CN105796594A - 一种组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用及该组合物的使用方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种肿瘤治疗药物的组合物，具体药物是临床一线化疗药物顺铂（cisplatin,CDDP或者DDP）、一种人工合成的双链RNA（polyinosinic‑polycytidylic acid,poly IC 或者PIC）以及临床靶向药物西妥昔单抗（cetuximab）的肿瘤治疗药物的组合物，特别涉及上述组合物的使用剂量和方法。体内外实验均显示本发明对于克服肿瘤化疗抵抗及其副作用具有重要意义。
Description
技术领域：
本发明涉及生物医药领域，具体涉及一种肿瘤化疗药物组合物以及使用剂量和顺序。
背景技术：
据2015中国肿瘤登记年报，2011年我国新增癌症病例约337万例，比2010年增加28万例，过去10年我国癌症发病率和死亡率均呈明显上升趋势。目前，临床肿瘤患者的治疗方案主要为手术切除、化疗和放疗，虽然随着临床肿瘤学研究取得的显著成就，部分肿瘤患者的生存期得到明显延长，生活质量也得到不断提高，但是临床化疗和放疗的敏感性及其副作用仍然成为肿瘤患者死亡的重要原因。
顺铂作为诸多肿瘤的临床一线化疗药物之一，包括头颈癌、肺癌、肝癌和淋巴瘤等，具有显著的抗肿瘤作用，但是它具有明显的毒副作用包括消化道反应、肾脏毒性、神经毒性和骨髓抑制等，显著影响肿瘤患者的生存质量。此外，部分肿瘤患者还容易产生对顺铂治疗的抵抗和不敏感性，这也促使临床化疗药物使用方法的更新或新药的研发。西妥昔单抗通过与表皮生长因子受体结合并抑制其作用，阻断细胞内信号转导途径，从而抑制癌细胞的增殖，诱导癌细胞的凋亡，是晚期头颈癌化疗的主要靶向类药物。
本发明涉及的药物按特定顺序的联合使用能够显著在降低顺铂使用剂量的情况下，显著提高顺铂的杀伤效果，尤其是提高低剂量的顺铂的杀伤效果，并且体内动物模型的实验显示，本发明能够有效增强低剂量顺铂对于实体瘤、转移瘤和血液瘤的杀伤效果，并且与单独高剂量顺铂治疗作用相比，本发明具有显著降低顺铂毒副作用的特点
发明内容：
顺铂是治疗头颈部肿瘤疗效较好的基础化疗药物。常规剂量80-120mg/m2(比如使用75mg/m2)，有效缓解率只有30-40％。而且其毒副作用也进一步降低肿瘤患者的生存和生活质量，最常见的毒副作用包括：消化道反应，急性呕吐一般发生于给药后1～2小时，可持续一周左右。而累积性及剂量相关性肾功能损伤是顺铂的主要毒性作用，一般剂量每日超过90mg/m2即为肾毒性的危险因素。主要为肾小管损伤，表现为血尿素氮(BUN)及肌酐(Cr)增高，肌酐清除率降低。目前除水化外尚无有效预防本品所致的肾毒性的手段。其他毒性还有神经毒性、骨髓抑制和过敏反应等等。并且，长期的顺铂使用会使部分化疗患者对顺铂产生药物抵抗或者耐受，这进一步降低临床顺铂的有效应答率。
本实验通过组合物以及使用方法上的创新降低了顺铂的使用剂量：临床上常规顺铂的使用剂量为75mg/m2，而临床使用的低剂量顺铂浓度为10-20mg/m2，取平均值为15mg/m2(即为常规剂量的1/5)，换算出临床低剂量顺铂对应的老鼠使用的浓度为5mg/kg，并以此浓度作为给小鼠使用的高浓度，以该浓度的一半作为给小鼠使用的低浓度，即2.5mg/kg。因此，所述组合物当中的顺铂在使用时其浓度对应的临床换算浓度为常规顺铂临床使用的剂量的1/10。
本实验通过组合物以及使用方法上的创新提高了顺铂的疗效：在头颈癌动物模型中，相比于单独给予2.5mg/kg顺铂的小鼠，按实施例2顺序联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC的小鼠肿瘤体积显著降低。并且按实施例3方法同时联合西妥昔单抗，能够进一步抑制肿瘤的生长，小鼠肿瘤的完全抑制率为87.5％。在黑色素瘤动物模型中，相比于单独给予2.5mg/kg顺铂的小鼠，按实施例4顺序联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC的小鼠肺部肿瘤结节灶的数目显著降低。在B细胞淋巴瘤瘤动物模型中，相比于单独给予2.5mg/kg顺铂的小鼠，按实施例5顺序联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μgpoly IC的小鼠胃肠道肿瘤结节灶的数目显著降低。
本实验通过组合物以及使用方法上的创新减轻了顺铂的毒副作用：在头颈癌动物模型中，相比于单独给予5mg/kg顺铂的小鼠，按按实施例2顺序联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC的小鼠的体重下降率显著减低，并且肾脏毒性指标肌酐(Cr)的含量显著降低。在B细胞淋巴瘤瘤动物模型中，相比于单独给予5mg/kg顺铂的小鼠，按实施例5顺序联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC的小鼠的体重下降率显著减低。
本发明显示，按实施例2和3预处理双链RNA poly IC后，联合使用低剂量顺铂、双链RNA poly IC以及西妥昔单抗显著提高低剂量顺铂的杀伤作用，并且显著降低顺铂的毒副作用。
本发明显示，按实施例4和5预处理双链RNA poly IC后，联合使用低剂量顺铂和双链RNA poly IC显著提高低剂量顺铂的杀伤作用，抑制黑色素瘤和B淋巴瘤进展，并且显著降低顺铂的毒副作用。
目前，临床常规的以顺铂为基础化疗的策略虽然能够缓解肿瘤患者的进展(有效缓解率达30-40％)，但是化疗本身对化疗患者的毒副作用极大地限制了顺铂的使用剂量和频率。并且，长期常规剂量的顺铂使用容易使化疗患者对顺铂产生药物抵抗或者耐受，这进一步降低临床顺铂的有效应答率。本发明将顺铂、双链RNA poly IC和西妥昔单抗按实施例2、3、4和5中所述的特定顺序的联合使用，其中，顺铂使用浓度的临床换算浓度为常规顺铂临床使用的剂量的1/10，在此浓度下，能够显著缓解肿瘤进展(包括实体瘤头颈癌、转移瘤黑色素瘤和血液瘤B细胞淋巴瘤)，并且降低顺铂治疗带来的毒副作用。
附图说明：
图1为在头颈癌细胞系SCC4、SCC1、CAL27和OSCC3中，使用三种不同的顺铂浓度(分别为4种细胞各自的25％、50％和75％抑制率的浓度，即IC25、IC50和IC75组，见表1)处理4种细胞，每个浓度再分为三组，以IC25为例，第一组为顺铂单独处理组：单独的IC25浓度的顺铂组，即CDDP(IC25)组；第二组为两种药物同时组合给药：IC25浓度的顺铂+20μg/ml poly IC，即CDDP(IC25)+PIC组；第三组为：先用20μg/ml poly IC预处理肿瘤细胞12小时，再给以不同浓度的顺铂+20μg/ml poly IC，即PIC+CDDP(IC25)组，使用CCK-8实验检测该方法对肿瘤细胞杀伤效率。
图2以头颈癌SCC4肿瘤细胞建立裸鼠实体瘤模型，待肿瘤模型建立成功后给予药物治疗：按25μg poly IC/只提前一天预处理小鼠，次日联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC为肿瘤小鼠给药治疗，即Poly(I:C)25+DDP2.5组。同时，单独使用磷酸缓冲溶液(PBS)为空白对照，即PBS组；单独使用2.5mg/kg的低剂量顺铂为阴性对照，即DDP2.5组；单独使用5mg/kg的高剂量顺铂组为阳性对照，即DDP5组，用于毒副作用的比较，包括体重、肝脏毒性谷(丙转氨酶，ALT；谷草转氨酶，AST)以及肾脏毒性(肌酐Cr)。
图3以头颈癌SCC4肿瘤细胞建立裸鼠实体瘤模型，待肿瘤模型建立成功后给予药物治疗。阴性对照为：先用25μg poly IC/只在第一天预处理小鼠，在第二天同时联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂和25μg/只poly IC为肿瘤小鼠给药治疗，即Poly(I:C)25/DDP2.5组；实验组为：先用25μg poly IC/只在第一天预处理小鼠，在第二天同时联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂、25μg/只poly IC以及200μg西妥昔单抗(cetuximab)/只为肿瘤小鼠给药治疗，即Poly(I:C)25/DDP2.5/cetuximab组；或者，在第二天联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂和25μg/只poly IC，并在第四天给予200μg西妥昔单抗/只为肿瘤小鼠给药治疗，即Poly(I:C)25/DDP2.5+cetuximab组，该组用于比较西妥昔单抗的不同联合方式的治疗作用以及毒副作用。
图4以黑色素瘤细胞B16建立裸鼠转移瘤模型，待肿瘤模型建立成功后给予药物治疗：按25μg poly IC/只提前一天预处理小鼠，次日联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC为肿瘤小鼠给药治疗，即Poly(I:C)25+DDP2.5组。同时，单独使用磷酸缓冲溶液(PBS)为空白对照，即PBS组；单独使用2.5mg/kg的低剂量顺铂为阴性对照，即DDP2.5组；单独使用5mg/kg的高剂量顺铂为阳性对照，即DDP5组。其体重变化用于毒副作用的比较。
图5以B淋巴瘤细胞A20建立裸鼠血液瘤模型，待肿瘤模型建立成功后给予药物治疗：按25μg poly IC/只提前一天预处理小鼠，次日联合使用2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC为肿瘤小鼠给药治疗，即Poly(I:C)25+DDP2.5组。同时，单独使用磷酸缓冲溶液(PBS)为空白对照，即PBS组；单独使用2.5mg/kg的低剂量顺铂为阴性对照，即DDP2.5组；单独使用5mg/kg的高剂量顺铂为阳性对照，即DDP5组。其体重变化用于毒副作用的比较。
具体实施方式：
实施例1：药物组合物在体外的抗肿瘤效果
首先通过设置不同浓度梯度(0.5μM、1μM、2μM、4μM、8μM、16μM和32μM)的顺铂，处理四种头颈癌细胞系SCC4、SCC1、CAL27和OSCC3，48h后通过CCK-8实验检测不同浓度顺铂的杀伤作用，绘制肿瘤细胞的活力抑制曲线，通过Prism5软件分析得到各种细胞的半数(50％)抑制浓度(即IC50)以及IC25和IC75，见表1：
表1四种头颈癌细胞系对顺铂的IC25、IC50和IC75
| μM | IC25 | IC50(95％CI) | IC75 |
| OSCC3 | 2.005 | 5.138(4.109-6.426) | 16.44 |
| CAL27 | 3.684 | 7.368(6.266-8.664) | 18.42 |
| SCC1 | 3.454 | 8.636(6.451-11.56) | 21.59 |
| SCC4 | 4.266 | 8.532(7.327-9.935) | 21.33 |
分别使用每个细胞系各自对应的IC50、IC25和IC75的顺铂浓度处理对应的4种细胞，并各自设置三个实验组：第一组为顺铂单独处理组：单独的不同浓度的顺铂组(CDDP组)；第二组为两种药物组成的组合物同时给药：不同浓度顺铂+20μg/ml poly IC(CDDP+PIC组)，第三组为：先用20μg/ml poly IC预处理肿瘤细胞12小时，再给以两种药物组成的组合物：不同浓度的顺铂+20μg/ml poly IC(PIC+CDDP组)，使用CCK-8实验检测该方法对肿瘤细胞杀伤效率。结果如图1A所示。在IC25这一低浓度的顺铂处理下，CDDP+PIC组的肿瘤杀伤效果显著高于CDDP组。与CDDP+PIC组相比，PIC+CDDP组的肿瘤杀伤效果又能够进一步提高，并且能够达到CDDP组在IC50浓度的杀伤效果(图1B)。因此，在体外，预处理双链RNApoly IC后，联合使用低剂量顺铂(IC25)和双链RNApoly IC能够显著提高低剂量顺铂的杀伤作用，并且能达到高剂量顺铂(IC50)的杀伤效果。
实施例2：肿瘤化疗药物组合物在体内的抗实体肿瘤(头颈癌)效果：
取1*106个对数生长期生长状况良好的头颈癌肿瘤细胞系SCC4，于BALB/c Nude品系裸鼠腋下进行植瘤，待肿瘤模型成功建立后(图2A)，按照临床上常规顺铂的使用剂量为75mg/m2，而使用的低浓度顺铂剂量为10-20mg/m2，取平均值为15mg/m2，为了换算出此临床浓度对应的小鼠所用浓度，需根据如下公式：
小鼠(mg/kg)*(小鼠转换因子/人转换因子)＝人(mg/m2)/人转换因子
其中，小鼠的mg/kg-mg/m2转换因子为3，人的mg/kg-mg/m2转换因子为36。换算出临床低剂量对应的老鼠使用的浓度顺铂剂量为5mg/kg，并以此浓度为给小鼠使用的高浓度，以该浓度的一半作为给小鼠使用的低浓度，即2.5mg/kg。因此，所述组合物当中的顺铂在使用时其浓度对应的临床换算浓度为常规顺铂临床使用的剂量的1/10。使2.5mg/kg低顺铂浓度治疗荷瘤裸鼠，并各自设置四个实验组(图2B)：第一组为不作处理的荷瘤裸鼠组(PBS组)，第二组为单独的2.5mg/kg的低浓度顺铂组(给药时间参考第四组)(DDP2.5组)，第三组为先提前一天(第一天)用25μg poly IC/只预处理荷瘤老鼠，于次日(第二天)再给予两种药物组成的组合物：2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC(Poly(I:C)25+DDP2.5组)，第四组(第二天)为单独的5mg/kg的高浓度顺铂组(DDP5组)。间隔三天后进行第二个疗程，总共6个疗程，每个疗程5天。结果如图2B所示。Poly(I:C)25+DDP2.5组肿瘤的抑制效果要显著高于PBS组和DDP2.5组，并且，其平均肿瘤体积和高浓度组即DDP5组无显著差异。我们进一步比较3组处理对裸鼠的毒副作用(图3C)，根据体重的变化以及肝脏(ALT/AST)和肾脏(Cr)的毒性指标分析，结果提示高浓度顺铂组DDP5组对荷瘤裸鼠的毒副作用最强，虽然能够有效抑制肿瘤进展，而Poly(I:C)25+DDP2.5组即联合组能够在杀伤肿瘤的同时，显著降低对荷瘤裸鼠的毒副作用。因此，预处理双链RNApoly IC后，联合使用低剂量顺铂和双链RNA poly IC显著提高低剂量顺铂的杀伤作用，并且显著降低顺铂的毒副作用。
实施例3：肿瘤化疗药物组合物在体内的抗实体肿瘤(头颈癌)效果：
取1*106个对数生长期生长状况良好的头颈癌肿瘤细胞系SCC4，于BALB/c Nude品系裸鼠腋下进行植瘤，待肿瘤模型成功建立后(图3A)，根据实施例2的发现：用25μg poly IC预处理裸鼠，然后于次日联合用药能够显著提高低浓度顺铂的杀伤效果并降低该方法治疗的毒副作用。我们进一步联合晚期头颈癌的常用靶向治疗药物西妥昔单抗，用以治疗荷瘤裸鼠，并各自设置三个实验组(图3B)：第一组为实施例2中的第三处理组的荷瘤裸鼠组(Poly(I:C)25/DDP2.5组)，第二组为先提前一天(第一天)用25μg poly IC/只预处理荷瘤老鼠，于次日(第二天)再给予三种药物组成的组合物：2.5mg/kg低剂量顺铂、25μg poly IC/只和200μg西妥昔单抗/只给予三种药物(Poly(I:C)25/DDP2.5/cetuximab组)，第三组为先提前一天(第一天)用25μg poly IC/只预处理荷瘤老鼠，于次日(第二天)再给予两种药物组成的组合物：2.5mg/kg低剂量顺铂和25μg poly IC/只处理荷瘤老鼠，并与第四天用200μg西妥昔单抗/只处理荷瘤老鼠(Poly(I:C)25/DDP2.5+cetuximab组)。第六天后进行第二个疗程，总共4个疗程，每个疗程5天。结果如图3B所示。Poly(I:C)25/DDP2.5/cetuximab组肿瘤的抑制效果要显著高于Poly(I:C)25/DDP2.5组和Poly(I:C)25/DDP2.5+cetuximab组。并且，我们进一步比较3组处理对裸鼠的毒副作用(图3C)，根据体重的变化的毒性指标分析，结果提示通过25μg poly IC/只预处理荷瘤老鼠后，同时联合使用三种药物能够有效抑制肿瘤的进展，促使肿瘤消退并显著降低其对体重的毒副作用。因此，联合使用低剂量顺铂、双链RNApoly IC以及西妥昔单抗能进一步显著提高低剂量顺铂的杀伤作用，并且显著降低顺铂的毒副作用。
实施例4：肿瘤化疗药物组合物在体内的抗转移瘤(黑色素瘤)效果：
取1*106个对数生长期生长状况良好的黑色素瘤细胞系B16，于C57BL/6品系黑鼠腋下进行植瘤，待肿瘤模型成功建立后(图4A)，按照实施例2设置四个实验组(图4B)：第一组为不作处理的荷瘤黑鼠组(PBS组)，第二组为单独的2.5mg/kg的低浓度顺铂组(给药时间参考第四组)(DDP2.5组)，第三组为先提前一天(第一天)用25μg poly IC/只预处理荷瘤老鼠，于次日(第二天)再给予两种药物组成的组合物：2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC(Poly(I:C)25+DDP2.5组)，第四组(第二天)为单独的5mg/kg的高浓度顺铂组(DDP5组)。间隔一天后进行第二个疗程，总共4个疗程，每个疗程3天。结果如图4B所示。Poly(I:C)25+DDP2.5组对黑色素瘤的转移抑制效果要显著高于PBS组和DDP2.5组，并且，其肺的肿瘤转移灶的数目显著少于高浓度组即DDP5组的转移灶数目。我们进一步比较3组处理对裸鼠的毒副作用(图4C)，根据体重的变化分析提示DDP5组和Poly(I:C)25+DDP2.5组即联合组虽然对荷瘤黑鼠的具有毒副作用，但是均能够有效抑制肿瘤进展。其产生的毒副作用可能和黑色素转移瘤模型本身的发病进展快，致死率高等因素有关。因此，预处理双链RNApoly IC后，联合使用低剂量顺铂和双链RNA poly IC显著提高低剂量顺铂的杀伤作用，抑制黑色素瘤进展。
实施例5：肿瘤化疗药物组合物在体内的抗血液瘤(B细胞淋巴瘤)效果：
取2*107个对数生长期生长状况良好的B细胞淋巴瘤细胞系A20，于BALB/c品系白鼠腋下进行植瘤，待肿瘤模型成功建立后(图5)，按照实施例2设置四个实验组：第一组为不作处理的荷瘤白鼠组(PBS组)，第二组为单独的2.5mg/kg的低浓度顺铂组(给药时间参考第四组)(DDP2.5组)，第三组为先提前一天(第一天)用25μg poly IC/只预处理荷瘤老鼠，于次日(第二天)再给予两种药物组成的组合物：2.5mg/kg的低剂量顺铂以及25μg poly IC(Poly(I:C)25+DDP2.5组)，第四组为单独(第二天)的5mg/kg的高浓度顺铂组(DDP5组)。间隔一天后进行第二个疗程，总共4个疗程，每个疗程3天。结果如图5所示。Poly(I:C)25+DDP2.5组对胃肠道肿瘤灶的抑制效果要显著高于PBS组和DDP2.5组。我们进一步比较3组处理对裸鼠的毒副作用，根据体重的变化分析提示：相比于DDP5组，Poly(I:C)25+DDP2.5组即联合组对荷瘤白鼠的具有显著降低的毒副作用。因此，预处理双链RNA poly IC后，联合使用低剂量顺铂和双链RNA poly IC显著提高低剂量顺铂的杀伤作用，抑制B淋巴瘤进展，并且显著降低顺铂的毒副作用。
Claims (12)
1.一种组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述药物可以为疾病诊断和治疗目的的药物，也可以为非疾病诊断和治疗目的的、实验室研究目的工具制剂，其特征在于，该组合物由顺铂和双链RNA poly IC组成。
2.一种组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，所述药物可以为疾病诊断和治疗目的的药物，也可以为非疾病诊断和治疗目的的、实验室研究目的工具制剂，其特征在于，该组合物由顺铂、双链RNApoly IC和西妥昔单抗组成。
3.如权利要求2所述的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体肿瘤头颈癌。
4.如权利要求1所述的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为实体肿瘤头颈癌。
5.如权利要求1所述的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为转移瘤黑色素瘤。
6.如权利要求1所述的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于，所述肿瘤为血液瘤B细胞淋巴瘤。
7.如权利要求1或者2所述的组合物的使用方法，其特征在于：第一天先用双链RNA poly IC刺激，第二天使用权利要求1或者2所述的组合物；所述使用，其场合可以为疾病的治疗，也可以是非疾病诊断或者治疗目的的实验室研究。
8.如权利要求1或者2所述的组合物的使用方法，其特征在于：第一天先用双链RNA poly IC刺激，第二天使用权利要求1或者2所述的组合物；所述组合物当中的顺铂在使用时其浓度对应的临床换算浓度为顺铂临床使用的剂量的1/10；所述使用，其场合可以为疾病的治疗，也可以是非疾病诊断或者治疗目的的实验室研究。
9.如权利要求1所述的组合物的使用方法，其特征在于：第一天先用双链RNApoly IC刺激，第二天使用权利要求1所述的组合物，第四天使用西妥昔单抗；所述使用，其场合可以为疾病的治疗，也可以是非疾病诊断或者治疗目的的实验室研究。
10.如权利要求1所述的组合物的使用方法，其特征在于：第一天先用双链RNApoly IC刺激，第二天使用权利要求1所述的组合物，第四天使用西妥昔单抗；所述组合物当中的顺铂在使用时其浓度对应的临床换算浓度为顺铂临床使用的剂量的1/10；所述使用，其场合可以为疾病的治疗，也可以是非疾病诊断或者治疗目的的实验室研究。
11.如权利要求5所述的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述组合物可以显著抑制转移瘤黑色素瘤在肺部的肿瘤转移灶的形成；且使用时第一天先用双链RNA poly IC刺激，第二天使用权利要求1所述的组合物；所述使用，其场合可以为疾病的治疗，也可以是非疾病诊断或者治疗目的的实验室研究。
12.如权利要求6所述的组合物在制备治疗肿瘤药物中的应用，其特征在于：所述组合物可以显著抑制血液瘤B细胞淋巴瘤在肠道部位的肿瘤灶的形成；且使用时第一天先用双链RNA poly IC刺激，第二天使用权利要求1所述的组合物；所述使用，其场合可以为疾病的治疗，也可以是非疾病诊断或者治疗目的的实验室研究。
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