CN106191238B - Tlr3预测肿瘤转移、评估预后和选择防治方案的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及TLR3预测肿瘤转移、评估预后和选择防治方案的应用。本发明具体涉及检测生物样品中模式识别受体TLR3的物质在制备用于预测对象中肿瘤转移和/或评估对象肿瘤预后和/或选择肿瘤防治方案的产品中的应用、相应的产品以及方法。本发明提供了模式识别受体TLR3在预测肿瘤转移、肿瘤预后评估以及肿瘤防治方案选择中的应用，并提供了相应的产品和方法，具有一定的临床应用前景。

Description

TLR3预测肿瘤转移、评估预后和选择防治方案的应用
技术领域
本发明涉及生物技术和医学诊断领域，具体涉及模式识别受体TLR3在肿瘤转移预测、预后评估和防治方案选择中的应用。
背景技术
肿瘤是危害人类健康的重大疾病，而肿瘤转移则是导致肿瘤患者死亡的主要原因。肿瘤转移是肿瘤细胞从原发部位经淋巴道、血管或体腔等到达其他部位形成新的肿瘤克隆。目前研究发现，肿瘤的转移不仅与肿瘤细胞本身相关，还与肿瘤所处的微环境密切相关。
肿瘤微环境是由肿瘤细胞以及肿瘤相关细胞组成(主要是宿主细胞)，包括血管内皮细胞、成纤维细胞、周细胞以及一些炎性细胞(Hanahan,D.和Weinberg,R.A.，Hallmarksof cancer:the next generation.Cell.2011；144：646-674)。肿瘤微环境包括肿瘤原位微环境、侵袭微环境以及转移微环境。肿瘤转移前微环境(Pre-metastatic niche)概念的提出为肿瘤转移尤其是转移器官选择性提供了新的理论解释。
转移前微环境是指原发灶的肿瘤能够通过肿瘤来源的分泌物质(Tumor-derivedsecrected factors,TDSFs)动员和募集骨髓来源细胞(Bone marrow-derived cells,BMDCs)到转移靶器官，通过与靶器官中基质细胞及细胞外基质的协同作用，创造了利于肿瘤细胞定居的“土壤”(Kaplan,R.N.等.VEGFR1-positive haematopoietic bone marrowprogenitors initiate the pre-metastatic niche.Nature.2005，438：820-827)。多种BMDCs(VRGFR+骨髓前体细胞、CD11b+髓系细胞等)被证实参与了转移前微环境的形成。因此，检测肿瘤转移前微环境形成的影响因素对于肿瘤转移的预判及判断患者的预后至关重要。
目前，中性粒细胞被证实在转移前微环境中发挥了关键的促进作用。中性粒细胞是天然免疫系统中抵御病原体感染的重要成员，当炎症发生时，它们被迅速趋化至炎症部位，吞噬入侵的病原体和组织碎片，发挥抗感染和创伤修复的作用。在肿瘤转移前微环境中，中性粒细胞被大量募集到预转移器官。这些中性粒细胞发挥着 抑制抗肿瘤免疫、促进肿瘤细胞存活而促进了肿瘤转移前微环境的形成的功能。
目前，中性粒细胞所介导的肿瘤免疫抑制及促肿瘤功能在多种小鼠及临床肿瘤中得到验证(Wculek,S.K.和Malanchi,I.Neutrophils support lung colonization ofmetastasis-initiating breast cancer cells.Nature.2015；528：413-417)。因此，基于中性粒细胞及其影响因素的干预已成为肿瘤治疗新的生长点(Steele C.W.等，CXCR2Inhibition Profoundly Suppresses Metastases and Augments Immunotherapyin Pancreatic Ductal Adenocarcinoma.Cancer Cell.2016；29:832)。
然而，中性粒细胞如何迁移到转移的靶器官而促进转移前微环境形成、转移靶器官如何识别肿瘤来源的刺激信号而募集中性粒细胞，这些问题的解决有利于寻找新的预测肿瘤转移及肿瘤治疗的靶点。
模式识别受体(Pattern recognition receptors，PRRs)是机体识别外源性及内源性危险信号启动免疫应答的主要媒介。目前发现的PRR主要分为三类：TLRs(Toll-likereceptors)；RLHs(RIG-I-like helicases)；NLRs(Nucleotide-oligomerization domain-like receptors)。其中，Toll样受体(Toll-like receptors,TLRs)是最早发现且研究较为深入的一类模式识别受体。细菌或病毒成分如蛋白质、RNA等能够被免疫细胞的TLRs识别，进而活化下游信号途径，促使免疫细胞活化并表达促炎症细胞因子和干扰素，提高细胞的抗病原体能力，发挥清除病原体感染的作用。
TLRs是一种进化上高度保守的胚系编码的I型跨膜蛋白，由胞外区、跨膜区和胞内区组成。目前发现并克隆了十多种哺乳动物的TLRs分子，分别选择识别不同的病原体相关分子模式(Cao,X.,Self-regulation and cross-regulation of pattern-recognitionreceptor signalling in health and disease.Nat.Rev.Immunol.2016；16:35-50)。
TLR3是机体识别双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)的一种Toll样受体，其在抗病毒免疫反应中发挥着很重要的作用。TLR3的特异性配体是双链RNA，病毒在复制和转录过程中可产生大量dsRNA。TLR3和dsRNA结合后，可经由MyD88依赖和非依赖两条途径来诱导NF-κB的激活，促进其转位进入细胞核内和DNA片段结合，启动相应的炎性因子和细胞因子的转录和翻译，如IL-8、IL-12、TNFα、IFNα等，从而引起抗病毒免疫反应，抵抗病毒的进一步感染。
除了感知双链RNA病毒感染，TLR还被报道参与识别了内源性的来自坏死或凋亡细胞的RNA，提示TLR3也参与了坏死诱导的炎症的触发(Cavassani,K.A.等，TLR3is anendogenous sensor of tissue necrosis during acute inflammatory events.J.Exp.Med.2008；205：2609-2621)。
在感染过程中，TLRs促发的炎症信号对于中性粒细胞向感染部位的迁移及趋化至关重要，但目前尚未见报道TLR3影响中性粒细胞在肿瘤内或转移前微环境中的浸润及迁移相关。
在肿瘤研究领域，Toll样受体的功能日益受到关注。肿瘤细胞高表达多种TLRs，其在肿瘤发生发展中发挥着双向调控功能。本领域中已知某些模式识别受体与肿瘤具有一定的相关性，如TLR4信号的活化促使胃癌恶化(X,Yuan等，Activation of TLR4signalingpromotes gastric cancer progression by inducing mitochondrial ROSproduction.Cell Death and Disease.2013；4,e794)，帮助肺癌细胞实现免疫逃逸(Weigang,H.等，TLR4signaling promotes immune escape of human lung cancer cellsby inducing immunosuppressive cytokines and apoptosis resistance.MolecularImmunology.2007；44(11):2850-2859)；TLR3在乳腺癌细胞中发挥促凋亡作用(Salaun B.等，TLR3can directly trigger apoptosis in human cancer cells.J Immunol.2006；176:4894-4901)。
宿主细胞表达的TLRs也日益受到关注，TLRs是宿主促肿瘤发生的慢性炎症的启动因素。宿主TLRs也影响了肿瘤的转移，肿瘤产生的物质能够激活宿主髓系细胞的TLR2而促进肿瘤的肺转移(Kim,S.等,Carcinoma-produced factors activate myeloid cellsthrough TLR2to stimulate metastasis.Nature.2009；457:102-106)；肿瘤分泌的小RNA(microRNAs)能够结合TLR7/8促进肿瘤诱导的相关炎症而促进肿瘤转移(Fabbri,M.等，MicroRNAs bind to Toll-like receptors to induce prometastatic inflammatory response.Proc.Natl.Acad.Sci.USA.2012，109：E2110-2116)。
然而，由于肿瘤转移模型以及研究的靶细胞不同，宿主TLRs在肿瘤转移中功能报道往往不一致，这也提示着不同细胞以及不同肿瘤阶段TLRs功能的多样性。深入研究TLRs在宿主肿瘤微环境中发挥的功能有利于肿瘤治疗靶点的寻找。
由于癌症是危害人类健康的主要疾病之一，为了有效地治疗和预防肿瘤(如肺癌)，目前人们已经越来越关注肿瘤转移及患者预后预判以指导肿瘤的治疗。用临床指标(如TNM分级)和单个分子指标(如NSE)预测肺癌进展、复发转移的研究已经有较长的历史。但是，临床指标或者病理类型相似的患者却有截然不同的临床结局，所以用临床指标或者单独的分子标志来预测或评价患者难以取得满意的效果。对肿瘤实行个体化、预见性的治疗有助于更加深入理解临床病理学特征，改善对患者的临床处理，从而提高肿瘤患者的无瘤生存期及绝对生存期。确定癌症(如肺癌) 发展过程中的肿瘤细胞以及微环境中相关基因及其参与癌症发病机理，可为癌症个体化预见性治疗提供基础，也为新的治疗方案提供靶点，从而有利于提高肺癌的治愈率。
另一方面，肿瘤的发展包括转移不仅与肿瘤细胞本身有关，还与肿瘤所处的微环境(如上述的转移前微环境)密切相关。目前，针对肿瘤微环境中的免疫检查点(PD-1和CTLA4)抗体治疗有效的增强了微环境中T细胞对肿瘤的杀伤功能，成为近年来免疫治疗领域的重大突破(Topalian S.L.等,Immune checkpoint blockade:a common denominatorapproach to cancer therapy.Cancer Cell.2015；27:450)。
此外，针对中性粒细胞及其影响因素的干预已日益受到肿瘤治疗领域研究者的关注，并取得了良好的效果(Steele C.W.等，CXCR2Inhibition Profoundly SuppressesMetastases and Augments Immunotherapy in Pancreatic DuctalAdenocarcinoma.Cancer Cell.2016；29:832)。以上进展提示除了肿瘤细胞本身针对肿瘤微环境重要靶点的检测及干预治疗方法成为肿瘤诊断及治疗新的增长点。
目前，国内外尚无有关宿主模式识别受体TLR3与中性粒细胞迁移及肿瘤转移与预后相关性的研究报道。
而本领域迫切需要寻找到可有效用于肿瘤诊断、肿瘤治疗方案选择、肿瘤预后评估的宿主PRR分子，并将其用于这些用途中。
发明内容
本发明中证明了TLR3与肿瘤转移、预后和防治方案选择具有密切的相关性，由此提供了TLR3检测在肿瘤转移预测、预后评估和防治方案选择中的应用以及相应的产品。
在本发明的一个方面中，提供了检测生物样品中模式识别受体TLR3的物质在制备用于预测对象中肿瘤转移和/或评估对象肿瘤预后和/或选择肿瘤防治方案的产品中的应用。
与此相对应，本发明的另一方面中，还提供了用于预测对象中肿瘤转移和/或评估对象肿瘤预后和/或选择肿瘤防治方案的产品，其包含检测生物样品中模式识别受体TLR3的物质。
与以上方面相对应，本发明的另一方面中，还提供了用于预测对象中肿瘤转移和/或评估对象肿瘤预后和/或选择肿瘤防治方案的方法，所述方法包括采用检测生物样品中模式识别受体TLR3的物质或产品来测定对象的TLR3水平，并根据检测 结果预测对象中肿瘤转移和/或评估对象肿瘤预后和/或选择肿瘤防治方案。所述方法可包括步骤：(a)检测对象生物样本中的模式识别受体TLR3的表达量；(b)将(a)中检测到的模式识别受体TLR3表达量与正常对照值进行比较；(c)得到的检测结果显示生物样品中的TLR3分子的水平高于正常对照的，则提示所述生物样品的对象易发生肿瘤转移、肿瘤预后不良和/或适于采用TLR3抑制剂进行肿瘤防治。
在本发明的一些实施方式中，所述物质是用于检测TLR3的DNA水平、mRNA水平和/或蛋白质水平的物质，例如针对TLR3的抗体、针对TLR3的特异性探针、针对TLR3的基因芯片或蛋白质芯片。
在本发明的一些实施方式中，所述物质是用于通过如下方法中的一种或多种来检测TLR3的物质：免疫组化法、化学发光法、放射性同位素法、荧光发光法(如免疫荧光法)、酶标法、胶体金法、实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印记法原位杂交法、蛋白质印迹法。
在本发明的一些实施方式中，所述物质带有可检测标记物，例如放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)、或它们的任合组合。
在本发明的一些实施方式中，所述TLR3具有Gene ID：7098，或为其同源序列。
在本发明的一些实施方式中，所述生物样品获自所述对象，例如获自哺乳动物，如灵长类动物、啮齿类动物、家畜、宠物等，优选人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴；和/或，所述生物样品选自：新鲜组织或细胞样品、福尔马林固定样品、石蜡包埋样品、血液、体液。
在本发明的一些实施方式中，所述生物样品获自所述对象的非肿瘤组织和/或细胞，优选获自所述对象肿瘤微环境中的非肿瘤组织和/或细胞(如癌旁组织和/或细胞)，例如选自：怀疑发生肿瘤转移的组织和/或细胞、肿瘤转移高风险的组织和/或细胞、已发生肿瘤转移的组织和/或细胞、已建立转移灶的组织和/或细胞或它们的组合，如肺上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞。
在本发明的一些实施方式中，所述肿瘤选自：肺癌(如非小细胞肺癌)、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、肠癌、头部颈部癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌。
在本发明的一些实施方式中，所述生物样品中存在高于对照水平的模式识别受体TLR3指示所述对象已发生或易发生肿瘤转移；和/或，指示所述对象肿瘤预后 不良；和/或，指示所述对象适于采用TLR3抑制剂来防治肿瘤转移和/或改善预后。
在本发明的一些实施方式中，所述对照水平选自：由所述对象非肿瘤的正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的TLR3水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
在本发明的一些实施方式中，所述产品选自：检测试剂盒、检测条、检测卡、检测仪器或它们的任意组合；和/或，所述产品还可包含选自下组的一种或多种物质：容器、缓冲剂、助剂、溶剂、阳性对照物、阴性对照物、使用说明书。
在本发明的一些实施方式中，当所述生物样品中存在高于对照水平的模式识别受体TLR3指示所述对象适于采用TLR3抑制剂来防治肿瘤转移和/或改善预后。所述抑制剂选自：抑制TLR3表达和/或功能的物质，例如抗TLR3的抗体(优选单克隆抗体)、针对TLR3的干扰RNA(siRNA)、针对TLR3的反义寡核苷酸、TLR3表达或功能抑制化合物、用于敲除或敲减TLR3表达的物质。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂为针对TLR3的干扰RNA，例如针对TLR3基因mRNA不同位点选取的siRNA序列，优选为选自如下序列的siRNA：SEQ ID No.:1、SEQ IDNo.:2、SEQ ID No.:3和SEQ ID No.:4。
在本发明的一些实施方式中，所述抑制剂或包含所述抑制剂的药物，可与本领域中已知用于预防和/或治疗对象中肿瘤转移的药物或疗法联用。所述联用包括：同时、依序、分开或单独给予本发明的物质或产品以及其他已知药物或疗法。
本领域的技术人员可对前述的技术方案和技术特征进行任意组合而不脱离本发明的发明构思和保护范围。本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
下面结合附图对本发明作进一步说明，其中这些显示仅为了图示说明本发明的实施方案，而不是为了局限本发明的范围。
图1：肺癌癌旁组织中TLR3分子的表达与肿瘤转移相关因子(S100A8和S100A9)的相关性分析，其中：
图1A为癌旁组织中TLR3、S100A8和S100A9表达的免疫组化图；
图1B为肺癌癌旁组织中TLR3分子的表达与S100A8和S100A9表达的相关性分析(Pearson correlation)。
图2：模式识别受体TLR3分子的表达与中性粒细胞浸润的相关性分析，其中：
图2A为癌旁组织中TLR3、CD66b表达的免疫组化图；
图2B、2C为肺癌癌旁组织中TLR3分子的表达与CD66b阳性细胞数(即中性粒细胞数)的相关性分析(Unpaired Student’s t-tests；***，P<0.001及Pearson correlation)。
图3：肺癌癌旁组织中TLR3表达及中性粒细胞浸润与患者总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线，其中：
图3A为肺癌癌旁组织中TLR3表达与患者总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线；
图3B为中性粒细胞浸润数与患者总体生存时间的Kaplan-Meier生存曲线。
图4：TLR3缺陷抑制中性粒细胞在肺组织中的浸润及肿瘤肺转移。利用小鼠肺癌细胞系LLC皮下接种后自发肺转移的模型，观察TLR3缺陷小鼠与正常对照小鼠肺转移情况及小鼠荷瘤生存率，其中：
图4A为TLR3缺陷小鼠与正常对照小鼠肿瘤肺转移的体外活体成像图及相关统计，Unpaired Student’s t-tests；**，P<0.01；
图4B为TLR3缺陷小鼠与正常对照小鼠荷瘤生存时间Kaplan-Meier生存曲线；
图4C为TLR3缺陷小鼠与正常对照小鼠荷瘤后肺组织中中性粒细胞浸润的流式细胞图及其比例的统计，Unpaired Student’s t-tests；**，P<0.01；***，P<0.001。
图5：肺上皮细胞TLR3缺陷或干扰RNA干扰TLR3表达后中性粒细胞相关趋化因子的表达，其中：
图5A为分选TLR3缺陷小鼠以及正常对照小鼠荷瘤14天后肺上皮细胞，qRT-PCR法检测细胞趋化因子的基因表达；
图5B为利用si-Tlr3l(SEQ ID No.:1)、si-Tlr3 2(SEQ ID No.:2)干扰人肺上皮细胞细胞系A549的TLR3表达，肿瘤培养上清刺激后qRT-PCR法检测细胞趋化因子的基因表达；
图5C为利用si-Tlr3 3(SEQ ID No.:3)、si-Tlr3 4(SEQ ID No.:4)干扰小鼠肺上皮细胞细胞系MLE-12的TLR3表达，肿瘤培养上清刺激后qRT-PCR法检测细胞趋化因子的基因表达。Unpaired Student’s t-tests；**，P<0.01；***，P<0.001。
具体实施方式
本发明人从小鼠肺癌自发肺转移模型中发现，宿主表达的TLR3调控中性粒细胞在肺脏中的募集，从而影响肿瘤肺转移。临床样本研究验证TLR3与中性粒细胞的浸润呈相关性，两者与肿瘤患者的预后密切相关。由此本发明进一步提供了TLR3分子在用于对象中肿瘤转移预测以及肿瘤预后评估中的新用途，并提供了相应的检测试剂盒。
具体而言，本发明揭示了TLR3分子在肿瘤发展判断、肿瘤转移的预测和/或预后评估和/或防治方案选择(例如肿瘤预防和/或治疗方案，尤其是肿瘤转移的预防和/或治疗方案)中的新用途，为Toll样受体乃至其它模式识别受体的研究和开发利用提供了新的思路和途径。本发明的TLR3分子可有效用于肿瘤转移预测以及肿瘤预后评估，从而为本领域提供了一种新颖的肿瘤诊断剂和/或治疗剂，具有一定的临床应用前景。
如本文所用，术语“模式识别受体TLR3”或“Toll样受体3”或“TLR3”可互换使用，且具有本领域中已知的含义。例如，TLR3可为Gene ID:7098所示的序列，或可为其同源序列。TLR3可表达于对象宿主细胞中，例如表达于肺上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞。
如本文所用，术语“宿主细胞”或“非肿瘤细胞”可互换使用，可包括肿瘤微环境中的非肿瘤细胞，例如包括但不限于：怀疑发生肿瘤转移组织中的细胞、肿瘤转移高风险组织中的细胞、已发生肿瘤转移组织中的细胞、已建立转移灶中的细胞或它们的组合，如肺上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞。从另一角度而言，所述非肿瘤细胞选自：肿瘤侵袭微环境中的细胞、转移微环境中的细胞、肿瘤转移前微环境中的细胞或它们的组合。
“肿瘤微环境(tumor microenvironment，TME)”是指肿瘤存在的细胞环境，主要由肿瘤细胞以及肿瘤相关细胞(非肿瘤细胞)组成，其可包括周围血管、血管内皮细胞、成纤维细胞、上皮细胞、炎性细胞、免疫细胞等，肿瘤微环境包括肿瘤原位微环境、侵袭微环境以及转移微环境(可例如参见Hanahan,D.和Weinberg,R.A.，Hallmarks of cancer:the nextgeneration.Cell.2011；144：646-674)。肿瘤与其微环境密切相关并始终存在相互作用。
如本文所用，术语“检测试剂”或“检测TLR3分子的试剂”或“检测生物样品中模式识别受体TLR3表达量的试剂”可互换使用，均是指特异性针对TLR3分子， 且可用于直接或间接检测出TLR3分子的存在和/或含量的试剂。
由于TLR3分子的序列在本领域中是已知的，本领域普通技术人员可基于常规手段制备或通过市售获得特异性针对TLR3分子的试剂。例如，本发明中可用的检测试剂包括但不限于：对TLR3分子具有检测特异性的抗体。
为了便于检测，本发明的检测试剂还可带有可检测标记，所述可检测标记包括但不限于：放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体(如，生物素或半抗原)等。
如本文所用，术语“产品”或“本发明的产品”可互换使用，是指包含检测生物样品中模式识别受体TLR3的物质的、可用于预测对象中肿瘤转移和/或评估对象肿瘤预后和/或选择肿瘤防治方案的产品。本发明的产品包括但不限于：检测试剂盒、检测条、检测卡、检测笔、检测仪器或它们的任意组合。本发明的产品还包含选自下组的一种或多种物质：容器、缓冲剂、助剂、溶剂、阳性对照物、阴性对照物、使用说明书。
本发明的示例性产品可包含如下组成物质，其可用于基于免疫酶标法的免疫组织化学方法检测生物样品中TLR3的表达：
试剂a：封闭液，10％山羊血清；
试剂b：抗人或小鼠TLR3单克隆抗体；
试剂c：抗小鼠生物素化二抗；
试剂d：HRP标记链亲和素；
试剂e：DAB底物缓冲液；
试剂f：DAB显色液；
试剂g：底物溶液。
通常，可利用本发明的产品，采用如下方法进行肿瘤转移预测以及肿瘤预后评估：(a)从对象获得待测样品；(b)使待测样品与本发明产品中的检测物质接触；(c)检测该待测样品中TLR3分子的水平，并将该水平与对照水平相比较；(d)根据检测结果进行肿瘤转移预测、肿瘤预后评估和/或肿瘤防治方案选自：如检测结果显示对象组织中的TLR3分子的水平高于对照水平，则提示所述对象易发生肿瘤转移、肿瘤预后不良和/或适于用TLR3抑制剂进行肿瘤防治。
如本文所用，术语“正常对照”是指用作参照的TLR3分子的水平，其包括但不限于：由同一对象的非肿瘤正常生物样品(例如获自该对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品)中测得的TLR3分子水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标 准化的水平。
如本文所用，术语“预后”是指预测疾病的可能病程和结局，其包括判断疾病的特定后果(如康复，某种症状、体征和并发症等其它异常的出现或消失及死亡)。本发明中所述的预后不良包括但不限于：生存期缩短、易发肿瘤转移、肿瘤数量增加快、肿瘤变大加快、TNM分级上升等。在预测了患者预后情况后，可结合降低TLR3分子表达量的治疗方法改善患者的预后。
如本文所用，术语“对Toll样受体3具有抑制作用的物质”或“TLR3抑制剂”或“本发明的活性物质”可互换使用，均是指可抑制TLR3水平和/或功能的物质。所述抑制可为部分抑制，即降低TLR3水平和/或功能，也可为完全抑制，即完全消除TLR3和/或其功能，所述抑制可为mRNA水平、DNA水平和/或蛋白质水平上的抑制。可用于本发明中的抑制剂包括但不限于，针对TLR3或其编码序列的：抗体(优选单克隆抗体)、siRNA、miRNA、反义寡核苷酸、拮抗剂、阻断剂、化学物质等。可采用本领域中已知的方法获得所述抑制剂或通过市售获得市售抑制剂，例如本领域普通技术人员可通过本领域已知杂交瘤法制备针对TLR3的单克隆抗体，并将其用于本发明中。
本文中提供的所有数值范围旨在清楚地包括落在范围端点之间的所有数值及它们之间的数值范围。可对本发明提到的特征或实施例提到的特征进行组合。本说明书所揭示的所有特征可与任何组合物形式并用，说明书中所揭示的各个特征，可以任何可提供相同、均等或相似目的的替代性特征取代。因此除有特别说明，所揭示的特征仅为均等或相似特征的一般性例子。
如本文所用，“含有”、“具有”或“包括”包括了“包含”、“主要由……构成”、“基本上由……构成”、和“由……构成”；“主要由……构成”、“基本上由……构成”和“由……构成”属于“含有”、“具有”或“包括”的下位概念。
如本文所用，“一”、“一个”或“一种”等表示单数的用语也可根据实际情况表示复数概念。
实施例
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。本领域技术人员可对本发明做出适当的修改、变动，这些修改和变动都在本发明的范围之内。
下列实施例中未注明具体条件的实验方法，可采用本领域中的常规方法，例如 参考《分子克隆实验指南》(第三版，纽约，冷泉港实验室出版社，New York：Cold SpringHarbor Laboratory Press，1989)或按照供应商所建议的条件。DNA的测序方法为本领域常规的方法，也可由商业公司提供测试。
除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。除非另行定义，文中所使用的所有专业与科学用语与本领域熟练人员所熟悉的意义相同。此外，任何与所记载内容相似或均等的方法及材料皆可应用于本发明方法中。文中所述的较佳实施方法与材料仅作示范之用。
实施例1：检测试剂盒的制备
按如下组成制备检测试剂盒，该试剂盒适于以免疫组织化学方法检测生物样品中TLR3的表达：
试剂a:封闭液，为10％山羊血清，1瓶，即用型；
试剂b：抗人或小鼠TLR3单克隆抗体(购自美国abcam公司，目录号ab13915)，一支，200×浓溶液；
试剂c：抗小鼠生物素化二抗(购自北京中杉金桥公司，目录号SP-9002)，1瓶，即用型；
试剂d:HRP标记链亲和素，1瓶，即用型；
试剂e:DAB底物缓冲液，一支，20×浓溶液；
试剂f:DAB显色液，一支，20×浓溶液；
以及装有上述试剂的容器及使用说明书。
实施例2：肺癌癌旁组织中TLR3表达与肺癌患者临床因素的相关性
选取2004年90例肺癌患者(组织切片来自上海芯超生物科技有限公司)，其肺癌组织类型均为非小细胞肺癌(NSCLC)，患者在手术前未接受化疗及放疗。
采用免疫组化方法，利用实施例1中的试剂盒对该90例肺癌癌旁组织中TLR3蛋白进行了染色，分析TLR3表达与肺癌患者临床因素的相关性。P值使用SPSS 17.0中的Chi-square tests(表1)。结果发现TLR3表达与肿瘤患者TNM分期相关(P值<0.05)，即癌旁组织TLR3表达越高，其肿瘤的TNM分级越高。
对影响肺癌患者预后的危险因素进行Cox回归分析，危害比(95％可信区间)和P值使用SPSS 17.0中的单因素和多因素Cox回归分析计算。表2示出了影响肺癌患者预后危险因素的单因素和多因素Cox回归分析结果，多因素分析使用了 年龄性别校正。
通过单因素和多因素分析发现，癌旁组织中TLR3的表达是一个显著独立的预测肺癌患者总体生存时间的危险因素。
表1.肺癌癌旁组织中TLR3表达与肺癌患者临床因素的相关分析
Figure BDA0001044563500000121
*，P<0.05
表2.影响肺癌患者总体生存时间危险因素的单因素和多因素Cox回归分析
实施例3：肺癌癌旁组织中TLR3分子的表达与肿瘤转移相关因子(S100A8和S100A9)的相关性分析
对该90例肺癌患者，采用免疫组化方法，利用实施例1中的试剂盒对该90例肺癌癌旁组织中TLR3蛋白以及肿瘤转移相关因子(S100A8和S100A9，其检测试剂同实施例1，除了试剂b替换为S100A8抗体，目录号ab80708或S100A9抗体，目录号ab24111(均购自美国abcam公司))进行了染色，分析TLR3表达与肿瘤转移相关因子(S100A8和S100A9)表达的相关性。
TLR3、S100A8及S100A9免疫组化评分：采用quick score(QS)的方法对TLR3、S100A8及S100A9蛋白的表达进行评分。首先，对阳性细胞的比例按1-6分进行评分(1＝1～4％；2＝5～19％；3＝20～39％；4＝40～59％；5＝60～79％；和6＝80～100％)；其次，对阳性染色细胞的平均强度评分(0＝无染色；1＝弱，2＝中间，和3＝强染色)；之后，用阳性细胞数比例与阳性平均强度相乘，得到0-18的数值。TLR3高低表达的评判：0-9的数值表示TLR3低表达，10-18数值表示TLR3高表达。
结果发现，癌旁组织中TLR3的表达与肿瘤转移相关因子(S100A8和S100A9)的表达存在正相关(图1A和1B)。
实施例4：模式识别受体TLR3分子的表达与中性粒细胞浸润的相关性分析
对该90例肺癌患者，采用免疫组化方法，利用实施例1中的试剂盒对该90例肺癌癌旁组织中TLR3及CD66b蛋白(中性粒细胞标记，其检测同实施例1，除了试剂b替换为CD66b抗体，目录号ab197678，购自美国abcam公司)进行了染色，分析TLR3表达与中性粒细胞浸润(CD66b+细胞数)的相关性。
结果发现，癌旁组织中TLR3表达越高，中性粒细胞浸润越多，提示TLR3可能参与了中性粒细胞在肺脏中的募集(图2A和2B)。
实施例5：肺癌癌旁组织中TLR3表达及中性粒细胞浸润与患者总体生存时间的相关性分析
对该90例肺癌患者，采用免疫组化方法，利用实施例1中的试剂盒对该90例肺癌癌旁组织中TLR3及CD66b蛋白(中性粒细胞标记)进行了染色。将90例肺癌患者按TLR3表达中位数分为高低两组，分别为41及49人(见实施例3TLR3 免疫组化评分)；按中性粒细胞浸润数的中位数分为高低两组，分别为43及47人。分别对TLR3表达及中性粒细胞浸润(CD66b+细胞数)与患者总体生存时间的相关性进行分析，P值使用SPSS 17.0中的log-rank test计算。
结果发现：TLR3的高表达及中性粒细胞浸润多均与患者更低的总体生存时间显著相关(图3A和图3B)。
实施例6：TLR3缺陷抑制中性粒细胞在肺组织中的浸润及肿瘤肺转移
TLR3缺陷小鼠购自美国Jackson实验室，在SPF级环境中饲养，通过杂交获得8-10周龄同窝野生型小鼠及TLR3基因缺陷型小鼠。本研究所使用的实验及对照小鼠均为C57BL/6背景、周龄为8-10周的雌性小鼠。
小鼠肺癌自发性肺转移模型的建立：每只小鼠背部皮下注射约1×106个肺癌细胞系LLC或黑色素瘤B16/F10细胞(细胞均购自美国PerkinElmer公司)。待肿瘤长至1cm2大小(18-20天)时，切除背部肿瘤。接种后40-45天时检测小鼠肺部转移情况。
体外肺组织活体成像：利用荧光素酶慢病毒载体FLuc-Puromycin(购自PerkinElmer公司，目录号CLS960002)感染LLC及B16/F10细胞，经嘌呤霉素筛选获得稳定表达荧光素酶的细胞克隆后进行小鼠皮下接种(接种细胞数为1×106/只)，建立肿瘤自发转移模型。上机检测前给予小鼠D-Luciferin(15μg/g体重)腹腔注射，10分钟后取小鼠肺脏，置于小动物活体成像仪(PerkinElmer公司)中检测。
肺组织单细胞悬液的制备：取小鼠肺组织，用剪刀将其剪碎，在含有Ⅳ型胶原酶(1mg/ml)、DNA酶I(40mg/ml)的RPMI 1640培养基中消化60分钟，每10分钟用巴氏吸管轻轻吹打悬液，直到没有可见的团块。然后通过一个40μm的网格，洗涤两次，并再悬浮于RPMI1640培养基中。
流式细胞术：收集细胞，用预冷的流式专用PBS(0.1％NaN3+0.5％BSA+2mM EDTA，PH7.2)洗1遍(500g离心5分钟)，再用PBS 100μl重悬，加入抗CD16/CD32抗体(1μg/ml，购自美国BD Pharmingen公司)以消除非特异性结合，分别加入各种荧光素标记的抗体以及相应的同型对照抗体等(Ly6G抗体，目录号12-5931；Ly6C抗体，目录号53-5932，均购自美国BDPharmingen公司)，终浓度均为1μg/ml，混匀后置4℃，30min，加入500μl PBS洗2遍，加入200μl PBS。
利用小鼠肺癌自发性肺转移模型，发现TLR3缺陷小鼠肺转移较正常对照荷瘤小鼠明显减少，生存期明显延长(图4A和4B)。
取荷瘤小鼠肺组织，进行流式细胞术检测免疫细胞群体发现，TLR3缺陷小鼠肺组织中浸润的中性粒细胞较正常小鼠明显减少(图4C)。
实施例7：肺上皮细胞TLR3缺陷或干扰RNA干扰TLR3表达后中性粒细胞相关趋化因子的表达
分选TLR3缺陷小鼠以及正常对照小鼠荷瘤14天肺上皮细胞(如实施例6处理)，采用TRIzol(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，qRT-PCR法检测细胞趋化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL12)的基因表达。
体内结果(图5A)显示：TLR3缺陷后肺上皮细胞表达趋化因子的能力下降。
培养小鼠肺上皮细胞细胞系MLE-12及人肺上皮细胞细胞系A549(购自ATCC)，细胞接种于含10％的小牛血清的RPMI 1640(Gibco BRL公司产品)培养液，置于37摄氏度、体积分数为5％的CO2培养箱中常规培养。优化转染条件，利用si-Tlr3l(SEQ ID No.:1)、si-Tlr3 2(SEQ ID No.:2)干扰人肺上皮细胞细胞系A549；利用si-Tlr3 3(SEQ ID No.:3)、si-Tlr3 4(SEQ ID No.:4)干扰小鼠肺上皮细胞细胞系MLE-12的TLR3的表达，并以si-Tlr3neg1(SEQ ID No.:5)和si-Tlr3neg2(SEQ ID No.:6)为阴性对照，各siRNA以50nmol的终浓度加入细胞培养液，于孵育后24～48h利用肿瘤培养上清刺激以后，采用TRIzol(Invitrogen公司)抽提细胞总RNA，qRT-PCR法检测细胞趋化因子(CXCL1、CXCL2、CXCL5、CXCL12)的基因表达。
各siRNA的序列如下所示：
针对人TLR3基因mRNA不同位点选取的2段21个碱基的siRNA序列：
SEQ ID No.1:5’-GAGGUCUUCAAGGAUUUAUTT-3’
SEQ ID No.2:5’-GUCCCAUUUAUUUCCUAAATT-3’
针对小鼠TLR3基因mRNA不同位点选取的2段21个碱基的siRNA序列：
SEQ ID No.3:5’-GGAGAGGUCUGAGAAAUAUTT-3’
SEQ ID No.4:5’-CGGCCUUAAUGAAAUUGAATT-3’
作为阴性对照的随机序列：
SEQ ID No.5:5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUdTdT-3’
SEQ ID No.6:5’-ACGUGACACGUUCGGAGAAdTdT-3’。
体外RNA干扰结果(图5B与5C)显示：干扰RNA干扰Tlr3表达后能明显减低肿瘤诱导的肺上皮细胞趋化因子的表达。
该结果表明：肺上皮细胞的TLR3能够调控其趋化因子的分泌，结合之前实施 例的结果，提示肺上皮细胞的TLR3可以作为肿瘤治疗的靶点，针对TLR3高表达的非肿瘤组织和/或细胞，可利用干扰RNA技术干扰其表达以抑制中性粒细胞在转移部位迁移及趋化，从而抑制肿瘤的转移，达到预防和/或治疗肿瘤转移的目的。
上述实施例中的试验结果表明：宿主TLR3的表达与肺组织中中性粒细胞的浸润密切相关，且其高表达与患者较差的预后显著相关，该结果提示了宿主TLR3参与调控了中性粒细胞在肺部的浸润，并最终影响了肿瘤的肺转移以及患者的预后，由此可作为预测肿瘤转移或肿瘤预后评估的标志物。并且，研究还表明对于存在高于对照水平的模式识别受体TLR3的对象，可采用TLR3抑制剂来防治肿瘤转移和/或改善预后。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
Figure IDA0001044563590000011
Figure IDA0001044563590000021

Claims (22)

1.检测生物样品中模式识别受体TLR3的物质在制备用于预测对象中肿瘤转移和/或评估对象肿瘤预后和/或选择肿瘤防治方案的产品中的应用，其中所述生物样品为获自对象肿瘤微环境中的非肿瘤组织和/或细胞。
2.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质是用于检测TLR3的DNA水平、mRNA水平和/或蛋白质水平的物质。
3.如权利要求1所述的应用，其中所述物质是针对TLR3的抗体、针对TLR3的特异性探针、针对TLR3的基因芯片或蛋白质芯片。
4.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质是用于通过如下方法中的一种或多种来检测TLR3的物质：免疫组化法、化学发光法、放射性同位素法、荧光发光法、酶标法、胶体金法、实时定量反转录PCR、生物芯片检测法、DNA印迹法、RNA印记法原位杂交法、蛋白质印迹法。
5.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质是用于通过免疫荧光法来检测TLR3的物质。
6.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质带有可检测标记物。
7.如权利要求1所述的应用，其中，所述物质带有放射性同位素、荧光团、化学发光部分、酶、酶底物、酶辅因子、酶抑制剂、染料、金属离子、配体或它们的任合组合。
8.如权利要求7所述的应用，其中，所述配体为生物素或半抗原。
9.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物样品获自哺乳动物。
10.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物样品获自灵长类动物、啮齿类动物、家畜、宠物。
11.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物样品获自人、大鼠、小鼠、犬、马、牛、兔或猴。
12.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物样品选自：新鲜组织或细胞样品、福尔马林固定样品、石蜡包埋样品。
13.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物样品选自血液、体液。
14.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物样品获自所述对象肿瘤微环境中的癌旁组织和/或细胞。
15.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物样品获自怀疑发生肿瘤转移的组织和/或细胞、肿瘤转移高风险的组织和/或细胞、已发生肿瘤转移的组织和/或细胞、已建立转移灶的组织和/或细胞或它们的组合。
16.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物样品包括肺上皮细胞、内皮细胞、巨噬细胞、树突状细胞。
17.如权利要求1所述的应用，其中，所述肿瘤选自：肺癌、黑色素瘤、乳腺癌、卵巢癌、前列腺癌、肝癌、肾癌、肠癌、头部颈部癌、皮肤癌、膀胱癌、胰腺癌。
18.如权利要求17所述的应用，其中，所述肺癌为非小细胞肺癌。
19.如权利要求1所述的应用，其中，所述生物样品中存在高于对照水平的模式识别受体TLR3指示所述对象已发生或易发生肿瘤转移；和/或，指示所述对象肿瘤预后不良；和/或，指示所述对象适于采用TLR3抑制剂来防治肿瘤转移和/或改善预后。
20.如权利要求19所述的应用，其中，所述对照水平选自：由所述对象非肿瘤的正常生物样品中测得的TLR3水平、通过统计学确定的群体标准水平、或经标准化的水平。
21.如权利要求20所述的应用，其中，所述正常生物样品为获自所述对象非肿瘤癌旁组织或正常组织的样品。
22.如权利要求1所述的应用，其中，所述产品选自：检测试剂盒、检测条、检测卡、检测笔、检测仪器或它们的任意组合；和/或，所述产品还包含选自下组的一种或多种物质：容器、缓冲剂、助剂、溶剂、阳性对照物、阴性对照物、使用说明书。
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