KR101936210B1 - 암 예후 예측용 바이오마커 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 암, 특히 갑상선암 또는 간암의 예후를 예측하기 위한 유전자 바이오마커, 상기 유전자 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 예후 예측용 조성물, 상기 조성물을 포함하는 암 예후 예측용 키트, 상기 키트를 이용하여 암의 예후를 예측하기 위한 정보제공방법, 상기 유전자 바이오마커를 이용하여 암의 예방 또는 치료용 물질을 스크리닝하는 시스템 및 상기 유전자 바이오마커를 타겟으로 하는 암의 예방 또는 치료용 약학적 조성물에 관한 것으로, 보다 상세하게는 암 환자에서 본 발명의 유전자 바이오마커의 발현수준을 측정하여 암 환자의 예후를 예측할 수 있고, 예후 예측결과에 따라 암의 불량한 예후에 관여하는 해당 유전자 바이오마커의 발현을 억제할 수 있으므로, 암 환자를 보다 효과적으로 치료할 수 있다.

Description

암 예후 예측용 바이오마커{Biomarkers for Thyroid and Liver cancer and the use thereof}
본 발명은 암의 예후를 예측하기 위한 유전자 바이오마커, 상기 유전자 바이오마커의 발현수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 예후 예측용 조성물에 관한 것이다.
암에서의 nc886의 역할은 다수의 암세포 주 및 환자 시료에서 이것의 발현 패턴 때문에 알려졌다. 본 발명자 및 다른 연구실에서의 이전의 연구들은 몇몇 종양들에서 이것의 후성 유적학적 침묵에 기반하여, 이것의 추정적인 종양 억제 역할을 강조했다. 그러나, 여러 데이터들은 nc886 발현의 증가가, 특히 종양발생의 초기 단계 동안에 좀 더 일반적인 현상이라는 것을 암시했다. 상기 nc886 레벨은 비-증식 조직보다 증식 세포에서 훨씬 더 높다. 예를 들면, 대부분 불멸화 세포(immortalized cell)들은 nc886을 풍부하게 발현한다. 많은 케이스에서, nc886의 높은 레벨은 불멸화 세포(immortalized cell)가 형질전환된 세포로 진행됨에 따라 유지되거나 심지어 더 높아진다. 암에서 nc886의 증가된 발현은 nc886을 검파하는 프로브가 있는 miRNA 프로파일링 데이터에서 또한 보여진다. 모든 이러한 관찰들은 정상 세포에서보다 암세포에서의 더 높은 PolⅢ 활성과 일치한다.
nc886은 PKR에서 이것의 억제 역할을 통해 세포 사멸 또는 증식을 결정하는데 있어서 중요한 역할을 한다. PKR은 원래 바이러스 감염에 활성화될 때 eIF2α 인산화함으로써 세포 사멸을 이끌고 결과적으로 세포성 단백질 합성을 shut down 되는 바이러스성 센서로 알려져 있다. 바이러스성 센싱 뿐만 아니라, PKR은 다양한 세포성 신호 통로에 관여하고 암에 관여한다. PKR의 본래 종양 억제자 역할로 제시된 pro-apoptotic 역할에도 불구하고 암에서 이것의 중요한 역할은 여전히 논쟁적이다. nc886의 후성유전학적 침묵은 암세포의 아군에서 발생하고, nc886 knockdown(KD)은 PKR을 활성화시키며, 결과적으로 바이러스 감염에서와 마찬가지로, 세포사멸을 유도한다. 이러한 결과는 제거 전-암성 세포에서 nc886/PKR의 중요성을 설명하기 위하여, PKR의 본래 바이러스 감지 역할과 비교된 "종양 감지 모델"을 제안하였다.
그럼에도 불구하고, 종양 촉진 또는 억제에 있어 PKR과의 관계에서 nc886의 정확한 역할은 아직 밝혀지지 않았다. 증식 세포에서 nc886의 증가된 발현은 PKR의 추정 종양 억제 기능에 대응하는 그것의 oncogenic 역할과 일치한다: 그러나 이러한 아이디어는 입증되지 않았다. 물론, nc886은 PKR-독립적인 역할을 할 것이다. nc886에 관한 연구는 PKR 활성화를 통해 급성 세포 사멸에서의 고갈 결과로 인한 한계가 있었다. 이러한 이유로, 동종 nc886+대조군 세포주로부터 nc886- 세포주를 수득하는 것에 대한 도전이 되었다. 두 세포주 사이의 비교는 암에서 nc886의 정확한 역할을 측정하기 위해 필수적이다. 본 연구에서, 본 발명자들은 PKR 및 nc886 낙아웃(knockout, KO) 세포를 연속적으로 생산함으로써 상기와 같은 문제를 해결하였고, 처음으로, 암 특히 갑상선암 및 간암에서의 역할을 명백히 결정하였다.
본 발명은 nc886 유전자를 포함하는 암의 예후 예측용 바이오마커 등을 제공하고자 한다.
그러나, 본 발명이 이루고자 하는 기술적 과제는 이상에서 언급한 과제에 제한되지 않으며, 언급되지 않은 또 다른 과제들은 아래의 기재로부터 당업자에게 명확하게 이해될 수 있을 것이다.
본 발명은 nc886 유전자를 포함하는 암의 예후 예측용 바이오마커 를 제공한다.
상기 암은 갑상선암 또는 간일 수 있다.
본 발명의 일구현예는 본 발명의 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 예후 예측용 조성물을 제공한다.
상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적으로 결합하는 프라이머 쌍, 프로브 또는 안티센스 뉴클레오티드를 포함할 수 있다.
본 발명의 다른 일구현예는 본 발명의 조성물을 포함하는 암 예후 예측용 키트를 제공한다.
상기 키트는 RT-PCR 키트, 경쟁적 RP-PCR 키트, 실시간 RT-PCR 키트, 정량적 RT-PCR 키트 또는 DNA 칩 키트 일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예는 a) 암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 바이오마커의 발현 수준, 또는 발현 패턴을 얻는 단계; 및 b) 상기 a) 단계에서 얻은 발현 수준 또는 발현 패턴을 예후가 알려진 암 환자의 해당 유전자의 바이오마커 발현 수준, 또는 발현 패턴과 비교하는 단계를 포함하는 암 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다.
상기 바이오마커 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay) 또는 면역형광법(immunofluorescence)인 것일 수 있다.
본 발명의 또 다른 일구현예는 a) 암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계;b) 후보물질이 처리된 암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 c) 상기 b) 단계의 바이오마커 발현 수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 시스템을 제공한다.
본 발명의 또 다른 일구현예는 본 발명에 따른 바이오마커의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용가능한 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
상기 물질은 바이오마커에 대한 안티센스 올리고 뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA인 것일 수 있다.
상기 물질은 상기 바이오마커의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편인 것일 수 있다.
상기 조성물은 ANLN, C5orf13(=NREP), COL5A1, VGLL2, C15orf52, 또는 KIAA1644의 발현을 억제할 수 있다.
상기 조성물은 EGFR, HIPK2, HSPBL2 또는 TAXIBP1으로 구성된 군 중 하나 이상의 항-세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)의 발현을 억제할 수 있다.
상기 조성물은 CDKN2C 또는 DKK1의 발현을 증가시킬 수 있다.
본 발명은 nc886 유전자를 포함하는 갑상선암 또는 간암의 예후 예측용 바이오마커에 관한 것으로서, 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정함으로써, 암 환자의 예후를 예측할 수 있다. 또한, 예측된 예후에 따라 적절한 치료방향을 결정할 수 있어 환자 맞춤별 치료방법의 제공이 가능하고, 불량한 예후의 암 환자의 암 재발 및 사망률을 감소시켜 유방암 환자를 더욱 효과적으로 치료할 수 있다.
도 1은 갑상선암 환자 및 세포주로부터 얻은 조직샘플에서의 nc886의 발현을 나타낸 것이다. 구체적으로, (a)는 갑상선 종양 및 인접한 정상조직의 37쌍의 nc886에 대한 qRT-PCR 측정 결과를 나타낸 것이고, (b) 및 (c)는 T 병기(패널B) 및 림프절 전이(패널 C)에 따라 nc886 발현 그룹에서 환자의 하위 분류를 나타낸 것이며, (d)는 갑상선 세포주의 nc886에 대한 qRT-PCR 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 2는 갑상선암 환자 및 세포주로부터 얻은 조직샘플에서 세포 증식을 악화시키는 PKR를 활성화시키는 nc886KD를 나타낸 것이다. 구체적으로, (a)는 nc886 KD후, 로딩 컨트롤(상단 패널) 및 세포증식(MRS)분석(하단 패널)으로 nc886 및 5SrRNA의 Northern hybridization 결과를 나타낸 것이고, (b)는 nc86 KD 후 패널 A에서 표시된 단백질을 Western blot으로 확인한 결과이며, (c)는 패널 A~B의 nc886 KD 데이터 요약 및 nc886 KO의 예상 세포 결과를 나타낸 것이다.
도 3은 갑상선암 환자 및 세포주로부터 얻은 조직샘플에서 PKR 또는 nc886 KO 세포의 세포 증식 분석 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, (a)는 PKR/nc886의 Western/Northern blots에 의한 KO 세포주를 각각 loading controls로서 β-actin 및 5S rRNA로 확인한 것이고, (b)는 표시된 KO 세포주의 MTT 세포 증식 분석을 나타낸 것이며, (c) 및 (d)는 콜로니 형성 분석을 나타낸 것이다.
도 4는 (갑상선암 환자 및 세포주로부터 얻은 조직샘플에서 PKR 또는 nc886 KO 세포의 세포 이동((a)~(b)) 및 침습((c)~(d)) 결과를 나타낸 것이다.
도 5는 갑상선암 환자 및 세포주로부터 얻은 조직샘플에서 PKRwt/nc886wt, PKRKO/nc886wt, 및 PKRKO/nc886KO 사이의 유전자 발현 프로필을 비교한 결과를 나타낸 것이다. 구체적으로, (a)는 PKR 또는 nc886 KO에서 발현 값이 유의하게(log2 (fc)> 1 또는 <-1) 변화된 226개의 유전자의 계층적 클러스터링을 보여주는 히트 맵을 나타내는 것이고, (b)는 표시된 유전자의 발현에 따라 505명의 환자(TCGA 코호트)의 생존율을 계층화하는 Kaplan-Meier 곡선을 나타낸 것이다.
도 6은 nc886의 갑상선암에서의 역할을 요약한 모식도이다.
도 7(a)~(c)는 간세포 암종양(hepatocellular carcinoma tumor) 및 정상 간 조직에서의 nc886 발현 여부를 비교한 그래프이다.
도 8은 (a) 58명의 간암 환자의 종양에서 nc886의 발현이 증가된 환자(39명) 및 nc886의 발현이 감소된 환자(19명)을 두 하위 그룹으로 분류한 결과를 나타낸 것이고, (b) 상기 두 하위그룹의 RFP 및 OS의 확률을 보여주는 Kaplan-Meier 곡선을 나타낸 것이며, (c) 상기 58개의 환자 표본의 mRNA 마이크로어레이 데이터로부터 생성된 히트맵(heat map)을 나타내는 것이다.
본 발명자들은 CRIPR/Cas-매개(mediated) 유전자 KO를 사용하여, nc886이 갑상선 암 또는 간암에서 종양 유발 유전자(oncogene) 역할을 한다는 것을 밝혀냄으로써, 본 발명을 완성하였다.
이하, 본 발명을 보다 상세하게 설명한다.
암의 예후 예측용 바이오마커
본 발명은 nc886 유전자를 포함하는 암의 예후 예측용 바이오마커를 제공한다. 구체적으로, 상기 암은 갑상선암 또는 간암일 수 있다.
상기 nc886의 발현은 갑상선 세포를 활발하게 증식시키며, 세포 증식, 이동 및 침습에 필수적이며, nc886의 고발현은 종양의 공격성 및 측면 림프절 전이와 밀접하게 관련되어 있다. nc886 KO는 한 세트 유전자의 하향 조절을 유도하고, 이들 중 일부 저발현은 TCGA 코호트(cohort)에서 환자의 양호한 생존과 관련이 있음을 확인할 수 있었다. 즉, nc886과 관련된 유전자는 수술 전후 수술의 범위를 결정하고, 수술 후의 결과를 개선하기 위해 방사선 요오드 요법의 용량을 결정하는데 유익한 지표가 될 수 있다.
암 예후 예측용 조성물
본 발명은 본 발명에 따른 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는 암 예후 예측용 조성물을 제공한다. 상기 바이오마커의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 제제는 상기 바이오마커에 특이적인 프라이머, 프로브, 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer) 또는 항체일 수 있다. 본 발명에 따른 조성물은 nc886의 폴리뉴클레오티드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 갑상선암 또는 간암을 진단할 수 있고, PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다. 또한, 본 발명의 프라이머는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있으며, 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, 캡화, 천연 뉴클레오티드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오티드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트 등)로의 변형이 있다.
암 예후 예측용 키트
본 발명은 본 발명에 따른 암 예후 예측용 조성물을 포함하는 암 예후 예측용 키트를 제공한다. 상기 암 예후 예측용 조성물의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 바이오마커의 발현수준을 측정하기 위한 키트는 RT-PCR을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 키트일 수 있다. RT-PCR 키트는 마커 유전자에 대한 특이적인 각각의 프라이머 쌍 외에도 테스트 튜브 또는 다른 적절한 컨테이너, 반응 완충액, 데옥시뉴클레오티드(dNTPs), Taq-중합효소 및 역전사효소, DNase, RNase 억제제, DEPC-물(DEPC-water), 멸균수 등을 포함할 수 있다.
또한, 본 발명의 키트는 DNA 칩을 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 갑상선암 또는 간암의 진단용 유전자를 검출하기 위한 키트일 수 있다. DNA 칩 키트는 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA가 프로브로 부착되어 있는 기판을 포함하고 기판은 정량 대조군 유전자 또는 그의 단편에 해당하는 cDNA를 포함할 수 있다.
암 예후 예측을 위한 정보제공방법
본 발명은 (a) 암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 바이오마커의 발현 수준, 또는 발현 패턴을 얻는 단계; 및 (b) 상기 (a) 단계에서 얻은 발현 수준 또는 발현 패턴을 예후가 알려진 암 환자의 해당 유전자의 바이오마커 발현 수준, 또는 발현 패턴과 비교하는 단계를 포함하는 암 예후 예측을 위한 정보제공방법을 제공한다. 상기 바이오마커의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
먼저, 본 발명에 따른 정보제공방법은 암 환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 제1항의 바이오마커의 발현 수준, 또는 발현 패턴을 얻는 단계[(a) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 진단하고자 하는 개체로부터 분리된 생물학적 시료로부터 상기 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계는 갑상선암 또는 간암의 진단용 조성물을 생물학적 시료와 접촉시키는 단계를 통하여 이루어지는 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 이때, 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay), 면역형광법(immunofluorescence)인 것일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 생물학적 시료는 간 유래 조직, 세포, 전혈, 혈정, 혈장, 타액, 객담 또는 뇨일 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
다음으로, 본 발명에 따른 정보제공방법은 상기 (a) 단계에서 얻은 발현 수준 또는 발현 패턴을 예후가 알려진 암 환자의 해당 유전자의 바이오마커 발현 수준, 또는 발현 패턴과 비교하는 단계[(b) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 상기 바이오카커의 발현 수준을 정상 대조군 시료의 nc886의 발현 수준과 비교하는 단계는 상기 시료 내 상기 바이오마커의 수준이 대조군에 비해 높은 것을 확인하는 단계이다.
이후, 본 발명에 따른 정보제공방법은 상기 (a) 단계에서 측정한 발현 수준이 정상 대조군 시료의 해당 바이오마커의 발현 수준보다 높은 경우, 갑상선암 또는 간암으로 판단하는 단계를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 정상 대조군에서의 nc886의 발현 수준과 갑상선암 또는 간암 의심 환자에서의 nc886의 발현 수준을 비교함으로써, 갑상선암 또는 간암의 실제 환자 여부를 진단할 수 있고, 나아가서는 갑상선암 또는 간암의 진행단계 또는 예후를 예측할 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 정보제공방법에 의하면, 갑상선암 또는 간암을 정확하게 진달할 수 있고, 진행단계 또는 예후를 예측할 수 있는바, 예측된 예후에 따라 적절한 치료계획을 세울 수 있는 이점이 있다.
암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 시스템
본 발명은 (a) 암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계; (b) 후보물질이 처리된 암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계; 및 (c) 상기 (b) 단계의 바이오마커 발현 수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계; 를 포함하는 암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 시스템을 제공한다. 상기 바이오마커의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
먼저, 본 발명에 따른 스크리닝 시스템은 암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계[(a) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 상기 시료는 갑상선암 또는 간암 환자의 갑상선 또는 간 유래의 조직, 세포, 전혈, 혈청, 혈장, 타액, 객담, 뇌척수액 또는 뇨일 수 있으며, 갑상선 또는 간 종양 조직인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다. 또한, 상기 후보물질은 통상적인 선정방식에 따라 갑상선암 또는 간암 치료제로서 가능성을 지닌 것으로 추정되거나 또는 무작위적으로 선정된 개별적인 핵산, 펩타이드, 단백질, 항체, 기타 추출물 또는 천연물, 화합물 등이 될 수 있으며, 상기 바이오마커의 발현을 저해하는 화합물인 것이 바람직하나, 이에 한정되지 않는다.
다음으로, 본 발명에 따른 스크리닝 시스템은 후보물질이 처리된 암 환자의 시료에서 제1항에 따른 바이오마커의 발현 수준을 측정하는 단계[(b) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 갑상선암 또는 간암의 치료 또는 예방의 후보물질을 간 세포 또는 조직 또는 기타 생물학적 시료에 처리하여, 상기 바이오마커의 발현 수준 및 바이오마커 발현 관련 신호전달 단백질의 발현 및 인산화 수준을 측정함으로써, 갑상선암 또는 간암의 치료 또는 예방 물질을 선별할 수 있다.
마지막으로, 본 발명에 따른 스크리닝 시스템은 상기 (b) 단계의 바이오마커 발현 수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계[(c) 단계]를 포함한다. 구체적으로, 상기 후보물질을 처리하지 않은 경우와 비교하여, 상기 바이오마커의 발현 및 바이오마커 발현 관련 신호전달 단백질의 발현 및 인산화를 저해하는 물질을 갑상선암 또는 간암의 질환 치료 또는 예방 물질로서 결정하며, 상기 물질 간의 반응 확인은, 단백질-단백질, 단백질-화합물, 또는 상기 언급된 후보물질로서, 단백질-핵산, 펩타이드, 항체, 기타 추출물 또는 천연물 간의 반응 여부를 확인하는데 사용되는 통상적인 방법들을 사용할 수 있다.
암 예방 또는 치료용 약학적 조성물
본 발명은 제1항에 따른 바이오마커의 발현 또는 활성을 억제하는 물질; 및 약학적으로 허용 가능한 담체를 포함하는 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물을 제공한다. 상기 바이오마커의 구체적인 내용은 전술한 바와 같다.
구체적으로, 상기 물질은 상기 바이오마커에 대한 안티센스 올리고뉴클레오티드, 앱타머(aptamer), siRNA 또는 shRNA일 수 있으며, 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질의 활성을 억제하는 항체 또는 그의 항원 결합 단편일 수 있다. 또한, 상기 항체는 특별히 이에 제한되지 않으나, 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질에 특이적으로 결합할 수 있는 모든 항체가 될 수 있고, 바람직하게는 단일클론항체, 카이메릭 항체(chimeric antibody), 인간화 항체(humanized antibody), 인간 항체(human antibody) 등이 될 수 있을 뿐만 아니라, 상기 항체의 기능적인 단편이 될 수도 있다. 또한 상기 항체는 본 발명의 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질을 특이적으로 인식하는 결합의 특성을 갖는 한, 2개의 중쇄(heavy chain)와 2개의 경쇄(light chain)의 전체 길이를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라, 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체의 분자의 기능적인 단편이란, 적어도 항원 결합 기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며, Fab, F(ab'), F(ab')2 및 Fv 등이 있다.
본 발명에 따른 암 예방 또는 치료용 약학적 조성물은 ANLN, C5orf13(= NREP), COL5A1, VGLL2, C15orf52, 또는 KIAA1644의 발현을 억제함으로써, 종양 세포 증식 및 이동을 억제할 수 있다. 또한, EGFR, HIPK2, HSPBL2 또는 TAXIBP1으로 구성된 군 중 하나 이상의 항-세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)의 발현을 억제할 수 있다.
더 나아가, 상기 조성물은 CDKN2C 또는 DKK1의 발현을 증가시킴으로써, 갑상선 세포의 증식 및 이동을 억제할 수 있다.
본 발명에서 제공하는 조성물은 유효성분으로 사용되는 상기 바이오마커에 의해 코딩되는 단백질 발현 또는 활성을 억제하는 올리고 뉴클레오티드 또는 항체 이외에, 갑상선암 또는 간암의 치료 활성을 나타내는 치료제를 추가로 포함할 수 있다. 본 발명의 조성물은 투여 방식에 따라 약학적으로 허용 가능한 담체, 부형제 또는 희석제를 추가로 포함할 수 있다. 구체적으로, 식염수, 멸균수, 링거액, 완충 식염수, 덱스트로즈 용액, 말토덱스트린 용액, 글리세롤, 에탄올, 리포좀 및 상기 성분들 중 어느 하나의 이상의 성분을 혼합하여 사용할 수 있으며, 필요에 따라 항산화제, 완충액 등 통상적으로 사용되는 다른 첨가제를 추가적으로 포함할 수 있다. 또한 투여 목적에 따라 희석제, 분산제, 계면활성제, 결합제 및 윤활제를 첨가하여 수용액, 현탁액, 유탁액 등과 같은 주사용 제형, 환약, 캡슐, 과립 또는 정제로 제제화할 수 있고, 표적 기관에 특이적으로 작용할 수 있도록 표적 기관 또는 조직 특이적 항체 또는 기타 리간드를 상기 담체와 결합시켜 사용할 수 있다. 상기와 같은 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류는 당업계의 통상적인 제제를 모두 포함하며, 상기 예에 의해 사용가능한 담체, 부형제 또는 첨가제의 종류가 제한되는 것은 아니다.
상기와 같은 조성물 또는 혼합물은 목적 또는 필요에 따라 당업계에서 사용되는 통상적인 방법, 투여 경로, 투여량에 따라 적절하게 개체에 투여될 수 있다. 투여 경로의 예로는 경구, 비 경구, 피하, 복강 내, 폐 내, 및 비강 내로 투여될 수 있고, 국부적 면역억제 치료를 위해, 필요하다면 병변 내 투여를 포함하는 적합한 방법에 의해 투여된다. 비 경구 주입에는 근육 내, 정맥 내, 동맥 내, 복강 내 또는 피하투여가 포함된다. 또한 당업계에 공지된 방법에 따라 적절한 투여량 및 투여 횟수가 선택될 수 있으며, 실제로 투여되는 본 발명의 안티센스 올리고뉴클레오티드, siRNA 또는 shRNA를 포함하는 조성물의 양 및 투여 횟수는 예방 또는 치료하고자 하는 증상의 종류, 투여 경로, 성별, 건강 상태, 식이, 개체의 연령 및 체중, 및 질환의 중증도와 같은 다양한 인자에 의해 적절하게 결정될 수 있다.
이하, 본 발명의 이해를 돕기 위하여 바람직한 실시예를 제시한다. 그러나 하기의 실시예는 본 발명을 보다 쉽게 이해하기 위하여 제공되는 것일 뿐, 하기 실시예에 의해 본 발명의 내용이 한정되는 것은 아니다.
[실험 방법]
1. 세포주 및 조직 시료(Cell lines and tissue samples)
normal primary thyroid follicular epithelial cells에서 유래된 SV-40 immortalized cell line인 Nthy-ori 3-1(Lemoine NR, Mayall ES, Jones T, Sheer D, McDermid S, Kendall-Taylor P et al. Characterisation of human thyroid epithelial cells immortalized in vitro by simian virus 40 DNA transfection. Br J Cancer 1989; 60(6):897-903.); 유두 갑상선암종(papillary thyroid carcinoma)으로부터 유래된 BCPAP, KTC-1, SNU-790 ; 여포상 갑상선암종(follicular thyroid carcinoma)으로부터 유래된 FTC133; 역형성 갑상선암종(anaplastic thyroid carcinoma)로부터 유래된 C643, SW1736, 및 Cal-62 [SNU-790, (Koh CS, Ku JL, Park SY, Kim KH, Choi JS, Kim IJ et al. Establishment and characterization of cell lines from three human thyroid carcinomas: responses to all-transretinoic acid and mutations in the BRAF gene. Molecular and cellular endocrinology 2007;264(1-2):118-127.); 모든 다른 세포주(Pilli T, Prasad KV, Jayarama S, Pacini F, Prabhakar BS. Potential utility and limitations of thyroid cancer cell lines as models for studying thyroid cancer. Thyroid : official journal of the American Thyroid Association 2009; 19(12):1333-1342.) 및 그것의 참고문헌]) cell line이 본 연구를 위해 사용되었다.
Nthy-ori 3-1은 Sigma-Aldrich (St. Louis, MO, USA)에서 구매하였고 BCPAP 및 Cal-62은 DSMZ에서 구매하였으며(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen, Germany); C643 및 SW1736은 CLS로부터(Cell Line service, Germany); KTC-1, SNU-790 및 FTC133 lines는 본 발명자들의 연구실 stocks에서 얻었다(National Cancer Center, Center for Thyroid Cancer, Korea). Cell을 10% fetal bovine serum (FBS)(GE Healthcare Life Sciences; Logan, UT, USA) 및 1% antibiotic-antimyotic(Life Technologies; Carlsbad,CA, USA)가 풍부한성장배지에서 배양하였다. 모든 cell line은 7℃에서 5% CO2의 humidified incubator에서 배양하였다.
Normal 및 tumor tissues는 the National Cancer Center (NCC) Hospital에서 갑상선 수술을 받은 갑상선암 환자로부터 얻었다. 모든 fresh tissue는 액체 질소에서 수술 직후에 냉동하였고 Declaration of Helsinki의 원칙에 따른 NCC (NCC2014-0003)의 인간 대상 가이드라인에 대한 NCC, 기관검토위원회에 의해 승인된 프로토콜에 따라 -70℃에서 보관하였다.
병원 의료 기록 및 수술을 시행하고 병원에서 유두 갑상선 암으로 진단받은 37명의 환자의 병리보고서를 검토하였다. Pathologic staging는 International Union against Cancer and the American Joint Committee on Cancer, 7th edition에 따라 정의하였다. 환자의 임상적 및 병리학적 특징을 하기 표 1에 나타냈다.
총 n=37 nc886의 발현 수준 P-value
저(n=18) 중(n=8) 고(n=11)
진단시 연령(세) 47.5±11.2 50.2±10.8 42.0±10.2 47.1±12.0 0.228
종양의 크기(cm) 1.7±1.0 1.7±1.1 1.9±1.3 1.6±0.8 0.777
첫번째 종양의 수 1.5±0.8 1.3±0.6 2.1±1.0 1.5±0.7 0.028
과갑상선신장(extrathyroidal extension) 26(70.3%) 10(55.6%) 7(87.5%) 9(81.8%) 0.157
후기 T 단계(T3-4) 28(75.7%) 11(61.1%) 7(87.5%) 10(90.9%) 0.131
림프절 전이(n,%) 22(59.5%) 5(27.8%) 8(100%) 9(81.8%) 0.0005
N0 15(40.5%) 13(72.2%) 0(0%) 2(18.2%) 0.028
N1a 15(40.5%) 4(22.2%) 4(50.0%) 7(63.6%)
N1b 7(18.9%) 1(5.6%) 4(50.0%) 2(18.2%)
하시모토병(Hashimoto's thyroiditis) 16(43.2%) 6(33.3%) 4(50.5%) 6(54.5%) 0.486
평균±표준편차
P 경향성=0.050
2. 형질주입(Transfection), anti-oligos, RNA/단백질 분리 및 측정
본 실시예에서 사용된 일반적인 시약은
· 문헌[Lee K, Kunkeaw N, Jeon SH, Lee I, Johnson BH, Kang GY et al. Precursor miR-886, a novel noncoding RNA repressed in cancer, associates with PKR and modulates its activity. RNA 2011; 17(6):1076-1089.]
· 문헌[Kunkeaw N, Jeon SH, Lee K, Johnson BH, Tanasanvimon S, Javle M et al. Cell death/proliferation roles for nc886, a non-coding RNA, in the protein kinase R pathway in cholangiocarcinoma. Oncogene 2013; 32(32):3722-3731.]
· 문헌[Lee KS, Park JL, Lee K, Richardson LE, Johnson BH, Lee HS et al. nc886, a noncoding RNA of anti-proliferative role, is suppressed by CpG DNA methylation in human gastric cancer. Oncotarget 2014; 5(11):3944-3955.]에 충분히 기재되었다.
Anti-oligos(본 연구에서 각각 "anti-nc886" 및 "anti-control"으로 설계된 "anti886 75-56" 및 "anti-vt 21-2")는 「Lee K, Kunkeaw N, Jeon SH, Lee I, Johnson BH, Kang GY et al. Precursor miR-886, a novel noncoding RNA repressed in cancer, associates with PKR and modulates its activity. RNA 2011; 17(6):1076-1089.」에서 기술된 바와 같이 준비하였고 transfection 하였다. 환자 tissue sample 및 cell line의 total RNA는 Trizol reagent (Life Technologies; Carlsbad, CA, USA)로 isolation 하였다. nc886 및 control genes의 Northern hybridization, qRT-PCR measurement, PKR 및 다른 proteins의 Western blot을 「Lee K, Kunkeaw N, Jeon SH, Lee I, Johnson BH, Kang GY et al. Precursor miR-886, a novel noncoding RNA repressed in cancer, associates with PKR and modulates its activity. RNA 2011; 17(6):1076-1089.」에서 기술된 바와 같이 수행하였으며, qRT-PCR primers의 서열 정보는 요청시 이용 가능하다.
3. CRISPR/Cas KO 세포주의 생성(generation)
"hCas9" 및 "gRNA_Cloning Vector"는 Addgene (plasmid #41815 및 #41824 각각)에서 구매하였다. PKR의 sgRNA-expressing plasmid ("pCR sgPKR-1a")는 Duke University의 Dr. Stacy Horne에 의해 발견되었다. nc886의 sgRNA-expressing plasmids는 gDNA synthesis protocol [https://www.addgene.org/41824/and (33)]에 따라 구성되었다. 간략하게, sgRNA sequences 를 포함하는 두 개의 partially complementary oligo를 annealing하고(도 5A) Phusion™ High-Fidelity DNA Polymerase 「New England Biolabs; Ipswich, MA, USA」에 의해 fully double-stranded DNA fragment를 전환함으로써 insert를 만들었다. 상기 insert는 "pCR sg886-164" 및 "pCR sg886+15"을 얻기 위해, Gibson assembly kit (New England Biolabs)를 사용함으로써 AflII-linearized "gRNA_Cloning Vector"로 통합하였다.
"pCR sgPKR-1a" (for PKR KO) 또는 "pCR sg886-164" 및 "pCR sg886+15" (for nc886 KO)와 결합된, The Cas9-expressing plasmid ("hCas9")는 Lipofectamine 2000 (Life Technologies)를 이용함으로써 transfection 하였다. Untransfected cells은 G418 selection시, 음성대조군으로 병렬 처리하였다. 24시간 transfection한 후, cell을 G418의 1㎎/㎖을 포함하는 성장 배지에 옮겼다. G418-resistant colonies를 개별적으로 분리하고 추가 배양하였다.
4. 세포 증식(cell proliferation), 이동(migration) 및 침습(invasion) 분석
세포 증식은 3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide (MTT) dye의 변환 또는 이것의 유도체 MTT dye에 기반하여 측정하였다. MTT 및 MTS dyes를 Sigma-Aldrich 및 Promega (Madison, WI, USA)에서 각각 구매하였고 assay는 제조사의 지시에 따라 수행하였다. colony formation assay에서, 100 cells을 6-well plate 중 한 플레이트에 접종하였고 7일 동안 유지시켰다. 이후, 콜로니 수를 세기 위하여 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하고 고정하였다.
세포 이동 분석은 8-㎛ pore filter insert (BD Biosciences; San Jose, CA, USA)를 사용하여 수행하였다. Cell을 serum-free RPMI-1640 medium에 재부유(resuspention)시키고, upper chamber에 첨가하였으며, 24시간 동안 1% PBS와 RPMI-1640을 포함하는 lower chamber로 이동시켰다. 상기 insert의 바닥 표면에 있는 Migrated cells을 고정시키고 20분 동안 공기-건조(air dried) 시켰으며, 20분 동안 1% 크리스탈 바이올렛으로 염색하였다. 이후, top surface에 있는 Remaining cells을 cotton swab으로 wiping함으로써 제거하였다. migration rates을 정량하기 위해, insert는 10% acetic acid을 넣고 564nm에서 흡광도를 측정하였다. Cell invasion assays는 matrigel-coated insert (BD Biosciences)로 수행하였다. 세포를 Diff-Quik stain™ (Sysmex; Kobe, Japan)로 염색하고 세포수를 측정하였다.
본 실시예에서 MTT 및 콜로니 형성 분석을 통해 PKRKO/nc886KO cells이 nc886wt cells (PKRwt/nc886wt 및 PKRKO/nc886wt, 도 3B-D 및 도 S7A-C)에 비해 더 느리게 성장함을 확인할 수 있었다. 성장 이점을 부여하는, PKR KO 자체는 PKRwt/nc886wt의 콜로니 크기보다 PKRKO/nc886wt cells의 더 큰 콜로니 크기로 보여질 수 있다. 그러나, MTT 값 및 콜로니 수는 PKR의 부재로 현저하게 증가하지는 않았다(도 3B-D 및). 세포 이동 및 침습 분석도 비슷한 결과를 얻었다. PKRKO/nc886KO cells은 명백히 PKRKO/nc886wt cells에 비해 덜 migrating 하고 invasive했으며, PKRKO/nc886wt cells은 PKRwt/nc886wt cells에 비해 약간 더 migrating 하고 invasive했다(도 4A-D). 종합적으로 이러한 모든 데이터에서, nc886은 oncogenic한 역할을 할 것으로 예측하였다.
5. mRNA 마이크로어레이 및 경로 분석
mRNA 발현 profiling 및 molecular signatures의 analysis를
· 문헌[Lee HS, Lee K, Jang HJ, Lee GK, Park JL, Kim SY et al. Epigenetic silencing of the non-coding RNA nc886 provokes oncogenes during human esophageal tumorigenesis. Oncotarget 2014; 5(11):3472-3481.]
· 문헌[Lee KS, Park JL, Lee K, Richardson LE, Johnson BH, Lee HS et al. nc886, a noncoding RNA of anti-proliferative role, is suppressed by CpG DNA methylation in human gastric cancer. Oncotarget 2014; 5(11): 3944-3955.]에 기술된 바와 같이 수행하였다.
Hierarchical clustering 및 generation of a heat map을 Cluster 3.0 및 Java TreeView (version 1.1.6r4) softwares를 이용하여 수행하였다. 직접 물리적 상호작용 및 해당 경로는 "GeneMANIA" Cytoscape plug-in function (http://www.cytoscape.org/) (Warde-Farley D, Donaldson SL, Comes O, Zuberi K, Badrawi R, Chao P et al. The GeneMANIA prediction server: biological network integration for gene prioritization and predicting gene function. Nucleic Acids Res 2010; 38(Web Server issue):W214-220.)를 이용하여 추정하였다.
6. TCGA 데이터 분석
본 실시예에서는 nc886의 임상적 의의를 더 심문하기 위해 The Cancer Genomic Altas(TCGA)에서 데이터 검사를 하였다. ncc886은 mRNA도 miRNA에도 속하지 않기 때문에 상기 TCGA는 nc886 자체의 발현 데이터를 포함하지 않았고 따라서 대부분의 배열 또는 sequencing platforms에서 제외되었다. 대신, 본 발명자들은 환자 생존율에서 그 의미를 분석하기 위해 갑상선암 환자 505명의 TCGA RNA-seq data에서 201개 nc886-regulated genes의 발현을 조사하였다. 갑상선암 환자 505명의 RNA-seq data 및 임상 데이터를 TCGA database (https://tcga data.nci.nih.gov/tcga/tcgaHome2.jsp)에서 다운로드 하였다. 상기 TCGA RNA-seq data에서 이용 가능한 총 20,132 gene을 추가 분석을 위해 수집하였다. TCGA는 표준화 발현 수준으로 Expectation Minimization values (RSEM)에서 RNA-seq data를 제공한다. 유전자의 발현 배-변화 (fold-change, fc)는 Gene의 RSEM을 총 505개의환자 샘플로부터 측정된 RSEM의 평균으로 나누어 측정하였고 log2-transform하였다. 이전에 보고된 절차에 따라(34), 0~0.1의 RSEM 값은 상기 발현 fc를 계산하는데 있어 무한한 문제를 피하기 위해 0.1로 모두 대체하였다.
선택된 유전자의 발현 수준에 따라, 환자들을 이전에 기술된 바와 같이, "high-expression group" (if a log2(fc) value is > 0)" 및 "low-expression group" (< 0)으로 분류하였다. 201개의 nc886-regulated gene(도 5) 중 189개의 gene을 상기 TCGA RNA-seq data의 리스트에서 찾았고 survival analysis를 위해 사용하였다. R studio는 모든 통계적 테스트 및 분석을 위해 사용되었다(http://www.rstudio.com/). 상기 '생존' 패키지는 Kaplan-Meier curve를 그리고 Cox proportional hazard ratio를 계산하기 위해 사용하였다.
그 결과, 본 발명자들은 ANLN, C5orf13(= NREP), COL5A1, VGLL2, C15orf52, 및 KIAA1644의 더 낮아진 발현이, nc886 KO에 따라 낮아진 발현 수준과 일치한다는, 환자의 이상 생존 (도 5A)과 크게(p<0.05) 관련이 있다는 것을 관찰하였다.
7. 통계적 분석
환자 인구 통계를 식별하기 위해 기술적 분석을 수행하였다. 범주형 변수 분석을 위해, 주파수 및 백분율을 산출하였다. 갑상선암 환자 37명의 한 쌍의 정상/종양 시료에서 nc886의 발현을 측정하고 nc886 레벨에 따라 세 그룹(저, 중 및 고)으로 나누었다(도 1A). 각 그룹의 비율은 χ2 및 Fisher's exact test를 사용하여 비교하였다. 연속 변수, 평균, 및 표준편차 분석을 위해 측정하였다. 상기 연속 변수의 차이는 Mann-Whitney U test, Student's unpaired two-sided t-test 또는 one-way ANOVA를 이용하여 분석하였다. 통계적 분석은 STATA software (version 10, StataCorp., College Station, TX, USA)로 수행되었다. 모든 p-values는 two-sided했고, p-values는 0.05 미만이 통계적으로 유의한 것으로 간주하였다.
[ 실시예 ]
실시예 1. 환자 및 갑상선 세포주에서 nc886의 발현 분석
갑상선암 환자 37명의 정상 및 종양 시료에서 nc886의 발현을 측정하고 nc886의 발현 수준에 따라 세 그룹(저, 중, 고)으로 분류하였다(도 1A). 종양에서의 증가된 nc886의 발현은 원발성 종양(primary tumor)의 수(p=0.028), 종양의 공격성(aggressiveness) (도 1B에서 T 병기, P 경향성=0.050) 및 림프절로의 전이와 상관관계가 있었다(p=0.028). 그러나, 진단 당시의 나이, 원발성 종양의 크기 및 만성 염증으로 이어지는 자가 면역 질환인 하시모토 갑상선염(Hashimoto's thyroiditis)과 같은 임상적 변수와 nc886의 유의한 연관성은 없었다.
또한, 갑상선 세포주에서 nc886의 발현을 측정하였고, 불멸화 세포주인 Nthy-ori-3-1보다 암 세포주의 대부분에서 더 높게 발현됨을 확인하였다(도 1D). Nthy-ori 3-1 세포는 완전히 형질 전환되지는 않았지만 잘 증식되었고 비 증식(non-proliferatong) 갑상선 조직보다 nc886이 현저하게 높게 발현되었다. nc886의 매우 낮은 발현은 여러 기관의 정상 조직에서도 나타났으며, nc886 발현이 세포 증식률에 비례함을 나타냈다. 즉, 배양 배지에서 혈청 농도를 감소시킴으로써, 세포 증식이 느려지면, nc886의 발현이 감소하였다.
상기 nc886 발현 패턴은 in vitro에서의 세포 증식 및 환자에서의 종양 진행 및 공격성과 관련하여 갑상선암에서 발암적(oncogene) 역할을 하는 것으로 추정된다. 그러나 nc886은 식도 편평 상피암(esophageal squamous cell carcinoma), 위암(gastric cancer), 급성 골수성 백혈병(acute myeloid leukemia) 및 폐암(lung cancer)을 포함한 다른 유형의 암에서 볼 수 있듯이 갑상선 세포의 서브 세트에서 후성적으로 침묵(epigenetically silenced)하였다. 따라서, 종양 억제 인자 역할의 가능성을 배제할 수 없으므로 갑상선암에서 nc886의 역할을 명확히 하기 위해, 기능 상실 표현형을 평가하였다.
실시예 2. nc886 침묵(silencing)에 의한 급성 세포 죽음(acute cell death) 및 PKR 활성화의 결과
nc886은 PKR을 억제한다. Nthy-ori 3-1, SW1736 및 C643 갑상선 세포주에 nc886을 표적으로 하는 안티센스 올리고 뉴클레오티드(anti-oligo)를 형질 감염시켰을 때, nc886의 발현 수준은 도 2A의 Northern blot에 나타난 바와 같이, 감소하였다. nc886 KD은 활성 형태인 phospho-PKR의 증가에 의해 PKR 활성화를 유도하였다(도 2B). 활성 PKR은 그것의 최상 기질인 eIF2?를 인산화시켰고, 결과적으로 불멸화 Nthy-ori 3-1 세포주뿐만 아니라 갑상선암 세포주 SW1736에서도 세포 증식을 억제하였다(도 2A-B). 반면, 다른 암 세포주인 C643에서는 eIF2? 인산화 또는 세포 증식 효과가 관찰되지 않았다.
nc886 KD에서 세포 증식의 손상은 그것의 추정 발암적 역할(putative oncogenic role)과 일치하는 것으로 보였다. 그러나, 이러한 현상은 병인(etiology) 및/또는 갑상선암의 진행에 있어서, nc886의 역할보다는 PKR 의존적 "종양 감지 모델"로 이해하여야 한다. 즉, nc886 KD은 불멸화 세포 또는 형질 전환된 세포에서 nc886의 상승된 발현의 기능적 중요성을 반영할 수 있는 다른 표현형을 관찰하기 전에, PKR 세포 사멸 경로를 즉시 유발하였다. 이것을 밝히기 위해서는 장기적인 세포 표현형을 검사하고 nc886-null(nc886-) 세포와 isogenic nc886+ 세포를 비교해야 한다. 따라서, nc886 KO 세포주를 생성하였다.
실시예 3. PKR 및 PKR / nc886 이중 KO 세포주의 순차적 생성
antioligos는 자기 전파(self-propagation)를 하지 않아 장기적인 KD에는 부적합하기 때문에 "CRISPR(Clustered Regularly Interspaced Short Palindromic Repeats)"과 "CRISPR associated genes(Cas)"으로 구성된 박테리아 면역계로부터 새로운 유전자 편집 기술을 도입하였다. PKR은 nc886 KO 세포를 생성할 때도 nc886-가 PKR이 있는 상태에서 죽을 것으로 예상되기 때문에 문제가 되었으나(도 2C), 이러한 저항은 PKR 경로가 이미 잘못되었음을 나타냈다. 따라서, 상기 세포주의 어떤 데이터가 PKR과 함께 nc886의 역할을 갑상선 종양 형성에 적절하게 반영하는지 여부에 대한 의문이 들었다.
이러한 문제를 해결하기 위해, 본 발명자들은 PKR KO 세포주를 nc886 KO 세포주보다 앞서 만들었다. 이러한 방식으로. 야생형(PKRwt/nc886wt), PKR KO(PKRKO/nc886wt) 및 이중 KO(PKRKO/mc886KO)를 비교함으로써, 갑상선 종양 형성에 있어서, nc886 및/또는 PKR의 기여 여부를 확인할 수 있었다. 완전히 형질 전환된 세포주가 아닌 Nthy-ori 3-1을 선택하였고, 암세포주와 비교하여 더 자연적인 PKR 경로를 유지할 가능성이 높을 것으로 예상하였다. 같은 이유로, Nthy-on 3-1 세포는 nc886/PKR KO에 비해 종 양성 또는 이하의 어느 방향으로든 변형될 수 있다. 이것은 nc886과 PKR KO가 반대의 표현형을 나타낼 것으로 예상되었기 때문에 상당한 이점이 될 것으로 보인다.
PKR 유전자의 첫 번째 엑손(exon)에서 아미노산 #15-21을 표적으로 하는 small guide RNA(sgRNA)를 디자인하고, DNA 시퀀싱과 웨스턴 블랏에 의한 PKR 단백질 발현에 따라, 1~2nt가 프레임시프트(frameshift)에 의해 결실된 PKRKO 클론을 선택하였다.
이후, PKRKO 클론으로부터 nc886KO의 생성을 시도하였다. nc886은 non-coding RNA이기 때문에 1~2nt가 결실되었다 하더라도, 기능성 KO를 보장할 수 없었다. 따라서, nc886 전사체(transcript)와 인접한 두 개의 sgRNA를 설계하여 이들 사이의 전체 DNA 부분을 제거하였다. 2개의 sgRNA-발현 플라스미드를 parental Nthy-ori 3-1(PKRwt) 및 Nthy-ori 3-1(PKRKO) 세포로 형질 감염(transfection)시켰다. nc886KO 후보 클론을 초기 선택하는 동안, PKRwt Nthy-ori 3-1 세포에서는 콜로니가 거의 회수되지 않은 반면, 4개의 PKRKO 클론 모두에서 상당한 수의 콜로니가 회수되었음을 확인할 수 있었다. 이 결과는, nc886 결실(deletion)이 세포 증식에 해롭고, PKR 활성화가 그 원인 중 하나라는 생각을 확증하였다. 이후, 본 발명자들은 두 개의 sgRNA 사이의 nc886 DNA segment의 결실 및 시퀀싱(도 5C에 도시된 nc886KO 클론 #6의 대표 결과)을 나타내는 짧은 PCR 생성물을 확인함으로써, PKRK0/nc886KO 서브 클론을 얻었다. 또한, 3개의 PKRKO/nc886KO 클론(도 3A의 #6, #13 및 #17)에서 Northern hybridization에 의해 nc886이 발현되지 않음을 확인하고, 이들 세포주를 갑상선암에서의 nc886의 역할을 조사하는데 사용하였다.
실시예 4. nc886 KO 세포의 세포 배양(cell growth), 이동 및 침습의 지연
MTT 및 콜로니 형성 분석은 PKRKO/nc886KO 세포가 nc886wt 세포보다 천천히 성장하였다는 것을 입증하였다. PKR KO 자체는 PKRwt/nc886wt 세포보다 큰 콜로니 사이즈의 PKRKO/nc886wt 세포에서 볼 수 있듯이, 미세한 성장 이점을 나타냈다. 그러나, PKR KO의 경우 MTT 값과 콜로니 수가 유의적으로 증가하지는 않았다. 세포 이동 및 침습 분석 역시 비슷한 결과를 나타냈다. PKRKO/nc886KO 세포는 PKRKO/nc886wt 세포보다 세포 이동 및 침습이 덜 발생하는 것을 확인할 수 있었다. 즉, PKRKO/nc886wt 세포가 PKRwt/nc886wt 세포보다 약간 더 많은 것을 확인할 수 있었다(도 4A-D). 이러한 모든 데이터를 종합적으로 살펴보면, nc886이 oncogene으로서의 역할을 한다는 것을 확인할 수 있다.
nc886KO 세포가 PKRKO-background에 있었고, 따라서 nc886 KO에 의해 나타나는 모든 표현형은 PKR 독립적인 것으로 주목해야 한다. 예를 들어, nc886의 증식적(proliferative) 역할은 PKR의 전-세포사멸(pro-apoptotic) 기능 억제에 기인할 수 없다. PKR 억제가 nc886의 유일한 기능이라면, PKRKO/nc886KO 세포와 PKRKO/nc886wt 세포는 동일한 표현형을 가질 것이다. 상기 데이터로부터 얻은 또 다른 중요한 결론은 PKR이 기여할 때, 중요한 역할을 하는 것처럼 보이는 경우이다.
실시예 5. PKR KO 및 nc886 KO 세포의 유전자 발현 프로파일
다음으로 nc886/PKR의 역할에 대한 분자적 기초를 더 조사하였다. 3 가지 세포주(PKRwt/nc886wt, PKRKO/nc886wt 및 PKRKO/nc886KO)에서 마이크로어레이 실험을 수행하여 상기 세포주 사이의 표현 변화로부터 226개의 유전자 목록을 얻었다. 히트맵(heat map)에 나타난 바와 같이(도 5A, 좌측 패널), PKR 및 nc886 KO에 의해 201개 유전자 및 25개 유전자의 발현이 각각 변경되었다. 마이크로어레이 데이터는 qRT-PCR에 의해 변경된 일부 유전자를 측정함으로써 확인하였다(도 5A, 우측 패널).
본 발명자들은 추가적인 분석을 위하여, 201개의 유전자에 집중하였다. 유전자 온톨로지(GO, gene ontology) 분석 결과, 13개의 GO 세트가 nc886 KO에 비해 유의하게(p <0.05) 변경되었으며 대부분이 종양 형성에 직접 또는 간접적으로 관련되어 있음을 보여 주었으며, 그 결과를 하기 표 2에 나타냈다. 그 중에서도 세포 주기, 세포 성장 및 세포 사멸뿐만 아니라 세포 뼈대 구성(표 2에서 bold-highlighted GO 용어)은 세포 증식, 이동 및 침습에서 nc886 KO 표현형을 설명할 수 있다(그림 3-4). 예를 들어, EGFR, HIPK2, HSPBL2 및 TAX1BP1과 같은 항-세포사멸 단백질(anti-apoptotic protein)의 발현은 nc886 KO에 따라 감소되었고, 따라서, PKRKO/nc886KO 세포의 성장을 감소시키는 것으로 설명할 수 있을 것이다.
Figure 112017074500918-pat00001
또한, 본 발명자들은 201개 유전자 사이의 직접적인 물리적 상호 작용과 경로의 상호 연결을 확인하기 위하여, GeneMANIA plug-in tool in Cytoscape [http://www.cytoscape.org/]을 사용하여 유전자 네트워크 분석을 수행하였다. 상기 유전자 네트워크에서, p53 및 MYC(the most renowned oncogene)는 중요한 허브(hub)이다. p53과 MYC는 각각 가장 유명한 종양 억제 인자(tumor suppressor)와 종양 유전자이며, 흥미롭게도 Pol III 전사와 따라서 nc886 발현을 조절하는 것으로 알려져 있다. nc886과 p53, MYC 및 201 개 유전자의 관계를 밝히기 위해서는 더 많은 연구가 필요할 것이다.
다음으로, 본 발명자들은 TCGA(The Cancer Genome Atlas)의 데이터를 검토하여 nc886의 임상적 중요성에 대해 조사하였다. nc886은 mRNA 또는 miRNA에 속하지 않으므로 대부분의 어레이 또는 시퀀싱 플랫폼에서 제외되었기 때문에 TCGA는 nc886 자체의 발현 데이터를 포함하지 않는다. 대신, 환자의 생존에 미치는 영향을 분석하기 위해 갑상선암 환자 505명의 TCGA RNA-seq 데이터에서 201개의 nc886 조절 유전자 발현을 조사하였다. 그 결과, ANLN, C5orf13(= NREP), COL5A1, VGLL2, C15orf52 및 KIAA1644의 낮은 발현이 nc886 KO에 대한 발현 수준의 저하와 일치하여 환자의 장시간 생존과 유의미한(p <0.05) 관계가 있음을 확인할 수 있었다.또한, 배열 데이터를 분자 표지 데이터베이스(MSigDB; http://software.broadinstitute.org/gsea/index.jsp)와 비교하여 어떤 전사 인자 (TF) 표적 유전자가 강화(enriched)되었는지 또는 감소(depletion)되었는지 분석하였다. 그 결과, nc886 KO에서 TF 표적의 일정한 평가값(evaluation) 또는 감소(depletion)를 발견할 수 없었으나, 예외적으로 nc886 KO에 풍부한 혈청 반응 인자(serum response factor) 시그니처(signature)를 발견할 수 있었다. 단, 상기 SRF의 증가된 활성이 nc886 KO의 직접적인 결과인지 여부를 명확히 할 필요성이 있다.
PKR KO가 한계 표현형과 유전자 발현의 중간 정도 변화를 보였음에도 불구하고, 많은 TF 표적 유전자가 현저하게 변화한다는 것을 발견하였다(Z-score cutoff = 3). PKRKO 세포에서 모두 고갈된 9개의 최상위 TF(Z-score cutoff = 4)는 NF-κB TF였다. 또한, Biocarta를 사용하여 NF-κB와 관련된 7개의 강화(enriched) 경로와 13 개의 감소(depletion) 경로 (Z-score cutoff = 4)를 확인하였다. 이러한 결과는 PKR이 NF-κB의 upstream에 있다는 것을 확증한다.
실시예 6. 환자 및 간암 세포주에서 nc886의 발현 분석
간암에서 nc886의 발현양상을 보기 위해 58명의 간암환자로부터 정상조직 및 암조직을 얻고 (미국 MD Anderson Cancer Center의 이주석 박사 그룹으로부터 얻음), RNA를 분리한 후 nc886의 발현을 노던 블랏으로 측정하였다. nc886 시그날을 적절히 보정하기 위해서, 동일한 블랏에 5S rRNA에 대한 탐침을 사용하여 노던 실험을 한번 더 수행하였다. 노던 결과를 densitometer로 정량한 후, 각각의 샘플에 대해서 nc886 / 5S rRNA의 값을 구하여, 이를 nc886 발현량으로 사용하였다. 간암샘플과 그에 대응하는 정상조직 샘플의 nc886 발현량을 비교하여, 58환자를 두개의 소그룹으로 분류하였다. 그 결과 39 환자에서는 nc886이 증가하였고 19 환자에서는 nc886이 감소하였으며, 이러한 경향성은 갑상선암에서의 경향성과 유사함을 알 수 있었다.
위의 두 소그룹에서 환자의 생존을 Kaplan-Meier plot으로 본 결과, nc886이 증가한 환자들에서 RFS(recurrence-free survival)가 통계적으로 유의한 정도로 감소된 것을 확인할 수 있었다(p = 0.01). 비록 환자의 샘플수가 비교적 많지 않은 관계로 통계적 유의성을 볼 수는 없었으나(p = 0.19), 전체적인 생존율도 낮아진 경향을 보이는 것을 확인할 수 있었다.
58쌍의 샘플에서 mRNA array 결과가 존재한다(미국 MD Anderson Cancer Center의 이주석 박사 그룹으로부터 얻음). nc886 발현이 높고 낮은 두 소그룹에 따라 mRNA 발현양상을 clustering한 결과, nc886이 높은 그룹에서 암촉진 전사인자의 활성이 증가되어 있었으며, 동시에 암억제 microRNA의 활성이 낮아져 있었다.
이상의 결과를 정리하면, nc886 발현양이 암조직에서 전반적으로 증가되어 있었으며, nc886이 증가한 환자는 유전자 발현이 암을 유도하는 방향으로 변화하였고, 환자의 생존율이 낮은 것을 확인할 수 있다. 즉, 상기 결과는 nc886이 간암에서 암 촉진 인자로 작용함을 강하게 시사한다.
전술한 본 발명의 설명은 예시를 위한 것이며, 본 발명이 속하는 기술분야의 통상의 지식을 가진 자는 본 발명의 기술적 사상이나 필수적인 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 쉽게 변형이 가능하다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 그러므로 이상에서 기술한 실시예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적이 아닌 것으로 이해해야만 한다.

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  7. (a) 갑상선암환자에서 분리된 생물학적 시료로부터 nc886 유전자의 발현 수준을 얻는 단계; 및
    (b) 상기 (a) 단계의 nc886 유전자의 발현 수준을 정상 대조군의 nc886 유전자의 발현 수준과 각각 비교하는 단계; 및
    (c) 상기 (b) 단계의 비교 결과 상기 (a) 단계의 nc886 유전자의 발현 수준이 정상대조군의 nc886 유전자의 발현 수준보다 높은 경우, VGLL2 유전자를 포함하는 nc886 조절 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계;
    (d) 상기 단계 (c)의 VGLL2 유전자의 발현 수준이 정상대조군의 VGLL2 유전자의 발현 수준보다 높은 경우, 갑상선암 환자의 생존 가능성이 낮아지는 것으로 판단하는 단계;
    를 포함하는 갑상선암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  8. 제7항에 있어서,
    상기 nc886 유전자 또는 nc886 조절 유전자의 발현 수준을 측정하는 방법은 역전사효소 중합반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사효소 중합효소반응(competitive RT-PCR), 실시간 역전사 효소 중합효소반응(real time quantitative RT-PCR), 정량적 중합효소반응(quantitative RT-PCR), RNase 보호 분석법(RNase protection method), 노던 블랏팅(Nothern blotting) 또는 DNA 칩 방법(DNA chip technology), 노던 블랏팅(Nothern blotting), 면역조직화학염색법(immunohistochemical staining), 면역침전분석법(immunoprecipitation assay), 보체 고정 분석법(complenent Fixation Assay) 또는 면역형광법(immunofluorescence)인 것인
    갑상선암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  9. (a) 갑상선암 환자에서 분리한 시료에 후보물질을 처리하는 단계;
    (b) 후보물질이 처리된 갑상선암 환자의 시료에서 nc886 유전자의 발현 수준을 측정하는 단계; 및
    (c) 상기 단계 (b)의 발현수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, VGLL2 유전자를 포함하는 nc886 조절 유전자의 발현 수준을 확인하는 단계; 및
    (d) 상기 (c) 단계의 VGLL2 유전자의 발현 수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 갑상선암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 단계;
    를 포함하는 갑상선암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법으로서,
    상기 갑상선암은 BCPAP, KTC-1, FTC133, C643 및 SW1736 세포주로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 세포주로 야기되는 갑상선암인 것을 특징으로 하는 갑상선암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법.
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  16. 제7항에 있어서, 상기 갑상선암은 BCPAP, KTC-1, FTC133, C643 및 SW1736 세포주로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 세포주로 야기되는 갑상선암인 것을 특징으로 하는 갑상선암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  17. 제7항에 있어서, 상기 단계 (c)의 nc886 조절 유전자는 ANLN, C5orf13(=NREP), COL5A1, C15orf52 및 KIAA1644 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 추가적으로 포함하며,
    상기 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 정상대조군의 상응하는 유전자의 발현 수준보다 높은 경우, 갑상선암 환자의 생존 가능성이 낮아지는 것으로 판단하는 것을 특징으로 하는
    갑상선암 예후 예측을 위한 정보제공방법.
  18. 제9항에 있어서, 상기 단계 (c)의 nc886 조절 유전자는 ANLN, C5orf13(=NREP), COL5A1, C15orf52 및 KIAA1644 유전자로 이루어진 군에서 선택되는 어느 하나 이상의 유전자를 추가적으로 포함하며,
    상기 군에서 선택된 어느 하나 이상의 유전자의 발현 수준이 후보물질의 처리 전보다 낮은 경우, 후보물질을 갑상선암의 예방 또는 치료용 물질로 판단하는 것을 특징으로 하는
    갑상선암 예방 또는 치료용 물질 스크리닝 방법.
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