JP2008507530A - Toll様受容体を発現する腫瘍細胞におけるアポトーシスの誘導 - Google Patents
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Abstract
Description
本願は、米国出願第60/589,616号に対する優先権を主張する。
(発明の分野)
本発明は、TLRを発現する腫瘍細胞を選択し、そしてその細胞を治療的に有効な量のTLRリガンドと接触させることによって、Toll様受容体(TLR)を発現する癌および腫瘍細胞を処置するための方法に関連する。本発明は特に、TLR3アゴニストを用いて、TLR3を発現する癌および腫瘍細胞を処置するための方法に関連する。
癌は、世界中で主な死因の1つである。従って、我々がこの致命的な疾患を処置する新規な方法を開発することが必須である。多くの現在の癌治療は、急速に分裂する細胞に影響を与える。これらの治療は、癌細胞のみでなく、胃腸管および毛包の細胞のような、全ての急速に分裂する細胞に影響を与えるので、破壊的な副作用を有する。従って、そのような破壊的な副作用を有さない、新規の処置方法が必要である。本出願は、Toll様受容体3を、癌処置における処置標的として同定する。
Aliprantisら、「Cell Activation and Apoptosis by Bacterial Lipoproteins Through Toll−like Receptor−2」、Science、第285巻、736−739頁(1999年7月30日) Aliprantisら、「The apoptotic signaling pathway activated by Toll−like receptor−2」、Embo J.,第19(13)巻、3325−3336頁(2000) Sabroeら、「Selective Roles for Toll−Like Receptor(TLR)2 and TLR4 in the Regulation of Neutrophil Activation and Life Span」、J.Immunology、第170巻、5268−5275頁(2003) BannermanおよびGoldblum、「Mechanisms of bacterial lipopolysaccharide−induced endothelial apoptosis」、Am.J.Physiology Lung Cell Molecular Physiology、第284巻、L899−L914頁(2003) Meyerら、「Induction of apoptosis by Toll−like Receptor−7 agonist in tissue cultures」、British J.Dermatology、第149巻(supp.66)、9−13頁(2003) Wenら、「The Effect of Innate Immunity on Autoimmune Diabetes and the Expression of Toll−Like Receptors on Pancreatic Islets」、J.Immunology、第172巻、3173−3180頁(2004) Hanら、「Mechanisms of the TRIF−induced Interferon−stimulated Response Element and NF−κB Activation and Apoptosis Pathways」、J.Biological Chemistry、第279巻、第15号、15652−15661頁(2004)
本発明の実施態様は、a)TLRを発現する癌を有する患者を選択する工程、およびb)その患者に、治療的に有効な量のTLRリガンドを投与する工程を包含する、癌を処置するための方法を提供する。好ましくは、そのリガンドはアゴニストまたはアンタゴニストである。
本明細書中で引用された全ての刊行物は、その全体が参考として援用される。
「アポトーシス」という用語は、プログラム細胞死を意味する。
ヒトToll様受容体(hTLR)のファミリーは、10個のメンバーhTLR1〜hTLR10から構成される。hTLR1〜hTLR10のそれぞれの完全なオープンリーディングフレームのヌクレオチド配列および対応するアミノ酸配列は、当該分野で公知である。例えば、hTLR1〜hTLR10の配列はPCT公開第WO01/90151において開示されるが、その配列は公の命名法と異なって番号が付けられている。hTLR1〜hTLR10のそれぞれのヌクレオチド配列およびアミノ酸配列はまた、下記の表1において示すように、GenBank(登録商標)データベースにおいても見出され得る。
本発明の方法の工程は、TLRを発現する癌を有する患者を選択すること、またはTLRを発現する腫瘍細胞を選択することを含む。
本発明の方法の別の工程は、患者に、治療的に有効な量のTLRリガンドを投与することを含む。この工程は、TLRリガンドを医薬品組成物中で投与することを含む。例えば、医薬品組成物は、錠剤の形式であり得、その結果、リガンドが血流中に吸収される。次いで循環系によってTLRリガンドがTLRを発現する癌へと送達され得、その結果、リガンドと癌とがお互いに接触し得る。この接触工程が、リガンドが癌のToll様受容体に結合し、そして癌における増殖阻害およびアポトーシスを誘導することを可能にする。あるいは、黒色腫の処置のためのように、医薬品組成物を局所的(locally)または表面(topically)に投与し得る。
あるいは、本発明の方法の工程は、TLRを発現する腫瘍細胞を、有効な量のTLRリガンドと接触させることを含む。インビボにおいて、接触工程は、TLRリガンドを医薬品組成物中で患者に投与することを含む。インビトロにおいて、接触工程は、TLRを発現する腫瘍細胞およびTLRリガンドを、リガンドと細胞とがお互いに接触し得るように、物理的に近づけることを含む。この接触工程は、リガンドが細胞のToll様受容体に結合し、そして腫瘍細胞において増殖阻害およびアポトーシスを誘導することを可能にする。
抗体、抗体断片またはリポペプチドのようなポリペプチドを、本発明の方法において、TLRを発現する癌または細胞を選択するために選択工程において、TLRリガンドを患者に送達するために投与工程において、またはTLR発現細胞において増殖阻害およびアポトーシスを誘導するために接触工程において使用し得る。それに加えて、TLRに結合する(抗体のような)リガンドを同定または産生するために、TLRポリペプチドまたはその断片を産生し得る。
TLRを発現する癌を有する患者を選択するために、またはTLRを発現する腫瘍細胞を選択するために、核酸を使用し得る。患者を選択するために、好ましくは患者の腫瘍の生検を行う。次いで、その腫瘍細胞を、インビトロでTLR核酸の発現に関して分析し得る。
TLRに特異的な抗体およびその断片を、本発明の方法の、TLR発現細胞を選択するために選択工程において、TLRリガンドを患者に送達するために投与工程において、またはTLR発現細胞において増殖阻害およびアポトーシスを誘導するために接触工程において使用し得る。
TLRアゴニストおよびアンタゴニストを、治療的に使用して、TLRの活性を刺激またはブロックし、そしてそれによってTLRによって引き起こされる、または媒介される任意の医学的状態を処置し得る。処置的適用に関わる投与レジメは、処置物質の作用を改変し得る様々な因子、例えば患者の状態、体重、性別および食事、投与時間、および他の臨床的因子を考慮して、担当医師によって決定される。
癌の予防または処置におけるTLRリガンドの有効性を、リガンドを、この同じ目的のために有効な、別の薬剤または処置と組み合わせて投与することによって改善し得る。例えば、TLRリガンドを、化学療法剤または癌処置と組み合わせて投与され得る。好ましくは、TLRリガンドはTLR3アゴニストである。
例えば、Maniatisら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual、1982、Cold Spring Harbor Laboratory、Cold Spring Harbor Press;Sambrookら、Molecular Cloning:A Laboratory Manual(第2版)、第1−3巻、1989、Cold Spring Harbor Press、NY;Ausubelら、Biology、Greene Publishing Associates、Brooklyn、NY;またはAusubelら(1987および増刊)、Current Protocols in Molecular Biology、Greene/Wiley、New York;Innisら(編)、PCR Protocols:A Guide to Methods and Applications、1990、Academic Press、N.Y.において記載されるような、標準的な方法を使用した。
ヒト乳房腫瘍細胞株である、Cama−1、SW527、BT−483およびMCF−7を、ATCC(Rockville、MD)から得て、そして2mMのL−グルタミン(Life Technologies、Paisley Park、GB)、10%のウシ胎仔血清(Life Technologies)、160μg/mLのゲンタリン(gentalline)(Schering Plough、Kenilworth、NJ)、2.5mg/mLの炭酸水素ナトリウム(Life Technologies)、アミノ酸(Invitrogen)および1mMのピルビン酸ナトリウム(Sigma−Aldrich、Saint Louis、MO)を補充した4.5g/mLのグルコース(Invitrogen、San Diego、CA)を含むDMEM F12中で培養した(完全培地と呼ばれる)。ポリイノシン酸−ポリシチジン酸(ポリIC)を、Invitrogen(San Diego、CA)から得た。ペプチドグリカン(PGN)およびリポ多糖(LPS)を、Sigma−Aldrichから購入した。I型IFN受容体をブロックするmAbを、PBL Biochemical Laboratories(Piscataway、NJ)から購入し、そしてTNF−α中和mAbを、Genzyme(Cambridge、MA)から購入した。Stat1に対する抗体、リン酸化Stat1(チロシン701)に対する抗体およびPKRに対する抗体を、Cell Signaling(Beverly、MA)から購入した。ヒトIFN−βに対する抗体を、R&D Systems(Minneapolis、MIN)から購入した。NF−κB p65サブユニット、TRAF6およびβ−チューブリンに対する抗体を、Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz、CA)から購入した。一般的なカスパーゼ阻害剤z−VAD−fmkを、R&D Systemsから購入した。シクロヘキシミド(CHX)を、Sigma−Aldrichから購入した。
TLRリガンドによる処置後の細胞回復を、クリスタルバイオレット染色(Sigma−Aldrich)によって測定した。細胞を96穴プレートに、104細胞/ウェルでプレーティングした。TLRリガンド有りまたは無しのいずれかで72時間培養した後、細胞をPBSで洗浄し、6%のホルムアルデヒド(Sigma−Aldrich)で20分間固定し、2回洗浄し、そして次いで0.1%のクリスタルバイオレットで10分間染色した。洗浄および1%のSDS中で1時間インキュベートした後、Vmaxプレートリーダー(Molecular Devices、Sunnyvale、CA)において、605nmで吸光度を読み取った。アネキシンV染色を、アネキシン−FITCアポトーシス検出キット(BD Pharmingen、San Diego、CA)で、製造会社の指示に従って行った。70%のエタノール中で一晩透過処理した後、3μg/mLのヨウ化プロピジウム(PI)(Molecular probes、Eugene、OR)で染色することによって、二倍体未満(sub−diploid)の細胞を検出した。二重線識別モジュールを備えたFACScalibur(Becton Dickinson、Mountain View、CA)で、そしてCellquest Proソフトウェア(Becton Dickinson)を用いて、フローサイトメトリーによって蛍光を分析した。
Cama−1細胞を、1%のNonidet−P40を含む緩衝液中で溶解した。SDS−ポリアクリルアミドゲル(Invitrogen)に、1レーンあたり20μgの全タンパク質をローディングした。上記で記載した抗体を用いて、標準的な技術によってウェスタンブロット(WB)を行った。抗IRAK−4モノクローナル抗体を、Fossiezら、「T cell interleukin−17 induces stromal cells to produce proinflammatory and hematopoietic cytokines」、J.Exp.Med.、第183(6)巻、2593−2603(1996)において記載されたプロトコールに従って、研究室で作製した。
IL−6の分泌を、DuoSet ELISAキット(R&D Systems)を製造会社の指示に従って用いた標準的な酵素結合アッセイ(ELISA)によって、培養上清中で測定した。
Cama−1細胞を、6穴プレートに1ウェルあたり3×105細胞でプレーティングした。一晩接着させた後、siRNAのトランスフェクションを、3μg/mLのリポフェクトアミン2000(Invitrogen)および100nMのsiRNAを含むOptiMEM培地(Life technologies)中で5時間行った。次いでポリICによる処理およびアポトーシス分析の前に、細胞を洗浄し、そして完全培地中で72時間培養した。TLR3に特異的なsiRNA二重鎖、PKRに特異的なsiRNA二重鎖、IRAK−4に特異的なsiRNA二重鎖、TRAF6に特異的なsiRNA二重鎖およびp65に特異的なsiRNA二重鎖を、Dharmacon(Lafayette、CO)からSMART−Poolsとして購入した。TRIF siRNAを、同じ供給会社から単一のオリゴ二重鎖(5’−GCUCUUGUAUCUGAAGCAC−3’)(配列番号23)として購入した。TLR3およびTRIFの発現を、以下のプライマーを用いて、TaqPCR ReadyMix(Sigma−Aldrich)によるPCR(35サイクル:1分94℃、1分55℃、2分72℃)によって評価した:TLR3に関して5’−AACGATTCCTTTGCTTGGCTTC−3’(前方向)(配列番号24)/5’−GCTTAGATCCAGAATGGTCAAG−3’(逆方向)(配列番号25)、およびTRIFに関して5’−ACTTCCTAGCGCCTTCGACA−3’(前方向)(配列番号26)/5’−ATCTTCTACAGAAAGTTGGA−3’(逆方向)(配列番号27)。PKR、IRAK−4、TRAF6およびp65の発現を、上記で記載したようにWBによって評価した。
これらの実験のセットにおいて、TLR1〜TLR10のそれぞれに関するTLRの発現を、6つのヒト結腸直腸腺癌細胞株において、RT−PCRによって検出した。分析した6つの細胞株は、Caco2、LoVo、Colo320DM、SNU−C1、T84およびColo205であった。同量のmRNAを、各細胞株から抽出した。続いてmRNAを、hTLR特異的プライマーを用いて、PCRによって35サイクル(94℃で30秒、60℃で45秒、72℃で90秒)増幅した。以下のプライマーを使用した:
4つのヒト乳房腫瘍細胞株である、Cama−1、SW527、BT483、およびMCF−7を、ポリICに応答した細胞死に関して分析した。細胞を5μg/mlのPGN、50μg/mlのポリICまたは10μg/mlのLPSと72時間インキュベートした。コントロール細胞を、PBSとともに培養した。クリスタルバイオレット染色によって細胞傷害性を評価し、そしてコントロールのパーセントとして表した。
Cama−1細胞を、ポリICに反応したTLR3 mRNAの発現に関して分析した。Cama−1細胞を、完全培地(4.5g/mLのグルコースを含み、そして2mMのL−グルタミン、10%のウシ胎仔血清、160μg/mLのゲンタリン、2.5mg/mLの炭酸水素ナトリウムを補足したDMEM F12)中で、単独で、またはLPS(5μg/ml)および/もしくはポリIC(5μg/ml)と共に、48時間培養した。各グループの細胞からmRNAを抽出した。次いでmRNAを逆転写し、そしてhTLR3特異的プライマー(TLR3F:aacgattcctttgcttggcttc(配列番号5)およびTLR3R:gcttagatccagaatggtcaag(配列番号6))を用いて35サイクル(上記の実施例1におけるように)PCR増幅した。TLR3 mRNAは、休止Cama−1細胞からは増幅できなかった。
2つの細胞株である、大腸癌細胞株LS174Tおよび乳癌細胞株Cama−1を、死および細胞周期の変化に関して分析した。細胞を、ポリIC(5μg/ml)の存在下または非存在下のいずれかで48時間培養した。1μg/mlのブロモデオキシウリジン(BrdU)の30分のパルスの後、細胞を70%エタノール中で4℃にて一晩固定した後、FITC結合抗BrdUモノクローナル抗体および3μg/mlのヨウ化プロピジウムで染色した。細胞死および細胞周期を、フローサイトメトリー(FACS)によって分析した。BrdUの組み込みは増殖の尺度であり、一方、ヨウ化プロピジウム染色はDNA含有量、特にアポトーシスを起こしている二倍体未満の細胞集団の定量を可能にする。
乳房腫瘍細胞株に対するポリIC処置の効果をさらに調査するために、アネキシンV染色によって、Cama−1細胞において細胞死を分析した。細胞を、5μg/mlのポリIC有りまたは無しのいずれかで、24時間培養した。アポトーシスを、アネキシンV染色およびフローサイトメトリーによって測定した。そのデータは、70%を超えるCama−1細胞がアネキシンVによって染色されたことを示し、ポリICによって誘導されたアポトーシスをさらに示す。
TLR3を、ポリIC誘導アポトーシスにおけるその役割に関して分析した。Cama−1細胞を、無関係な配列(Scr RNA;配列:ACUAGUUCACGAGUCACCUtt)(配列番号21)、またはhTLR3(配列:CAGUGUUGAACCUUACCCAtt)(配列番号22)のいずれかに対応するsiRNAでトランスフェクトした。siRNAトランスフェクションを、3μg/mLのリポフェクトアミン2000および100nMのsiRNAを含む、1mLのOptiMEMTM培地中で、5時間行った。次いで細胞をリン酸緩衝化生理食塩水溶液(PBS)で洗浄し、完全培地中で72時間培養し、その後、5μg/mLのポリICによって48時間処理した。次いで細胞周期を、実施例3で記載されたように、エチジウムブロミドによって染色した後FACSによって分析した。
ポリAUを、そのアポトーシスに対する効果に関して分析した。Cama−1細胞を、PBSまたは5ng/mlから50μg/mlまでの範囲の漸増濃度のポリAUのいずれかと共に48時間培養した。アポトーシスを、アネキシンV陽性細胞のパーセンテージを測定することによって分析した。そのデータは、ポリICと同様、ポリAUはアポトーシスを引き起こすことを示す。
本発明者らは、インビボでポリIC誘導アポトーシスに対するIFNの効果を分析した。TRP−Tagマウスは、網膜色素上皮にSV40のT抗原を発現し、そして代表的には生後数週間以内に完全な貫通を有する眼の腫瘍を発生させる。
ポリIC誘導Cama−1細胞傷害性の経路を決定するために、RNA干渉を使用してTRIFおよびPKRの発現を効率的にダウンレギュレートした。Cama−1細胞を、6穴プレートに1ウェルあたり3×105細胞でプレーティングした。一晩接着させた後、siRNAトランスフェクションを、3μg/mLのリポフェクトアミン2000(Invivogen)および100nMのsiRNAを含むOptiMEM培地(Life Technologies)中で5時間行った。細胞を、MOCK(水)、コントロールスクランブル二重鎖(scr)siRNA、TRIF siRNAまたはPKR siRNAのいずれかでトランスフェクトした。
TLR3によって媒介される細胞傷害性をさらに調査するために、どちらもTLRシグナル伝達の下流メディエーターであるシグナル伝達分子IRAK−4およびTRAF6の関与を評価した。Cama−1細胞を6穴プレートに1ウェルあたり3×105細胞でプレーティングした。一晩接着させた後、siRNAトランスフェクションを、3μg/mLのリポフェクトアミン2000(Invivogen)および100nMのsiRNAを含むOptiMEM培地(Life Technologies)中で5時間行った。細胞を、コントロールスクランブル二重鎖(scr)siRNA、IRAK−4 siRNAまたはTRAF−6 siRNAのいずれかでトランスフェクトした。次いで細胞を洗浄し、そしてポリICによる処理およびアポトーシス分析の前に、完全培地中で72時間培養した。IRAK−4およびTRAF6に特異的なsiRNA二重鎖を、Dharmacon(Lafayette、CO)からSMART−Poolsとして購入した。
TLR3によって媒介されるアポトーシスにおける1型インターフェロンの関与を評価した。Cama−1細胞を、5μg/mlのポリICとともに、0時間、1時間、6時間、18時間または24時間のいずれかでインキュベートした。細胞溶解産物におけるIFN−β、リン酸化Stat1(チロシン701)(P−Stat−1)および総Stat−1の存在を、ウェスタンブロットによって分析した。
本発明者らは、TNF−αがTLR3によって媒介されるアポトーシスにおいて役割を果たしているかどうか決定することを試みた。Cama−1細胞を、20μg/mlの中和抗TNF−α mAbまたは10μg/mlのCHX有りまたは無しのいずれかでプレインキュベートした。次いで細胞を、5μg/mlのポリICまたは25ng/mlのTNF−α有りまたは無しのいずれかで培養した。アポトーシスを、アネキシンV染色によって測定し、そして培養中のアポトーシス細胞のパーセンテージとして表した。
本発明者らは、次にアポトーシスにおけるカスパーゼの役割に取り組んだ。Cama−1細胞を25μMの一般的なカスパーゼ阻害剤z−VAD−fmkまたはDMSOと共に1時間プレインキュベートし、その後、5μg/mlのポリICまたは25ng/mlのTNF−α(ポジティブコントロールとして使用した)有りまたは無しで24時間培養した。アポトーシスをアネキシンV染色によって測定し、そして培養中のアポトーシス細胞のパーセンテージとして表した。
本発明者らは、TLR3リガンドとI型インターフェロンとの間に何らかの相乗作用が存在するかどうかをさらに調査しようと試みた。初代乳癌細胞SKBr3を、6穴プレートに1ウェルあたり3×105細胞でプレーティングした。一晩接着させた後、siRNAトランスフェクションを、3μg/mLのリポフェクトアミン2000(Invivogen)および100nMのsiRNAを含むOptiMEM培地(Life Technologies)中で5時間行った。細胞を、MOCK(水)、TLR3 siRNAまたはPKR siRNAのいずれかでトランスフェクトした。次いで細胞を洗浄し、完全培地中で72時間培養し、その後、50μg/mlのポリICにより24時間処理し、そしてアポトーシス分析を行った。
Claims (22)
- 癌を処置するための方法であって、
a)TLRを発現する癌を有する患者を選択する工程、および
b)該患者に治療的に有効な量のTLRリガンドを投与する工程
を包含する、方法。 - 前記リガンドがアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項1に記載の方法。
- 腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、
a)TLRを発現する腫瘍細胞を選択する工程、および
b)該細胞を、該細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量のTLRリガンドと接触させる工程
を包含する、方法。 - 前記リガンドがアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項3に記載の方法。
- 癌を処置するための方法であって、
a)TLR3を発現する癌を有する患者を選択する工程;および
b)該患者に治療的に有効な量のTLR3リガンドを投与する工程
を包含する、方法。 - 前記リガンドがアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項5に記載の方法。
- 前記アゴニストがポリICである、請求項6に記載の方法。
- 前記アゴニストがポリAUである、請求項6に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが抗体またはその断片である、請求項6に記載の方法。
- 前記TLR3を発現する癌が乳癌である、請求項5に記載の方法。
- 前記TLR3を発現する癌が大腸癌である、請求項5に記載の方法。
- 前記方法が、前記患者に化学療法剤または癌処置を投与する工程をさらに包含する、請求項5に記載の方法。
- 前記方法が、TLR3リガンドの投与前に、前記患者に低用量のI型IFNを投与する工程をさらに包含する、請求項5に記載の方法。
- 腫瘍細胞のアポトーシスを誘導するための方法であって、
a)TLR3を発現する腫瘍細胞を選択する工程;および
b)該細胞を、該細胞においてアポトーシスを誘導するのに有効な量でTLR3リガンドと接触させる工程
を包含する、方法。 - 前記リガンドがアゴニストまたはアンタゴニストである、請求項14に記載の方法。
- 前記アゴニストがポリICである、請求項15に記載の方法。
- 前記アゴニストがポリAUである、請求項15に記載の方法。
- 前記アンタゴニストが抗体またはその断片である、請求項15に記載の方法。
- 前記TLR3を発現する腫瘍細胞が乳癌細胞である、請求項14に記載の方法。
- 前記TLR3を発現する腫瘍細胞が大腸癌細胞である、請求項14に記載の方法。
- 前記方法が、前記細胞を化学療法剤または癌処置に接触させる工程をさらに包含する、請求項14に記載の方法。
- 前記方法が、TLR3リガンドの投与前に、前記細胞を低用量のI型IFNと接触させる工程をさらに包含する、請求項14に記載の方法。
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