 것이다. 아치와 숫자는 엑손-엑손 접합부에서 RNA-seq reads를 나타낸다. 도 5g는 18명의 환자 조직 샘플에서 LRRFIP2 엑손 7의 PSI 값과 ESRP1 발현(TPM) 간의 피어슨 상관관계를 나타낸 것이다(R=-0.7724, P=0.0002). 도 5h는 ESRP1-low 또는 ESRP1-high 위암 조직에서 LRRFIP2 이소형 2와 이소형 3의 발현 정도를 나타낸 RT-PCR 결과이다. 결과는 적어도 두 번의 독립실험 결과이다.
도 6는 LRRFIP 이소형 2 및 3과 ESRP1의 상관관계를 나타낸 것으로 18개의 세포주에서 고도로 발현된다. 도 6a는 LRRFIP2의 4가지 이소형을 개략적으로 나타낸 것이다. 회색 상자는 엑손을 나타낸다. Eh6b는 ESRP1-low(N=5) 및 ESRP1-high(N=13) 조건에서 4개의 선택적 스플라이싱된 이소형의 TPM 프로파일로부터 나타낸 도트플롯이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests를 통해 계산되었다. 상기 데이터는 평균±S.D. 값이다.
도 7는 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7이 in vivo 및 in vitro에서 위암 세포의 전이 가능성을 결정함을 나타내는 도면이다. 도 7a는 ESRP1 단백질을 안정적으로 발현하는 MKN1 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 각각 침입 및 이동된 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다(오른쪽). 원본 확대 배율 _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 7b는 ESRP1 및 LRRFIP2 이소형 2 및 3의 과발현을 나타낸 RT-PCR 분석결과이다. 도 7c는 ESRP1 면역 침전의 면역블롯 및 RT-PCR 분석 결과이다. 도 7d는 LPCX-Flag-LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포의 면역블롯 및 RT-PCR 분석 결과이다. 도 7e는 LRRFIP2 이소형 2 및 3 단백질을 안정적으로 발현하는 MKN28 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 각각 침입 및 이동된 세포의 수를 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율 _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 7f는 전이성 결절을 나타내는 전체 간 이미지(왼쪽)와 간 전이성 결절의 수를 나타내는 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 도 7g는 7f에서 전이된 간 부분을 나타내는 H&E 염색 결과이다. 원본 확대 배율, _100X. 스케일 바, 100μm. 도 7h는 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 엑손 7 결실을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 7i는 엑손 7-결실 세포주에서 LRRFIP2의 RT-PCR 분석 결과이다. 도 7j는 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 엑손 7-결실 세포주(상단)의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(상단)과 각각 침입 및 이동된 세포의 수를 나타내는 막대 그래프(하단)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 7k는 전이성 결절을 나타내는 전체 간 영상(왼쪽)과 간 전이성 결절의 수를 나타내는 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 도 7l은 7k에서 전이된 간 부분을 나타내는 H&E 염색 결과이다. 원본 확대 배율, _100X. 스케일 바, 100μm. 도 7a, 7e, 7j의 데이터는 3번의 실험의 평균±SD이다(N=3). 도 7b-7d, 7i 는 최소 세 번의 독립적인 실험 결과이다. 도 7f는 5마리의 독립적 동물의 대표적인 평균 ± SD 값이다 (n=5). 도 7k는 4마리의 독립적 동물의 대표적인 평균 ± SD 값이다 (n=4). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다. 상기 데이터는 평균±S.D로 표시된다.
도 8은 ESRP1의 과발현 또는 LRRFIP2의 스플라이싱 변형이 위암 세포의 종양 형성을 변경시키지 않음을 나타낸 것이다. 도 8a는 대조군 및 ESRP-과발현 MKN1 세포의 세포 배가 시간을 나타낸 것이다. 각 점은 세번의 실험 결과에서 계산된 세포 수의 평균을 나타낸다. 도 8b는 대조군 및 ESRP-과발현 MKN1 세포에서 Foci 형성을 나타낸 것이다. 도 8c는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28세포의 세포 배가 시간을 나타낸 것이다. 도 8d는 면역결핍 마우스의 옆구리에 피하 주사된 대조군 및 LRRFIP2 변이체 2 및 3-과발현 MKN28 세포의 종양 형성 및 성장을 나타낸 것이다(n=6). 원발성 종양 이미지(왼쪽)와 종양 중량(오른쪽)을 나타낸다. 도 8e는 대조군 및 엑손 7-결실 MKN1 세포의 세포 배가 시간을 나타낸 것이다. 도 8f는 대조군 및 엑손 7-결실 MKN1 세포의 foci 형성을 나타낸 것이다. 도 8a, 8b, 8e, 8f의 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균±SD 값을 나타낸다. 도 8d의 데이터는 5마리의 독립적인 동물(n=5)의 평균±SD 값이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests를 통해 계산되었다. ns: 유의미하지 않음.
도 9은 MKN28 세포에서 LRRFIP2 전사체에 ESRP1이 직접적으로 결합함을 나타낸 것으로 LRRFIP2 이소형 유전자 내 ESRP1 결합 부위를 개략적으로 나타낸 것이다. 붉은 상자는 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7을 나타내며, 회색 상자는 도 7c의 표적 서열을 나타낸 것이다.
도 10은 LRRFIP2 이소형 3의 과발현에 따른 MKN74 세포의 침습성 및 이동의 향상을 나타낸 것이다. 도 10a는 LRRFIP2 이소형 2 및 3 과발현 MKN세포의 트랜스웰 이동 분석 및 매트리겔 침입 분석(왼쪽), 및 크리스탈 바이올렛 염색 후 침입 및 이동된 세포의 수를 나타낸 막대 그래프(오른쪽)이다(40x, 스케일바=0.5mm). 도 10b LRRFIP2 이소형 2 및 3을 과발현하는 MKN74 세포에서 LRRFIP2 및 SERPINE1의 RT-PCR 분석을 나타낸 것이다. 도 10c는 Flag-태그된 LRRFIP2 및 히스톤 H3R17 메틸화를 면역블롯분석을 통해 나타낸 것이다. 도 10a의 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균±SD를 나타낸다. 도 10b 및 10c는 적어도 2번의 독립 실험으로부터 얻어진 대표 결과이다. 데이터는 평균±S.D. 값이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests를 통해 계산되었다.
도 11는 CRISPR/Cas9 시스템으로 엑손 7이 녹아웃된 세포주를 생성한 결과이다. 도 11a는 엑손 7을 djwf제하도록 설계된 CRISPR/Cas9의 두 표적 부위를 나타낸다. 도 11b는 클론 선택 후 클론의 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다. 도 11c는 녹아웃 클론에서 LRRFIP2를 RT-PCR 분석한 결과를 나타낸 것이다. 2% 아가로스 겔을 사용하여 이소형(294bp 및 222bp)의 밴드를 관찰하였다.
도 12은 LRRFIP2 엑손 7의 녹아웃이 SNU484 세포의 전이 가능성을 감소시킴을 나타낸 것이다. 도 12a는 엑손 7-결실 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 12b는 엑손 7 결실 SNU484 세포에서 LRRFIP2 및 SERPINE1의 RT-PCR 분석 결과이다. 도 12c는 엑손 7 결실 SNU484 세포에서 LRRFIP2 및 히스톤 H3R17 메틸화의 면역블롯 분석결과이다. 도 12a의 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균±SD이다(N=3). 도 12b, 12c은 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻은 대표 결과이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다.
도 13은 엑손 7 녹아웃 세포주에서 LRRFIP2 이소형 3의 과발현은 위암 세포의 침입과 이동을 회복시킴을 나타낸 결과이다. 도 13a는 대조군, 엑손 7- 녹아웃 및 LRRFIP2 이소형 3 회복 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 13b는 히스톤 H3R17 메틸화 및 LRRFIP2의 면역블롯 분석 결과이다. 도 13c는 MKN1 대조군 및 엑손 7 녹아웃 세포에서 LRRFIP2 및 SERPINE1의 RT-PCR 분석결과이다. 도 13d는 LRRFIP2 이소형 3의 과발현 후 SERPINE1 프로모터의 루시퍼라제 활성을 나타낸 것이다. 도 13a의 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균±SD 이다(N=3). 도 13b, 13c는 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻어진 대표 결과이다. 도 13d의 데이터는 각각 3회의 독립적인 실험의 평균±SD이다(n=3). 모든 통계분석에서 멀티플 테스트에 대한 Benjamini-Hochberg 보정을 사용한 unpaired two-tailed Student's t tests를 수행하였다(P < 0.05). 상기 데이터는 평균±SD 이다.
도 14은 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱이 위암 세포에서 전이 관련 유전자 네트워크를 조절함을 나타낸 것이다. 도 14a는 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7이 결실된 MKN1 세포에서 하향 조절된 유전자를 나타내는 히트맵이다. 임계값은 다음과 같다: corrected P value < 0.01 및 absolute log2-fold change >1.0. 도 14b는 14a에서 엑손 7의 결실에 의해 하향 조절되는 차별적으로 발현되는 유전자가 풍부한 KEGG 경로 및 GO terms 이다. 도 14c는 exon 7 결실 MKN1 세포에서 변경된 표적 유전자의 발현을 나타내는 실시간 qRT-PCR 결과이다. 도 14d는 LRRFIP2 이소형 2 및 3을 안정적으로 발현하는 MKN28 세포에서 14c로부터 변경된 표적 유전자의 발현을 나타내는 실시간 qRT-PCR 결과이다. 도 14e는 공개 TCGA 데이터 세트에서 위암 조직의 각 종양 단계에서 SERPINE1 발현 수준을 나타내는 박스 플롯이다. T1-T4는 주변 조직으로의 주요 종양의 크기 및/또는 범위를 나타낸다. 중심선은 중앙값이다. 박스는 25번째에서 75번째 백분위이다. 위/아래 whisker는 위쪽 및 아래쪽에 대한 힌지에서 각각 1.5 x IQR(1사분위수와 3사분위수 사이의 거리) 힌지까지 확장된다. 도 14f는 공개 메타 분석 데이터(N=875)에서 SERPINE1 발현 수준에 따라 무재발 생존을 나타내는 Kaplan-Meier 분석결과이다. 도 14c 및 14d의 P 값은 unpaired two-tailed Student's t-tests로 계산되었다. 도 14e의 P 값은 two-sided Wilcoxon rank sum tests로 계산되었다. 도 14f의 P 값은 log-rank test로 계산되었다. 도 14c, 14d의 데이터는 3번의 독립 샘플의 평균±SD 값이다(N=3). n.s: 유의미하지 않음.
도 15는 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱이 위암 세포에서 유전자 발현을 조절함을 나타낸다. 도 15a 및 15b는 exon7-결실 MKN1 세포(a) 및 대조군, LRRFIP2 이소형2 및 3-과발현 MKN28 세포(b)에서 변경된 표적 유전자의 발현을 나타낸다. 도 15c는 공개 TCGA 데이터 세트에서 위암 조직의 각 종양 단계에서 COL5A2, LOXL2 및 SEMA3C 발현 수준을 나타내는 박스 플롯이다. T1-T4는 주변 조직으로의 주요 종양의 크기 및/또는 범위를 나타낸다. 중심선은 중앙값이다. 박스는 25번째에서 75번째 백분위이다. 위/아래 whisker는 위쪽 및 아래쪽에 대한 힌지에서 각각 1.5 x IQR(1사분위수와 3사분위수 사이의 거리) 힌지까지 확장된다. 도 15d는 공개 메타 분석 데이터(N=875)에서 LOXL2 및 CDK6 발현 수준에 따른 전체 생존을 나타내는 Kaplan-Meier 분석 결과이다. 도 15a, 15b의 데이터는 3개의 독립적인 실험(N=3)의 평균±SD이다. P 값은 값은 unpaired two-tailed Student's t-tests로 계산되었다. 도 12c, 12d의 P 값은 log-rank test를 사용하여 계산되었다.
도 16은 CARM1이 짧은 무재발 생존 기간을 갖는 종양 조직 및 위암 환자에서 높게 발현됨을 확인한 결과이다. 도 16a는 TCGA 및 GTEx 데이터베이스 기반 GEPIA를 사용한 CARM1의 유전자 발현 분석결과이다. 박스 플롯은 각각 종양(빨간색, N=408) 및 정상(회색, N=211) 샘플에서 log 2(TPM+1) 측면에서 유전자 발현 수준을 나타낸다. 정상 조직은 TCGA 인접 조직 및 GTEx 데이터와 일치한다. 중심선은 중앙값이다. 박스는 25번째에서 75번째 백분위이다. 위/아래 whisker는 위쪽 및 아래쪽에 대한 힌지에서 각각 1.5 x IQR(1사분위수와 3사분위수 사이의 거리) 힌지까지 확장된다. 도 16b는 공개 메타 분석 데이터(N=875)에서 CARM1 발현 수준에 따른 전체 생존을 나타내는 Kaplan-Meier 분석 결과이다. 모든 P 값은 log-rank test를 사용하여 계산되었다.
도 17는 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱이 특정 상호작용을 통해 CARM1의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 조절함을 나타낸 것이다. 도 17a는 질량 분석법 기반 가교 분석에서 분석된 LRRFIP2 결합 파트너 후보를 나타낸 것이다. 도 17b는 293 T 세포에서 HA-CARM1과 Flag-LRRFIP2 이소형 2 또는 3 사이의 상호작용을 나타내는 면역침전 분석 결과이다. 도 17c는 LRRFIP2 이소형 2 또는 3과 내인성 CARM1 사이의 상호 작용을 나타내는 면역 침전 분석 결과이다. 도 17d는 대조군 및 CARM1 siRNA 처리 세포에서 H3R17me2a, 히스톤 H3 및 CARM1을 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 17e는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포에서 H3R17me2a, 히스톤 H3 및 Flag를 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 17f는 대조군 및 엑손 7-결실 세포주에서 H3R17me2a, 히스톤 H3 및 LRRFIP2를 나타내는 면역블롯 및 RT-PCR 분석 결과이다. 도 17g는 siRNA 형질감염에 의한 CARM1 녹다운과 함께 LRRFIP2 이소형 2 또는 3-과발현 MKN28 세포에서 SERPINE1, CARM1, LRRFIP2의 발현을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다. 도 17h, 17i는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포주(h) 및 LRRFIP2 이소형 3 엑손7 결실 MKN1 세포주(i)에서 CARM1, H3R17me2a에 대한 항체를 사용한 인간 SERPINE1 프로모터의 qChIP 분석결과 이다. 도 17j는 도 7k의 전이된 간 조직에서 SERPINE1 및 H3R17me2a 발현을 나타내는 IHC 이미지(왼쪽) 및 IHC 염색의 H-점수 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _200X. 스케일 바, 50μm. 도 4k는 CARM1 녹다운을 사용한 MKN1 세포의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽) 및 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동한 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 17b 내지 17g는 최소 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 대표 결과이다. 도 17h, 17i의 데이터는 3개의 독립적인 샘플의 평균±SD이다(N=3). 도 17j의 데이터는 6개의 독립 샘플의 평균±SD이다(n=6). 도 17k 데이터는 데이터는 3개의 독립적인 샘플의 평균±SD이다(N=3). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다.
도 18는 분획화된 세포 용해물을 면역블롯하여 CARM1 및 LRRFIP2의 세포내 국재화를 나타낸 것이다. 본 결과는 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻었다.
도 19는 BAF155(R1064)의 디메틸화는 위암 세포에서 CARM1 또는 LRRFIP2의 스플라이싱 이소형 또는 발현 수준과 관련이 없음을 나타낸 것이다. 도 19a는 대조군 및 CARM1 siRNA로 형질감염된 MKN1 세포에서 BAF155(R1064)의 메틸화 및 총 BAF155 발현의 이뮤노블롯 분석 결과이다. 도 19b는 CARM1 siRNA로 형질 감염된 MKN1 세포에서 BAF155(R1064)의 메틸화 및 총 BAF155 발현의 이뮤노블롯 분석 및 LRRFIP2 이소형의 RT-PCR 분석 결과이다. c 대조군 및 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포에서의 BAF155(R1064)의 메틸화 및 총 BAF155 발현의 면역블롯 분석 결과이다. 대표 결과는 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻었다.
도 20은 Exon 7 결실에 의한 SERPINE1 프로모터의 루시퍼라제 활성을 감소를 나타낸 것이다. 도 20a는 대조군 및 엑손 7-결실 MKN1 세포를 SERPINE1 프로모터(-1500/+500)로 형질감염시킨 후 루시퍼라제 활성을 분석한 결과이다. 도 20b는 대조군 및 CARM1-넉다운 MKN1 세포를 SERPINE1 프로모터(-1500/+500)로 형질감염시킨 후 루시퍼라제 활성을 분석한 결과이다. 데이터는 각각 3회수행된 세 가지 독립적인 실험의 평균±SD이다(n=3). 모든 통계분석에서 멀티플 테스트에 대한 Benjamini-Hochberg 보정을 사용한 unpaired two-tailed Student's t tests를 수행하였다(P < 0.05).
도 21은 LRRFIP2 이소형 3의 과발현이 CARM1의 표적 유전자의 전사를 유도함을 나타낸다. 도 21a는 대조군 및 LRRFIP2 변이체 2 및 3-과발현 MKN28 세포에서 인간 Cyclin E1 프로모터(-1546bp/-1331bp)에 대한 CARM1의 동원을 나타내는 qChIP 분석결과이다. 침전은 항-정상 IgG 또는 항-CARM1 항체로 수행하였다. 도 21b는 대조군 및 LRRFIP2 변이체 2 및 3-과발현 MKN28 세포에서 CARM1 표적 유전자(CCNE1, AXIN2 및 GADD45A) 및 LRRFIP2의 RT-PCR 분석 결과이다. 도 21a의 데이터는 3개의 독립적인 샘플의 평균±SD 이다. 도 21b의 대표 결과는 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻었다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다.
도 22은 LRRFIP2 이소형 3의 존재 하에 CARM1과 LRRFIP2 이소형 2 사이의 상호작용을 나타내는 면역침강 분석결과로, LRRFIP2 이소형 3의 과발현이 CARM1과 LRRFIP2 변이체 2 사이의 상호작용을 감소시킴을 나타낸다. 본 결과는 적어도 2개의 독립적인 실험에서 얻었다.
도 23는 CARM1과 p160 coactivator ACTR/SRC3/AIB1/NCOA3의 SERPINE1의 전사 조절에 대한 연관성을 나타낸다. 도 23a는 대조군 및 엑손 7-결실 MKN1 세포주에서 내인성 CARM1과 ACTR 구성원 사이의 상호 작용을 나타내는 면역침전 분석 및 LRRFIP2 이소형의 발현을 나타내는 RT-PCR 분석결과이다. 도 23b는 LRRFIP2 이소형 2 및 3 과발현 MKN28 세포주에서 내인성 CARM1과 ACTR 구성원 간의 상호 작용을 나타내는 면역 침전 분석결과이다. 도 23c는 MKN1 세포에서 ACTR의 녹다운 후 H3R17me2a 및 ACTR의 발현을 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 23d MKN1 세포에서 ACTR의 녹다운 후 SERPINE1 및 ACTR의 발현을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다. 도 23e는 대조군 및 ACTR siRNA 형질 감염 후 MKN1 세포에서 CARM1, H3R17me2a에 대한 항체를 사용하여 인간 SERPINE1 프로모터의 qChIP 분석 결과이다. 도 23f는 대조군 및 ACTR-녹다운 MKN1 세포를 SERPINE1 프로모터(-1500/+500)로 형질감염시킨 다음 루시퍼라제 활성을 분석한 결과이다. 도 23g는 ACTR의 녹다운 후 MKN1 세포의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽) 및 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 23h는 SERPINE1, CARM1 및 ACTR의 상대적인 mRNA 발현을 나타내는 qRT-PCR 결과이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다. 도 23a 내지 23c의 결과는 최소 세 번의 독립적인 실험에서 얻었다. 도 23d 내지 23f, 23h의 데이터는 3개의 독립적인 샘플의 대표적인 평균±SD이다(N=3). 도 23g의 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 대표적인 평균±SD이다(N=3).
도 24는 MKN1 세포에서 LRRFIP2 이소형 2의 과발현이 위암 세포의 전이 가능성을 감소시킴을 나타낸다. 도 24a는 내인성 CARM1과 ACTR 사이의 상호 작용을 나타내는 면역 침전 분석 결과이다. 도 24b는 SERPINE1의 mRNA 수준을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다. 도 19c는 Histone H3R17me2의 면역블롯 분석 결과이다. LRRFIP2 이소형 2 과발현 MKN1 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 24a 내지 24c의 결과는 적어도 두 번의 독립적 실험 결과로부터 얻어진 결과이다. 도 24d의 데이터는 3회의 독립적 실험의 평균±SD이다(n=3). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다.
도 25은 EZM2302가 LRRFIP2 이소형 3의 존재 하에서 SERPINE1 발현을 약화시켜 위암 세포의 전이 가능성을 감소시킴을 확인한 것이다. 도 25a는 지시된 시간 동안 EZM2302 처리시 MKN1 세포에서 H3R17me2a 및 히스톤 H3의 발현을 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 25b는 지시된 시간 동안 EZM2302 처리 시 LRRFIP2 이소형 3을 과발현하는 MKN28 세포에서 H3R17me2a, 히스톤 H3 및 Flag의 발현을 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 25c 및 25d는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포주(c) 및 LRRFIP2 이소형 3 엑손 7 결실 MKN1 세포주(d)에서 CARM1, H3R17me2a에 대한 항체와 함께 24시간 동안 EZM2302 처리 시 인간 SERPINE1 프로모터의 qChIP 분석 결과이다. 도 25e는 지시된 시간 동안 EZM2302 처리 시 MKN1 세포에서 SERPINE1 발현을 나타내는 실시간 qRT-PCR 분석 결과이다. 도 25f는 지시된 시간 동안 EZM2302 처리 시 LRRFIP2 이소형 3을 과발현하는 MKN28 세포에서 SERPINE1 발현을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다. 도 25g 및 25h는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포주(g) 및 LRRFIP2 이소형 3 엑손 7 결실 MKN1 세포주(h)를 EZM2302 처리하는 경우 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽) 및 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. P 값은 대조군 0 μM에 대비되며, 그렇지 않으면 표시됨. 도 25i는 전이성 결절을 나타내는 대표적인 전체 간 영상(왼쪽)과 간 전이성 결절의 수를 나타내는 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 도 25j는 도 25i의 전이된 간 조직에서 SERPINE1 및 H3R17me2a 발현 및 H&E 염색을 나타내는 대표적인 IHC 이미지(왼쪽) 및 IHC 염색의 H-점수 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _200X. 스케일 바, 50μm. 도 25a 및 25b의 결과는 적어도 세 번의 독립적 실험 결과로부터 얻어진 결과이다. 도 25c 및 25d의 데이터는 3회의 독립적 샘플의 평균±SD이다(n=3). 도 25g 및 25h의 데이터는 3회의 독립적 실험의 평균±SD이다(n=3). 도 25i의 데이터는 5회의 독립적 동물의 평균±SD이다(n=5). 도 25j의 데이터는 6회의 독립적 측정의 평균±SD이다(n=6). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다. n.s: 유의미하지 않음
도 26은 EZM2302 처리가 in vitro에서 MKN1 및 MKN28 세포의 세포 증식에 영향을 미치지 않음을 나타낸 것이다. 도 26a는 EZM2302 처리로 세포에서 수행된 콜로니 형성 분석결과이다. 도 26b는 EZM2302 처리로 LRRFIP2 이소형 2 및 3을 과발현하는 MKN28 세포의 세포 더블링을 나타낸 것이다. 도 26c는 EZM2302 처리로 LRRFIP2 이소형 2 및 3 과발현 MKN28 세포에서 수행된 콜로니 형성 검정결과이다. 도 26d는 EZM2302 처리로 대조군 및 엑손 7 결실 MKN1 세포의 세포 더블링을 나타낸 것이다. 도 26e는 EZM2302 처리된 대조군 및 엑손7 결실 MKN1 세포에서 수행된 콜로니 형성 분석 결과이다. 데이터는 3회의 독립적 실험의 평균±SD이다(n=3). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다. n.s: 유의미하지 않음
도 2는 LRRFIP2 선택적 스플라이싱 상대빈도와 인간 위암 세포주 및 위암 환자 조직에서의 ESRP1의 발현 수준과의 연관성을 나타낸 것이다. 도 2a는 위암 세포주에서 차별적으로 발현되는 ESRP1의 발현 수준을 나타내는 막대 그래프이다. 도 2b, 2c는 ESRP1-low(b) 및 ESRP1-high(c) 조건에서 선택적으로 발현된 20개의 스플라이싱 변형의 상대적 TPM을 나타내는 히트맵이다. 도 2d, 2e는 ESRP1-low 세포주(b) 및 ESRP1-high 세포주(c)에서 상향 조절된 차별적으로 발현된 유전자가 풍부한 KEGG 경로 및 GO terms을 나타낸 것이다. 도 2f는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 차별적으로 표현되는 인간 LRRFIP2 이소형을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 2g는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 LRRFIP2의 엑손 사용 및 스플라이싱을 나타낸 사시미 플롯이다. 아치와 숫자는 엑손-엑손 접합에서 RNA-seq read를 나타낸다. 도 2h는 위암 세포주에서 LRRFIP2 엑손 7의 PSI에서의 도트플롯을 나타낸다. 데이터는 ESRP1-low (N=5) 및 ESRP1-high (N=13)에서 개별 세포주의 평균 PSI±SD이다. 도 2i는 동일한 프라이머 세트를 사용하는 LRRFIP2 변이체의 PCR 분석결과를 개략적으로 나타낸 것이다. 도 2j는 18개의 위암 세포주에서 LRRFIP2 이소형 2(빨간색으로 표시) 및 이소형 3(파란색으로 표시)의 발현 수준을 나타내는 막대 그래프 및 RT-PCR 결과이다. 도 2k 내지 2n은 공개 TCGA 데이터 세트의 위암 조직에서 ESRP1 및 LRRFIP2 이소형 3 발현 수준을 나타낸 박스플롯이다. k, l: 암 단계 I-IV 및 m, n: 비전이성 위암 및 전이성 위암. 중심선은 중앙값이다. 박스는 25번째에서 75번째 백분위이다. 위/아래 whisker는 위쪽 및 아래쪽에 대한 힌지에서 각각 1.5 x IQR(1사분위수와 3사분위수 사이의 거리) 힌지까지 확장된다. 도 2o는 일치하는 정상 조직과 비교하여 종양에서 LRRFIP2 이소형 3(LRRFIP2-V3) 발현 수준이 고도로 상향조절된 환자(≥2배)(N=12) 및 IV기 위암 데이터세트의 다른 환자(N=25 사이의 생존 차이를 나타내는 Kaplan-Meier 곡선 플롯을 나타낸 것이다. 전체생존기간은 4기 진단일로부터 사망까지의 시간(개월)으로 정의하였다. 도 1h에 대한 P 값은 unpaired two-tailed Student's t-tests로 계산하였다. 1k 내지 1o에 대한 P 값은 log-rank test에서 계산되었다.
도 3는 ESRP1 발현 및 위암 세포에서 EMT 마커의 발현의 상관관계를 나타낸 것으로 ESRP1-low 위암 세포주(SNU668, SNU5 및 MKN1), 및 ESRP1-high 위암 세포주(KATOIII, MKN74 및 MKN28)에서 EMT 마커의 면역블롯 분석결과이다. 본 도의 결과는 적어도 두 번의 독립실험 결과이다.
도 4는 CCDC50 및 BICD2의 스플라이싱 변이는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 엑손 스킵핑 이벤트를 차등적으로 나타낸다. 도 4a는 도 3b 및 도 3c로부터 CCDC50(NM_178335) 엑손 6와 ESRP1(TPM)의 연관성을 피어슨 상관관계 분석으로 나타낸 것이다(R=0.6562,P0.0031). 도 4c 및 4d는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 차등적으로 발현되는 인간 CCDC50(c) 및 BICD2 (d) 이소형을 도식화 한 것이다. 화살표는 선택적 스플라이싱 빈도가 ESRP1의 발현수준과 관련된 엑손을 나타낸다. 도 4e, 4f는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 CCDC50(e) 및 BICD2 (f)의 엑손 사용 및 스플라이싱을 나타낸 것이다. 아치와 숫자는 엑손-엑손 접합부에서 RNA-seq reads를 나타낸다.
도 5은 위암 조직에서 LRRFIP2 스플라이싱의 상대빈도와 ESRP1의 발현 수준의 연관성을 나타낸 것이다. 도 5a는 위암 조직에서 차별적으로 발현되는 ESRP의 발현 수준을 나타낸 막대 그래프이다. 도 5b 및 5c는 ESRP1-low(b) 및 ESRP1-high(c) 조건에서 선택적으로 발현된 20 개의 스플라이싱 변형의 상대적 TPM을 나타낸 히트맵이다. 도 5d 및 5e는 도 5b 및 5c에서 상향 조절 발현된 유전자가 풍부화된 KEGG 경로 및 GO terms를 나타낸 것이다. 도 5f는 ESRP1-low 및 ESRP1-high 조건에서 LRRFIP2의 엑손 사용 및 스플라이싱을 나타낸 것이다. 아치와 숫자는 엑손-엑손 접합부에서 RNA-seq reads를 나타낸다. 도 5g는 18명의 환자 조직 샘플에서 LRRFIP2 엑손 7의 PSI 값과 ESRP1 발현(TPM) 간의 피어슨 상관관계를 나타낸 것이다(R=-0.7724, P=0.0002). 도 5h는 ESRP1-low 또는 ESRP1-high 위암 조직에서 LRRFIP2 이소형 2와 이소형 3의 발현 정도를 나타낸 RT-PCR 결과이다. 결과는 적어도 두 번의 독립실험 결과이다.
도 6는 LRRFIP 이소형 2 및 3과 ESRP1의 상관관계를 나타낸 것으로 18개의 세포주에서 고도로 발현된다. 도 6a는 LRRFIP2의 4가지 이소형을 개략적으로 나타낸 것이다. 회색 상자는 엑손을 나타낸다. Eh6b는 ESRP1-low(N=5) 및 ESRP1-high(N=13) 조건에서 4개의 선택적 스플라이싱된 이소형의 TPM 프로파일로부터 나타낸 도트플롯이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests를 통해 계산되었다. 상기 데이터는 평균±S.D. 값이다.
도 7는 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7이 in vivo 및 in vitro에서 위암 세포의 전이 가능성을 결정함을 나타내는 도면이다. 도 7a는 ESRP1 단백질을 안정적으로 발현하는 MKN1 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 각각 침입 및 이동된 세포의 수를 나타내는 막대 그래프이다(오른쪽). 원본 확대 배율 _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 7b는 ESRP1 및 LRRFIP2 이소형 2 및 3의 과발현을 나타낸 RT-PCR 분석결과이다. 도 7c는 ESRP1 면역 침전의 면역블롯 및 RT-PCR 분석 결과이다. 도 7d는 LPCX-Flag-LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포의 면역블롯 및 RT-PCR 분석 결과이다. 도 7e는 LRRFIP2 이소형 2 및 3 단백질을 안정적으로 발현하는 MKN28 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 각각 침입 및 이동된 세포의 수를 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율 _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 7f는 전이성 결절을 나타내는 전체 간 이미지(왼쪽)와 간 전이성 결절의 수를 나타내는 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 도 7g는 7f에서 전이된 간 부분을 나타내는 H&E 염색 결과이다. 원본 확대 배율, _100X. 스케일 바, 100μm. 도 7h는 CRISPR/Cas9 시스템에 의한 엑손 7 결실을 개략적으로 나타낸 것이다. 도 7i는 엑손 7-결실 세포주에서 LRRFIP2의 RT-PCR 분석 결과이다. 도 7j는 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 엑손 7-결실 세포주(상단)의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(상단)과 각각 침입 및 이동된 세포의 수를 나타내는 막대 그래프(하단)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 7k는 전이성 결절을 나타내는 전체 간 영상(왼쪽)과 간 전이성 결절의 수를 나타내는 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 도 7l은 7k에서 전이된 간 부분을 나타내는 H&E 염색 결과이다. 원본 확대 배율, _100X. 스케일 바, 100μm. 도 7a, 7e, 7j의 데이터는 3번의 실험의 평균±SD이다(N=3). 도 7b-7d, 7i 는 최소 세 번의 독립적인 실험 결과이다. 도 7f는 5마리의 독립적 동물의 대표적인 평균 ± SD 값이다 (n=5). 도 7k는 4마리의 독립적 동물의 대표적인 평균 ± SD 값이다 (n=4). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다. 상기 데이터는 평균±S.D로 표시된다.
도 8은 ESRP1의 과발현 또는 LRRFIP2의 스플라이싱 변형이 위암 세포의 종양 형성을 변경시키지 않음을 나타낸 것이다. 도 8a는 대조군 및 ESRP-과발현 MKN1 세포의 세포 배가 시간을 나타낸 것이다. 각 점은 세번의 실험 결과에서 계산된 세포 수의 평균을 나타낸다. 도 8b는 대조군 및 ESRP-과발현 MKN1 세포에서 Foci 형성을 나타낸 것이다. 도 8c는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28세포의 세포 배가 시간을 나타낸 것이다. 도 8d는 면역결핍 마우스의 옆구리에 피하 주사된 대조군 및 LRRFIP2 변이체 2 및 3-과발현 MKN28 세포의 종양 형성 및 성장을 나타낸 것이다(n=6). 원발성 종양 이미지(왼쪽)와 종양 중량(오른쪽)을 나타낸다. 도 8e는 대조군 및 엑손 7-결실 MKN1 세포의 세포 배가 시간을 나타낸 것이다. 도 8f는 대조군 및 엑손 7-결실 MKN1 세포의 foci 형성을 나타낸 것이다. 도 8a, 8b, 8e, 8f의 데이터는 세 가지 독립적인 실험의 평균±SD 값을 나타낸다. 도 8d의 데이터는 5마리의 독립적인 동물(n=5)의 평균±SD 값이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests를 통해 계산되었다. ns: 유의미하지 않음.
도 9은 MKN28 세포에서 LRRFIP2 전사체에 ESRP1이 직접적으로 결합함을 나타낸 것으로 LRRFIP2 이소형 유전자 내 ESRP1 결합 부위를 개략적으로 나타낸 것이다. 붉은 상자는 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7을 나타내며, 회색 상자는 도 7c의 표적 서열을 나타낸 것이다.
도 10은 LRRFIP2 이소형 3의 과발현에 따른 MKN74 세포의 침습성 및 이동의 향상을 나타낸 것이다. 도 10a는 LRRFIP2 이소형 2 및 3 과발현 MKN세포의 트랜스웰 이동 분석 및 매트리겔 침입 분석(왼쪽), 및 크리스탈 바이올렛 염색 후 침입 및 이동된 세포의 수를 나타낸 막대 그래프(오른쪽)이다(40x, 스케일바=0.5mm). 도 10b LRRFIP2 이소형 2 및 3을 과발현하는 MKN74 세포에서 LRRFIP2 및 SERPINE1의 RT-PCR 분석을 나타낸 것이다. 도 10c는 Flag-태그된 LRRFIP2 및 히스톤 H3R17 메틸화를 면역블롯분석을 통해 나타낸 것이다. 도 10a의 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균±SD를 나타낸다. 도 10b 및 10c는 적어도 2번의 독립 실험으로부터 얻어진 대표 결과이다. 데이터는 평균±S.D. 값이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests를 통해 계산되었다.
도 11는 CRISPR/Cas9 시스템으로 엑손 7이 녹아웃된 세포주를 생성한 결과이다. 도 11a는 엑손 7을 djwf제하도록 설계된 CRISPR/Cas9의 두 표적 부위를 나타낸다. 도 11b는 클론 선택 후 클론의 시퀀싱 결과를 나타낸 것이다. 도 11c는 녹아웃 클론에서 LRRFIP2를 RT-PCR 분석한 결과를 나타낸 것이다. 2% 아가로스 겔을 사용하여 이소형(294bp 및 222bp)의 밴드를 관찰하였다.
도 12은 LRRFIP2 엑손 7의 녹아웃이 SNU484 세포의 전이 가능성을 감소시킴을 나타낸 것이다. 도 12a는 엑손 7-결실 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 12b는 엑손 7 결실 SNU484 세포에서 LRRFIP2 및 SERPINE1의 RT-PCR 분석 결과이다. 도 12c는 엑손 7 결실 SNU484 세포에서 LRRFIP2 및 히스톤 H3R17 메틸화의 면역블롯 분석결과이다. 도 12a의 데이터는 3개의 독립적인 실험의 평균±SD이다(N=3). 도 12b, 12c은 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻은 대표 결과이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다.
도 13은 엑손 7 녹아웃 세포주에서 LRRFIP2 이소형 3의 과발현은 위암 세포의 침입과 이동을 회복시킴을 나타낸 결과이다. 도 13a는 대조군, 엑손 7- 녹아웃 및 LRRFIP2 이소형 3 회복 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 13b는 히스톤 H3R17 메틸화 및 LRRFIP2의 면역블롯 분석 결과이다. 도 13c는 MKN1 대조군 및 엑손 7 녹아웃 세포에서 LRRFIP2 및 SERPINE1의 RT-PCR 분석결과이다. 도 13d는 LRRFIP2 이소형 3의 과발현 후 SERPINE1 프로모터의 루시퍼라제 활성을 나타낸 것이다. 도 13a의 데이터는 3번의 독립적인 실험의 평균±SD 이다(N=3). 도 13b, 13c는 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻어진 대표 결과이다. 도 13d의 데이터는 각각 3회의 독립적인 실험의 평균±SD이다(n=3). 모든 통계분석에서 멀티플 테스트에 대한 Benjamini-Hochberg 보정을 사용한 unpaired two-tailed Student's t tests를 수행하였다(P < 0.05). 상기 데이터는 평균±SD 이다.
도 14은 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱이 위암 세포에서 전이 관련 유전자 네트워크를 조절함을 나타낸 것이다. 도 14a는 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7이 결실된 MKN1 세포에서 하향 조절된 유전자를 나타내는 히트맵이다. 임계값은 다음과 같다: corrected P value < 0.01 및 absolute log2-fold change >1.0. 도 14b는 14a에서 엑손 7의 결실에 의해 하향 조절되는 차별적으로 발현되는 유전자가 풍부한 KEGG 경로 및 GO terms 이다. 도 14c는 exon 7 결실 MKN1 세포에서 변경된 표적 유전자의 발현을 나타내는 실시간 qRT-PCR 결과이다. 도 14d는 LRRFIP2 이소형 2 및 3을 안정적으로 발현하는 MKN28 세포에서 14c로부터 변경된 표적 유전자의 발현을 나타내는 실시간 qRT-PCR 결과이다. 도 14e는 공개 TCGA 데이터 세트에서 위암 조직의 각 종양 단계에서 SERPINE1 발현 수준을 나타내는 박스 플롯이다. T1-T4는 주변 조직으로의 주요 종양의 크기 및/또는 범위를 나타낸다. 중심선은 중앙값이다. 박스는 25번째에서 75번째 백분위이다. 위/아래 whisker는 위쪽 및 아래쪽에 대한 힌지에서 각각 1.5 x IQR(1사분위수와 3사분위수 사이의 거리) 힌지까지 확장된다. 도 14f는 공개 메타 분석 데이터(N=875)에서 SERPINE1 발현 수준에 따라 무재발 생존을 나타내는 Kaplan-Meier 분석결과이다. 도 14c 및 14d의 P 값은 unpaired two-tailed Student's t-tests로 계산되었다. 도 14e의 P 값은 two-sided Wilcoxon rank sum tests로 계산되었다. 도 14f의 P 값은 log-rank test로 계산되었다. 도 14c, 14d의 데이터는 3번의 독립 샘플의 평균±SD 값이다(N=3). n.s: 유의미하지 않음.
도 15는 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱이 위암 세포에서 유전자 발현을 조절함을 나타낸다. 도 15a 및 15b는 exon7-결실 MKN1 세포(a) 및 대조군, LRRFIP2 이소형2 및 3-과발현 MKN28 세포(b)에서 변경된 표적 유전자의 발현을 나타낸다. 도 15c는 공개 TCGA 데이터 세트에서 위암 조직의 각 종양 단계에서 COL5A2, LOXL2 및 SEMA3C 발현 수준을 나타내는 박스 플롯이다. T1-T4는 주변 조직으로의 주요 종양의 크기 및/또는 범위를 나타낸다. 중심선은 중앙값이다. 박스는 25번째에서 75번째 백분위이다. 위/아래 whisker는 위쪽 및 아래쪽에 대한 힌지에서 각각 1.5 x IQR(1사분위수와 3사분위수 사이의 거리) 힌지까지 확장된다. 도 15d는 공개 메타 분석 데이터(N=875)에서 LOXL2 및 CDK6 발현 수준에 따른 전체 생존을 나타내는 Kaplan-Meier 분석 결과이다. 도 15a, 15b의 데이터는 3개의 독립적인 실험(N=3)의 평균±SD이다. P 값은 값은 unpaired two-tailed Student's t-tests로 계산되었다. 도 12c, 12d의 P 값은 log-rank test를 사용하여 계산되었다.
도 16은 CARM1이 짧은 무재발 생존 기간을 갖는 종양 조직 및 위암 환자에서 높게 발현됨을 확인한 결과이다. 도 16a는 TCGA 및 GTEx 데이터베이스 기반 GEPIA를 사용한 CARM1의 유전자 발현 분석결과이다. 박스 플롯은 각각 종양(빨간색, N=408) 및 정상(회색, N=211) 샘플에서 log 2(TPM+1) 측면에서 유전자 발현 수준을 나타낸다. 정상 조직은 TCGA 인접 조직 및 GTEx 데이터와 일치한다. 중심선은 중앙값이다. 박스는 25번째에서 75번째 백분위이다. 위/아래 whisker는 위쪽 및 아래쪽에 대한 힌지에서 각각 1.5 x IQR(1사분위수와 3사분위수 사이의 거리) 힌지까지 확장된다. 도 16b는 공개 메타 분석 데이터(N=875)에서 CARM1 발현 수준에 따른 전체 생존을 나타내는 Kaplan-Meier 분석 결과이다. 모든 P 값은 log-rank test를 사용하여 계산되었다.
도 17는 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱이 특정 상호작용을 통해 CARM1의 히스톤 메틸트랜스퍼라제 활성을 조절함을 나타낸 것이다. 도 17a는 질량 분석법 기반 가교 분석에서 분석된 LRRFIP2 결합 파트너 후보를 나타낸 것이다. 도 17b는 293 T 세포에서 HA-CARM1과 Flag-LRRFIP2 이소형 2 또는 3 사이의 상호작용을 나타내는 면역침전 분석 결과이다. 도 17c는 LRRFIP2 이소형 2 또는 3과 내인성 CARM1 사이의 상호 작용을 나타내는 면역 침전 분석 결과이다. 도 17d는 대조군 및 CARM1 siRNA 처리 세포에서 H3R17me2a, 히스톤 H3 및 CARM1을 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 17e는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포에서 H3R17me2a, 히스톤 H3 및 Flag를 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 17f는 대조군 및 엑손 7-결실 세포주에서 H3R17me2a, 히스톤 H3 및 LRRFIP2를 나타내는 면역블롯 및 RT-PCR 분석 결과이다. 도 17g는 siRNA 형질감염에 의한 CARM1 녹다운과 함께 LRRFIP2 이소형 2 또는 3-과발현 MKN28 세포에서 SERPINE1, CARM1, LRRFIP2의 발현을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다. 도 17h, 17i는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포주(h) 및 LRRFIP2 이소형 3 엑손7 결실 MKN1 세포주(i)에서 CARM1, H3R17me2a에 대한 항체를 사용한 인간 SERPINE1 프로모터의 qChIP 분석결과 이다. 도 17j는 도 7k의 전이된 간 조직에서 SERPINE1 및 H3R17me2a 발현을 나타내는 IHC 이미지(왼쪽) 및 IHC 염색의 H-점수 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _200X. 스케일 바, 50μm. 도 4k는 CARM1 녹다운을 사용한 MKN1 세포의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽) 및 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동한 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 17b 내지 17g는 최소 세 번의 독립적인 실험에서 얻은 대표 결과이다. 도 17h, 17i의 데이터는 3개의 독립적인 샘플의 평균±SD이다(N=3). 도 17j의 데이터는 6개의 독립 샘플의 평균±SD이다(n=6). 도 17k 데이터는 데이터는 3개의 독립적인 샘플의 평균±SD이다(N=3). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다.
도 18는 분획화된 세포 용해물을 면역블롯하여 CARM1 및 LRRFIP2의 세포내 국재화를 나타낸 것이다. 본 결과는 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻었다.
도 19는 BAF155(R1064)의 디메틸화는 위암 세포에서 CARM1 또는 LRRFIP2의 스플라이싱 이소형 또는 발현 수준과 관련이 없음을 나타낸 것이다. 도 19a는 대조군 및 CARM1 siRNA로 형질감염된 MKN1 세포에서 BAF155(R1064)의 메틸화 및 총 BAF155 발현의 이뮤노블롯 분석 결과이다. 도 19b는 CARM1 siRNA로 형질 감염된 MKN1 세포에서 BAF155(R1064)의 메틸화 및 총 BAF155 발현의 이뮤노블롯 분석 및 LRRFIP2 이소형의 RT-PCR 분석 결과이다. c 대조군 및 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포에서의 BAF155(R1064)의 메틸화 및 총 BAF155 발현의 면역블롯 분석 결과이다. 대표 결과는 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻었다.
도 20은 Exon 7 결실에 의한 SERPINE1 프로모터의 루시퍼라제 활성을 감소를 나타낸 것이다. 도 20a는 대조군 및 엑손 7-결실 MKN1 세포를 SERPINE1 프로모터(-1500/+500)로 형질감염시킨 후 루시퍼라제 활성을 분석한 결과이다. 도 20b는 대조군 및 CARM1-넉다운 MKN1 세포를 SERPINE1 프로모터(-1500/+500)로 형질감염시킨 후 루시퍼라제 활성을 분석한 결과이다. 데이터는 각각 3회수행된 세 가지 독립적인 실험의 평균±SD이다(n=3). 모든 통계분석에서 멀티플 테스트에 대한 Benjamini-Hochberg 보정을 사용한 unpaired two-tailed Student's t tests를 수행하였다(P < 0.05).
도 21은 LRRFIP2 이소형 3의 과발현이 CARM1의 표적 유전자의 전사를 유도함을 나타낸다. 도 21a는 대조군 및 LRRFIP2 변이체 2 및 3-과발현 MKN28 세포에서 인간 Cyclin E1 프로모터(-1546bp/-1331bp)에 대한 CARM1의 동원을 나타내는 qChIP 분석결과이다. 침전은 항-정상 IgG 또는 항-CARM1 항체로 수행하였다. 도 21b는 대조군 및 LRRFIP2 변이체 2 및 3-과발현 MKN28 세포에서 CARM1 표적 유전자(CCNE1, AXIN2 및 GADD45A) 및 LRRFIP2의 RT-PCR 분석 결과이다. 도 21a의 데이터는 3개의 독립적인 샘플의 평균±SD 이다. 도 21b의 대표 결과는 최소 두 번의 독립적인 실험에서 얻었다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다.
도 22은 LRRFIP2 이소형 3의 존재 하에 CARM1과 LRRFIP2 이소형 2 사이의 상호작용을 나타내는 면역침강 분석결과로, LRRFIP2 이소형 3의 과발현이 CARM1과 LRRFIP2 변이체 2 사이의 상호작용을 감소시킴을 나타낸다. 본 결과는 적어도 2개의 독립적인 실험에서 얻었다.
도 23는 CARM1과 p160 coactivator ACTR/SRC3/AIB1/NCOA3의 SERPINE1의 전사 조절에 대한 연관성을 나타낸다. 도 23a는 대조군 및 엑손 7-결실 MKN1 세포주에서 내인성 CARM1과 ACTR 구성원 사이의 상호 작용을 나타내는 면역침전 분석 및 LRRFIP2 이소형의 발현을 나타내는 RT-PCR 분석결과이다. 도 23b는 LRRFIP2 이소형 2 및 3 과발현 MKN28 세포주에서 내인성 CARM1과 ACTR 구성원 간의 상호 작용을 나타내는 면역 침전 분석결과이다. 도 23c는 MKN1 세포에서 ACTR의 녹다운 후 H3R17me2a 및 ACTR의 발현을 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 23d MKN1 세포에서 ACTR의 녹다운 후 SERPINE1 및 ACTR의 발현을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다. 도 23e는 대조군 및 ACTR siRNA 형질 감염 후 MKN1 세포에서 CARM1, H3R17me2a에 대한 항체를 사용하여 인간 SERPINE1 프로모터의 qChIP 분석 결과이다. 도 23f는 대조군 및 ACTR-녹다운 MKN1 세포를 SERPINE1 프로모터(-1500/+500)로 형질감염시킨 다음 루시퍼라제 활성을 분석한 결과이다. 도 23g는 ACTR의 녹다운 후 MKN1 세포의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽) 및 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 23h는 SERPINE1, CARM1 및 ACTR의 상대적인 mRNA 발현을 나타내는 qRT-PCR 결과이다. 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다. 도 23a 내지 23c의 결과는 최소 세 번의 독립적인 실험에서 얻었다. 도 23d 내지 23f, 23h의 데이터는 3개의 독립적인 샘플의 대표적인 평균±SD이다(N=3). 도 23g의 데이터는 세 번의 독립적인 실험의 대표적인 평균±SD이다(N=3).
도 24는 MKN1 세포에서 LRRFIP2 이소형 2의 과발현이 위암 세포의 전이 가능성을 감소시킴을 나타낸다. 도 24a는 내인성 CARM1과 ACTR 사이의 상호 작용을 나타내는 면역 침전 분석 결과이다. 도 24b는 SERPINE1의 mRNA 수준을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다. 도 19c는 Histone H3R17me2의 면역블롯 분석 결과이다. LRRFIP2 이소형 2 과발현 MKN1 세포주의 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽)과 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. 도 24a 내지 24c의 결과는 적어도 두 번의 독립적 실험 결과로부터 얻어진 결과이다. 도 24d의 데이터는 3회의 독립적 실험의 평균±SD이다(n=3). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다.
도 25은 EZM2302가 LRRFIP2 이소형 3의 존재 하에서 SERPINE1 발현을 약화시켜 위암 세포의 전이 가능성을 감소시킴을 확인한 것이다. 도 25a는 지시된 시간 동안 EZM2302 처리시 MKN1 세포에서 H3R17me2a 및 히스톤 H3의 발현을 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 25b는 지시된 시간 동안 EZM2302 처리 시 LRRFIP2 이소형 3을 과발현하는 MKN28 세포에서 H3R17me2a, 히스톤 H3 및 Flag의 발현을 나타내는 면역블롯 분석 결과이다. 도 25c 및 25d는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포주(c) 및 LRRFIP2 이소형 3 엑손 7 결실 MKN1 세포주(d)에서 CARM1, H3R17me2a에 대한 항체와 함께 24시간 동안 EZM2302 처리 시 인간 SERPINE1 프로모터의 qChIP 분석 결과이다. 도 25e는 지시된 시간 동안 EZM2302 처리 시 MKN1 세포에서 SERPINE1 발현을 나타내는 실시간 qRT-PCR 분석 결과이다. 도 25f는 지시된 시간 동안 EZM2302 처리 시 LRRFIP2 이소형 3을 과발현하는 MKN28 세포에서 SERPINE1 발현을 나타내는 RT-PCR 분석 결과이다. 도 25g 및 25h는 LRRFIP2 이소형 2 및 3-과발현 MKN28 세포주(g) 및 LRRFIP2 이소형 3 엑손 7 결실 MKN1 세포주(h)를 EZM2302 처리하는 경우 Transwell 이동 분석 및 Matrigel 침입 분석(왼쪽) 및 크리스탈 바이올렛으로 염색한 후 침입 및 이동된 세포의 수를 각각 나타내는 막대 그래프(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _40X. 스케일 바, 0.5mm. P 값은 대조군 0 μM에 대비되며, 그렇지 않으면 표시됨. 도 25i는 전이성 결절을 나타내는 대표적인 전체 간 영상(왼쪽)과 간 전이성 결절의 수를 나타내는 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 도 25j는 도 25i의 전이된 간 조직에서 SERPINE1 및 H3R17me2a 발현 및 H&E 염색을 나타내는 대표적인 IHC 이미지(왼쪽) 및 IHC 염색의 H-점수 스캐터 플롯(오른쪽)이다. 원본 확대 배율, _200X. 스케일 바, 50μm. 도 25a 및 25b의 결과는 적어도 세 번의 독립적 실험 결과로부터 얻어진 결과이다. 도 25c 및 25d의 데이터는 3회의 독립적 샘플의 평균±SD이다(n=3). 도 25g 및 25h의 데이터는 3회의 독립적 실험의 평균±SD이다(n=3). 도 25i의 데이터는 5회의 독립적 동물의 평균±SD이다(n=5). 도 25j의 데이터는 6회의 독립적 측정의 평균±SD이다(n=6). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다. n.s: 유의미하지 않음
도 26은 EZM2302 처리가 in vitro에서 MKN1 및 MKN28 세포의 세포 증식에 영향을 미치지 않음을 나타낸 것이다. 도 26a는 EZM2302 처리로 세포에서 수행된 콜로니 형성 분석결과이다. 도 26b는 EZM2302 처리로 LRRFIP2 이소형 2 및 3을 과발현하는 MKN28 세포의 세포 더블링을 나타낸 것이다. 도 26c는 EZM2302 처리로 LRRFIP2 이소형 2 및 3 과발현 MKN28 세포에서 수행된 콜로니 형성 검정결과이다. 도 26d는 EZM2302 처리로 대조군 및 엑손 7 결실 MKN1 세포의 세포 더블링을 나타낸 것이다. 도 26e는 EZM2302 처리된 대조군 및 엑손7 결실 MKN1 세포에서 수행된 콜로니 형성 분석 결과이다. 데이터는 3회의 독립적 실험의 평균±SD이다(n=3). 모든 P 값은 unpaired two-tailed Student's t tests로 계산되었다. n.s: 유의미하지 않음
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로 본 명세서에서 사용된 명명법 및 이하에 기술하는 실험 방법은 본 기술 분야에서 잘 알려져 있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명에서는, 암 세포에서 ESRP1의 선택적 스플라이싱 타겟으로서 LRRFIP2 (Leucine-rich repeat Fli-1-interacting protein 2)유전자를 동정하였으며, LRRFIP2의 보고된 이소형 중 서열번호 5로 표시되는 엑손 7의 스플라이싱 여부에 따라 위암 세포의 전이성이 유의하게 연관되어 있는 것을 확인하였다.
보다 구체적으로는 LRRFIP2 이소형 2 및 LRRFIP2 이소형 3 중에서, 진행성 및/또는 전이성 암 세포에서 LRRFIP2 이소형 3의 발현 수준이 높음을 확인하였으며, LRRFIP2 이소형 2는 CARM1과 상호작용을 통해 CARM1 표적 유전자의 발현을 억제하여 암의 진행성 및/또는 전이성을 낮추는데 반해 LRRFIP2 이소형 3은 LRRFIP2 이소형 2의 CARM1 상호작용을 억제하여, CARM1의 표적 유전자의 발현을 증가시켜 결과적으로 보고된 암의 진행성 및 전이성 마커의 발현을 증가시키고, 중간엽 표현형을 나타내도록 하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 일 관점에서, (a)대상으로부터 분리된 시료에서 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측방법에 관한 것이다.
본 발명은 다른 관점에서, 상기 (a) 단계를 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, “대상”은 본 발명의 방법을 통해 암의 전이 또는 예후를 예측하고자 하는 대상을 의미하며, 상기 대상은 암을 앓거나 암을 앓는 것으로 의심되는 것을 특징으로 할 수 있다. 예를 들어, 상기 대상은 바람직하게는 포유 동물, 더욱 바람직하게는 인간일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 사용된 용어, “대상으로부터 분리된 시료”는 대상으로부터 분리된 조직, 세포의 집단 또는 단독 세포를 의미할 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 조직, 세포의 집단 또는 단독세포는 예를 들어, 암 조직 또는 암으로 의심되는 부위 또는 그 주변의 조직 또는 세포, 보다 바람직하게는 종양 스페로이드 또는 종양 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 용어 “LRRFIP2(LRR Binding FLII Interacting Protein 2)”는 Flightless-I의 결합 파트너로 처음 보고되었으며, Wnt 신호 조절 및 caspase-1 억제 등을 통한 염증 인자로 잘 알려져 있다. 암의 진행 및 전이성에 관한 LRRFIP2의 역할은 보고된 바 없으나, 본 발명에서는 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱에 따른 암의 진행 및 전이성과의 연관성을 상세히 규명하였다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 단백질 또는 LRRFIP2 유전자 서열은 다양한 유전자/단백질 데이터 베이스에서 검색 가능하며, 본 발명의 예후 예측을 위한 대상에 따른 LRRFIP2 단백질 또는 LRRFIP2 유전자 서열을 쉽게 확인할 수 있다. 예를 들어, 대상이 인간인 경우 LRRFIP2 전장 유전자 서열은 NCBI Gene ID: 9209와 같다.
LRRFIP2 유전자는 약 33개의 엑손을 갖는 것으로 보고되며, 선택적 스플라이싱을 통해 다양한 이소형으로 발현된다. 예를 들어, LRRFIP2 유전자의 이소형은 LRRFIP2 이소형 1(유전자: NM_006309.4, 단백질: NP_006300.1), LRRFIP2 이소형 2(유전자: NM_017724.2(서열번호 1), 단백질: NP_060194.1(서열번호 2)), LRRFIP2 이소형 3(유전자: NM_001134369.2(서열번호 3), 단백질: NP_001127841.1(서열번호 4)), LRRFIP2 이소형 4(유전자: NM_ 001282691.1, 단백질: NP_001269620.1) 등이 보고되었다.
본 발명에 있어서, 상기 암의 전이 또는 예후 예측은 LRRFIP2 이소형 3의 발현 수준에 기반하여 수행되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 대상이 인간인 경우, LRRFIP2 이소형 3의 cDNA는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. LRRFIP2 이소형 3의 cDNA는 서열번호 1로 표시되는 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA와 비교하여, 서열번호 5로 표시되는 서열이 스킵되지 않고 발현하는 것을 특징으로 한다. 본 발명에서 LRRFIP2 이소형 3이 추가로 포함하는 서열번호 5의 서열은 LRRFIP2 이소형 3의 7번째 엑손으로서, 이하 “엑손 7”으로 명명된다.
본 발명에 있어서, 상기 대상이 인간인 경우, LRRFIP2 이소형 3 단백질의 서열은 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질은 서열번호 2로 표시되는 LRRFIP2 이소형 2 단백질 서열과 비교하여, 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 추가로 포함한다.
본 발명에 있어서, 상기 대상이 인간이 아닌 경우, LRRFIP2 이소형의 서열은 본 발명에 기재된 인간 LRRFIP2 이소형의 mRNA(또는 cDNA) 서열 또는 단백질 서열과의 정렬(alignment)를 통해 상응하는 LRRFIP2 이소형 서열을 쉽게 이해할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계는 표적 유전자 또는 표적 단백질의 수준을 측정하는 당업계에 알려진 다양한 기술을 통해 수행될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준”은 대상 또는 대상으로부터 분리된 시료에 포함된 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 또는 단백질의 양을 통해 측정 가능하며, 상기 수준은 절대적 양을 의미하는 절대적 수준 또는 대조 시료 또는 다른 대조 유전자 또는 단백질(예, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 또는 단백질)과의 상대적 수준을 모두 포함하는 의미로 사용된다.
예를 들어, 본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준 측정은 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드, 및 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준 측정은 보다 바람직하게는 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 엑손 7(서열번호 5) 부위에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드, 및 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 엑손 7(서열번호 5) 부위를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머로 구성된 군에서 선택될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
또 다른 예를 들어, 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준 측정은 RNA 시퀀싱을 이용한 전사체 분석을 통해 수행될 수 있다. 본 발명의 실시예에서는 시료로부터 분리된 RNA의 역전사를 통해 제조된 cDNA 라이브러리의 전사체 분석을 통해 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 발현 수준을 확인하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에서 용어, "프라이머"는 짧은 자유 3 말단 수산화기(free 3` hydroxyl group)을 가지는 핵산 서열로 상보적인 주형(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 주형의 복사를 위한 시작지점으로는 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 본 발명에서는 본 발명 GPC-3 단백질을 암호화하는 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 위암의 전이 또는 예후를 예측할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 "프로브"란 mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오티드 프로브, 단쇄 DNA(single straned DNA) 프로브, 이중쇄 DNA (double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준 측정은 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 예를 들어, LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer) 중 어느 하나 이상을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 LRRFIP2의 다른 이소형 단백질에 결합하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준 측정은 보다 바람직하게는 LRRFRIP2 이소형 3의 엑손 7에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 6)에 특이적으로 결합하는 물질을 사용하여 수행될 수 있다. 상기 LRRFRIP2 이소형 3의 엑손 7에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 6)에 특이적으로 결합하는 물질은 예를 들어, LRRFRIP2 이소형 3의 엑손 7에 의해 코딩되는 아미노산 서열(서열번호 6)에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer) 중 어느 하나 이상을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 다클론 항체, 단클론 항체 및 재조합 항체 등의 "항체"를 모두 포함하며 항체란 항원성 부위에 대해서 지시되는 특이적인 단백질 분자를 의미한다. 다클론 항체는 본 발명의 난소용 진단용 바이오마커 단백질을 항원으로 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당업계에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론 항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 쥐, 랫트(rat), 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 단클론 항체는 당업계에 널리 공지된 하이브리도마 방법(Kohler 및 Milstein (1976) European Jounral of Immunology 6:511-519 참조), 또는 파지 항체 라이브러리(Clackson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol., 222:58, 1-597, 1991) 기술을 이용하여 제조될 수 있다. 상기 방법으로 제조된 항체는 겔 전기영동, 투석, 염 침전, 이온교환 크로마토그래피, 친화성 크로마토그래피 등의 방법을 이용하여 분리, 정제할 수 있다. 또한 본 발명의 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등이 있다.
이러한 항체에는 일반적으로 알칼라인 포스파타제(alkaline phosphatase, AP) 또는 홀스래디쉬 퍼록시다제 (horseradish peroxidase, HRP) 등의 효소가 컨쥬게이션된 2차 항체 및 이들의 기질을 사용하여 발색반응시킴으로써 정량분석하거나, 직접 상기 단백질 모노클로날 항체에 AP 또는 HRP 효소 등이 컨쥬게이션된 것을 사용하여 정량분석할 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 “PNA(Peptide Nucleic Acid)”는 인공 합성된 DNA 또는 RNA와 유사한 중합체로, 펩타이드 결합에 의해 연결된 N-(2-aminoethyl)-glycine 골격을 갖는다. PNA는 DNA 또는 RNA에 대한 결합력과 안정성이 향상되어, 진단 분석에 사용된다.
본 발명에 있어서, 상기 “앱타머(aptamer)”는 올리고 핵산 또는 펩타이드 분자로, 표적에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 압타머는 본 발명의 난소암 진단용 바이오마커 단백질 중 어느 하나 이상에 특이적으로 결합하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 단백질 수준의 측정은 대상으로부터 분리된 시료에서 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 것을 의미한다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준은 면역조직화학법(immunohistochemical techniques), 웨스턴 블랏(western blotting), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석법(Radioimmunoassay), 방사면역확산법(Radioimmunodiffusion), 오우크레로니 (Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(Rocket) 면역전기영동, 면역 염색, 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complete fixation assay), FACS, 단백질 칩(protein chip), 및 질량 분석법(mass spectrometry) 등을 사용하여 측정될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 단백질의 수준, 바람직하게는 혈장 단백질 수준을 측정할 수 있는 공지된 방법이라면 모두 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 질량 분석법(Mass spectrometry)은 이온화 방법에 따라, 예를 들어 FAB, CI, APCI, ESI, DESI, MALDI, SELDI, ICP, DESI, SESI, LAESI, FD, FAB, DIOS, DART, SIMS, TIMS 등으로, 질량 선택방법에 따라, 4극 질량 필터(qaudrupole mass filter), 이온 포집(ion trap), 전자증배관(electron multiplier) 등으로, 분리 기술과의 조합에 따라, 기체 크로마토그래피(Gas chromatography, GS), 액체 크로마토그래피(liquid chromatography, LC) 등으로 구분될 수 있으며, 질량 분석법으로 도출된 데이터는 SIM, TIC, SRM 과 같은 방법으로 표시될 수 있고, 각 분류는 조합되어 명명된다. 구체적인 예를 들어, MALDI-TOF(Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, SELDITOF(Sulface Enhanced Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry) 분석, 액상 크로마토그래피-질량분석(liquid chromatography-Mass Spectrometry, LC-MS), LCMS/MS(liquid chromatography-Mass Spectrometry/ Mass Spectrometry) 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 대상이 인간인 경우, LRRFIP2 이소형 2의 cDNA는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. LRRFIP2 이소형 2의 cDNA는 서열번호 3으로 표시되는 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA(또는 cDNA)와 비교하여, 서열번호 5로 표시되는 서열이 스킵되어 발현되지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 대상이 인간인 경우, LRRFIP2 이소형 2 단백질의 서열은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2 단백질은 서열번호 4로 표시되는 LRRFIP2 이소형 3 단백질 서열과 비교하여, 엑손 7이 암호화하는 서열번호 6으로 표시되는 아미노산 서열을 포함하지 않는 것을 특징으로 한다.
본 발명에 있어서, 상기 대상이 인간이 아닌 경우, LRRFIP2 이소형의 서열은 본 발명에 기재된 인간 LRRFIP2 이소형의 mRNA(또는 cDNA) 서열 또는 단백질 서열과의 정렬(alignment)를 통해 상응하는 LRRFIP2 이소형 서열을 쉽게 이해할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준의 측정은 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 측정에서 기재한 것을 참조하여, 제제 및 방법을 통해 수행될 수 있다.본 발명의 용어 "예후"는 의학적 귀추(예컨대, 장기 생존 가능성, 무병생존율 등)에 대한 예상을 의미하며, 양성적 예후(긍정적 예후) 또는 음성적 예후(부정적 예후)를 포함하며, 상기 음성적 예후는 재발, 종양 성장, 전이, 약 저항성 등의 병의 진행 또는 치명성(mortality)을 포함하고, 양성적 예후는 질병이 없는 상태 등의 질병의 차도, 종양 퇴행 등의 질병의 개선 또는 안정화(stabilization)를 포함한다.
본 발명에 있어서, 용어 "예측"은 의학적 귀추에 대하여 미리 헤아려 짐작하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 암을 갖는 대상의 병의 경과, 바람직하게는 암의 진행 및/또는 전이 가능성을 미리 짐작하는 것을 의미한다.
본 발명의 일 실시예에서, LRRFIP2 이소형 3의 발현이 증가한 경우 암의 이동 및 침습이 향상된 것을 확인하였으며, CARM1의 표적 유전자로서 다양한 암 진행 및/또는 침습 마커의 발현이 향상되는 암의 진행성 및 전이성을 향상시키는 구체적 메커니즘을 규명하였다.
본 발명에 있어서, 상기 예후는 바람직하게는 암의 진행성 및/또는 암의 전이성인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 증가한 경우, 진행성 암 또는 전이성 암으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 비-진행성 암 또는 비-전이성 암으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 증가 한 경우, 암의 진행 가능성 및/또는 전이 가능성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 암의 진행 가능성 및/또는 전이 가능성이 낮은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 진행성 암 또는 전이성 암으로 분류하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 증가한 경우, 비-진행성 암 또는 비-전이성 암으로 분류하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 암의 진행 가능성 및/또는 전이 가능성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 증가한 경우, 암의 진행 가능성 및/또는 전이 가능성이 낮은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2와 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형2에 대한 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율(이소형 3/이소형 2)이 대조 시료에 비해 증가한 경우, 암의 진행 가능성 및/또는 전이 가능성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형2에 대한 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율(이소형 3/이소형 2)이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 암의 진행 가능성 및/또는 전이 가능성이 낮은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 용어, “암의 진행성(Progression)” 또는 “진행성 암(advanced cancer)”은 암이 특정 기관의 조직 또는 경계를 지나 주변 조직 또는 기관으로 침습한 것을 의미한다. 예를 들어, 위암의 경우 진행성 위암은 암의 점막하층을 침습하여 근육층 및 그 이상의 단계로 진행한 위암을 의미한다.
본 발명의 용어, “전이(metastasis)” 또는 “전이성 암(Metastatic cancer)”은 종양세포가 원발 종양이 발생한 기관이나 조직에서 거리상으로 분리된 곳으로 이동한 것을 의미한다. 예를 들어, 전이성 위암은 림프절, 간, 폐, 뇌 등의 기관으로 전이된 암을 의미할 수 있으며, 보다 바람직하게는 간으로의 전이를 의미할 수 있으나 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 대조 시료는 동일 대상 또는 상이한 대상으로부터 분리된 정상 조직, 비-진행성 또는 비-전이성 암 조직으로부터 분리된 시료인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 또는 단백질의 발현 수준 외에도 암의 진행성 및/또는 전이성 마커로 보고된 다른 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명의 실시예에서, ESRP1의 발현은 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱을 스위치할 수 있는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 시료에서 ESRP1의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, ESRP1의 발현 수준이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 암의 진행 가능성 및/또는 전이 가능성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 실시예에서, LRRFIP2 이소형 3의 발현이 증가하는 경우, CARM1이 H3R17 히스톤 단백질의 다이메틸화(demethylation)을 증가시키는 것을 확인하였다. 또한, LRRFIP2 이소형 3의 발현이 증가하는 경우 CARM1의 표적 단백질인 SERPINE1, COL5A2, SEMA3C, LOXL2, CD74, CDK6, PKP1, AXIN2, CCNE1, 및 GADD45A와 같은 암의 진행성/전이성 관련 마커의 발현이 증가하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명에 있어서, 상기 시료에서 히스톤 단백질의 메틸화(methylation)를 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있으며, 보다 바람직하게는 H3R17 히스톤 단백질의 메틸화를 확인하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시료에서 SERPINE1, COL5A2, SEMA3C, LOXL2, CD74, CDK6, PKP1, AXIN2, CCNE1, 및 GADD45A로 구성된 군에서 선택된 유전자 또는 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 시료에서 SERPINE1, COL5A2, SEMA3C, LOXL2, CD74, CDK6, PKP1, AXIN2, CCNE1, 및 GADD45A 중 어느 하나 이상의 유전자 또는 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 증가하는 경우, 암의 진행 가능성 및/또는 전이 가능성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 암은 예를 들어, 위암, 간암, 담관암, 폐암, 췌장암, 대장암, 유방암, 전립선암, 자궁경부암, 자궁 내막암, 두경부암, 신경교종, 흑색종, 난소암, 신장암, 피부암, 고환암, 갑상선암, 요로상피암, 백혈병 및 림프종으로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으며, 가장 바람직하게는 위암인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 예를 들어, LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer) 중 어느 하나 이상을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 LRRFIP2의 다른 이소형 단백질에 결합하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질은 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드, 및 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 암의 전이 또는 예후 예측용 조성물은 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 예를 들어, LRRFIP2 이소형 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer) 중 어느 하나 이상을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질은 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드, 및 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
CARM1(coactivator-associated arginine methyltransferase 1)은 암의 전이 또는 진행에 있어 중요한 역할을 하는 효소로 보고된 바 있다.
본 발명의 일 실시예에서는 LRRFIP2 이소형 2가 CARM1에 결합하여 CARM1에 의한 암의 전이 또는 진행에 관련된 유전자의 발현을 억제하는 것을 확인하였으며, LRRFIP2 이소형 3의 발현 비율이 높아지는 경우 CARM1에 대한 결합능이 현저히 감소하여 암의 전이성 및 진행성이 높아지는 것을 확인하였다.
본 발명의 다른 실시예에서는 LRRFIP2 이소형 3의 발현율이 높은 종양에서, CARM1 저해제인 EZM2302를 사용하는 경우 암의 전이 또는 진행을 현저히 감소시키며, LRRFIP2 이소형 2의 발현율이 높은 종양에서는 CARM1 저해제인 EZM2302의 암의 전이 또는 진행 억제 효과가 낮은 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, 대상으로부터 분리된 시료에서 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 대상으로부터 분리된 시료에서 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공방법에 관한 것이다.
본 명세서에서 사용되는 용어 "감수성"은 개개의 환자의 암에 대하여 특정 약물이 효과를 나타내는지 여부 또는 효과를 나타내는 수준을 의미한다. 이와 같은 개개의 환자에 대해 약물이 효과를 나타내는지 여부 또는 효과가 나타나는 수준을 약물 감수성이라고 한다. 본 발명에 있어서, 상기 “감수성”은 약물에 대한 “반응성”과 상호호환적으로 사용될 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 감수성은 CARM1 저해제를 사용한 암의 치료에 대해 유효 수준 이상의 치료 효과를 나타내는 것을 특징으로 할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 치료 효과는 바람직하게는 암의 전이 억제 또는 암의 진행 억제를 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 CARM1 저해제는 CARM1의 활성을 차폐 또는 저해하는 물질, 예를 들어 소분자 화합물, 항체, 압타머 등일 수 잇으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명의 실시예에서는 CARM1 저해제로서 EZM2302(CAS No.: 1628830-21-6)를 사용하였으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 증가한 경우, 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성이 낮은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 증가한 경우, 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성이 낮은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2와 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형2에 대한 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율(이소형 3/이소형 2)이 대조 시료에 비해 증가한 경우, 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형2에 대한 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율(이소형 3/이소형 2)이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성이 낮은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 예를 들어, LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer) 중 어느 하나 이상을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 LRRFIP2의 다른 이소형 단백질에 결합하지 않는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질은 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드, 및 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 감수성 예측용 조성물은 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 예를 들어, LRRFIP2 이소형 2 단백질에 특이적으로 결합하는 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer) 중 어느 하나 이상을 사용하여 수행할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질은 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드, 및 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
별도로 기재되지 않는 한, 본 발명은 암의 전이 또는 예후 예측방법과 관련하여 기재된 특징을 포함할 수 있다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 대상 또는 대상으로부터 분리된 시료에서 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계;
확인된 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준에 기초하여 CARM1 저해제를 대상에게 투여하는 단계를 포함하는 암의 예방 또는 치료 방법에 관한 것이다.
본 발명에서 사용된 용어, “대상으로부터 분리된 시료”는 대상으로부터 분리된 조직, 세포의 집단 또는 단독 세포를 의미할 수 있다. 본 발명에 있어서 상기 조직, 세포의 집단 또는 단독세포는 예를 들어, 암 조직 또는 암으로 의심되는 부위 또는 그 주변의 조직 또는 세포, 보다 바람직하게는 종양 스페로이드 또는 종양 세포일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 “확인된 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준에 기초하여”는 본 명세서에 설명된 것과 같이 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준(절대적 또는 상대적 수준)에 따라 대상의 CARM1 저해제에 대한 치료 감수성을 예측하는 단계를 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법은 대상으로부터 분리된 시료에서 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 증가한 경우, CARM1 저해제를 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 감소한 경우, CARM1 저해제를 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 방법이 LRRFIP2 이소형2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 측정하는 단계를 포함하는 경우, LRRFIP2 이소형 2와 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율을 확인하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 있어서, LRRFIP2 이소형2에 대한 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율(이소형 3/이소형 2)이 대조 시료에 비해 증가한 경우, CARM1 저해제를 투여하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 실시예에서는 LRRFIP2의 엑손 7를 표적으로하는 CRISPR/Cas9 시스템을 사용한 엑손 7의 결실이 암 세포의 이동과 침습을 현저하게 감소시키는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 다른 관점에서, 종양 세포에서 서열번호 5로 표시되는 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7을 결실 또는 발현 억제시키는 단계를 포함하는 암의 치료방법 또는 전이억제 방법에 관한 것이다.본 발명에 있어서, 상기 서열번호 5로 표시되는 LRRFIP2의 엑손 7의 결실 또는 발현 억제는 당업계에 공지된 다양한 유전자 편집 기술을 통해 수행될 수 있다. 예를 들어, 상기 유전자 편집 기술은 CRISPER/Cas9, TALEN, ZFN, RNase P RNA, C2c1, C2c2, C2c3, Cas9, Cpf1, TevCas9, Archaea Cas9, CasY.1, CasY.2, CasY.3, CasY.4, CasY.5, CasY.6, 또는 CasX 와 같은 유전자 가위, siRNA, miRNA, shRNA와 같은 RNAi 기술 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 예를 들어, 상기 서열번호 5로 표시되는 LRRFIP2의 엑손 7이 CRISPER/Cas9 시스템에 의해 결실되는 경우, 가이드 RNA로서, 서열번호 7 또는 8로 표시되는 핵산 서열(gRNA1: 5'-CCTCCATATATAGCCC TGTCCCC-3' (서열번호 7); gRNA2: 5'-CCGTGGTGTCTTAGCCATACAAA-3' (서열번호 8)) 를 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명은 또 다른 관점에서, 서열번호 5로 표시되는 LRRFIP2의 엑손 7을 결실 또는 발현 억제하기 위한 제제를 포함하는 암의 치료 또는 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명에 있어서, 상기 서열번호 5로 표시되는 LRRFIP2의 엑손 7을 결실 또는 발현 억제하기 위한 제제는 LRRFIP2의 엑손 7을 특이적으로 결실시키거나, 발현을 억제시킬 수 있는 물질을 의미한다. 본 발명의 서열번호 5로 표시되는 LRRFIP2의 엑손 7을 결실 또는 발현 억제하기 위한 제제는 당업계에 공지된 다양한 유전자 편집 플랫폼에 따라 용이하게 제조될 수 있다. 예를 들어, 서열번호 5에 특이적으로 작용하는 siRNA, miRNA, shRNA, 가이드 RNA가 포함될 수 있으며, 보다 구체적인 예를 들어 본 발명의 실시예에서와 같이, 서열번호 7 도는 8로 표시되는 핵산 서열을 포함하는 가이드 RNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 실시예에서는 LRRFIP2 이소형 2의 과발현이 히스톤 단백질의 다이메틸화를 억제시키고, CARM1의 표적 유전자의 발현을 억제하여, 암 세포의 진행성/전이성 표현형을 억제하는 것을 확인하였다.
따라서, 본 발명은 또 다른 관점에서, LRRFIP2 이소형 2 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 포함하는 암의 치료용 또는 전이 억제용 약학적 조성물에 관한 것이다.
본 발명은 또한, LRRFIP2 이소형 2 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산을 투여하는 단계를 포함하는 암의 치료방법 또는 전이 억제 방법에 관한 것이다.
본 발명은 또한, LRRFIP2 이소형 2 단백질 및/또는 이를 암호화하는 핵산의 억제제의 암의 치료 또는 전이 억제를 위한 용도, 및/또는 상기 약학적 조성물의 제조를 위한 용도에 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어, "치료"는 본 발명에 따른 약학 조성물의 투여에 의해 질환에 대한 증세가 호전되거나 이롭게 변경되는 모든 행위를 의미한다. 본 발명에 있어서, 상기 치료는 보다 바람직하게는 암의 진행을 억제하거나 암의 전이를 억제하는 것을 의미할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 핵산은 LRRFIP2 이소형 2 단백질을 암호화하는 유전자 서열로서, 예를 들어, DNA 또는 RNA일 수 있으며, 보다 바람직하게는 LRRFIP2 이소형 2 단백질을 암호화하는 mRNA 또는 이의 cDNA일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2를 암호화하는 핵산은 당업계에 알려진 핵산 전달 방법을 통해 치료 대상에게 전달되고 발현될 수 있다. 다수의 임상 연구에서 다양한 전달 시스템을 사용하여 세포로의 생체 내 유전자 전달의 유용성이 보고된 바 있다. 생체 내 유전자 전달은 환자에게, 보다 바람직하게는 환자의 종양 조직 또는 세포에 상기 LRRFIP2 이소형 2 단백질을 암호화하는 핵산을 투여하는 것이다. 이를 통해 환자의 종양 조직 또는 세포는 장기간 동안 본 발명의 LRRFIP2 이소형 2 단백질을 생산함에 따라, 진행 및 전이가 현저히 억제될 수 있다. 를 생산하고 생산 부위에 따라 전신적으로 또는 국소적으로 분비할 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 핵산의 전달을 위해 다양한 생체 내 핵산 전달 플랫폼이 사용될 수 있으며, 예를 들어, 바이러스 벡터, 비바이러스 벡터, 네이키드 DNA 또는 RNA, 엑소좀, 리포좀(Pharm. Res. 9, 1235-1242), 나노파티클(Rodrigo et al. PNAS 109:15271-15276) 등이 포함된다. 핵산의 유전자 전달은 상품 및 생산 비용을 줄임으로써 비용 절감을 가능하게 할 뿐만 아니라 약물 투여 빈도를 줄일 수도 있다.
본 발명에 있어서, 상기 약학적 조성물은 본 발명의 유효성분을 함유하는 것 이외에 통상적으로 약학 조성물에 사용되는 적절한 담체, 부형제 및 희석제를 더 포함할 수 있다.
상기 약학적 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제는 락토오스, 덱스트로오스, 수크로오스, 소르비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로오스, 메틸 셀룰로오스, 미정질 셀룰로오스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시 벤조에이트, 프로필히드록시 벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유 등이 있다. 상기 조성물을 물질화할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 통상의 방법에 따라 다양한 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 적합한 제형으로는 정제, 환제, 산제, 과립제, 당의정, 경질 또는 연질의 캡슐제, 용액제, 현탁제 또는 유화액제, 주사제, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액 등이 있으나, 이에 한정되는 것은 아니다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 불활성인 유기 또는 무기 담체를 이용하여 적합한 제형으로 제조할 수 있다. 즉, 제형이 정제, 코팅된 정제, 당의정 및 경질 캡슐제인 경우 락토스, 수크로스, 전분 또는 그 유도체, 탈크, 칼슘 카보네이트, 젤라틴, 스테아르산 또는 그 염을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 연질 캡슐제인 경우에는 식물성 오일, 왁스, 지방, 반고체 및 액체의 폴리올을 포함할 수 있다. 또한, 제형이 용액 또는 시럽 형태인 경우, 물, 폴리올, 글리세롤, 및 식물성 오일 등을 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 상기의 담체 외에도 보존제, 안정화제, 습윤제, 유화제, 용해제, 감미제, 착색제, 삼투압 조절제, 산화방지제 등을 더 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 약학적 조성물은 약학적으로 유효한 양으로 투여한다. 본 발명에 있어서, "약학적으로 유효한 양"은 의학적 치료에 적용 가능한 합리적인 수혜/위험 비율로 질환을 치료하기에 충분한 양을 의미하며, 유효 용량 수준은 환자의 질환의 종류, 중증도, 약물의 활성, 약물에 대한 민감도, 투여 시간, 투여 경로 및 배출 비율, 치료기간, 동시 사용되는 약물을 포함한 요소 및 기타 의학 분야에 잘 알려진 요소에 따라 결정될 수 있다. 본 발명에 따른 약학 조성물은 개별 치료제로 투여하거나 다른 치료제와 병용하여 투여될 수 있고 종래의 치료제와는 순차적 또는 동시에 투여될 수 있으며, 단일 또는 다중 투여될 수 있다. 상기한 요소들을 모두 고려하여 부작용 없이 최소한의 양으로 최대 효과를 얻을 수 있는 양을 투여하는 것이 중요하며, 이는 당업자에 의해 용이하게 결정될 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 개체에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 방식은, 예를 들면, 피하, 정맥, 근육 또는 자궁 내 경막 또는 뇌혈관 내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 약학 조성물은 치료할 질환, 투여 경로, 환자의 연령, 성별 및 체중 및 질환의 중등도 등의 여러 관련 인자와 함께, 활성 성분인 약물의 종류에 따라 결정된다.
본 발명에 따른 약학적 조성물의 투여 방법은 제형에 따라 용이하게 선택될 수 있으며, 경구 또는 비경구 투여될 수 있다. 투여량은 환자의 나이, 성별, 체중, 병증의 정도, 투여 경로에 따라 달라질 수 있다.
본 발명의 약학적 조성물은 다른 치료 요법 또는 치료제와 병용하여 투여될 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 다른 치료 요법 또는 치료제는 소분자 화합물, 면역 요법 또는 면역세포치료제 일 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 임상의의 판단에 따라 다양하게 조합되어 사용될 수 있다.
실시예
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 예시하기 위한 것으로서, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되는 것으로 해석되지는 않는 것은 당업계에서 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: 재료 및 방법
실시예 1-1: 세포 배양 및 형질감염
총 18종의 위암세포주(SNU-5, SNU-16, SNU-216, SNU-484,SNU-601, SNU-620, SNU-668, SNU-719, MKN-1, MKN-28, MKN-45,MKN-74, KATOIII, AGS, NCI-N87, SNU-1, SNU-520 및 SNU-638)는 한국세포주은행에서 구입하였다. 세포를 표준 조건(37℃, 5% CO2에서 25 mM HEPES, 10% 태아 소 혈청, 100 unit/mL 스트렙토마이신 및 100 unit/mL 페니실린을 함유하는 RPMI-1640)에서 유지시켰다. 293 T 세포주는 10% 태아 소 혈청(FBS) 및 1% 페니실린/스트렙토마이신이 포함된 DMEM 배지에서 37°C에서 배양하였다. 세포배양을 위한 배지 및 시약은 대한민국 WELGENE, Inc.에서 구입하였다. 제조업체의 지침에 따라 Fugene® HD(Promega)를 사용하여 형질감염을 수행하였다.
실시예 1-2: 플라스미드
인간 LRRFIP2 이소형 2 및 이소형 3의 cDNA를 MKN28 및 MKN1 cDNA로부터 각각 PCR로 증폭하고 pCS4-3Flag 벡터(Addgene)의 XhoI 및 NheI 부위에 서브클로닝하였다. Flag-LRRFIP2의 두 이소형은 LPCX 벡터(NIH)의 XhoI 및 HpaI 부위에 서브클로닝되어 LPCX-Flag-LRRFIP2 이소형 2 및 이소형 3을 제작하였다.
실시예 1-3: 안정적인 세포주 생성
레트로바이러스 생성을 위해 GP2-293 세포를 형질감염 24시간 전에 100 mm 배양 플레이트에 도말하였다. 형질 감염은은 플레이트당 10 μg DNA 및 5 μg VSV-G와 함께 폴리에틸렌이민(PEI)을 사용하여 수행하였다. 형질감염 후, 재조합 레트로바이러스를 포함하는 조정 배지를 수집하고 0.45μm 멸균 필터를 통해 여과하였다. 그 뒤 여과된 레트로바이러스 3ml를 100mm 배양 접시에 감염시키기 전에 18시간 동안 도말한 MKN28 세포에 즉시 처리하였다. Polybrene(Sigma-Aldrich)을 최종 농도 8μg/ml로 첨가하고 상등액을 세포와 함께 8시간 동안 배양하였다 배지를 흡인하고 신선한 바이러스 상등액으로 교체한 뒤 절차를 반복하였다. 감염 후, 세포를 신선한 성장 배지에 24시간 동안 두고, 일반적인 방법으로 배양하였다. 감염 48시간 후 2μg/ml 퓨로마이신(Sigma-Aldrich)을 사용하여 선별하였다.
실시예 1-4: CRISPR 유전자 편집
LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7(서열번호 5)을 제거하기 위해 LRRFIP2 variant3의 exon7을 표적으로 하는 gRNA(guide RNA)를 설계하였다(gRNA1: 5′-CCTCCATATATAGCCCTGTCCCC-3′ (서열번호 7);gRNA2:5′-CCGTGGTGTCTTAGCCATACAAA-3′(서열번호 8)). 올리고뉴클레오타이드는 합성되어 이전에 보고된 방법(을 사용하여 pSpCas9(BB)-2A-Puro(PX459)로 결찰되었다 (Nat. Protoc. 8, 2281-2308 (2013)). MKN1 세포는 제조업체의 프로토콜에 따라 Neon Transfection System(Thermo Fisher Scientific)을 사용하여 gRNA 서열을 포함하는 벡터로 형질 감염시켰다. 그 뒤 세포의 클론 선택을 거쳐 RT-PCR로 발현을 확인하였다.
실시예 1-5: RNA 추출, RT-PCR 및 실시간 qRT-PCR
제조사에서 제공한 프로토콜에 따라 easy-BLUE Total RNA 추출 키트(Intron bio)를 사용하여 세포 및 조직으로부터 총 RNA를 분리하였다. 역전사는 M-MLV 역전사 효소(Promega, M1705)를 사용하여 2 μg의 정제된 RNA로 수행하였다. 합성된 cDNA는 특정 프라이머를 사용하여 PCR로 증폭하였다. PCR 산물을 Redsafe(Chembio, 21141) 염색으로 1.5% -2% 아가로스 겔에서 전기영동으로 시각화하고 ImageQuant LAS 4000 이미지 분석기(GE Healthcare)로 분석하였다.
내부 대조군으로는 18S rRNA 유전자를 사용하였다. LRRFIP2 이소형 2 및 이소형 3을 검출하기 위해, 정방향 프라이머는 5'-CCTCAGCAACAACCCCTCTA-3'(서열번호 9), 역방향 프라이머는 5'-CCTGCTTCTTCAATAACATCC-3'(서열번호 10)을 사용하였다. LRRFIP2 이소형 2 및 이소형 3의 PCR 생성물은 각각 222bp 및 294bp이다. Quantitative real-time PCR(qRT-PCR)은 2x SYBR Green PCR Master Mix(TaKaRa)를 사용하여 적절한 프라이머로 수행되었으며 QuantStudio 5(Applied Biosystems)에서 수행되었다. 본 실시예에 사용된 모든 프라이머는 하기 표 1과 같다.
실시예 1-6: 위암 세포주 및 조직의 RNA-seq 데이터 분석
우리는 18개의 위암 세포주, 18개의 위암 조직 샘플 및 16개의 정상 위 조직 샘플에서 얻은 기존에 보고된 RNA-seq 데이터를 재분석하였다(Genome Res. 23, 1109-1117 (2013)). 히트맵의 경우 ESRP1 발현의 Pearson 상관 계수와 조직 데이터의 첫 번째 이소형 세트에서 ESRP1 발현의 Pearson 상관 계수와 두 번째 이소형 세트를 차감하였다. 그런 다음 이소형 1과 이소형 2의 상대 발현 평균의 합이 0.5 미만인 유전자는 무시하였다. 결과 중 상위 20개의 유전자 사용하여 도 2b, 2c, 7b, 7c의 히트맵을 생성하였다. RNA-seq 판독을 정렬하지 않고 전사체 수준의 비율을 정량화하기 위해 Salmon 버전 0.8.0(Nat. Methods 14,417-419 (2017))을 GRCh38 게놈에 대한 Refseq 주석과 함께 사용하였다. 정량화된 전사 수준은 TPM(Transcript Per Million)으로 정규화하였다. 이소형 식별 소프트웨어 iso-kTSP15를 사용하여 ESRP1 발현 수준에 의해 차등적으로 표현된 상위 100개의 전사 변이체를 수득하였다. SUPPA17을 사용하여 선택적 3' 스플라이싱 부위(A3), 선택적 5' 스플라이싱 부위(A5), 선택적 첫번째 엑손(AF), 선택적 마지막 엑손(AL), 상호 배타적 엑손(MX), 유지된 인트론(RI) 및 스킵핑 엑손(SE)의 7가지 스플라이싱 이벤트 유형을 생성하였다. 위암 세포주에서 ESRP1에 의한 Intron(RI) 및 Skipping Exon(SE). 우리는 TCGA 데이터베이스에서 다운로드한 대규모 위암 조직에서 ESRP1 발현을 확인하였다(Nature 13, 202-209 (2014)). LRRFIP2 isoforms의 발현은 SpliceSeq에서 얻었다(Bioinformatics 28, 2385-2387 (2012)).
실시예 1-7: LRRFIP2 (Δexon7) 세포주의 RNA 시퀀싱
cDNA 라이브러리는 TruSeq stranded mRNA 샘플 준비 키트(Illumina)를 사용하여 151bp 페어-엔드 시퀀싱을 위해 Total RNA로부터 제조하였다. RNA 시퀀싱을 위한 각 세포의 총 RNA는 제조업체의 지침에 따라 TRIzol 시약을 사용하여 분리하였다. mRNA 분자는 oligo(dT) 자성 비드를 사용하여 1ug의 Total RNA로부터 정제 및 단편화하였다. 순차 처리 후 cDNA 라이브러리를 PCR(Polymerase Chain Reaction)로 증폭한 후 Agilent 2100 bioanalyzer(Agilent)를 사용하여 품질을 검사하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 KAPA 라이브러리 정량화 키트(Kapa Biosystems)로 정량화하였다. 변성된 템플릿의 클러스터 증폭 후, 샘플은 Illumina Novaseq6000 플랫폼(Illumina)으로 페어-엔드 시퀀싱하였다. 시퀀싱 후 cutadapt v.2.863을 사용하여 다음 기준에 따라 낮은 품질의 read를 필터링하였다. 어댑터 시퀀스 및 read의 끝은 Phred 품질 점수 20 미만이며, read는 50bp 미만이다. 전체 필터링 프로세스는 사내에서 개발한 스크립트를 사용하여 수행하였다. 필터링된 read는 STAR v.2.7.1a 정렬 소프트웨어를 사용하여 종과 관련된 GRCh38 게놈에 맵핑하였다. 유전자 발현 수준은 앙상블 데이터베이스를 사용하여 RSEM v1.3.165로 측정하였으며, 유전자에 매핑된 읽기와 킬로베이스 단위의 유전자 길이의 비율로 정량화하고, 매핑된 백만 단편당 전사물의 킬로베이스당 단편(fragments per kilobase of transcript per million fragments mapped, FPKM)으로 표현하였다. 비암호화 유전자 영역은 유전자 발현 측정에서 제외하였다. 측정의 정확도를 높이기 위해 multiread correction과 frag-bias-correct 옵션을 적용하였다. 다른 모든 옵션은 기본값으로 설정하였다.
실시예 1-8: GO, KEGG 경로, 및 PPI 네트워크 분석
도 2d, 2e 및 도 5d, 5e에 대한 풍부한 GO 및 KEGG 경로 용어는 Enrichr 소프트웨어에서 수득하였다(Nucleic Acids Res. 44, W90-W97 (2016)). DAVID 도구와 KEGG orthology-based annotation system(KOBAS) online tool은 P < 0.01의 컷오프 값으로 도 14b에 사용하였다. String은 단백질-단백질 상호작용(PPI) 네트워크를 생성하는 데 사용하였다(Nucleic Acids Res. 31, 258-261 (2003)).
실시예 1-9: 사시미 플롯(Sashimi plots)
LRRFIP2의 스플라이싱 이소형, CCDC50 및 BICD2에 대한 사시미 플롯을 생성하기 위해 STAR64를 사용하여 GRCh38 게놈에서 RNA-seq read를 정렬하였다. 다음으로 매핑된 파일을 참고문헌(Bioinformatics 25,2078-2079 (2009))에 따라 ESRP1-low 세포주, ESRP1-high 세포주, ESRP1-low 종양 조직(137T, 87T, 236T, 211T, 80T, 135T 및 134T) 및 ESRP-high 종양 조직(130T, 134T, 103T, 95T, 195T, 849T, 43T, 917T, 859T, 119T, 889T 및 882T)의 4개 파일로 결합하였다. IGV(Integrative Genomics Viewer)를 사용하여 LRRFIP2, CCDC50 및 BICD2의 게놈 유전자좌의 Sashimi 플롯을 그렸다.
실시예 1-10: 환자 생존 분석.
본 실시예에서 등록된 환자는 측정 가능하고, 조직학적 또는 세포학적으로 확인된 전이성 및/또는 재발성 위 선암종을 보유하였다(Genome Med. 13, 11 (2021)). 임상시험은 헬싱키 선언 및 우수임상시험지침(ClinicalTrial.gov identier: NCT# 02628951). 임상시험계획서는 삼성서울병원 임상심사위원회(Institutional Review Board)(서울, 한국)의 승인을 받았으며, 모든 환자는 등록 전에 서면 동의서를 제공하였다. Kaplan-Meier 생존 분석은 IV기 위암 환자(N=37)의 유전자 발현 프로필과 임상 데이터를 사용하여 수행하였다. 생존 분석을 위해 R 패키지 3.5.3에서 Rpackage'survival'과 'survminer'를 사용하였다.
실시예 1-11: 면역침전 및 면역블롯 분석
세포를 차가운 PBS에서 2회 세척하고 IP 완충액(50 mM Tris, pH 7.4, 150 mM NaCl, 1% Triton X-100, 0.5% 데옥시콜산 나트륨, 2 mM EDTA 및 10% 글리세롤) + 포스파타제 및 프로테아제 억제제(Roche)에서 용해시켰다. 전체 세포 추출물을 적절한 1차 항체와 함께 4°C에서 밤새 배양하였다. Dynabeads(Thermo Fisher Scientific)를 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 항체 결합 단백질을 침전시켰다. 비드를 용해 버퍼로 3회 세척한 다음 2X SDS 샘플 로딩 버퍼에서 용출하였다. 용출된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔 전기영동으로 분리하고 PVDF 멤브레인(Millipore)으로 옮기고 화학발광에 의해 홀스래디쉬 퍼옥시다아제 접합 2차 항체와 결합된 적절한 1차 항체를 사용하여 검출하였다(GE Health-care). 본 실시예에서 사용된 모든 항체는 하기 표 2 및 표 3과 같다.
실시예 1-12: RNA 면역 침전
RNA 면역 침전은 공지된 방법으로 수행하였다(Cancers (Basel) 13 (2021)). MKN28 세포를 차가운 등장 완충액(20 mM HEPES,100 mM NaCl, 250 mM Sucrose, 5 mM MgCl2), 프로테아제 억제제(Roche), RNAse 억제제(Promega)의 칵테일 및 DTT에서 5분 동안 배양하여 총 세포 단백질 추출물을 얻었다. 용해물을 Dynabeads 단백질 G를 사용하여 4°C에서 1시간 동안 사전 제거(precleared) 하였다. 항-ESRP1 항체(Sigma-Aldrich) 또는 토끼 IgG를 사전 제거한 용해물에 4°C에서 밤새 첨가하고 다음날 dynabeads를 4°C에서 1시간 동안 첨가하였다.
실시예 1-13: 단백질 상호작용 분석을 위한 가교 결합
질량 분석을 위한 LRRFIP2 이소형 2 및 이소형 3-과발현 MKN28 세포의 가교 결합(cross-linking)은 공지된 방법으로 수행하였다(J. Biomed. Biotechnol. 2010, 927585 (2010)). 특히 세포는 PBS 내 1% 포름알데히드에 고정시켰다. 용출된 단백질을 SDS-폴리아크릴아미드 겔에 로딩하고 전기영동으로 분리하였다. 겔 상의 가교결합된 단백질을 Coomassie blue(Tech & Innovation)로 염색하고 NICEM(National Instrumentation Center for Environmental Management)(서울, 한국)에서 질량 분석법을 사용하여 분석하였다.
실시예 1-14: 세포 이동 및 침입 분석
제조업체의 프로토콜에 설명된 방법으로 투명 PET 막 삽입물(Falcon, 353097)을 사용하여 Transwell 이동 분석을 수행하였다. 총 1×105개의 세포를 삽입물에 플레이팅하고 16시간 동안 배양하였다. 제조업체의 프로토콜에 따라 BioCoat Matrigel 침입 챔버(Corning, 354578)를 사용하여 침입 분석을 수행하였다. 세포는 FBS가 없는 DMEM 배지에서 24시간 동안 굶게 하였다. 굶주린 세포(1x105)를 무혈청 DMEM이 포함된 상단 챔버에 플레이팅하고 하단 챔버에는 10% FBS가 포함된 DMEM을 포함하였다. 24시간 배양 후 비침습성 세포를 면봉으로 제거하였다. 막을 통해 이동하여 막의 하부 표면에 부착된 세포를 70% 에탄올로 고정하고 0.05% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 통계 분석을 위해 각 시야에서 침입한 세포의 수를 정량화하였다.
실시예 1-15: 생체 내 종양 형성 및 간 전이
모든 실험 프로토콜은 우정바이오(수원, 대한민국) 센터의 동물 실험 및 사용 위원회의 승인을 받았다. 실험용 마우스는 일정한 습도(40±10%)와 함께 실온(20~22℃)에서 12시간 명/암 주기로 유지되었다. 종양 형성 분석을 위해 총 1×107개의 레트로바이러스에 감염된 MKN28 세포를 1:3 PBS/하이드로겔(The Well Bioscience) 용액에 재현탁하고 6주령 수컷NOD/ShiLtJ-Prkdcem1AMCIl2rgem1AMC (NSGA, Joong Ah Bio) 마우스에 피하주사하였다 (그룹당 n=5). 윤리위원회에서 허용하는 최대 종양 크기이므로 종양 크기가 직경 20mm를 초과하는 것을 허용하지 않았다. 간 전이 모델에서 피부를 면도하고 에탄올 패드로 문지른 후 비장 근처에 0.5cm 복부를 절개하였다. 1.5×106 세포를 100 μl의 PBS에 현탁하여 전신마취 하에 6주령 수컷 NOD/ShiLtJPrkdcem1AMCIl2rgem1AMC (NSGA, Joong Ah Bio) 마우스에 주사하였다 (그룹당 n=4 또는 5). 바늘은 주사 후 2분 동안 비장 조직에 유지되었다. 출혈을 방지하기 위해 비장의 문을 가로질러 외과적으로 봉합하고 비장 절제술을 수행하였다. 주사 5주 후, 마우스를 희생시키고 간을 적출하여 조직학적 검사(헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 IHC(면역조직화학) 염색)를 위해 준비하였다. 억제제 연구를 위해 EZM2302 또는 비히클(dH20 중 0.5% 메틸셀룰로오스)을 21일 동안 100mg/kg의 용량으로 경구 BID 투여하였다.
주사 5주 후, 마우스를 희생시키고 간을 적출하여 조직학적 검사(헤마톡실린 및 에오신(H&E) 및 IHC(면역조직화학) 염색)를 수행하였다. 억제제 연구를 위해 EZM2302 또는 비히클(dH20 중 0.5% 메틸셀룰로오스)을 21일 동안 100mg/kg의 용량으로 경구 BID 투여하였다.
실시예 1-16: 정량 및 통계 분석
도 2o, 14f, 도 1, 15d, 및 16b의 P 값은 log-rank test를 사용하여 계산하였다. 도 2k-2n, 14e, 15c의 P 값은 two-sided Wilcoxon rank sum tests를 사용하여 계산하였다. 다른 모든 비교를 위해 GraphPad Prism 5의 two-tailed unpaired Student's t-test가 사용되었으며 P < 0.05는 통계적 유의성을 나타낸다.
실시예 2: LRRFIP2 선택적 스플라이싱의 상대빈도와 인간 위암 세포주 및 위암 환자 조직에서 ESRP1의 발현 수준의 연관성 확인
위암에서 ESRP1의 임상적 관련성을 확인하기 위해 먼저 유전자 발현 수준을 전체 생존률과 연관시켰다. 다른 암에서 ESRP1에 관한 이전의 보고와 같이 ESRP1의 높은 발현은 전체 생존 기간이 더 긴 것으로 나타났다(도 1) (Oncogene 33,4485-4495 (2014), Oncotarget 7,73800-73816 (2016)). 18개의 위암 세포주를 ESRP1의 발현 수준을 기준으로 두 그룹 (ESRP1-low 및 ESRP1-high)로 분류하였다. (도 2a). 흥미롭게도, ESRP1-low 그룹에 속하는 대다수의 세포(SNU668, SNU484, and MKN1)는 중간엽 서브타입으로 밝혀진 반면, ESRP1-high 그룹에 속하는 세포주(SNU638, SNU719, KATOIII, AGS, SNU601, SNU620, MKN45, NCI-N87, MKN74, SNU216, MKN28, and SNU16) 는 대부분 상피 서브타입으로 밝혀져 ESRP1 발현이 위암 세포의 상피/중간엽 표현형 결정에 관여할 수 있음을 확인하였다(도 3)(Gastroenterology155,799-814.e13 (2018)).
ESRP1이 위암 세포주의 mRNA 스플라이싱 패턴에 미치는 영향을 조사하기 위해 다양한 수준의 ESRP1을 발현하는 18개의 위암 세포주에서 기존에 보고된 RNA 시퀀싱 데이터(Genome Res. 23, 1109-1117 (2013))를 재분석하였다. iso-KTSP(Bioinformatics 33, 3308-3310 (2017); Nucleic Acids Res. 43,1345-1356 (2015))를 사용하여 isoform 스위치 분석을 수행한 결과, ESRP1-low 세포주와 ESRP1-high 세포주에서 splicing isoforms의 상대 빈도가 다른 100개의 유전자를 확인하였다(도 2b, 2c 및 표 4).
위암 세포주의 RNA 서열분석 데이터에서와 같이 ESRP1 발현이 높은 순서대로 조직샘플을 배열하고 splicing isoform의 상대빈도의 차등패턴을 분석하여 상관관계 점수가 높은 상위 20개 후보유전자를 히트맵에 나타내었다(도 5a 내지 5c). 또한, SUPPA(Genome Biol. 19,40(2018))을 사용하여 스플라이싱 이벤트 유형을 조사하였다.
ESRP1에 의해 조절되는 생물학적 프로세스를 조사하기 위해 DAVID 기능 주석 도구를 사용하여 GO term (Gene Ontology term) 및 KEGG 경로 (Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes pathway)를 동정하였다. 그 결과, ESRP1-low 세포주에서 상향 조절된 유전자가 기저 세포 암종, 상피 세포 분화의 음성 조절 및 세포 외 기질 구성과 같은 용어 및 경로에 대해 매우 풍부함을 확인하였다(도 2d). 반대로, ESRP1-high 세포주에서 상향 조절된 유전자는 접착 및 밀착 접합과 같은 KEGG 경로, 및 세포 접착의 양성 조절, 운동성 및 세포 분열의 조절, 세포-세포 접합 조립과 같은 GO term과 관련이 있는 것으로 확인되었다(도 2e). 위 종양 조직의 ESRP1-low 조건에서 상향 조절된 유전자는 국소 접착(focal adhesion), 세포 이동 조절 및 세포 접합 조립을 포함하는 GO termr과 KEGG 경로에서 풍부하였다 (도 5d). 반대로, ESRP1-high 조건의 조직에서 상향 조절된 유전자는 밀착 접합 및 세포-세포 접합 구성을 포함하는 GO term 및 KEGG 경로에서 풍부하였다(도 5e). 위암 조직의 이질적 특성으로 인해 세포주와 종양 조직 사이의 용어와 경로에 약간의 불일치가 있지만 세포 접합, 증식 및 운동성에 관한 용어와 경로는 일관성을 보였으며, 이는 ESRP1이 위암 세포에서 종양 운동성과 침윤성의 억제를 통해 전이와 종양 형성에서 중요한 역할을 수행한다는 것을 의미한다.
상위 후보 유전자 중 LRRFIP2 유전자는 스플라이싱 이벤트가 ESRP1과 높은 상관관계가 있는 신규한 선택적 스플라이싱 후보인 것으로 확인되었다. ESRP1-low 조건에서, LRRFIP2_NM_00134369(이하, LRRFIP2 이소형 3이라 함)의 엑손 7(서열번호 5)은 온전한 반면, ESRP1-high 조건에서 엑손 7은 스킵되었다(LRRFIP2_NM_017724; 이하, LRRFIP2 이소형 2라함) (도 2f, 5f, 5g). LRRFIP2 외에도, ESRP1의 또 다른 스플라이싱 후보인 CCDC50 또한 엑손의 스킵을 나타내었으며, BICD2는 ESRP1의 발현에 따라 위암 세포에서 발생하는 인트론 이벤트가 유지되었다(도 4).
LRRFIP2 유전자는 pre-mRNA 선택적 스플라이싱을 통해 4개의 mRNA 전사물을 생성할 수 있다(도 6a). 그러나, LRRFIP2 이소형 2 및 LRRFIP2 이소형 3만이 ESRP1와 연관된 발현패턴을 뚜렷하게 나타내었다(P<0.0001, 도 6b). LRRFIP2 스플라이싱 빈도는 ESRP1 발현 수준과 직접적인 상관관계가 있었으며, 18개 위암 세포주와 18개 조직 샘플의 RNA 시퀀싱 결과를 RT-PCR로 확인하였다(도 2i, 2j 및 도 5h). 이러한 결과는 LRRFIP2의 isoform 스위칭 이벤트가 ESRP1에 의해 조절되는 위암 세포에서의 상피 표현형 결정에 중요한 역할을 수행할 수 있음을 의미한다.
전이성 진행에서 ESRP1과 LRRFIP2 이소형 3의 발현 사이의 상관관계를 조사하기 위해 TCGA의 위암 데이터 세트에 대한 조사를 수행하였다. 그 결과, 진행성 위암 스테이지에서 낮은 ESRP1의 발현 수준 및 높은 LRRFIP2 이소형 3의 발현 수준이 확인되었다 (도 2k, 2l). 이와 일치하게도, 전이성 스테이지의 분석 결과는 전이성 위암이 있는 경우 ESRP1의 mRNA 발현이 현저히 낮고 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 발현이 현저히 높음을 확인하였다 (도 2m, 2n). LRRFIP2 이소형 3 발현과 위암 임상 결과의 연관성에 대한 기능적 중요성을 확인하기 위해, IV기 위암 환자의 발현 프로파일과 임상 데이터를 사용하여 Kaplan-Meier 생존(Kaplan-Meier survival)을 수행하였다(Mol. Oncol. 8,508-519 (2014); Genome Med. 13, 11 (2021)) 특히, 정상 조직과 비교하여 종양 조직에서 2배 이상 상향 조절된 LRRFIP2 이소형 3의 발현 수준을 보이는 위암 환자가 다른 환자보다 전체 생존 시간이 현저히 짧음을 확인하였다 (도 2o). 따라서, 이러한 데이터는 LRRFIP2 이소형 3의 발현이 ESRP1 발현과 부정적 상관관계를 나타내는 반면, 위 종양 조직의 전이 가능성과는 양의 상관관계가 있음을 의미한다.
실시예 3: LRRFIP2의 변이 형태에 따른 위암 세포 전이 가능성의 연관성 확인
다음으로 위암의 LRRFIP2 이소형의 isoform에 대한 ESRP1 조절의 영향을 확인하였다. 기존 보고에 따르면, ESRP1은 다양한 유형의 암에서 발암 가능성을 억제하고/하거나 전이를 약화시키는 데 중심적인 역할을 하는 것으로 보고된다[Mol. Cell 33,591-601 (2009); J. Biol. Chem. 287,36435-36442 (2012); RNA Biol. 6,546-562 (2009)]. 위암 세포의 침습성 및 이동성의 조절에 대한 ESRP1의 역할을 확인하기 위해 ESRP1의 이소성 과발현(ectopic expression) 후 ESRP1의 기저 발현이 낮은 MKN1 세포를 사용하여 트랜스웰 이동(transwell migration) 및 매트리겔 침습(Matrigel invasion) 분석을 수행하였다. ESRP1의 과발현은 MKN1 세포의 이동과 침습을 유의하게 감소시켰으나(도 7a), 증식이나 포커스 형성(foci-forming) 능력에는 유의한 영향을 미치지 않았다(도 8a, 8b). ESRP1에 의한 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱의 조절이 직접적인 연관성을 갖는지 여부를 확인하기 위해 ESRP1을 안정적으로 과발현하는 MKN1 및 SNU484 세포에서 LRRFIP2 이소형의 발현을 분석하였다. 그 결과, ESRP1의 이소성 과발현은 MKN1 및 SNU484 세포에서 주로 발현되는 LRRFIP2 이소형 3의 발현을 감소시키는 반면 LRRFIP2 이소형 2의 발현을 증가시켰다(도 7b). 최근의 연구에서 ESRP 결합 모티프가 ESRP-silenced exon21의 상류에서 종종 관찰되는 것에 기초하여, LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7의 상류 및 하류 여러 영역을 스크리닝하여 ESRP1이 엑손 7의 상류에 결합하는 것을 확인하였다(도 7c 및 도 9). 결론적으로, 이러한 본 발명의 결과는 ESRP1과 LRRFIP2 유전자 사이의 직접적인 상호 작용이 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7의 침묵을 유도할 수 있음을 의미한다.
LRRFIP2 이소형의 변화에 대한 ESRP1의 조절 능력을 확인함에 따라, LRRFIP2 이소형 2와 3을 안정적으로 과발현하는 세포주를 생성하여 위암 진행과 전이에서 LRRFIP2의 두 이소형의 생리학적 기능을 평가하였다(도 7d). 특히, LRRFIP2 이소형 3의 과발현은 상대적으로 ESRP1 발현이 높은 MKN28 및 MKN74 세포의 세포 이동 및 침습 능력을 유의하게 증가시켰으나, LRRFIP2 이소형 2의 과발현은 유의한 변화를 나타내지 않았다 (도 7e 및 도 10a). 간 전이에 대한 생체 내 모델로 자주 사용되는 MKN28 세포주를 사용하여 LRRFIP2 이소형 3-과발현만이 면역결핍 마우스에서 유의한 간 전이 유도를 유도한다는 것을 추가로 확인하였다(도 7f, 7g). 다음으로, LRRFIP2 이소형 2 및 3의 과발현이 세포 증식 및 종양 성장에 영향을 미치는지 여부를 평가하였다. 흥미롭게도 isoform 스위치는 in vitro에서 위암 세포주의 증식에 큰 영향을 미치지 않았다 (도 8c). in vivo에서의 효과를 확인하기 위해, LRRFIP2 이소형 2 및 3을 과발현하는 MKN28 세포를 면역 결핍 마우스의 옆구리에 피하 주사하고 관찰한 결과 LRRFIP2 이소형 중 어느 것도 위암 세포의 종양 부피에 유의미한 차이를 나타내지 않음을 확인하였다(도 8d).
LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7의 존재가 위암 세포의 전이 가능성에 실질적으로 중요한 기능을 수행하는지 여부를 확인하기 위해 CRISPR/Cas9 시스템을 사용하여, SRP1의 발현이 낮고 LRRFIP2 이소형 3의 발현이 높은 MKN1 세포에서 내인성 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7을 결실시켰다(도 7h, 7i 및 도 11). 이후, LRRFIP2의 엑손 7이 결핍된 MKN1 세포의 세포 이동 및 침습 능력을 테스트하였다. 엑손의 녹아웃은 MKN1 세포와 SNU484 세포의 이동과 침습을 극적으로 감소시켰지만 세포 증식에는 유의한 영향을 미치지 않았다(도 7j 및 도 8e 및 12a). 전체 LRRFIP2 유전자가 아닌 엑손 7만을 녹아웃해야 하기 때문에, 엑손 7 녹아웃 클론에서 LRRFIP2 이소형 3을 과발현 시킨 후 LRRFIP2 이소형 3에 의한 회복 효과를 평가하여 다중 부위를 표적화하는 한계를 해결하였다. LRRFIP2 이소형 3의 외인성 도입은 잠재적 오프-타겟 효과를 제외하고 감소된 침습성 및 이동 잠재성의 회복을 나타내었다(도 13a). 또한, LRRFIP2 엑손 7이 고갈된 MKN1 세포를 면역 결핍마우스의 비장에 주사하고, 생체 내 표현형 변화를 조사한 결과, 두 엑손 7 녹아웃 클론 모두에서 간 전이의 현저한 감소를 확인하였다(도 7k, 7l). 이러한 표현형 변화가 LRRFIP2 이소형 3의 기능 상실뿐만 아니라, LRRFIP2 이소형 2의 기능 획득에 의한 결과일 수 있으나, 엑손 7은 위암 세포의 전이 특성을 결정하는 중요한 요소임을 의미한다. 결론적으로 본 실시예의 in vivo 및 in vitro 데이터는 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7의 존재는 위암 세포의 전이 가능성을 현저히 증가시킬 수 있음을 의미한다.
실시예 4: LRRFIP2 변형 3의 엑손 7 결실에 따른 유전자 발현 패턴의 변화
실시예 1 및 2에서 LRRFIP2 이소형 3의 발현이 위암 세포의 세포 운동성과 침습성을 유의하게 유도할 수 있음을 확인함에 따라, LRRFIP2의 isoform과 암 세포 전이 가능성의 구체적 경로를 검증하고자 하였다. 우선, 야생형 및 엑손 7이 결실된 MKN1 세포의 RNA 시퀀싱을 수행하였다. 흥미롭게도, 엑손 7의 결실은 히트맵(2배 컷오프, P < 0.001)에 표시된 것과 같이, 여러 유전자의 발현 패턴의 상당한 차이를 나타내는 것을 확인하였다 (도 14a). LRRFIP2의 isoform에 따른 다른 유전자의 상향 또는 하향 조절을 확인하기 위해, DAVID 기능 주석 도구를 사용하여 GO 및 KEGG 경로 분석을 수행한 결과, LRRFIP2 엑손 7이 고갈된 세포의 하향 조절된 유전자가 세포 부착, 세포 이동 및 세포외 기질과 같은 경로에 대해 매우 풍부함을 확인하였다(도 14b). 그 뒤, 정량적 RT-PCR을 통해 공격적인 표현형을 나타내는 암 세포에서 중요한 역할을 수행하는 것으로 보고된 유전자들의 발현 수준의 변화를 확인하였다(도 14c 및 15a). 이들 중 상향된 유전자가 LRRFIP2 이소형 3으로 형질도입된 세포주에서도 상향 조절되는지 여부를 확인하기 위해 LRRFIP2 이소형 2 및 3을 과발현하는 MKN28 세포를 사용하여 정량적 RT-PCR을 수행하였다. 그 결과, 엑손 7이 고갈된 MKN1 세포에서 하향 조절된 유전자가 MKN28 세포에서 LRRFIP2 이소형 3의 과발현에 의해 상향조절되는 것을 확인하였다(도 14d 및 도 15b).
또한, 위암에서 표적 유전자 발현의 임상적 관련성을 조사하기 위해 TCGA 위암 샘플의 여러 단계에서 발현 수준을 조사하고 보다 공격적인 단계에서 SERPINE1, COL5A2, SEMA3C 및 LOXL2의 발현이 유의하게 높음을 확인하였다(도 14e, 15c). 위암의 임상 결과와 이들 유전자 중 일부의 연관성 및 기능적 중요성을 확인하기 위해 Kaplan-Meier Plotter 소프트웨어를 사용하여 퍼블릭 메타 분석을 수행하였다. 주목할 점은 SERPINE1, LOXL2 및 CDK6의 발현이 높은 환자는 발현이 낮은 환자보다 무재발 생존 기간(relapse-free survival)이 유의하게 더 짧다는 것에 있다(도 14f 및 15d). 종합하면, 이러한 결과는 LRRFIP2 이소형이 전이에 필수적인 유전자의 전사를 차등적으로 조절할 수 있으며, 결과적으로 LRRFIP2 이소형에 기초하여 시험관 내 및 생체 내에서 관찰된 암의 표현형을 예측할 수 있음을 의미한다.
실시예 5: CARM1 및 LRRFIP2 이소형 3에 의한 SERPINE1 전사의 공동 활성화
LRRFIP2 이소형의 상대 빈도가 변경된 세포에서 차별적으로 조절되는 유전자 전사의 분자적 메커니즘을 도출하기 위해, LRRFIP2 이소형 2 및 LRRFIP2 이소형 3 과발현 MKN28 세포를 사용하여 질량 분석 분석을 수행함으로서, 상호작용 파트너를 동정하였다. 질량 분석 분석 결과 LRRFIP2 이소형 2 독점적인 잠재적 결합 단백질로서, 아르기닌 잔기에서 단백질 기질을 비대칭적으로 디메틸화함으로써 전사 보조활성화제로 작용하는 type I PRMT(protein arginine methyltransferase)인 CARM1(coactivator-associated arginine methyltransferase)을 확인하였다(도 17a). 이는 CARM1이 인간 암에서 암유전자(oncogene)로 기능함을 의미하며, 유방암, 결장암, 전립선암과 같은 여러 암유형에서 CARM1이 높게 발현되는 기존의 보고와 일치한다. CARM1의 mRNA 발현 또한 정상 조직에 비해 위암 조직에서 유의하게 증가한다(도 16a). Kaplan-Meier Plotter 소프트웨어를 사용한 퍼블릭 메타 분석에서도 CARM1 발현이 높은 환자는 발현이 낮은 환자보다 무재발 생존 기간이 유의하게 더 짧은 것으로 나타났니다(도 16b). 면역 침전 분석 결과 CARM1 이 LRRFIP2 이소형 2와 강한 상호작용을 나타내나, LRRFIP2 이소형 3과는 약한 상호작용을 나타내는 것을 확인하였다(도 17b, 17c). 질량 분석 데이터 및 면역 침전 데이터의 추가 검증을 위해 CARM1 및 LRRFIP2의 세포 내 위치를 확인한 결과, CARM1은 핵에서만 발견되었으며, LRRFIP2는 핵 및 세포질 모두에서 검출되었다(도 18).
CARM1은 후생유전학적 조절자로서 히스톤 H3R17, 전사 인자 및 기타 공동 전사 조절자에 대한 특이성을 가진 히스톤의 아르기닌 잔기를 메틸화하여 전사를 조절한다. CARM1의 보고된 기능과 같이 CARM1의 녹다운이 위암 세포에서 H3R17의 비대칭 다이-메틸화(dimethylation)를 감소시키는 것을 확인하였다(도 17d). 그러나 유방암 세포에서 CARM1의 또 다른 잘 알려진 표적인 BAF155 R1064 다이-메틸화의 유의한 변화는 관찰되지 않았으며 이는 BAF155 R1064의 다이-메틸화가 세포 유형에 따라 다를 수 있음을 의미한다(도 19a). CARM1 매개 메틸화에서 LRRFIP2 이소형의 역할과 표적 유전자의 후속 전사 조절을 확인하기 위해, MKN28 세포에서 LRRFIP2 이소형 2와 이소형 3이 과발현되고 MKN1 세포에서 내인성 LRRFIP2 이소형 3의 엑손 7이 제거되는 경우의 H3R17의 다이-메틸화 상태를 평가하였다. 흥미롭게도, H3R17 다이-메틸화 는 MKN28 및 MKN74 세포에서 LRRFIP2 이소형 3이 이소성 과발현된 경우에만 유의하게 향상되었고 LRRFIP2의 엑손 7이 MKN1 및 SNU484 세포에서 결실되었을 때 감소하였다(도 17e, 17f 및 도 10b 및 12b). 또한, 엑손 7 녹아웃 세포주에서 LRRFIP2 변형 3의 외인성 과발현은 CARM1에 의한 H3R17의 메틸화를 회복시켰다(도 13b). 반대로, LRRFIP2 이소형들의 과발현 또는 엑손 7 결실에 의해 BAF155 R1064 다이-메틸화의 유의한 변화가 관찰되지 않았으며, 이는 위암 세포에서 CARM1 단독 또는 LRRFIP2와 CARM1의 공동 작용이 BAF155 R1064 다이-메틸화의 조절에 중요하지 않을 수 있음을 의미한다(도 19b, 19c).
본 실시예의 결과는 LRRFIP2 이소형 3의 존재 하에 CARM1에 의한 H3R17의 높은 다이-메틸화(dimethylation)가 유전자 전사를 유도할 수 있는지 여부를 확인하였다. RNA 시퀀싱(도 14a)결과에서 확인된 유전자 중 SERPINE1은 종양 전이에서 중요한 역할을 수행하며, 다양한 암에서 불량한 예후를 초래하는 것으로 보고된다(Biomed. Pharmacother. 105,83-94 (2018)). SERPINE1의 mRNA 발현과 프로모터 활성이 LRRFIP2의 이소형 스위치에 의해 유의하게 조절된다는 것을 확인하였기 때문에(도 14c, 14d 및 도 10c, 12c, 13c-13d 및 20a), SERPINE1 유전자 발현에 대한 LRRFIP2 스플라이싱 이소형 및 CARM1의 기능적 관련성을 평가하였다. LRRFIP2 이소형 3을 과발현하는 MKN28 세포에서 SERPINE1의 상향조절된 mRNA 발현은 CARM1의 녹다운에 의해 감소되었으며(도 17g), 이는 SERPINE1이 LRRFIP2 이소형 3의 존재 하에서 CARM1에 의해 전사적으로 활성화될 수 있음을 의미한다. SERPINE1의 프로모터 활성은 CARM1의 녹다운에 의해 하향 조절되었다(도 20b).
또한 인간 CARM1 및 H3R17me2에 대한 항체로 LRRFIP2 이소형 2 및 3을 과발현하는 세포에서 크로마틴 면역 침전(ChIP) 분석을 수행하여 CARM1 단백질 및 비대칭적으로 다이-메틸화된 H3R17 단백질이 LRRFIP2 이소형 3의 존재 하에 인간 SERPINE1 프로모터에 존재함을 확인하였다(도 17h, 17i). 흥미롭게도, 전이성 간암 조직에서 SERPINE1 단백질 및 다이-메틸화 H3R17 단백질의 발현을 조사한 결과, 대조군 MKN1 세포에 비해 LRRFIP2 엑손 7 결실을 갖는 MKN1 세포에서 이들 단백질의 발현이 유의하게 감소하는 것을 확인하였다(도 14k 및 17j). 이는 CARM1 및 LRRFIP2 이소형 3이 모두 SERPINE1의 발현 조절에 관여함을 의미한다. 또한, CARM1 표적으로 알려진 CCNE1 프로모터에 대한 CARM1 모집 유도는 ChIP 분석에 의해 LRRFIP2 이소형 3의 존재 하에서도 관찰되었으며, 이는 다른 CARM 표적 유전자에서 CARM1에 의한 전사 조절이 LRRFIP2의 선택적 스플라이싱과 연관될 수 있음을 의미한다(도 21a). 실제로 우리는 LRRFIP2 이소형 3을 과발현하는 MKN28 세포에서 AXIN2, CCNE1 및 GADD45A를 포함한 CARM1의 알려진 표적 유전자의 발현 수준이 상승하는 것을 확인하였으며, LRRFIP2 이소형 2 과발현 세포에서는 상향 조절되지 않음을 확인하였다(도 21b).
또한, LRRFIP2의 선택적 스플라이싱에 의한 H3R17의 비대칭 다이-메틸화 및 SERPINE1 발현의 변화가 생체 내에도 발생하는지 확인하기 위해 전이된 간 조직에서 항-SERPINE1 및 항-H3R17me2a 항체를 사용하여 면역조직화학적 분석을 수행하였다(도 7k 및 7l). 세포주에서의 결과와 일치하게, SERPINE1의 발현과 H3R17의 다이-메틸화는 LRRFIP2 엑손 7-결실 세포가 주입된 마우스의 간 조직에서 유의하게 감소하였다(도 17j).
CARM1 발현이 SERPINE1 발현에 중요하다는 점을 고려하여 CARM1이 실제로 위암 세포의 이동 및 침습에 영향을 미치는지 확인한 결과, CARM1의 녹다운은 MKN1 세포의 이동 및 침습 능력을 상당히 감소시켰다(도 17k). 흥미롭게도, LRRFIP2 이소형 3은 LRRFIP2 이소형 2에 결합하며, LRRFIP2 이소형 2와 CARM1의 결합을 억제하는 것으로 나타났다(도 22). 이러한 결과는 LRRFIP2 이소형 3이 LRRFIP2 이소형 2와 CARM1의 상호작용을 차단하여 LRRFIP2 이소형 2의 종양 억제활성을 감소시킬 수 있음을 의미한다. LRRFIP2 이소형 3은 표적 유전자에 CARM1을 모집하여 SERPINE1과 같은 전이 촉진 유전자의 전사 활성화를 조절할 수 있다.
실시예 6: CARM1 및 LRRFIP2 이소형 3의 SERPINE1의 전사 조절에서 ACTR과 CARM1의 상호작용
CARM1은 원래 이스트-2-하이브리드 스크리닝에서 GRIP1/TIF2/Src-2/NCOA2에 대한 결합을 통해 동정되었으며, 기타 p160 패밀리 구성원(Src-1/NCOA1, ACTR /AIB1/SRC-3/NCOA3)과도 직접 상호작용하는 것으로 보고된다. p160 coactivator 패밀리는 CARM1의 바인딩 플랫폼 역할을 하여 전사의 공동 조절자로서의 역할을 지원하기 때문에, LRRFIP2 이소형 2가 p160 패밀리 구성원과의 상호 작용을 제거하여 CARM1의 활성을 감소시킬 수 있는지 여부를 조사하였다. 엑손 7 결실은 ACTR과 CARM1 사이의 상호 작용을 감소시켰다(도 23a). 이러한 결과와 일치하여, MKN28 세포에서 LRRFIP2 이소형 3 과발현은 CARM1과 ACTR 사이의 상호작용을 증가시킨 반면, LRRFIP2 이소형 2의 과발현은 CARM1과 ACTR 사이의 상호작용을 약간 감소시켰다(도 23b). LRRFIP2 이소형 2가 CARM1에 대한 직접 결합을 통해 ACTR과 CARM1 간의 상호 작용을 방해하는지 여부를 추가로 확인하기 위해 LRRFIP2 이소형 3의 발현이 높은 MKN1 세포에서 LRRFIP2 변형 2를 과발현하는 세포주를 제조하였다. 그 결과, CARM1에 대한 ACTR의 결합은 LRRFIP2 이소형 2의 이소성 발현에 의해 현저하게 감소되었으며(도 24a), 이는 LRRFIP2 이소형 2가 CARM1에 직접 결합하여 ACTR이 CARM1에 결합하는 것을 방지함을 의미한다. 또한, MKN1 세포에서 LRRFIP2 이소형 2의 과발현은 SERPINE1의 발현, 히스톤 H3R17의 비대칭 다이-메틸화, 침습성 및 이동 가능성을 하향 조절하는 것으로 확인되었다(도 24b 내지 24d).
그 뒤, LRRFIP2 이소형 3을 우세 발현하는 MKN1 세포에서 CARM1 매개 유전자 전사에서의 ACTR의 역할을 확인하였다. ACTR 녹다운은 위암 세포에서 히스톤 H3R17의 비대칭 다이-메틸화를 감소시켰으며, 이는 히스톤 메틸화를 통한 CARM1에 의한 표적 유전자의 전사 조절이 주로 ACTR 발현과 관련이 있음을 의미한다(도 23c). 특히, siRNA에 의한 ACTR 녹다운은 SERPINE1의 mRNA 발현을 약화시켰고(도 23d), 이는 보조활성화제 CARM1이 p160-유형 보조활성화 인자 중 하나인 ACTR과 상승적으로 협력하여 SERPINE1의 발현을 유도함을 의미한다. 다음으로 SERPINE1 유전자에서 CARM1 모집에 ACTR이 필요한지 여부를 조사하였으며, 대조군 MKN1 세포와 ACTR 녹다운 MKN1 세포를 사용하여 ChIP 분석을 수행하였다. 예상대로 ACTR의 감소된 발현은 CARM1의 SERPINE1 프로모터로의 모집을 현저하게 감소시켰다(도 23e). SERPINE1 프로모터의 루시퍼라제 활성은 또한 대조군 MKN1 세포와 비교하여 ACTR-녹다운 MKN1 세포에서 감소하였다(도 23f). 트랜스웰 이동(transwell migration) 및 매트리겔 침습(Matrigel invasion) 분석을 사용하여 ACTR 침묵이 위암 세포의 마이그레이션 및 침습에 영향을 미치는지 여부를 추가로 시험하였으며, 그 결과, ACTR의 녹다운은 MKN1 세포의 이동과 침입을 극적으로 감소시켰다(도 23g).
또한, CARM1 단독의 과발현은 MKN1 대조군 세포에서 SERPINE1 발현을 유의하게 증가시키지 않은 반면, CARM1 및 ACTR의 동시 과발현은 SERPINE1의 전사를 증가시켰다(도 23h). 그러나 이러한 증가는 엑손 7이 결실된 MKN1 세포에서는 유의하지 않았다. 한편, CARM1 과발현은 엑손 7-결실 MKN1 세포에서 SERPINE1 발현을 회복시켰다. 이는 exon-7 결실에 의해 생성된 LRRFIP2-이소형 2가 SERPINE1 프로모터에 대한 p160 패밀리의 공동활성자인 중 하나인 ACTR과 결합된 CARM1의 모집을 억제하고 SERPINE1의 발현 감소를 유도함을 의미한다. 본 실시예의 결과는 LRRFIP2 이소형 2가 CARM1의 발암성 기능을 억제함으로써 위암의 전이성 표현형을 억제할 수 있음을 의미한다.
실시예 7: CARM1 효소 활성 억제에 의한 SERPINE1 발현 및 LRRFIP2 이소형 3-과발현 위암 세포의 침습성 억제효과
CARM1이 아르기닌 메틸트랜스퍼라제라는 점을 감안하여 CARM1의 메틸트랜스퍼라제 활성이 위암 세포에서 SERPINE1의 전사 조절에 중요한지 여부를 확인하였다. CARM1 효소 활성의 강력한 선택적 억제제인 EZM2302를 처리한 결과 히스톤 H3R17의 비대칭 다이-메틸화가 현저히 감소되었으며, 이는 CARM1의 효소 활성이 억제되었음을 의미한다(도 25a). 또한, LRRFIP2 이소형 3의 이소성 과발현에 의한 히스톤 H3R17의 메틸화의 향상은 EZM2302 처리에 의해 감소되었으며, 이는 LRRFIP2 이소형 3-과발현 세포에서 히스톤 메틸화의 유도가 실제로 CARM1에 의해 유도되었음을 의미한다(도 25b). ChIP 분석은 CARM1 및 히스톤H3R17의 비대칭 다이-메틸화에 대항하는 항체와 함께 ZM2302를 처리 후, 엑손 7이 결실된 MKN1 세포 및 LRRFIP2 이소형 2 과발현 MKN228 세포에서 수행되었다. 특히, CARM1의 효소 활성 억제는 CARM1dml 모집 및 LRRFIP2 이소형 3의 과발현에 의해 강화된 SERPINE1 프로모터에서의 히스톤 H3R17의 비대칭 메틸화 농축을 모두 감소시켰다(도 25c, 25d). 결과적으로, SERPINE1의 mRNA 발현은 EZM2302 처리에 의해 감소되었다(도 25e). LRRFIP2 변형 3에 의한 상향 조절된 SERPINE1 발현은 억제제 처리에 의해 다시 하향 조절되었으며, 이는 SERPINE1의 전사 조절자로서 CARM1의 역할을 뒷받침한다(도 25f).
다음으로 EZM2302 처리 시 MKN28 및 MKN1 세포주의 이동 능력을 테스트하였다. 그 결과, CARM1의 약리학적 억제는 대조군 및 이소형 2-과발현 MKN28 세포에 비해 LRRFIP2 이소형 3-과발현 세포의 이동 이점을 용량 의존적으로 제거하였다(도 25g). 마찬가지로, MKN1 대조군 세포의 이동은 EZM 2302 처리 시 용량 의존적으로 감소한 반면, LRRFIP2 엑손 7-결실 세포에서는 더 이상의 감소가 관찰되지 않았다(도 25h). 또한 LRRFIP2 이소형 3-과발현 세포를 면역결핍 마우스에 비장내 주사한 후 EZM2302 처리하여 생체 내 표현형 변화를 조사했으며 LRRFIP2 이소형 3-과발현 조건에서만 EZM2302 처리에 의한 간 전이의 상당한 감소를 관찰하였다(그림 25i, j). 이러한 결과는 EZM2302의 위암 전이 억제 활성이 LRRFIP2 이소형 3의 발현 정도에 따라 달라질 수 있음을 시사한다. 흥미롭게도, EZM2302는 이들 세포주에서 세포 증식이나 초점 형성 능력에는 유의미한 영향을 미치지 않았다(도 26). 결과적으로, 이러한 결과는 CARM1 효소 활성의 억제가 SERPINE1 발현의 억제를 초래하고 이어서 위암 세포의 침습 가능성을 현저이 낮춘다는 것을 의미한다.
이상으로 본 발명 내용의 특정한 부분을 상세히 기술하였는 바, 당업계의 통상의 지식을 가진 자에게 있어서 이러한 구체적 기술은 단지 바람직한 실시 양태일 뿐이며, 이에 의해 본 발명의 범위가 제한되는 것이 아닌 점은 명백할 것이다. 따라서, 본 발명의 실질적인 범위는 첨부된 청구항들과 그것들의 등가물에 의하여 정의된다고 할 것이다.
Claims (26)
- 대상으로부터 분리된 시료에서 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질은 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서,
LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 증가 한 경우, 암의 진행성 및 전이성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 대조 시료는 정상 조직, 비-진행성 또는 비-전이성 암 조직으로부터 분리된 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제6항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2 단백질은 서열번호 2로 표시되는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제6항에 있어서, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준이 대조 시료에 비해 감소한 경우, 암의 진행성 및 전이성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제6항에 있어서, LRRFIP2 이소형2에 대한 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율(이소형 3/이소형 2)이 대조 시료에 비해 증가한 경우, 암의 진행성 및 전이성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시료에서 히스톤의 다이-메틸화(dimethylation) 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 시료에서 ESRP1, CARM1, SERPINE1, COL5A2, SEMA3C, LOXL2, CD74, CDK6, PKP1, AXIN2, CCNE1, 및 GADD45A 로 구성된 군에서 선택된 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 암의 예후 예측은 암의 진행성 또는 전이성을 예측하는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 암은 위암인 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- 제1항에 있어서, 상기 전이는 간 전이인 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측을 위한 정보제공 방법.
- LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측용 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질은 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA에 특이적으로 결합하는 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드, 및 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA를 특이적으로 증폭할 수 있는 프라이머로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측용 조성물.
- 제16항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질에 특이적으로 결합하는 물질은 항체, 올리고펩타이드, 리간드, PNA(peptide nucleic acid) 및 앱타머(aptamer)로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 암의 전이 또는 예후 예측용 조성물.
- 제16항에 있어서, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA의 수준을 측정하기 위한 물질 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질에 특이적으로 결합하는 물질을 포함하는 암의 전이 또는 예후 예측용 조성물.
- 대상으로부터 분리된 시료에서 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 3 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 포함하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공방법.
- 제20항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA는 서열번호 3으로 표시되는 것을 특징으로 하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공방법.
- 제20항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 3 단백질은 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공방법.
- 제20항에 있어서, LRRFIP2 이소형 2의 mRNA 수준 또는 LRRFIP2 이소형 2 단백질의 발현 수준을 확인하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공방법.
- 제23항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2의 mRNA는 서열번호 1로 표시되는 것을 특징으로 하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공방법.
- 제23항에 있어서, 상기 LRRFIP2 이소형 2 단백질은 서열번호 4로 표시되는 것을 특징으로 하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공방법.
- 제23항에 있어서, LRRFIP2 이소형2에 대한 LRRFIP2 이소형 3의 mRNA 수준 또는 단백질 발현 수준의 비율(이소형 3/이소형 2)이 대조 시료에 비해 증가한 경우, 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성이 높은 것으로 분류하는 단계를 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 대상의 CARM1 저해제에 대한 감수성 예측을 위한 정보제공방법.
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