CN101018567B - 表达Toll样受体的肿瘤细胞凋亡的诱导 - Google Patents

Abstract

某些类型的癌细胞表达一种或多种Toll样受体(TLR)。这些TLR均为治疗靶。本发明涉及通过筛选表达TLR的肿瘤细胞，使该细胞与治疗有效量的TLR配体接触，治疗表达Toll样受体的癌和肿瘤细胞的方法。本发明具体涉及用TLR3激动剂治疗表达TLR3的癌和肿瘤细胞的方法。

Description

表达Toll样受体的肿瘤细胞凋亡的诱导

相关申请的交叉引用

本发明要求美国专利申请序号60/589,616的优先权。

发明背景

发明领域

本发明涉及通过筛选表达Toll样受体(TLR)的肿瘤细胞，并使所述细胞与治疗有效量的TLR配体接触，用于治疗表达TLR的癌和肿瘤细胞的方法。本发明具体涉及使用TLR3激动剂治疗表达TLR3的癌和肿瘤细胞的方法。

背景

在全世界，癌症是死亡的主要原因之一。因此，我们开发新的治疗这种致命疾病的方法十分重要。许多现行的癌症疗法影响快速分裂的细胞。这些疗法具有破坏性的副作用，因为它们不仅影响癌细胞，而且影响所有快速分裂的细胞，例如胃肠道细胞和毛囊细胞。因此，需要没有这种破坏性副作用的新治疗方法。本申请将Toll样受体3鉴定为癌症治疗中的治疗靶。

果蝇(Drosophila)toll蛋白控制果蝇胚的背腹图式形成，还被视为代表了古老的宿主防御机制。

已经鉴定出果蝇toll的人类同源物，称为Toll样受体(TLR)。人和果蝇Toll蛋白的序列比对显示，两个序列在全长蛋白质链上是同源的。因此，相信TLR是人类先天免疫的重要组分。

人Toll样受体家族由10个高度保守的受体蛋白TLR1～TLR10组成。象果蝇toll一样，人TLR是I型跨膜蛋白，具有由识别病原体相关性分子图式(pathogen-associated molecular pattern，PAMP)的富含亮氨酸重复序列(LRR)结构域组成的胞外域，以及与人白介素-1(IL-1)受体胞质域同源的胞质域。与果蝇toll和IL-1受体的信号传导途径相似，人Toll样受体通过NF-κB途径发出信号。

虽然哺乳动物TLR共有许多特性和信号转导机制，但是它们的生物学功能十分不同。部分是因为4种不同的衔接分子(MyD88、TIRAP、TRIF和TRAF)按不同组合与TLR结合，介导不同的信号传导途径。另外，一种TLR的不同配体可优先激活不同的信号转导途径。此外，TLR在各种造血和非造血细胞中进行差异性表达。因此，对TLR配体的反应不仅取决于TLR激活的信号途径，而且取决于表达各个TLR的细胞的性质。

虽然还有待于鉴定某些TLR的配体，但是已经报道了数种TLR特异性配体。例如，Poly IC和Poly AU都是TLR3激动剂。

聚肌胞苷酸(Poly IC)是合成的高分子量的双链RNA，大小不同。Poly IC是一种TLR3激动剂，但也是一种有效的PKR激活剂，而PKR是参与抗病毒反应和基因转录后调节的遍在酶。

聚腺尿苷酸(Poly AU)是合成的多核糖核苷酸的双链复合体。PolyAU是一种TLR3激动剂。Poly AU是体液免疫应答和细胞免疫应答两者的调节剂，也是干扰素的诱导剂。

虽然Poly IC和Poly AU两者曾在不同类型的癌症(例如乳腺癌、膀胱癌、肾癌和胃癌)中用作某些临床试验的辅助治疗，但是本文所公开的新方法中，这些药物以前未见使用。

如前所述，本申请将Toll样受体3鉴定为癌症治疗中的治疗靶。下面公布的研究涉及TLR与细胞凋亡之间的关系。

Aliprantis等报道了在表达人Toll样受体2(hTLR2)的单核细胞系中，检测细菌脂蛋白(BLP)诱导细胞凋亡作用的试验。参见Aliprantis等，“由细菌脂蛋白经Toll样受体2的细胞活化和细胞凋亡(CellActivation and Apoptosis by Bacterial Lipoproteins Through Toll-likeReceptor-2)”，Science，第285卷，第736-739页(1999年7月30日)。

Aliprantis等的另一篇参考文献涉及TLR2在通过FADD募集引发胱天蛋白酶8活化中的作用。参见Aliprantis等，“Toll样受体2激活的细胞凋亡信号传导途径(The apoptotic signaling pathwayactivatedby Toll-like receptor-2)”，Embo J.，第19(13)卷，第3325-3336页(2000)。

Sabroe等涉及TLR2在嗜中性粒细胞存活中的作用。参见Sabroe等，“Toll样受体(TLR)2和TLR4在调节嗜中性粒细胞活化作用和生存期限中的选择性作用(Selective Roles for Toll-Like Receptor(TLR)2 and TLR4 in the Regulation of Neutrophil Activation and LifeSpan)”，J.Immunology，第170卷，第5268-5275页(2003)。

Bannerman和Goldblum涉及表明TLR4和TLR2为细菌脂多糖(LPS)受体的研究。参见Bannerman和Goldblum，“细菌脂多糖诱导的内皮细胞凋亡的机制(Mechanisms of bacterial lipopolysaccharide-induced endothelial apoptosis)”，Am.J.Physiology Lung Cell MolecularPhysiology，第284卷，第L899-L914页(2003)。

Meyer等涉及人上皮细胞系(HeLa S3)、角质形成细胞(HaCaT和A431细胞)和小鼠成纤维细胞(McCoy细胞)中，通过TLR7激动剂诱导细胞凋亡的研究。参见Meyer等，“组织培养物中Toll样受体7激动剂诱导的细胞凋亡(Induction of apoptosis by Toll-like Receptor-7agonist in tissue cultures)”，British J.Dermatology，第149卷(增刊66)，第9-13页(2003)。

Wen等提出糖尿病部分是由胰岛通过表达先天免疫受体TLR3，结合直接识别病毒样刺激物诱发的。Wen等还推测Poly IC诱导的细胞凋亡可能是由TLR3介导的。参见Wen等，“先天免疫对自身免疫性糖尿病及胰岛Toll样受体表达的作用(The Effect of InnateImmunity on Autoimmune Diabetes and the Expression of Toll-likeReceptors on Pancreatic Islets)”，J.Immunology，第172卷，第3173-3180页(2004)。

最后，Han等涉及在过量表达TRIF的293细胞中诱导细胞凋亡。Han等还涉及TRIF诱导的胞内信号传导途径(ISRE/IFNβ，NF-κB和细胞凋亡)的假设模型，该途径由TLR3激活。参见Han等，“TRIF诱导干扰素刺激的应答元件和NF-κB活化作用的机制及细胞凋亡途径(Mechanisms of the TRIF-induced Interferon-stimulated ResponseElement and NF-κB Activation and Apoptosis Pathways)”，J.BiologicalChemistry，第279卷，第15期，第15652-15661页(2004)。

发明概述

本发明的一个实施方案提供治疗癌症的方法，该方法包括：a)筛选患有表达TLR的癌的患者，b)给予患者治疗有效量的TLR配体。优选配体是激动剂或拮抗剂。

本发明的另一个实施方案提供诱导肿瘤细胞凋亡的方法，该方法包括：a)筛选表达TLR的肿瘤细胞，b)使该细胞与TLR配体接触，该配体的量足以诱导细胞凋亡。优选配体是激动剂或拮抗剂。

本发明的又一个实施方案提供治疗癌症的方法，该方法包括：a)筛选患有表达TLR3的癌的患者；b)给予患者治疗有效量的TLR3配体。优选配体是激动剂或拮抗剂。更优选激动剂是Poly AU。最优选激动剂是Poly IC。或者，拮抗剂是抗体或其片段。优选表达TLR3的癌是结肠癌。最优选表达TLR3的癌是乳腺癌。该方法还可包括给予患者化疗药物或癌症治疗。该方法还可进一步包括在给予TLR3配体之前，给予患者低剂量的I型IFN。

本发明的再一个实施方案提供诱导肿瘤细胞凋亡的方法，该方法包括：a)筛选表达TLR3的肿瘤细胞，b)使该细胞与TLR3配体接触，该配体的量足以诱导细胞凋亡。优选配体是激动剂或拮抗剂。更优选激动剂是Poly AU。最优选激动剂是Poly IC。或者，拮抗剂是抗体或其片段。优选表达TLR3的肿瘤细胞是结肠癌细胞。最优选表达TLR3的肿瘤细胞是乳腺癌细胞。该方法还可包括使细胞与化疗药物或癌症治疗接触。该方法还可进一步包括在给予TLR3配体之前，使细胞与低剂量的I型IFN接触。

附图简述

本发明的前述特征和其它特征在以下的发明详述及附图简述中更为清晰明了，其中：

图1是一组图表，表示Cama-1细胞在与Poly IC一起孵育48小时后，TLR3的siRNA沉默对Cama-1细胞凋亡的影响。

发明详述

本文所引用的所有出版物都通过引用全部结合到本文中。

定义

术语“细胞凋亡(apoptosis)”是指程序性细胞死亡(programmed celldeath)。

术语“激动剂”是指能够与受体结合并激活受体的配体。

术语“拮抗剂”是指能够与受体结合并阻断或钝化受体的配体。或者，“拮抗剂”可与激动剂结合并阻断或钝化激动剂以防止激动剂与受体结合。

术语“抗体”是指完整的免疫球蛋白，也就是说包含与F_c片段连接的两个F_ab片段。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体、嵌合抗体、灵长类动物源化抗体(primatized antibody)、人源化抗体(humanized antibody)和人抗体。术语“抗体”包括五种重要类别的免疫球蛋白的任一种：IgA、IgD、IgE、IgG和IgM，还包括亚类(同种型)的免疫球蛋白，也就是IgG1、IgG2、IgG3、IgG4、IgA和IgA2。

术语“抗体片段”是指完整免疫球蛋白的任一片段或任何片段组合，例如F_ab、F_c、F_(ab)2和F_v片段。

术语“癌症”描述了通常以细胞生长不受控制为特征的生理病症。癌症的实例包括但不限于癌、淋巴瘤、胚细胞瘤、肉瘤和白血病。更具体的实例包括鳞状细胞癌、小细胞肺癌、非小细胞肺癌、胃肠癌、胰腺癌、成胶质细胞瘤、宫颈癌、卵巢癌、肝癌、膀胱癌、肝细胞瘤、乳腺癌、结肠癌、结肠直肠癌、子宫内膜癌、唾液腺癌、肾癌、前列腺癌、外阴癌、甲状腺癌、肝癌和各种类型的头颈部癌。

术语“化疗药物”是指用于癌症治疗的化合物。

术语“治疗”是指治疗、预防或抑制疾病的方法以达到临床上所需或有益的效果，包括但不限于缓解一种或多种症状、疾病消退、疾病进程减缓或停止。

术语“siRNA”是指短干扰RNA。

术语“TLR”是指Toll样受体。TLR可以是任何种类的Toll样受体。优选该术语是指人Toll样受体(hTLR)，例如TLR 1-10之一。

术语“表达TLR的癌”是指含有表达Toll样受体细胞的肿瘤。

术语“表达TLR的肿瘤细胞”是指表达Toll样受体的肿瘤细胞。

术语“表达”是指核酸转录和翻译形成多肽。细胞中，这是指多肽或分泌保留在细胞质中，或至少部分存在于细胞膜上。

术语“配体”是指能够与另一分子(例如受体)特异性结合的任何分子。术语“配体”包括激动剂和拮抗剂。例如，“配体”可以是小分子(有机分子)、抗体或抗体片段、siRNA、反义核酸、多肽、DNA和RNA等。

术语“TLR配体”是指能够与Toll样受体、尤其是人TLR 1-10特异性结合的任何分子。术语“TLR配体”包括TLR的激动剂和拮抗剂。例如，“TLR配体”可以是小分子(有机分子)、抗体或抗体片段、siRNA、反义核酸、多肽、DNA和RNA等。

术语“相应TLR配体”是指与特定TLR结合的配体。例如，TLR1配体是TLR1的相应TLR配体。同样，TLR2配体是TLR2的相应TLR配体。同样原理适用于TLR 3-10。

术语“患者”是指人和非人类动物。

术语“Poly IC”是指聚肌胞苷酸。

术语“Poly AU”是指聚腺尿苷酸。

术语“治疗有效量”是指TLR配体等组合物的量，可以改善一种或多种表征由TLR引起或介导的医学病症(例如癌症)的参数。

术语“有效量”是指TLR配体等药物组合物的量，可产生某种效果，例如诱导细胞凋亡。

术语“低剂量”是指物质的量低于被认为是正常获得某种效果(例如治疗效果)的量。

Toll样受体(TLR)特征鉴定

人Toll样受体(hTLR)家族由10个成员(hTLR 1-10)组成。hTLR1-10的完全可读框的核苷酸序列和相应氨基酸序列都是本领域已知的。例如，PCT公布号WO 01/90151公开了hTLR 1-10的序列，虽然该序列的编号不同于之后的公开命名。hTLR 1-10各自的核苷酸序列和氨基酸序列也可参见GenBank数据库，见下表1。

表1

TLR	核苷酸序列GenBank序号	氨基酸序列GenBank序号
			HTLR1	NM 003263	NP 003254
HTLR2	NM 003264	NP 003255

HTLR3	NM 003265	NP 003256
			HTLR4	NM 138557(同种型4)NM 138556(同种型2)NM 138554(同种型1)NM 003266(同种型3)	NP 612567(同种型D)NP 612566(同种型B)NP 612564(同种型A)NP 003257(同种型C)
HTLR5	NM 003268	NP 003259
			HTLR6	NM 006068	NP 006059
HTLR7	NM 016562	NP 057646
			HTLR8	NM 138636(同种型2)	NP 619542(同种型2)

	NM 016610(同种型1)	NP 057694(同种型1)
			HTLR9	NM 138688(同种型B)NM 017442(同种型A)	NP 619633(同种型B)AAF72189(同种型A)
hTLR10	NM 030956	AAK26744

一旦给出任何TLR的核酸序列和氨基酸序列，本领域技术人员就能够应用标准分子生物学技术获得任何TLR蛋白或其片段、抗该蛋白质或片段的抗体、核酸或其片段、核酸探针、反义核酸、siRNA等。然后，可用这些分子筛选表达TLR的癌或肿瘤细胞。

已鉴定出某些TLR配体，见下表2。本领域技术人员能分离或得到任何下述配体。或者，可从商业途径购买配体。

表2

TLR作为免疫应答的介质发挥作用。因此，TLR的治疗应用存在于肿瘤学、传染性疾病、自身免疫、变态反应、哮喘、COPD和心脏病学领域。

本发明部分基于以下发现：某些类型的肿瘤细胞表达Toll样受体，与这些TLR结合的配体有助于建立并改进肿瘤定向免疫应答的有效性。

筛选表达TLR的癌或肿瘤细胞

本发明方法的一个步骤包括筛选患有表达TLR癌的患者或筛选表达TLR的肿瘤细胞。

术语“筛选”是指确定某种目标物。在本申请内容里，短语“筛选患者”是指确定患有具体病症(例如表达TLR的癌)的患者。短语“筛选表达TLR的肿瘤细胞”是指确定表达Toll样受体的肿瘤细胞。

正如本领域所知那样，有许多筛选患有表达TLR癌的患者或筛选表达TLR的肿瘤细胞的方法。例如，可用抗体或抗体片段与表达TLR的肿瘤细胞结合，确定表达TLR的肿瘤细胞。优选用TLR3抗体与表达TLR3的肿瘤细胞结合，确定表达TLR3的肿瘤细胞。抗体或其片段可以药物组合物的形式体内给予，或可体外给予。优选对患者进行活组织检查，体外筛选肿瘤细胞。活组织检查前还可增加TLR的表达，作为征募并不包括在TLR配体治疗方案中的患者的可行方法。就TLR3而论，可在活组织检查或任何其它诊断过程(针吸或医学成像)的前几天，给予低剂量的I型IFN或TLR3配体本身。或者，可用本申请表2中所确定的任一种TLR配体或其它小分子与表达TLR的肿瘤细胞结合，确定表达TLR的肿瘤细胞。优选用TLR3配体与表达TLR3的细胞结合，确定表达TLR3的细胞。此外，筛选步骤优选在体外进行。而且，可使肿瘤细胞裂解以确定细胞是否表现出高水平的特定TLR蛋白(通过蛋白质印迹)或特定的TLR RNA(通过RNA印迹)。

筛选方法可包括检测标记的应用。例如，为了检测，需要标记上述抗体、抗体片段、小分子、DNA、RNA和其它配体。可通过目测或使用装置进行检测。虽然可使用任何检测标记，但是本领域常用的检测标记包括放射性标记、荧光标记和酶标记。

另外，为了确定表达TLR的肿瘤细胞，筛选步骤可能要确定具体的肿瘤细胞表达哪一种Toll样受体(TLR 1-10)。这是因为用于筛选表达TLR的肿瘤细胞的许多抗体、抗体片段、DNA、RNA、小分子或其它配体，与TLR 1-10中的各个TLR特异性地结合。

还可用间接方式筛选患有表达TLR癌的患者或筛选表达TLR的肿瘤细胞的步骤。例如，癌表达特定的TLR可与具有具体病原的癌的具体亚型相关。任何这种具体病原的标记，例如病毒，可表示特定TLR的表达，将是有用的指导使用相应TLR配体的标记。

给予患者TLR配体

本发明方法的另一个步骤包括给予患者治疗有效量的TLR配体。该步骤包括以药物组合物的形式给予TLR配体。例如，药物组合物可为片剂的形式，使得配体吸收进入血流。然后，循环系统将TLR配体递送到表达TLR的癌中，使得配体与癌可相互接触。该接触步骤将使配体与癌的Toll样受体结合，诱导癌的生长抑制和细胞凋亡。或者，可局部给予药物组合物，例如用于治疗黑素瘤。

如上所述，筛选步骤可能确定癌表达的特定TLR。优选给药步骤包括向患有表达Toll样受体的癌的患者给予相应配体。例如，如果癌表达TLR1，则优选给予患者有效量的TLR1配体。同样，如果癌表达TLR2，则优选给予患者有效量的TLR2配体。同样原理也适用于TLR 3-10。

优选本发明的方法包括向患有表达TLR3癌的患者给予有效量的TLR3配体。优选TLR3配体是激动剂。更优选TLR3配体是PolyAU。最优选TLR3配体是Poly IC。优选癌为结肠癌细胞或乳腺癌。

优选本发明的方法还包括给予患者化疗药物或癌症治疗。

优选本发明的方法还包括给予患者低剂量的I型IFN或TLR3配体。例如，低剂量的I型IFN的范围介于1-3MU，优选2MU。更优选低剂量的I型IFN小于1MU。

使表达TLR的肿瘤细胞与TLR配体接触

或者，本发明方法的步骤包括使表达TLR的肿瘤细胞与有效量的TLR配体接触。在体内，该接触步骤包括以药物组合物的形式给予患者TLR配体。在体外，该接触步骤包括使表达TLR的肿瘤细胞与TLR配体的物理距离非常接近，使得配体和细胞相互接触。这一接触步骤会使得配体与细胞Toll样受体结合，诱导肿瘤细胞的生长抑制和凋亡。

如上所述，筛选步骤可能确定肿瘤细胞表达的特定TLR。优选接触步骤包括使表达Toll样受体的细胞与其相应配体接触。例如，如果是表达TLR1的肿瘤细胞，该细胞优选与有效量的TLR1配体接触。同样，如果是表达TLR2的肿瘤细胞，则该细胞优选与有效量的TLR2配体接触。相同原理也适用于TLR 3-10。

优选本发明的方法包括使表达TLR3的肿瘤细胞与有效量的TLR3配体接触。优选TLR3配体是激动剂。更优选TLR3配体是PolyAU。最优选TLR3配体是Poly IC。优选细胞是结肠癌细胞或乳腺癌细胞。

优选本发明的方法还包括使细胞与化疗药物或癌症治疗接触。

优选本发明的方法还包括使细胞与低剂量的I型IFN或TLR3配体接触。例如，低剂量的I型IFN的范围介于1-3MU，优选2MU。更优选低剂量的I型IFN小于1MU。

多肽

本发明的方法中，可以使用多肽，例如抗体、抗体片段或脂肽，以便在筛选步骤中筛选表达TLR的癌或细胞、在给药步骤中给予患者TLR配体、或者在接触步骤中诱导表达TLR的细胞生长抑制和凋亡。另外，可形成TLR多肽或其片段，以确定或产生配体，例如会与TLR结合的抗体。

本文所用的术语“多肽”或“肽”是指例如多肽的片段或区段，该多肽含有至少8个、优选至少12个、更优选至少20个、最优选至少30个以上的连续氨基酸残基，达到及包括完整蛋白质的总残基数目。术语“多肽”还包括带有缺失、添加、修饰和置换的多肽、多肽类似物、变体和糖基化或非糖基化多肽。

置换包括保守置换和非保守置换。

氨基酸残基的修饰可包括但不限于C端脂族酯或酰胺或含羧基侧链残基的脂族酯或酰胺、含羟基残基的O-酰基衍生物和N端氨基酸或含氨基残基的N-酰基衍生物，例如赖氨酸或精氨酸。

类似物为包含修饰的多肽，例如掺入非天然的氨基酸残基，或磷酸化氨基酸残基，例如磷酸酪氨酸、磷酸丝氨酸或磷酸苏氨酸残基。其它可能的修饰包括磺化、生物素化或加入其它部分，特别是那些分子形状类似于磷酸酯基团的部分。

多肽的合成技术记载于例如Merrifield，J.Amer.Chem.Soc.85：2149(1963)；Merrifield，Science 232：341(1986)和Atherton等，SolidPhase Peptide Synthesis：A Practical Approach，1989，IRL Press，Oxford。

可通过以下方法制备多肽类似物：化学合成或使用位点定向诱变[Gillman等，Gene 8：81(1979)；Roberts等，Nature，328：731(1987)或Innis(主编)，1990，PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，Academic Press，New York，NY]，或聚合酶链式反应方法[PCR，Saiki等，Science 239：487(1988)]，正如Daugherty等[NucleicAcids Res.19：2471(1991)]举例说明的一样，修饰编码完整受体的核酸。添加附加表位标记以期纯化或检测重组产物。

核酸

可用核酸筛选患有表达TLR癌的患者或筛选表达TLR的肿瘤细胞。为了筛选患者，优选对患者的肿瘤进行活组织检查。然后，体外分析肿瘤细胞TLR核酸的表达。

如本申请表1中所示，hTLR 1-10核酸序列和氨基酸序列都是本领域已知的。本领域技术人员可用已知序列或其片段进行杂交实验，确定特定的肿瘤细胞是否表达TLR核酸。例如，本领域技术人员可用已知的特定TLR序列进行RNA印迹分析，确定肿瘤细胞是否表达该特定的TLR。

另外，可用编码具体TLR或其片段的核酸产生TLR多肽。然后，可用该TLR多肽产生抗特定TLR的抗体。

本文的核酸“片段”定义为包含至少17个、一般至少25个、优选至少35个、更优选至少45个、最优选至少55个以上的连续核苷酸的核苷酸序列。

核酸操纵和表达的通用技术概述于例如Sambrook等，MolecularCloning：A Laboratory Manual(第二版)，1989，第1-3卷，Cold SpringHarbor Laboratory。

抗体产生

本发明的方法中，TLR特异性的抗体及其片段可用于筛选步骤以筛选表达TLR的细胞、用于给药步骤以给予患者TLR配体、或者用于接触步骤以诱导表达TLR的细胞生长抑制和凋亡。

可产生各TLR的抗原(即免疫原性)片段。不论它们是否与TLR配体结合，该片段像完整受体一样，用作抗原以制备可与完整受体结合的抗体。更短的片段可连在或附着在载体上。因为本领域非常清楚，表位一般含有至少约5个、优选至少8个氨基酸残基[Ohno等，Proc.Natl.Acad Sci.USA 82：2945(1985)]，用于生产抗体的片段一般至少如此大小。如上所述，它们优选含有甚至更多的残基。可通过常规实验，容易地确定给出的片段是否有免疫原性。

虽然在具有免疫能力的宿主中，无需将完整的TLR用作抗原以诱发抗体产生，但是较小的抗原片段优选通过与免疫原性载体分子(即具有在宿主动物体内独立诱发免疫应答特性的大分子)交联或多联、或偶联，最先提供较多的免疫原性。可能需要与载体分子交联或缀合，因为小的多肽片段有时作为半抗原(能够与抗体特异性结合，但不能诱发抗体产生的分子，也就是说，它们无免疫原性)。该片段与免疫原性载体分子缀合，通过众所周知的“载体效应”，为它们提供更多的免疫原性。

合适的载体分子包括蛋白质和天然或合成的高分子化合物，例如多肽、多糖、脂多糖等。特别优选蛋白载体分子，包括但不限于匙孔

血蓝蛋白和哺乳动物血清蛋白，例如人丙种球蛋白、牛丙种球蛋白、人血清白蛋白、牛血清白蛋白、兔血清白蛋白或这些蛋白的甲基化衍生物或其它衍生物。其它蛋白载体对本领域的技术人员是显而易见的。对于宿主动物，蛋白载体优选是外源的，但这不是必要的，可在宿主动物体内诱发抗片段的抗体。

可用本领域熟知的方法，获得与载体分子共价偶联，其准确的选择受控于所用载体分子的性质。当免疫原性载体分子为蛋白质时，本发明的片段可用例如二环己基碳二亚胺或戊二醛等水溶性碳二亚胺进行偶联。

还可使用这一类的偶联剂，无需使用单独的载体分子，便使片段与自身交联。这种交联形成的聚合体还能增加免疫原性。已知的佐剂还可单独使用或与偶联体或聚合体联合使用，增加免疫原性。

用于动物疫苗合适的佐剂包括但不限于佐剂65(含有花生油、二缩甘露醇单油酸酯和单硬脂酸铝)；弗氏完全或不完全佐剂；矿物凝胶，例如氢氧化铝、磷酸铝和明矾；表面活性剂，例如十六烷胺、十八烷胺、溶血磷脂酰胆碱、溴化二甲基二(十八烷基)铵、N，N-双十八烷基-N′，N′-二(2-羟甲基)丙二胺、甲氧基十六烷基甘油和多聚醇(pluronic polyols)；聚阴离子，例如吡喃、硫酸萄聚糖、poly IC、聚丙烯酸和卡波普；肽，例如胞壁酰二肽、二甲基甘氨酸和他福新；及油乳胶。还可在掺入脂质体或其它微载体后给予多肽。

已有有关佐剂和免疫测定各方面的资料记载，例如P.Tijssen的丛书Practice and Theory of Enzyme Immunoassays，第三版，1987，Elsevier，New York。其它有用的涵盖多克隆抗血清制备方法的参考文献包括Microbiology，1969，Hoeber Medical Division，Harper和Row；Landsteiner，Specificity of Serological Reactions，1962，DoverPublications，New York及Williams等，Methods in Immunology andImmunochemistry，第1卷，1967，Academic Press，New York。

可直接使用应用标准方法从免疫动物中产生的血清，或者可应用标准方法从血清中分离出IgG组分，例如血浆除去法或用IgG特异性吸附剂(例如固定化A蛋白)的吸附色谱法。或者，可制备单克隆抗体。

通过众所周知的技术制备产生抗TLR或其抗原性片段的单克隆抗体的杂交瘤。通常，该方法包括无限增殖细胞系与产生所需抗体的B淋巴细胞融合。或者，可采用产生无限增殖抗体生成细胞系的非融合技术，例如，病毒诱导的转化[Casali等，Science 234：476(1986)]。无限增殖细胞系通常是转化的哺乳动物细胞，尤其是来源于啮齿动物、牛和人的骨髓瘤细胞。因为方便且易于获取，所以最常用的是大鼠或小鼠骨髓瘤细胞系。

从注射抗原的哺乳动物中获取产生抗体的淋巴细胞的技术广为人知。一般来说，如果采用来源于人的细胞，则使用外周血淋巴细胞(PBL)，或者使用来源于非人类哺乳动物的脾细胞或淋巴结细胞。给宿主动物注射重复剂量的纯化抗原(人细胞则体外致敏)，使该动物产生所需的抗体生成细胞后，收获细胞，用于与无限增殖细胞系融合。融合技术也是本领域众所周知的，一般来说，包括将细胞与聚乙二醇等融合剂进行混合。

通过标准方法筛选杂交瘤，例如HAT(次黄嘌呤-氨基蝶呤-胸苷)筛选法。用标准免疫测定法，例如蛋白质印迹法、ELISA(酶联免疫吸附测定)、RIA(放射免疫测定)等，筛选分泌所需抗体的杂交瘤。用标准蛋白质纯化技术从培养基中回收抗体[Tijssen，Practice andTheory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)]。

有许多参考文献提供应用上述技术的指导[Kohler等，HybridomaTechniques(Cold Spring Harbor Laboratory，New York，1980)；Tijssen，Practice and Theory of Enzyme Immunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)；Campbell，Monoclonal Antibody Technology(Elsevier，Amsterdam，1984)；Hurrell，Monoclonal Hybridoma Antibodies：Techniques and Applications(CRC Press，Boca Raton，FL，1982)]。还可用众所周知的噬菌体文库系统产生单克隆抗体。参见例如Huse等，Science 246：1275(1989)；Ward等，Nature，341：544(1989)。

可使用由此所产生的抗体，不论是多克隆抗体还是单克隆抗体，通过熟知的方法，例如以结合到固相载体上的固定化形式，通过免疫亲和色谱法纯化受体。

还可使用抗抗原片段的抗体，未标记或者通过标准方法标记，作为TLR免疫测定的基础。所用的特殊标记将取决于免疫测定的类型。可以使用的标记的实例包括但不限于放射性标记，例如³²P、¹²⁵I、³H和¹⁴C；荧光标记，例如荧光素及其衍生物、罗丹明及其衍生物、丹磺酰和伞形酮；化学发光剂(chemiluminescer)，例如萤光素(luciferia)和2，3-二氢二氮杂萘二酮；以及酶，例如辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、溶菌酶和葡糖-6-磷酸脱氢酶。

可通过已知方法采用这类标记来标记抗体。例如，可使用醛、碳二亚胺、马来酰亚胺、拟除虫菊酯类(imidates)、琥珀酰亚胺、bisdiazotized benzadine等偶联剂，将荧光标记、化学发光标记或酶标记等标记在抗体上。所用的常规方法是本领域众所周知的，记载于例如Immunoassay：A PracticalGuide，1987，Chan(主编)，AcademicPress，Inc.，Orlando，FL。例如，可以对受体纯化时所得到的部分进行这种免疫测定。

本发明的抗体还可用于鉴定表达克隆系统中表达TLR的特定cDNA克隆。

对受体的配体结合位点特异性的中和抗体还可用作拮抗剂(抑制剂)以阻断配体结合。通过常规实验法，例如，用下文所述的放射性配体结合测定法，可容易地鉴定这种中和抗体。可用完整的抗体分子，或者众所周知的抗原结合片段例如Fab、Fc、F(ab)₂和Fv片段，实现对TLR活性的拮抗作用。

这些片段的定义可参见例如Klein，Immunology(John Wiley，NewYork，1982)；Parham，第14章，Weir编写的Immunochemistry，第4版(Blackwell Scientific Publishers，Oxford，1986)。抗体片段的应用和产生还记载于例如：Fab片段[Tijssen，Practice and Theory of EnzymeImmunoassays(Elsevier，Amsterdam，1985)]、Fv片段[Hochman等，Biochemistry 12：1130(1973)；Sharon等，Biochemistry 15：1591(1976)；Ehrlich等，美国专利第4,355,023号]和抗体半分子(Auditore-Hargreaves，美国专利第4,470,925号)。基于已知抗体重链和轻链可变区序列的重组Fv片段的制备方法还记载于例如Moore等(美国专利第4,642,334号)和Plückthun[Bio/Technology 9：545(1991)]。或者，可用标准方法进行化学合成。

还可使用抗作为抗原的受体所诱发的抗体，产生抗独特型抗体(多克隆抗体和单克隆抗体)。这些抗体是有用的，因为它们可模拟受体。

药物组合物

TLR激动剂和拮抗剂在治疗上可用于刺激或阻断TLR的活性，因此用来治疗任何由TLR引起或介导的医学病症。主治医师在考虑可以改善治疗药物作用的各方面因素(例如患者的病症、体重、性别和饮食、给药时间和其它临床因素)后，将决定治疗应用中所涉及的给药方案。

这些药物的治疗给药的典型方案是本领域众所周知的。通常经胃肠外、腹膜内、静脉内、皮下，给予药物组合物，或者通过肌内注射、或输注或任何其它可接受的系统方法，给予药物组合物。治疗剂量通常从低水平不断提高以使安全性和功效达到最佳。日剂量的范围一般约0.01-20mg蛋白/kg体重。典型的剂量范围介于约0.1-5mg/kg体重之间。

可以调整剂量以应对较小的分子大小和给药后可能衰减的半寿期(清除时间)。本领域技术人员对此都十分重视，然而，除其它类型的抑制剂(包括有机小分子和抑制性配体类似物)外，TLR拮抗剂还包括中和抗体或其结合片段，这可用本发明的方法予以确定。

虽然药物组合物可以简单的溶液剂给予，但更常用的是与其它材料例如载体、优选药物载体联用。可用的药物载体可为任何适于向患者递送药物组合物的相容性无毒物质。载体中可包括无菌水、醇、脂肪、蜡和惰性固体。药物组合物中还可掺入药学上可接受的助剂(缓冲剂、分散剂)。一般来说，用于胃肠外给予该药的组合物是众所周知的，例如Remington′s Pharmaceutical Science，第17版(MackPublishing Company，Easton，PA，1990)。或者，可通过植入药物释放系统将药物组合物导入患者体内[Urquhart等，Ann.Rev.Pharmacol.Toxicol.24：199(1984)]。

可以许多常规的剂量制剂给予治疗制剂。制剂通常包括至少一种活性成分以及一种以上药学上可接受的载体。制剂可包括适于口服、直肠、鼻内或胃肠外(包括皮下、肌内、静脉内和皮内)给药的制剂。

制剂可方便地呈单位剂型，可通过任何制药领域熟知的方法制备。参见例如Gilman等(主编)(1990)，The Pharmacological Bases ofTherapeutics，第8版，Pergamon Press；Remington′s PharmaceuticalSciences，出处同上，Easton，Penn.；Avis等(主编)(1993)PharmaceuticalDosage Forms：Parenteral Medications Dekker，New York；Lieberman等(主编)(1990)Pharmaceutical Dosage Forms：Tablets Dekker，NewYork；和Lieberman等(主编)(1990)，Pharmaceutical Dosage Forms：Disperse Systems Dekker，New York。

联合治疗

可将TLR配体与其它对于相同目的有效的药物或治疗剂联合给予，改进TLR配体在预防或治疗癌症中的有效性。例如，TLR配体可与化疗药物或癌症治疗联合给予。优选TLR配体是TLR3激动剂。

“化疗药物”是用于治疗癌症的化合物。化疗药物的实例包括烷化剂，例如塞替派和环磷酰胺(CYTOXAN^TM)；烷基磺酸盐，例如白消安、英丙舒凡和哌泊舒凡；吖丙啶，例如苯佐替派、卡波醌、美妥替哌和乌瑞替派(uredopa)；氮丙啶和methylamelamines，包括六甲蜜胺、曲他胺、trietylenephosphoramide、塞替派和trimethylolomelamine；acetogenins(尤其是泡番荔枝辛(bullatacin)和番荔枝塔亭丁(bullatacinone))；喜树碱(包括合成类似物托泊替康)；苔藓抑素；callystatin；CC-1065(包括其阿多来新、卡折来新和比折来新合成类似物)；念珠藻环肽(cryptophycin)(尤其是念珠藻环肽1和念珠藻环肽8)；多拉司他汀；duocarmycin(包括合成类似物、KW-2189和CBI-TMI)；艾榴素(eleutherobin)；pancratistatin；sarcodictyin；海绵素(spongistatin)；氮芥，例如苯丁酸氮芥、萘氮芥、cholophosphamide、雌莫司汀、异环磷酰胺、氮芥(mechlorethamine)、盐酸氧氮芥、美法仑、新氮芥、苯芥胆甾醇、泼尼莫司汀、曲磷胺和乌拉莫司汀；亚硝基脲，例如卡莫司汀、氯脲菌素、福莫司汀、洛莫司汀、尼莫司汀、雷莫司汀；抗生素，例如enediyne抗生素(例如卡奇霉素(calicheamicin)、尤其是卡奇霉素γ11和卡奇霉素φ11，参见例如Agnew，Chem Intl.Ed.Engl.，33：183-186(1994)；蒽环类抗生素，包括蒽环类抗生素A；二膦酸盐，例如氯膦酸盐；esperamicin；以及新制癌菌素生色团和相关色蛋白enediyne抗生素生色团、阿克拉霉素、放线菌素、authramycin、偶氮丝氨酸、博来霉素、放线菌素C、carabicin、洋红霉素、嗜癌霉素、色霉素、放线菌素D、柔红霉素、地托比星、6-重氮-5-氧代-L-正亮氨酸(6-diazo-5-oxo-L-norleucine)、多柔比星(Adriamycin^TM)(包括吗啉代-多柔比星、氰基吗啉代-多柔比星、2-吡咯啉基-多柔比星和去氧多柔比星)、表柔比星、依索比星、伊达比星、马塞罗霉素、丝裂霉素C等丝裂霉素、麦考酚酸、诺拉霉素、橄榄霉素、培洛霉素、potfiromycin、嘌罗霉素、三铁阿霉素、罗多比星、链黑霉素、链佐星、杀结核菌素、乌苯美司、净司他丁和佐柔比星；抗代谢药，例如甲氨蝶呤和5-氟尿嘧啶(5-FU)；叶酸类似物，例如denopterin、甲氨蝶呤、蝶罗呤和三甲曲沙；嘌呤类似物，例如氟达拉滨、6-巯基嘌呤、thiamiprine和硫鸟嘌呤；嘧啶类似物，例如安西他滨、阿扎胞苷、6-氮尿苷、卡莫氟、阿糖胞苷、二脱氧尿苷、去氧氟尿苷、依诺他滨和氟尿苷；雄激素，例如卡普睾酮、丙酸屈他雄酮、环硫雄醇、美雄烷和睾内酯；抗肾上腺药，例如氨鲁米特、米托坦和曲洛司坦；叶酸补充物，例如frolinicacid；醋葡醛内酯；aldophosphamide glycoside；氨基酮戊酸；恩尿嘧啶；安吖啶；bestrabucil；比生群；依达曲沙(edatraxate)；defofamine；秋水仙胺；地吖醌；elfornithine；依利醋铵；埃坡霉素(epothilone)；依托格鲁；硝酸镓；羟基脲；香菇多糖；氯尼达明(Ionidamine)；美登素类药(maytansinoids)，例如美登素和安丝菌素(ansamitocins)；米托胍腙；米托蒽醌；莫哌达醇；二胺硝吖啶(nitracrine)；喷司他丁；phenamet；吡柔比星；洛索蒽醌；鬼臼酸；2-乙基酰肼；丙卡巴肼；PSK；雷佐生；根霉素；西佐喃；锗螺胺；细格孢氮杂酸；三亚胺醌；2，2′，2″-三氯三乙胺；单端孢菌素(尤其是T-2毒素、疣孢菌素A(verracurin A)、杆孢菌素A和蛇形菌素)；乌拉坦；长春地辛；达卡巴嗪；甘露莫司汀；二溴甘露醇；二溴卫矛醇；派泊溴烷；gacytosine；阿拉伯糖苷(“Ara-C”)；环磷酰胺；塞替派；紫杉烷二萜(taxoids)，例如紫杉醇(TAXOL，Bristol-Myers Squibb Oncology，Princeton，N.J.)和多西他赛(doxetaxel)(TAXOTERE

，Rhone-Poulenc Rorer，Antony，France)；苯丁酸氮芥；吉西他滨(Gemzar^TM)；6-硫鸟嘌呤；巯嘌呤；甲氨蝶呤；铂类似物，例如顺铂和卡铂；长春碱；铂；依托泊苷(VP-16)；异环磷酰胺；米托蒽醌；长春新碱；长春瑞滨(NavelbineT^TM)；诺安托；替尼泊苷；依达曲沙；道诺霉素；氨基蝶呤；适罗达；伊班膦酸盐；CPT-11；拓扑异构酶抑制剂RFS 2000；二氟甲基鸟氨酸(DMFO)；类视色素，例如维A酸；卡培他滨；以及药学上可接受的任何上述药物的盐、酸或衍生物。该定义还包括抗激素药物，该药用作调节或抑制作用于肿瘤的激素，例如抗雌激素和选择性雌激素受体调节剂(SERM)，包括例如他莫昔芬(包括Nolvadex^TM)、雷洛昔芬、屈洛昔芬、4-羟基他莫昔芬、曲沃昔芬、盐酸雷洛昔芬(keoxifene)、LY117018、奥那司酮和托瑞米芬(Fareston^TM)；抑制芳香酶的芳香酶抑制剂，该酶调节肾上腺雌激素的产生，例如4(5)-咪唑、氨鲁米特、醋酸甲地孕酮(Megace^TM)、依西美坦、福美坦、法倔唑、伏氯唑(Rivisor^TM)、来曲唑(Femara^TM)和阿那曲唑(Arimidex^TM)；抗雄激素，例如氟他胺、尼鲁米特、比卡鲁胺、亮丙立德和戈舍瑞林；以及药学上可接受的任何上述药物的盐、酸或衍生物。

癌症“治疗”包括癌切除手术以及缩小或杀死癌或肿瘤的放射治疗。

也可联合给予TLR配体和低剂量的I型IFN，改进TLR配体在预防或治疗癌症中的有效性。例如，低剂量I型IFN的范围介于1-3MU之间，优选2MU。更优选低剂量的I型IFN小于1MU。优选TLR配体是TLR3激动剂。

如上所述，可由主治医师确定联合治疗所涉及的剂量方案。

实施例

通过参照下述非限制性的实施例(作为本发明代表性实例而提供)，可以更好地理解本发明。为了更全面地举例说明本发明，因此提供下述实施例，但决不能认为是对本发明广泛范围的限制。除非另有说明，下面所给出的固体/固体混合物、液体/液体和固体/液体的百分比分别以重量/重量、体积/体积和重量/体积为准。细胞培养时一般保持无菌条件。

材料和一般方法

采用下述标准方法：例如，Maniatis等，Molecular Cloning：ALaboratory Manual，1982，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold SpringHarbor Press；Sambrook等，Molecular Cloning：A Laboratory Manual，(第二版)，第1-3卷，1989，Cold Spring Harbor Press，NY；Ausubel等，Biology，Greene Publishing Associates，Brooklyn，NY；或Ausubel等(1987和增刊)，Current Protocols in Molecular Biology，Greene/Wiley，New York；Innis等(主编)PCR Protocols：A Guide to Methods andApplications，1990，Academic Press，N.Y.。

细胞系和试剂

从ATCC(Rockville，MD)获取人乳腺肿瘤细胞系Cama-1、SW527、BT-483和MCF-7，在含有4.5g/ml葡萄糖(Invitrogen，SanDiego，CA)的DMEM F12中培养，培养基补充了2mM L-谷氨酰胺(LifeTechnologies，Paisley Park，GB)、10％胎牛血清(Life Technologies)、160μg/ml gentalline(Schering Plough，Kenilworth，NJ)、2.5mg/ml碳酸氢钠(Life Technologies)、氨基酸(Invitrogen)和1mM丙酮酸钠(Sigma-Aldrich，Saint Louis，MO)(称为完全培养基)。从Invivogen(San Diego，CA)获取聚肌胞苷酸Poly IC。肽聚糖(PGN)和脂多糖(LPS)购自Sigma-Aldrich。I型IFN受体阻断mAb购自PBL BiochemicalLaboratories(Piscataway，NJ)，TNF-α中和mAb购自Genzyme(Cambridge，MA)。抗Stat1抗体、磷酸化Stat1(酪氨酸701)和PKR购自Cell Signaling(Beverly，MA)。抗人IFN-β抗体购自R&D Systems(Minneapolis，MIN)。抗NF-κB p65亚基抗体、TRAF6和β-微管蛋白购自Santa Cruz Biotechnology(Santa Cruz，CA)。通用型胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk购自R&D Systems。环己酰亚胺(CHX)购自Sigma-Aldrich。

按照医院生物伦理协议(Hospital bioethical protocols)，从CentreLéon Bérard(Lyon，France)获取人原代乳腺肿瘤样本。按照生产商的说明书，用胶原酶A(Sigma-Aldrich)消化，洗涤，用HEA-microbeads(Mylteni Biotech，Bergisch Gladbach，Germany)在人上皮抗原(HEA)阳性细胞中进行富集培养，得到单细胞悬液。最终的单细胞悬液含有80％以上的HEA阳性细胞和2％以下的CD4⁺造血污染物。

细胞凋亡分析

用结晶紫染色(Sigma-Aldrich)测定TLR配体处理后的细胞恢复。将细胞以10⁴细胞/孔加入96孔板中。有TLR配体或无TLR配体时培养72小时后，细胞用PBS洗涤，在6％甲醛(Sigma-Aldrich)中固定20分钟，洗涤两次，然后用0.1％结晶紫染色10分钟。洗涤后，在1％SDS中孵育1小时，用Vmax读板仪(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)在605nm下读取吸光度。按照生产商的说明书，用膜联蛋白-FITC细胞凋亡检测试剂盒(BD Pharmingen，San Diego，CA)进行膜联蛋白V染色。70％乙醇中过夜透化后，用3μg/ml碘化丙锭(PI)(Molecular probes，Eugene，OR)染色，检测近二倍体(sub-diploid)细胞。用Cellquest Pro软件(Becton Dickinson)，在配备双鉴别模块(doublet-discrimination module)的FACScalibur(Becton Dickinson，MountainView，CA)上，通过流式细胞术进行荧光分析。

生物化学

使Cama-1细胞在含1％乙基苯基聚乙二醇(Nonidet-P40)的缓冲液中裂解。在SDS-聚丙烯酰胺凝胶(Invitrogen)各泳道中加入20μg总蛋白质。采用上述抗体，用标准技术进行蛋白质印迹(WB)。根据Fossiez等在“T细胞白介素17诱导基质细胞产生促炎细胞因子和造血细胞因子(T cell interleukin-17 induces stromal cells to produceproinflammatory and hematopoietic cytokines)”，J.Exp.Med.，第183(6)卷，第2593-2603页(1996)中描述的方法，在实验室中制备抗IRAK-4单克隆抗体。

细胞因子分泌

按照生产商的说明书(R&D Systems)，用DuoSet ELISA试剂盒，通过标准酶联测定法(ELISA)测量培养上清液中IL-6的分泌。

siRNA实验

将Cama-1细胞以3×10⁵细胞/孔加入6孔板中。过夜贴壁后，在含有3μg/ml脂转染胺试剂2000(Invivogen)和100nM siRNA的OptiMEM培养基(Life technologies)中，进行siRNA转染5小时。然后洗涤细胞，在完全培养基中培养72小时后，用Poly IC处理，分析细胞凋亡。对TLR3、PKR、IRAK-4、TRAF6和p65特异性的siRNA双链体购自Dharmacon(Lafayette，CO)，作为SMART-Pools。TRIFsiRNA购自同一供应商，作为单种寡双链体(single oligoduplexes)(5’-GCUCUUGUAUCUGAAGCAC-3’)(SEQ ID NO：23)。用下述引物，应用Taq PCR ReadyMix(Sigma-Aldrich)，通过PCR(35轮循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟)评价TLR3和TRIF表达：对于TLR3，5’-AACGATTCCTTTGCTTGGCTTC-3’(正向)(SEQ ID NO：24)/5’-GCTTAGATCCAGAATGGTCAAG-3’(反向)(SEQ ID NO：25)；对于TRIF，5’-ACTTCCTAGCGCCTTCGACA-3’(正向)(SEQ IDNO：26)/5’-ATCTTCTACAGAAAGTTGGA-3’(反向)(SEQ IDNO：27)。如上所述，通过WB评价PKR、IRAK-4、TRAF6和p65的表达。

实施例1

在这些实验中，在6种人结肠直肠腺癌细胞系中，用RT-PCR检测TLR 1-10中各TLR的表达。所分析的这6种细胞系是Caco 2、LoVo、Colo 320 DM、SNU-C1、T84和Colo 205。从各细胞系中提取等量的mRNA。随后，用hTLR特异性引物，通过PCR 35轮循环(94℃30秒、60℃45秒，72℃90秒)，扩增mRNA。使用下列引物：

TLR1F：caggatcaaggtacttgatcttc(SEQ ID NO：1)；

TLR1R：tttctctcatgaaggcaaatctg(SEQ ID NO：2)；

TLR2F：ctcaggagcagcaagcactg(SEQ ID NO：3)；

TLR2R：atcttccgcagcttgcagaag(SEQ ID NO：4)；

TLR3F：aacgattcctttgcttggcttc(SEQ ID NO：5)；

TLR3R：gcttagatccagaatggtcaag(SEQ ID NO：6)；

TLR4F：ctcagaatgactttgcttgtac(SEQ ID NO：7)；

TLR4R：gcaggacaatgaagatgatacc(SEQ ID NO：8)；

TLR5F：cgaacctcatccacttatcag(SEQ ID NO：9)；

TLR5R：gtgaactttagggactttaagac(SEQ ID NO：10)；

TLR6F：ccaatgtacctgtgagctaag(SEQ ID NO：11)；

TLR6R：ccactcactctggacaaagttg(SEQ ID NO：12)；

TLR7F：ggatctgtctttcaattttgaac(SEQ ID NO：13)；

TLR7R：ccaaggtctgcccatacttg(SEQ ID NO：14)；

TLR8F：gctatccttgtgatgagaaaaag(SEQ ID NO：15)；

TLR8R：gcattgaagcacctcggacag(SEQ ID NO：16)；

TLR9F：actgtttcgccctctcgctg(SEQ ID NO：17)；

TLR9R：gccagcacaaacagcgtcttg(SEQ ID NO：18)；

TLR10F：ttgttcagagctgccaggaag(SEQ ID NO：19)；and

TLR10R：gcaaagtagaattcataatggcac(SEQ ID NO：20)。

然后，分析经溴化乙锭染色的琼脂糖凝胶上的PCR产物。

这些实验结果表明，Caco 2细胞系表达TLR 2、5、7和9。LoVo细胞系表达TLR 2、3、4、5和6。Colo 320 DM细胞系表达TLR 5和6。SNU-C1细胞系表达TLR 4。T84细胞系表达TLR 4、5和6。Colo 205细胞系表达TLR 4、5和6。

对8种人肺细胞系(NCI-H526、SHP-77、NCI-N417、A549、NCI-H358、A427、NCI-H292、NCI-H187)和4种人乳腺癌细胞系(SW527、Cama-1、BT483、MCF-7)也进行了类似的分析。这些实验结果表明，NCI-H526细胞系(小细胞肺癌)表达TLR 2、3、5和9。SHP-77细胞系(SCLC的大细胞变种)表达TLR 4、5、6、7、9和10。NCI-N417细胞系(小细胞肺癌)表达TLR 5。A549细胞系(肺癌)表达TLR 1、2、3、4、5、6、7和10。NCI-H358细胞系(细支气管肺泡癌)表达TLR 2、4、5、6、7和10。A427细胞系(肺癌)细胞系表达TLR 2、3、5和6。NCI-H292细胞系(表皮样肺癌)表达TLR 1、2、3、4、5、6和10。NCI-H187细胞系(小细胞肺癌)表达TLR 5、6和10。SW527细胞系(乳腺癌)表达TLR 2、4、6和10。Cama-1细胞系(乳腺癌)表达TLR 2、5、6和10。BT483细胞系(乳腺癌)表达TLR 2、4、5、6、7、9和10。MCF-7细胞系(乳腺癌)表达TLR 2、5、6和9。

可见所有所测试的这些来自人结肠、乳腺和肺的肿瘤系都表达多种TLR转录物。然而，就各细胞系表达哪一种TLR及其表达水平而言，基本上仍然存在异质性。

实施例2

分析了4种人乳腺肿瘤细胞系Cama-1、SW527、BT483和MCF-7对Poly IC作出反应时的细胞死亡。细胞用5μg/ml PGN、50μg/ml PolyIC或10μg/ml LPS培养72小时。对照细胞用PBS培养。通过结晶紫染色评价细胞毒性，以占对照的百分比表示。

对照细胞平均显示100％的细胞恢复(cell recovery)。PGN细胞显示平均95％的细胞恢复。LPS处理的细胞显示平均95％的恢复。用PolyIC处理的细胞平均显示67.5％的细胞恢复。具体地讲，Cama-1、SW527、BT483和MCF-7细胞系分别显示的细胞恢复为33％、75％、67％和100％。

数据表示，在三种测试细胞系Cama-1、BT483和SW527中，PolyIC引发细胞恢复的减少。从数据可看出，Cama-1细胞系始终显示十分强烈的减少。然而，在MCF-7细胞系中，Poly IC不会引起细胞恢复减少。

此外，还测试了其它TLR配体，以确定任何可能的细胞毒性作用。测试配体是PGN、LPS、鞭毛蛋白(Flagellin)、R848和CpG。用5μg/ml PGN、10μg/ml LPS、50ng/ml鞭毛蛋白、6μg/ml R848、10μg/mlCpG ODN或用PBS为对照，培养细胞72小时。用结晶紫染色评价细胞恢复，以占对照的百分比表示。这些配体中没有一种显著减少四种乳腺癌细胞系(Cama-1、BT483、SW527和MCF-7)中任一种的细胞恢复。虽然PGN对细胞恢复无作用，但它在某些细胞系中诱导IL-8分泌，因此确定缺乏细胞毒性不是因为缺乏TLR激发。

实施例3

分析Cama-1细胞对Poly IC作出反应时TLR3 mRNA的表达。Cama-1细胞在完全培养基(含有4.5g/ml葡萄糖的DMEM F12，补充了2mM L-谷氨酰胺、10％胎牛血清、160μg/ml gentalline、2.5mg/ml碳酸氢钠)中，或者单独，或者与LPS(5μg/ml)和/或与Poly IC(5μg/ml)一起培养48小时。提取各组细胞中的mRNA。然后将mRNA反转录，用以下hTLR3的特异性引物进行35轮循环的PCR扩增(同上述实施例1)：TLR3F：aacgattcctttgcttggcttc(SEQ ID NO：5)和TLR3R：gcttagatccagaatggtcaag(SEQ ID NO：6)。静息Cama-1细胞不能扩增TLR3 mRNA。

将用hTLR3特异性引物经RT-PCR扩增的DNA进行凝胶电泳。在阳性对照(质粒TLR3)、在用Poly IC处理的细胞及用Poly IC和LPS处理的细胞中，凝胶显示出TLR3表达。用LPS处理或未经处理(阴性对照)的细胞中，凝胶显示无TLR3表达。

数据显示，在人乳腺癌Cama-1细胞中，Poly IC诱导TLR3 mRNA表达。因此，在某些肿瘤细胞系中，Poly IC处理正调节其识别受体TLR3的表达。另一方面，Cama-1细胞中，用LPS处理不影响TLR3mRNA表达。

实施例4

对结肠癌细胞系LS174T和乳腺癌细胞系Cama-1这两个细胞系的死亡和细胞周期变化进行了分析。存在或不存在Poly IC(5μg/ml)时，培养细胞48小时。用1μg/ml溴脱氧尿苷(BrdU)脉冲30分钟后，细胞在70％乙醇中于4℃固定过夜，然后用FITC偶联的抗BrdU单克隆抗体和3μg/ml碘化丙锭染色。通过流式细胞术(FACS)分析细胞死亡和细胞周期。掺入BrdU是一种增殖测量方法，而碘化丙锭染色则可确定DNA含量，特别是正在经历细胞凋亡的近二倍体细胞群体。

数据显示，掺入BrdU的LS174T细胞的百分比从处理前的27％变为Poly IC存在下培养48小时后的9％。相反，具有近二倍体DNA含量的LS174T细胞的百分比，从处理前的3％变为Poly IC存在下培养48小时后的23％，说明Poly IC的细胞毒性强。

数据还显示，掺入BrdU的Cama-1细胞的百分比，由处理前的15％变为Poly IC存在下培养48小时后的2％。相反，具有近二倍体DNA含量的Cama-1细胞的百分比，从处理前的4％变为poly IC存在下培养48小时后的17％，表明Poly IC引发细胞凋亡。

这些数据表明，用Poly IC处理48小时，LS 174T和Cama-1细胞系停止分裂，并经历细胞凋亡。

实施例5

为了进一步研究Poly IC处理对乳腺肿瘤细胞系的作用，在Cama-1细胞中，通过膜联蛋白V染色对细胞死亡进行了分析。存在或不存在5μg/ml Poly IC时培养细胞24小时。通过膜联蛋白V染色和流式细胞术检测细胞凋亡。数据显示，超过70％的Cama-1细胞被膜联蛋白V染色，进一步证明Poly IC诱导细胞凋亡。

我们还试图测定Poly IC诱导细胞凋亡的动力学。5μg/ml或50ng/ml Poly IC存在或不存在时，培养Cama-1细胞。30小时后，检测培养物中凋亡细胞(膜联蛋白阳性细胞)的百分比。数据显示，30小时后，未处理细胞显示15％的自发性细胞凋亡。然而，80％用Poly IC处理的细胞显示细胞死亡。具体地讲，Cama-1细胞中，加入Poly IC后9小时便开始Poly IC引发的细胞凋亡，处理30小时后，凋亡细胞达到80％。

我们于是试图测定Poly IC对人原代乳腺肿瘤细胞的作用。刚恢复的肿瘤单细胞悬液与PBS或Poly IC(50μg/ml)孵育48小时。通过PI染色测定细胞凋亡。百分比表示含有低含量DNA的细胞(subG0/G1细胞)的比例，即凋亡细胞的比例。数据显示，19.5％用PBS处理的细胞具有低含量的DNA，而38.6％用Poly IC处理的细胞具有低含量的DNA。因此，观察到相似的Poly IC对人乳腺原代肿瘤细胞的细胞毒性作用。

实施例6

对TLR3在Poly IC诱导的细胞凋亡中的作用进行了分析。Cama-1细胞用与以下序列相对应的siRNA转染：无关序列(Scr RNA，序列：ACUAGUUCACGAGUCACCUtt)(SEQ ID NO：21)，或hTLR3(序列：CAGUGUUGAACCUUACCCAtt)(SEQ ID NO：22)。在含有3μg/ml脂转染胺试剂2000和100nM siRNA的1ml OptiMEM^TM培养基中进行siRNA转染5小时。然后，细胞用磷酸缓冲盐溶液(PBS)洗涤，在完全培养基中培养72小时后，用5μg/ml Poly IC随后处理48小时。然后如实施例3所述，用溴化乙锭染色后，通过FACS分析细胞周期。

这些实验结果如图1所示。数据显示，Poly IC存在时，将用无关的合成RNA转染的Cama-1细胞孵育48小时，近二倍体细胞的百分比从2％增至45％。然而，poly IC存在时，将用hTLR3 siRNA转染的Cama-1细胞孵育48小时，并不增加近二倍体细胞的百分比，百分比维持3％不变。

这些数据证明，Poly IC传递给Cama-1细胞的细胞凋亡信号需要TLR3的表达。

实施例7

分析了Poly AU对细胞凋亡的作用。Cama-1细胞与PBS或者与浓度范围从5ng/ml增加至50μg/ml的Poly AU一起培养48小时。通过测定膜联蛋白V阳性细胞的百分比，分析细胞凋亡。数据显示，与Poly IC相似，Poly AU引发细胞凋亡。

实施例8

我们分析了体内IFN对Poly IC诱导的细胞凋亡的作用。TRP-Tag小鼠在视网膜色素上皮内表达SV40 T抗原，出生后数周内，通常发生完全外显的眼肿瘤。

在这些实验中，各实验中14-16只TRP-Tag/IFNαβγR-/-小鼠(这些是与同时缺乏I型干扰素受体(IFNαβR)和II型干扰素受体(IFNγR)的小鼠杂交的TPR-Tag小鼠)，在第21、23、25、27和29天通过静脉注射Poly IC(100μg/剂)或PBS进行处理。每周2-3次监测肉眼可见的眼肿瘤发展的动力学。

poly IC处理的小鼠与PBS处理的小鼠相比，眼肿瘤的出现延迟达到21天。因为这些实验所用的小鼠没有功能性的干扰素应答系统，所以，数据显示，Poly IC诱导的肿瘤生长抑制，不依赖于体内的I型和II型干扰素。

实施例9

为了测定Poly IC诱导的Cama-1细胞毒性的途径，采用RNA干扰，有效地负调节TRIF和PKR的表达。将Cama-1细胞以3×10⁵细胞/孔加入6孔板中。过夜贴壁后，在含有3μg/ml脂转染胺试剂2000(Invivogen)和100nM siRNA的OptiMEM培养基(Life technologies)中，进行siRNA转染5小时。或者用MOCK(水)，或者用合成双链体(scr)siRNA、TRIF siRNA或PKR siRNA对照转染细胞。

PKR特异性的siRNA双链体用作SMART-Pool，购自Dharmacon(Lafayette，CO)。TRIF siRNA用作单种寡双链体5’-GCUCUUGUAUCUGAAGCAC-3’(SEQ ID NO：23)，购自同一供应商。使用下述引物，用Taq PCR ReadyMix(Sigma-AIdrich)，通过PCR(35轮循环：94℃1分钟、55℃1分钟、72℃2分钟)，评价TLR3和TRIF表达：对于TLR3，5’-AACGATTCCTTTGCTTGGCTTC-3’(SEQ IDNO：24)(正向)/5’-GCTTAGATCCAGAATGGTCAAG-3’(SEQ ID NO：25)(反向)；对于TRIF，5’-ACTTCCTAGCGCCTTCGACA-3’(SEQ IDNO：26)(正向)/5’-ATCTTCTACAGAAAGTTGGA-3’(SEQ ID NO：27)(反向)。通过蛋白质印迹评价PKR的表达。对于TRIF mRNA，5μg/mlPoly IC存在或不存在时，再培养24小时后进行PCR。

数据显示，使用RNA干扰有效地负调节TRIF和PKR的表达。

siRNA转染后72小时，Cama-1细胞在5μg/ml Poly IC存在或不存在时，再培养24小时。通过膜联蛋白V染色测定细胞凋亡，用培养物中凋亡细胞的百分比表示。平均10％的未处理对照细胞(MOCK和scr)经历细胞凋亡。相反，约75％用Poly IC处理的对照细胞(MOCK和scr)经历细胞凋亡。TRIF siRNA组中，未处理细胞显示10％的凋亡细胞，而用TRIF siRNA处理的细胞则显示20％的凋亡细胞。最后，PKR siRNA组中，未处理细胞显示10％的凋亡细胞，而用PKR siRNA处理的细胞则显示80％的凋亡细胞。

因此，用TRIF siRNA处理实际破坏了Poly IC诱导的细胞凋亡，而缺乏PKR表达时，通常发生细胞死亡。

这些数据清楚地表明，Cama-1细胞中Poly IC诱导的细胞凋亡是由TLR3和TRIF两者介导的，不依赖于PKR。

实施例10

为了进一步研究TLR3介导的细胞毒性，对信号分子IRAK-4和TRAF6(两者皆为TLR信号的下游介质)进行了评价。将Cama-1细胞以3×10⁵细胞/孔加入6孔板中。过夜贴壁后，在含有3μg/ml脂转染胺试剂2000(Invivogen)和100nM siRNA的OptiMEM培养基(Lifetechnologies)中，进行siRNA转染5小时。细胞用合成双链体(scr)siRNA、IRAK-4 siRNA或TRAF-6 siRNA对照转染。然后洗涤细胞，在完全培养基中培养72小时后，用Poly IC处理，分析细胞凋亡。IRAK-4和TRAF6特异性的siRNA双链体作为SMART-Pool，购自Dharmacon(Lafayette，CO)。

通过蛋白质印迹分析IRAK-4和TRAF 6的表达。蛋白质印迹显示，IRAK-4和TRAF6 siRNA破坏相应蛋白质的表达。

siRNA转染后72小时，在5μg/ml Poly IC存在或不存在时，Cama-1细胞再培养24小时。通过膜联蛋白V染色测定细胞凋亡，用培养物中凋亡细胞的百分比表示。平均10％未处理的对照细胞(scr)经历细胞凋亡。相反，约75％用Poly IC处理的对照细胞(scr)经历细胞凋亡。IRAK-4 siRNA组中，培养物显示仅20％的凋亡细胞，而TRAF6 siRNA组中，在培养结束时，75％的细胞凋亡。TRAF6 siRNA组中，未处理细胞显示15％的凋亡细胞，而用TRAF6 siRNA处理的细胞则显示75％的凋亡细胞。

数据显示，抑制IRAK-4表达导致TLR3介导的细胞毒性受到抑制。然而，抑制TRAF6表达不会使TLR3介导的细胞毒性受到抑制。这一发现是意想不到的，因为一般认为TRAF6位于TLR信号途径中IRAK-4的下游。因此，这就提示TLR3可能通过IRAK-4发出信号，以激活不依赖TRAF6的凋亡途径。

平行实验中，5μg/ml Poly IC存在或不存在时，Cama-1细胞培养24小时，通过ELISA测定siRNA转染的Cama-1细胞上清液中IL-6的浓度。数据显示，对于scr组，未处理细胞和处理细胞的IL-6浓度(pg/ml/10⁶细胞)分别为10和110。siRNA IRAK-4组中，未处理细胞和处理细胞的IL-6浓度(pg/ml/10⁶细胞)分别为10和40。siRNA TRAF6组中，未处理细胞和处理细胞的IL-6浓度(pg/ml/10⁶细胞)分别为10和20。这些数据显示，IRAK-4和TRAF6两者都是细胞因子产生所需要的。

实施例11

对I型干扰素参与TLR3介导的细胞凋亡进行了评价。Cama-1细胞与5μg/ml Poly IC一起孵育0小时、1小时、6小时、18小时或24小时。通过蛋白质印迹，对细胞裂解液中存在的IFN-β、磷酸化Stat1(酪氨酸701)(P-Stat-1)和总Stat-1进行了分析。

数据显示，Poly IC处理时强烈诱导IFN-β产生。同样，观察到Stat1的磷酸化。这些观察结果证明，I型IFN信号是由Cama-1细胞中的Poly IC引发的。有趣的是，Stat1磷酸化在Poly IC处理后6小时达到最大，但此时几乎仍无法检测到IFN-β产生。

在另一个实验中，Cama-1细胞与20μg/ml中和IFN I型受体mAb(抗IFN R1)或同种型对照(小鼠IgG1)一起预孵育1小时。然后，细胞与5μg/ml Poly IC或无Poly IC，或者与IFN-α或IFN-β各1000U/ml的混合物培养24小时。通过膜联蛋白V染色测定细胞凋亡，用培养物中凋亡细胞的百分比表示。

抗体不存在时，未处理细胞、Poly IC和IFNα/β处理的细胞分别显示10％、70％和20％的凋亡细胞。mIgG1组中，未处理细胞、Poly IC和IFNα/β处理的细胞分别显示10％、70％和20％的凋亡细胞。抗IFNR1组中，未处理细胞、Poly IC和IFNα/β处理的细胞分别显示10％、30％和15％的凋亡细胞。

数据显示，I型IFN受体被特异性单克隆抗体中和显著减少PolyIC诱导的细胞凋亡。这证明I型IFN是TLR3介导的细胞凋亡所必需的。

将Cama-1细胞用IFNα和IFNβ的混合物处理不能诱导显著的细胞凋亡。这就表示TLR3引发的细胞毒性需要I型IFN信号，但I型IFN信号并不足以单独诱导细胞死亡。

实施例12

我们试图测定TNF-α是否在TLR3介导的细胞凋亡中发挥作用。Cama-1细胞与20μg/ml中和抗TNF-αmAb或无中和抗TNF-αmAb，或者与10μg/ml CHX一起预孵育。然后，细胞与5μg/ml Poly IC或无Poly IC，或者与25ng/ml TNF-α一起培养。通过膜联蛋白V染色测定细胞凋亡，用培养物中凋亡细胞的百分比表示。

抗体不存在时，未处理细胞、Poly IC和TNF-α处理的细胞分别显示10％、70％和40％的凋亡细胞。抗TNF-αmAb组中，未处理细胞、Poly IC和TNF-α处理的细胞分别显示10％、65％和10％的凋亡细胞。CHX组中，未处理细胞、Poly IC和TNF-α处理的细胞分别显示15％、40％和70％的凋亡细胞。

数据显示，保护Cama-1细胞免于TNF-α诱导的细胞凋亡的中和抗TNF-α抗体，对Poly IC引发的细胞死亡无作用。因此，TNF-α不会在TLR3介导的细胞凋亡中发挥作用。

如上所述，Cama-1细胞用通用转录抑制剂CHX预处理，已知该抑制剂通过阻断NFκB控制的存活程序，使细胞敏化，发生TNF-α诱导的细胞凋亡。

数据显示，CHX使Cama-1细胞显著敏化，发生TNF-α诱导的细胞凋亡。相反，CHX部分保护该细胞免于Poly IC诱导的细胞凋亡。这就证实不同机制是由这两种促凋亡刺激物引发的。

然后，用RNA干扰评价NFκB在TLR3介导的细胞凋亡中的参与程度。Cama-1细胞用p65 siRNA或者合成对照双链体(scr)转染72小时后，与50ng/ml或5μg/ml Poly IC或无Poly IC时培养24小时。消除p65蛋白表达后，用蛋白质印迹评价Poly IC处理。通过膜联蛋白V染色测定细胞凋亡。结果用培养物中凋亡细胞的百分比表示。

scr组中，未处理细胞、Poly IC(50ng/ml)和Poly IC(5μg/ml)处理的细胞分别显示10％、20％和70％的凋亡细胞。siRNA p65组中，未处理细胞、Poly IC(50ng/ml)和Poly IC(5μg/ml)处理的细胞分别显示10％、10％和20％的凋亡细胞。

数据显示，siRNA抑制NFκB p65的表达，导致明显地免于PolyIC诱导的细胞毒性的保护作用。这就证实NFκB在Poly IC引发的细胞凋亡中发挥促凋亡的作用。

综上所述，这些结果证明，TNF-α分泌不是造成Poly IC诱导的细胞凋亡的原因。另外，这些结果还证明，NFκB在TLR3介导的细胞凋亡中发挥促凋亡的作用，这与其在TNF处理中的抗凋亡作用不同。

实施例13

接下来，我们研究了胱天蛋白酶在细胞凋亡中的作用。Cama-1细胞与25μM通用胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk或DMSO一起预孵育1小时后，在5μg/ml Poly IC或25ng/ml TNF-α(用作阳性对照)存在或不存在时培养24小时。通过膜联蛋白V染色测定细胞凋亡，用培养物中凋亡细胞的百分比表示。

DMSO组中，未处理细胞、Poly IC和TNF-α处理的细胞分别显示10％、70％和40％的凋亡细胞。z-VAD-fmk组中，未处理细胞、PolyIC和TNF-α处理的细胞分别显示10％、30％和10％的凋亡细胞。

数据显示，通过广谱胱天蛋白酶抑制剂z-VAD-fmk对胱天蛋白酶活性的抑制，大大减少了Poly IC诱导的细胞凋亡。这提示胱天蛋白酶在TLR3引发的细胞毒性中的重要作用。

在另一个实验中，通过蛋白质印迹，分析了从上述细胞中所获得的裂解物中的PARP、胱天蛋白酶3和胱天蛋白酶8的裂解成分。

数据显示，PARP的裂解(胱天蛋白酶依赖性细胞凋亡的标志)发生在Poly IC处理的Cama-1细胞中。这证实胱天蛋白酶参与TLR3介导的细胞凋亡。实际上，Poly IC处理时胱天蛋白酶3被激活，正如蛋白质印迹分析所证明的一样。

实施例14

我们试图进一步研究TLR3配体和I型IFN间是否存在任何协同作用。将原代乳腺癌细胞SKBr3以3×10⁵细胞/孔加入6孔板中。过夜贴壁后，在含有3μg/ml脂转染胺试剂2000(Invivogen)和100nMsiRNA的OptiMEM培养基(Life technologies)中进行siRNA转染5小时。细胞用MOCK(水)、TLR3 siRNA或PKR siRNA转染。然后，洗涤细胞，在完全培养基中培养72小时后，用50μg/ml Poly IC处理24小时，分析细胞凋亡。

MOCK组中，未处理细胞和Poly IC(50μg/ml)处理的细胞分别显示10％和22％的凋亡细胞。TLR3 siRNA组中，未处理细胞和Poly IC(50μg/ml)处理的细胞分别显示8％和13％的凋亡细胞。PKR siRNA组中，未处理细胞和Poly IC(50μg/ml)处理的细胞分别显示12％和22％的凋亡细胞。

数据显示，当用Poly IC处理时，乳腺癌细胞系SKBr3经历了部分的细胞凋亡。另外，数据还显示，用TLR3 siRNA预处理的细胞破坏了细胞凋亡，而PKR siRNA没有保护作用。

在另一个实验中，我们试图测定IFN和Poly IC是否协同作用以诱导细胞凋亡。SKBr3细胞不用或用10U/ml或100U/ml低剂量的IFN-α和IFN-β的混合物预处理。按以下剂量给予Poly IC：0μg/ml、0.5μg/ml、5μg/ml和50μg/ml，为时48小时。

数据显示，未处理的Poly IC组中，未处理细胞、IFN-α/β(10U/ml)和IFN-α/β(100U/ml)处理的细胞分别显示10％、14％和22％的凋亡细胞。0.5μg/ml Poly IC组中，未处理细胞、IFN-α/β(10U/ml)和IFN-α/β(100U/ml)处理的细胞分别显示15％、45％和55％的凋亡细胞。5μg/ml Poly IC组中，未处理细胞、IFN-α/β(10U/ml)和IFH-α/β(100U/ml)处理的细胞分别显示20％、55％和60％的凋亡细胞。50μg/mlPoly IC组中，未处理细胞、IFN-α/β(10U/ml)和IFN-α/β(100U/ml)处理的细胞分别显示20％、55％和60％的凋亡细胞。

因此，IFN能够与Poly IC协同作用以诱导细胞凋亡。这种协同作用表现在两个方面：1)预处理时，在比未预处理细胞低100倍的浓度下，SKBr3细胞对Poly IC诱导的细胞凋亡变得敏感；2)由Poly IC诱导至细胞凋亡的SKBr3细胞的百分比，从22％增加至I型IFN预处理后的66％。

总之，I型IFN预处理使SKBr3乳腺癌细胞敏化，发生TLR3介导的Poly IC诱导的细胞凋亡。因此，用低剂量I型IFN预治疗乳腺癌患者，不仅增加Poly IC治疗的功效，而且能征募到用别的办法不能仅从Poly IC获益的患者。患者还可在手术前用低剂量的I型IFN治疗，以增加活组织检查中免疫组织学上呈阳性的以及将对TLR3配体产生反应的肿瘤的百分比。另外，低剂量I型IFN和低剂量Poly IC的联用比单用较高剂量的Poly IC更有效。这种联用还可降低副作用的风险。

Claims (16)

1.TLR3配体激动剂和低剂量I型IFN在制备用于治疗患者中表达TLR3的癌的药物中的用途，其中低剂量I型IFN介于1-3MU。

2.权利要求1的用途，其中所述低剂量I型IFN是2MU。

3.TLR3配体激动剂和低剂量I型IFN在制备用于治疗患者中表达TLR3的癌的药物中的用途，其中所述低剂量I型IFN大于0和少于1MU。

4.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述TLR3激动剂是PolyIC。

5.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述TLR3激动剂是PolyAU。

6.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述表达TLR3的癌是乳腺癌。

7.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述表达TLR3的癌是结肠癌。

8.权利要求1-3中任一项的用途，其中所述药物还包括化疗药物或癌症治疗。

9.TLR3激动剂和低剂量I型IFN在制备用于诱导表达TLR3的肿瘤细胞发生细胞凋亡的药物中的用途，其中所述低剂量I型IFN介于1-3MU。

10.权利要求9的用途，其中所述低剂量I型IFN是2MU。

11.TLR3激动剂和低剂量I型IFN在制备用于诱导表达TLR3的肿瘤细胞发生细胞凋亡的药物中的用途，其中所述低剂量I型IFN大于0和少于1MU。

12.权利要求9-11中任一项的用途，其中所述TLR3激动剂是Poly IC。

13.权利要求9-11中任一项的用途，其中所述TLR3激动剂是Poly AU。

14.权利要求9-11中任一项的用途，其中所述表达TLR3的肿瘤细胞是乳腺癌细胞。

15.权利要求9-11中任一项的用途，其中所述表达TLR3的肿瘤细胞是结肠癌细胞。

16.权利要求9-11中任一项的用途，其中所述药物还包括化疗药物或癌症治疗。