KR101926841B1 - Srf-yap 및 yap 시그니쳐를 이용한 줄기세포특성을 보이는 기저양 유방암 및 삼중 음성 유방암 진단 및 치료방법 - Google Patents

Srf-yap 및 yap 시그니쳐를 이용한 줄기세포특성을 보이는 기저양 유방암 및 삼중 음성 유방암 진단 및 치료방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암의 진단 및 치료를 위한 신규 바이오마커 및 이들의 이용한 진단 및 치료용 조성물, 및 방법에 관한 것으로, 더욱 구체적으로는 유선줄기세포를 유도할 수 있는 SRF-YAP와 관련된 MASC-YAP 시그니쳐 유전자들을 발굴하여 이들 유전자의 mRNA 또는 그 단백질의 발현 정도를 측정하으로써, 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 및 삼중 음성 유방암 중에서도 SRF-YAP 과발현 유전 종양 줄기세포 특징을 보이는 유방암의 효과적인 진단을 가능하게 하고, 더 나아가, 상기 MASC-YAP 시그니쳐 전사인자(유전자) 활성화 억제 또는 이들의 단백질에 결합하는 물질의 투여에 의한 SRF-YAP 과발현 유전종양줄기세포 특징을 보이는 삼중 음성 유방암 및 기저양 유방암에 대한 치료 효능을 획기적으로 개선시킬 수 있는 약학적 조성물 및 스크리닝 방법을 제공한다.

Description

SRF-YAP 및 YAP 시그니쳐를 이용한 줄기세포특성을 보이는 기저양 유방암 및 삼중 음성 유방암 진단 및 치료방법{New molecular diagnosis/therapy of triple basal-like breast cancer and negative breast cancers using SRF-YAP and YAP signature}
본 발명은 SRF-YAP의 전사인자 활성화 억제제를 포함하는 삼중 음성 유방암을 포함한 줄기세포 특성을 보이는 BLBC 예방 또는 치료용 조성물, 진단용 조성물 및 줄기세포 특성을 보이는 BLBC & 삼중 음성 유방암 치료제 스크리닝 방법에 관한 것이다.
유방암은 임상적으로나 병리학적으로 매우 복잡하고 다양한 양상을 나타내는 암으로 알려져 있다. 이러한 유방암의 예후를 예측하고 치료 방법을 결정하기 위해서 원발 종양의 병기, 조직형과 조직학적 등급에 따라 여러 아형으로 분류되어 왔다. 최근 유방암 치료에 효과를 나타내는 다양한 표적 치료제가 개발되면서, 유방암도 점차 치료 표적의 발현 유무에 따라 분류하게 되었다.
현재까지 잘 알려진 유방암 치료의 표적은 호르몬 수용체와 HER2의 과발현이며, 이들 표적에 대한 치료를 통해 유방암의 예후를 향상시키는 효과를 가져왔다. 최근에는 유전자 발현 양상에 따라 유전자 차원에서 유방암을 평가하고 있다. DNA 미세 배열(microarray) 방법에 의해 유방암을 내강형 A군(에스트로겐 수용체 양성, HER2음성), 내강형 B군(에스트로겐 수용체 양성, HER2 양성), HER2 과발현 군(에스트로겐 수용체 음성, HER2 양성), 에스트로겐 수용체와 HER2 음성인 기저양(basal-like) 군과 정상형 군으로 분류하였다. 특히 기저양(basal-like) 유방암은 주로 호르몬 수용체가 없고 HER2/neu 발현이 되지 않는 군으로 나머지 군들에 비해 조기 재발이 많고, 예후가 불량하다고 알려져 있다. 그런데 이러한 유전자 발현 양상에 따른 분류 방법은 임상적으로 적용하기 어려워서, 현재는 면역조직화학염색을 통한 호르몬 수용체와 HER2의 발현 유무로 유방암을 구분하는 방법을 이용하고 있다.
삼중음성유방암은 면역조직화학염색에서 에스트로겐 수용체(ER), 프로게스테론 수용체(FR)와 HER2의 발현이 모두 음성인 유방암으로 전체 유방암의 10~15%를 차지한다. 삼중음성유방암은 기저양(basal-like) 유방암과 정확하게 일치하지는 않으나 비슷한 임상 경과를 나타내어 혼용되어 사용되기도 한다. 삼중음성유방암은 비삼중음성유방암 환자에 비해 상대적으로 불량한 예후를 보인다고 알려져 있으며, 이는 비특이적 항암치료 이외에 호르몬 치료나 표적 치료 등의 특별한 치료 방법이 없는 것에서 기인하여, 이에 대한 진단 및 치료제의 발굴이 필요한 실정이다.
한편, 새롭게 밝혀지고 있는 Hippo 회로(pathway)의 하위 작용기(effector)인 전사 공동활성제(co-activator) YAP(Yes-associated protein)은 최근에 조직 재생, 암 및 성체 줄기 세포의 핵심적인 조절자로서 보고되고 있으며, 형태의 암에서 11q22 앰프리콘(amplicon)에 존재하여 그 발현이 증가되는 것으로 추정되는 종양유전자이다. YAP의 종양유전자로의 기능 연구는, YAP 녹아웃 마우스와 Hippo 회로 녹아웃 마우스를 이용하여 생체 내(in vivo)의 조직 손상 과정에서 YAP이 성체 줄기 세포 활성화에 필요함을 총괄적으로 나타내고, 잘못된 YAP 활성화는 상피세포 줄기/전구 세포의 분열을 촉진하여 종양발생을 야기한다는 것을 보여주었다. 이러한 발견들은, YAP에 의한 줄기성의 유도의 하부 메커니즘을 이해하는 것이 좋지 않게 분화된 암의 발달에 필요한 메커니즘을 밝히는데 필요할지도 모른다는 사실을 제시한다. 또한, 그것은 나쁜 예후와 연관되어 있는 YAP을 과발현하는 암에 대한 효과적인 치료가 될 수 있음을 제시한다. 그러나, YAP의 하부 메커니즘과 이에 직접적으로 조절되는 YAP 시그니쳐(YAP signature, 전사타겟)들 등은 명확하게 밝혀져 있지 않다.
이에, 본 발명자들은 유선줄기세포를 유도할 수 있는 SRF-YAP와 관련 유전자들을 발굴하여 이들 유전자가 기저양(basal-like) 유방암 및 삼중 음성 유방암에 특이적으로 과발현됨 및 이에 관련 YAP 시그니쳐 유전자들을 확인하였는바, 이를 기초로 하여, SRF-YAP와 관련 유전자군 발현을 통한 삼중 음성 유방암의 진단방법을 제공할 수 있으며, SRF-YAP의 전사인자 활성화 억제를 통한 유전종양줄기세포 특징을 보이는 삼중 음성 유방암 치료제 스크리닝 방법을 제공할 수 있음 또한 확인하여 본 발명을 완성하였다.
이에, 본 발명의 목적은 유방암 환자로부터 얻은 시료로부터 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커를 이용하여 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암 진단에 정보를 제공하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 하나의 목적은 SRF-YAP의 전사인자 활성화 억제제를 포함하는 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암 예방 또는 치료용 조성물을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 SRF-YAP의 전사인자의 과발현 여부와 SRF-YAP의 주요 전사 타겟 유전자(Signature)들을 측정하는 단계를 포함하는 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암의 진단방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 추가 목적은 후보 화합물을 접촉시키는 단계 및 SRF-YAP의 전사인자 활성화 억제여부를 측정하는 단계를 포함하는 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암의 치료제를 스크리닝하는 방법을 제공하는 것이다.
상기와 같은 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 유방암 환자로부터 얻은 시료로부터 IL6(NCBI Accession Nos.: NG_011640 (human), NM_031168 (mouse)), THBS1(NCBI Accession Nos.: NM_003246 (human), NM_011580 (mouse)), FST(NCBI Accession Nos.: NM_006350 (human), NM_001301373 및 XM_006517527 (mouse)), TES(NCBI Accession Nos.: NM_015641 (human), NM_207176 (mouse)), PCDH7(NCBI Accession Nos.: NM_032456 (human), NM_001122758 (mouse)), DLL1(NCBI Accession Nos.: NM_005618 (human), NM_007865 (mouse)) 및 CTGF(NCBI Accession Nos.: NM_001901 (human), NM_010217 (mouse))로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암 진단용 조성물에 관한 것이다.
본 발명에서 용어, "진단" 또는 "예측"이란, 병리 상태의 존재 또는 특징을 확인하는 것을 의미하며, 본 발명의 목적상 진단은 상기 유방암 환자의 암이 SRF-YAP이 동시에 과발현되어 종양줄기세포의 특성을 갖는 유방암, 구체적으로 기저양 유방암 또는 삼중 음성 유방암에 해당하는지 여부를 판별하는 것을 말한다. 본 발명은 유방암 환자들에 대하여 상기 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포 특성을 갖는 유방암 환자들을 특별하고 적절한 관리를 통하여 유방암의 전이 또는 재발을 위험성을 예측하고 방지하는 데 사용될 수 있다. 또한, 본 발명은 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포 특성을 갖는 유방암을 조기에 진단하여 가장 적절한 치료 방식을 선택함으로써 치료 결정을 하기 위해 임상적으로 사용될 수 있다.
본 발명에서 용어, "진단용 마커, 진단하기 위한 마커 또는 진단 마커(diagnosis marker)" 또는 "표지자"란 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포 특성을 갖는 유방암 세포와 내강형 유방암 세포 또는 정상 세포를 구분하여 진단할 수 있는 물질로, 정상 세포 및 내강형 유방암 세포의 시료에 비하여 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포 특성을 갖는 유방암으로 예측되는 환자의 시료에서 유의적인 농도의 증가 또는 감소를 보이는 폴리펩타이드 또는 핵산(예: mRNA 등), 단백질 등과 같은 생체 유기 분자들을 의미한다. 본 발명의 목적상, 이러한 마커 또는 표지자는 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포 특성을 갖는 유방암 환자의 시료에서 특이적으로 증가된 수준을 나타내는 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐를 의미한다.
상기 "mRNA 발현 수준 측정"이란, SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포 특성을 갖는 유방암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 상기 MASC- YAP 시그니쳐 마커 유전자들의 mRNA 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로서, mRNA의 양을 측정함으로써 알 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), Q-PCR, Digital PCR, Next Generation Sequencing, RNASeq, lab-on-a-chip 또는 마이크로어레이 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 유전자들의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제는 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포특성을 갖는 유방암 세포에서 발현이 증가하는 상기 MASC YAP 시그니쳐 유전자들의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 유전자에 특이적으로 결합하는 프라이머 또는 프로브를 포함하는 것일 수 있다. 위의 유전자들의 서열을 바탕으로 이들 유전자의 특정 영역을 특이적으로 증폭하는 프라이머 또는 프로브를 디자인할 수 있다.
본 발명에서의 "프라이머" 란, 짧은 자유 3말단 수산화기(free 3' hydroxyl group)를 가지는 핵산 서열로 상보적인 템플레이트(template)와 염기쌍(base pair)을 형성할 수 있고 템플레이트 가닥 복사를 위한 시작 지점으로 기능을 하는 짧은 핵산 서열을 의미한다. 프라이머는 적절한 완충용액 및 온도에서 중합반응(즉, DNA 폴리머레이즈 또는 역전사효소)을 위한 시약 및 상이한 4가지 뉴클레오사이드 트리포스페이트의 존재하에서 DNA 합성을 개시할 수 있다. 본 발명에서는 SRF, YAP 유전자, MASC YAP signature 유전자들의 폴리뉴클레오타이드의 센스 및 안티센스 프라이머를 이용하여 PCR 증폭을 실시하여 원하는 생성물의 생성 여부를 통해 암을 진단할 수 있다. PCR 조건, 센스 및 안티센스 프라이머의 길이는 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
또한 "프로브"란, mRNA와 특이적 결합을 이룰 수 있는 짧게는 수 염기 내지 길게는 수백 염기에 해당하는 RNA 또는 DNA 등의 핵산 단편을 의미하며, 라벨링되어 있어서 특정 mRNA의 존재 유무를 확인할 수 있다. 프로브는 올리고뉴클레오타이드(oligonucleotide) 프로브, 단쇄 DNA(single stranded DNA) 프로브, 이중쇄 DNA(double stranded DNA) 프로브, RNA 프로브 등의 형태로 제작될 수 있다. 본 발명에서는 SRF, YAP 유전자, MASC YAP signature 유전자들의 상보적인 프로브를 이용하여 혼성화를 실시하여, 혼성화 여부를 통해 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포특성을 갖는 유방암을 진단할 수 있다. 적당한 프로브의 선택 및 혼성화 조건은 당업계에 공지된 것을 기초로 변형할 수 있다.
본 발명의 프라이머 또는 프로브는 포스포르아미다이트 고체 지지체 방법, 또는 기타 널리 공지된 방법을 사용하여 화학적으로 합성할 수 있다. 이러한 핵산 서열은 또한 당해 분야에 공지된 많은 수단을 이용하여 변형시킬 수 있다. 이러한 변형의 비-제한적인 예로는 메틸화, "캡화", 천연 뉴클레오타이드 하나 이상의 동족체로의 치환, 및 뉴클레오타이드 간의 변형, 예를 들면, 하전되지 않은 연결체(예: 메틸 포스포네이트, 포스포트리에스테르, 포스포로아미데이트, 카바메이트 등) 또는 하전된 연결체(예: 포스포로티오에이트, 포스포로디티오에이트등)로의 변형이 있다.
또한 본 발명에서의"단백질 발현수준 측정"이란, SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포특성을 갖는 유방암을 진단하기 위하여 생물학적 시료에서 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC YAP 시그니쳐 유전자로부터 발현된 단백질의 존재 여부와 발현 정도를 확인하는 과정으로, 바람직하게는 상기 유전자의 단백질에 대하여 특이적으로 결합하는 항체를 이용하여 단백질의 양을 확인할 수 있다. 이를 위한 분석 방법으로는 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip), Lab-on-a-chip 또는 나노드롭 등이 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
상기 단백질의 발현수준을 측정하는 제제는 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포특성을 갖는 유방암 세포에서 발현이 증가하는 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC YAP 시그니쳐 마커 유전자로부터 발현되는 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커의 검출에 사용될 수 있는 분자를 의미하며, 이에 제한되지는 않으나 바람직하게는 상기 단백질에 특이적인 항체를 포함하는 것일 수 있다. 상기 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC YAP 시그니쳐 유전자로부터 발현되는 단백질의 아미노산 서열을 바탕으로 당업자는 상기 단백질에 특이적인 항체를 디자인할 수 있다.
본 발명의 일 구체적인 예에서, "항체"란, 상기에서 설명한 바와 같으며, 단클론항체, 다클론항체 및 재조합 항체를 모두 포함한다.
단클론항체는 당해 분야에 널리 공지된 하이브리도마 방법(Kohler 및 Milstein(1976)European journal of Immunology 6:511-519), 또는 파지 항체 라이브러리(Clarkson et al, Nature, 352:624-628, 1991; Marks et al, J. Mol. Biol.,222:58, 1-597, 1991)기술을 이용하여 제조될 수 있다.
다클론항체는 상기한 단백질 항원을 동물에 주사하고 동물로부터 채혈하여 항체를 포함하는 혈청을 수득하는 당해 분야에 널리 공지된 방법에 의해 생산할 수 있다. 이러한 다클론항체는 염소, 토끼, 양, 원숭이, 말, 돼지, 소, 개 등의 임의의 동물 종 숙주로부터 제조 가능하다. 또한, 본 발명의 항체에는 키메라 항체, 인간화 항체, 인간항체 등의 특수항체도 포함된다.
나아가, 본 발명에 사용되는 항체는 2개의 전체 길이의 경쇄 및 2개의 전체 길이의 중쇄를 가지는 완전한 형태뿐만 아니라 항체 분자의 기능적인 단편을 포함한다. 항체 분자의 기능적인 단편이란 적어도 항원 결합기능을 보유하고 있는 단편을 뜻하며 Fab, F(ab'), F(ab') 2 및 Fv 등을 예시할 수 있다.
이러한 항체를 이용하여 시료 내 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커들의 농도를 측정하기 위한 방법으로는, 시료에 상기 항체를 처리하여 항원-항체 복합체의 생성 정도를 확인할 수 있는 방법이라면 제한 없이 사용할 수 있다. 상기 "항원-항체 복합체"란 상기 마커 및 이에 특이적인 항체의 결합물을 의미하고, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다.
예를 들어, 웨스턴 블랏(Western blot), ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 면역침전분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorecence Activated Cell Sorter, FACS), 단백질 칩(protein chip), 방사면역측정(radioimmunoassay, RIA), 효소면역분석(enzyme immunoassays, EIA), 형광 면역분석(fluorescence immunoassays, FIA), 형광 편광 면역분석(fluorescence polarization immunoassays, FPIA), 비탁 억제 면역분석(nephelometric inhibition immunoassays, NIA), 미량입자 효소 면역분석(microparticle enzyme immunoassays, MEIA), 화학발광 자기 면역분석(chemiluminescent magnetic immunoassay, CMIA), Lab-on-a-chip 또는 나노드롭을 예시할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다.
본 발명의 또 다른 구체적인 예에서, 상기 어느 하나 이상의 조성물을 포함하는, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암 진단용 키트를 제공한다. 상기 키트는 마이크로어레이, 유전자 증폭 키트 또는 면역분석(immunoassay)용 키트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 키트를 제공한다.
본 발명에서의"키트"란 특정한 목적을 위해 필요한 조성물 및 부속품들을 모아놓은 세트를 의미한다. 본 발명의 목적상, 본 발명의 키트는 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단 마커인 상기 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC YAP 시그니쳐의 발현수준을 mRNA 또는 이의 단백질의 발현수준을 확인함으로써 마커를 검출할 수 있다. 본 발명의 키트에는 상기 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단 마커의 발현수준을 측정하기 위한 프라이머, 프로브 또는 선택적으로 마커를 인지하는 항체뿐만 아니라 분석방법에 적합한 한 종류 또는 그 이상의 다른 구성성분 조성물, 용액 또는 장치가 포함될 수 있다.
본 발명의 키트는 유방암 환자의 시료 내 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커들의 농도를 측정할 수 있는 제제뿐만 아니라, 농도 분석에 적합한 한 종류 이상의 조성물, 용액 또는 장치를 포함할 수 있다. 예를 들어, 상기 키트는 항체의 면역학적 검출을 위하여 지지체 또는 적합한 담체, 기질, 검출 라벨(또는 검출 라벨로 표지된 2차 항체), 완충용액, 반응 정지제, 용해제, 세척액 및/또는 안정화제 등을 포함할 수 있다.
적합한 담체 또는 지지체의 예로는 고분자, 유리, 금속, 실리콘 또는 생체막(membrane) 등을 예시할 수 있다. 구체적으로는, 폴리부틸렌숙시네이트, 폴리스틸렌, 폴리에틸렌, 폴리프로필렌, 폴리에스테르, 폴리아크릴로니트릴, 불소 수지, 아가로스, 셀룰로즈, 니트로셀룰로즈, 덱스트란, 세파덱스, 세파로즈, 리포솜, 카복시메틸 셀룰로즈, 폴리아크릴아미드, 폴리스테린, 반려암, 여과지, 이온교환수지, 플라스틱 필름, 플라스틱 튜브, 폴리아민-메틸 비닐-에테르-말레산 공중합체, 아미노산 공중합체, 에틸렌-말레산 공중합체, 나일론, 금속, 유리, 글래스 비드, 또는 자성 입자 등이 포함된다. 그 외의 다른 고체 기질로는 배양 플레이트, ELISA 플레이트, 튜브 및 폴리머성 막이 있다. 상기 지지체는 임의의 가능한 형태, 예를 들어 구형(비드), 원통형(시험관 또는 웰 내면), 평면형(시트, 시험 스트립)을 가질 수 있다.
구체적인 일례로, 상기 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포 특성을 갖는 유방암 진단용 키트는 ELISA 키트, 샌드위치 ELISA등 다양한 ELISA 방법을 구현하기 위하여, ELISA를 수행하기 위해 필요한 필수 요소를 포함하는 것을 특징으로 하는 키트일 수 있다. ELISA 키트는 상기 단백질들에 대한 특이적인 항체를 포함한다. 항체는 각 마커에 대한 특이성 및 친화성이 높고 다른 단백질에 교차 반응성이 거의 없는 항체로, 단클론항체, 다클론항체 또는 재조합 항체일 수 있다. 또한 ELISA 키트는 대조군 단백질에 특이적인 항체를 포함할 수 있다. 그 외 ELISA 키트는 결합된 항체를 검출할 수 있는 시약, 예를 들면, 표지된 2차 항체, 발색단(chromopores), 효소 및 그의 기질 또는 항체와 결합할 수 있는 다른 물질 등을 포함할 수 있다.
이 외에도, 상기 키트는 웨스턴 블랏, 면역침전분석법, 보체 고정 분석법, 유세포분석, 또는 단백질 칩 등을 구현하기 위한 키트일 수 있으며, 각 분석 방법에 적합한 부가적인 구성을 추가로 포함할 수 있다. 이 분석 방법들을 통하여, 항원-항체 복합체 형성량을 정량화함으로써 유방암 환자의 암이 SRF-YAP 과발현된 종양줄기세포 특성을 갖는 유방암인지 여부를 진단할 수 있으며, 이에 따라 이러한 유방암들의 전이 또는 재발과 같은 좋지 않은 예후 등을 예방하는데 사용할 수 있다.
상기 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨(detection label)의 시그널의 크기를 통해서 정량적으로 측정 가능하다. 검출 라벨은 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 마커들에 특이적으로 결합하는 항체에 표지하거나, 상기 항체를 인지할 수 있으며 검출 라벨로 표지된 2차 항체를 반응시켜 측정할 수 있다. 예를 들어, 항원-항체 복합체의 형성량은 검출 라벨의 형광, 발광, 화학발광(chemiluminescence), 흡광도, 반사 또는 투과를 통하여 측정할 수 있다. 이를 위하여, 상기 검출 라벨은 효소, 형광물질, 리간드, 발광물, 미소입자(microparticle), 콜로이드, 레독스 분자 및 방사선 동위원소로 이루어진 그룹 중에서 선택할 수 있으며, 반드시 이로 제한되는 것은 아니다.
검출 라벨의 정량적 측정 방법으로, 초고속 스크리닝(high throughput screening, HTS) 시스템을 이용할 수 있다. 여기에는 검출체로 형광물질이 부착되어 형광을 검출함으로써 수행되는 형광법, 검출체로 방사선 동위원소가 부착되어 방사선을 검출함으로써 수행되는 방사선법, 검출체의 표지 없이 표면의 플라즈몬 공명 변화를 실시간으로 측정하는 SPR(surface plasmon resonance) 방법, 또는 SPR 시스템을 영상화하여 확인하는 SPRI(surface plasmon resonance imaging) 방법 등을 이용하는 것이 가능하나, 이에 한정되지 않는다.
다른 예로, 본 발명은 유방암 환자로부터 얻은 시료로부터 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암 진단에 관하여 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 관한 것이다.
본 발명에서 사용되는 용어 "진단에 관하여 필요한 정보를 제공"한다는 것은 시료 등으로부터 측정된 마커의 발현 정도를 정성적 또는 정량적으로 측정하여 질환의 진단 여부 판단을 위한 다양한 정보를 제공하는 것을 의미한다.
바람직한 일예로, 본 발명은 유방암 환자의 시료로부터 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커들의 농도를 측정하는 단계, 및 상기 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커들의 농도가 정상 또는 내강형(luminal type) 유방암 환자보다 높거나 임계값(cut-off)보다 높을 경우 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암에 해당한다고 예측하는 단계를 포함하는, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암 진단에 필요한 정보를 제공하는 방법에 관한 것이다.
상기 방법에서 유방암 환자의 시료는 생체로부터 채취 및 분리되는 환자의 조직, 세포, 혈액, 혈청, 혈장, 타액 또는 뇨 등일 수 있다. 이러한 시료의 채취는 통상적인 채취 방법, 예를 들어 주사기 등으로 채혈하는 방법 등을 사용하여 수행될 수 있다. 또한 이와 같이 생체로부터 채취 및 분리된 것 외에 그로부터 인공적으로 배양된 세포, 조직 또는 이의 배양물을 사용할 수도 있다.
또한, 시료는 마커의 탐지 감도를 증가시키도록 준비될 수 있는데, 예를 들어 유방암 환자의 시료는 음이온 교환 크로마토그래피, 친화도 크로마토그래피, 크기별 배제크로마토그래피(size exclusion chromatography), 액체 크로마토그래피, 연속추출(sequential extraction) 또는 젤 전기영동 등의 방법을 이용하여 전처리될 수 있으나, 이에 한정되지 않는다.
상기 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자 의 수준은 상기 단백질 또는 유전자와 상호작용하는 물질을 이용하는 통상적인 모든 단백질 또는 유전자 분석 방법에 의하여 측정될 수 있다. 상기 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질은 상기 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 단백질 또는 그의 유전자에 특이적으로 결합하는 화학 물질(chemical, small molecule), 단백질, 펩타이드, 핵산 분자(폴리뉴클레오타이드, 올리고뉴클레오타이드 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 예컨대, 상기 MASC- YAP 시그니쳐 마커 단백질 또는 이를 암호화하는 유전자와 상호작용하는 물질은 MASC- YAP 시그니쳐 마커 단백질에 특이적으로 결합하는 화합물, 항체, 압타머, 및 MASC- YAP 시그니쳐 마커 유전자의 전부 또는 일부에 결합하는 핵산 분자(예컨대, 프라이머, 프로브, 앱타머 등) 등으로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상일 수 있다. 이러한 측정 방법은 상기 진단용 조성물, 키트에서 언급된 사항을 그대로 적용할 수 있다. 구체적으로, 상기 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 mRNA 발현 정도를 측정하는 것은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있고, MASC- YAP 시그니쳐 마커의 단백질 발현 정도를 측정하는 것은 상기 시그니쳐 마커 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 이때, 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론항체일 수 있으며, 시그니쳐 마커 단백질-항체 복합체의 형성량의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행될 수 있다.
나아가, 또 하나의 양태로서, 본 발명은 후보 화합물을 접촉시키는 단계 및 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 활성화 억제여부를 측정하는 단계를 포함하는 SRF-YAP 과발현 유선 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암의 치료제를 스크리닝하는 방법에 관한 것이다.
바람직하게, 상기 스크리닝 방법은 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암의 치료 후보 화합물을 예를 들어 투여 등의 방법에 의해 접촉시킨 후, IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커 유전자의 발현 수준 또는 상기 유전자가 암호화하는 단백질의 발현 수준이 억제되는 경우 후보 화합물을 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암의 치료제로 결정하는 단계를 포함한다. 상기 유전자의 발현 수준 또는 단백질의 발현 수준의 측정에 관한 사항은 상기 진단 방법 등에 개시된 사항을 적용시킬 수 있다. 구체적으로, 상기 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 mRNA 발현 정도를 측정하는 것은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting) 및 DNA 칩으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행되는 것일 수 있고, MASC- YAP 시그니쳐 마커의 단백질 발현 정도를 측정하는 것은 상기 시그니쳐 마커 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 수행될 수 있다. 이때, 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론항체일 수 있으며, 시그니쳐 마커 단백질-항체 복합체의 형성량의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행될 수 있다.
한편, 본 발명은 MASC- YAP 시그니쳐의 mRNA 발현을 증가시키기 위한 성분, 또는 MASC- YAP 시그니쳐 단백질을 유효 성분으로 포함하는 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암 치료용 약학적 조성물을 제공한다.
본 발명에서, "유효 성분으로 포함"이라는 용어는, 원하는 생물학적 효과를 실현하는데 필요하거나 또는 충분한 양으로 해당 성분이 포함되는 것을 의미한다. 실제 적용에 있어서 유효 성분으로 포함되는 양의 결정은 대상 질병을 치료하기 위한 양으로서, 다른 독성을 야기하지 않는 사항을 고려해서 결정될 수 있으며, 예를 들어 치료되는 질병 또는 병태, 투여되는 조성물의 형태, 피험체의 크기, 또는 질병 또는 병태의 심각도 등과 같은 다양한 인자에 따라서 변화될 수 있다. 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 기술을 지닌 기술자라면 과도한 실험을 동반하지 않고 개별적 조성물의 유효량을 경험적으로 결정할 수 있다. 상기 조성물의 형태는 투여하고자 하는 모드에 따라서 다양하게 선택될 수 있으며, 이에 제한되는 것은 아니지 만, 예를 들어 정제, 환약, 분말, 캡슐, 겔, 연고, 유체 또는 현탁액 등의 고상, 반고상 또는 액상의 투약 형태 일 수 있다. 바람직하게는 상기 조성물은 정확한 투약량의 단독 투여에 적절한 단위 투약 형태로 투여될 수 있다. 또한 상기 조성물은 동물 또는 인간 투여를 위한 약학 조성물을 제형화하는데 일반적으로 사용되는 약학적으로 허용 가능한 담체 또는 희석제를 원하는 제형에 따라 적절히 선택하여 포함할 수 있다. 이러한 희석제의 예는 증류수, 생리 식염수, 링거액, 포도당 용액, 및 행크스(Hank's) 용액이 있다. 약학적 조성물은 또한 다른 약물 제제, 약학 제제, 담체, 보조제, 비독성, 비치료상, 비면역성 안정화제 등을 포함할 수 있 다. 이러한 희석제 또는 담체의 유효량은 성분의 용해성, 생물학적 활성 등으로 환산하여 약학적으로 허용 가능한 제형을 획득하는데 유효한 양이다. 한편, 본 발명에 따른 약학적 조성물은 기존의 유방암 치료용 제제의 약효를 더욱 증대시키는데 사용 가능한바, 이에 제한되는 것은 아니지만, 타목시펜 (tamoxifen), 랄록시펜(Evista), 토레미펜(Fareston) 등과 같은 항-호르몬 치료제의 치료 효능을 더욱 증대시키는데 사용 가능하다.
본 발명에 따른 유선줄기세포 특성을 부여하는 SRF-YAP 및 MASC-YAP signature 를 진단 및 치료에 이용하는 경우, 종래 진단이 어려운 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암에 대한 진단의 정확성을 높여 보다 분자적으로 세분화된 유방암 진단에 큰 활용이 기대된다.
본 발명의 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암의 진단 및 치료를 위한 신규 바이오마커 및 이들의 이용한 진단 및 치료용 조성물, 및 방법을 사용하는 경우 MASC-YAP 시그니쳐 전사인자(유전자) 활성화 억제 또는 이들의 단백질에 결합하는 물질의 투여에 의하여 SRF-YAP 과발현 유전종양줄기세포 특징을 보이는 삼중 음성 유방암 및 기저양 유방암에 대한 진단 및 치료 효능을 획기적으로 개선시킬 수 있다.
도 1a은 본 발명의 실시예에 따른 MCF-10A ERT2 및 MCF-10A ERT2-YAP 2SA 세포에 표시된 시간 동안 4-OHT를 처리한 후의 웨스턴 블롯과 수량적인 역전사-PCR(qRT-PCR) 결과이다.
도 1b는 본 발명의 실시예에 따른 Heatmap은 4-OHT를 처리한 MCF-10A ERT2 및 MCF-10A ERT2-YAP 2SA 세포의 마이크로어레이 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 1c은 본 발명의 실시예에 따른 YAP 유도에 의해서 유도되는 유전자(YAPm) 및 유선 줄기 세포, luminal 전구 세포(Prog.) 또는 분화된 luminal 세포(Diff.)에서 유도되는(m) 또는 결핍된(k) 유전자 세트들의 전반적인 벤다이어 그램이다.
도 1d는 본 발명의 실시예에 따른 표시된 유전자를 발현하는 MCF-10A 세포에 의해서 형성된 유방종양괴(mammosphere)의 숫자, 및 유방종양괴(mammosphere)(n = 3 실험, 스케일 바, 200 mm)의 대표적인 그림이다.
도 1e는 본 발명의 실시예에 따른 표시된 shRNA 레트로바이러스로 감염된 MCF-10A 세포들의 웨스턴 블롯과 qRT-PCR 분석(n = 2 반복) 결과를 보여주는 그림이다.
도 1f은 본 발명의 실시예에 따른 표시된 shRNA 레트로바이러스로 감염된 MCF-10A 세포들의 분비된 IL6에 대한 ELISA(n = 3 반복) 결과를 보여주는 그림이다.
도 1g은 본 발명의 실시예에 따른 표시된 shRNA 레트로바이러스로 감염된 MCF-10A 세포들의 대표적인 FACS 곡선과 CD44 및 CD24 항원 발현의 통계적 분석(n = 3 실험) 결과를 보여주는 그림이다.
도 1h은 본 발명의 실시예에 따른 표시된 shRNA 레트로바이러스로 감염된 MCF-10A 세포들의 IL6, IL6를 중성화하는 항체(Ab-IL6) 또는 200nM tofacitinib(JAK 저해제)를 처리한 YAP-과발현 세포에 의해서 형성된 유방종양괴(mammosphere)의 숫자와 크기의 통계적 분석 결과를 보여주는 그림이다.
도 1i는 본 발명의 실시예에 따라 MCF-10A, ERT2-YAP 2DA 세포의 마이크로어레이 분석결과를 나타내는 것으로서, MCF-10A는 레트로바이러스에 의해 감염된 것이며, (a)웨스턴 블랏 결과, (b) 48시간 혈청 기아 상태후 BrdU 분석결과(n=1 실험), (c) 생성 세포에 대한 연질 아가 콜로니 계수(n=3 실험), (d) 보존된 YAP 타겟 유전자에 대한 gene set enrichment 분석결과. (e) 선택된 Hippo pathway gene에 대한 Heatmap 분석, (f) 선택된 분비 유전자에 대한 Heatmap 분석, (g) Piccolo 등에 열거된 YAP/TAZ의 Heatmap 분석, (h) YAP 유도 후 상향조절된 유전자의 Gene ontology analysis 결과이다.
도 2a는 본 발명의 실시예에 따른 표시된 YAP 돌연변이로 감염된 세포의 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 분석(n = 2 반복) 결과를 보여주는 그림이다.
도 2b은 본 발명의 실시예에 따른 CD44 및 CD24 항원 발현의 대표적인 FACS 곡선과 통계적 분석 결과를 보여주는 그림이다.
도 2c은 본 발명의 실시예에 따른 표시된 YAP 돌연변이로 감염된 MCF-10A 세포를 사용한 유방종양괴(mammosphere) 분석의 결과를 보여주는 그래프이다.
도 2d는 본 발명의 실시예에 따라 TEAD1/3/4 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 YAP을 발현하는 MCF-10A 세포들의 웨스턴 블롯 결과를 보여주는 그림이다.
도 2e은 본 발명의 실시예에 따라 TEAD1/3/4 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 YAP을 발현하는 MCF-10A 세포들의 qRT-PCR 분석(n = 2 반복) 결과를 보여주는 그림이다.
도 2f는 본 발명의 실시예에 따른 YAP 및 TAZ 의 과발현에 따른 MaSC signature gene 발현을 나타내는 결과이다.
도 3a는 본 발명의 실시예에 따른 전사 인자 타겟의 세트에 대한 GSEA 분석의 요약을 보여주는 표이다.
도 3b는 본 발명의 실시예에 따라 shRNA의 타겟 전사 인자(beta_catenins, TC3, Slug, SRF)로 감염되거나 우성 음성(dominant-negative) 전사 인자 LIP를 공동 발현하는 YAP을 과발현 하는 MCF-10A 세포에서 qRT-PCR 분석(n = 2 반복) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3c은 본 발명의 실시예에 따라 YAP 과발현세포에서의 SRF(n = 2 반복)에 대한 shRNA로 감염시킨 MCF-10A 세포의 qRT-PCR 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3d은 본 발명의 실시예 에 따라 YAP 과발련과 동시에 TEAD1/3/4(n = 2 반복)에 대한 shRNA를 과발현하는 MCF-10A 세포의 qRT-PCR 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3e 본 발명의 실시예 에 따라 YAP 과발현과 동시에 SRF에 대한 shRNA를 발현하는 MCF-10A 세포에서 CD44 및 CD24 항원 발현의 대표적인 FACS 곡선과 통계적 분석(n = 3 실험) 결과를 보여주는 그래프이다.
도 3f는 본 발명의 실시예에 따라 YAP 과발현과 동시에 SRF에 대한 shRNA를 발현하는 MCF-10A 세포에 의해서 형성된 유방종양괴(mammosphere)의 숫자를 보여주는 그래프이다.
도 4a은 본 발명의 실시예에 따라 YAP 및 TEAD2/SRF를 공동발현하는 MCF-10A 세포의 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 분석(n = 2 반복)결과를 보여주는 그래프이다.
도 4b은 본 발명의 실시예에 따라 SRF-YAP이 SRF- 및/또는 S-tagged YAP 과발현하는 293T 세포에서의 추출물과 S-agarose로 공동 면역침강하는 것을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4c는 본 발명의 실시예에 따라 293T 세포 추출에서 내인성 SRF-YAP을 YAP 항체로 공동 면역침강하는 것을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4d은 본 발명의 실시예에 따라 293T 세포 추출물에서 내인성 SRF-YAP을 SRF 항체로 공동 면역침강하는 것을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4e는 본 발명의 실시예에 따라 표시된 Flag-표지된 돌연변이 YAP 및 SRF의 공동 면역 침강을 나타낸 웨스턴 블롯 결과이다.
도 4f는 본 발명의 실시예에 따라 정제한 S-표지된-Flag-SRF 및 박테리아에서 정제한 GST-결합 YAP 돌연변이를 사용한 in vitro 풀다운 분석 결과이다.
도 5a은 본 발명의 실시예에 따라 표시된 전사 조절자에 대한 크로마틴 면역침강-qPCR 분석(n = 3 실험)결과이다.
도 5b은 본 발명의 실시예에 따라 IL6 프로모터 CArG 박스의 Luciferase 분석(n = 3 실험)결과이다.
도 5c은 본 발명의 실시예에 따라 표시된 유전자를 발현하는 293T 추출물과 GST 결합된 단백질을 사용한 IL6 프로모터 CArG 박스의 EMSA 분석 결과이다.
도 5d은 본 발명의 실시예에 따라 표시된 세포에 대한 YAP에 대한 크로마틴 면역침강-qPCR 분석(n = 3 실험)결과이다.
도 5e은 본 발명의 실시예에 따라 표시된 돌연변이 YAP을 발현하는 MCF-10A 세포에서 TEAD 결합 박스의 CTGF/CYR61 프로모터 및 IL6/DLL1 프로모터의 CArG 박스의 크로마틴 면역침강-qPCR 분석(n = 3 실험)결과이다.
도 6a은 본 발명의 실시예에 따라 HRas-G12과발현과 표시된 siRNA 발현에 따른 웨스턴 블롯 및 qRT-PCR 분석(n = 2 반복)결과이다.
도 6b는 본 발명의 실시예에 따라 Hras-G12 과발현과 표시된 siRNA 발현에 따른 CD44 및 CD24 항원 발현의 대표적인 FACS 곡선 및 통계적 분석(n = 3 실험)결과이다.
도 6c 본 발명의 실시예에 따라 HRasG12V와 YAP 및/또는 TAZ에 대한 shRNA를 발현하는 MCF-10A 세포에 의해서 형성된 유방종양괴(mammosphere)의 숫자에 대한 통계적 분석(n = 3 실험)결과이다.
도 6d는 본 발명의 실시예에 따라 SRF shRNA로 감염된 MCF-10A H-RasG12V 세포의 웨스턴 블롯 결과와 IL6, CTGF의 qRT-PCR 분석(n = 2 반복)결과이다.
도 6e은 본 발명의 실시예에 따라 SRF shRNA로 감염된 MCF-10A H-RasG12V 세포에서 형성된 유방종양괴(mammosphere)의 숫자에 대한 통계적 분석(n = 3 실험) 결과이다.
도 6f은 본 발명의 실시예에 따라 YAP/TAZ 또는 SRF shRNA, H-RasG12V 세포에 IL6를 발현한 MCF-10A세포에서의 숫자에 대한 통계적 분석(n = 3 실험) 결과이다.
도 6g은 본 발명의 실시예에 따라 YAP/TAZ 또는 SRF shRNA로 감염된 MCF-10A H-RasG12V 세포를 재조합 IL6(r-hIL6; 5 ngml_1)가 처리된 후 유방종양괴(mammosphere)의 숫자에 대한 통계적 분석(n = 3 실험) 결과이다.
도 6h은 본 발명의 도 6에서 형성된 세포에 대한 한계 희석 이종이식 분석 결과이다.
도 7a는 본 발명의 실시예에 따라 4T1 공통 유전자 이식 종양의 연속적인 부분의 면역조직화학적 분석 결과이다.
도 7b은 본 발명의 실시예에 따라 YAP을 과발현하는 레트로바이러스 및 표시된 유전자에 대한 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 4T1 세포의 IL6 발현에 대한 qRT-PCR 분석(n = 2 반복) 결과이다.
도 7c은 본 발명의 실시예에 따라 YAP을 과발현하는 레트로바이러스 및 표시된 유전자에 대한 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 4T1 세포의 IL6 발현에 대한 유방종양괴(mammosphere)의 숫자에 대한 수량화(n = 3 실험) 결과이다.
도 7d는 본 발명의 실시예에 따라 표시된 바이러스로 감연된 4T1 세포에 대한 크로마틴 면역침강-qPCR 분석(n = 3 실험)결과이다.
도 7e은 본 발명의 실시예에 따라 YAP을 과발현하는 레트로바이러스 및 표시된 유전자에 대한 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 4T1 세포에서의 대표적인 종양 이미지이다.
도 7f는 본 발명의 실시예에 따라 YAP을 과발현하는 레트로바이러스 및 표시된 유전자에 대한 shRNA를 발현하는 렌티바이러스로 감염된 4T1 세포에서의 종양 생성 빈도의 데이터 요약 결과이다
도 7g는 CTGF가 YAP의 MASC 특성을 유도하게 하는데 중요하지 않다는 점을 확인하기 위하여 MCF-10A 세포를 사용하여 웨스턴 블럿, 유방종양괴의 수/크기를 분석한 결과를 나타낸 도면이다.
도 8a는 본 발명의 실시예에 따라 유방암 패널(GSE31448; n>27 각 서브타입에 대해서)에서 표시된 유전자의 발현에 대한 Heatmap 분석 결과이다.
도 8b은 본 발명의 실시예에 따라 유방암 패널(GSE31448; n>27 각 서브타입에 대해서)에서 표시된 유전자의 발현에 대한 통계적 분석 결과이다.
도 8c은 본 발명의 실시예에 따라 다양한 형태의 유방암에 대한 대표적인 면역조직화학적 데이터 결과이다.
도 8d은 본 발명의 실시예에 따라 조직 마이크로어레이 데이터의 요약 및 통계적 분석 결과이다.
도 8e는 본 발명의 실시예에 따라 YAP + TAZ 또는 SRF 발현 수준에 대한 표시된 세포 형태에 대한 특징적 스코어의 산포도(Scatter plot)(n = 357; Pearson's correlation coefficient를 사용한 상관도 테스트, r) 이다.
도 8f은 본 발명의 실시예에 따라 YAP + TAZ 또는 SRF 발현 수준에 대한 IL6 및 CTGF 발현의 산포도(n = 357; Pearson's correlation coefficient를 사용한 상관도 테스트, r)결과이다.
도 8g는 본 발명의 실시예에 따라 표시된 유전자에서 SRF가 인지하는 DNA-binding site와 표시된 조건에서 크로마틴 면역침강-qPCR 분석을 수행한 결과를 나타낸 그래프이다.
도 9a은 본 발명의 실시예에 따라 표시된 항체를 이용한 반수량적 RT-PCR(semiquantitative RT-PCR) 및 웨스턴 블롯 분석에 의해서 분석된 유방암 세포 주의 패널 사진이다.
도 9b은 본 발명의 실시예에 따라 FACS를 사용한 YAP을 과발현하는 기저 및 luminal 세포 주에서 CD44 및 CD24 항원 발현의 통계적 분석(n = 3 실험)결과이다.
도 9c은 본 발명의 실시예에 따라 YAP을 과발현하는 기저 및 luminal 세포에 대한 유방종양괴(mammosphere) 형성에 대한 분석(n = 3 실험)결과이다.
도 9d은 본 발명의 실시예에 따라 Luminal 암 및 BLBC에서의 IL6 및 CTGF 발현 대 YAP + TAZ 발현 수준의 산포도 결과이다.
도 9e은 본 발명의 실시예에 따라 YAP를 과발현하는 표시된 luminal 및 기저 암 세포 주에 대한 IL6 mRNA 발현의 RT-qPCR 분석(n = 3 반복)결과이다.
도 9f은 본 발명의 실시예에 따라 YAP/TAZ 발현이 다른 luminal 형태 유방암 환자 및 BLBC 환자에 대한 Kaplan-Meier 곡선(로그 순위 테스트)결과이다.
도 9g은 본 발명의 실시예에 따른 BLBC 특이적인 SRF와 YAP-TEAD에 의해서 MASC Signature 유전자 발현을 통한 줄기성을 부여한다는 분자적 모델이다.
도 9h는 본 발명의 실시예에 따라 BLBC와 내강형 유방암 암환자에서 YAP/TAZ의 발현정도에 따른 생존율을 분석한 그래프이다.
도 10은 MCF-10A 세포를 사용하여 SRF-YAP이 Ras-유도된 암 줄기세포 형성을 IL6의 조절을 통해 촉진한다는 것을 확인한 그래프이다.
이하, 본 발명을 하기의 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시하기 위한 것일 뿐이며, 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
<실험에 사용된 물질 및 실험방법>
1. 세포 배양(Cell culture)
293T, MDA-MB-231, 및 MCF-7 세포들은 10% fetal bovine serum(FBS)가 첨가된 DMEM에서 배양되었다. 다른 유방암 세포 주(HCC1954, MDA-MB361, SKBR3, MDA-MB453, T47D, ZR-75-1, BT-20, HCC38 및 Hs578T)들은 10% FBS가 첨가된 RPMI-1640 배지에서 배양되었다. 293T, MCF-7 및 MDA-MB-231 세포들은 American Type Culture Collection에서 얻었고, 다른 유방암 세포 주들은 한국생명공학연구원(Korea Research Institute of Bioscience and Biotechnology)에서 얻었다. MCF-10A세포들은 ref. 47에서 기술된 바와 같이 배양되었다. 세포 주들은 TPOX, TH01, vWA 및 D5S818 염색체 위치(loci)에 대하여 DNA 핑거프린팅(fingerprinting)에 의해서 확인되었다. 세포들은 4,6-diamidino-2-phenylindole로 주기적으로 염색하여 마이코플라즈마의 존재를 확인하였다.
2. 유동 세포 분석(Flow cytometry )
세포들은 6-웰 플레이트에 웰당 105 개의 세포를 심고, 다음 날, 세포들은 트립신이 처리되고 항-CD44-PerCP-Cy5.5(eBioScience, 1:100) 및 항-CD24-biotin(eBioScience, 1:100) 항체로 염색한 다음 fluorescein isothiocyanate-conjugated streptavidin(BD Biosciences, 1:200)으로 염색하였다. 염색된 세포들은 FACSCalibur 유동 세포 분석 시스템(BD Biosciences)을 사용하여 분석하였고, 유동 세포 분석 곡선(fluorescence-activated cell sorting plots)을 FlowJo software(Tree Star Inc.)을 사용하여 분석하였다.
3. 유방종양괴 ( mammosphere ) 분석
트리신으로 세포들을 처리하고, 웰당 104 개의 세포들은 2.5 mL의 B-27이 첨가된 DMEM/F12(Gibco), 20 ng ml_1 인간 상피 성장 인자(Peprotech), 20 ng ml_1 염기성 섬유모세포 성장 인자(basic fibroblast growth factor)(KOMA Biotech) 및 4 mgml_1 헤파린(heparin)(Sigma) 속에서 poly-HEMA(Sigma)가 사전에 코팅된 6-웰 플레이트에 심고, 5 내지 10일 후에 유방종양괴(mammosphere) 숫자를 셌다.
4. 마이크로어레이 분석( Microarray analysis)
RNA는 수집되고 인간 HT-12v4 발현 칩(Illumina)을 사용하여 분석되었다. 모든 발현 값(log2로 표현)은 대조군 MCF-10A ERT2 세포에서 큰 변화가 없는(P>0.01) MCF-10A ERT2-YAP 2SA 세포에서 4-OHT 처리된 후 2 및 6일째에 평균 발현이 상당히 증가(P<0.001)하는 유전자를 확인하기 위해서 표준화되고 통계적으로 분석되었다. 관심 있는 유전자 세트의 Heatmap들은 Multi-experiment Viewer를 사용하여 만들어졌다. 마이크로어레이 분석의 원시 데이터(raw data)는 Gene Expression Omnibus(GEO, GSE60579)에서 이용이 가능하다.
5. 크로마틴 면역침강 분석( ChIP assay)
컨플루언트한 2개의 100-mm 배양 그릇에서 자라는 세포에서 얻은 DNA에 대하여 DNA에 간접적으로 결합한 단백질을 잡기 위해서 1.5mM ethylene glycol bis(succinimidylsuccinate)(Sigma)를 상온에서 30분동안 사전 처리하였고, 그리고 나서 1% formaldehyde로 15분 동안 배양하여 크로스링크하였다. DNA 크로스링크 후에, 세포들은 SDS 용해 버퍼(50mM Tris-Cl pH 8.0, 1% SDS 및 10mM EDTA)상에서 Bioruptor(BMS Co.)에 의해서 초음파 처리되었고 희석 버퍼(16.7mM Tris-Cl pH 8.0, 167mM NaCl, 1.1% Triton X-100 및 1.2mM EDTA)에 의해서 1/10로 희석되었으며, 2 mg의 항-YAP 항체(H-125, Santa Cruz Biotechnology), 항-TEAD4 항체(Abcam) 또는 항-SRF 항체(Cell Signaling) 및 Protein A/G agarose(GenDEPOT)을 이용하여 크로마틴 면역침강 분석이 수행되었다. YAP 5SA은 크로마틴에 YAP이 최대의 효율로 결합하도록 사용되었다. 사용된 프라이머는 추가적 표 1에 나타나 있다.
6. GEO 마이크로어레이 분석( GEO microarray analysis)
유방암 집단의 독립적인 세트에 대한 마이크로어레이 데이터는 NCBI GEO에서 다운로드하였다. 마이크로어레이 데이터는 표준화되고 geWorkbench를 사용하여 분석되었다. 본 연구를 위한 마이크로어레이 집단은 GSE1456(ref. 48), GSE3494(ref. 49), GSE21653(ref. 50) 및 GSE31448(ref. 51)였다.
7. 조직 배열 분석(Tissue array analysis)
조직 배열과 종양 서브타입과 등급에 대한 정보들은 연세대학교 병원(Yonsei Severance Hospital)에서 사전에 동의를 받은 환자에게서 얻어졌다. 면역조직화학은 다음과 같은 항체를 사용하여 수행되었다: 항-YAP(Cell Signaling, 1:200), 항-TAZ(V386; Cell Signaling, 1:200), 항-SRF(Cell Signaling, 1:200) 및 항-ALDH1A(ab52492; Abcam, 1:200). 항원 염색의 정도는 1에서 4의 규모로 평가되었다. 1 및 2는 낮음으로, 3 및 4는 높음으로 표현되었다. 본 연구는 연세대학교 병원의 임상 시험 심사위원회(Institutional Review Board)에 승인되었다.
8. In vivo 마우스 실험
마우스 실험들은 한국과학기술원 동물관리 및 사용위원회(Korea Advanced Institute of Science and Technology-Animal Care and Use Committee)의 승인된 절차를 따라서 수행되었다.
9. 이종이식 분석( Xenograft assay)
1:1 혼합물의 Matrigel과 PBS는 100 mL의 최종 부피에서 106 또는 4_106의 세포를 포함하는데 이들은 6-9주의 암컷의 누드 마우스의 피하를 통해 주사되었다. 손으로 만져질 만한 종양의 존재는 이종이식 후 4주후에 조사되었다. 종양 생성 세포의 숫자는 ELDA(Extreme Limiting Dilution Analysis) 소프트웨어를 사용하여 조사되었다.
10. 공통 유전자 이식 분석( Syngeneic graft assay)
4T1 종양 면역조직화학 분석을 위해서, 100 mL의 1:1 Matrigel 및 PBS의 혼합물의 105 개의세포들은 5-6주 암컷 BALB/c 마우스의 네번째 사타구니 유선 지방 패드(fourth inguinal mammary fat pad)를 통해 주입되었다. 종양들은 면역조직화학적 분석을 위해서 15일 동안 성장하고 절개되었다. 한계 희석 분석(limiting dilution)을 위해서, 10 또는 50 개의 4T1 세포들이 면역조직화학 분석에서 기술된 바와 같이 주입되었고 주입 후 15일 후에 이종이식 분석과 유사하게 분석되었다. 종양 생성 세포의 숫자는 ELDA 소프트웨어를 사용하여 조사되었다.
11. 공동 면역침강 분석(Co- immunoprecipitation )
세포들은 PBS로 두번 세척하고 나서 크로스링크 물질인 dithiobis(succinimidyl propionate)(1 mM; Pierce)이 4에서 2시간 처리되었다. 그리고 나서 세포들은 결합 버퍼(20 mM Tris-Cl pH 8.0, 100 mM NaCl, 1mM MgCl2, 0.5% NP-40)상에서 용해되었다. 정제된 용해물(Cleared lysate)은 S-표지된 단백질을 면역침강 시키기 위해서 단백질 S 아가로즈(Novagen)와 1시간동안 배양되었고, Flag-표지된 단백질과 내인성 SRF를 면역침강 시키기 위해서 항-Flag 또는 항-SRF 항체(Cell Signaling)와 밤새 배양하고 단백질 A/G(Genedepot Inc.)과 1시간 동안 배양되었다. 100 유닛의 benzonase(Enzynomics)은 세포 용해물에서 불순물 DNA를 제거하기 위해서 첨가되었다. 용해물은 결합 버퍼로 5회 세척하였고, Laemmli 샘플 버퍼에서 끓인 다음에 SDS-PAGE가 수행되었다
12. In vitro 풀다운 분석(In vitro pulldown assay)
Glutathione S-transferase(GST)이 결합된 YAP(51-394) 단백질은 대장균(Escherichia coli)에서 정제하였다. S- 표지된-Flag-SRF를 발현하는 1 mg의 293T 세포 추출물(extract)은 처음에 단백질 S-아가로즈(Novagen)와 1시간 동안 배양되고 결합 단백질을 최대한 제거하기 위해서 500mM LiCl이 첨가 된 결합 버퍼로 5회 세척하였다. 그리고 나서, S-표지된-Flag-SRF에 대한 비드(bead)는 결합 버퍼에 의해서 재부유(resuspend)되고 50 mg의 GST 단백질과 100 유닛의 benzonase이 밤새 동안 4에서 배양되었다. 그리고 나서, 비드는 결합 버퍼로 5회 세척하였고, Laemmli 샘플 버퍼로 끓인 후, SDS-PAGE가 수행되었다. 편집되지 않은 웨스턴 블롯 분석의 원래 이미지들은 추가적 도 14에 나타나 있다.
13. EMSA ( electrophoretic mobility shift assay)
IL6 프로모터 CArG 염색체 위치를 타겟하는 크로마틴 면역침강 분석의 프라이머를 사용하여 생성된 PCR 결과물은 T4 polynucleotide kinase를 통해 표지되었다. 표지된 프로브(10 fmol)는 2 mg의 MDA-MB-231 핵 추출물과 1 mg의 GST가 결합된 YAP(51-394) 단백질(In vitro 풀다운 분석에서 사용됨)과 EMSA 버퍼에서(15mM HEPES-KOH pH 7.9, 42mM NaCl, 2mM MgCl2, 0.1 mgml_1 bovine serum albumin(BSA), 0.5mM dithiothreitol, 5% glycerol, 1mM EDTA 및 50 mgml_1 poly[I:C])에서 2시간 동안 4에서 배양되었다. IL6 프로모터 CArG 박스(50-AGCTTCCTTACAAGGAAAAC-30) 또는 그것의 돌연변이 파생물(50-AGCTTAATTACAAGGAAAAC-30)을 포함하는 20 염기쌍 비표지된 경쟁자 올리고뉴클레오티드는 표지된 프로브에 1000배 과도(10 pmol)하게 첨가되었다. 슈퍼쉬프트(Supershift)는 1 mg의 대조군, 비특이적 IgG 또는 haemagglutinin(HA) 항체를 첨가하여 수행되었다. 그리고 나서 DNA-단백질 복합체는 5% 폴리아클리아마이드 젤상의 TBE하에서 전기영동 되었고, 말린 후에, 자가 방사능 사진 촬영(autoradiography)를 사용하여 분석하였다.
14. F/G- 액틴 분별(F/G-actin fractionation)
F/G-액틴 분별은 ref. 53에 기술된 바와 같이 수행되었다. 간략하게, 세포들은 상온에서 G-액틴 추출 버퍼(1% Triton X-100, 10mM Tris-Cl pH 7.5, 1mM EGTA, 50mM NaCl 및 15% glycerol)상에서 용해하고 5% 용해물은 전체 액틴으로 보관되었다. 상온에서 1시간 동안 150,000g에서 초원심분리 후에, 5%의 상등액은 G-액틴 부분으로 보관되었다. 그리고 나서 침전물(pellet)은 F-액틴 추출 버퍼(4M urea, 1% SDS, 0.5% Triton X-100, 5mM Tris-Cl pH 7.5, 0.5mM EGTA, 25mM NaCl, 15% glycerol 및 50mM dithiothreitol)상에서 강력한 볼텍스에 의해서 용해되었다. 20%의 상등액은 F-액틴 부분으로 보관되었다. 그리고 나서 모든 부분들은 Laemmli 샘플 버퍼에서 끓이고 SDS-PAGE가 수행되었다.
15. 면역형광법 ( Immunofluorescence )
세포들은 젤란틴으로 코팅된 커버슬립에 심어지고 4% 파라폼알데히드에 의해서 고정되고, 0.1% Triton X-100의 PBS상에서 투과(permeabilized)되고 1% BSA의 PBS에 의해서 블록킹되었다. 그리고 나서 세포들은 일차 항체와 밤새동안 4에서 배양하였다. PBS로 세척후에, 세포들은 이차 항체와 1시간 동안 37에서 배양되었고, 그리고 나서 PBS로 세척하고 Vectashield(Vector Laboratories)로 마운팅되었다.
16. 항체(Antibodies)
다음의 항체들이 사용되었다(특별하게 언급되어 있지 않으면 희석배수는 웨스턴 블롯에 사용된 것임): 항-Flag(Wako; 1:1,000), 항-HA(Covance; 1:10,000), 항-YAP(C 말단의 인간 YAP 항원에 대한 것; 1:2,000), TAZ(Cell Signaling(V386); 1:1,000 웨스턴 블롯용, 1:200 면역조직화학용), 항-b-actin(Sigma; 1:10,000), 항-SRF(Cell Signaling(D71A9); 1:1,000 웨스턴 블롯용, 1:200 면역조직화학용), 항-CTGF(Santa Cruz; 1:250), 항-E-cadherin(BD Biosciences; 1:2,000), 항-N-cadherin(BD Biosciences; 1:500), 항-ALDH1A1(Abcam(EP1933Y); 1:100 면역조직화학용), 항-IL6(Abcam; 1:500 면역조직화학용) 및 항-MRTFB(Bethyl Laboratories; 1:100 면역조직화학용)
17.shRNA
본 연구에서 사용된 shRNA 타겟 서열들은 다음과 같다:
서열번호 명명 서열목록(5'->3')
1 shYAP CAGGTGATACTATCAACCAAA
2 shTAZ AGGTACTTCCTCAATCACA
3 shSRF #1 CGATGTTTGCCATGAGTATTA
4 shSRF #2 GTGAGACAGGCCATGTGTATA
5 shIL6 #1 GAACTTATGTTGTTCTCTA
6 shIL6 #2 AGAACGAATTGACAAACAA
7 shCTGF #1 AAATCTCCAAGCCTATCAAGT
8 shCTGF #2 CTGCACCAGCATGAAGACATA
9 shTCF3 CCCAGCAGCCTCTCTTCATCC
10 shSlug #1 CCCATTCTGATGTAAAGAAAT
11 shSlug #2 GAGTGACGCAATCAATGTTTA
12 shMRTFA GACTATCTCAAACGGAAGATT
13 shMRTFB GCAGACACTTTCACCGAGATT
14 shSrf(마우스) GCCAGCATTCACAGTCACCAA
15 shIl6(마우스) CAATGGCAATTCTGATTGTA
18.RT - PCR
세포들은 Ribo-Ex(GeneAll Inc.) 용액에서 용해되고, RNA는 제조사의 프로토콜에 따라서 분리되었다. 전체 RNA와 MMLV 역전사 효소(Enzynomics)를 37에서 2시간 동안 배양하여 cDNA를 합성하였다. 모든 유전자 발현 수준은 인간 세포의 hypoxanthine phosphoribosyltransferase 1 사례의 것에 대하여 표준화 되었고, 마우스 세포의 glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase 사례의 것에 대하여 표준화 되었다. 사용된 프라이머는 표 2 내지 5에 나타나 있다.
RT-qPCR primers Human genes
서열번호 명명 서열목록(5'->3')
16 IL6_F AAATTCGGTACATCCTCGACGG
17 IL6_R AGGTTCAGGTTGTTTTCTGC
18 HPRT1_F CCTGGCGTCGTGATTAGTGAT
19 HPRT1_R AGACGTTCAGTCCTGTCCATAA
20 TEAD1_F ATGGAAAGGATGAGTGACTCTGC
21 TEAD1_R TCCCACATGGTGGATAGATAGC
22 TEAD2_F GCCTCCGAGAGCTATATGATCG
23 TEAD2_R TCACTCCGTAGAAGCCACCA
24 TEAD3_F TCATCCTGTCAGACGAGGG
25 TEAD3_R TCTTCCGAGCTAGAACCTGTATG
26 TEAD4_F GAACGGGGACCCTCCAATG
27 TEAD4_R GCGAGCATACTCTGTCTCAAC
28 ETS1_F ACCGTGCTGACCTCAATAAGG
29 ETS1_R CCCCGCTGTCTTGTGGATG
30 DLL1_F TCCTGATGACCTCGCAACAGA
31 DLL1_R ACACACGAAGCGGTAGGAGT
32 ANKRD1_F AGTAGAGGAACTGGTCACTGG
33 ANKRD1_R TGGGCTAGAAGTGTCTTCAGAT
34 CTGF_F ACCGACTGGAAGACACGTTTG
35 CTGF_R CCAGGTCAGCTTCGCAAGG
36 THBS1_F CCTGACCGTCCAAGGAAAGC
37 THBS1_R CCTTTGCGATGCGGAGTCT
38 SGK1_F AGGATGGGTCTGAACGACTTT
39 SGK1_R GCCCTTTCCGATCACTTTCAAG
40 EDN1_F TGTGTCTACTTCTGCCACCT
41 EDN1_R CCCTGAGTTCTTTTCCTGCTT
42 ITGB2_F AGTGTGACACCATCAACTGTG
43 ITGB2_R GCACTCGCATACGTTGCAG
44 CDH1_F ATTTTTCCCTCGACACCCGAT
45 CDH1_R TCCCAGGCGTAGACCAAGA
46 CDH2_F TGCGGTACAGTGTAACTGGG
47 CDH2_R GAAACCGGGCTATCTGCTCG
48 VIM_F AGTCCACTGAGTACCGGAGAC
49 VIM_R CATTTCACGCATCTGGCGTTC
50 FN1_F AGGAAGCCGAGGTTTTAACTG
51 FN1_R AGGACGCTCATAAGTGTCACC
52 NEDD9_F ATGGCAAGGGCCTTATATGACA
53 NEDD9_R TTCTGCTCTATGACGGTCAGG
54 SLUG_F TGTGACAAGGAATATGTGAGCC
55 SLUG_R TGAGCCCTCAGATTTGACCTG
56 SRF_F CCGGCAAGGCACTGATTCA
57 SRF_R CTCATTCTCTGGTCTGTTGTGG
58 ACTB_F CATGTACGTTGCTATCCAGGC
59 ACTB_R CTCCTTAATGTCACGCACGAT
60 MYH9_F CCGCCAAGCCAAGGAAGAA
61 MYH9_R GGTATTTGTTGTACGGCTCCA
RT-qPCR primers Mouse genes
서열번호 명명 서열목록(5'->3')
62 Il6_F TAGTCCTTCCTACCCCAATTTCC
63 Il6_R TTGGTCCTTAGCCACTCCTTC
64 Gapdh_F AGGTCGGTGTGAACGGATTTG
65 Gapdh_R TGTAGACCATGTAGTTGAGGTCA
ChIP-qPCR primers Human genomic loci
서열번호 명명 서열목록(5'->3')
66 IL6_F CTGCAAGTTCCCACAGTTCA
67 IL6_R CCCACCTTCTTCAAAATCCA
68 PCDH7_F CGCAACCATCCAAAGTCTG
69 PCDH7_R CCCAGAAAGCCACTCTGTTC
70 FST_F TAAAGCACTCCGGATCTTGC
71 FST_R TGCGTGCTTTGTAAGTGTCC
72 PPP2R2B_F ATGTGGAGGCAGAAAACACC
73 PPP2R2B_R ATGGGAGTAGGCTGCAGAGA
74 ETS1_F ATTCTCACCTAGACACTGTGC
75 ETS1_R CCGAACCTCAGTTCCTCCAT
76 DLL1_F TGCCTAGGAGGGCAATTTAG
77 DLL1_R CCCCAACCCACAACCTTTAC
78 CTGF_F (TEAD binding sequence) GGAGTGGTGCGAAGAGGATA
79 CTGF_R (TEAD binding sequence) GCCAATGAGCTGAATGGAGT
80 THBS1_F ACACTCCCACGCAAGAAAAG
81 THBS1_R GGCCAGGGCATAGGTAGAAG
82 CYR61_F (TEAD binding sequence) TTCCAAGCGGTAAAGCATTC
83 CYR61_R (TEAD binding sequence) TCCCAAAGTGCTGGGATTAC
84 CTGF_F (CArG box) TTCCTGCTGTTTGCCTCTTC
85 CTGF_R(CArG box) TATCCTCTTCGCACCACTCC
86 CYR61_F (CArG box) CAAGAATGCTTTGTGGTTGG
87 CYR61_R (CArG box) GGTGAATCAGACACCAGACG
88 ANKRD1_F (CArG box) GGCACTTTTCTATGCAGTTGG
89 ANKRD1_R (CArG box) TTCTGGCAGCATATTTCAGC
90 SRF_F TATGCAAATAAGCGCCCTCT
91 SRF_R CCCCCATATAAAGAGATACAATGTT
92 MYH9_F CTCAAGACGCTCACAATGGA
93 MYH9_R CTCATGTCATCCCACCACAA
94 VCL_F CCCGCTGAGGTGATTCTG
95 VCL_R GATTCCCGAGCCCTAACG
96 Gene Desert_F GTTCATCCCAGCACCTGTCT
97 Gene Desert_R GTGATGGACCTGGAGCCTAA
ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci
서열번호 명명 서열목록(5'->3')
98 Il6_F ATGAGGGTGTTCCTCCACAC
99 Il6_R CCTTGTCAGGCATCAATGG
100 Dll1_F GGCCCTCCCAATAAACTCAT
101 Dll1_R CCCCCAACACATAACCTTTA
102 Ets1_F CTTTCTGGCTGGTAGGCAAG
103 Ets1_R TGAGAGCTGCCCTTTGTTTC
104 Thbs1_F CTGGGTGTTTCCAAGGTTTG
105 Thbs1_R CAGGGATCCAGGTAAAAGCA
106 Gene desert_F CATCAAGGTGCTGGACAAGA
107 Gene desert_R AAAACCTTTGCTCCTGCTGCTGA
19. 통계적 분석 및 데이터 처리(Statistics and data processing)
생존 분석에 대한 two-tailed t-tests 및 log-rank tests를 포함한 모든 통계적 분석은 Graphpad Prism 소프트웨어를 사용하여 수행하였다. 특별히 언급되지 않은 경우 분석은 two-tailed t-tests에 의해서 수행하였으며, 샘플을 배제 하지 않았으며, 적절한 샘플 크기는 우리가 관찰한 유의한 차이를 드러내기 위해 한정되어 있다. 무작위 테스트(randomization)와 맹검(blinding)은 수행되지 않았다.
실시예 1: YAP에 의한 MaSC signature gene 유도
YAP은 유선 줄기 세포 특징적인 유전자의 발현을 유도한다. YAP을 과발현하는 세포/조직을 사용한 마이크로어레이 (Microarray) 분석은 YAP의 많은 전사 타겟을 나타냈다. 그러나, YAP은 비암성 (noncancerous) 세포의 암으로의 전환을 유도하므로, 종래에 밝혀진 많은 YAP의 타겟은 YAP의 암으로의 전환 성질의 결과인 것으로 보인다.
YAP 활성화에 의한 직접적으로 조절되는 하위 신호 이벤트를 보다 정확하게 한정하기 위해서, 첫째로 타목시펜에 의해서 유도되는(tamoxifen-inducible), 과활성의 YAP 돌연변이 (S127/381A; 두 개의 주요한 LATS 인산화 부위를 알라닌으로 돌연변이 됨) 발현 벡터를 제작하고 무한증식하는 유선 상피 MCF-10A 세포 (immortalized mammary epithelial MCF-10A cell)에 유전자를 transfection하여 stable 세포주를 구축하였다. 최대로 활성이 있는 YAP 5SA 돌연변이(모든 다섯 개의 인산화 부위가 알라닌으로 돌연변이 됨)는 4-hydroxytamoxifen의 처리가 없더라도 암으로의 전환 활성의 원인이 될 수 있기 때문에 사용하지 않았다. MCF-10A ERT2-YAP 2SA 세포를 4-OHT로 처리한 경우 2시간 이내에 YAP을 핵으로 이동시켜서 전사기능을 활성화 시켰고, YAP의 전사 타겟인 CTGF (connective tissue growth factor)를 상승으로 YAP 활성화를 확인하였다 (도 1a).
ERT2-YAP 2SA는 4-OHT를 처리하지 않았더라도 약간의 발현이 증가하는 현상이 관찰되었지만, 이 경우 그 기능적 활성이 존재하지 않는데, 아마도 heat-shock protein의 결합으로 인한 세포질로의 격리 때문에 발생한 것으로 보인다. 우리의 발견은 이러한 것을 뒷받침하며, 매개체 (vehicle)를 처리한 MCF-10A ERT2-YAP 2SA 세포들은 YAP의 타겟 유전자 CTCF를 증가시키지 못했고, 혈청 또는 접촉-독립적인 성장을 이끌거나 YAP 특징적 전사체 (transcriptome)의 발현을 촉진했다 (도i의 a-d).
4-OHT를 처리한 후 2시간과 6시간에서의 MCF-10A ERT2-YAP 2SA과 MCF-10A ERT2 세포에서 얻은 RNA에 대한 마이크로어레이를 수행하였으며, 유전자 발현 분석은 31,333중에서 226개 (0.7%)의 겹쳐지지 않은 유전자 (nonredundant genes)를 YAP에 의해서 유도되는 타겟 유전자라고 나타냈다 (도 1b과 도i). 비록, 이 유전자 리스트는 YAP 활성화의 결과를 간접적으로 포함할 지도 모르지만, 이것은 보다 초기에 반응하는 YAP 타겟의 한 세트를 나타낸다. YAP 특징적인 유전자로 종래에 논문으로 보고된 것들 중에서, 24% (16/68)가 우리의 전사 타겟 리스트에서 확인되었다 (도 1b와 도i의 g). 유전자의 유전자 실체론적 분석 (gene ontology analysis)은 4-OHT가 처리된 MCF-10A ERT2-YAP 2SA 세포에서 배타적으로 증가된 유전자는 다양한 암에서 연관된 YAP 타겟으로 분류되었다 (도i의 h). 많은 YAP 타겟들은 Hippo 회로의 요소들과 IL6, IL8, CXCL1 (chemokine [C-X-C motif] ligand 1), CTGF 및 CYR61 (cysteine-rich angiogenic inducer 61)같은 분비된 발암 물질들을 포함하고, 이는 각각 가능한 음성 피드백 메커니즘과 종양 형성 (tumorigenesis)에서 YAP의 비-세포자발적 (non-cell autonomous)역할을 제시한다 (도i의 e,f).
그 다음에 YAP에 의해서 활성화된 세포의 전사체가 미분화된 세포의 것과 유사한지 여부를 확인하고자 하였다.
유선 상피 세포들은 일반적으로 세 개의 증가된 분화 형태- 유선 줄기 세포, 내강 간세포(luminal progenitor cells) 및 성숙 내강 세포(mature luminal cells)-로 분류가 가능하다. 이에, 마이크로어레이 분석에 의해서 밝혀진 YAP 타겟 유전자 세트는 Visvader와 그의 동료들에 의해서 확립된 각 세포 형태에서 특징적으로 증가되거나 결핍된 유전자 세트들과 중복되는지 확인하였다. 두드러지게, 밝혀진 YAP 타겟 세트들은 유선 줄기 세포에서 증가된 유전자 세트와 성숙 내강 세포(mature luminal cell)에서 결핍된 유전자 세트와 상당히 중복 (6%, 31/489 유전자, P¼3.1_10_20, Fisher's exact test)되었다 (도 1c). luminal-basal cell 가소성 (plasticity)에서 TAZ의 배타적 기능과 대비하여, YAP과 TAZ 모두는 유선 줄기 세포 특징적 유전자의 전사를 활성화 시켰고, 이는 이러한 인자들이 유선 줄기 세포 유사한 기능을 촉진하는데 기능적으로 중복된다는 것을 제시한다 (도 2f의 a). 이러한 결과와 일치하게, YAP 과발현은 실제 유방종양괴(mammosphere) 형성 실험에서 그 숫자를 증가시켰다 (도 1d). 초활성화 (hyperactive) YAP은 접촉-독립적 성장과 유방종양괴(mammosphere) assays의 confound 분석을 아마도 촉진하기 때문에 비-초활성화, 야생형 YAP은 이러한 실험에 사용되었다.
IL6가 유선 줄기 세포에서 증가되어 있고 유방암 줄기 세포(CSC)의 유지를 위해서 필수적이고 YAP-IL6의 초파리 동족체 (homologue) (yorkie-unpaired)가 장 중기 세포의 활성화에 중요하기 때문에 IL6이 YAP에 의해서 유도된 유선 줄기 세포 유사한 특징에 원인이라고 판단했다. YAP이 IL6를 유도함을 mRNA 수준에서 확인했고 (도 1e과 도 2f의 b), IL6 분비를 증가시킴을 확인했다 (도 1f). IL6의 고갈은 CD44Hi/CD24Lo 세포 비율을 감소시켰고 유방종양괴(mammosphere)의 숫자와 크기 모두를 감소시켰으나, 전사후 수준에서 CTGF를 증가시켰다 (도 1e 및 도 3g의 a part). 특히, IL6 결핍은 EMT를 되돌리거나 세포 분열 또는 세포사멸을 변화시키지 못했다 (도 3g의 a-c 파트). 그리하여, 다른 암으로 변화시키는 특성에 영향을 주지는 않지만, IL6는 유선 줄기 세포 유사한 특징을 촉진하는데 특이적으로 관여되어 있다. YAP의 타겟 CTGF의 결핍화는 유선 줄기 세포 유사한 특성을 약화시키지 못했다 (도 4g).
IL6를 중성화시키는 항체와 IL6의 하위 JAK 신호의 저해제는 유방종양괴(mammosphere) 빈도를 증가시켰다 (도 1h). IL6 세포 내부 신호는 노화와 관련된 분비성의 발현에서 증명되었기 때문에, 세포 내부의 IL6가 YAP에 의해서 유도된 유선 줄기 세포 유사 특성의 원인이라고 가정했다. 실제로, 비록 신호 펩타이드가 결핍된 비분비성 돌연변이 IL6 (IL6 ΔS)를 발현하는 MCF-10A 세포가 JAK 신호의 활성화를 시키지 못하지만, 이는 야생형 IL6를 발현하는 MCF-10A세포의 것과 비교하여 상대적으로 유사한 정도의 빈도의 유방종양괴(mammosphere)를 생성하였고 (도 3g의 파트 d-f), 이는 세포 내부의 IL6가 유선 줄기 세포 유사한 특징을 촉진하는데 두드러진 역할을 함을 제시한다. 이에 따라서, 재조합 인간 IL6의 처리는 암으로 전환되지 않은 (untransformed) MCF-10A세포에서 유방종양괴(mammosphere)를 증가시키지 못했다 (도 3g). 이것은 IL6-JAK 신호가 암으로 전환 된 세포에서 암 줄기성을 결정하는 중요한 인자가 됨과 극명하게 대비된다 (도 6g). 본 발명자들은 왜 세포 외부의 IL6의 저해가 유방종양괴(mammosphere) 형성을 촉진하는지 확실히 알고 있지 않다. 아마도 세포 내부와 세포 외부의 IL6 신호 사이의 균형이 유선 줄기 세포 유사한 특징을 결정할 것이고, 반면에 세포 외부의 IL6 신호는 아마도 유선 줄기 세포 유사한 특징을 저해할 것이라고 생각하고 있다.
실시예 2: TEAD는 YAP에 의해서 유도된 유선 줄기 세포 특징에서 불필요함
어떤 전사 인자가 YAP에 의해서 유도된 유선 줄기 세포 특징에 필요한지 확인하고자 하였다.
전사 인자와 YAP의 물리적 연결의 상당히 대다수는 TEAD 결합과 WW 도메인에 의존하고 있기 때문에, 본 발명자들은 각각의 단백질과 상호작용하는 도메인이 제거된 돌연변이 YAP들을 사용하였고, 유선 줄기 세포 특징의 유도와 유선 줄기 세포 특징적 유전자를 대표하는 IL6와 CTGF의 발현을 조사하였다. 놀랍게도, YAP delWW는 IL6과 CTFG의 발현을 촉진하고 CD44Hi 세포를 제작하는데 상당히 유용했지만, TEAD 결합이 결핍된 YAP인 YAP S94A은 완전히 그러한 활성이 없었다 (도 2a, b).
MCF-10A 세포에서 각각 단백질 상호작용에 필요한 모티프 (motif)들이 결핍된 돌연변이 YAP을 과발현시켰을 때, 오직 YAP S94A를 발현하는 세포들만이 유방종양괴(mammosphere)를 형성하지 못했다 (도 2c). TEAD 결합은 아마도 YAP이 핵내에 잔존을 증대시킬 것이기 때문에, 본 발명자들은 S94A 돌연변이가 핵으로 들어가지 못할 것이라고 생각했다. 그러나, YAP S94A가 nuclear localization signal과 결합하여 핵으로 이동하도록 된 경우에도 (도 5g), 그것은 유방종양괴(mammosphere)을 형성하는데 실패했다 (도 2c).
short hairpin RNA (shRNA)에 의해서 매개된 MCF-10A 세포에서 가장 주용한 TEAD 형태인 TEAD1, -3 및-4의 결핍을 이용하여 TEAD 전사인자의 역할을 살펴보았다 (도 6i의 a파트). 놀랍게도, TEAD의 녹다운은 효과적으로 YAP의 전사적 타겟인 CTCF, CYR61 및 ANKRD1를 감소시켰지만, 이것은 IL6의 발현을 상당히 증가시켰고 (도 2d 및 도 6i의 b파트) 유방종양괴(mammosphere)의 형성을 촉진했다 (도 2e 및 도 6i의 c파트).
실시예 3: SRF -YAP 복합체는 유선 줄기 세포 유사한 특성에 필요함
YAP에 의해서 유도되는 유선 줄기 세포 특성을 위해서 필요한 대안이 되는 전사인자의 후보물을 확인하는 비편향적인 접근으로서, 본 발명의 마이크로어레이 데이터를 유선 줄기 세포 특징적인 유전에 대하여 Gene Set Enrichment Analysis (GSEA)를 적용하였다. E12/E47 (TCF3), TCF4/LEF1-b-catenin 및 SRF를 포함하는 수 많은 유전자 세트들은 MCF-10A ERT2-YAP 2SA 세포들에서 증가되어 있었다 (false discovery rate q-valueo0.25; 도 3a 및 추가적 데이터 2). 특히, TEAD 타겟의 집적은 통계적인 유의도에 도달하는 데는 실패하였다 (false discovery rate¼0.28).
처음에 유선 줄기 세포 유전자를 대표하는 IL6 및 CTGF mRNA를 수량화하여 위와 같은 전사 인자의 불활성화가 유선 줄기 세포 유전자의 발현에 영향을 주는지 여부를 조사하였다. 놀랍게도, SRF는 그것의 결핍이 모든 유전자의 발현을 상당히 감소시키는 유일한 인자였다 (도 3b 및 도 7g의 b파트). SRF의 결핍은 IL6, CTGF, THBS1(thrombospondin 1), ETS1 및 DLL1 (delta-like 1) 를 포함하는 YAP에 의해서 유도 되는 많은 유선 줄기 세포 특징적인 유전자들을 감소시켰다 (도 3c). 종래에 유방암 시작 세포를 촉진하는 것으로 보고된 SRF-MRTF의 타겟인 NEDD9의 발현은 YAP 과발현에 의해서 영향 받지 않았다 (도 3c). 흥미롭게도, SRF 녹다운은 CYR61 및 ANKRD1과 같은 유선 줄기 세포 특징적인 유전자가 아닌 다른 YAP 타겟 유전자의 발현에 영향을 미치지 않았다. 이것은 유선 줄기 세포 특징적인 유전자의 상태와 관계없이 많은 YAP 타겟 유전자를 상당히 감소시키는 TEAD 녹다운 결과와 완전히 대비되었다 (도 3d). IL6 및 DLL1은 TEAD 녹다운에 의해서 감소되지 않았다. 이것은 SRF가 특이적이게 유선 줄기 세포 특징적인 유전자의 발현을 조절함을 나타내고, 더욱이 SRF에 의해서 배타적으로 조절되는 YAP 타겟 유전자 및 TEAD에 의해서 조절되지 않는 것은 YAP에 의해서 유도되는 유선 줄기 세포 유사한 특성에 핵심적인 유전자 부분집합을 제시할 지도 모른다. 중요하게도, SRF 녹다운은 YAP에 의해서 유도된 CD44Hi/CD24Lo 세포 집단의 증가와 유방종양괴(mammosphere) 형성을 약화시켰다 (도 3e,f). MCF-10A 세포에서 SRF의 과발현은 세포가 죽도록 하였고, 이는 아마도 종양 형성의 투여량을 조절하기 위한 방어 메커니즘에 의한 것으로 보인다. 그러나, 완전히 암으로 전환되고, 전이적 (transformed, metastatic) 특성이 있는 4T1 세포의 경우에서, 본 발명자들은 YAP이 또한 SRF에 의해서 유도된 유선 줄기 세포 유사한 특성에 필요함을 확인했다 (도 7 g의 c파트); 게다가, 4T1 세포에서 SRF 및 YAP은 상승적으로 유선 줄기 세포 유사한 특성을 유도하는데 필요했다 (도 7g의 d파트). 결국, SRF 결핍은 MCF-10A와 4T1 세포 모두에서 유방종양괴(mammosphere) 형성을 제거하였다 (도 7 g의 e파트). 이러한 데이터는 SRF가 YAP에 의해서 유도되는 유선 줄기 세포 특징적인 유전자 발현과 유선 줄기 세포 유사한 특성을 위해서 필요한 핵심적인 전사인자임을 제시한다.
TEAD가 아닌 SRF가 유선 줄기 세포 특징적인 유전자 프로모터에서 YAP와 전사 인자 복합체를 형성함을 밝혔다. 이러한 해석과 일관되게, TEAD가 아닌 SRF와 YPA의 공동 발현은 상승적으로 IL6와 CTGF를 증가 시킴을 확인하였다 (도 4a).
비록, SRF 및 YAP에 의한 상승적인 CTGF의 유도는 TEAD 결핍에 의해서 사라지지만, SRF-YAP은 이미 잘 성립된 SRF의 타겟 유전자이기 때문에 독립적으로 CTFG를 증가시킬 수 있었다 (도 7 g의 f파트). 공동 면역침전 (Co-immunoprecipitation) 분석은 외인성 (exogenous) 및 내인성 (endogenous)에서 SRF가 YAP과 결합함을 나타냈다 (도 4d-d 및 도 7g).
SRF-YAP 상호작용 도메인 지도제작은 YAO S94A 돌연변이는 SRF와의 상호작용이 일어나지 않음을 나타냈다 (도 4e, f). 이것은 아마도 YAP S94A 돌연변이가 유선 줄기 세포 유사한 특성을 유도하지 못하지만, TEAD 전사인자는 이것에 필수적임을 설명할지도 모른다. 그 다음에, 본 발명자들은 YAP이 SRF 결합 DNA 모티프, CArG 박스, IL6, CTGF, PCDH7, THBS1, PPP2R2B, ETS1 및 DLL1을 포함하는 유선 줄기 세포 특징적인 유전자의 프로모터에 모임 (recruitment)을 크로마틴 면역 침강 (Chromatin immunoprecipitation 분석을 이용하여 조사하였다 (도 8g의 a파트). 흥미롭게도, YAP은 유선 줄기 세포 유전자 프로모터 내부의 CArG 박스에 상당한 양이 축적되었고 여기에는 SRF 또한 축적되어 있었다 (도 5a).
추가적으로 luciferase 분석을 사용하여 SRF 및 YAP이 상승적으로 CArG 박스를 포함하는 IL6 포로모터를 활성화시키는지를 확인하였고(도 5b), electromobility shift assay (EMSA)를 사용하여 YAP S94A 돌연변이에 의해서 기능이 저해되는 DNA-SRF-YAP 복합체를 검출하였다(도 5c). 또한, 일관적이게 SRF의 결핍은 상기의 언급된 유선 줄기 세포 특징적인 유전자의 프로모터에서 YAP 농축을 완화시켰다 (도 5d). 또한 YAP은 CYR61 및 ANKRD1과 같은 SRF 결핍에 의해서 그 발현이 영향 받지 않는 YAP 타겟 유전자의 CArG 박스에서 농축되었고, 이 농축은 SRF 결핍에 의해서 감소하였다 (도 8 g의 c, f파트).
비록 이러한 두 개의 유전자가 실제로 SRF-YAP에 의해서 조절되지만, TEAD-YAP에 의한 이 조절은 아마도 우세할지도 모른다고 믿고 있다. 결국, 우리의 SRF-YAP 상호작용 도메인 지도제작의 결과와 일치하게, YAP S94A 돌연변이는 CTGF 및 CYR61 프로모터의 TEAD 결합 박스 및 IL6 및 DLL1 프로모터의 CArG 박스에 위치하지 못했다 (도 5e). SRF 및 YAP은 in vitro에서 TEAD4 단백질의 검출 없이 상호작용했고 (도 4f), EMSA 분석에 의하면 외인성 TEAD4는 추가적인 DNA-SRF-YAP 복합체의 변화를 이끌지는 못했다 (도 5c, 7 및 12 선을 대조). 이러한 증거들은 SRF-YAP 복합체는 아마도 TEAD와 독립적으로 존재할 것이라는 것을 나타낸다. 일관적이게, TEAD 결핍은 IL6 프로모터의 활성과 유선 줄기 세포 특징적인 유전자 프로모터에 YAP의 농축에 거의 영향이 없었다 (도 8g의 d,e 파트). 종합적으로, 이러한 데이터들은 SRF가 유선 줄기 세포 특징적인 유전자의 발현과 유선 줄기 세포 형성에서 YAP의 유도를 위해 필수적인 전사인자임을 제시한다.
실시예 4: SRF -YAP/ TAZ -IL6는 Ras -유도 암줄기 세포 형성을 촉진함
SRF-YAP-IL6 신호가 유선 줄기 세포 유사한 특성의 유도에 중요하다는 본 발명의 실험 결과는 상기 회로가 암 줄기 세포 형성에 필요하다는 것을 제시한다. 위와 같은 사실을 확인하기 위해서, 암 줄기 세포 유지를 위해서 IL6의 수준이 높은 H-RasG12V를 통해 암 세포로 된 MCF-10A 세포를 사용하였다(도 10의 a-c파트). 특히, CTGF는 H-RasG12V에 의해서 유도된 암 줄기 세포의 형성에 불필요하다(도 10의 d,e파트).
YAP/TAZ 녹다운은 MCF-10A H-RasG12V 세포에서 IL6의 발현을 감소시키고 CD44Hi/CD24Lo 세포 집단과 종양구(tumoursphere) 형성의 빈도를 감소시켰다(도 6a-c). 두 개의 다른 BLBC 세포(MDA-MB-231 및 Hs578T)에서 YAP/TAZ 결핍에 의해서 IL6의 발현이 감소하고, 이어서 종양구의 빈도가 감소하는 것을 관찰했다(도 10의 f파트).
이와 유사하게 MCF-10A H-RasG12V 세포에서 SRF 녹다운은 IL6의 발현 수준과 종양구 형성 빈도를 상당히 감소시켰다(도 6d,e). 특히, MCF-10A H-RasG12V 세포에서 TEAD 녹다운은 종양구 형성 빈도에 거의 영향을 비치지 않았고, 이는 TEAD가 암 줄기 세포 형성에 필수적이지 않음을 나타낸다(도 10의 g파트).
또한, YAP/TAZ 또는 SRF가 결핍된 MCF-10A H-RasG12V 세포에서 IL6 발현의 회복 또는 재조합 IL6의 처리는 종양구 형성의 빈도를 회복하는데 충분했고, 이는 IL6가 SRF-YAP/TAZ에 의해서 유도된 암 줄기 세포 형성에 핵심적인 인자임을 확신하게 하였다(도 6f,g). 또한, 한계 희석(limiting dilution) 이종이식 검정을 사용하여, IL6 과발현이 MCF-10A H-RasG12V 세포에 YAP/TAZ 또는 SRF을 녹다운하여 발생한 종양 생성 활성의 감소를 회복시킴을 확인할 수 있었다(도 6h).
IL6 사이토카인은 면역 세포에서 발현되어 있기 때문에, 면역 저하 마우스(immune-deficient mice)에 대한 이종이식은 아마도 종양 생성에서 SRF-YAP-IL6 신호의 in vivo 중요성을 충실하게 반영하지 못할지도 모른다. 이를 확인하기 위해서, immune-competent BALB/c 마우스에서 4T1 공통 유전자(syngeneic) 종양 이식 모델을 사용하였다. 연쇄적 종양 부분에 대한 면역조직화학적 분석은 면역 세포 마커 인 CD45의 것과 상당히 겹쳐지지 않음을 드러냈으나, IL6를 발현하는 부위는 4T1 암 세포 마커인 사이토카인 IL6의 것과 상당히 겹쳐졌다(도 7a). IL6 세포 내부 신호가 아마도 유선 줄기 세포 유사한 특성을 유도할지 모른다는 본 발명자의 증거와 함께하여, 이러한 발견들은 종양 세포에서 유래한 IL6는 암 줄기 세포 특징의 중요한 매개자라는 것을 제시한다.
4T1 유방암 세포 주 공통 유전자 이식 모델을 사용하여 in vivo SRF-YAP-IL6 신호 축의 중요성을 살펴보았다. 4T1 세포에서 YAP은 SRF에 의존적인 방법으로 IL6를 증가시켰고, SRF 또는 IL6의 결핍은 종양구 빈도를 감소시켰다(도 7b,c). 또한, YAP은 SRF 의존적인 방법으로 유선 줄기 세포 유전자 프로모터에서 CArG 박스로 모였다(도 7d). 공통 유전자 이식 분석은 다시 YAP 과발현이 종양 생성 세포 빈도를 증가시키고, SRF 또는 IL6의 결핍은 그것을 감소시킴을 나타냈다(도 7e,f). 이러한 결과들은 in vivo에서 IL6가 SRF 및 YAP-TAZ 의존적인 암 줄기 세포 형성의 유도에서 핵심적인 인자임을 나타낸다.
실시예 5: SRF -YAP/ TAZ -IL6는 미분화된 BLBC에서 농축됨
인간 유방암으로 확장시키기 위해서, 다양한 유방암 연구 집단(cohorts)를 사용한 마이크로어레이 데이터를 분석하여 인간 유방암 환자에서 SRF, YAP/TAZ 및 IL6의 발현 수준을 조사하였다.
SRF, YAP, TAZ(WWTR1) 및 IL6는 일관되게 BLBC, 정상-유사 유방암 및 claudin-low subtype에서 증가되어 있었다(도 8a,b). 비록 claudin-low subtype이 유선 줄기 세포와 가장 높은 유사성을 나타내고 YAP.TAZ에 대해서 가장 높은 활성을 가질 것으로 예상되고, 이러한 subtype은 luminal progenitor cell에서 유래한 것으로 알려진 BLBC와 비교하여 YAP/TAZ mRNA 수준이 높지 않았다. 조직 어레이(tissue array)를 사용하여 유방암 줄기성에서 다시 SRF 및 YAP/TAZ의 중요성을 확인하였다. SRF 발현과 핵 YAP/TAZ는 명확하게 세개의 음성인 BLBC 및 ALDH1A1(aldehyde dehydrogenase 1A1) 양성인 유방암 줄기 세포와 연관되어 있었다(도 8c,d).
그 다음에, 마이크로어레이에서의 각각 환자에 대해서 연구하기 위해서, Visvader 및 동료들에 정의된 것과 같이(Lim, E. et al. Aberrant luminal progenitors as the candidate target population for basal tumor development in BRCA1 mutation carriers. Nat Med 15, 907-913 (2009)), 네 개의 세포 유형(유선 줄기 세포, luminal progenitor cells, mature luminal cells 및 stromal cells)의 특징적인 점수를 결정하였고, 그들과 SRF 및 YAP/TAZ 발현 수준간의 연관성을 조사하였다. 놀랍게도, SRF 및 YAP/TAZ 발현 수준 모두는 유선 줄기 세포, luminal progenitor cell 및 stromal cell 특징과 양성의 연관성이 있었고, mature luminal cell 특징과 음성의 연관성이 있었다(도 8e). 결국, 본 발명자들은 YAP/TAZ 및 SRF 발현과 IL6의 수준 사이의 상당한 양성의 연관성을 발견했고, 이는 in vivo에서 IL6가 SRF 및 YAP/TAZ에 의해서 유도됨을 나타낸다(도 8f). 앞서 언급한 모든 관찰들은 다른 독립적인 유방암 집단에서 유사하게 증명되었다(도 13의 a-d). 이러한 데이터는 SRF-YAP-IL6 신호의 상향 조절은 저조하게 분화된 BLBC과 유선 줄기 세포 유사한 특성과 연관되어 있음을 제시하고, 더욱이 이러한 유전자의 유방암에서의 중요성을 강조해 준다.
실시예 6:YAP은 선택적으로 BLBC의 암 줄기성을 유도함
YAP에 의해서 유도된 유선 줄기 세포 유사한 특성을 위해 필수적인 SRF가 BLBC에서는 높게 발현되지만, luminal-type 유방암에서는 그렇지 않다는 사실에 주목하여, YAP이 BLBC에서 특이적인 IL6 발현 및 유선 줄기 세포 유사한 특성을 활성화하는지에 대한 가능성을 시험하였다.
다양한 유방암 세포 주에서의 발현 분석은 SRF, YAP/TAZ 및 IL6가 모두 다른 유방암 형태와 비교할 때 BLBC 세포 주에서 증가되어 있음을 나타냈다(도 9a). 중간엽(mesenchyme) 표현형의 Basal B-type 암 세포 주는 YAP 타겟인 IL6 및 CTGF의 가장 높은 발현을 나타냈다. 이것은 EMT로 인해서, 이러한 세포 주에서 YAP의 과잉 활성 및 핵 위치화를 나타낸다(도 12). 상기 가정과 일관되게, 기저 세포(basal cells) 또는 MCF-10A, MCF-10A H-RasG12V 및 4T1과 같은 BLBC에서의 YAP 과발현은 IL6 발현, CD44HiCD24Lo 표면 항원 프로파일인 세포의 비율 및 유방종양괴(mammosphere) 빈도를 증가시켰으나, 반면에 MCF-7 및 ZR-75-1과 같은 luminal-type 암 세포에서의 IL6 및 유선 줄기 세포 유사한 특성은 증가시키지 못했다(도 9b,c,e). 그럼에도 불구하고 많은 luminal-type 암 세포 주에서 SRF 및 YAP/TAZ의 공동발현은 유선 줄기 세포 유사한 특성을 유도하는데 충분하지 못했고, 이는 SRF-YAP이 유선 줄기 세포 유사한 특성이 나타나는데 필요하지만, 충분하지 않다는 것을 나타낸다(도 10h,j). BLBC에서 IL6 발현은 YAP/TAZ 발현과 상당히 연관되어 있었으나, luminal-type 유방암에서는 그렇지 않았는데, 이것은 IL6가 BLBC 특이적인 YAP의 전사 타겟이 될 수 있음을 제시한다(도 9d 및 도 13e). 이러한 경향은 그것의 발현은 유방암 서브타입과 관계없이 YAP/TAZ 발현과 양의 상관이 있는 것으로 잘 알려진 YAP의 보편적인 타겟인 CTGF의 것과 상당히 대조적이다.
암 줄기 세포는 화학치료 후 암 재발에 대한 세포의 기원으로 여겨진다. 그리하여, 본 발명자들은 YAP에 의한 BLBC에서의 특이적인 줄기성의 유도는 암 재발을 촉진한다는 가설을 세웠다. 이것을 증명하기 위해서, 본 발명자들은 다양한 유방암 서브타입에서 YAP/TAZ 발현 수준과 환자의 치료 결과 사이의 연관성을 조사하였다. 놀랍게도, YAP/TAZ 발현은 유방암의 다른 서브타입에서는 환자의 예후와 거의 관련성이 없었지만, 그것은 BLBC 환자에서 짧은 무재발 생존 시간(shorter relapse-free survival time)과 상당한 연관성이 있었다(도 9d).
종합적으로, 이러한 발견들은 BLBC에서 SRF의 높은 발현은 YAP이 더욱 효율적으로 유선 줄기 세포 특징적인 유전자 및 유선 줄기 세포 유사한 특성을 유도할 수 있는 신호 환경을 제공함을 나타낸다. 그리하여, YAP은 암 발생의 BLBC의 줄기세포성을 부여할 수 있는 중요한 인자가 될 수 있다(도 9g).
<결론>
YAP은 주로 Hippo 신호, G단백질 연결 수용체(G-protein-coupled receptor) 활성화 및 액토미오신(actomyosin) 장력(tension)등을 포함한 다양한 자극에 의해서 조절되는 LATS kinase에 의해서 인산화 되어 저해되어 있다. YAP은 혈청에서 존재하는 분열촉진물질(serum-borne mitogens)과 매트릭스-단단함 신호를 세포 분열, 침입(invasion), EMT(epithelial-mesenchymal transition) 및 줄기성으로 변환하는 핵심적인 타겟이다.
YAP의 조절과 기능은 혈청반응인자(serum response factor; 이하, SRF)의 것과 유사하다. SRF는 혈청 및/또는 actin cytoskeleton assembly에 의해서 활성화 된다고 알려져 있다. 또한, SRF은 간세포암(hepatocellular carcinoma, HCC)과 피부암에서 EMT-유사한 표현형과 연관되어 있고, 암 전이와 종양 생성 유방 암 세포의 자기 재생(self-renewal)를 촉진한다.
이에 본 발명자들은 YAP이 많은 유선 줄기 세포 특징적 유전자를 유도함을 확인하였으며, SRF이 YAP에 의해서 유도된 유선 줄기 세포 특징적인 유전자의 전사를 위해서 핵심적인 전사 인자이며, 인터류킨-6(interleukin-6; 이하, IL-6)가 유선 줄기 세포 유사한 특징의 유도를 위한 핵심적인 전사 타겟임을 밝혀냈다. SRF-YAP-IL6 신호는 유선 줄기 세포/전구 세포 성격을 보이는 BLBC 환자 샘플에서 증가되고 암 줄기 세포(cancer stem cells, CSCs)와 특히 BLBC에서의 암의 재발을 위해서 필요하다. 초파리에서 yorkie의 작용기로 기능하는 시토카인 unpaired에 관한 종래의 발견과 종합하여, 이러한 발견은 IL-6가 초파리에서 인간까지 보존된 줄기성을 촉진하는데 연관되어 있는 YAP의 첫 번째 보편적인 전사 타겟으로서 기능함을 밝혔다.
YAP은 유선 줄기 세포 특징적인 유전자의 발현을 유도하며, YAP을 과발현하는 세포/조직을 사용한 마이크로어레이(Microarray) 분석은 YAP의 많은 전사 타겟을 나타냈다. 그러나, YAP은 비암성(noncancerous) 세포가 암으로 전환을 유도하므로, 종래에 밝혀진 많은 YAP의 타겟은 YAP의 암으로의 전환 성질의 결과일 가능성도 있다.
주목할 만한 발견은 잘 특징화된 TEAD 및 CTGF를 통한 YAP의 하위의 종양 형성의 회로가 유선 줄기 세포 유사한 특성을 유도하는데 불필요하다는 것이다. 본 발명자들은 TEAD 및 SRF 모두가 YAP의 암이 되게 하는 활성을 위해 필요하다는 것을 제시했다. 그러나, 다양한 YAP에 의해서 부여된 세포 표현형은 메커니즘적으로 분리가 가능할 수 있다. 예를 들어, TEAD는 주로 YAP에 의해서 유도된 EMT 및 세포 증식에 관여하고, SRF는 주로 유선 상피 세포에서 줄기성 특성의 유도에 관여한다. 특정한 전사 인자에 의존적인 것에 따른 YAP의 전사 타겟을 분류하기 위한 유전체 규모의 연구는 YAP의 발암 형성 기능에서의 다양한 전사 인자 파트너의 역할을 밝히는데 중요할 수 있다.
본 발명은 TEAD가 YAP 그 자체를 지지하는 것보다 YAP의 유선 줄기 세포 유사한 특성의 유도를 방해함을 확인하였으며, TEAD가 3 가지 이유 때문에 IL6 발현에서 직접적으로 관여되지 않을 것이라고 생각하고 있다. 하나는 YAP 결합에서 TEAD의 결핍은 야생형 TEAD와 마찬가지로 효율적이게 IL6 발현을 저해 할 수 있다는 것이다. 둘째는, 본 발명자들은 또한 YAP 및 SRF가 TEAD의 존재 없이 상호작용하는 것을 증명한 것이다. 마지막으로, EMSA 분석을 통해 외인성 TEAD는 SRF 및 YAP에 의한 DNA 이동성 변화를 바꾸지 못함을 보여준 것이다. 모든 이러한 증거들은 TEAD가 SRF-YAP 복합체의 부분으로 기능성 역할을 가지지 못함을 나타낸다. 후속 연구들은 TEAD가 유선 상피 세포에서 줄기성을 저해하는 정확한 메커니즘을 확인해야 할 것이다. 결국, YAP-TEAD 상호작용의 화학적 저해제인 verteporfin이 YAP 과발현 암의 예상 치료 물질로 나타났다. 그러나, 우리의 결과들은 TEAD 불활성화는 유선 줄기 세포 유사한 특성을 감소시킴 없이 증가시켰고 Ras에 의해서 암이 형성된 암 세포에서 줄기성을 감소시키는데 비효과적이었다. 그리하여, 특정한 환경에서 YAP에 의해서 활성화된 암을 위한 verteporfin의 사용을 위해서 주의가 보증될 필요가 있다. 따라서 줄기세포성 증가에 기여하는 SRF-YAP과 EMT, 암전이 세포분열에 기여하는 YAP-TEAD를 억제하는 각각의 약물의 동시투여가 종양줄기성 유방암치료에 효과적일 수 있다.
YAP은 Hippo 암 저해 회로에서 핵심적인 하위 작용기 물질이다. 그에 맞춰, Hippo 회로의 손실은 YAP 과발현의 표현형을 모방하고, 다양한 기관에서 줄기/전구 세포의 확장과 같은 결과를 나타낸다. 본 발명자들은 이전에 YAP이 간에서 타원형의 세포(간전구 세포) 특이적 증식에 관여함을 나타낸바 있다. YAP이 luminal 층의 것과 다르게 기저 층에서 상피 세포에 대해 줄기성을 부여하는 것에 대한 우리의 현재 발견은 YAP이 특이적인 조직 부분에 대해 선호적으로 줄기성을 부여하는 것을 나타낸다. 우리의 발견은 Hippo 회로 녹아웃 마우스에서 YAP의 과발현화에 의한 IL6의 발현 증가는 줄기/전구 세포의 확장에 필수적일지도 모르는 흥미로운 가능성을 나타냈다. Hippo 회로에 대한 조건적 녹아웃(conditional knockout) 마우스는 Hippo 회로 의존적인 성체 줄기/전구 세포의 제한이 발견된 유선, 간 및 장과 같은 다양한 조직에서 줄기/전구 세포의 확장에서 SRF 및 IL6를 포함한 줄기세포 특성을 부여하는 YAP signature의 중요성을 밝힐지도 모른다. 이러한 미래 연구는 Hippo-YAP 회로에서의 특이적인 역할과 in vivo의 전구세포에서 IL6 및 SRF의 관여를 통한 하위 신호를 명확하게 할 것이다. SRF-IL6가 YAP의 줄기성을 촉진하는 활성에 대해서 핵심적인 신호 모듈로 작용한다는 개념은 암에 대하여 유사하게 적용될 수 있다. 사실, IL6 녹아웃 마우스는 간, 피부 및 장에 대한 다양한 발암성의 자극에 대하여 저항성을 나타낸다.
짝이 없는 것(Unpaired)은 비세포 자율적인 암 침입 조절에 핵심이라는 최근의 보고를 고려하여, Hippo 신호 회로의 결핍을 통해 제작된 암에서 SRF-IL6의 후속 연구는 조직 항상성에서 Hippo 신호의 보편적으로 보존된 하위 메커니즘을 설명해야 한다.
SRF 및 YAP은 위의 모든 단백질이 공통의 물리적 화학적 신호에 의해서 활성화 되는 활성화 메커니즘을 공유함을 나타낸다. 본 발명자들은 SRF-YAP 복합체는 줄기성 및 침입 같은 세포 생리의 변화에 대한 세포 외부 신호에 반응 하기 위해서 필수적일지 모른다는 것을 추측했다. 특히, SRF-YAP을 활성화하는 신호는 덱스트란 설페이트에 의한 대장염(dextran sulfate-mediated colitis)과 같은 조직 부상에서 사실상 즉각적으로 관여되어 있다. 그리하여, 이러한 상위 신호는 정상, 항상성 조건에서 조직 손상을 받는 동안에 SRF 및 YAP을 활성화하고 그리하여 재생 반응을 유도할 수도 있다. SRF 및 YAP의 자유화(Deregulation)은 계속적으로(constitutively) 부상, 과도한 세포 증식과 함께 과재생 반응, 침입, 및 줄기/전구 세포의 확장을 초래할 수 있다. 추가적인 연구는 SRF 및 YAP을 평행하게 조절하거나 교차(crosstalk)를 나타내는 상위 신호를 성립하는데 필요할 것이다.
<110> KOREA ADVANCED INSTITUTE OF SCIENCE AND TECHNOLOGY <120> New molecular diagnosis/therapy of triple basal-like breast cancer and negative breast cancers using SRF-YAP and YAP signature <130> DPP20161902KR <160> 107 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shYAP target sequence <400> 1 caggtgatac tatcaaccaa a 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shTAZ target sequence <400> 2 caggtgatac tatcaaccaa a 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shSRF #1 target sequence <400> 3 cgatgtttgc catgagtatt a 21 <210> 4 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shSRF #2 target sequence <400> 4 gtgagacagg ccatgtgtat a 21 <210> 5 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shIL6 #1 target sequence <400> 5 gaacttatgt tgttctcta 19 <210> 6 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> shIL6 #2 target sequence <400> 6 agaacgaatt gacaaacaa 19 <210> 7 <211> 21 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tagtccttcc taccccaatt tcc 23 <210> 63 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Il6_R RT-qPCR primers mouse genes <400> 63 ttggtcctta gccactcctt c 21 <210> 64 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh_F RT-qPCR primers mouse genes <400> 64 aggtcggtgt gaacggattt g 21 <210> 65 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gapdh_R RT-qPCR primers mouse genes <400> 65 tgtagaccat gtagttgagg tca 23 <210> 66 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 66 ctgcaagttc ccacagttca 20 <210> 67 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> IL6_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 67 cccaccttct tcaaaatcca 20 <210> 68 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCDH7_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 68 cgcaaccatc caaagtctg 19 <210> 69 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PCDH7_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 69 cccagaaagc cactctgttc 20 <210> 70 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FST_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 70 taaagcactc cggatcttgc 20 <210> 71 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> FST_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 71 tgcgtgcttt gtaagtgtcc 20 <210> 72 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R2B_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 72 atgtggaggc agaaaacacc 20 <210> 73 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> PPP2R2B_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 73 atgggagtag gctgcagaga 20 <210> 74 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ETS1_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 74 attctcacct agacactgtg c 21 <210> 75 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ETS1_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 75 ccgaacctca gttcctccat 20 <210> 76 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLL1_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 76 tgcctaggag ggcaatttag 20 <210> 77 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> DLL1_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 77 ccccaaccca caacctttac 20 <210> 78 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci(TEAD binding sequence) <400> 78 ggagtggtgc gaagaggata 20 <210> 79 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci(TEAD binding sequence) <400> 79 gccaatgagc tgaatggagt 20 <210> 80 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> THBS1_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 80 acactcccac gcaagaaaag 20 <210> 81 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> THBS1_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 81 ggccagggca taggtagaag 20 <210> 82 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYR61_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci (TEAD binding sequence) <400> 82 ttccaagcgg taaagcattc 20 <210> 83 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYR61_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci (TEAD binding sequence) <400> 83 tcccaaagtg ctgggattac 20 <210> 84 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci (CArG box) <400> 84 ttcctgctgt ttgcctcttc 20 <210> 85 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CTGF_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci (CArG box) <400> 85 tatcctcttc gcaccactcc 20 <210> 86 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYR61_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci (CArG box) <400> 86 caagaatgct ttgtggttgg 20 <210> 87 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> CYR61_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci (CArG box) <400> 87 ggtgaatcag acaccagacg 20 <210> 88 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANKRD1_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci (CArG box) <400> 88 ggcacttttc tatgcagttg g 21 <210> 89 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> ANKRD1_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci (CArG box) <400> 89 ttctggcagc atatttcagc 20 <210> 90 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRF_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 90 tatgcaaata agcgccctct 20 <210> 91 <211> 25 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> SRF_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 91 cccccatata aagagataca atgtt 25 <210> 92 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH9_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 92 ctcaagacgc tcacaatgga 20 <210> 93 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> MYH9_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 93 ctcatgtcat cccaccacaa 20 <210> 94 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCL_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 94 cccgctgagg tgattctg 18 <210> 95 <211> 18 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> VCL_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 95 gattcccgag ccctaacg 18 <210> 96 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene Desert_F ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 96 gttcatccca gcacctgtct 20 <210> 97 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene Desert_R ChIP-qPCR primers Human genomic loci <400> 97 gtgatggacc tggagcctaa 20 <210> 98 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Il6_F ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 98 atgagggtgt tcctccacac 20 <210> 99 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Il6_R ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 99 ccttgtcagg catcaatgg 19 <210> 100 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dll1_F ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 100 ggccctccca ataaactcat 20 <210> 101 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Dll1_R ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 101 cccccaacac ataaccttta 20 <210> 102 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ets1_F ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 102 ctttctggct ggtaggcaag 20 <210> 103 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Ets1_R ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 103 tgagagctgc cctttgtttc 20 <210> 104 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thbs1_F ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 104 ctgggtgttt ccaaggtttg 20 <210> 105 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Thbs1_R ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 105 cagggatcca ggtaaaagca 20 <210> 106 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene desert_F ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 106 catcaaggtg ctggacaaga 20 <210> 107 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Gene desert_R ChIP-qPCR primers Mouse genomic loci <400> 107 aaaacctttg ctcctgctgc tga 23

Claims (16)

  1. 유방암 환자로부터 얻은 시료로부터 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 발현 정도를 측정하는 단계를 포함하는, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  2. 제1항에 있어서,
    유방암 환자로부터 얻은 시료로부터 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 발현 정도를 측정하는 단계, 및
    상기 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 발현 정도가 정상 시료 또는 luminal type의 암과 비교하여 높은 경우, 상기 환자를 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 암 환자로 결정하는 것을 특징으로 하는, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  3. 제1항에 있어서, 상기 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 발현 정도는 mRNA 발현 정도 또는 단백질 발현 정도를 측정하는 것인, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  4. 제3항에 있어서, 상기 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 mRNA 발현 정도를 측정하는 것은 역전사 중합효소반응(RT-PCR), 경쟁적 역전사 중합효소반응(Competitive RT-PCR), 실시간 역전사 중합효소반응(Real-time RT-PCR), RNase 보호 분석법(RPA; RNase protection assay), 노던 블랏팅(Northern blotting), DNA 칩, Q-PCR, Digital PCR, Next Generation Sequencing, RNASeq, lab-on-a-chip 및 마이크로어레이로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행되는 것인, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  5. 제3항에 있어서, 상기 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 단백질 발현 정도를 측정하는 것은 상기 시그니쳐 마커 단백질에 특이적인 항체를 이용하여 수행되는 것인, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  6. 제5항에 있어서, 상기 항체는 단클론항체 또는 다클론항체인, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  7. 제5항에 있어서, 상기 시그니쳐 마커 단백질-항체 복합체의 형성량의 측정은 웨스턴 블랏, ELISA(enzyme linked immunosorbent assay), 방사선면역분석(RIA: Radioimmunoassay), 방사 면역 확산법(radioimmunodiffusion), 오우크테로니(Ouchterlony) 면역 확산법, 로케트(rocket) 면역전기영동, 조직면역 염색, 면역침전 분석법(Immunoprecipitation Assay), 보체 고정 분석법(Complement Fixation Assay), 유세포분석(Fluorescence Activated Cell Sorter, FACS) 및 단백질 칩(protein chip)으로 이루어진 군에서 선택되는 1종 이상의 방법으로 수행되는 것인, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법.
  8. IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐의 발현 수준을 측정하는 제제를 포함하는, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단용 조성물.
  9. 제8항에 있어서, 상기 MASC- YAP 시그니쳐의 발현 수준을 측정하는 제제는 MASC- YAP 시그니쳐의 단백질 발현 수준을 측정하는 제제로서, 상기 시그니쳐 단백질에 특이적인 항체인 것인, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단용 조성물.
  10. 제8항에 있어서, 상기 MASC- YAP 시그니쳐의 발현 수준을 측정하는 제제는 MASC- YAP 시그니쳐의 mRNA 발현 수준을 측정하는 제제로서, 상기 시그니쳐 유전자의 mRNA에 상보적인 안티센스 올리고 뉴클레오타이드, 프라이머 또는 프로브인 것인, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단용 조성물.
  11. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 따른 조성물을 포함하는, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단용 키트.
  12. 제11항에 있어서, 상기 키트는 마이크로어레이, 유전자 증폭 키트 및 면역분석(immunoassay)용 키트로 구성된 군으로부터 선택된 것인 키트.
  13. 후보 화합물을 접촉시키는 단계;
    및 IL6, THBS1, FST, TES, PCDH7, DLL1 및 CTGF로 이루어진 군으로부터 선택된 하나 이상의 MASC- YAP 시그니쳐 마커의 활성화 억제여부를 측정하는 단계를 포함하는 SRF-YAP 과발현 유선 종양줄기세포 특성의 유방암의 치료제를 스크리닝하는 방법.
  14. MASC- YAP 시그니쳐의 mRNA 발현을 증가시키기 위한 성분, 또는 MASC- YAP 시그니쳐 단백질을 유효 성분으로 포함하는 SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 치료용 약학적 조성물.
  15. 제1항 내지 제7항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유방암은, 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암인 것인, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단에 관한 정보를 제공하는 방법..
  16. 제8항 내지 제10항 중 어느 한 항에 있어서, 상기 유방암은, 기저양 유방암(Basal-like breast cancer, BLBC) 또는 삼중 음성 유방암인 것인, SRF-YAP 과발현 종양줄기세포 특성의 유방암 진단용 조성물.
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