CN1500142A - 通过增强细胞活力生产高水平细胞因子 - Google Patents

Abstract

本发明涉及在人细胞培养中提高细胞因子产量的组合物和方法，特别是在通过表达CrmA抑制凋亡细胞死亡的条件下。

Description

通过增强细胞活力生产高水平细胞因子

技术领域

本发明涉及通过抑制与细胞因子合成有关的凋亡过程在人细胞培养中提高细胞因子产量的组合物和方法，特别是在细胞因子调节因子过度表达的条件下。

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背景技术

由包括病毒、细菌和寄生虫病原体所致的感染引起宿主免疫系统的激活和多种分子如细胞因子的信号传导，导致免疫系统多个支路的动员。细胞因子是迅速增加的有效和多效多肽的集合体，作为局部和/或全身细胞间调节因子而起作用(见，如，Balkwill和Burke，1989；Wong和Clark，1988；和Clark和Kamen，1987.)。它们在许多生物学过程中发挥重要作用，如免疫性、炎症和造血，并由包括成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞/单核细胞和淋巴细胞的多种细胞类型产生。至今，已经鉴定了大量的细胞因子，包括干扰素类(IFNs)、肿瘤坏死因子类(TNFs)、白介素类(ILs)、生长因子类如表皮生长因子、和分化因子类如集落刺激因子(CSF)。

一般来说，细胞因子和大量其他具有药用和工业用途的蛋白可通过从细胞培养中纯化天然蛋白质或在昆虫、微生物或人类细胞中重组产生蛋白质而生产。天然的细胞因子和其他蛋白质是优选的，因为已知它们含有特定天然形式细胞因子或蛋白的完整组成部分，并具有正确的结构。但是，这种天然形式的细胞因子和蛋白的生产是昂贵和耗费时间的。

重组产生的细胞因子和其它蛋白质的生产不太昂贵，但可能含有外源性抗原，引起用药的受者产生免疫反应，或由于与天然形式即糖基化形式的结构差异而活性较低。一般来说，产生细胞因子和其他蛋白质的本方法是基于下面这些因素的表达：(i)在微生物系统中，不允许进行蛋白质天然折叠的适当糖基化，或(ii)在人细胞中产生水平较低。

因此，增加天然细胞因子和其他蛋白质的产量，使其生产不太昂贵的方法将是有益的。

dsRNA激活的蛋白激酶(PKR)是指PI/eIF2激酶、DAI或dsRNA激活抑制剂dsI、p68(人)或p65(鼠)激酶，是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其酶活性的激活需要与dsRNA、或呈现内部dsRNA结构的单链RNA结合，随后自动磷酸化(Galabru和Hovanessian，1987；Meurs，等人，1990)。PKR在许多有用的细胞因子的表达中起重要作用，包括干扰素类，如美国专利第6,159,712号所描述的，在此特别引入以供参考。

最近的结果表明，PKR活性形式的表达可能通过上调Fas受体而触发凋亡(Donze，O.，等人.，1999)，也提示PKR可能具有肿瘤抑制剂和凋亡诱导剂的作用(见，如，Clemens和Bommer，1999；Koromilas，等人.，1992)。也见Yeung，M.C.，等人，1996；Yeung，M.，和Lau，A.S.，1998)。

总起来说，这些结果表明，可以期望在表达PKR的细胞系中抑制凋亡细胞的死亡，以便延长细胞在细胞因子诱导期间的寿命，从而提高细胞中细胞因子和其他蛋白的产量。

发明概述

在一个方面，本发明包括在哺乳动物细胞培养中产生一种或多种细胞因子的方法。

本发明提供了产生细胞因子的人细胞组合物，其中所述细胞的特征是表达抗凋亡蛋白的编码序列，且其细胞因子的产生水平是不表达抗凋亡蛋白的相应亲代细胞系表现的细胞因子产生水平的至少两倍(2×)。

在一个相关的方面，本发明提供了产生人细胞组合物的方法，该细胞组合物显示一种或多种选自以下细胞因子的活性、表达或产量增加：干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；白介素-2(IL-2)；白介素-3(IL-3)；白介素-7(IL-7)；白介素-8(IL-8)；白介素-10(IL-10)；和白介素-12(IL-12)。

在这样的产生细胞因子的细胞中表达的抗凋亡蛋白优选包括修饰的或突变形式的eIF-2a、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAX；抗凋亡蛋白如Bcl-2、Bcl-X_L和相关的类似物，特别是CrmA。

这种产生细胞因子的人细胞组合物可如此制备：通过引入含有CrmA编码序列和选择性标记物编码核酸序列的第一个表达载体修饰能够产生细胞因子的亲代人细胞系，并在筛选剂的存在下培养被修饰的细胞以选择CrmA表达细胞。

在实施本发明的过程中，产生抗凋亡蛋白的细胞可进一步(1)通过引发和/或诱导，以有效增强细胞因子产量的方式处理；或(2)通过引入第二个表达载体而被修饰，该载体含有细胞因子调节因子如PKR的编码序列和编码选择性标记物的核酸序列以选择表达CrmA和PKR的细胞，然后进行引发和/或诱导。

可通过将转化细胞与许多试剂中的任试剂接触而实现而引发，如醋酸佛波豆蔻酯(PMA)或干扰素-β。诱导是指将转化细胞与微生物诱导剂接触，如仙台病毒、脑心肌炎病毒或单纯疱疹病毒；或将细胞与至少一种非微生物诱导剂接触，该诱导剂选自poly(I)：poly(C)(poly IC)，或poly r(I)：poly r(C)(poly rIC)，肝素，硫酸葡聚糖，放线菌酮，放线菌素D，丁酸钠，钙离子载体和硫酸软骨素。

通过抑制凋亡，本发明的细胞系组合物和方法增加了细胞因子的产量和/或增加了细胞产生细胞因子的时间。

当结合阅读本发明的下列详细描述与附图时，就会完全地理解本发明的这些和其他目的和特征。

附图描述

图1显示了在超诱导和仙台病毒进行病毒诱导后，亲代野生型(WT)和表达CrmA(CrmA-#2)的MG-63细胞采用亚丙基测定检测细胞活力的结果。

图2显示了在超诱导和仙台病毒处理后亲代野生型(WT)和表达(CrmA-#2)的MG-63细胞中β-干扰素的产量。

图3显示了在超诱导后表达(CrmA-#2)的MG-63细胞中0、2mM、4mM和8mM 2-氨基嘌呤(2-AP；PKR抑制剂)对β-干扰素产量的影响。

图4A和4B显示了分别用仙台病毒和poly IC进行细胞因子诱导后6A，A9和WT细胞系活力的百分比。

图5A和5B显示了分别用仙台病毒和poly IC处理后6A，A9和WT细胞系中产生的α-干扰素水平。

发明的详述

I. 定义

如果没有其他说明，所有在此所使用的科技术语对于本发明领域的专业技术人员们来说，具有相同的含义。可以特别地指导医生们在Sambrook等人，1989和Ausubel FM等人，1993中获得本领域的术语和定义。可以理解的是本发明并不限制于所描述的特殊方法学、步骤和试剂，因为他们是可以变化的。

在此所引用的所有出版物在此均特别引入以供参考，其目的是描述和公开所可能使用的与本发明有关的组合物和方法学。

“异源”核酸构建物或序列是它要被表达的细胞的非天然序列的一部分。就控制序列而言，异源性是指本质上不能调控它正在调控的相同基因表达的一条控制序列(即启动子或增强子)。一般来说，异源核酸序列对于细胞或它们所存在的基因组的一部分来说不是内源性的，并已经通过感染、转染、微注射、电穿孔或类似方法加入至细胞中。“异源”核酸构建物可能含有一个控制序列/DNA编码序列结合物，它与在天然细胞中所发现的控制序列/DNA编码序列结合物相同或不同。

术语“载体”，如在此所使用的，是指设计用来在不同宿主细胞之间转移的核酸构建物。“表达载体”是指具有在外来细胞中掺入和表达外源DNA片段能力的载体。许多原核和真核表达载体可从商业渠道获得。适当表达载体的选择是包含在本领域专业技术人员的知识范围之内的。克隆或表达载体可包含其他的元件，如表达载体可具有两个复制系统，因此可以允许在两个生物体中生存，如在人细胞中表达，在原核细胞宿主中克隆和扩增。克隆和表达载体典型地含有一个选择性标记物。

如在此所使用的，术语“编码选择性标记物的核酸序列”是指一个能够在哺乳动物细胞中表达的核苷酸序列，其中选择性标记物的表达赋予了含有所表达基因的细胞在选择性试剂的存在下生长的能力。

如在此所使用的，术语“启动子”是指一个可引导下游基因直接转录的核酸序列。启动子一般适合于靶基因被表达的宿主细胞。启动子与其他转录和翻译调控核酸序列一起(也称为“控制序列”)对于表达特定基因是必需的。一般来说，转录和翻译调控序列包括，但不限于，启动子序列、核糖体结合位点、转录起始和终止序列、翻译起始和终止序列以及增强子或激活子序列。启动子可以是结构性的或诱导性的，可以是天然存在的，基因工程改造的或杂合的启动子。

术语“控制序列”是指在特殊宿主生物体中可操作连接的编码序列所必须的DNA序列。适合原核细胞的控制序列，例如包括启动子，任选的操纵子序列，和核糖体结合位点。真核细胞已知可使用启动子、多腺苷酸化信号和增强子。

如在此所使用的，术语“可操作性连接”涉及重组DNA构建物或载体，其含义是重组DNA构建物或载体的核苷酸组分可直接与另一个连接，以便操作性的控制所选择的编码序列。一般来说，“可操作性连接”的DNA序列在分泌性引导子的情况下是连续的，并在可读框中也是连续的。但是，增强子不一定是连续的。在合适的限制性位点上通过连接反应进行连接。如果这样的位点不存在，可根据常规的方法使用合成的寡核苷酸接头或连接子。

如在此所使用的，术语“基因”是指涉及产生多肽链的DNA片段，可包括或不包括编码区之前和之后的区域，如5′不翻译(5′UTR)或“引导”序列和3′UTR或“尾”序列，以及单个编码片段(外显子)之间的插入序列(内含子)。

如在此所使用的，术语“序列同一性”是指采用序列排列程序进行排列时，在两个或多个排列序列之中的核酸或氨基酸序列同一性。

术语“同源性”在此与“同一性”交叉使用，是指当采用序列排列程序进行排列时，在两个或多个排列的序列之间的核酸或氨基酸序列同一性的水平。如，在此所使用的，80％的同源性是指通过特定的算法确定的80％序列同一性，并且相应地给定序列的同源物在给定长度的序列上具有超过80％的序列同一性。序列同一性的实例水平如在此所描述的，包括但不限于，与PKR序列具有80，85，90或95％或更多的序列同一性。

用于确定两个序列之间同一性的计算机程序的实例包括，但不限于，BLAST程序系列，如BLASTN，BLASTX，和TBLASTX，BLASTP和TBLASTN，可公共的在互联网上在http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/＂获得。也见，Altschul，S.F.等人，1990和Altschul，S.F.等人，1997。

当计算一条指定核酸序列与在GenBank DNA序列库和其他公共数据库中的核酸序列的相似性时，序列的检索典型地是采用BLASTN程序来执行。BLASTX程序优选检索在GenBank蛋白序列库和其他公共数据库中已经在所有可读框中被翻译为氨基酸序列的核酸序列。BLASTN和BLASTX的运行采用缺省参数，开放间隙补偿系数为11.0，延伸间隙补偿系数为1.0，并使用BLOSUM-62矩阵。[见Altschul等人，1997。]

为了确定在两条或多条序列之间的“％同一性”，所选择的序列的优选排列使用如CLUSTAL-W程序的Mac Vector6.5版来执行，采用缺省参数进行操作，包括开放间隙补偿系数为10.0，延伸间隙补偿系数为0.1，并使用BLOSUM 30相似性矩阵。

如果两条序列可在中等至高等严格杂交和冲洗条件下互相特异性杂交，该核酸序列被认为是与参考核酸序列“可选择性杂交”。杂交条件是以核酸结合复合体或探针的变性温度(Tm)为基础的。如，“最大严格性”典型地发生在大约Tm-5℃(探针Tm下5°)；“高等严格性则在Tm下大约5-10°；“中等严格性”在Tm下大约10-20°；“低等严格性”在Tm下大约20-25°，最大严格性条件用来鉴定与杂交探针具有严格同一性或近似严格同一性的序列；同时高等严格性条件用来鉴定与探针具有80％或以上序列同一性的序列。

中等和高等严格性杂交条件在本领域是为人熟知的(见，如Sambrook等人，1989，第9和11章，和Ausubel，F.M.等人，1993，在此特别合并作为参考文献)。高等严格性条件的实例包括在大约42℃，在50％甲酰胺，5×SSC，5×Denhardt′s溶液，0.5％SDS和100μg/ml变性载体DNA中进行杂交，然后在2×SSC和0.5％SDS室温下冲洗两次，在42℃在0.1×SSC和0.5％SDS中另外冲洗两次。

如在此所使用的，“重组体”涉及细胞或载体，它们已经通过引入异源核酸序列而被修饰，或细胞来自如此修饰的细胞。因此，例如，重组细胞可表达一些在细胞的天然形式(非重组体)的相同形式中未被发现的基因，或反之表达一些异常表达的天然基因，这些基因在人为的干预下表达或根本不表达。

如在此所使用的，术语“转化”，“稳定转化”或“转基因”就哺乳动物细胞而言，它们是指哺乳动物细胞具有非天然的(异源性)核酸序列，该序列被整合进其基因组中，可维持两代或更多代。

如在此所使用的，术语“表达”是指在基因的核酸序列基础上产生多肽的过程。该过程包括转录和翻译。

术语“细胞因子调节因子表达”是指细胞因子调控因子基因的转录和表达，其产物包括前体RNA，mRNA；多肽，翻译后加工多肽，及其衍生物，包括来自其他物种如鼠或猿酶的细胞因子调节因子。

紧接着，术语“PKR表达”是指PKR编码核酸序列的转录和翻译，其产物包括前体RNA，mRNA，多肽，翻译后加工多肽，及其衍生物，并包括来自其他物种如鼠或猿酶的PKR。例如，PKR表达的分析包括自磷酸化测定和eIF2α磷酸化测定检测PKR活性，Western印迹检测蛋白表达，Northern印迹分析和逆转录酶聚合酶链式反应(RT-PCR)检测PKR mRNA表达。

“选择性剪接”的过程是从一种单一的基因产生多个多肽同型异构体，并在基因转录的一些过程，但不是所有的过程中，涉及非连续外显子的共同剪接。因此一个特别的外显子可能与几个可选择的外显子中的任何一个连接，形成信使RNA。选择性剪接的mRNA可产生一些多肽(“剪接变异体”)，其中一些部分是相同的，而其他部分是不同的。

如在此所使用的，术语“生物学活性”和“生物学上有活性的”是指在细胞系培养中由特殊蛋白产生的活性。应该理解的是这样蛋白的“生物学活性”可根据培养条件而有所变化，一般认为是活性范围。相应地，蛋白的“生物学无活性”形式是指蛋白的一种形式，它被修饰的方式可干扰蛋白的天然活性。

如在此所使用的，术语“细胞因子调节因子的生物学活性”和“生物学上有活性的细胞因子调节因子”是指与特殊细胞因子调节因子或细胞因子调节因子的任何片断，衍生物，或类似物有关的任何生物学活性，如酶的活性等。

如在此所使用的，术语“细胞因子调节因子活性的正常水平”和“细胞因子调节因子表达的正常水平”是指在一个特殊类型如一个特殊类型的亲代细胞系中未修饰，未诱导，未引发或未感染的细胞中测定的细胞因子调节因子活性或表达的水平。应该理解的是这样“正常的”细胞因子调节因子活性或表达，被认为是细胞因子调节因子活性或表达的一个范围，一般在特定类型的细胞中进行观察，该细胞并未用编码细胞因子调节因子的载体转染，是未受刺激的(未被诱导或引发)和未被感染的。

然后，术语“PKR的生物学活性”和“生物学有活性的PKR”是指与PKR，或PKR的一个片断，衍生物或类似物有关的任何生物学活性，如酶活性，特别地包括涉及底物磷酸化的自磷酸化活性和激酶活性，这些底物如真核细胞翻译起始因子2(elf-2)和转录因子如NF-κB。

相似地，术语“PKR活性的正常水平”和“PKR表达的正常水平”是指测定在特殊类型，如一种特殊细胞系的未刺激或未感染细胞中存在的PKR活性或表达的水平。应该理解的是这样“正常”的PKR活性或表达，被认为是PKR活性或表达的一个范围，一般在特定类型的细胞中进行观察，该细胞并未用编码PKR的载体转染，是未受刺激的(未被诱导或引发)和未被感染的。

“正常”细胞因子调节因子活性或表达的范围可根据培养条件而有所变化。例如，U937细胞系具有PKR活性的正常范围，与Vero或Namalwa细胞系的PKR活性的正常范围不同。PKR的过度表达意味着其表达水平在PKR表达的正常范围之上，一般在特定类型的细胞中进行观察，该细胞未用编码PKR的载体转染，是未受刺激的(未被诱导或引发的)和未被感染的。相应地，PKR的“过度表达”意味着PKR活性，表达或产量的范围超过了一般在特定类型细胞中所观察到的范围，该细胞未通过引入含有PKR编码序列而被修饰以用来选择PKR的过度表达，是未受刺激的(未被诱导或引发的)和未被感染的。

在一个优选的方面，细胞因子调节因子的过度表达是指在所应用的特殊培养条件下，细胞因子调节因子活性，表达或产量的水平较相同细胞系细胞因子调节因子活性，表达或产量的正常水平高至少150％(1.5倍或1.5×)，，优选至少200％，300％或400％，或500％或更高。换言之，过度表达细胞因子调节因子的细胞系所表现的细胞因子调节因子产量或表达的水平较在相同类型细胞所表现的典型的细胞因子调节因子表达或产量水平高至少1.5倍，优选2倍(2×)，3倍(3×)，4倍(4×)，5倍(5×)或更高，后者细胞是未被选择，修饰或以可有效引起细胞因子调节因子过度表达的方式处理的。

在一些情况下，在特殊培养条件下，过度表达细胞因子调节因子如PKR的细胞系所表现的细胞因子调节因子表达或产量的水平较在相同类型细胞所表现的典型的细胞因子调节因子表达或产量水平高10倍(10×)或更高，后者细胞是未被选择或以可有效引起细胞因子调节因子过度表达的方式处理的。通过实例，术语“以有效引起PKR过度表达的方式处理”是指，将一种或多种PKR编码序列(异源性或自体来源的)引入至细胞中，选择，刺激(引发或引发和诱导)和/或感染。

如在此所使用的，术语“细胞因子的正常水平”和“蛋白的正常水平”，涉及活性，表达和产量，是指细胞因子或其他蛋白活性，表达或产量的水平，是在特殊类型的细胞中检测的，其中，该细胞未以可有效引起细胞因子调节因子过度表达的方式进行处理。实例包括，未被选择或未以可引起细胞因子调节因子活性，表达或产量增加的方式进行处理的一个野生型细胞系和不含有所引入的细胞因子调节因子编码序列的细胞系。应该理解的是，这样“正常”的细胞因子或其他蛋白的活性，表达或产量被认为是在一个特定类型细胞中所观察到的典型的活性，表达或产量的范围，可根据培养条件而发生变化。

相应地，“正常”细胞因子活性或表达的范围可根据培养条件而变化。术语“增高的水平”和“在正常水平之上”就细胞因子或蛋白活性，表达或产量而言可以互相交换使用。术语是指在所使用的特殊培养条件下，细胞因子或蛋白活性，表达或产量的水平较相同细胞系的亲代细胞所表现的细胞因子或蛋白活性，表达或产量水平高至少150％(1.5倍或1.5×)，优选至少200％，300％或400％，或500％或更高，其中亲代细胞未被选择，修饰或用可有效引起细胞因子或蛋白活性，表达或产量增加的方式处理。在一些情况下，细胞因子或蛋白活性，表达或产量的增加是亲代细胞系的10倍(10×)或更高。

如在此所使用的，术语“纯化”和“分离”一般是指可从发现或产生的环境中的其他组分中分离的分子，多核苷酸或多肽。例如一个分离或纯化的多核苷酸或多台典型地可从发现或产生它们的环境中的75％或更多组分中分离出来。一个分离或纯化的多核苷酸或多肽优选从发现它们的环境的至少80％至85％和更优选至少90％，95％或更多的组分中分离出来。例如，一个“纯化”或“分离”的细胞因子是指，细胞因子从其被产生的细胞培养培养基中至少75％或更多，优选从至少80％至85％或更优选从至少90％或更多的组分中被分离出来。

如在此所使用的术语“凋亡细胞死亡”，“程序性细胞死亡”和“凋亡”是指由于细胞事件中的复合级联反应或与之相关的任何细胞死亡，该事件发生在细胞分化的特殊时期，是对特异的刺激产生的反应。凋亡细胞死亡的特征是细胞质的固缩和濒死细胞核染色质的固缩。与该过程相关的是DNA碎裂成多个长度为200的碱基对，RNA降解，以及蛋白水解，其形成方式不需要坏死细胞死亡时所见到的细胞迅速溶解。

如在此所使用的，术语“抑制凋亡细胞死亡”是指在培养细胞系以表达或产生细胞因子或其他蛋白的整个期间内部分或全部抑制细胞死亡过程。这样的抑制作用就在没有被可有效抑制凋亡的方式修饰过的细胞系中所观察到的凋亡细胞死亡的数量来说，一般是指凋亡细胞死亡被减少至少20％，优选至少50％和更优选80％或更多。

在产生细胞因子的细胞系中，这样的抑制作用就没有被以可有效抑制凋亡的方式修饰过的过度表达PKR的细胞系中所观察到的凋亡细胞死亡的数量来说，一般是指凋亡细胞死亡的数量减少至少20％，优选至少50％，更优选80％或更多。

上面所提到的关于细胞因子的定义也适用于采用本发明方法产生的“其他蛋白”，如CrmA，Bcl-2，Bcl-X_L和相关的同源物。相应地，CrmA，Bcl-2或Bcl-X_L的“过度表达”分别表示CrmA，Bcl-2或Bcl-X_L活性或表达的范围，它们较没有被编码CrmA，Bcl-2或Bcl-X_L的载体转染和被刺激产生凋亡的特定类型细胞所观察的一般范围高。

如在此所使用的，术语“修饰形式”，就与凋亡相关的蛋白而言，其实例为eIF-2α或eIF-2α，eIF-3，FADD，Bcl-Xs，BAK，BAX，等，其含义是天然蛋白的衍生物或变异体形式。也就是，一个蛋白的“修饰形式”具有一个衍生多肽序列，该序列含有至少一个氨基酸取代、缺失或插入，特别优选具有氨基酸取代。氨基酸取代，插入或删除可发生在多肽序列中的任何残基上，可干扰蛋白的生物学活性。编码变异体或衍生蛋白的相应核酸序列被认为是“突变”或“修饰形式”的基因或其编码序列，它包括在本发明的范围之内。

II. 细胞因子调节因子和细胞因子的产生

许多已知的因子涉及细胞如人类细胞中细胞因子的诱导和/或表达增强。这些因子包括细胞因子和其他蛋白特异的转录调节因子，如干扰素调节因子(IRF-1、IRF-3和IRF-7)，细胞因子受体，核因子kB(NF-kB)，激活物蛋白-1(AP-1)，核因子IL-6(NF-IL6)，特别是PKR。

增强任何这些因子的表达或活性一般将引起较一种或多种编码细胞因子的基因正常表达更高的表达。

PKR在此用作能调控细胞因子和其他蛋白表达的蛋白实例；但应该理解的是其他细胞因子和蛋白增强因子(在此称为“细胞因子调节因子”或“CRF”)可用来代替PKR，如(1)蛋白激酶C(PKC)诱导物，TNF-α，GM-CSF， EGF和PDGF，G-CSF，TGF， TNF-α或TNF-β，IL-1，IFNs(IFN-α，IFN-β，IFN-γ)或趋化因子(IL-8，巨噬细胞炎性蛋白[MIP-Ia&-Ib]和单核细胞趋化蛋白[MCPs])；(2)其他细胞信号传导因子如PMA，钙离子载体，丁酸钠或内毒素；(3)poly I：C，双链RNA或病毒类似物；(4)可激活PKR的细胞应激信号，包括热休克，病原体感染，如病毒感染，或(5)可增强这样一种细胞因子调节因子表达从而引起细胞因子产生增加的任何因子。

    A. PKR

PKR是仅有的被鉴定的已知具有激酶活性的dsRNA结合蛋白，PKR是一种丝氨酸/苏氨酸激酶，其酶的激活需要dsRNA结合和其后的自磷酸化(Meurs等人，1990；Feng GS等人，1992)。

PKR体内最特征化的底物是真核起始因子(eIF-2a)的α亚单位，一旦被磷酸化，最终将抑制细胞和病毒蛋白的合成(Hershey，J.W.B.，1991)。当被双链RNA激活时，在体外PKR已经被证明是磷酸化起始因子eIF-2α(Chong等人，1992)。PKR的这种特殊功能已经被证明是介导IFN-α和IFN-β的抗病毒和抗增殖活性的机制之一。PKR的另外一个生物学功能被假定为信号转换器，如IkB的磷酸化，可引起核因子kB(NF-kB)的激活和释放(Kumar A等人，1994)。

以前证明PKR可介导干扰素(IFN)表达的转录激活(Der D和LauAS，1995)。IFN可表现其生物学活性，与其同源受体结合，然后进行信号转导，引起IFN刺激基因((ISGs)的诱导。这样的ISG被认为至少通过两种细胞内通路介导IFN的生物学活性：通过激活特异的核糖体和诱导IFN调控的双链RNA激活激酶(PKR)。与这种观察一致，通过用PKR的反义寡核苷酸转染U937细胞或表达PKR缺陷的突变体抑制内源PKR活性，可引起IFN对病毒感染的诱导反应消失(Der D和Lau AS，1995)。

总之，与PKR有关的有：(1)对复合体受体系统进行信号转导(包括IFN，TNF和Fas)，(2)转录激活细胞因子基因，(3)启动凋亡，和(4)通过磷酸化eIF-2α抑制蛋白合成。PKR的其他活性包括：(1)介导IFN-α和IFN-β的抗病毒和抗增殖活性，(2)未感染细胞对生理性应激的反应，和(3)细胞生长调节(Clemens和Elia，1997；Zamanian-Daryou等人，1999)。

也已经证明PKR可作为肿瘤抑制剂和凋亡诱导剂。(见，如Clemens MJ等，1999；Yeung，Lau等人，1996；Koromilas等人，1992)。最近的结果表明PKR活性形式的表达可引发凋亡，可能是通过上调Fas受体(Donze O，等人，1999)。

III. 凋亡

凋亡或程序性细胞死亡是一个细胞内部过程，是正常发育的中心部分，被严格地调控，对于发育，宿主的防御和抑制肿瘤形成都是很重要的。(其综述见Orrenius 1995；Stellar 1995；Vaux 1993)。凋亡在胚胎的发育(Cohen 1992)，控制器官的形成(Nagata等人，1995；Vaux，1993)，在成体生命中保持内环境稳定等方面均可对生物体提供许多益处。一旦形成凋亡，细胞则经历新轮次的蛋白合成和多种形态学/生理学变化包括细胞质固缩，核染色质固缩，膜起泡，最终在核小体间连接部位发生DNA降解，产生DNA片段，为多个长度为180的碱基对(bp)，检测为特征性的寡核小体梯度(Levine AJ，1993)。濒死的细胞最终碎裂成与膜结合的凋亡小体，可迅速被吞噬，被巨噬细胞或邻近细胞消化。

凋亡的作用是一种防御机制，可去除不必要的和潜在危险的细胞，包括病毒感染的细胞，自体免疫性疾病中的自反应性淋巴细胞，或恶性细胞(Oehm等人，1992；Yonehara等人，1989；Vaux，1993)。凋亡已经被默认为是尽量较少组织中由于频繁与诱突变化学品接触，致癌原或紫外线而产生的癌细胞发育危险的一种方式。

对肿瘤的进一步保护作用是对免疫系统激活反应而产生的一种前炎性细胞因子TNF-α提供的。TNF-α可引发转化的宿主细胞的凋亡性死亡(Heller，1992，Yeung，1996)。

凋亡的失调节可能导致发生疾病的过程(Thompson，1995)。相信这在疾病的发展过程中具有重要作用，这些疾病包括癌症，AIDS，缺血性中风和神经变性疾患。有证据表明抑制细胞死亡和不当的细胞死亡对宿主都是有害的，例如神经变性疾病包括阿尔兹海姆病和帕金森病，它们都与神经元的特殊亚型的过早死亡有关(Kosik KS，1992)。细胞凋亡的不当抑制或内在缺陷也显示可导致细胞的恶性转化(Korsmeyer，1992)。

与凋亡相关的个别原癌基因在经历凋亡的过程中在细胞中被表达，据观察控制原癌基因的表达可影响该过程。原癌基因的实例包括c-myc，Fas(APO-1)，p53，和Bcl-2，另外还有其他基因如ced-3，ced-4，ced-9和Ice(Stellar，1995；Cohen，1993)。

      A. PKR和TNF-α在凋亡中的作用

TNF是原型的前炎性细胞因子，是由激活的免疫细胞在清除病原体，抗病毒活性和破坏肿瘤的过程中产生的细胞毒性蛋白。但是体内高水平的TNF-α是有害的，因为TNF-α可诱导代谢性障碍，消耗和抑制造血。在细胞水平，TNF-α可诱导产生超氧化物自由基，激活溶酶体酶(Larrick等人，1990；Liddil等人，1989)，通过激活核酸内切酶断裂DNA(Rubin等人，1988)，引起凋亡。

多种机制被用来解释TNF-α相关的凋亡(Dressler等人，1992；Obeid等人，1993)。已经显示：(1)TNF-α的处理可引起几种丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶包括PKR的激活；(2)TNF-α和PKR可动员NF-kB；(3)PKR在TNF-α的信号通路中具有关键作用；(4)肿瘤抑制基因p53在TNF-α诱导的凋亡过程中具有关键作用。(见，Guy等人，1992；VanLint等人，1992；Yeung和Lau等人，1996)。

凋亡的抑制或延缓

本发明提供了通过抑制凋亡细胞死亡的过程在哺乳动物细胞培养中增强细胞因子产生的方法。通过抑制凋亡，在此所描述的细胞系在培养中具有更长的生命期，显示细胞因子的生物合成增加和/或在细胞产生细胞因子的时间增加。

在一个方面，本发明提供了通过在细胞培养中修饰细胞来调节细胞因子或其他蛋白产生的方法，其方式可有效地引起凋亡的抑制或延缓。如在此所描述的，发明人已经观察到一个细胞系的修饰可以能有效抑制或延缓凋亡的方式进行，以及一次或多次进一步的修饰，引发和诱导，这样与在相同条件下没有进行修饰的亲代细胞系相比，可以达到正常水平以上的细胞因子或其他蛋白产量。

在另一个方面，本发明提供了产生细胞因子或其他蛋白的方法，包括培养转染了一个表达载体的宿主细胞，该载体含有一个可在宿主细胞中起作用的启动子，并与编码一种蛋白的DNA序列可操作地相连，该蛋白的表达可有效抑制凋亡。

在哺乳动物细胞培养中抑制凋亡细胞死亡的过程可通过任何大量定向抑制凋亡的策略的任何一种来达到，包括：(1)能够抑制凋亡的蛋白的过度表达，其实例包括但不限于CrmA，Bcl-2a和Bcl-X_L或其同源物，(2)抑制eIF2-α(GenBank登记号A457497)磷酸化，如通过eIF2-α的突变形式或真核翻译起始因子(eIF-3)的过度表达，采用同源重组或位点定向诱变通过突变相应的内源基因而制备(因此可抑制PKR的下游底物)；(3)抑制内源性FADD活性，如通过FADD突变形式的过度表达，采用同源重组或位点定向诱变通过突变内源FADD基因而制备；或(4)使用占优势的突变体，采用同源重组或位点定向诱变通过突变一个内源基因获得Bcl-2a的一种或多种前凋亡体，如BAX(GenBank登记号L22473)，BAK(GenBank登记号BE221666)，和/或Bcl-Xs(GenBank登记号L20122)，或基因切除或删除一种或多种BAX，BAK，和Bcl-Xs。

在本发明的一个优选的方面，一个选择基因，如CrmA，Bcl-2a，Bcl-X_L或其同源物在宿主细胞中过度表达，可引起凋亡细胞死亡的抑制或延缓。在其他情况下，内源基因表达的抑制可引起凋亡细胞死亡的抑制或延缓，可被许多方法所影响，这些方法包括但不限于内源基因的突变，同源重组或位点定向诱变，基因删除或基因切除或任何可有效导致靶基因失活或表达改变的方法。

细胞的死亡可通过用亚丙基(PI)对细胞染色而进行检测，或使用凋亡细胞死亡特异的测定法，如，用annexin V染色(Vermes等人，1995)。坏死的细胞死亡可通过评价细胞活力测定组合的结果，以及相应细胞形态学的显微镜观察来与凋亡细胞死亡区分。

如上面所提到的，可通过增加本质上与可阻断凋亡过程相关的蛋白的表达来抑制凋亡。可以选择地，也可以通过减少本质上与加速凋亡过程的蛋白的表达来抑制凋亡，如通过以可有效表达这种蛋白的修饰或变异形式的方式来修饰细胞。

    A. 增强细胞因子反应修饰因子A(CrmA)的表达

痘病毒类可编码几种细胞因子反应修饰因子(Crm)蛋白，它们具有与许多对免疫反应很重要的人类蛋白同源的序列(Zhou Q等人，1997；Dbaibo GS等人，1998)。牛痘病毒细胞因子反应修饰因子A(CrmA)可抑制丝氨酸和半胱氨酸蛋白酶(Tewan，M等人，1995)，并已经被证明是凋亡的一个有效抑制剂，其中凋亡的诱导是通过去除血清(Nicholson，D.W等人，1995)，Fas或TNF受体的激活(Kostura，MJ等人，1989；Chinnaiyan，AM等人，1996)，或在原代鸡神经元培养中去除神经生长因子(Orth，K等人，1996)。CrmA已经显示具有优选的活性，可作为IL-1β转化酶(ICE)的竞争性抑制剂(Muzio，M等人，1996)，也显示对在凋亡过程中参与的ICE家族的其他成员的蛋白分解酶活性有较低的有效抑制作用。(见，如Dbaibo GS等人，1998和Dbaibo GS等人，1997。)

属于IL-1β转化酶(ICE)1家族的的蛋白酶被认为是凋亡过程的中心，部分是根据以下的观察结果：当这些蛋白酶以活性形式过度表达时凋亡被诱导(Miura，M等人，1993)；当这些蛋白酶被特异抑制时，凋亡被抑制(Tewari，M等人，1995)。

神经酰胺鞘氨酯最近被显示在许多不同的系统中是一个有效的凋亡诱导物。(见，如Brenner B等人，1998和Wegenknecht B等人，1998)。另外，TNF-α，Fas连接，去除血清，一些化学治疗剂和γ-照射(所有这些据报道均可诱导凋亡)已经显示可增加神经酰胺的细胞水平，表明神经酰胺的生物学活性对于许多凋亡诱导物所共有的通路是普遍的(Jayadev，S等人，1995；Haimovitz-Friedman，A等人，1994；和Tepper，C.G等人，1995)。

来自Fas和TNF-α受体1的凋亡死亡信号已经被观察到通过FADD起作用，含有“致死功能区”的蛋白属于信号分子的新家族，与TNF-α受体家族的成员有关。FADD的显性失活突变体的表达显示可抑制神经酰胺的积累，ICE相关的蛋白酶的激活，和用Fas抗体处理后的凋亡。外源提供的神经酰胺能够绕过这种阻断作用，产生凋亡(Chinnaiyan，A.M.等人，1996)。

用TNF-α处理后在MCF-7细胞中神经酰胺的积累被观察到可完全被CrmA抑制，表明CrmA可靶向作用于对TNF-α反应而产生神经酰胺的上游凋亡信号传导。外源神经酰胺显示可通过CrmA绕过这种阻断作用，并产生凋亡(Dbaibo等人，1997)。

相对比的是，Bcl-2可保护TNF-α和神经酰胺诱导的细胞死亡，但不干扰神经酰胺的产生，表明它进一步作用于神经酰胺通路的下游(Dbaibo等人，1997)。

    B. 增强Bcl-2，Bcl-XL或其同源物的表达

Bcl-2家族成员已经显示可作为凋亡的抑制剂或促进剂。Bcl-2是作为一条基因被发现的，其表达可通过在B细胞肿瘤中染色体转位而增加(由Reed进行了广泛的综述)。Bcl-2已经被发现在大多数滤泡性非何杰金氏淋巴瘤中是激活的，在其他恶性肿瘤中如前列腺癌中出现频率较低。其激活在一些良性病变如滤泡性淋巴结和扁桃体增生中也已经被发现了。

在多种类型细胞包括但不限于淋巴细胞，成纤维细胞，神经元和造血细胞，Bcl-2的表达已经显示可延缓或甚至阻止凋亡。相反地，Bcl-2在许多这些系统中的下调已经显示可促进凋亡。Bcl-2是一个膜相关蛋白，典型地可在完整细胞的核包膜，内质网和线粒体上发现。

Bcl-2家族的基因产物一般涉及凋亡过程。Bcl-2a和Bcl-X_L被认为是抗凋亡蛋白(Boise和Thompson，1995；Schendel，1998)，以前对淋巴细胞和髓样细胞的研究表明Bcl-2a在维持细胞生长和防止细胞死亡方面具有一定作用(Cohen，1993)。另外，Bcl-2a在防止神经细胞凋亡方面具有明显的作用(Garcia等人，1992)，可能是通过减少活性氧物质的产生(Kane等人，1993)。

许多细胞的活力依赖细胞因子或生长因子的持续或间断供应。在缺乏这样的细胞因子或生长因子的情况下，细胞发生凋亡。Bcl-2家族的蛋白是细胞因子所介导的凋亡过程所必须的。当细胞因子被去除后，Bcl-2和Bcl-X_L的过度表达已经显示可抑制凋亡。BAX和BAK的过度表达已经显示可抵消来自细胞因子受体的信号，并诱导凋亡。

在本发明的一个实例应用中，过度表达Bcl-2的细胞可通过用一个pSV-2-Bcl2表达载体转染靶细胞系而产生(Reed等人，1988；Reed等人，1981)。过度表达Bcl-2的细胞被产生，选择，并进一步以可有效产生细胞因子或其他蛋白的方式被培养，然后培养物被分析细胞因子或蛋白的产量，进一步在下面实例4中描述。

C. 抑制eIF2-α磷酸化

已证实，PKR在包括前单核细胞U937细胞的细胞中对TNF-诱导的和p53-介导的凋亡起重要的作用。(Yeung，M.C.，等人，1996；Yeung，M.，和Lau，A.S.，1998)。通过用PKR-反义或PKR-突变体的表达质粒转染U937细胞，抑制PKR活性，使细胞对TNF或内毒素诱导的细胞毒性具有更大的抗性。由于eIF-2α是PKR的生理学底物，已经表明它被PKR的磷酸化足以导致凋亡。

始终地，TNF-诱导的凋亡与eIF-2的α亚单位的磷酸化增加相关(Srivastave，等人，1998)。

如上所述，eIF-2α磷酸化后是抑制细胞和病毒蛋白合成的原因。通过因子磷酸化位点突变抑制PKR-介导的eIF-2α磷酸化后，提供了抑制PKR过度表达影响培养细胞系凋亡的方法。

在强病毒启动子的控制下，采用含eIF-2α修饰形式的编码序列的载体，在淋巴细胞中表达了eIF-2α蛋白的变异体。表达修饰形式eIF-2a的细胞被产生、选择和以有效地引起细胞因子或其它目的蛋白产生的方式进一步培养，并分析细胞因子或其它目的蛋白的生物合成(数据未展示)。

D. 抑制内源性FADD活性

Fas受体是TNF和神经生长因子受体超家族的成员(Stellar，1995)。在Fas配基与Fas受体结合后，通过直接的下游效应器包括FADD、FLICE和TRADD，启动凋亡。FADD是具有致死功能区的胞浆蛋白，该功能区对于CD 95配基和TNF诱导的凋亡是至关重要的。

这些蛋白与其各自受体的结合引起caspase蛋白酶级联的活化并加速凋亡。以往已经证实，NIH-3T3细胞中，Fas表达及随后的凋亡是受PKR活性调节的(Donze，等人，1999)。在用PKR激酶活性缺陷的显性失活突变体转染的细胞中，Fas、TNFR-1、FADD(Fas伴随的致死功能区)、FLICE、Bad和BAX的表达被抑制，细胞对凋亡-诱导剂有抗性。另外，缺少FADD的小鼠成纤维细胞几乎抵抗dsRNA-介导的细胞死亡(Balachandran，等人，1998)。

变异体、无功能的人和小鼠FADD基因产自野生型FADD基因(Chinnaiyen，等人，1995；Yeh，等人，1998)。突变体基因已被用于产生FADD活性缺陷的小鼠FADD-/-细胞，其结果对PKR-介导的细胞毒性具有抗性(Balachandran，等人，1998)。结果提示，Fas-介导的细胞死亡过程在表达修饰的FADD基因的细胞中被抑制或消除，使凋亡得到抑制，且此无活性形式FADD的抑制效果不被PKR活化所阻止。

为在实践本发明中使用，突变的FADD cDNA序列被插入载体中，该载体在强病毒启动子的控制下有效地表达插入的片段。表达修饰形式FADD的细胞被产生、选择、和以有效地引起细胞因子产生的方式进一步培养，并分析细胞因子或其它目的蛋白的生物合成(数据未展示)。

E. 抑制Bcl-2的前凋亡对应物

一般，BAX、BAK、Bcl-Xs和其它者是前凋亡蛋白(Boise和Thompson，1998)。BAX、BAK和Bcl-Xs的过度表达已显示压制了来自与细胞活力相关的细胞因子-介导的信号传导的信号，并引起凋亡。

突变的或变异体人BAX、BAK或Bcl-Xs cDNA序列可被插入到有效表达插入片段的载体中。于是，表达修饰形式人BAX、BAK或Bcl-Xs的细胞被产生、选择和以有效地引起细胞因子或其它目的蛋白产生的方式进一步培养，然后分析细胞因子或其它目的蛋白的生物合成(数据未展示)，如下所述。

在一个优选的实施方案中，在实践本发明中所用的修饰的eIF-2a、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAX蛋白是在自然中发现的其各自蛋白的衍生或变异体形式。即，衍生的多肽或蛋白含有至少一个氨基酸取代、缺失或插入。氨基酸的取代、插入或删除可发生在多肽或蛋白氨基酸序列中的任何残基上，只要它干扰了蛋白的生物学活性。

这种天然蛋白的修饰或变异体的形式一般是通过对编码eIF-2a、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAK蛋白的核酸序列中的一种或多种核苷酸进行位点特异的诱变而制备的，采用试剂盒或PCR诱变或本领域已知的其它技术产生编码修饰或变异体蛋白的DNA，此后在细胞培养中表达重组形式的DNA。

位点特异的诱变提供了在编码特定蛋白的DNA中引入一种或多种核苷酸序列改变的方法。位点特异的诱变技术通常为本领域已知，并典型地应用一个可以单链和双链形式存在的噬菌体载体。

应当理解，这里描述的天然蛋白的突变体、修饰或变异体形式可以通过适当核酸序列的点或位点定向的诱变，或通过同源重组(敲入或敲除)实现靶基因或相应蛋白功能或活性的抑制。

在一个作为举例的方法中，编码修饰的eIF-2a、FADD、Bcl-Xs、BAK或BAK蛋白的酵母和人型基因的cDNA序列，在启动子控制下被分别地插入表达载体中。启动子的范例包括结构性启动子和诱导性启动子，其实例包括CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、如所在描述的在tet-开或tet-关系统中含tet反应元件(TRE)的启动子(ClonTech and BASF)、β肌动蛋白启动子和可以通过添加某些金属盐类而上调的金属硫因启动子。

当变异体或突变体、无功能的人BAX、BAK或Bcl-Xs基因被掺入异源核酸构建物中并用于产生分别缺少BAX、BAK或Bcl-Xs活性的转化细胞时，凋亡被抑制。这种生物学无活性形式的BAX、BAK或Bcl-Xs对凋亡的抑制作用，提供了阻止细胞因子调节因子如PKR对培养细胞系中凋亡细胞死亡的过度表达的刺激作用的方法。

V. 增强的细胞因子活性、表达或产生

A. 细胞因子调节因子的过度表达

在一个方法中，细胞因子调节因子在哺乳动物细胞中的表达增强被用来增加细胞因子的活性、表达或产生。一种或多种细胞因子调节因子的表达高于正常构成水平，或其中细胞因子调节因子的表达可被诱导到高于正常水平的哺乳动物细胞系，因此被用于生产细胞因子。

用于产生特定细胞因子的细胞可以从任何哺乳动物来源过度表达一种或多种细胞因子调节因子，如PKR。

例如，含PKR-编码核酸序列的载体可被引入细胞，引起细胞PKR的过度表达。在这种载体中使用的编码序列的范例包括但不限于，在GenBank登记号第M35663中发现的来自人p68 PKR基因的编码序列，小鼠PKR基因，在兔网状细胞或人外周血单核细胞中正常发现的PKR形式，和其它eIF-2-α激酶包括酵母GCN2和氯高铁血红素调节抑制子(Wek RC，1994)。在优选的方法中，PKR的人p68激酶形式在人细胞系中过度表达。

在某些情况下，一种或多种过度表达的细胞因子调节因子是天然型细胞因子调节因子的突变体、变异体形式或类似物，如，就PKR而言，非天然的蛋白激酶可以介导细胞因子的dsRNA活化和其它蛋白转录(通常通过修饰编码天然PKR蛋白的基因而获得)。通过表达，特定细胞因子调节因子的突变体或变异体形式可具有增加的或减少的活性。

按照本发明，已经发现，在过度表达实例的细胞因子调节因子的细胞中，通过抑制细胞凋亡，可提高细胞的活力，引起细胞因子的产生增加。(见实例1和4)

特别关于PKR，PKR抑制子p53的抑制已经显示引起PKR活性的增强(Tan SL，等人，1998)。可选择地，去除血清和生长因子如IL-3可被用于在细胞中诱导PKR活性，或者可通过调节因子增加PKR的表达，该调节因子与控制PKR-编码核酸序列表达的启动子相互作用。关于内源性PKR-编码核酸序列的表达，调节因子的实例包括干扰素诱导的GAS元件、IL-6敏感的NF-IL6和APRF元件和KF-kB元件。(见，如，Jagus R.等人，1999和Williams BR，1999.)

B. 细胞因子调节因子过度表达细胞系的产生

细胞因子调节因子过度表达或过度产生的细胞可以通过以下方法获得：(i)能够表达一种或多种细胞因子调节因子的亲代细胞系的有限稀释克隆，筛选细胞因子调节因子的活性、表达和/或产生，并选择细胞因子调节因子的活性、表达和/或产生至少增加2倍(2×)的亚克隆；或(ii)在有效地引起细胞因子调节因子的活性、表达和/或产生至少增加2倍(2×)的条件下，通过将细胞因子调节因子-编码核酸序列引入细胞以修饰能够表达细胞因子调节因子的亲代细胞系。

随之，PKR过度表达或过度产生的细胞可以通过以下方法获得：(i)能够表达PKR的亲代细胞系有限稀释克隆，筛选PKR的活性、表达和/或产生，并选择PKR活性、表达和/或产生至少增加2倍(2×)的亚克隆；或(ii)在有效地引起PKR的活性、表达和/或产生至少增加2倍(2×)的条件下，通过将PKR的编码核酸序列引入细胞以修饰能够表达PKR的亲代细胞系，如共有的美国申请序列号第09/657,881中所进一步描述的，在此特别加入以供参考。

1. 增加内源性细胞因子调节因子的活性、表达和/或产生

在一个实施方案中，本发明提供了过度表达或过度产生内源性细胞因子调节因子编码序列的天然细胞系，并用这种细胞系来产生一种或多种细胞因子。

在此实施方案的一个优选的方面，过度表达或过度产生内源性细胞因子调节因子的天然细胞系通过用抗凋亡基因和/或引发和/或诱导作用转化细胞而被修饰，以增强细胞的细胞因子生成。

在实践本方法中，能够表达细胞因子调节因子和一种或多种细胞因子的细胞系(这里是指＂亲代细胞系＂)被鉴定，并采用本领域专业技术人员常规使用的标准方法进行单细胞的有限稀释克隆。通常，在96孔板内亚克隆步骤至少进行3次，优选地至少5次，典型地5至10次。亚克隆采用典型地用于培养亲代细胞系的培养条件进行培养以获得大约0.3至0.5百万细胞/ml的群落。然后，采用本领域已知的用于特定细胞因子调节因子的方法，通过评价转录(mRNA)和/或蛋白水平(Western印迹)和/或生物学活性，检测亚克隆中细胞因子调节因子的表达。

作为实例，PKR活性的测定包括自磷酸化测定(Der等人，1995)，eIF2α磷酸化的测定(Zamanian-Daryoush，等人，1999)，激酶试验(通过PKR的免疫沉淀完成和激酶的体外测定(Zamanian-Daryoush，等人，2000)。

通常可应用于分析细胞因子调节因子表达和/或产生的测定实例，包括蛋白测定如Western印迹，和mRNA检测如RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)、Northern印迹、斑点印迹，或采用根据细胞因子调节因子-编码核酸序列的适当标记探针进行原位杂交。

细胞因子调节因子表达或产生的水平比亲代细胞系高至少2倍(2×)，优选地是3倍(3×)、4倍(4×)、5倍(5×)或更高的亚克隆被选择。在某些情况下，这样选择的亚克隆具有比亲代细胞系高10倍(10×)以上的细胞因子调节因子表达或产生水平。

然后，选择的亚克隆被修饰和/或以有效地引起细胞因子产生增加的方式处理。被修饰通常是指用抗凋亡基因转化细胞，而处理通常是指引发和/或诱导以增加细胞产生的细胞因子，如下面进一步详述的。

2. 细胞因子调节因子-编码核酸在宿主细胞中的表达

本发明还提供了用含细胞因子调节因子-编码核酸序列的表达载体转导、转化或转染的宿主细胞。培养条件如温度、pH等以前用于转导、转化或转染前的亲代细胞系，并为本领域专业技术人员所理解。

在一个方法中，哺乳动物细胞系用表达载体被转染，表达载体含有可操作地连接编码PKR的DNA片段的启动子、或有生物学活性的启动子片段或在宿主细胞系中起作用的一种或多种(如，系列)增强子，以使PKR在细胞系中过度表达。

在此方法的一个优选方面，细胞首选用含抗凋亡基因的载体被转染，选择并成功的转化株被进一步修饰以产生过度表达细胞因子调节因子的细胞系。

细胞因子调节因子的过度表达是指细胞因子调节因子活性高于正常水平。通常为了观察未被用编码细胞因子调节因子的载体转染、未被引发或诱导和未被感染的相应亲代细胞系，典型地，＂正常的＂细胞因子调节因子活性或表达被报告为细胞因子调节因子活性或表达的范围。可以理解，特定类型细胞的细胞因子调节因子活性范围可依培养条件而有些不同。

高于正常的细胞因子调节因子表达是指相应亲代细胞系的正常细胞因子调节因子产生或表达水平的至少150％，优选地至少200％、300％或400％，更优选地500％或以上。细胞因子调节因子过度表达的细胞系可以是结构性细胞因子调节因子过度表达或诱导性细胞因子调节因子过度表达。

在一个优选的方法中，细胞因子调节因子过度表达细胞系可被诱导过度表达细胞因子调节因子，以调节可用于诱导细胞因子的细胞因子调节因子水平。

C. 细胞因子的产生增加

虽然细胞因子调节因子表达增强在这里被描述为增加细胞因子活性、表达或产生的方法，应当理解，为了增加细胞因子活性、表达或产生，不必要调节或直接地增加细胞因子调节因子的表达。

在一个可选择的方法中，插入或不插入异源核酸构建物都可以增加细胞因子的产生，异源核酸构建物编码细胞因子调节因子(如PKR、IRF-3、IRF-7、NF-KB或另一个转录因子)或编码抗凋亡蛋白。在一个实例中，这是通过选择抗凋亡蛋白表达增强的细胞系来实现的，如CrmA表达水平增强的细胞系，通过亚克隆选择。这种细胞系可以在亚克隆选择前或后通过引导编码细胞因子调节因子的异源核酸构建物而被修饰。

如这里详述的，采用适当的方法学通过引发和/或诱导被处理的细胞具有细胞因子产生的增加。换言之，本发明包括了增加细胞因子活性、表达或产生的方法和合成物，但不包括增强细胞因子调节因子表达的细胞选择或修饰。但是应当理解，当细胞在引起细胞因子产生增加的适当条件下被引发和/或诱导时，可以发生这种细胞因子调节因子表达的增强。

增加的或＂高于正常的＂细胞因子活性、产生或表达是指相应亲代细胞系所具有的细胞因子活性、产生或表达水平的至少150％，优选地至少200％、300％或400％，更优选地500％或以上。具有增加的或＂高于正常的＂细胞因子活性、产生或表达的细胞系可以是结构性细胞因子表达或诱导性细胞因子表达。

VI. 凋亡的抑制和细胞因子表达和产生的增加

相似地，为了调节凋亡以及使细胞因子的产量达到最佳的细胞因子调节因子表达，用于实践本发明的细胞系可被诱导过度表达干扰凋亡过程的蛋白。

A. 抑制凋亡

通常，通过抑制细胞系中的凋亡可以增加细胞因子产生，该细胞系的特征是一种或多种细胞因子调节因子和一种或多种细胞因子过度表达。

在一个优选的实施方案中，本发明提供了用第一个异源核酸构建物或表达载体转染的细胞系，它们在第一个启动子的控制下在细胞中有效地表达能够抑制凋亡的蛋白的编码序列。能够抑制凋亡的蛋白实例包括但不限于，CrmA、Bcl-2a、Bcl-X_L、修饰形式的真核细胞翻译启动因子2α(eIF-2α)或真核细胞翻译启动因子(eIF-3)、修饰形式的Fas-相关死亡结构区(FADD)、修饰形式的Bcl-Xs、修饰形式的Bcl-2-同系拮抗剂/扼杀剂(BAK)和修饰形式的BAX，如Bcl-2a或Bcl-X_L。

在此实施方案的一个方面，相同的细胞系以如下方式被修饰：(i)有效地表达能够抑制凋亡的蛋白(＂抗凋亡＂蛋白)的编码序列；和(ii)有效地表达一种或多种细胞因子调节因子如PKR的编码序列。通常，编码序列作为独立的异源核酸构建物被引入细胞。例如，第一个异源核酸构建物或表达载体典型地会包括抗凋亡蛋白如CrmA的编码序列、第一个启动子和第一个编码可选择标记物的核酸序列。相似地，第二个异源核酸构建物或表达载体典型地会包括一种或多种细胞因子调节因子如PKR的编码序列、第二个启动子和第二个编码可选择标记物的核酸序列。但是，两个编码序列都可以用单一载体被引入细胞。

在本发明这个方面的实践中，细胞可以(1)用单一载体转染，载体含编码抗凋亡蛋白的第一个编码序列、第一个启动子、第一个编码可选择标记物的核酸序列和编码细胞因子调节因子的第二个编码序列、第二个启动子和第二个编码可选择标记物的核酸序列；(2)用第一和第二个表达载体(如上所述)同时转染；(3)用第一个表达载体转染，选择稳定的转基因细胞系，然后用第二个表达载体转染所选择的细胞并选择双重转化株；(4)用第一个表达载体转染，仅选择稳定的转基因细胞系；或(5)用第二个表达载体转染，选择稳定的转基因细胞系，然后用第一个表达载体转染所选择的细胞并选择双重转化株。

在优选的方法中，按上面(1)-(5)的任何之一的描述制备的稳定转基因细胞系被引发和/或诱导以进一步增加细胞因子的产生，如下面进一步描述的。

B. 处理细胞以进一步增加细胞因子的产生

在本发明的另一个方面，表达有效抑制凋亡的蛋白的细胞系以有效地引起细胞因子产生增加的方式被引发和/或处理(诱导)。

在细胞系以有效地引起细胞因子产生增加的方式接受一种或多种选择、修饰、引发和处理(诱导)之前或之后，细胞系可以有效地抑制凋亡的方式被修饰。

在一个优选的方法中，该方法包括：(a)通过引导含抗凋亡蛋白编码序列，如编码CrmA的基因，的异源核酸构建物进入细胞系细胞，以有效地抑制凋亡的方式修饰能够产生细胞因子的细胞系，并进一步通过引导外源细胞因子调节因子的编码核酸序列进入细胞，以有效地表达因子的方式修饰细胞系，以及培养细胞以产生细胞因子调节因子过度表达的细胞系，该细胞系也表达抗凋亡基因；或(b)选择过度表达内源性细胞因子调节因子编码核酸序列的细胞，并培养该细胞以产生细胞因子调节因子过度表达的细胞系，进一步通过引导含抗凋亡蛋白编码序列，如编码CrmA的基因，的异源核酸构建物进入细胞系的细胞，以有效地抑制凋亡的方式来修饰细胞系，以产生细胞因子调节因子过度表达同时表达抗凋亡基因的细胞系；或(d)选择高水平表达内源性抗凋亡基因如CrmA同系物的细胞；或(e)选择高水平表达内源性抗凋亡基因如CrmA同系物的细胞，并进一步通过引导外源细胞因子调节因子的编码核酸序列进入细胞，以有效地表达因子的方式修饰细胞系，培养细胞以产生细胞因子调节因子过度表达同时表达抗凋亡基因的细胞系；和/或(f)引发和/或诱导。

引发是一个熟知的现象，当与处理或诱导一起应用时，通过用引发剂预处理细胞引起一种或多种细胞因子的产生增加。引发剂的实例包括但不限于，醋酸佛波醇豆蔻酯(PMA)和其它佛波醇酯类，钙粒子载体，干扰素-α，干扰素-γ，干扰素-β，G-CSF，GM-CSF， PDGF，TGF，EGF或趋化因子(IL-8，MCP或MIP)，丁酸钠，内毒素，激酶激活剂(如PKR、PACT的蛋白激活剂)，或转录激活剂(NF-KB，IRF类包括IRF-3和LRF-7)。适合的引发剂浓度可在科学文献中发现，如PMA浓度范围5-50nM，优选地大约10nM，是适合的。

诱导或处理是指在细胞培养中添加微生物(如病毒，细菌，或真菌)诱导剂，能够作为诱导剂的微生物提取物(如内毒素或含细菌胞壁的提取物)，或非微生物诱导剂。

非微生物诱导的方法实例包括但不限于，接触双链RNA(dsRNA)如poly(I)：poly(C)或poly r(I)：poly r(C)(polyIC)；接触小分子如，聚阴离子，硫酸肝素葡聚糖，硫酸软骨素，放线菌酮，放线菌素D，钙离子载体或丁酸钠；以及接触细胞因子。

病毒诱导的方法实例包括但不限于，(1)接触活病毒如，仙台病毒，脑心肌炎病毒或单纯疱疹病毒；(2)接触上述灭活的病毒；或(3)接触分离的双链病毒RNA。此外，通过将已知刺激细胞因子产生的特殊细胞因子加入某些细胞中可以产生或加强细胞因子诱导。

添加诱导剂后，典型地，细胞被进一步孵育直至达到所需的诱导水平并获得分泌的细胞因子。在37℃孵育至少12-48小时，直至72-96小时一般是足够的。

在本方法的一个应用实例中，细胞用IFN-β引发大约24 hr，随后接触含polyI：C和放线菌酮的培养基大约5hrs，在最后1小时内加入放线菌素D至终浓度。

在本方法的另一个应用实例中，细胞用IFN-β引发大约24hr，然后通过用病毒诱导剂如仙台病毒(SV)处理大约1hr来诱导，随后接触含polyI：C和放线菌酮的培养基大约5hrs，在最后1小时内加入放线菌素D至终浓度。

实例1描述了表达CrmA的细胞系的产生，及其超诱导和病毒诱导。实例2描述了载体的实例，转染方法和细胞因子调节因子过度表达的细胞系的产生，该细胞系还表达抗凋亡蛋白，Bcl-X_L，适合用于实践本发明。实例3通过实例的细胞因子调节因子过度表达细胞系和细胞因子调节因子过度表达同时表达抗凋亡蛋白的细胞系描述了细胞因子的产生。

VII. 表达载体和宿主细胞的转化

A. 表达载体

作为实例，异源核酸构建物或表达载体为产生表达CrmA，Bcl-X_L和PKR的转基因细胞系而制备(见实施例1和2)。特别地，从商业来源获得能够引入选择的人细胞并在其中复制的适合质粒或其它载体是载体构建领域熟知的，其中的质粒还可以装配有可选择的标记物、插入位点和适合的调控元件如终止序列。质粒可以有或没有其自己的启动子，或启动子可以在标准载体中交换。

用于实践本发明的异源核酸构建物或表达载体包括单独的抗凋亡蛋白编码序列或与细胞因子调节因子的编码序列联合。应当理解，术语＂抗凋亡蛋白＂可以指直接抑制凋亡的蛋白(如CrmA，Bcl-2a或Bcl-X_L)或与凋亡相关的修饰形式的蛋白(如，修饰形式的：真核细胞eIF-2α，eIF-3，FADD，Bcl-Xs，BAK，或BAX如Bcl-2a或Bcl-X_L)。

这种编码序列的变异体形式、片段及其剪接变异体包括在本发明的范围内。另外，载体可以包括独立的编码序列或联合其他的编码序列如融合蛋白或信号肽编码序列。

用于实践本发明的载体构建采用本领域专业技术人员已知的切割、连接和细菌转化标准方法。一般见于Maniatis，等人，1989；Ausubel，F.M.，等人，1993；和Gelvin，S.B.，等人，1990，它们全部在此特别地合并为参考文献。这里公开的载体和方法适合于表达抗凋亡蛋白和细胞因子调节因子的编码序列。任何载体都可以使用，只要它可复制并在它所引入的哺乳动物细胞中可有活力的。大量适合的载体和启动子为本领域专业技术人员已知，并可以从商业上获得。用于人细胞的适合克隆和表达载体也被描述于Sambrook等人，1989，和Ausubel FM等人，1989，在此特别地合并为参考文献。适当的DNA序列可以通过各种方法插入质粒或载体(在此合称为＂载体＂)中。通常，DNA序列通过标准的方法插入适当的限制性核酸内切酶位点中。此方法和相关的亚克隆方法相信在本领域专业技术人员的知识范围内。

本发明依赖于使用含编码上面描述的一条或多条序列的核酸的异源核酸构建物。该构建物包含载体如质粒或病毒载体，其中以正或反方向插入了本发明的序列。

载体典型地装配有可选择的标记物、插入位点和适合的调控元件如终止序列。载体可含有对编码序列在宿主细胞中(和/或在一般不表达修饰的可溶性蛋白抗原编码序列的载体或宿主细胞环境中)的表达有作用的调节序列，包括例如，非编码序列如内含子和调控元件，即启动子和终止子元件或5′和/或3′非翻译区，可操作地与编码序列相连接。

启动子可以是结构性的或诱导性的，可以是天然存在的、基因工程的或杂交的启动子。启动子的实例包括结构性启动子和诱导性启动子，其实例是CMV启动子、SV40早期启动子、RSV启动子、EF-1α启动子、如所描述的在tet-on或tet-off系统中含tet反应元件(TRE)的启动子(ClonTech和BASF)、β肌动蛋白启动子和可以通过添加某些金属盐而上调的金属硫因启动子。大量适合的载体和启动子为本领域专业技术人员已知，可以从商业上获得并被描述于Sambrook，等人，(见上)。

用于这种表达载体的可选择标记物通常是本领域已知的，准确可选择标记物的选择依赖于宿主细胞。可选择标记物基因的实例编码的蛋白使细胞对抗生素或其它毒素具有抗性，包括氨比西林、氨甲喋呤、四环素、新霉素(Southern和Berg，J.，1982)、霉酚酸(Mulligan和Berg，1980)、嘌呤霉素、zeomycin或潮霉素(Sugden等人，，1985)。

细胞用标准的方法被转染，包括电穿孔、磷酸钙、DEAE葡聚糖、Iipofection或Lipofectamine处理，并在适合的抗生素中被选择。采用重组DNA技术克隆和表达修饰形式天然蛋白的方法通常是本领域已知的，如Ausubel，等人，1992和Sambrook，等人，1989所描述的，在此特别地合并为参考文献。

B. 核酸编码的序列

按照本发明，编码特定细胞因子调节因子(CRF)或抗凋亡蛋白(包括与凋亡相关的修饰形式的蛋白)的多核苷酸序列包括剪接变异体、片段、融合蛋白、修饰形式的蛋白或其功能相等物，在此合称为＂CRF-或抗凋亡蛋白-编码核酸序列＂。

由于遗传密码固有的简并性，编码实际上相同或功能上相等的氨基酸序列的其它核酸序列也可以用于克隆和表达CRT-或抗凋亡蛋白-编码核酸序列。因此，对于特定的CRF-或抗凋亡蛋白-编码核酸序列，应当理解作为遗传密码简并性的结果，可以产生编码相同氨基酸序列的多个编码序列。例如，三联CGT编码精氨酸。精氨酸可选择地由CGA、CGC、CGG、AGA和AGG编码。因此应当理解，这种编码区的取代在本发明涵盖的序列变异体范围内。任何和所有这些序列变异体可以按这里描述的相同的方法应用于天然形式CRF-或抗凋亡蛋白的编码核酸序列。

＂变异体＂CRF-或抗凋亡蛋白-编码核酸序列可以编码＂变异体＂CRF-或抗凋亡氨基酸序列，它改变了天然多肽序列的一种或多种氨基酸，它们都包括在本发明的范围内。相似地，术语“修饰形式的”，相对于CRF-或抗凋亡蛋白，是指衍生的或变异体形式的天然CRF-或抗凋亡蛋白-编码核酸序列或天然CRF-或抗凋亡氨基酸序列。典型地，“修饰形式的”天然CRF-或抗凋亡蛋白或蛋白的编码序列，分别具有至少一个氨基酸或核酸取代、缺失或插入的衍生序列。

相似地，用于实践本发明的多核苷酸包括，编码天然CRF-或抗凋亡蛋白及其剪接变异体的序列，与蛋白编码序列互补的序列，和CRF-或抗凋亡蛋白新片段的编码多核苷酸。多核苷酸可以是RNA形式或DNA形式，包括信使RNA、合成的RNA和DNA、cDNA和基因组DNA。DNA可以是双链的或单链的，如果是单链则可以是编码链或非编码(反义、互补)链。

如本领域专业技术人员会理解的，在某些情况下产生具有非天然存在密码子的核苷酸序列可以是有利的。可以选择特定真核细胞宿主优选的密码子(Murray，E.等人，1989)，例如，为了增加CRF-或抗凋亡蛋白表达的速率，或为了产生具有所需特性重组RNA转录体，如较天然存在序列产生的转录体更长的半衰期。

因各种原因，天然CRF-或抗凋亡蛋白-编码核苷酸序列可以被改造以改变编码序列，包括但不限于，修饰克隆，处理和/或细胞表达CRF-或抗凋亡蛋白而发生的改变。

1. 细胞因子调节因子和抗凋亡蛋白

在一个方法中，用于实践本发明的异源核酸构建物或表达载体包括需要活性形式的蛋白的编码序列或凋亡蛋白的编码序列，前者如细胞因子调节因子(CRF)的编码序列，这里以PKR为例，后者在此以CrmA，Bcl-2或Bcl-X_L为例。

在本发明的一个通用实施方案中，CRF或抗凋亡蛋白-编码核酸序列与GenBank中发现的天然编码序列具有至少70％，优选地80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性。例如用于表达人PKR的编码序列与GenBank登记号第M35663中发现的序列具有至少70％，优选地80％，85％，90％或95％或以上的序列同一性。

就细胞因子调节因子或抗凋亡蛋白-编码核酸序列来说，取代、插入或删除可发生在序列中的任何残基上，只要编码的氨基酸序列保持天然细胞因子调节因子或抗凋亡蛋白的生物学活性。

B. 细胞系的选择

若干能够产生一种或多种细胞因子或目的蛋白的已知细胞型的任何一种可以用在本发明的方法中。在本发明实践中，选择的细胞系以表达细胞因子调节因子和/或抗凋亡蛋白-编码核酸序列的方式被修饰。能够产生细胞因子或其它蛋白的哺乳动物细胞系可以通过本领域已知的许多方法获得，包括原代细胞系的分离或从商业来源获得已经建立的细胞系。

因此，本发明提供的细胞系含已接受一种或多种选择、修饰、引发和诱导的细胞，相对于相应的亲代细胞系有效地引起细胞因子产生或表达的增加。

适合用于实践本发明的细胞系实例包括但不限于，成纤维细胞或免疫细胞，B细胞(如，Namalwa，293，Raji)，单核的细胞(如，U937，THP-1)，T细胞；嗜中性粒细胞，自然杀伤细胞，MRC-5细胞，WI-38细胞，Flow 1000细胞，Flow 4000细胞，FS-4，FS-7细胞，MG-63细胞，CCRF-SB细胞，CCRF-CEM，Jurkat细胞，WIL2细胞和T98G细胞。

对于实践本发明，人细胞是优选的。在本发明的一个应用实例中，人细胞系如Namalwa以有效抑制凋亡的方式被修饰，并进一步以有效引起细胞因子或其它蛋白产生增加的方式被修饰、引发和/或处理。可选择地，细胞以有效抑制凋亡的方式被修饰并通过有限稀释亚克隆以获得表达细胞因子调节因子的亚克隆而选择细胞因子调节因子的表达，然后以有效引起细胞因子或其它蛋白产生增加的方式引发和/或处理亚克隆。可被用于实践本发明的适合原代细胞型的实例包括但不限于，单核细胞/巨噬细胞系的细胞，淋巴细胞系细胞包括T-和B-细胞，肥大细胞，成纤维细胞，骨髓细胞，角化细胞，造骨细胞起源的细胞，黑素细胞，内皮细胞，血小板，各种其它免疫系统细胞，肺上皮细胞，胰腺实质细胞，神经胶质细胞和来自这些细胞类型的肿瘤细胞。修饰的、引发的和/或诱导的细胞在培养亲代细胞系所用的条件下被培养。

通常，细胞在含生理盐和营养素的标准培养基中培养，如标准的RPMI，MEM，IMEM或DMEM，典型地补充有5-10％血清，如胎牛血清。培养条件也是标准的，如，培养物孵育在37℃固定或滚动培养直至获得所需的细胞因子表达或产生水平。在有效促进细胞因子回收的条件下培养细胞包括但不限于，在血清和/或无蛋白培养或无血清培养基中培养。

优选的特定细胞系的培养条件可在科学文献中和/或从细胞系提供者如American Type Culture Collection(ATCC；＂http：//www.atcc.org/＂)发现。原代细胞系，如成纤维细胞、B-细胞、T-细胞、内皮细胞、树状细胞和单核细胞，的优选培养条件通常可在科学文献中获得，。

在本发明的进一步应用中，经处理而抑制了凋亡的细胞包括通常用于表达特定重组细胞因子或目的蛋白的细胞系，其中细胞因子或目的蛋白的表达与细胞因子调节因子如PKR无关，如CHO(中国仓鼠卵巢)细胞。

VIII. 细胞因子

细胞因子通过与其同源的受体结合发挥其生物学活性，随后通过信号转导导致刺激多种生物化学过程。在某些情况下，这种受体的表达被特异的信号所调节，如细胞因子可能涉及正或负反馈环，从而调节相同或不同细胞因子的受体的表达。这种受体可以是产生细胞因子的同类型细胞的或不同类型细胞的。

细胞因子是用来介导和调节免疫和炎症反应的。通常，细胞因子的产生是短暂的并发生在引起mRNA转录体产生的转录的短时间内，mRNA转录体也是短暂存在的并受制于转录后控制机制。最近的研究表明，各种细胞因子使用共同的信号转导通路，＂Jak/STAT＂通路(Abbas，等人，1997)。

应当理解，细胞因子的细胞来源是每个独立细胞因子的不同特性，它可能由多种不同类型的细胞产生。此外，特定的细胞因子(1)可能对超过一个细胞类型起作用，(2)对同一个细胞可能具有超过一个的作用，(3)可具有与其它细胞因子共同的活性，和(4)可影响其它细胞因子的合成或作用，如通过拮抗或协同其作用。

产生的细胞因子可以是以下的一种或多种：干扰素类包括IFN-γ、IFN-α和IFN-β；肿瘤坏死因子(TNF)包括TNF-α、TNF-β和TNF可溶性受体(sTNF-R)；白介素(IL)包括IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-11和IL-12；集落刺激因子包括粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；血管来源的因子类包括成纤维细胞生长因子(FGF)、血管内皮生长因子(VEGF)；血小板衍生生长因子1和2(PDGF1和2)；趋化因子包括调节的正常活化T-表达分泌的(RANTES)；巨噬细胞炎症蛋白类(MIP)如MIP-1α和MIP-2α；单核细胞趋化蛋白-1(MCP)；抗血管发生因子包括血管抑素；内皮抑素；白血病抑制因子(LIF)；睫状神经营养因子；心脏营养素和制瘤素包括制瘤素M。

本发明的方法还可用于增加能够在细胞培养中产生的许多蛋白中任一种的表达。蛋白的实例包括但不限于，胰岛素、促红细胞生成素(EPO)、组织血浆酶原激活剂(TPA)、生长激素和因子VIII。

细胞因子组的一个实例，干扰素类(IFNs)对病毒感染或肿瘤细胞生长起反应而产生。这些糖蛋白类在其抗病毒作用以外还具有抗肿瘤和免疫调节活性。自从1994年，IFNs在美国获得了FDA批准用于特定的临床适应症。最近，两个IFN-β制剂，一个在大肠杆菌中产生另一个在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生，已获准用于多发硬化患者。CHO细胞产生的产品已显示除引起不需要的作用如大多数患者注射部位组织坏死外，可引起抗IFN抗体，并形成干扰素免疫复合物。另外的缺陷归因于细菌产生的IFNs，包括引起抗体和IFN-α在各种疾病中的作用受限，它可能部分地是由于在重组制剂中缺少所有的亚型。以前的研究已显示，由抗体形成反映出的排斥发生率在细菌产生的IFN可以高达20-38％，相比天然IFN-α仅有1.2％(Antonelli，等人，1991；Antonelli，等人，1997)。

本发明意图提供改进的产生细胞因子组合物的细胞系，它没有不需要的副作用，如给患者用药时引起免疫反应，或由于不适当的糖基化或在重组制剂中缺少天然亚型的完全补充而限制了效果。

这里描述的方法有效地引起细胞因子产生的增加。在本发明一个优选的方面，细胞系修饰、培养条件、引发和诱导的一种或多种联合引起细胞因子产生的显著增加，如，相对于没有修饰、处理、引发或诱导细胞的相同细胞系，在相同的培养条件下所具有的细胞因子产生或表达水平，表现为增加至少200％(2倍或2×)、250％(2.5倍或2.5×)、300％(3倍或3×)、400％(4倍或4×)、500％(5倍或5×)，优选地1000％(10倍或10×)或以上，如在此所描述的。在某些情况下，本发明的方法引起细胞因子的产生增加100倍(100×)至1000倍(1000×)或以上。

IX. 细胞因子或其它蛋白产生、分离和细胞因子纯化的评价

A. 细胞因子或其它蛋白产生的评价

为了评价已经接受一种或多种的修饰、引发和/或诱导的细胞系对细胞因子或其它目的蛋白的表达，可以在蛋白水平、RNA水平或通过对要表达的单独细胞因子或其它蛋白使用特殊的功能性生物检验进行检测。

作为实例，特定细胞因子的产生和/或表达可以在样本中直接检测，例如，通过检测细胞因子的活性、表达和/或产生。检测包括定量mRNA转录的Northern印迹，点印迹(DNA或RNA分析)，RT-PCR(逆转录酶聚合酶链式反应)，或采用适当标记探针(根据细胞因子的编码核酸序列)的原位杂交和常规的Southern印迹。

可选择地，蛋白的表达可以通过免疫学方法评价，如细胞、组织切片的免疫组化染色或组织培养基的免疫检测，如通过Western印迹或ELISA。这种免疫检测可被用来定性和定量地评价细胞因子或其它蛋白的表达。这些方法的细节为本领域专业技术人员已知，且进行这些方法的许多试剂可以从商业上获得。

细胞因子或其它蛋白的纯化形式典型地被用来产生对表达蛋白特异的单克隆或多克隆抗体，以用于各种免疫检测(见如，Harlow等人，1988)。检测的实例包括ELISA、竞争性免疫检测、放射免疫检测、Western印迹、间接免疫荧光检测等。通常，商业上获得的抗体和/或试剂盒可用于定量的免疫检测已知细胞因子或其它蛋白的表达水平，如实施例1中干扰素-β分析和实施例4中干扰素-α分析所举例说明的。

B. 细胞因子的分离和纯化

通常，在细胞培养中产生的细胞因子被分泌到培养基中，并可以被纯化或分离，如通过从细胞培养基中去除不需要的成分。典型地，细胞因子被分馏以隔离具有所选择特性的细胞因子如，与特殊结合剂如抗体或受体结合的亲合性；或具有选择的分子量范围，或等电点范围。

一旦获得增加产生的特定细胞因子或其它蛋白，就从细胞培养中纯化由此产生的细胞因子或其它蛋白。适合这种纯化的方法实例包括如下：抗体亲合性柱层析、离子交换层析；乙醇沉淀；反相HPLC；在二氧化硅或阳离子交换树脂如DEAE上的层析；色谱焦聚；SDS-PAGE；硫酸铵沉淀；和采用如Sephadex G-75的凝胶过滤。可以使用蛋白纯化的各种方法，这些方法为本领域已知并被描述于如Deutscher，1990；Scopes，1982.纯化步骤的选择将依赖于如，所用的生产过程的性质和产生的特定细胞因子或蛋白。

上面描述了特殊的实施例，但是，本领域的普通专业技术人员应当明白许多修饰是可以接受的，实施例仅为说明的目的而提供，并不限制本发明，除非这样指定。

在本说明中引用的所有专利和参考文献均在此引入以供参考。

                          实施例1

转基因CrmA-表达细胞系的制备和鉴定

A. 转基因CrmA-表达细胞系的制备

根据Huang等人，1997描述的载体基础上，通过将CrmA的编码序列在框架内插入Mizushima和Negata(NAR 18，5322.1990)描述的pEF Bos载体中，而构建pEF FLAG-crmA-puro表达载体。pEFFLAG-crmA-puro含有在强延伸因子1α(EF-1α)启动子控制下的编码抗凋亡CrmA蛋白的全长cDNA(GenBank登记号第M 14217；牛痘病毒白痘变异体(CPV-W2)(CrmA)基因，完整的编码序列)，和在pGK启动子控制下的嘌呤霉素抗性基因。另外一个注意的特征是，N-末端FLAG抗原决定簇(Hopp等人，1988)的编码序列被加入CrmA核酸序列中以帮助检测表达CrmA的细胞系。

载体还包括(i)多腺苷信号和转录终止序列以加强mRNA的稳定性；(ii)游离基因复制和简单载体挽救的SV40启始点；(iii)在大肠杆菌中选择和维持的氨比西林抗性基因和ColEl启始点；和(iv)嘌呤霉素抗性标记物(Puro)，使得用pEF FLAG-crmA-puro转染后可以选择和鉴定含质粒的真核细胞。

转染前一天，MG-63细胞以每孔5×10⁴被接种在6孔板中。在100μl无血清、蛋白或抗生素的Opti-MEM培养基中悬浮2μg pEFFLAG-crmA-puro质粒DNA。Lipofectamine试剂(Gibco，10μl)用无血清Opti-MEM培养基稀释至100μl。接着轻轻混合两个溶液，混合物在室温孵育45min以形成DNA-脂质体复合物。处理MG-63细胞前即刻，600μl无血清Opti-MEM培养基被加入到含DNA-脂质体混合物的反应试管中以获得最终的转染溶液。细胞用PBS冲洗，随后添加最终DNA-脂质体混合物并在37℃孵育4小时。然后添加1ml MEM-5％FBS，再孵育16hrs。轻轻抽吸以移出培养上清，并加入新鲜的细胞生长培养基(加有5％FBS的MEM)。孵育48hr后，添加含选择标记物、geneticin(G418，500μg/ml)的新鲜培养基(MEM 5％FBS)，以用本领域已知的标准方法选择稳定的转染体。总之，通过用500μg/ml G418(Gibco-BRL)选择3-4周，获得一批稳定的转化体。

B. 转基因CrmA-表达细胞系的鉴定

1. 增加的细胞活力

采用以下步骤，通过仙台病毒(SV)诱导和超诱导(SI；Inoue I等人，1991)，野生型(WT)和CrmA-表达(CrmA-#2)的MG-63细胞被处理。

细胞以每孔2.5×10⁴细胞的细胞密度被接种在24孔板上，随后在37℃用5％CO₂浓度孵育。孵育后，细胞用IFN-β(100IU/ml)引发24hr。然后，在每孔200μl添加2％胎牛血清(FBS)的MEM培养基中，通过添加1000血细胞凝集素单位的SV诱导细胞，孵育1小时，接着添加300μl含polyI：C(100μg/ml)和放线菌酮(5μg/ml)的新鲜培养基，另外孵育5hrs。在最后1小时内添加放线菌素D至4μg/ml的终浓度。诱导过程后，经处理的细胞用PBS被冲洗3次以去除所有的诱导剂，并在含2％FBS的新鲜MEM中重悬浮。

野生型(WT)和不被仙台病毒(SV)±或超诱导(SI)处理的CrmA-表达(CrmA-#2)MG-63细胞被用作对照(UT)。每型细胞的活力用标准的亚丙基FACS试验测定。如图1所显示的，CrmA的表达抑制了SV/SI-诱导的细胞死亡，通过SV诱导和SI处理后20h CrmA-表达细胞的活力高达80％而显示。相反，与相同条件接触的野生型MG-63细胞仅有20％存活。

2. 细胞因子的产生增加

孵育细胞20hrs，然后从每个孔中收集培养基并通过ELISA检测干扰素-β(IFN-β)的产生。IFN-β的ELISA按供应商所描述的方法进行(人干扰素-βELISA试剂盒；由TFB，Inc.分装，由FUJIREBIO，Inc.，Tokyo，Japan生产)。如图2所示，同MG-63野生型对应者相比，CrmA#2 MG-63细胞产生显著增多的IFN-β。

表达CrmA(CrmA-#2)的MG-63细胞在培养基中接受超诱导(SI)处理，培养基含0.2mM，4mM和8mM的核苷类似物2-氨基嘌呤(2-AP)，是已知的PKR抑制剂。

引发前日，在37 5％CO₂浓度下，通过在24孔板上以每孔2.5×10⁴的密度接种细胞，对细胞进行SI(超诱导)处理。孵育后，细胞用IFN-β(100IU/ml)引发24hr，然后，添加500μl含polyI：C(100μg/ml)和放线菌酮(5μg/ml)的新鲜培养基，另外孵育5hrs，在最后1小时内添加放线菌素D至4μg/ml的终浓度。诱导过程后，经处理的细胞用PBS被冲洗3次以去除所有的诱导剂，并在含2％FBS的新鲜MEM中重悬浮。

如图3所示，2-AP以剂量依赖的方式抑制IFN-β的产生，证实PKR在调节IFN-β表达中发挥作用。

3. 通过Western印迹分析Flag-CrmA蛋白的表达

亲代野生型细胞系(MG-63-WT)的细胞和如上所述制备的CrmA转化体(MG-63-CrmA-#2)在100mm培养皿中培养至100％融合。细胞在冷的磷酸缓冲盐水(PBS)中被冲洗并用细胞刮刀收集在1.5ml微量离心管中。进一步用PBS冲洗后，细胞在溶解缓冲液(10mM Tris-HCL[pH 7.5]，1％Triton X-100，0.25％SDS，50mM KCL，1mM二硫苏糖醇，2mM MgCl₂和1×蛋白抑制剂鸡尾酒[Roche])中冰上孵育10min，然后以10,000g离心10min。溶解物上清被转移到新的微量离心管中，用BRL试剂盒按照厂商提供的规程检测蛋白浓度。

含100μg蛋白的细胞溶解物被置于4-12％的NuPAGE Bis-TrisMOPS凝胶上接受电泳分离，其后凝胶被点样在PVDF膜上。此膜进一步在5％牛乳-PBS中印迹过夜并与1∶500稀释的大鼠抗-Flag一抗接触1小时，一抗由Dr.A Strasser(Royal Melbourne Hospital，Victoria，Australia)惠赠。印迹膜用PBS-0.1％Tween-20冲洗3次，与抗大鼠HRP结合二抗(1∶2000)一起孵育1小时。用ECL检测试剂(Amersham)检查出现的Flag-CrmA蛋白。

每个用CrmA表达质粒转染的细胞样本显示了高水平的Flag-CrmA表达，相反，亲代野生型对照细胞(MG63-WT)显示没有表达。

                      实施例2

PKR过度表达及表达PKR和抗凋亡蛋白的Namalwa细胞系

A. 制备pEF-FLAG-Bcl-XL

pEF-FLAG-Bcl-X_L载体(Huang，等人，1997)含编码抗凋亡Bcl-X_L蛋白的全长cDNA，可操作地连接在强延伸因子1α(EF-1α)启动子上。该载体另外的显著特征是N-末端的FLAG抗原决定簇(Hopp等人，1988)，它加在Bcl-X_L蛋白上以促成选择表达高水平Bcl-X_L的细胞系。

该载体还包括i)多腺苷信号和转录终止序列以增强mRNA的稳定性；ii)游离基因复制和简单载体挽救的SV40启始点；(iii)在大肠杆菌中选择和维持的氨比西林抗性基因和ColEl启始点；和(iv)嘌呤霉素抗性标记物(Puro)，使得用Bcl-X_L和PKR转染后可以选择和鉴定含质粒的真核细胞。

B. 制备pcDNA-FLAG-PKR

pcDNA-FLAG-PKR载体含编码全长人PKR分子(551个氨基酸；Meurs，等人，1990；GenBank登记号第NM002759)的cDNA，通过聚合酶链式反应修饰以包含编码MDYKDDDDK序列的N末端FLAG尾(Hopp等人，1988)，并被插入真核细胞表达载体pcDNA3(Invitrogen)中，使得FLAG-PKR编码序列在CMV启动子的控制下表达。

称为pcDNA-FLAG-PKR的载体含各种适合于PKR转录的特征，包括：i)来自人CMV即刻早期基因的启动子序列，以高水平表达mRNA；ii)来自牛生长激素(BGH)基因的多腺苷信号和转录终止序列，以增强mRNA稳定性；iii)游离基因复制和简单载体挽救的SV40启始点；iv)在大肠杆菌中选择和维持的氨比西林抗性基因和ColEl启始点；和v)G418抗性标记物(Neo)，使得转染后可以选择和鉴定含质粒的真核细胞。

第二个PKR载体叫做pTRE-PKR，通过将相同的PKR cDNA插入从Clontech获得的pTRE质粒的限制性/插入位点中而制备。pTRE质粒与制备第一个描述的PKR载体中所用的pFLAG相似，但在用于控制插入基因的CMV启动子上游含有四环素-反应元件。在实施例4中报道的研究中，TRE功能没有发挥，因此两个PKR载体在转化细胞中的作用预期基本上是一样的。

C. 制备6A细胞系

人B淋巴母细胞系Namalwa(WT)顺序用质粒pEF-FLAG-Bcl-X_L和pcDNA-FLAG-PKR转染。采用基因脉冲发生仪(Biorad)，用15μgpEF-FLAG-Bcl-X_L质粒在DMEM/F12(+10％FBS)中，通过对4×10⁶指数生长的Namalwa细胞进行800μF 300V的电穿孔作用获得了稳定的转染体。通过用2μg/ml的嘌呤霉素(Gibco-BRL)选择3-4周，并用流式细胞计数仪筛选Bcl-X_L的表达获得了稳定转化体的一批集落，如下所述。转染体群被冲洗，用丙酮增加通透性，随后用2μg/ml的小鼠抗FLAG M2单克隆抗体(IBI)、然后用藻红蛋白结合的山羊抗小鼠IgG(1μg/ml；Becton-Dickinson)染色。用FACScan分析细胞，根据其前向和侧向散射特性及Bcl-X_L表达细胞的荧光密度水平来区分活细胞和死细胞。然后用pcDNA-FLAG-PKR转染高水平表达Bcl-X_L的转化体(Namalwa-Bcl-X_L)。

采用基因脉冲发生仪(Biorad)，用15μg pcDNA-FLAG-PKR质粒在DMEM/F12(+10％FBS)中，通过对4×10⁶指数生长的Namalwa-Bcl-X_L细胞进行800μF 300V的电穿孔作用获得了稳定的高水平表达Bcl-X_L的转染体。通过用2μg/ml的geneticin(G418，Gibco-BRL)选择3-4周获得了稳定转化体的一批集落。随后通过有限稀释克隆获得克隆系，并通过Western印迹(Huang等人，1997)分析Bcl-X_L和PKR的表达。用2μg/ml抗FLAG M2抗体后接山羊抗小鼠过氧化物酶结合体，以及ECL检测(Amersham)鉴定蛋白。举例的Bcl-X_L和PKR阳性细胞系叫做6A。

D. 制备A9细胞系

采用基因脉冲发生仪(Biorad)，用15μg pTRE-PKR质粒在DMEM/F12(+10％FBS)中，通过对4×10⁶指数生长的Namalwa-Bcl-X_L细胞进行800μF 300V的电穿孔作用获得了稳定的高水平表达PKR的转染体。通过用2μg/ml的geneticin(G418，Gibco-BRL)选择3-4周获得了稳定转化体的一批集落。随后通过有限稀释克隆获得克隆系，并通过Western印迹(Huang等人，1997)分析PKR的表达。

实施例3  鉴定表达Bcl-XL和PKR的转基因Namalwa 细胞系

1. 增加的细胞活力

在过度表达PKR和诱导细胞因子的条件下，检测野生型Namalwa细胞(WT)和来自实施例3的A9和6A细胞在细胞培养中的细胞活力。特别地，PKR和Bcl-Xi双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)、PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)和亲代Namalwa细胞(WT)以2.5×10⁵细胞/ml在添加有10％FBS的DMEM/F12培养基中培养。细胞用20mMPMA(引发剂)处理20hr，随后用200μg/ml poly r(I)：poly r(C)和10μg/ml DEAE葡聚糖(poly IC诱导)处理72hr，或200HAU/I×10⁶仙台病毒细胞处理48hr。处理后，在FACScan上通过流式细胞仪检测细胞活力。

图4A显示，仙台病毒诱导后，细胞活力与PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)和亲代Namalwa细胞(WT)相似，PKR和Bcl-X_L双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)观察到有较大的活力。

图4B显示，poly IC诱导后，细胞活力与PKR和Bcl-X_L双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)和亲代Namalwa细胞(WT)相似，PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)观察到有较低的活力。

2. 增加的干扰素-α表达

在PKR过度产生的条件下，poly IC和仙台病毒诱导细胞因子后，IFN-α产生的水平也在三个细胞系中进行了分析。收集培养上清，按照ELISA试剂盒(R&D Systems)供应者提供的步骤通过ELISA分析IFN-α的水平。

在图5A中显示的结果表明，仙台病毒诱导后，由PKR和Bcl-X_L双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)产生的IFN-α表达，明显超过PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)和亲代Namalwa细胞(WT)产生的IFN-α。

在图5B中显示的结果表明，poly IC诱导后，PKR转染的Namalwa细胞(A9细胞系)及PKR和Bcl-X_L双转染的Namalwa细胞(6A细胞系)产生的IFN-α表达，明显超过亲代Namalwa细胞(WT)产生的IFN-α。

从前面可以看到，本发明的各种目的和特征是如何实现的。本领域的专业技术人员可以从前面的描述中理解，本发明的广泛教导可以多种方式被实现。因此，虽然本发明与特殊实施方案及其实施例一起被描述，但发明的真正范围不应如此被限制。在不背离本发明范围下可进行各种改变和修饰，如附加权利要求书所定义的那样。

Claims (40)

1.一种用来产生一种或多种细胞因子的人类细胞系，包括：

特征为表达一种抗凋亡蛋白的编码序列的人类细胞系，其细胞因子产量的水平是不表达抗凋亡蛋白编码序列的相应亲代细胞系所具有的细胞因子产量水平的至少两倍(2×)。

2.根据权利要求1所述的细胞系，其中所述的抗凋亡蛋白是CrmA。

3.一种用来产生一种或多种细胞因子的人类细胞系，通过以下的步骤制备：

获取一个能够产生一种或多种细胞因子的亲代人类细胞系；

通过将第一个表达载体引入所述细胞系的细胞而修饰细胞，该载体包含(i)可操作地连接于第一个启动子的CrmA编码序列，和(ii)在人类细胞中表达所必须的其他调控元件；和

筛选和选择表达CrmA的细胞。

4.根据权利要求3所述的人类细胞，其中所述的方法进一步包括：

以有效导致细胞因子产量增加的方式处理所述的表达CrmA的细胞，其中所述的转化和处理的细胞系特征是，细胞因子产量水平是相应的非转化亲代细胞系细胞因子产量水平的至少两倍(2×)。

5.根据权利要求3所述的人类细胞系，其中所述的方法进一步包括：

通过将第二个表达载体引入至所述细胞系的细胞中而修饰所述的细胞，该载体包含(i)可操作地连接于第二个启动子的PKR编码序列；和(ii)在人类细胞中表达所必须的其他调控元件，其中所述的第一个所述表达载体引入所述细胞是在所述第二个表达载体引入所述细胞之前或同时或之后，和

筛选和选择过度表达PKR的细胞。

6.根据权利要求5所述的人类细胞系，其中所述的方法进一步包括：

以有效导致细胞因子产量增加的方式处理所述人类细胞系的所述修饰细胞，其中所述的转化和处理的细胞系特征是，细胞因子产量水平是相应的非转化亲代细胞系的细胞因子产量水平的至少两倍(2×)。

7.根据权利要求6所述的人类细胞系，其中所述的处理方法是指对所述的转化细胞进行引发和诱导之一或两者都进行。

8.根据权利要求7所述的人类细胞系，其中所述的引发是指将所述的转化细胞与醋酸佛波豆蔻酯(PMA)或β-干扰素接触。

9.根据权利要求7所述的人类细胞系，其中所述的诱导是指将所述的转化细胞与微生物诱导剂接触，该诱导剂选自仙台病毒、脑心肌炎病毒和单纯疱疹病毒。

10.根据权利要求9所述的人类细胞系，其中所述的微生物诱导剂是仙台病毒。

11.根据权利要求7所述的人类细胞系，其中所述的诱导是指将所述细胞与至少一种非微生物诱导剂接触，该诱导剂选自poly(I)：poly(C)(poly IC)或poly r(I)：poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、放线菌酮、放线菌素D、丁酸钠、钙离子载体和硫酸软骨素。

12.根据权利要求11所述的人类细胞系，其中所述的非微生物诱导剂是polyI：C，放线菌酮和放线菌素D。

13.根据权利要求4所述的人类细胞系，其中所述的处理是指对所述的转化细胞进行引发和诱导之一或两者都进行。

14.根据权利要求13所述的人类细胞系，其中所述的引发是指将所述的转化细胞与醋酸佛波豆蔻酯(PMA)或β-干扰素接触。

15.根据权利要求13所述的人类细胞系，其中所述的诱导是指将所述转化细胞与微生物诱导剂接触，该诱导剂选自仙台病毒、脑心肌炎病毒和单纯疱疹病毒。

16.根据权利要求15所述的人类细胞系，其中所述的微生物诱导剂是仙台病毒。

17.根据权利要求13所述的人类细胞系，其中所述的诱导是指将所述的细胞与至少一种非微生物诱导剂接触，该诱导剂选自poly(I)：poly(C)(poly IC)或poly r(I)：poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、放线菌酮、放线菌素D、丁酸钠、钙离子载体和硫酸软骨素。

18.根据权利要求17所述的人类细胞系，其中所述的非微生物诱导剂是polyI：C，放线菌酮和放线菌素D。

19.根据权利要求3所述的人类细胞系，其中所述的亲代人类细胞系也能够表达PKR，其中所述的方法进一步包括筛选和选择PKR活性、表达和/或产量至少增加两倍(2×)的PKR过度表达细胞。

20.根据权利要求19所述的人类细胞系，其中所述的方法进一步包括：

以有效导致细胞因子产量增加的方式处理所述细胞系的所述表达CrmA和过度表达PKR的细胞，其中所述转化和处理的细胞系的特征是，细胞因子产量的水平是相应的非转化亲代细胞系细胞因子产量水平的至少两倍(2×)。

21.根据权利要求20所述的人类细胞系，其中所述的处理是指对所述的转化细胞进行引发和诱导之一或两者都进行。

22.根据权利要求21所述的人类细胞系，其中所述的引发是指将所述的转化细胞与醋酸佛波豆蔻酯(PMA)或β-干扰素接触。

23.根据权利要求21所述的人类细胞系，其中所述的诱导是指将所述的转化细胞与微生物诱导剂接触，该诱导剂选自仙台病毒、脑心肌炎病毒和单纯疱疹病毒。

24.根据权利要求23所述的人类细胞系，其中所述的微生物诱导剂是仙台病毒。

25.根据权利要求21所述的人类细胞系，其中所述的诱导是指将所述的细胞与至少一种非微生物诱导剂接触，该诱导剂选自poly(I)：poly(C)(poly IC)或poly r(I)：poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、放线菌酮、放线菌素D、丁酸钠、钙离子载体和硫酸软骨素。

26.根据权利要求25所述的人类细胞系，其中所述的诱导是指将所述细胞与poly I：C、放线菌酮和放线菌素D接触。

27.根据权利要求3所述的人类细胞系，其中所述的第一个表达载体进一步含有第一个选择性标记物的编码核酸序列，所述CrmA表达细胞的筛选和选择是指在含有选择CrmA表达细胞的第一个选择剂的培养基中培养所述的修饰细胞。

28.根据权利要求5所述的人类细胞系，其中所述的第二个表达载体进一步含有第二个选择性标记物的编码核酸序列，其中所述过度表达PKR细胞的筛选和选择是指在含有第二个选择剂的培养基中培养所述的修饰细胞，该选择剂对所述第二个选择性标记物是特异的，以选择过度表达PKR的细胞。

29.在人类细胞系中产生一种或多种细胞因子的改良方法中，其改良意图通过将亲代人类细胞系在下列一种或多种条件下进行培养来增加细胞活力和细胞因子的产量：(i)修饰以有效导致抗凋亡蛋白的表达；(ii)修饰以有效导致细胞因子调节因子的过度表达；(iii)引发；和(iv)诱导，其中细胞因子的产量是相应的未转化亲代细胞系产量水平的至少两倍(2×)。

30.根据权利要求29所述的方法，其中所述的修饰以有效导致抗凋亡蛋白表达是指，将第一个表达载体引入所述细胞系的细胞中，该载体包含(i)可操作地连接于第一个启动子的CrmA编码序列，(ii)在人类细胞中表达CrmA所必须的其他控制元件；并筛选和选择表达CrmA的细胞。

31.根据权利要求30的方法，其中所述的第一个表达载体进一步包含第一个选择性标记物的编码核酸序列，其中所述的CrmA表达细胞的筛选和选择是指在含有选择CrmA表达细胞的第一个选择剂的培养基中培养所述的修饰细胞。

32.根据权利要求30的方法，其中所述的修饰以有效导致细胞因子调节因子过度表达是指，将第二个表达载体引入所述表达CrmA的细胞系的细胞中，该载体包含(i)可操作地连接于第二个启动子的PKR编码序列；(ii)在人类细胞中表达所必须的其他调控元件，其中所述的第一个所述表达载体引入所述细胞中在所述第二个表达载体引入所述细胞之前、同时或之后；并筛选和选择过度表达PKR的细胞。

33.根据权利要求32所述的方法，其中所述的第二个表达载体进一步包含第二个选择性标记物的编码核酸序列；其中所述PKR过度表达细胞的筛选和选择是指，在含有第二个选择剂的培养基中培养所述的修饰细胞，该选择剂对所述第二个选择性标记物是特异的以选择过度表达PKR的细胞。

34.根据权利要求30所述的方法，其中所述的亲代人类细胞系也能够表达PKR，其中所述的方法进一步包括筛选和选择PKR活性、表达和/或产量至少增加两倍(2×)的PKR过度表达细胞。

35.根据权利要求29所述的方法，其所述的引发是指将细胞与醋酸佛波豆蔻酯(PMA)和β-干扰素之一或两者接触。

36.根据权利要求29所述的方法，其中所述的诱导是指将细胞与微生物诱导剂接触，该诱导剂选自仙台病毒、脑心肌炎病毒和单纯疱疹病毒。

37.根据权利要求36所述的方法，其中所述的微生物诱导剂是仙台病毒。

38.根据权利要求29所述的方法，其中所述的诱导是指将细胞与至少一种非微生物诱导剂接触，该诱导剂选自poly(I)：poly(C)(polyIC)或poly r(I)：poly r(C)(poly rIC)、肝素、硫酸葡聚糖、放线菌酮、放线菌素D、丁酸钠、钙离子载体和硫酸软骨素。

39.根据权利要求38所述的方法，其中所述的非微生物诱导剂是polyI：C、放线菌酮和放线菌素D。

40.根据权利要求29所述的方法，其中所述的一种或多种细胞因子选自α-干扰素(IFN-α)、β-干扰素(IFN-β)、γ-干扰素(IFN-γ)；粒细胞巨噬细胞集落刺激因子(GM-CSF)；粒细胞集落刺激因子(G-CSF)；白介素-2(IL-2)；白介素-3(IL-3)；白介素-7(IL-7)；白介素-8(IL-8)；白介素-10(IL-10)；和白介素-12(IL-12)。

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