CN109709335B - 热休克蛋白hspa4在肿瘤转移预测、预后评估和治疗中的应用 - Google Patents

Abstract

本申请涉及热休克蛋白HSPA4在肿瘤转移预测、预后评估和治疗中的应用。具体而言，本申请提供了用于检测热休克蛋白HSPA4水平的物质在制备预测对象中肿瘤转移或肿瘤患者预后评估的产品中的应用，热休克蛋白HSPA4和/或其基因的抑制剂在制备用于治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的药物中的应用，以及相应的产品和药物组合物。本申请具有一定的临床应用前景。

Description

热休克蛋白HSPA4在肿瘤转移预测、预后评估和治疗中的应用

技术领域

本发明涉及生物技术和医学领域，具体涉及热休克蛋白HSPA4与肿瘤转移预测、预后评估以及治疗的相关性及其应用。

背景技术

随着人口增长、衰老及社会经济发展，恶性肿瘤正日益成为全球性的重大健康问题，对经济及社会发展、人民健康都造成极大影响。因此，肿瘤的预防与控制已成为全球卫生防控的重点。根据肿瘤学权威期刊《临床肿瘤杂志》(CA Cancer J Clin) 发布的最新数据，2018年全球预计增加1810万癌症新病例，960万人因癌症死亡。而我国癌症患病率在国际中位于中等偏上水平(Siegel RL等,Cancer statistics,2018. CA Cancer JClin.2018；68(1):7-30.)。

以乳腺癌为例，其是女性中发病率最高的恶性肿瘤。近年来，全球女性乳腺癌的发病率和死亡率呈逐年上升的态势，并且占女性恶性肿瘤发病、死亡的比例也有所增加(Picon-Ruiz M等,Obesity and adverse breast cancer risk and outcome:Mechanistic insights and strategies for intervention.Ca Cancer J Clin,2017,67(5))。根据《临床肿瘤杂志》统计结果，乳腺癌是女性最常见的癌症类型(24.2％)，其还是女性癌症患者的头号杀手(15％)。2014年，全国女性乳腺癌新发病例约27.89万例，占女性恶性肿瘤发病的16.51％，位居女性恶性肿瘤发病的首位。而且，我国乳腺癌的疾病负担依然呈现逐年加重的趋势(李贺等，2014年中国女性乳腺癌发病与死亡分析.中华肿瘤杂志,2018,40(3))。

由于肿瘤是危害人类健康的主要疾病之一，为了有效地治疗和预防肿瘤，目前已越来越关注肿瘤的早期诊断和预后评估。

肿瘤转移是恶性肿瘤的重要特征，也是肿瘤致死的主要原因。原位肿瘤发生侵袭，通过血管或淋巴管迁移至转移靶器官定居与克隆形成，引起肿瘤转移。肿瘤的转移是多因素、多基因相互调控以及与外界环境相互作用的多阶段过程，是肿瘤学研究的重点内容(Hanahan D,Weinberg RA.Hallmarks of cancer:the next generation. Cell 2011,144(5):646-674)。恶性肿瘤可以发生全身多处转移，其中淋巴结转移是最常见的转移部位，其是判断肿瘤分期及患者预后的重要指标。尤其是乳腺癌，容易发生引流淋巴结(如腋下)的转移，其与乳腺癌复发及远端转移密切相关，也是指导后期治疗的重要判断依据。对肿瘤转移机制的研究，将有助于我们深入了解肿瘤转移的本质，为探寻能应用于临床诊断和治疗的靶标提供帮助。

目前，用临床指标(如TNM分级)和单个分子指标(如HER2)预测肿瘤复发转移的研究已经有较长的时间。但是，临床指标或者病理类型相似的患者却有截然不同的临床结局，所以用临床指标或者单独的分子标志来预测或评价患者难以取得满意的效果。对肿瘤实行个体化、预见性的治疗有助于更加深入理解临床病理学特征，改善对患者的临床处理，从而提高肿瘤患者的无瘤生存期及绝对生存期。确定肿瘤发展过程中的相关基因及其参与肿瘤发病机理，可为肿瘤个体化预见性治疗提供基础，也为新的治疗方案提供靶点，从而有利于提高肿瘤的治愈率。

热休克蛋白(Heat shock proteins，HSPs)是一种应激蛋白，是细胞在氧化应激、缺氧和热应激等环境刺激下产生的一种功能高度保守的蛋白质，广泛存在于原核及真核生物中。热休克蛋白可以作为分子伴侣，协助蛋白质的正确折叠，保护细胞适应外界环境的刺激，参与到细胞的生长、代谢及信号转导等过程中。根据其相对分子大小，HSP可分为六个家族，即HSP27家族、HSP40家族、HSP60家族、HSP70 家族、HSP90家族和其他HSP家族(HSP110和GRP170)(Chatterjee S等，Targeting Heat Shock Proteins in Cancer:A PromisingTherapeutic Approach.Int J Mol Sci. 2017；18(9))。

研究发现HSP在多种肿瘤组织中高表达，并发挥了重要功能。HSP能够通过促进肿瘤细胞增殖、侵袭以及抑制肿瘤细胞凋亡而促进肿瘤的发生发展。多种HSP 被应用于肿瘤的预后判断及作为肿瘤治疗的靶标。例如，HSP70参与多种肿瘤发生发展，与胆管癌、软骨肉瘤、黑色素瘤、结肠、膀胱等肿瘤的预后差密切相关(Court K A等，HSP70inhibitionsynergistically enhances the effects of magnetic fluid hyperthermia inovarian cancer.Mol Cancer Ther.,2017,16(5))。HSP90在多种肿瘤类型中高表达，其高表达与肺癌、食管癌、膀胱癌、黑色素瘤和白血病的预后不良有关，目前多种HSP90抑制剂应用于临床肿瘤研究中(Isaacs J S，Hsp90as a "Chaperone"of the Epigenome:Insightsand Opportunities for Cancer Therapy.Adv Cancer Res.,2016,129:107-140)。

相对于其他热休克蛋白，HSPA4在肿瘤中的研究较少。有报道显示，胃肠道肿瘤高表达突变的HSPA4(Jo YS等，Frameshift Mutations of HSPA4and MED13in Gastric andColorectal Cancers.Pathol Oncol Res.2016；22(4):769-72)。然而，HSPA4 参与肿瘤发生发展的机制和关联尚不清楚，其与肿瘤发生发展的相关性有待于进一步阐明。

目前，国内外尚无有关热休克蛋白HSPA4与肿瘤转移及预后相关性和治疗的研究报道。而本领域迫切需要寻找到可有效用于肿瘤诊断、肿瘤治疗方案选择、肿瘤预后评估的重要靶标分子，并将其用于这些用途中。

发明内容

本文正是提供了一种可用于肿瘤诊断、肿瘤治疗方案选择、肿瘤预后评估的新途径。

在本文的第一方面中，提供了一种用于检测热休克蛋白HSPA4水平的物质在制备在对象中预测肿瘤转移、对肿瘤预后评估或诊断肿瘤的产品中的应用。

在一些实施方式中，所述检测针对罹患或疑似罹患肿瘤或具有患肿瘤风险或曾罹患肿瘤但已治愈的哺乳动物或获自所述哺乳动物的样品进行。

在一些实施方式中，所述哺乳动物选自：灵长类动物、啮齿类动物、畜牧类哺乳动物、哺乳动物宠物等，例如人、猿、猩猩、猴、牛、羊、马、骆驼、猪、狗、猫、兔、鼠等。

在一些实施方式中，所述哺乳动物已采用本领域已知的方式鉴定为罹患肿瘤或已治愈肿瘤。

在一些实施方式中，所述样品选自获自所述哺乳动物的：组织或细胞样品，如乳腺组织或细胞样品、癌组织或细胞样品、癌旁组织或细胞样品。

在一些实施方式中，所述样品是新鲜样品、冻存样品、固定样品(例如福尔马林固定样品)、包埋样品(例如石蜡包埋样品)。

在一些实施方式中，所述用于检测热休克蛋白HSPA4水平的物质是用于在基因水平和/或蛋白质水平上检测热休克蛋白HSPA4的物质。

在一些实施方式中，所述物质是用于选自下组的一种或多种检测技术或方法中的物质：免疫组织化学法(如免疫荧光分析、ELISA、免疫胶体金法)、Western印迹法、Northern印迹法、PCR、生物芯片法。

在一些实施方式中，所述物质选自对HSPA4具有特异性的物质，例如抗HSPA4 抗体或其抗原结合片段，优选单克隆抗体；HSPA4特异性的探针、基因芯片、PCR 引物、gRNA等。

在一些实施方式中，所述物质带有可检测标记物，例如，所述选自下组的可检测标记物：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、或配体(如，生物素或半抗原)。

在一些实施方式中，所述肿瘤选自：肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肾癌、肠癌、头部颈部癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌。

在一些实施方式中，所述肿瘤为乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌。

在一些实施方式中，所述肿瘤为乳腺癌。

在一些实施方式中，乳腺癌选自如下分型：浸润性导管癌、非侵润性导管癌；或者，管腔A型、管腔B型、管腔-HER2型、HER2过表达型、基底细胞样型、 TNP-非基底型；或者，激素受体阳性型、HER2/neu受体阳性型、三阴性型。

在一些实施方式中，与正常对照值相比，所述对象或获自所述对象的样品中热休克蛋白HSPA4水平提高，表明所述对象易于或已发生癌症转移，或表明所述对象的癌症预后不良，或表明所述对象已患有癌症。

在一些实施方式中，所述正常对照值获自未罹患肿瘤对象的样品、获自所述对象正常组织的样品、正常对象的HSPA4水平。

在一些实施方式中，所述正常对照值为：由非肿瘤的正常生物样品(如获自健康人或待测对象正常组织的样品)中测得的HSPA4分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。

在一些实施方式中，所述产品为检测试剂盒。

在一些实施方式中，所述检测试剂盒还包含选自下组的一种或多种物质：容器、缓冲剂、助剂、溶剂、阴性对照物、阳性对照物、使用说明书。

在一个实施方式中，所述的检测试剂盒是基于免疫酶标法的免疫组织化学方法检测生物样品中HSPA4表达的试剂盒，其中包含：封闭液(如10％山羊血清)、抗 HSPA4抗体(例如兔抗人或小鼠HSPA4单克隆抗体)、二抗(如抗兔生物素化二抗)、标记的结合物(如HRP标记链亲和素)、底物缓冲液(如DAB底物缓冲液)、显色液(如 DAB显色液)和/或底物溶液。

在本申请的一个方面中，还提供了用于在对象中预测肿瘤转移、对肿瘤预后评估或诊断肿瘤的方法，所述方法包括：检测对象或获自对象的样品中热休克蛋白 HSPA4的水平的步骤。

在一些实施方式中，与正常对照相比，所述对象或获自所述对象的样品中热休克蛋白HSPA4水平提高，表明所述对象易于或已发生肿瘤转移，或表明所述对象的肿瘤患者预后不良，或表明所述对象已患有癌症。

在一些实施方式中，本申请方法所涉及的各特征如前述应用中所限定或阐述。

在本申请的一个方面中，提供了抑制热休克蛋白HSPA4和/或其基因的抑制剂在制备用于治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的药物中的应用。

在一些实施方式中，所述抑制剂选自：与热休克蛋白HSPA4直接结合的抑制剂、阻断热休克蛋白HSPA4与其受体或配体结合的抑制剂、降低热休克蛋白HSPA4 mRNA表达水平的抑制剂、降低热休克蛋白HSPA4蛋白水平的抑制剂、促进热休克蛋白HSPA4蛋白降解的抑制剂、用于敲除或敲减热休克蛋白HSPA4表达的物质，例如能够下调热休克蛋白HSPA4基因mRNA和蛋白表达水平的相关启动子元件、重组质粒、表达载体和相关抗体。

在一些实施方式中，所述抑制剂选自：抗HSPA4抗体(优选单克隆抗体)、抗 HSPA4受体的抗体(优选单克隆抗体)、针对HSPA4的CRISPR/Cas9系统、针对 HSPA4的干扰RNA、针对HSPA4的反义寡核苷酸、HAPA4表达或功能抑制化合物。

在一些实施方式中，所述针对HSPA4的CRISPR/Cas9系统包含：表达有Cas9 酶的载体pCD513B-Cas9和表达有guide RNA(gRNA)的载体psk-U6-sgRNA；表达针对HSPA4基因不同位点选取的gRNA序列，优选为具有选自SEQ ID NO：1-4 中任一项所示的gRNA。

在一些实施方式中，所述药物包含：(a)热休克蛋白HSPA4和/或其基因的抑制剂；和(b)药学上或保健品学可接受的载剂。

在一些实施方式中，所述药物还包含其他抗肿瘤物质，例如DNA损伤类化疗药、多靶向酪氨酸激酶抑制剂、细胞增殖抑制剂、血管增生抑制剂、烷化剂、抗代谢物质、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌物质、激素或免疫抑制剂。

在一些实施方式中，所述药物为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液、溶液剂或糖浆剂)形式。

在一些实施方式中，所述药物的形式适于口服、胃肠外(如静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、真皮内或皮下给药)、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、瘤内、局部给药。

在本文的一个方面中，提供了一种筛选治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的候选药物的方法，所述方法包括测试所述候选药物对对象或获自对象的样品中热休克蛋白HSPA4水平的影响，其中，在使用所述候选药物后，热休克蛋白HSPA4水平降低表明所述候选药物具有治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/ 或改善肿瘤预后的效果。

在一些实施方式中，所述降低相对于获自未罹患肿瘤对象的样品、获自所述对象正常组织的样品、正常对象的HSPA4水平。在一些实施方式中，所述降低相对于正常对照值而言，所述正常对照值为：由非肿瘤的正常生物样品(如获自健康人或待测对象正常组织的样品)中测得的HSPA4分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。

在一些实施方式中，本申请候选药物筛选方法所涉及的各特征如前述应用中所限定或阐述。

在本申请的另一方面中，提供了一种用于预测肿瘤转移、对肿瘤预后评估或诊断肿瘤的产品，其包含：用于检测热休克蛋白HSPA4水平的物质，以及可选的用于预测肿瘤转移、对肿瘤预后评估或诊断肿瘤的其他物质，例如现有肿瘤标志物的检测物质。该产品中所用物质以及产品的性能等所涉及的特征可如本文中所限定或阐述。

在本申请的另一方面中，还提供了一种药物组合物，其包含：作为治疗活性物质的抑制热休克蛋白HSPA4和/或其基因的抑制剂；以及药学上可接受的载体。该药物组合物中的活性物质以及性能等所涉及的特征可如本文中所限定或阐述。

在本申请的另一方面中，还提供了一种在对象中治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的方法，所述方法包括：给予所述对象热休克蛋白HSPA4和 /或其基因的抑制剂或包含所述抑制剂的药物。

本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。

附图说明

下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。

图1：PCR法检测HSPA4在肿瘤中的表达。

所选取的肿瘤为乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌，对照为各自肿瘤的癌旁组织。Unpaired Student’s t-tests。

图2：乳腺癌肿瘤组织中HSPA4分子的表达与患者预后的相关性分析：

A：乳腺癌组织中HSPA4表达的免疫组化图；

B：为乳腺癌组织中HSPA4表达与患者无病生存时间(PFS)的Kaplan-Meier生存曲线；

C：乳腺癌组织中HSPA4表达与患者总体生存时间(OS)的Kaplan-Meier生存曲线。

图3：人和小鼠乳腺癌HSPA4的敲除以及敲除对肿瘤淋巴结转移及肿瘤生长的影响：

利用CRISPR/Cas9技术敲除人和小鼠乳腺癌HSPA4，并对小鼠乳腺原位接种肿瘤后，比较小鼠肿瘤大小及淋巴结转移数量。其中：

A：CRISPR/Cas9质粒图谱；

B：利用CRISPR/Cas9技术敲除人乳腺癌HSPA4前后免疫印迹法检测肿瘤细胞HSPA4的表达；

C：利用CRISPR/Cas9技术敲除小鼠乳腺癌HSPA4前后免疫印迹法检测肿瘤细胞HSPA4的表达；

D：HSPA4敲除(KO)的小鼠乳腺癌细胞及对照细胞(WT)接种后转移的淋巴结数量的比较；

E：HSPA4敲除(KO)的小鼠乳腺癌细胞及对照细胞(WT)接种后肿瘤大小的比较。

图中，KO1、KO2分别表示利用SEQ ID NO：1和2的gRNA构建的HSPA4 敲除(KO)的人乳腺癌细胞；KO3、KO4分别表示利用SEQ ID No：3和4的gRNA 构建的HSPA4敲除(KO)的小鼠乳腺癌细胞。

具体实施方式

本发明的目的之一在于寻找到可有效用于肿瘤转移预测以及患者预后评估的分子并提供相应的检测产品。本发明的另一目的在于提供有效治疗肿瘤的靶标、药物及方法。

我们在研究中发现，HSPA4在多种肿瘤(乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌)中高表达。以乳腺癌为例，乳腺癌患者的肿瘤组织中热休克蛋白HSPA4(heat shock protein familyA member 4)分子的表达与患者淋巴结转移相关，并与肿瘤大小、分期密切相关，其高表达与患者的总生存时间短、预后差显著相关。敲除小鼠乳腺癌细胞HSPA4分子，能够显著抑制肿瘤生长及转移。由此本申请提供了HSPA4分子在用于对象中肿瘤转移预测以及肿瘤预后评估中的新用途，并提供了相应的检测试剂盒。以上进展提示热休克蛋白HSPA4的检测及干预治疗方法有望成为肿瘤诊断及治疗新的增长点。

本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。

如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。

热休克蛋白HSPA4及其检测物质

如本文所用，术语“HSPA4蛋白或多肽”与“HSPA4基因编码的蛋白质或多肽”可互换使用，均是指由HSPA4基因编码的蛋白质或多肽、它们的保守性变异多肽、或其同源蛋白或多肽、或其活性片段(例如HSPA4结合结构域)。HSPA4蛋白在本领域中是已知热休克蛋白家族成员，例如人HSPA4的序列可如Gene ID: 3308所示；小鼠HSPA4序列可如Gene ID:15525所示。

如本文所用，术语HSPA4“检测物质”、“检测试剂”或“检测HSPA4分子的试剂”或“检测HSPA4表达量的试剂”可互换使用，均是指特异性针对HSPA4 分子，且可用于直接或间接检测出HSPA4分子的存在和/或含量的物质。这些检测物质可在基因水平或蛋白质水平上检测HSPA4。

由于HSPA4分子的序列在本领域中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得特异性针对HSPA4分子的试剂。例如，本发明中可用的检测试剂包括但不限于：对HSPA4分子具有检测特异性的抗体。

并且，为了便于检测，本发明的检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)等。

本发明的检测试剂可存在于溶液中、固定于载体(如基片、吸附物)上或以其它本领域中常规的方式存在，只要该存在方式适于对生物样品中HSPA4检测即可。例如，当本发明的检测试剂为核苷酸探针时，其可以生物芯片(或称“微阵列”)的形式存在。

检测产品

本申请中还提供了一种用于预测肿瘤转移、对肿瘤预后评估或诊断肿瘤的产品，其包含：用于检测热休克蛋白HSPA4水平的物质，以及可任选的，用于预测肿瘤转移、对肿瘤预后评估或诊断肿瘤的其他物质，例如现有肿瘤标志物的检测物质。

根据所用检测方法的需要，可选择适当的HSPA4检测物质，并将其制成适于所用检测方法的产品，如试剂盒。本领域普通技术人员可根据实际条件和需要对检测方式和产品中所含试剂进行调整和改变。

由此，本文中还提供了一种产品(如检测试剂盒)，其包含：(i)检测有效量的用于检测HSPA4的一种或多种试剂；(ii)可任选地，选自下组的一种或多种物质：容器、使用说明书、阳性对照物、阴性对照物、缓冲剂、助剂或溶剂，例如用于混悬或固定细胞的溶液，可检测的标签或标记，使核酸易于杂交的溶液，用于裂解细胞的溶液，或用于核酸纯化的溶液。

在一个示例中，本文提供了一种适于通过免疫组织化学方法检测生物样品中HSPA4的表达的检测试剂盒。该检测试剂盒可包含：封闭液，例如10％山羊血清；一抗，例如兔抗人或小鼠HSPA4单克隆抗体；二抗，例如标记(如HRP标记的)或未标记的羊抗兔二抗；底物缓冲液，例如DAB底物缓冲液；显色液；以及可选的装有上述试剂的容器及使用说明书。

本文的检测试剂盒中还可附有试剂盒的使用说明书，其中记载了如何采用试剂盒进行检测，以及如何利用检测结果对肿瘤转移及预后情况进行判断、对治疗方案进行选择。

当然，试剂盒还可包含临床上用于对象中肿瘤发展的判断、治疗方案的选择和/或预后评估的其它试剂，以辅助或验证通过检测HSPA4所得到的结果。本领域普通技术人员可根据具体需要进行常规选择。

HSPA4在肿瘤转移预测、预后评估、诊断以及药物筛选中的应用

根据本申请中所公开的内容，HSPA4的水平与肿瘤的转移、预后和诊断密切相关，从而可作为肿瘤转移预测、预后评估以及诊断的指标。

如本文所用，术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，其包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)。本文中所述的预后不良包括但不限于：生存期缩短、易发肿瘤转移、肿瘤数量增加快、肿瘤变大加快、TNM分级上升等。在预测了患者预后情况后，可结合降低HSPA4 分子的量的治疗方法改善患者的预后。

通常，可采用如下方法进行肿瘤转移预测、预后评估和/或诊断：检测待测对象或获自该对象的样品中HSPA4分子的水平，并将该水平与对照水平相比较；若比较结果显示对象中的HSPA4分子的水平高于对照水平，则提示所述对象易发生肿瘤转移、预后不良、或已罹患癌症。在一些实施方式中，本申请的方法还可选地包括：从对象获得待测样品；使待测样品与检测HSPA4水平的试剂或试剂盒接触。

如本文所用，术语“正常对照”是指用作参照的HSPA4分子的水平，其包括但不限于：由同一对象的非肿瘤正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的HSPA4分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。

此外，本文还提供了一种筛选治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的候选药物的方法，所述方法包括测试所述候选药物对对象或获自对象的样品中热休克蛋白HSPA4水平的影响，其中，在使用所述候选药物后，热休克蛋白 HSPA4水平降低表明所述候选药物具有治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的效果。本申请候选药物筛选方法所涉及的各特征可如本文中所限定或阐述。在一些实施方式中，候选药物为热休克蛋白HSPA4的抑制剂。

热休克蛋白HSPA4的抑制剂

如本文所用，术语HSPA4“抑制剂”和/或“活性物质”以其最广义使用，其包括拮抗剂、阻断剂等，是对HSPA4起到负调节作用的物质。术语“拮抗剂”是指通过空间位阻、构型改变或其它生物化学机制以干扰一种分子与另一种分子的结合或干扰另一种细胞对一种细胞的刺激的特性的物质(如分子、化合物或药物)，例如通过不同受体产生相反效应的功能性拮抗或生理性拮抗、通过与激动剂竞争性结合、与受体相关的中间体结合等方式。术语“阻断剂”是指部分或全部阻止或抑制某一作用的物质。术语“拮抗剂”和“阻断剂”不局限于具体的作用机制，而是泛泛地指本文所述的功能特性。

本申请中HSPA4的抑制剂可包括，但不限于：天然提取物；抗HSPA4、抗HSPA4受体的抗体或抗HSPA4与其受体结合的抗体；HSPA4基因转录、翻译和/ 或表达的抑制剂(如siRNA、反义寡核苷酸、CRISPR-Cas系统)；HSPA4结合和/ 或功能抑制剂等(如与HSPA4竞争性结合其受体的结合抑制剂)；其他对HSPA4信号途径成员具有抑制活性的化学物质。

在一些实施方式中，HSPA4信号途径的抑制剂可为抗体或其活性片段，例如单克隆抗体、多克隆抗体、人源化抗体、人抗体、嵌合抗体、抗体活性片段(如Fv、 Fab、Fab'、F(ab')₂)。所述抗体可通过本领域中已知的方法获得，例如可参考Harlow 和Lane，《抗体：实验室手册》(Antibodies:A Laboratory Manual)，冷泉港实验室(Cold Spring HarborLaboratory)(1988))等。优选采用单克隆抗体，其制备可采用最先由 Kohler等(Nature，256：495(1975))描述的杂交瘤方法或重组DNA法完成。

本申请的抑制剂能发挥显著抑制肿瘤细胞生长及转移、改善肿瘤对象的预后，由此可作为肿瘤治疗的有效药物。并且，本申请还为肿瘤治疗提供了一种新的靶标，即HSPA4靶标。

包含HSPA4抑制剂的药物组合物

本文中还提供了一种药物组合物(或称药物)，其中含有有效量的HSPA4抑制剂作为活性物质或主要活性物质之一。

在一些实施方式中，本申请的药物可用于治疗与HSPA4过表达或功能异常相关的疾病、病症或体征。例如与HSPA4过表达或功能异常相关的癌症，尤其是乳腺癌。

如本文所用，术语“药学上可接受的“成分是适用于人和/或动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和变态反应)的，即有合理的效益/风险比的物质。如本文所用，术语“有效量“是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的量。

如本文所用，术语“药学上可接受的载体“指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。该术语指这样一些药剂载体：它们本身并不是必要的活性成分，且施用后没有过分的毒性。合适的载体是本领域普通技术人员所熟知的。在《雷明顿药物科学》(Remington’s Pharmaceutical Sciences，Mack Pub.Co.，N.J.1991)中可找到关于药学上可接受的赋形剂的充分讨论。

本申请的药物可含有液体，如水、盐水、甘油和乙醇等载剂。另外，这些载体中还可能存在辅助性的物质，如填充剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、泡腾剂、润湿剂或乳化剂、矫味剂、pH缓冲物质等。通常，可将这些物质配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为 6-8。

如本文所用，术语“单位剂型“是指为了服用方便，将产品制备成单次服用所需的剂型，包括但不限于各种固体剂(如片剂)、液体剂、胶囊剂、缓释剂。

在一些实施方式中，每天施用1～6剂本文所述的产品，如施用1～3剂。

应理解，所用活性物质(即HSPA4抑制剂)的有效剂量可随待施用或治疗的对象的情况而变化。具体情况根据对象的个体情况(例如对象体重、年龄、身体状况、所需达到的效果)来决定，这在熟练专业人员(如医师)可以判断的范围内。

本文所述的药物可以为固态(如颗粒剂、片剂、冻干粉、栓剂、胶囊、舌下含片)或液态(如口服液)或其它合适的形状。给予途径可采用本领域常规的方式，例如口服、胃肠外(如静脉内、动脉内、腹膜内、肌肉内、真皮内或皮下给药)、皮下、腹膜内、肺内、鼻内、瘤内、局部给予。

此外，本文所述的产品在作为药物或药物组合物时还可含有用于改善和治疗癌症的其他活性物质，例如DNA损伤类化疗药、多靶向酪氨酸激酶抑制剂、细胞增殖抑制剂、血管增生抑制剂、烷化剂、抗代谢物质、抗肿瘤抗生素、植物类抗癌物质、激素或免疫抑制剂等。

本文所述的HSPA4抑制剂相互间可以联合应用，还可以与其它药物和治疗手段联合，用于癌症的治疗。

实施例

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。

下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。

除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。

实施例1：检测试剂盒的制备

按如下组成制备检测试剂盒，该试剂盒适于以免疫组织化学方法检测生物样品中HSPA4的表达：

试剂a：封闭液，为10％山羊血清(购自北京中杉金桥公司，货号ZLI-9022)1 瓶，即用型；

试剂b：兔抗人或小鼠HSPA4单克隆抗体1支(购自美国abcam公司，货号ab185962)，200×浓溶液；

试剂c：HRP标记羊抗兔二抗(购自北京中杉金桥公司，货号ZB-2301)1瓶，即用型；

试剂d：DAB底物缓冲液及显色液(购自北京中杉金桥公司，货号ZLI-9019) 各1支，20×浓溶液；

以及装有上述试剂的容器及使用说明书。

实施例2：HSPA4在人肿瘤组织中的表达

选取人肿瘤样本(乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌)，对照为各自肿瘤的癌旁组织，以上肿瘤样本和对照均获自上海长海医院。采用TRIzol(美国Invitrogen公司) 抽提组织总RNA，qRT-PCR检测在LightCycler1.5(Roche公司)实时定量PCR仪上完成。

HSPA4定量PCR引物：

5'-GCATCGAGACTATCGCTAATGAG-3'(上游，SEQ ID NO：5)；

5'-TGCAAGGTTAGATTTTTCTGCCT-3'(下游，SEQ ID NO：6)。

GAPDH定量PCR引物：

5'-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3'(上游，SEQ ID NO：7)；

5'-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3'(下游，SEQ ID NO：8)。

miRNA的相对定量使用2^-ΔΔCt法计算(GAPDH为内参)【Livak，KJ.等， Analysis ofrelative gene expression data using real-time quantitative PCR and the 2^{-ΔΔ Ct}method.Methods.2001；25：402-408】。

qRT-PCR分析结果发现，与癌旁非肿瘤组织相比，HSPA4在多种肿瘤样本(乳腺癌、肺癌、胰腺癌、结肠癌)中均高表达(图1)。

实施例3：乳腺癌组织中HSPA4表达与乳腺癌患者临床因素的相关性

选取2004年至2005年233例女性乳腺癌患者(组织切片来自天津肿瘤医院)，其肿瘤类型均为浸润性导管癌(IDC)，患者在手术前未接受化疗及放疗(患者信息见表1)。所有患者均签署知情同意书。

采用免疫组化方法，利用实施例1中的试剂盒针对该233例乳腺癌肿瘤组织中HSPA4蛋白的表达进行了染色(图2A)，分析HSPA4表达与乳腺癌患者临床因素的相关性。P值使用SPSS 17.0中的Chi-square tests。

免疫组化评分标准：评分由两位经验丰富的临床病理医生独立进行，取平均值。采用乘法快速评分法(multiplicative quickscore method，QS)评估HSPA4蛋白的表达。这个评分系统同时评估了细胞染色的强度和范围。首先对阳性细胞比例进行估计，并按1-6级给予评分(1＝1-4％、2＝5-19％、3＝20-39％、4＝40-59％、5＝60-79％、 6＝80-100％)。阳性染色细胞的平均强度评分为0-3级(0＝阴性；1＝弱表达，2＝中表达，3＝强表达)。然后将百分比分数乘以强度分数来计算QS，从而得到评分 (0<QS<18)。根据QS，HSPA4表达分级为低(0-9)或高(10-18)。

表1.患者基本信息

表2.乳腺癌HSPA4表达与乳腺癌患者临床因素的相关分析

结果表明：HSPA4表达与肿瘤增殖、分子分型及TNM分期相关(P值<0.05)，即肿瘤组织HSPA4表达越高，其增殖(Ki-67⁺细胞数)越多，肿瘤的TNM分期越高 (表2)；同时，肿瘤组织中高表达HSPA的患者其淋巴结转移相较于低表达HSPA4 的患者显著增多(表2)。此外，HSPA4表达也与乳腺癌分子分型相关，基底细胞样型中HSPA4高表达的比例多于管腔A型及管腔B型。

实施例4：乳腺癌组织中HSPA4分子的表达与患者预后的相关性分析

对该233例乳腺癌患者，采用免疫组化方法，利用实施例1中的试剂盒针对该 233例乳腺癌肿瘤组织中HSPA4蛋白进行了染色(图2A)，分析HSPA4表达与患者无病生存时间(PFS)及总生存率(OS)的相关性。

结果显示，肿瘤组织中高表达HSPA的患者的无病生存时间(PFS)及总生存率 (OS)相对于低表达HSPA4的患者显著降低(图2B和2C)。

以上结果提示，肿瘤组织中HSPA4的表达是一个显著独立的预测乳腺癌患者总体生存时间的危险因素。

实施例5：CRISPR/Cas9技术敲除人和小鼠乳腺癌HSPA4以及敲除对肿瘤淋巴结转移及肿瘤生长的影响

小鼠乳腺癌细胞系4T1和人乳腺癌细胞系MBA-MD-231(购自美国ATCC)购自美国ATCC(DMEM培养基+10％胎牛血清)。Balb/c小鼠购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司，在SPF级环境中饲养。

小鼠乳腺癌模型的建立：在小鼠(雌性，8周龄)右下腹部乳腺脂肪垫下注射5 ×10⁵个/只乳腺癌细胞系4T1细胞，观察小鼠淋巴结转移及肿瘤生长情况。

CRISPR-Cas9技术敲除肿瘤细胞HSPA4：利用的CRISPR-Cas9系统由Cas9 酶表达质粒pCD513B-Cas9和靶标质粒psk-U6-sgRNA构成(质粒图谱见图3A)。利用MIT CRISPRDesign在线软件进行靶向HSPA4的sgRNA设计，合成sgRNA后构建三个HSPA4-KO靶标载体。用Cas9表达质粒及靶向HSPA4的靶标质粒转染 4T1细胞，转染后24小时，加入嘌呤霉素药筛。48小时后，将存活的细胞传入10 cm细胞培养皿中培养，挑取克隆鉴定。所用gRNA序列如下所示：

针对人HSPA4的gRNA：

SEQ ID NO:1:5’-GGTCCTAAGAATCGTTCAAT-3’

SEQ ID NO:2:5’-TGGCCGAGCATTCTCTGATC-3’

针对小鼠HSPA4的gRNA：

SEQ ID NO:3:5’-GCTCCAATTGAACGATTCTT-3’

SEQ ID NO:4:5’-GATTTTTCTGCTTCCACAAA-3’

提取细胞克隆的基因组，在各靶标位置上下游约300bp处设计引物(上游： 5’-TTATGACATCTCCTTACATAGCCCT-3’(SEQ ID NO：9)；下游： 5’-CAGAGGATCCAATATCTTCTTCTGA-3’(SEQ ID NO：10))，进行片段扩增测序，将其与野生型DNA片段进行比对，进一步利用Western印迹法进行鉴定，无HSPA4 表达者即为敲除细胞系。

我们成功的利用CRISPR/Cas9技术敲除了人和小鼠乳腺癌HSPA4(图3B和3C)。进一步利用小鼠4T1乳腺癌模型发现，HSPA4敲除肿瘤的荷瘤小鼠淋巴结转移较正常对照小鼠明显减少，肿瘤大小亦显著减小(图3D和3E)。

上述结果表明：乳腺癌HSPA4的表达与肿瘤大小及淋巴结转移密切相关，且其高表达与患者较差的预后显著相关，该结果提示了乳腺癌HSPA4参与调控了肿瘤的生长及转移，并最终影响了乳腺癌患者的预后，由此可作为预测肿瘤转移或肿瘤预后评估的标志物。

并且，在乳腺癌中抑制或消除HSPA4的表达可明显减少乳腺癌的转移和肿瘤的大小，由此提供了乳腺癌治疗的新靶点和新途径，即以HSPA4为靶点对其进行抑制或消除。而HSPA4的抑制剂也可用作乳腺癌治疗(尤其是防止或抑制乳腺转移) 的有效药物。

在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

附：序列相关信息

序列表

<110> 中国医学科学院基础医学研究所

<120> 热休克蛋白HSPA4在肿瘤转移预测、预后评估和治疗中的应用

<130> 18A404 1CNCN

<160> 10

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 1

ggccaagaac gcaa 14

<210> 2

<211> 14

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 2

ggccgagcac cgac 14

<210> 3

<211> 13

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 3

gcccaagaac gac 13

<210> 4

<211> 12

<212> RNA

<213> 人工序列

<400> 4

gacgcccaca aa 12

<210> 5

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 5

gcatcgagac tatcgctaat gag 23

<210> 6

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 6

tgcaaggtta gatttttctg cct 23

<210> 7

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 7

ggagcgagat ccctccaaaa t 21

<210> 8

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 8

ggctgttgtc atacttctca tgg 23

<210> 9

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 9

ttatgacatc tccttacata gccct 25

<210> 10

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列

<400> 10

cagaggatcc aatatcttct tctga 25

Claims (9)

1.抑制热休克蛋白HSPA4基因的抑制剂在制备用于治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的药物中的应用，其中，所述肿瘤为乳腺癌，且其中，所述抑制剂为降低热休克蛋白HSPA4 mRNA表达水平的抑制剂。

2.如权利要求1所述的应用，其中，所述抑制剂为用于敲除或敲减热休克蛋白HSPA4表达的物质。

3.如权利要求1所述的应用，其中，所述抑制剂选自：用于下调热休克蛋白HSPA4基因mRNA表达水平的相关启动子元件、重组质粒和表达载体。

4.如权利要求1所述的应用，其中，所述抑制剂选自：针对HSPA4的CRISPR/Cas9系统、针对HSPA4的干扰RNA和针对HSPA4的反义寡核苷酸。

5.一种筛选治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的候选药物的方法，所述方法包括测试所述候选药物对对象或获自对象的样品中热休克蛋白HSPA4水平的影响，其中，在使用所述候选药物后，热休克蛋白HSPA4水平降低表明所述候选药物具有治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的效果，其中，所述肿瘤为乳腺癌。

6.一种用于治疗肿瘤、缓解或防止肿瘤转移和/或改善肿瘤预后的药物组合物，其中所述肿瘤为乳腺癌，所述药物组合物包含：作为治疗活性物质的抑制热休克蛋白HSPA4基因的抑制剂；以及药学上可接受的载体，其中，所述抑制剂为降低热休克蛋白HSPA4 mRNA表达水平的抑制剂。

7.如权利要求6所述的药物组合物，其中，所述抑制剂为用于敲除或敲减热休克蛋白HSPA4表达的物质。

8.如权利要求6所述的药物组合物，其中，所述抑制剂选自：用于下调热休克蛋白HSPA4基因mRNA表达水平的相关启动子元件、重组质粒和表达载体。

9.如权利要求6所述的药物组合物，其中，所述抑制剂选自：针对HSPA4的CRISPR/Cas9系统、针对HSPA4的干扰RNA和针对HSPA4的反义寡核苷酸。

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