CN1259165A - 胞内发炎、细胞死亡和细胞存活通道的调节剂 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种B1蛋白、其同种型、类似物、片段和衍生物以及编码这些蛋白的DNA和重组产物。该蛋白可用来调节细胞内发炎、细胞死亡和/或细胞存活通道。

Description

胞内发炎、细胞死亡和细胞存活通道的调节剂

发明领域

本发明总的涉及由TNF/NGF受体超家族受体及其相关细胞内衔接蛋白质、蛋白酶类(caspase)和激酶介导的细胞内细胞死亡和细胞存活通道的调节剂领域。更具体地说，本发明涉及一种新的蛋白(该蛋白原来称为CBK，但现在命名为B1)，其同种型、类似物、片段和衍生物，它表现出能与属于细胞死亡、细胞存活和发炎通道的各种细胞内蛋白和酶直接或间接相互作用，从而是这些通道的调节剂。

发明背景

肿瘤坏死因子/神经生长因子(TNF/NGF)受体超家族的特征是其成员胞外结构域具有结构同源性(Bazan，1993；Beulter和Van Huffel，1994；Smith等人.，1994)。除了p55 TNF受体和Fas/APO1这两个受体外，该受体家族各成员的胞内结构域的结构没有呈现出明显的相似性。然而这些受体之间在功能上是很相近的，这提示这些受体分享了共同的信号传导通道。这种相似性的一个例子是几种TNF/NGF家族的受体都有激活转录因子NF-κB的能力。这种共同的能力应归功于一种细胞质蛋白，它能激活NF-κB，TNF受体相关因子2(TRAF2)使其与TNF/NGF家族的几个受体中结构不相似的胞内结构域发生结合。目前还不清楚TRAF2的作用机制，也不清楚针对其所结合的不同受体的应答是如何被协调的。

TRAF2是一个最近被描述的称为TRAF的蛋白质家族中的一员，这个家族包括几个已被确认的蛋白质如TRAF1、TRAF2(Rothe，M，Wong，s.c.，Hezen，W.J.和Goeddel，D(1994)Cell 78：681-692；PCT公开出版物WO95/33051)、TRAF3(Cheng G.等人，(1995))和TRAF6(见Cao等人，1996a)。

所有属于TRAF家族的蛋白质其C端结构域氨基酸有高度的相同性，而N端结构域可能没有相互关系。从TRAF2的简示图(图1)显示，此分子在其C端区域含有一个环指基序和两个TFIIIA样的锌指基序。分子的C端一半部分含有被称为“TRAF结构域”的区域，其包含一个在264-358位氨基酸之间延伸的潜在亮氨酸拉链区(称为N-TRAF)，朝向结构域羧基端的另一部分位于359-501位氨基酸之间(称为C-TRAF)，这个部分负责TRAF结合受体以及其他TRAF分子从而形成同源或异源二聚体。

转录因子NF-κB的活化是某些TNF/NGF受体所引发并由TRAF2所介导的信号级联反应的表现形式。NF-κB包括与Rel癌基因同源的、能形成二聚体的蛋白家族成员，当这些蛋白质处于二聚体形式时，能起转录因子的作用。这些因子是普遍存在的，并且参与多种基因的表达调控。尽管NF-κB最初被鉴定为一种在处于Igκ轻链表达阶段的B细胞中的组成型因子，但是已知NF-κB主要作为可诱导的转录激活物起作用。在大多数已知的情况下，NF-κB作为一级因子(primaryfactor)发挥作用，即其活性是通过激活细胞中早已存在的无活性形式的分子来诱导的，而不是通过从头合成(而该合成又依赖于开启NF-κB基因的可诱导转录因子)。NF-κB的效果是非常多效的。这些众多效果中的大多数具有共同的特征，即在对胞外刺激的应答中被迅速诱导。大多数NF-κB激活剂是免疫防御的诱导剂，其中包括病毒和细菌成份、调节免疫应答的细胞因子、紫外线和其它诱导物。因此，大多数受NF-κB调控的基因在免疫防御中都起作用(见Blank等人，1992，Grilli等人，1993.Baeuerle和Henkel，1994，参见综述)。

NF-κB调控作用的一个主要特点是，这个因子能以非DNA结合形式存在于细胞质中，能被诱导而转位到细胞核中，与DNA结合并且激活转录。NF-κB蛋白的这两种形式受到I-κB的调控—I-κB是一类含有结构域重复序列(该结构域最初是在红细胞锚蛋白中被发现)的蛋白质(Gilmore和Morin，1993)。处于未激活形式时，NF-κB二聚体和I-κB分子结合在一起，后者使NF-κB二聚体留在细胞质中并防止其与可结合NF-κB的DNA序列发生相互作用和激活转录。I-κB从NF-κB二聚体上解离下来是其受很多诱导因子活化过程中的关键步骤(Di Donato，等人，1995)。涉及该调节过程机理的知识仍很有限。细胞对不同NF-κB诱导剂应答的特异性方式明确的了解也很少。

肿瘤坏死因子(TNF)是最强的NF-κB诱导剂之一。有两种不同的TNF受体，p55和p75受体(p55-R和p75-R)。它们的表达水平随不同的细胞而单独变化(Vandenabeele等，1995)。p75受体优先对细胞结合形式的TNF反应(TNF表达成β-跨膜蛋白和可溶性蛋白)，而p55受体则只对可溶性TNF分子有效应答(Grell，等人，1995)。这两个受体的胞内结构域结构上无关，并且与不同的细胞质蛋白结合在一起。然而，TNF的至少部分效应，包括TNF的杀细胞作用和NF-κB的诱导作用，都可以受这两个受体的诱导。这个特性是细胞特异性的。p55受体能够在所有对TNF起反应表现出这类效应的细胞中诱导杀细胞作用或激活NF-κB。而p75受体只是在某些细胞中有这些作用。其它细胞尽管p75受体表达水平很高，却只有在对p55受体刺激应答中才能诱导这些作用(Vandenabeele等人，1995)。除了TNF受体之外，TNF/NGF受体家族中的其他多种受体，如CD30(McDonald等人，1995)、CD40(Berberich等人1994；Lalmanach-Girard等人，1993)，淋巴毒素β受体和在某些类型细胞中的FAS/APO1(Rensing-Ehl等人，1995)也能诱导NF-κB的激活作用。尽管事实上IL-1I型受体在结构上与TNF受体没有相似性，IL-1I型受体也能有效地引发NF-κB的激活作用，并且具有TNF受体的大多数功能。

在这些不同的受体被触发时，NF-κB的激活是由于与其结合的I-κB分子发生诱导性磷酸化而引起的。这个磷酸化过程使I-κB被降解，这种降解极可能发生于蛋白酶体。对于引起I-κB磷酸化的激酶的性质以及受体触发时的激活机制仍然未知。然而，在最近两年，人们获得了一些鉴定3种似乎参与磷酸化的受体相关蛋白的知识(见图2a及6的图解说明)。一种最初由D.Goeddel及其同事(Rothe等人，1994)克隆的、被称为TRAF2的蛋白质，好象在由TNF/NGF家族各类受体激活NF-κB的过程中起到中心作用。这个蛋白在高水平表达时本身可以触发NF-κB的激活，结合活化的p75 TNF-受体(Rothe等人1994)、淋巴毒素β受体(Mosialos等人1995)、CD40(Rothe等人，1995a)和CD30(未发表数据)，并通过它们来介导对NF-κB的诱导作用。TRAF2不能和p55 TNF受体结合，也不能和Fas/APO1结合。但是，它能和被称为TRADD的p55受体相关蛋白质相结合，而TRADD能结合于被称为MORT1的Fas/APO1相关蛋白(或FADD，见Boldin等人1995b和1996)。另一种与受体相互作用的蛋白称为RIP(见Stanger，等人1995)，它也能与TRAF2、FAS/APO1、TRADD、p55 TNF受体和MORT1发生相互作用。这样，尽管RIP与细胞毒性诱导(细胞死亡)相关，它与TRAF2相互作用的能力也暗示它与NF-κB激活作用有关，并且此外它也可以在导致NF-κB激活的通道中增加FAS/APO1、MOTR-1、p55 TNF受体和TRADD与TRAF2之间的相互作用。这些关系显然允许p55 TNF受体和Fas/APO1来触发NF-κB的激活(Hsu等人1995，Boldin等人，1995；Chinnaiyan.等人1995，Varfolomeev，等人，1996；Hsu等人1996)。IL-1受体对NF-κB活化的触发与TRAF2无关，这一触发过程可能涉及到一种最近克隆的被称为IRAK的IL-1受体相关蛋白激酶(Croston等人1995)。

TRAF2的作用机制尚不清楚。几种与TRAF2结合的胞质分子已被鉴定(Rothe等人，1994，Rothe等人，1995b)。但是从这些分子所得到的信息并没有提供任何线索来说明本身没有酶活性的TRAF2是通过何种方式来触发I-κB的磷酸化。另外，对于不同受体激活TRAF2的细胞特异性模式(例如两种TNF受体诱导NF-κB时所观察到的模式)机理也没有信息。

除了上述提到的以外，在各种TRAF蛋白中，也应注意到TRAF2可结合p55(CD120a)和p75(CD120b)TNF受体，也能直接或间接地通过其它上述的衔接蛋白(adaptor protein)来结合TNF/NGF受体家族中的其它几种受体，例如对于FAS/APO1受体，衔接蛋白是MOTR-1、TRADD和RIP。因此，TRAF2对于NF-κB的激活过程是关键的(另见Wallach，1996)。然而，TRAF3实际上可抑制TNF/NGF家族中某些受体对NF-κB的活化作用(参见Rothe等人，1995a)，而TRAF6则是在IL-1诱导NF-κB时所必需的(Cao等人，1996a)。

因此，在NF-κB的活化过程及其在维持细胞存活上的重要性方面，参与这一活化过程的各种胞内通道至今仍未弄清，例如，不同的TRAF蛋白是如何直接或间接地参予？

此外，现在已知道TNF/NGF受体家族的不同成员及其相关胞内信号传导通道(包括不同的衔接子、中介体(mediator)/调节蛋白)(例如参见待批的、共同拥有的以色列专利申请No.114615，114986，115319，116588中的简要综述及参考文献)，比如TNF和FAS/APO1的配体对细胞是既有益又有害的。例如，TNF对机体防御肿瘤及感染因子有贡献，同时也能通过诱导杀灭病毒感染的细胞和肿瘤细胞，增加粒细胞的抗细菌活性而使机体从损伤中恢复过来，因此，在这些情况下TNF诱导的细胞杀伤作用是所需的。但是，过量的TNF也是有害的，比如在脓毒休克、厌食症、风湿性疾病、炎症和移植物抗宿主反应等许多疾病中，已知TNF是一个主要的致病因子。在这些情况下，TNF诱导的细胞杀伤作用是不利的。例如，FAS/APO1配体也具有有益和有害的作用。FAS/APO1配体通过其受体在T细胞成熟过程中诱导杀死自身反应T细胞，也就是说，在T细胞发育过程中杀死识别自身抗原的T细胞，以避免自身免疫疾病。此外，很多恶性细胞和HIV感染的细胞在其细胞表面携带FAS/APO1受体，因此就可用其配体或针对受体的抗体来激活这些受体，进而激活该受体介导的细胞死亡(凋亡)胞内通道，从而摧毁这些细胞。但是，FAS/APO1受体也可介导有害的作用，例如在某些疾病如急性肝炎中，发现有不加控制地杀灭组织的现象，从而伴随有肝细胞的损坏。

综上所述，TNF/NGF家族的受体一方面能诱导细胞死亡通道，另一方面也可以诱导细胞存活通道(通过NF-κB诱导)，因此显然在胞内这两种相反的通道之间，存在着精妙的平衡。例如，当需要最大限度地杀伤肿瘤细胞或其它受感染或病态的细胞时，就需要让TNF和/或FAS/APO1配体只诱导细胞死亡通道而不诱导NF-κB。相反，当需要保护细胞(比如在炎症、移植物抗宿主反应、急性肝炎中)时，就希望阻断TNF和/或FAS/APO1配体的杀细胞诱导作用，并且相反增强它们对NF-κB的诱导。与此相同，在某些病理状态下，希望阻断p75 TNF受体和IL-1受体介导的胞内信号传导通道，而在另一些情况下，则希望增强这些胞内通道。

最近，本发明者已经分离出一种称为NIK的激酶(以色列专利申请No.117800，119133和WO97/37016)，该激酶能结合TRAF2，并直接参与导致NF-κB活化的磷酸化反应。

另外，许多研究者(包括本发明者(见待批的共同申请的以色列专利申请No.IL120759))已经分离出与上述衔接蛋白(如MORT-1/FADD)或衔接蛋白与TNF/NGF受体家族各种受体之间的复合物相互作用、并影响导致凋亡性细胞死亡的蛋白水解反应的许多蛋白酶类。因此，在需要抑制或增强细胞死亡的上述情况下，需要直接调节这些蛋白酶类的作用，例如，当希望抑制细胞死亡时，就希望抑制这些蛋白酶类的活性。在这方面，已经报道(参见Hotmann等人，1997年的综述)这些蛋白酶类中有许多存在一个称为前结构域(prodomain)的区域，该区域也存在于许多衔接蛋白如RAIDD(它能与RIP、TRADD相互作用，从而和MORT-1/FADD、p55-TNF-R和FAS/APO1相互作用)(一种细胞死亡通道的衔接蛋白)中；c-IAP1，c-IAP2这两种蛋白似乎是凋亡抑制剂，其本身与TRAF2相互作用，因而，它可能是蛋白酶类的抑制剂或刺激TRAF2参与细胞存活通道导致诱导NF-κB的活化。因此，该前结构域也被称为CARD(即“蛋白酶类募集结构域(capaserecruitment domain”)(见Hofmann等人，1997)。因此，该前结构域(CARD)代表了用来调节与细胞死亡诱导相关的胞内信号传导通道的另一个靶。

另外，最近已经描述(见Ynag和Korsmeyer，1996的综述)了称为BCL2蛋白家族的另一类蛋白家族，其中蛋白BCL2、其同系物BCL-X(包括两种形式，BCL-X_L和另一种方式剪接的BCL-X_S)MCL1、A1、BAK、BAD、BAG1、BAX、腺病毒E1B-19k以及Caenorhabditis elegans(C.elegans)CED-9蛋白均是其成员。在这些蛋白中，已经发现BCL2、BCL-X_L、E1B-19k和CED-9有抑制凋亡或保护免受各种胞内信号传导通道所诱导的凋亡的功能(见Yang和Korsmeyer，1996)。BCL2和BCL-X_L也显然是胞内膜结合蛋白，位于线粒体和光滑内质网以及核周膜，这些蛋白的C末端有一个信号锚序列，该序列起靶向和插入线粒体外膜和上述其它胞内膜的作用。一旦锚着于各种细胞内膜，BCL2和BCL-X_L蛋白就接触胞质液，在那里与其它各种细胞内蛋白相互作用。

关于BCL2、BCL-X_L、E1B-19k和CED9如何保护细胞还不完全清楚，但是好象它们的效应显然在细胞死亡效应物(上述各种蛋白酶类，如ICE/CED-3家族的ICE和ICE样蛋白酶，包括CPP32/Yama，ICE-LAP3(Mch3)，ICH-1和其它蛋白酶)的上游。实际上，发现CED-9是C.elegans死亡效应蛋白酶CED-3和CED-4的特异性抑制剂，BCL2显然是ICH-1(也称为NEDD2)、尤其是促进细胞死亡的ICH-1_L形式的抑制剂。因此，尽管BCL2、BCL-X_L、CED-9和E1B-19k抑制凋亡的确切机制还不清楚，但其显然在死亡效应物ICE-CED-3蛋白酶的上游(参见Yang和Korsmeyer，1996的综述以及Chinnaiyan等人，1996)。

关于上述其它BCL2家族成员，BAX是细胞死亡促进物。BAX与其自身结合，并以BAX均二聚体的形式促进凋亡。BAX还与BCL₂和BCL-X_L结合，这些异二聚体与BCL2抵御凋亡的保护作用有关。因此，BAX/BAX均二聚体数量和BAX/BCL2异二聚体数量之间的平衡确定了细胞是容易凋亡还是会受保护而免于凋亡。BAX在表观上液是一种胞内膜结合蛋白，它很大程度上也位于线粒体外膜上(对于上述关于BAX，另见Yang和Korsmeyer，1996的综述)。另外，上述BAK和BAD蛋白也作为BCL2和BCL-X_L活性的负调节剂起作用，即，它们抑制BCL2和BCL-X_L保护细胞免受凋亡的能力。似乎BAK和BAD均与BCL2和BCL-X_L结合进而防止BAX与BAL2和BCL-X_L结合，从而导致BAX/BAX均二聚体数量增加，因而促进细胞死亡(见Yang和Korsmeyer，1996的综述)。在这方面，看来BAK的功能是直接阻断BCL2和BCL-X_L的死亡抑制活性，因为BAK/BCL2和BAK/BCL-X_L异二聚体缺乏保护细胞免受凋亡的能力。BAD似乎更象是BAX与BCL2和BCL-X_L结合的竞争性抑制剂，因为BAD可能会替换BAX/BCL2和BAX/BCL-X_L异二聚体中的BAX，从而提供了增加量的促进死亡的BAX/BAX均二聚体。尽管BAK也好象是位于线粒体外膜的胞内膜结合蛋白，但是BAD显然没有膜锚着序列，因此它不是膜结合蛋白(见Yang和Korsmeyer，1996的综述)。

上述BCL2家族的另一成员是BAG1(见Yang和Korsmeyer，1996)，它是BCL2活性的正调节剂，它能增强BCL2抵抗凋亡的保护活性，甚至在通常不受BCL2抑制的信号所诱导而经历凋亡的细胞中，它也能提供抵御凋亡的BCL2保护活性。

还应注意，上述另一种剪接形式的BCL-X_L，即BCL-X_S蛋白也是BCL-X_L和BCL2活性的拮抗剂，它阻断了它们抵御凋亡的保护活性(见Yang和Korsmeyer，1996的综述)。

根据上述内容，BCL2蛋白家族在调节胞内细胞死亡或细胞存活通道中有一定作用，且从活跃阻断凋亡的该家族蛋白向促进凋亡或抑制抗凋亡活性的蛋白的平衡移动可能会导致细胞死亡增加，同样，平衡向另一方向移动可能导致细胞存活增加。

因此，当希望在上述情况下通过增加细胞内凋亡来增加细胞死亡时，就需要阻断该家族中阻遏或抑制凋亡的BCL2、BCL-X_L和其它成员的活性，或增加该家族中促进凋亡或抑制BCL2或BCL-X_L抗凋亡活性的BAX、BAK、BAD、BCL-X_S的活性。同样，当希望通过减少凋亡来增加细胞群中的细胞存活时，就需要增加该家族中阻遏或抑制凋亡的BCL2、BCL-X_L以及其它成员的活性，或减少上述该家族中凋亡促进物的活性。

本发明的一个目的是提供新的蛋白质，包括能调节胞内信号传导通道而导致发炎、细胞死亡或细胞存活的其同种型、类似物、片段或衍生物，该调节作用可以通过各种蛋白酶类的前结构域(CARD)或通过参与NF-κB活化的各种激酶的激酶结构域来进行。因此，本发明的这些新蛋白可以是蛋白酶类活性的直接调节剂(细胞死亡通道)和/或通过激酶活性活化NF-κB(细胞存活通道)。同样，本发明的新蛋白可以是参与发炎、细胞死亡或存活通道的其它各种蛋白(例如FAS/APO1，p55 TNF-R，p75 TNF-R，IL-1-R，MORT-1，TRADD，RIP，TRAF2，NIK和其它)的胞内生物活性的间接调节剂。同样，该调节作用也可以是通过与BCL2蛋白家族成员直接或间接相互作用，本发明的新蛋白能够调节BCL2或该家族其它蛋白的活性，在此意义上，本发明的新蛋白可以是受BCL2蛋白家族成员所调节的各种蛋白酶类的间接调节剂。

本发明的另一个目的是提供针对上述新蛋白的拮抗剂(如抗体、肽、有机化合物、或甚至是一些同种型)，包括其同种型、类似物、片段和衍生物，它们可用来在需要时抑制发炎、细胞死亡或存活信号传导过程。

本发明的另一个目的是用上述新蛋白及其同种型、类似物、片段和衍生物来分离并鉴定参与调节发炎、细胞死亡或存活通道并影响其活性的其它蛋白或因子，和/或分离并鉴定这些新蛋白、类似物、片段和衍生物结合的信号传导过程中更上游或下游(因而其功能也参与其中)的其它受体或其它细胞蛋白。

本发明还有一个目的是提供能导入细胞与新蛋白及其可能的同种型结合或相互作用的抑制剂，这些抑制剂能在需要时抑制发炎、细胞死亡或存活过程。

另外，本发明的一个目的是用上述新蛋白及其同种型和类似物、片段和衍生物作为抗原来制备针对它的多克隆和/或单克隆抗体。该抗体进而例如可用来纯化不同来源(如细胞抽提物或转化的细胞系)的新蛋白。

另外，这些抗体可用于诊断目的，例如，用来鉴定与细胞效应功能异常有关的疾病，这些细胞效应由蛋白酶类、激酶、属于BCL2家族的蛋白或TRAF蛋白直接介导的，或由通过与TRAF蛋白、蛋白酶类、激酶或BCL蛋白家族成员相互作用而直接或间接调节/介导胞内过程的p55 TNF受体、FAS/APO1受体或其它相关受体及其相关细胞蛋白(如RAIDD、MORT-1、TRADD、RIP)介导。

本发明的另一个目的是提供一种包含上述新蛋白及其同种型、类似物、片段或衍生物的药物组合物，以及包含上述抗体或其它拮抗剂的药物组合物。

发明概述

根据本发明，已经分离出一种命名为B1的新蛋白(以前称为CBK(即′c-IAP-结合激酶′)，因为它与c-IAP有一些同源性，见下文实施例1，但是在本文称为′B1′)，该蛋白具有前结构域(CARD)区、激酶结构域以及在所述CARD和激酶结构域之间的中间区，因此它能参与调节发炎、细胞死亡和细胞存活过程(详见下文)。如下文所解释的，B1调节细胞死亡或存活通道的作用可以是正作用(促进/增强作用)或负作用(抑制作用)，这取决于与它作用的胞内蛋白的类型。

因此，本发明提供了编码B1蛋白、其同种型、片段或类似物的DNA序列，所述B1、其同种型、片段或类似物能与发炎、细胞死亡或细胞存活通道的胞内中介体(mediator)或调节剂直接或间接地相互作用，所述B1、同种型、片段或类似物是所述胞内发炎、细胞死亡和/或细胞存活通道的胞内调节剂。

本发明上述DNA序列的实例包括：

(i)一种DNA序列，它选自：

(a)衍生自天然B1蛋白编码区的cDNA序列；

(b)编码能调节发炎、细胞死亡或细胞存活通道或两者的生物活性蛋白的序列(a)的片段；

(c)能在中等严谨条件下与序列(a)或(b)杂交的DNA序列，该序列编码能调节胞内发炎、死亡或细胞存活通道或两者的有生物活性的B1蛋白、类似物或片段；

(d)遗传密码与(a)-(c)所确定的DNA序列简并的DNA序列，该序列编码能调节发炎、细胞死亡或细胞存活通道或两者的具有生物活性的B1蛋白、类似物或片段。

(ii)上述一种DNA序列，它包含图3所示序列的至少部分并编码至少一种有活性的B1蛋白、同种型、类似物或片段。

(iii)上述一种DNA序列，它编码的B1蛋白、同种型、类似物或片段具有图3所示氨基酸序列的至少一部分。

另一方面，本发明提供了一种载体，该载体包含上述任何能在真核和原核宿主细胞内表达的本发明的DNA序列；以及含有所述载体的转化的原核和真核细胞。

利用本发明的另一方面，提供了一种由本发明上述DNA序列编码的B1蛋白、其同种型、片段、功能性类似物和衍生物，它们能通过与细胞内发炎、细胞死亡或细胞存活通道的其它胞内调节剂或中介体相结合来直接或间接地调节胞内发炎、细胞死亡或细胞存活通道。

本发明的蛋白的一个实例是，B1蛋白、及其同种型、片段、类似物和衍生物，其中所述蛋白、同种型、类似物、片段和衍生物具有图3所示氨基酸序列的至少一部分。

本发明还提供了一种产生上述B1蛋白及其同种型、片段、类似物或衍生物的方法，该方法包含使上述转化的宿主细胞在适合所述蛋白、其同种型、片段类似物或衍生物表达的条件下生长，在需要时进行翻译后修饰以获得所述蛋白、其同种型、片段、类似物或衍生物，以及分离所述表达的蛋白、同种型、片段、类似物或衍生物。

另一方面，本发明提供了对本发明的B1蛋白、其同种型、类似物、片段或衍生物有特异性的抗体或其活性片段或衍生物。

另一方面，本发明提供了调节胞内信号传导通道的各种方法，例如有下列方法：

(i)一种方法，用来调节或介导细胞中发炎、细胞死亡或细胞存活通道的活性或调节由B1或与本发明的B1蛋白、其同种型、类似物、片段或衍生物结合或直接或间接相互作用的其它分子直接或间接调节或介导的其它胞内信号传导活性，所述方法包括：通过将一种或多种所述的B1蛋白、其同种型、类似物、片段或衍生物以适合胞内导入的形式导入所述细胞，或将编码所述一种或多种B1蛋白、其同种型、类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入所述细胞内来处理所述细胞，所述载体能将所述序列插入所述细胞内以使所述序列在所述细胞中表达。

(ii)如上所述的一种方法，其中所述细胞的处理方法包括将编码所述B1蛋白、其同种型、片段、类似物或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入所述细胞内，所述载体能将所述序列插入所述细胞内以使所述序列在所述细胞中表达。

(iii)如上所述的一种方法，其中所述细胞的所述处理方法是用重组动物病毒载体转染所述细胞，该方法包括下列步骤：

(a)构建一个重组动物病毒载体，该载体携带了编码能结合所述待处理细胞表面上特异性细胞表面受体的病毒表面蛋白(配体)的序列以及编码选自上述B1蛋白、同种型、类似物、片段和衍生物的蛋白的第二序列，该蛋白在所述细胞中表达时能直接或间接地调节/介导发炎、细胞死亡或细胞存活通道的活性，或与所述B1蛋白、其同种型、类似物、片段和衍生物直接或间接相互作用的其它胞内分子所调节/介导的其它胞内信号传导活性；和

(b)用(a)所述的载体感染所述细胞。

(iv)一种调节由B1直接或间接调节的细胞内发炎、细胞死亡或细胞存活通道的方法，该方法包括用上文所述的抗体或其活性片段或衍生物处理所述细胞，所述处理是将含有所述抗体、其活性片段或衍生物的合适组合物施加于所述细胞，其中当所述细胞的B1蛋白或其部分暴露在胞外表面时，所述组合物就配制成用于胞外应用，当所述B1蛋白是胞内蛋白时，所述组合物就配制成胞内应用。

(v)一种调节由B1直接或间接调节的细胞内发炎、细胞死亡或细胞存活或其它通道的方法，该方法包括用编码本发明B1蛋白的DNA序列的至少一部分的反义序列的寡核苷酸序列处理所述细胞，所述寡核苷酸序列能阻断B1蛋白的表达。

(vi)如上所述的一种方法，其中通过上文(ii)所述的病毒将所述寡核苷酸序列导入所述细胞内，其中所述病毒的所述第二序列编码所述寡核苷酸序列。

(vii)一种调节由B1直接或间接调节的细胞内发炎、细胞死亡、细胞存活或其它通道的方法，该方法包括采用核酶程序，其中将载体以允许所述核酶序列在所述细胞内表达的形式导入所述细胞内，该载体编码的核酶序列能与编码本发明B1蛋白的细胞mRNA序列相互作用，并且当所述核酶序列在所述细胞中表达时，它与所述细胞mRNA序列相互作用并切割所述mRNA序列，导致所述B1蛋白在所述细胞内的表达被抑制。

在不同的方面，本发明提供了一种通过本发明蛋白中存在的激酶结构域或中间结构域来分离和鉴定本发明蛋白的方法，该蛋白与具有前结构域或蛋白酶类募集结构域(CARD)的蛋白或参与细胞内信号传导的其它蛋白或酶同源或能与之直接或间接相互作用，该方法包括采用酵母双杂交程序，其中一个杂交载体携带了具有所述CARD、激酶和中间结构域或这些结构域中至少一个的所述蛋白的编码序列，第二个杂交载体携带了来自cDNA或基因组DNA文库的序列，然后用载体转化酵母宿主细胞，分离阳性转化细胞，然后抽提所述第二杂交载体，获得与含有CARD、激酶和/或中间结构域的蛋白结合的蛋白编码序列。

在本发明的还有一个方面，提供了一种用于调节细胞内由B1直接或间接调节的发炎、细胞死亡、细胞存活或其它通道的药物组合物，该组合物包含至少一种本发明的B1蛋白、其生物活性片段、类似物、衍生物或其混合物作为活性组分。

上述药物组合物的一个实例是一种用于调节细胞内由B1直接或间接调节的发炎、细胞死亡、细胞存活或其它通道的药物组合物，它包含一种重组动物病毒载体作为活性组分，该载体编码能与细胞表面受体结合的蛋白，并编码至少一种B1蛋白、同种型、活性片段或类似物。

上述药物组合物的另一个实例是一种用于调节细胞内由B1直接或间接调节的发炎、细胞死亡、细胞存活或其它通道的药物组合物，该组合物包含一种寡核苷酸序列作为活性组分，该寡核苷酸编码B1蛋白mRNA序列的反义序列。

上述药物组合物的另一个实例是一种用于预防或治疗与B1蛋白直接或间接结合的一种或多种分子调节凋亡相关的病理性疾病的药物组合物，所述组合物包含有效量的B1蛋白或编码该蛋白的DNA分子、或能破坏所述B1蛋白与能和B1蛋白结合或相互作用的一种或多种分子直接或间接相互作用的分子。

上述药物组合物还有一个实例是一种用于预防或治疗与B1蛋白直接或间接结合的一种或多种分子调节凋亡相关的病理性疾病的药物组合物，所述组合物包含有效量的B1蛋白、或其DNA编码分子、或能破坏所述B1蛋白与能结合所述B1蛋白或与其相互作用的一种或多种分子直接或间接相互作用的分子。

上述药物组合物的另一个实例是一种用于预防或治疗与B1蛋白直接或间接结合的一种或多种分子所调节的凋亡相关的病理性状态的药物组合物，所述组合物包含一种能干扰B1的蛋白激酶活性的分子。

在本发明的另一个不同的方面，提供了下列治疗方法：

(i)一种用于预防或治疗与B1蛋白直接或间接结合的一种或多种分子所调节的凋亡相关的病理性状态的方法，所述方法包括给予需要的患者有效量的B1蛋白或其同种型、片段、类似物和衍生物或它们的混合物、或其DNA编码分子、或能破坏所述B1蛋白或其同种型、片段、类似物和衍生物或它们的混合物与能直接或间接结合B1蛋白或其同种型、片段、类似物和衍生物或它们的混合物的一种或多种分子直接或间接相互作用的分子。

(ii)一种调节B1蛋白直接或间接参与的发炎过程、凋亡过程或编程性细胞死亡过程(细胞死亡通道)的方法，该方法包括用一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物处理所述细胞，其中所述细胞的所述处理包括将一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物以适合胞内导入的形式导入所述细胞内，或将编码所述一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入所述细胞内，所述载体能将所述序列插入所述细胞内从而使所述序列在所述细胞内表达。

(iii)一种调节B1蛋白直接或间接参与的细胞存活过程的方法，该方法包括用一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物处理所述细胞，其中所述细胞的处理包括将所述一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物以适合胞内导入的形式导入所述细胞内，或将编码所述一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入所述细胞内，所述载体能将所述序列插入所述细胞内从而使所述序列在所述细胞内表达。

本发明还有一个方面提供下列筛选方法以及用于鉴定和生产各种配体的方法：

(i)一种筛选能结合B1蛋白的配体的方法，该方法包括使连接了所述蛋白的亲和层析基质与细胞抽提物接触，从而使配体与所述介质结合，然后洗脱、分离和分析所述配体。

(ii)一种筛选编码能结合B1蛋白的配体的DNA序列的方法，该方法包括采用酵母双杂交技术，其中一个杂交载体携带了编码所述B1蛋白的序列，第二个杂交载体携带了来自cDNA或基因组DNA文库的序列，用所述载体转化酵母宿主细胞，分离阳性转化的细胞，抽提所述第二个杂交载体以获得编码所述配体的序列。

(iii)一种鉴定和产生能调节B1调节/介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：

a)筛选能结合某多肽的配体，该多肽包含B1的至少一部分，具有至少一些图3所示的B1氨基酸残基，该部分基本上包括B1的全部前结构域(或CARD)；

b)对于所述筛选步骤发现的、能进行所述结合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受体家族受体一部分、或具有前结构域(CARD)的其它已知蛋白的配体，进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述配体。

(iv)一种鉴定和产生能调节B1蛋白调节或介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：

a)筛选能与某多肽结合的配体，该多肽至少包含图3所示的B1序列的羧基端部分，该部分包括前结构域(CARD)；

b)对于所述筛选步骤发现的、能进行所述结合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受体家族受体一部分、或具有前结构域(CARD)的其它已知蛋白的配体，进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述配体。

(v)一种鉴定和产生能调节B1调节/介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：

a)筛选能与基本上包括B1所有激酶结构域的图3所示B1序列的至少N端部分结合的配体；

b)对于所述筛选步骤发现的、能进行所述结合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受体家族受体一部分、或其它已知蛋白的胞内调节蛋白的配体，进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述配体。

(vi)一种鉴定和产生能直接或间接调节B1调节/介导的细胞活性的分子的方法，该方法包括：

a)筛选能调节B1调节/介导的活性的分子；

b)对所述分子进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述分子。

(vii)一种鉴定和产生能直接或间接调节本发明蛋白所调节/介导的细胞活性的分子的方法，该方法包括：

a)筛选能调节本发明的蛋白所调节/介导的活性的分子；

b)对所述分子进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述分子。

本发明的其它方面显然可从本发明下文详细描述中获得。

附图简述

图1示意性地描述了TRAF2分子的结构；

图2描述了参与发炎、细胞死亡和细胞存活(NF-κB活化)通道的一些蛋白；

图3(A，B)显示了本发明的B1蛋白的推定氨基酸序列(A)及其测得的核苷酸编码序列(B)，其中氨基酸序列显示了B1的激酶结构域(N末端用方框表示的区域)和B1的CARD结构域(C末端用下划线表示的区域)。

图4显示了在不同人组织中表达的B1的Northern分析，它显示了B1在大多数类型的人组织中表达；和

图5显示了所测试的不同的B1构建物的NF-κB活性、细胞死亡增强作用和JNK活化作用。

图6显示了用图6和实施例3的不同构建物进行的NF-κB活化作用测定结果。

图7显示了用上述构建物中的一些进行的JNK1活化的测定结果；和

图8显示了B1在体内自身缔合并且与TRAF1结合。

发明详述

本发明一方面涉及一种新的B1蛋白，该蛋白具有前结构域或CARD结构域(蛋白酶类募集结构域)和与RIP激酶结构域相似的蛋白激酶结构域。因此，本发明的B1蛋白能与参与发炎、细胞死亡(凋亡)和细胞存活(NF-κB激活)通道的许多胞内蛋白相互作用。这种相互作用可以通过前结构域(CARD)与各种蛋白结合或与它们相互作用，或可以利用激酶结构域的活性，或者这两种相互作用可同时存在。例如，B1能募集许多具有前结构域(CARD)的蛋白，然后通过利用其激酶结构域使它们磷酸化。同样，在一些情况下，B1可通过其前结构域(CARD)作为可能不是B1激酶结构域底物的其它各种含有前结构域蛋白的停靠或募集蛋白，或者B1可以只通过其激酶结构域而不通过其CARD结构域与各种蛋白相互作用。

另外，如本文所详细描述的，结合试验结果表明，本发明的新的B1蛋白可能能与BCL2蛋白结合。这一发现提出了B1蛋白可能是BCL2活性(尤其是凋亡调节作用方面)的调节剂的可能性。在最初的生物活性分析中，也提出了B1蛋白抑制BCL2抗凋亡保护效应的可能性。其根据是观察到B1蛋白本身不会引起细胞死亡，但是当细胞中加入细胞死亡的其它诱导物(例如FAS-R、p55 TNF-R和RIP)(所述加入细胞是通过用能在细胞内表达B1、FAS-R、p55 TNF-R或RIP的载体共转化细胞，见下文实施例2)时，它具有增强细胞死亡的作用。因此，B1很有可能并非以类似于BAX或BAK的方式(靠其自身以均二聚体的形式引起细胞死亡(见上文“背景技术”部分))起作用，而是以类似于BAD的方式起作用(通过结合BCL2来负调节BCL2，防止其与BAX或BAK结合，从而导致更多游离的BAX和/或BAK，进而增加细胞死亡(见上文“背景技术”部分))。

另外，对于上述NF-κB的激活和细胞存活，B1可能是通过引起NF-κB激活的减少来实现它所观察到的增强细胞死亡的活性，NF-κB激活的减少可能是靠B1的激酶活性，该激酶活性可能起着调节诱导NF-κB激活所需的各种蛋白(如NIK)的作用，结果减少了NF-κB的激活，从而减少了细胞存活。在这方面，感兴趣的是注意到当B1和细胞死亡诱导剂(如FAS-R、p55 TNF-R或RIP)一起加入时，B1增强了这些诱导物的杀细胞活性。已经知道，p55 TNF-R和FAS-R，可能还有RIP，它们除了诱导细胞死亡通道从而最终增加蛋白酶类活性外，还诱导了NF-κB的活化，这一定程度地抵消了诱导的细胞死亡。在一些细胞中，已经发现TNF不杀死细胞，这归因于TNF受体诱导NF-κB激活，而不是这些受体不能共同诱导细胞死亡通道，因此在这些细胞中，NF-κB介导的细胞存活通道显然比细胞死亡通道更具活性。因此，通过阻断NF-κB诱导就可能增强例如FAS-R、p55 TNF、RIP介导的杀细胞作用，本发明的B1蛋白可能就起这个作用，当其与FAS-R、p55-TNF-R或RIP一起加入时产生了所见的细胞死亡增强现象。

鉴于上述内容，表明B1可能以多种方式调节发炎、细胞死亡或细胞存活过程，并且甚至可以多种方式同时进行。例如，B1可能抑制NF-κB激活，或B1甚至可能不依赖于其对NF-κB的作用或除其对NF-κB可能产生的作用外，作用于参与细胞死亡或细胞存活通道的其它胞内蛋白。

因此，B1好象可能具有调节广泛范围的胞内蛋白、尤其是参与发炎、细胞死亡和细胞存活通道的那些蛋白的能力。如下文所详细的描述的那样，许多已知的胞内蛋白具有前结构域(CARD)，这些蛋白例如有参与细胞蛋白水解破坏(细胞死亡通道)的各种蛋白酶类酶(包括ICE、ICH-1、Mch6和其它)，以及也参与细胞死亡通道的各种衔接蛋白(包括RAIDD、c-IAP1、c-IAP2和其它)。这样，B1可能能通过它们共同的CARD与各种蛋白酶类直接或间接相互作用，从而可以调节它们的活性。这种调节作用可能是正作用，即，B1可能起集中各种蛋白酶类的作用，从而增强它们的蛋白水解活性导致细胞死亡增加。另外，用c-IAP1的序列分离B1，B1与本身是凋亡抑制剂的c-IAP1有同源性。c-IAP1具有前结构域(CARD)，并且可通过募集蛋白酶类从而抑制它们的活性来抑制凋亡。因此，B1可能能与c-IAP1直接或间接相互作用，并导致其凋亡抑制作用受阻遏，从而增加细胞死亡。另外，B1可能通过其CARD与各种蛋白酶类间接或直接相互作用，还可通过其激酶结构域的磷酸化作用来调节蛋白酶类从而增强蛋白酶类的活性。

一个更间接的方式是，B1可能能与衔接蛋白(如RAIDD、c-IAP1、c-IAP2和具有CARD的其它蛋白)直接或间接相互作用，从而可能能与发炎、细胞死亡和细胞存活通道更上游的其它蛋白相互作用。例如，RAIDD通过共有的死亡结构域(death domain)与其它胞内蛋白(如RIP和TRADD)相互作用，而RIP和TRADD再与诸如MORT-1、p55-TNF-R和FAS-R等蛋白相互作用。这样，通过与RAIDD相互作用，B1可能与这些死亡效应受体和蛋白间接连接。类似地，c-IAP1和c-IAP2与TRAF2蛋白相互作用，而TRAF2再与p75-TNF-R相互作用、并通过TRAF2与RIP和TRADD之间的相互作用与MORT-1、p55-TNF-R和FAS-R相互作用。因此，B1可能是通过间接地连接上述衔接蛋白、效应蛋白和受体成为作为细胞死亡过程的间接调节剂。这种间接调节作用可能是正作用，即它可能导致增强细胞死亡。

另外，鉴于B1可能至少是间接地(通过c-IAP1)与TRAF2相互作用，提出B1参与了NF-κB激活诱导相关的细胞存活通道的可能性。现在已经知道，TRAF2直接结合NIK(Malinin等人，1997)，而NIK直接参与诱导NF-κB激活，从而参与细胞存活。因此，通过可能间接调节TRAF2，B1也能调节细胞存活通道。另外，鉴于具有激酶结构域，B1可能能更直接地参与NIK所属的MAP激酶通道而导致诱导NF-κB激活和细胞存活。然而，如上所述，鉴于B1导致增强细胞死亡的事实，B1可能在调节细胞存活过程中起负面作用，即B1可能调节TRAF2，或是说，B1可能直接参与MAP激酶通道但却导致NF-κB激活减少。

B1也有可能在调节胞内信号传导通道、尤其是发炎、细胞死亡和细胞存活通道上起关键作用，因此B1可起调节这些通道的作用，从而使平衡从细胞存活向细胞死亡移动诱导移动，这与所观察到的B1对细胞死亡诱导有增强作用相一致(见实施例2)。因此，B1可认作组成这些通道的不同组成蛋白的直接或间接的“胞内信号传导活性调节剂”。

因此，在考虑B1在治疗上各种可能的用途时，重要的是要了解B1在所有情况下均可能具有多种作用，即，它可能增强细胞死亡过程，同时它也能激活性抑制NF-κB的诱导从而抑制细胞存活通道，或根据B1实际结合的蛋白/酶以及它们在细胞内的相对数量，B1可能会在一些细胞中起抑制细胞存活通道的作用，而在其它细胞中可能通过抑制细胞死亡抑制剂起增强细胞死亡通道的作用。

因此，例如从下文可以看出，当需要增加细胞死亡时(如在肿瘤、HIV-感染的细胞等中)，可以用B1来实现这个目的。例如，可将B1直接给予细胞，或将编码B1的DNA分子导入细胞内来增加B1的表达。

同样，在希望拯救细胞免受TNF或FAS-配体诱导的细胞死亡而促进细胞存活的场合下(例如在各种炎症、自身免疫疾病、移植物抗宿主反应等中)，可用B1拮抗剂来实现这个目的。例如，可以给予的B1拮抗剂例如是抗B1抗体、具有反义B1序列的寡核苷酸、具有B1序列的核酶、或所设计的特异性地抑制B1活性的各种肽或有机分子。

因此，当下文提到B1的用途时，将根据B1对各种胞内过程或疾病的调节效应来阐述B1用途，根据上述内容会理解，该调节作用可能是正作用(增强作用，在考虑细胞死亡通道的场合下)，或是负作用(抑制作用，在考虑细胞存活通道的场合下)。

本发明还涉及编码生物活性B1蛋白的DNA序列，以及编码其生物活性类似物、片段和衍生物的DNA序列，以及这些DNA序列编码的B1蛋白、蛋白的类似物、片段和衍生物。这些类似物、片段和衍生物的制备采用标准技术(例如参见，Sambrook等人，1989)，其中在DNA编码序列中，一个或多个密码子可以缺失、加入或被另一个密码子替代，产生的编码的类似物与天然蛋白质相比至少有一个氨基酸残基发生变化。可接受的类似物是至少保留了B1的前结构域(CARD)或激酶结构域或至少这些结构域任一个或两个的活性部分、有或没有介导其它任何结合或酶促活性(即不与更下游的蛋白或其它因子结合或直接或间接相互作用，或不催化信号依赖型反应(如激酶反应))的那些类似物。这样，可产生具有所谓显性负效应的类似物，该类似物通过前结构域与其它蛋白结合或相互作用中有能力缺陷，或在上述结合后的随后信号传导中有(也可能是激酶活性)缺陷。例如，这些类似物可用来与天然的B1蛋白竞争来调节上述的发炎、细胞死亡或细胞存活通道。同样，可产生所谓的显性阳性类似物来增强B1效应。这些类似物将具有相同或更佳的B1相关的与其它蛋白结合的性质，以及相同或更佳的天然B1蛋白信号传导性质或激酶活性。以类似的方式，本发明的克隆的生物活性片段可如上所述制备类似物那样来制得。本发明的DNA序列的合适片段是其编码的蛋白或多肽保留了与其它蛋白的B1结合能力或能介导上述其它结合活性或酶促(激酶)活性的那些片段。因此，可以制得具有如上文类似物所述的显性阴性或显性阳性效应的本发明编码蛋白的片段。类似地，通过用标准方法修饰蛋白、其类似物或片段的一个或多个氨基酸残基的侧链基团，或者通过将蛋白、其类似物或片段与另一分子(例如本领域熟知的抗体、酶、受体等)偶联，可制得衍生物。

在编码B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物的本发明上述DNA序列中，本发明一个实例还包括能与天然B1蛋白编码区衍生的cDNA序列杂交的DNA序列，其中这种杂交在中度严谨条件下进行，可杂交的DNA序列编码了具有生物活性的B1蛋白。因此，这些可杂交的DNA序列包括与天然B1的cDNA序列有相对高同源性的DNA序列，并因而代表了B1样序列，该B1样序列可以是例如：编码各种B1蛋白同种型的天然衍生序列，或属于一组B1样序列且编码具有B1蛋白活性的蛋白的天然存在的蛋白编码序列。此外，这些序列还包括(例如)非天然存在的、合成的序列，该序列与天然B1蛋白cDNA序列相似但掺入了许多所需的修饰。因此，这类合成的序列包括编码B1蛋白的类似物、片段和衍生物(都具有B1蛋白活性)的所有可能的序列。

为获取上述各种天然存在的B1蛋白样序列，可用天然B1蛋白cDNA或其部分作为探针，对不同组织中获取的天然衍生的DNA或RNA样品，用标准方法进行筛选和分离(参见例如Sambrook等人所述的标准方法，1989)。

同样地，为制备编码B1蛋白的类似物、片段或衍生物的上述各种合成的B1蛋白样序列，可以使用许多标准方法，正如下文详细描述的有关制备这些衍生物、片段和类似物的方法。

“基本对应于”B1蛋白的多肽或蛋白质不仅包括B1蛋白，也包括是B1蛋白类似物的多肽或蛋白。

基本对应于B1蛋白的类似物，是在B1蛋白的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代、删除和/或被插入而形成的多肽，只要所得的蛋白质基本上呈现出与其所对应的B1蛋白同样或更好的生物活性。

为了基本对应于B1蛋白，在B1蛋白序列中的变化(如同种型)通常较小。虽然变化的数目可能多于10个，但较佳的不多于10个，更佳地不多于5个，最佳地不多于3个这样的变化。尽管任何技术都可用于发现有潜在生物学活性且基本对应于B1蛋白的蛋白质，但是一种这样的方法是对编码该蛋白质的DNA运用常规的诱变方法，产生一些修饰。然后，根据它们与具有例如前结构域(CARD)、激酶结合位点的其它各种蛋白或与B1本身结合的能力以及在调节/介导上述胞内通道时调节这些其它蛋白或B1本身活性的能力，对这些克隆表达的蛋白加以筛选。

“保守的”变化是指预计不会改变蛋白质活性的那些变化，这些变化通常是首先要筛选的，因为这些变化预计不会明显改变蛋白大小、电荷或构型，因而预计不改变其生物特性。

B1蛋白的保守取代包括一种类似物，其中多肽中至少一个氨基酸残基被不同的氨基酸保守地取代。较佳地，这种取代根据表1A中下列清单进行，这些取代可用常规实验来确定，从而使合成的多肽分子在保持B1蛋白生物活性的同时又在结构和功能性质上有所变化。

                            表IA

            原来的残基           代表性的取代残基

            Ala                  Gly；Ser

            Arg                  Lys

            Asn                  Gln；His

            Asp                  Glu

            Cys                  Ser

            Gln                  Asn

            Glu                  Asp

            Gly                  Ala；Pro

            His                  Asn；Gln

            Ile                  Leu；Val

            Leu                  Ile；Val

            Lys                  Arg；Gln；Glu

            Met                  Leu；Tyr；Ile

            Phe                  Met；Leu；Tyr

            Ser                  Thr

            Thr                  Ser

            Trp                  Tyr

            Tyr                  Trp；Phe

            Val                  Ile；Leu或者，另一类B1蛋白的取代形式是在多肽中删去至少一个氨基酸残基，然后再根据下表IB在其位置插入不同残基。多肽中可进行的取代类型可依据对不同种类中同源蛋白之间氨基酸变化频率的分析结果，例如Schulz等，G.E.，“蛋白质结构原理”(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，New York，NY，1978中的表1-2，以及Creighton，T.E.，“蛋白质：结构和分子性能”(Proteins：Structureand Molecular Properties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA 1983中的图3-9中给出的分析结果。根据这一分析，本文另外定义了保守性取代，该取代能在下列5组任一组中进行互换。

                            表IB

1.小的脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；

2.极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Asn、Glu、Gln；

3.极性带正电荷的残基：His、Arg，Lys；

4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和

5.大的芳族残基：Phe、Tyr、Trp。

上述括号中的3个氨基酸残基在蛋白质结构中有特殊作用。Gly是唯一没有侧链的残基，因而它赋予肽链柔韧性。然而，这会倾向有利于形成除α-螺旋外的二级结构。Pro，因其不同寻常的几何结构，会紧密地约束肽链，并且通常会促进类似于β-转角的结构，而在一些例子中，Cys能够参与二硫键的形成(二硫键的形成在蛋白质折叠中很重要)。应注意，Schulz等(同上)将上面的第1和第2组合二为一。还应注意，Tyr，因其有形成氢键的趋势，因此与Ser和Thr等有显著的亲近关系。

根据本发明进行的保守性氨基酸取代，例如上面所陈述的，都是本领域中已知的，并且预期在氨基酸取代后可以维持多肽的生物学和结构特性。本发明的大多数缺失和取代是那些不导致蛋白质或多肽分子特性发生根本变化的类型。“特性”以遍举方式(non-inclusive)定义，其定义了二级结构(如α-螺旋或β-折叠)的变化和生物活性(例如上文和下文所述的与具有前结构域(CARD)或激酶活性的其它蛋白结合，和/或调节细胞死亡或存活通道)的变化。

可用于本发明来获得B1蛋白类似物的在蛋白质中产生氨基酸替换的例子包括：任何已知的方法步骤，例如在授予Mark等的美国专利RE33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等的美国专利5,116,943；授予Namen等的美国专利4,965,195；授予Chong等的美国专利4,879,111；授予Lee等的美国专利5,017,691中给出的方法；以及在美国专利No.4,904,584(Shaw等)中给出的用赖氨酸取代的蛋白质。

除了上述的不会明显改变B1蛋白活性的保守性取代外，那些会增加B1蛋白类似物生物活性的保守性取代或保守性稍低而随机性较高的改变，也在本发明范围之内。

当需要证实取代或缺失的确切效果时，本领域技术人员知道，可以通过常规的结合和细胞死亡试验来评价取代、缺失等的效果。用这类标准测试方法进行筛选并不需要过多的实验。

在遗传水平上，这些类似物通常可以这样制得：对编码B1蛋白的DNA中的核苷酸进行定点诱变，从而产生编码类似物的DNA，随后合成DNA并在重组细胞培养中表达多肽。类似物通常表现出与天然存在的蛋白相同或更高质量的生物活性，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publications andWiley Interscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。

制备本文所述的B1蛋白，或者制备能编码相同多肽但与天然序列不同的其他核苷酸序列(因为遗传密码已知的简并性允许这些变化)，都可以通过定点诱变编码早先制得的B1蛋白类似物或天然B1蛋白的DNA而实现。定点诱变可以利用编码具有所需突变的DNA序列以及足够数目的毗邻核苷酸的特异性寡核苷酸序列来产生类似物，以提供具有足够大小和序列复杂度(complexity)的引物序列，从而在被横跨的缺失接头两侧形成稳定的双链体。通常，较佳的是长度约20-25个核苷酸的引物，在待改变序列的每一侧有约5-10个互补核苷酸。一般，定点诱变技术是本领域中众所周知的，代表性的例子例如是Adelman等，DNA，2：183(1983)，该文献的公开内容纳入本文作参考。

正如人们所知晓的那样，定点诱变技术通常采用单链和双链形式的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括：载体如M13噬菌体，例如公开在Messing等，Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA，A.Walton，Elsevier，Amsterdam编辑(1981)中，该文献纳入本文作参考。这些噬菌体易在商业上购得，且它们的用法通常是本领域技术人员所熟知的。或者，也可用含有单链噬菌体复制起点的质粒载体来获得单链DNA(Veira等，Meth.Enzymol.153：3，1987)。

通常，本文所述的定点诱变这样来进行：先获得一单链载体，该载体序列中含有编码有关多肽的DNA序列。用自动化DNA/寡核苷酸合成法制得携带所需突变序列的寡核苷酸引物。然后将该引物与含有蛋白质编码序列的单链载体退火，然后用有DNA聚合作用的酶(如大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段)作用，完成携带突变的链的合成。这样，突变序列和第二条链就带有所需的突变。然后用该异源双链载体转化合适的细胞(如大肠杆菌JM101细胞)，并选出含有带突变序列重排的重组载体的克隆。

在选出了这样的克隆后，可以取出有突变的B1蛋白序列，并置于合适的载体中，该载体通常是可用于转染合适宿主的转移载体或表达载体。

因此，利用已知的DNA或RNA扩增技术(如PCR和化学寡核苷酸合成技术)，就可在体外、原位和/或体内检测、获得和/或修饰编码B1蛋白的基因或核酸。PCR可以通过重复的DNA聚合酶反应来扩增特异的DNA序列(增加数目)。该反应可用作克隆的替代手段；而所需的只是有关核酸序列的知识。为了进行PCR，可设计与感兴趣的序列互补的引物。然后通过自动化DNA合成法制得这些引物。因为引物被设计成能与基因任何部分杂交，因此可创造一些能够容忍互补碱基对存在错配的条件。扩增这些错配区域会导致合成出诱变的产物，从而产生具有新特性的肽(即定点诱变)。另见例如Ausubel，(同上)，第16章。此外，通过偶联互补DNA(cDNA)合成技术，并使用反转录酶和PCR反应，可将RNA用作原料来合成催乳素受体的胞外结构域，而不经过克隆。

此外，PCR引物可被设计成含有新的限制性位点或具有其他特征，例如在待扩增的基因节段末端处有终止密码子。在扩增的基因序列的5′和3′端安置限制性位点，可以使编码B1蛋白或其片段的基因节段能按需进行设计，以便在载体中连接其他序列和/或克隆位点。

PCR及扩增RNA和/或DNA的其它方法是本领域众所周知的，并且根据此处所讲述和给予的指导，无需过多试验就可根据本发明进行使用。已知的DNA或RNA扩增方法包括(但并不限于)：聚合酶链反应(PCR)和有关的扩增方法(例如参见授予Mullis等的美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等的美国专利4,795,699和4,921,794；授予Innis的美国专利5,142,033；授予Wilson等的美国专利5,122,464；授予Innis的美国专利5,091,310；授予Gyllensten等的美国专利5,066,584；授予Gelfand等的美国专利4,889,818；授予Silver等的美国专利4,994,370；授予Biswas的美国专利4,766,067；授予Ringold的美国专利4,656,135；和Innis等编辑的PCR Protocols：A Guide to Methodand Applications)，以及RNA介导的扩增方法，其中使用对靶序列的反义RNA作为模板来合成双链DNA(授予Malek等的美国专利No.5,130,238，其商品名为NASBA)；以及结合了DNA扩增和抗体标记技术的免疫-PCR(Ruzicka等，Science260：487(1993)；Sano等，Science 258：120(1992)；Sano等，Biotechniques 9：1378(1991))。这些专利和对比文献的全部内容纳入本文作参考。

按类似的方式，B1蛋白或其同种型的生物活性片段可参考上述B1蛋白类似物所述的方式进行制备。合适的B1蛋白片段是那些至少保留前结构域相关结合能力或激酶活性、并能介导B1蛋白直接或间接关联的其它各种蛋白或胞内通道生物活性的那些片段。因此，可以制得如上述类似物那样具有显性阴性或显性阳性效应的B1蛋白片段。应注意，这些片段代表了本发明的一类特殊的类似物，即，它们是衍生自全长B1蛋白序列的B1蛋白的确定部分，每个这样的片段或部分具有任一上述所需的活性。例如，这样的片段可以是一个肽。

类似地，衍生物还可通过对B1蛋白及其类似物或片段的一个或多个氨基酸残基侧链基团进行标准修饰，或者通过将B1蛋白及其类似物或片段偶联于其他分子(例如抗体、酶、受体等)来制得，这些技术都是本领域中熟知的。因此，本文所用的术语“衍生物”覆盖了用本领域已知手段对位于残基侧链的官能团或N-端或C-端基团进行修饰而制得的衍生物，这些衍生物均包括在本发明内。衍生物可以具有例如碳水化合物或磷酸残基的化学分子部分，只要这样的组份具有与B1蛋白相同或更高的生物活性。

例如，衍生物可包括：羧基的脂族酯、羧基的酰胺(通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得)、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(例如烷酰基(alkanoyl)或碳环类的芳酰基)形成的N-酰基衍生物，或游离的羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。

术语“衍生物”只包括那些没有一个氨基酸变成20种常见的天然氨基酸中的某一种氨基酸的衍生物。

B1蛋白是蛋白质或多肽，即它是氨基酸残基序列。根据本文的定义，由包括了B1蛋白全部序列的更长序列所构成的多肽也包括在该多肽范围内，只要所添加部分不影响本发明的基本特性和新的特性，即，它们保留或提高了B1蛋白的生物活性，或它们能够断裂产生具有B1蛋白生物活性的蛋白质或多肽。因此，例如，本发明包括B1蛋白与其他氨基酸或肽形成的融合蛋白。

新的B1蛋白、其类似物、片段和衍生物有许多可能的用途，例如：

(i)它们可通过直接或间接调节它们所结合的胞内蛋白来调节细胞存活通道。在不希望增强这些通道活性的情况下，即希望抑制它们而有利于细胞死亡通道时，例如在抗肿瘤或免疫刺激应用中，希望B1、其同种型、类似物、片段或衍生物的这种调节作用是抑制性的。在这种情况下，可用本来已知的标准技术将本发明的B1蛋白、其类似物、片段或衍生物导入细胞内。例如当本发明的DNA克隆编码的蛋白在细胞内，且它们只应被导入所需细胞内时，就需要一种将这些蛋白质特异性导入细胞内的系统。实现该目的的一种方法是产生一个重组动物病毒(例如从牛痘获得)，在DNA中导入下列两个基因：编码配体的基因，该配体能与细胞特异性表达的细胞表面蛋白(例如一种是与一些细胞(CD4淋巴细胞和相关的白血病细胞)特异性结合的AIDS(HIV)病毒gp120蛋白))结合；或者是编码与携带已知受体的细胞特异性结合的任何其它配体的基团，这样重组病毒载体将能结合这些细胞；以及编码本发明蛋白的基因。这样，细胞表面结合蛋白在病毒表面上的表达会使病毒特异性地靶向肿瘤细胞或其它携带受体的细胞，然后编码蛋白的序列会通过病毒导入细胞内，而且它一旦在细胞内表达，就会抑制细胞存活通道，导致这些细胞中产生所需的细胞死亡或免疫刺激效应。这些重组动物病毒可用标准技术来构建(例如参见，Sambrook等，1989)。另一种可能是将编码蛋白的序列以能被细胞吸收并在其中表达的寡核苷酸形式导入。

类似地，当B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物是刺激性的或增强细胞死亡过程时，它们也可如上所述那样给予细胞以提高抗肿瘤、免疫刺激性或其它细胞死亡作用的活性。

(ii)或者，例如在AIDS、脓毒休克、移植物抗宿主排斥反应等组织破坏的情况下，当需要阻断细胞死亡通道或刺激细胞存活通道时，它们可用来增强或提高细胞存活通道。在这种情况下这是可能的，例如，当B1蛋白实际上抑制了细胞存活过程、或是刺激或增强细胞死亡通道时，可以用标准技术将具有本发明B1蛋白反义编码序列的寡核苷酸导入细胞中，该寡核苷酸将有效地阻断编码该蛋白的mRNA的翻译，从而阻断其表达并导致抑制不希望的(细胞死亡)效应。这些寡核苷酸可用上述重组病毒方法导入细胞内，该病毒携带的第二序列是该寡核苷酸序列。

另一种可能是用针对本发明蛋白的特异性抗体来抑制它们的胞内信号传导活性。

抑制不希望的效应还有一种方法是最近开发出来的核酶方法。核酶是具有催化性的RNA分子，它能特异性地切割RNA。核酶可经基因工程改造来切割所选的靶RNA(例如编码本发明B1蛋白的mRNA)。这种核酶具有的序列对蛋白mRNA有特异性，能在切割mRNA后与其相互作用(互补结合)，从而导致蛋白表达的减少或完全丧失，而表达减少的水平取决于靶细胞中核酶表达的水平。为了将核酶导入所选细胞(例如携带B1蛋白序列的那些细胞)内，可以采用任何合适的载体，例如通常用于此目的的质粒、动物病毒(逆转录病毒)载体(另见上文(i)，其中病毒具有的第二序列是编码所选核酶序列的cDNA)。(关于有关核酶方法的回顾参见Chen等，1992；Zhao和Pick，1993)。

(iii)它们还可用来分离、鉴定和克隆能结合它们的其它蛋白，例如参与胞内发炎、细胞死亡或细胞存活通道的其它蛋白。例如，可将编码本发明蛋白的DNA序列用于酵母双杂交系统中，在该系统中用编码蛋白作为“诱饵”来分离、克隆和鉴定cDNA或基因组DNA文库中编码能结合克隆蛋白的其它蛋白序列(＂猎物＂)。同样，还可以确定本发明的蛋白是否能结合其它细胞蛋白，如TNF/NGF受体超家族的其它受体、或BCL2家族的其它成员。

(iv)编码的蛋白、其类似物、片段或衍生物还可用来分离、鉴别和克隆相同类别中的其它蛋白(即具有前结构域(CARD)或激酶结构域的那些蛋白、或功能上相关的并参与胞内信号传导过程的蛋白)。在该应用中，可采用上述酵母双杂交系统，或可采用最近开发出的采用非严谨性Southern杂交然后进行PCR克隆的系统(Wilks等人，1989)。

(v)利用本发明的编码蛋白、其类似物、片段或衍生物的还有一种方法是将它们用于亲和层析方法来分离和鉴别它们能结合的其它蛋白或因子，例如与B1蛋白相关的蛋白或参与胞内信号传导过程的其它蛋白或因子。在这种应用中，本发明的蛋白、其类似物、片段或衍生物可单独与亲和层析基质连接，然后使其与细胞抽提物或怀疑参与细胞内信号传导过程的分离的蛋白或因子接触。在亲和层析步骤后，就可洗脱、分离并鉴定和本发明的蛋白、其类似物、片段或衍生物结合的其它蛋白或因子。

(vi)如上所述，本发明的蛋白或其类似物、片段或衍生物还可用作免疫原(抗原)来生产其特异性的抗体。这些抗体也可用来从细胞抽提物或产生B1蛋白、其类似物或片段的转化细胞系中纯化本发明的蛋白。另外，这些抗体可用于诊断目的，用来鉴定与受体系统或它们在其中起作用的发炎、细胞死亡或存活通道的功能异常有关的疾病。因此，若这些疾病与涉及本发明蛋白的胞内信号传导系统功能失常有关，那么这些抗体就可作为重要的诊断工具。术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、针对可溶或结合形式被标记的抗体的抗独特型(抗-Id)抗体、以及它们的片段(例如Fab和F(ab′)₂—缺少完整抗体Fc片段、能结合抗原的片段)。

(vii)用于本发明的抗体，包括抗体片段，可用于定量或定性地检测样品中本发明的克隆，或者用于检测是否存在表达本发明克隆的细胞。这可采用荧光标记抗体的免疫荧光技术，并结合光学显微计量检测、流式细胞计量检测或荧光计量检测术而实现。

本发明所用的抗体(或其片段)可用于组织学，如在免疫荧光或免疫电子显微术中，以便原位检测本发明的克隆。原位检测可这样进行：取一份患者组织样品，然后将标记的本发明抗体提供给该样品。抗体(或其片段)的提供宜通过将标记的抗体(及其片段)施加或覆盖在生物样品上。通过使用这一程序，不仅可以确定是否存在克隆，而且可以确定其在受检组织中的分布。使用本发明，一般技术人员将会知道，可以改进各种不同的组织学方法(例如染色程序)以实现这种原位检测。

这些分析本发明克隆的方法通常包括：将生物样品如生物液体、组织提取物、新收获的细胞(如淋巴细胞或白细胞)、或在组织培养中培育过的细胞，在能鉴别该编码蛋白质的可检测标记抗体存在下培育，然后用本领域熟知的众多方法中的任一种技术来检测抗体。

(viii)本发明的编码蛋白利用其结合其他胞内蛋白质的能力，还可被用作众多其他蛋白质的间接调节剂，而这些其他胞内蛋白质可直接结合另一些胞内蛋白或跨膜蛋白的胞内结构域。

为了调节这些其他的胞内蛋白质或跨膜蛋白的胞内结构域，可用上文(i)和(ii)提到的许多方法将本发明蛋白质导入细胞。

还应注意，本发明蛋白的分离、鉴定和特性分析可用任何熟知的标准筛选步骤来进行。例如，这些筛选步骤中的一种—酵母双杂交程序可用来鉴定本发明的蛋白。同样，也可采用其它步骤，例如本领域熟知的亲和层析、DNA杂交程序，来分离、鉴定和特性分析本发明的B1蛋白，或用来分离、鉴定和特性分析能与本发明的蛋白结合的其它蛋白、因子、受体等。

此外，发现能结合本发明蛋白的蛋白质，其本身也能按上文或下文使用本发明蛋白的类似方式被利用，以分离、鉴别和特性分析其他蛋白质、因子等，这些蛋白质和因子等能结合本发明蛋白结合的蛋白，并代表了参与相关信号传导过程更下游的因子，或有它们的信号传导活性并因此代表了参与不同的信号传导过程的蛋白质。

本发明的DNA序列和所编码的蛋白质可用任何标准的重组DNA方法(参见例如Sambrook等人，1989)产生，方法是用合适的含有蛋白质编码序列的真核或原核载体转化合适的真核或原核宿主细胞。因此，本发明还涉及这些用于生产本发明蛋白的表达载体和转化的宿主细胞。如上所述，这些蛋白质还包括它们的生物活性类似物、其片段和衍生物，因此编码它们的载体也包括编码这些蛋白质的类似物和片段的载体，而转化的宿主包括那些产生这些类似物和片段的宿主。这些蛋白质的衍生物是由转化的宿主细胞产生的蛋白质、其类似物或片段通过标准修饰而产生的衍生物。

本发明还涉及调节B1介导的效应的药物组合物。该药物组合物含有一种或多种下列物质作为活性成分：(i)被亚克隆入合适的表达载体中的本发明的一种或多种DNA序列，或其部分；(ii)本发明的蛋白质、其生物活性片段、类似物、衍生物或它们的混合物；(iii)编码本发明蛋白质、其生物活性片段、类似物或衍生物的重组动物病毒载体。

该药物组合物可根据待治疗的疾病并以对病人有益的剂量(取决于体重和其他考虑因素)进行施用，这可以由医师来确定。

如上所述，B1可能是TRAF2的间接调节剂，因此它可能通过TRAF2-NIK-相互作用而参与NF-κB的激活。因此B1可能在细胞存活通道中起作用，使得TRAF2独立地或与其他蛋白质(如p55 TNF和p75 TNF受体、FAS/APO1受体、MORT-1、RIP和TRADD)一起发挥作用。在这方面，已认识到需要设计出能够增强或抑制TRAF2-NIK相互作用的药物是至关重要的。例如，当需要增加TNF诱导的细胞毒性时，就希望通过抑制TRAF2-NIK相互作用或通过特异性地抑制TRAF2和/或NIK来抑制NF-κB的诱导。同样，例如当需要抑制TNF诱导的细胞毒性时，就希望通过增强TRAF2-NIK相互作用或通过增强TRAF2和/或NIK特异性的NF-κB诱导作用来增强NF-κB的诱导。这类药物对许多疾病有很大帮助。这其中(请参见上面的论述)包括：急性肝炎，其中对肝脏的急性损伤似乎反映了在受Fas配体诱导后FAS/APO1受体介导的肝脏细胞死亡情况；自身免疫所诱导的细胞死亡，例如导致糖尿病的胰腺β郎格罕(Langerhans)细胞的死亡；在移植物排斥(如肾脏、心脏和肝脏)中的细胞死亡；在多发性硬化症中的脑少突胶质细胞死亡；和造成AIDS病毒的增殖并导致AIDS病的AIDS抑制的T细胞自杀。

在这些情况下，需要抑制FAS/APO1受体介导的细胞毒性(凋亡)通道，并通过TRAF2和TRAF2-NIK相互作用来增强FAS/APO1受体介导的NF-κB诱导。一种做法是增加细胞中NIK的数量，或者增加TRAF2和NIK的数量，这样将增加NIK或TRAF2-NIK-所介导的对NF-κB激活的诱导，从而提供了更高水平的NF-κB激活，因而使细胞存活更好；或者这样将增加FAS/APO1受体和TRAF2(或TRAF2-NIK)之间的直接或间接相互作用，结果使FAS/APO1受体与细胞毒中介体(如MACH，参见图2的示意图)的相互作用减少，从而提高NF-κB激活的诱导和细胞存活。

相反，例如在肿瘤和受感染细胞(参见上文的论述)的情况下，则需要增加FAS/APO1受体介导的细胞毒性，以增加细胞死亡。在这种情况下，就需要抑制FAS/APO1受体与TRAF2(或TRAF2-NIK)的相互作用和/或直接抑制NIK，从而减少对NF-κB活性的诱导。

由于本发明的B1蛋白可能与TRAF2有相互作用，因此它可能增强或抑制该相互作用，从而增强或抑制TRAF2的活性，尤其是增强或抑制TRAF2与NIK的相互作用以及相关的对NF-κB激活的诱导。B1和TRAF2之间相互作用的增强或抑制可能是直接的，或通过结合TRAF2以及可能通过和B1直接或间接相互作用的其它蛋白(如c-IAP1，c-IAP2)来实现。因此，通过侧重于B1蛋白并调节其与TRAF2之间可能的(直接或间接)相互作用，也可以调节TRAF2的活性，从而还能调节FAS/APO1(FAS-R)以及p55-TNF-R的效应(如上所述)。

另如上所述，B1可能直接作用于细胞死亡的中介体(即其蛋白水解活性导致细胞死亡的各种蛋白酶类)。因此，上述FAS/APO1(FAS-R)或p55 TNF-R效应可通过B1对蛋白酶类(如MACH和其它蛋白)的调节作用由B1来直接或间接调节，这些蛋白酶类与p55 TNF-R、FAS-R或其结合蛋白MORT-1相关并明显影响其介导的凋亡反应。因此，如果B1以增强这些蛋白酶类活性方式与它们相互作用，那么当如上所述需要细胞死亡时，这种相互作用应当增强，而当如上所述不需要细胞死亡时，这种相互作用应当抑制。

因此，鉴于上述内容，当不希望有这种相互作用时，可以筛选各种物质(如肽、有机化合物、抗体等)来获得能抑制B1与其它各种蛋白之间可能的相互作用的特异性药物。这些药物可能是特异性识别B1前结构域的那些药物，例如是与B1 CARD特异性结合并防止其与含有CARD的其它蛋白相互作用的肽、有机分子、抗体或抗体片段。相反，当需要B1与其它蛋白之间的这种相互作用时，可通过上文(i)中所述的标准程序增加细胞内B1的量来增强这种相互作用。在这里，还可以筛选能增强B1胞内活性或能增强其与其它蛋白相互作用的各种特异性药物。

另外，如上所述，B1还有一个激酶结构域可能涉及了其对发炎、细胞死亡或细胞存活通道的调节效应。因此，该激酶结构域可能起的作用是结合并磷酸化各种蛋白从而增加或减少它们的活性，这样就可能会增加或减少发炎、细胞死亡或细胞存活通道的活性。因此，当需要抑制或增强发炎、细胞死亡或存活通道时，可以筛选各种肽、有机化合物、抗体等来获得能抑制B1激酶活性的特异性药物。

如何来设计和筛选抑制B1通过其前结构域或激酶结构域与其它蛋白相互作用(如上所述)的肽抑制剂的非限制性实施例所根据的以前研究是：ICE或ICE样蛋白酶的肽抑制剂，ICE的底物特异性以及用肽合成法分析表位的策略。已发现，ICE有效切割肽的最低要求涉及切割位点左侧的4个氨基酸，并且在P₁位置强烈优选天冬氨酸，在P₁位的右侧有足够的甲胺(Sleath等，1990；Howard等，1991；Thornberry等，1992)。此外，一种缩写为Ac-DEVD-AMC的荧光底物肽(四肽)乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-甲基-香豆酰(coumaryl)-7-酰胺)，它对应于在FAS-R刺激后和其他凋亡过程(Kaufmann，1989；Kaufmann等，1993；Lazebnik等，1994)后不久在细胞中发现的被切割的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的序列，而且该底物被CPP32(CED3/ICE蛋白酶家族的一个成员)和MACH蛋白酶有效地切割。

因为底物P₁位的Asp显得很重要，因此可快速筛选第四个氨基酸残基为Asp而前3个残基位置有各种氨基酸组合的四肽是否与蛋白酶活性位点结合，例如采用Geysen开发的方法(Geysen，1985；Geysen等，1987)，在该方法中对固相载体上的大量肽进行筛选，确定它们是否与抗体有特异性的相互作用。MACH蛋白酶与特异性肽的结合可用本领域技术人员技术范围内各种熟知的检测方法(例如放射标记等)来检测。已表明，Geysen的这种方法每个工作日至少能测试4000种肽。

按类似的方式，确定B1与其它蛋白之间相互作用的确切结合区域或同源区域可以被阐明，然后可以筛选出能用于阻断该相互作用的肽，例如合成序列类似于结合区域或互补于结合区域的、能与天然B1竞争结合的肽，或是通过CARD或激酶结构域或者甚至是通过B1的CARD和激酶结构域之间的中间结构域与细胞死亡或细胞存活通道其它蛋白相互作用的肽。

因为设计出能选择性抑制B1相互作用而不干扰胞内信号传导通道其它成员参与的生理性细胞死亡或存活过程的肽抑制剂可能是有好处的，所以可以进一步合成上述试验中结合B1的肽库作为荧光底物肽，以测试B1与其它这些蛋白的选择性结合，只选出对B1有特异性的那些肽。然后可对经测定对例如B1的CARD或激酶结构域有特异性的肽进行修饰，以提高细胞通透性并可逆或不可逆地调节发炎、细胞死亡或细胞存活过程。Thornberry等(1994)报道了一种四肽(酰氧基)甲基酮Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH₂OC(O)-[2，6-(CF₃)]Ph，它是ICE的强效灭活剂。类似地，Milligan等(1995)报道说，具有氯甲基酮的四肽抑制剂(不可逆地)或具有醛基团的四肽抑制剂(可逆地)抑制ICE。此外，已表明苄氧基羧基-Asp-CH₂OC(O)-2，6-二氯苯(DCB)可抑制ICE(Mashima等，1995)。因此，以类似的方式，可以用例如醛基、氯甲基酮、(酰氧基)甲基酮或CH₂OC(O)-DCB基团对选择性结合(例如)B1的CARD或激酶结构域的四肽进行修饰，以产生B1活性的肽调节剂。另外，为了改进通透性，例如可对肽进行化学修饰或衍生，以增强它们通过细胞膜的通透性并使这些肽能传递通过膜进入细胞质。Muranishi等(1991)报道了用月桂酸衍生处理促甲状腺释放激素，形成一种亲脂的、具有良好的通过细胞膜性能的月桂酰衍生物。Zacharia等(1991)还报道了将甲硫氨酸氧化成亚砜并用其酮亚甲基异酯(COCH₂)(ketomethylene isoester)代替肽键，以帮助肽通过细胞膜。这些方法仅仅是本领域技术人员所知的修饰和衍生方法中的一些而已。

此外，能够(例如)通过干扰B1与任何蛋白(B1靠其CARD、激酶或中间结构域与该蛋白结合)之间的相互作用来抑制细胞死亡或细胞存活通道活性的药物或肽抑制剂可以与促进进入细胞的分子偶联或复合。

美国专利No.5,149,782公开了将待运输通过细胞膜的分子与膜共混剂(blending agent)偶连在一起，这些膜共混剂例如有融合性多肽、离子通道形成多肽、其他膜多肽、和长链脂肪酸如肉豆蔻酸和棕榈酸。这些膜共混剂将分子偶联物插入细胞膜的脂质双层中，并协助它们进入细胞质。

Low等的美国专利5,108,921回顾了通过受体介导的胞吞机制来跨膜运送分子(例如(但不局限于)蛋白质、核酸)的现有方法。这些受体系统包括识别下列物质的那些系统：半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、运铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白、钴胺传递蛋白(维生素B₁₂)、α-2巨球蛋白、胰岛素和其他肽生长因子如表皮生长因子(EGF)。Low等讲述了，营养物的受体(如生物素和叶酸的受体)可被有利地用于增强通过细胞膜的运输，因为在大多数细胞的膜表面上存在多种生物素和叶酸受体并且有相应受体介导的跨膜运输过程。因此，待输送入细胞质的化合物与配体(如生物素或叶酸)形成的复合物与具有生物素或叶酸受体的细胞膜接触之后，就启动了受体所介导的跨膜运输机制，从而允许所需化合物进入细胞。

已知ICE能容忍P₂位置上自由替换，而且对自由替换的这种容忍性可被加以利用，以开发出强效和高选择性的、含有生物素标记的亲和标记(Thornberry等，1994)。因此，可以对四肽抑制剂的P₂位以及可能的N-端进行修饰或衍生处理，例如添加生物素分子，从而提高这些肽抑制剂通过细胞膜的通透性。

此外，本领域中已经知道，可以使所需的肽序列与前导肽/信号肽序列融合，以产生“嵌合肽”，这就能使该“嵌合肽”穿膜运输进入细胞质。

正如肽领域技术人员所知道的那样，本发明上述的抑制B1与其它蛋白相互作用的肽抑制剂包括肽模拟型药物或抑制剂，它们也能被迅速筛选以确定是否和B1的CARD、激酶或中间结构域结合，从而设计出可能更稳定的抑制剂。

还应理解，上述用于协助或增强肽抑制剂运输通过细胞膜的相同手段，也可用于B1的类似物、片段或同种型，以及在细胞内发挥功效的其他B1特异性肽和蛋白质(包括融合蛋白)。

关于全文中提及的抗体，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、针对能够以可溶或固定形式被标记的抗体的抗独特型(抗-Id)抗体、以及用各种已知技术(例如(但并不限于)：酶切、肽合成或重组技术)所提供的它们的片段。

多克隆抗体是异质的抗体分子群体，它们来自用抗原免疫的动物血清。单克隆抗体含有基本上均质的、对抗原特异的抗体群，该群体含有基本相似的表位结合位点。单克隆抗体可用本领域技术人员已知的方法来获得。例如参见Kohler和Milstein，自然，256：495-497(1975)；美国专利No.4,376,110；Ausubel等编，Harlow和Lane，抗体：实验手册(ANTIBODIES：A LABORATORY MANUAL)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；和Colligan等编，Current Protocols inImmunology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience N.Y.，(1992-1996)，这些文献的内容都全部纳入本文作参考。这些抗体可以是任何种类的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何亚类。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以在体外、原位或体内培养。在体内或原位生产高滴度单克隆抗体的方法是目前较佳的生产方法。

嵌合抗体是这样一种分子，它的不同部分来自不同的动物物种，例如具有鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。嵌合抗体主要用于降低应用中的免疫原性以及增加产量，例如当鼠单克隆抗体在杂交瘤中有较高的产量但在人中具有较高免疫原性的情况下，可以使用这种人/鼠嵌合单克隆抗体。嵌合抗体及其生产方法是本领域中已知的(Cabilly等，美国科学院院报81：3273-3277(1984)；Morrison等，美国科学院院报81：6851-6855(1984)；Boulianne等，自然，312：643-646(1984)；Cabilly等，欧洲专利申请125023(1984年11月14日公开)；Neuberger等，自然，314：268-270(1985)；Taniguchi等，欧洲专利申请171496(1985年2月19日公开)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Neuberger等，PCT申请WO 8601533(1986年3月13日公开)；Kudo等，欧洲专利申请184187(1986年6月11日公开)；Sahagan等，J.Immunol.137：1066-1074(1986)；Robinson等，国际专利申请No.WO8702671(1987年5月7日公开)；Liu等，美国科学院院报84：3439-3443(1987)；Sun等，美国科学院院报84：214-218(1987)；Better等，科学240：1041-1043(1988)；以及Harlow和Lane，抗体：实验手册，同上)。这些文献全部纳入本文作参考。

抗独特型(抗-Id)抗体是这样一种抗体，它识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇。Id抗体可这样制得，免疫与单克隆抗体来源动物相同的物种和基因型的动物(例如小鼠品种)，其中该单克隆抗体就是制备的抗-Id所针对的。被免疫的动物会识别免疫用抗体的独特型决定簇，并通过产生针对这些独特型决定簇的抗体(抗-Id抗体)而进行应答。例如参见美国专利No.4,699,880，该专利全部纳入本文作参考。

抗-Id抗体还可用作“免疫原”，在另一动物中诱导免疫应答，产生所谓的抗-抗-Id抗体。该抗-抗-Id抗体可能与最初诱导抗-Id的单克隆抗体在表位上相同。因此，通过使用针对mAb独特型决定簇的抗体，就可鉴别出表达具有相同特异性的抗体的其它克隆。

因此，可用针对本发明的B1蛋白、其类似物、片段或衍生物而产生的单克隆抗体在合适的动物(如BALB/c小鼠)中诱导产生抗-Id抗体。可用该被免疫小鼠的脾细胞来产生分泌抗-Id mAb的抗-Id杂交瘤。此外，抗-Id单克隆抗体还可与载体(如匙孔  血蓝蛋白(KLH))偶联，并用于免疫其他的BALB/c小鼠。这些小鼠的血清含有抗-抗-Id抗体，该抗体具有最初单克隆抗体的结合特性，并对上述的B1蛋白、或其类似物、片段或衍生物的表位有特异性。

这样，抗-Id单克隆抗体具有它们自己的独特型表位，或有结构上与被评价表位相似的“独特位”(如GRB蛋白-a)。

术语“抗体”还包括完整的分子及其片段，例如能够结合抗原的Fab和F(ab′)₂。Fab和F(ab′)₂片段缺少完整抗体的Fc片段，能够更迅速地从循环系统中清除，并且与完整抗体相比具有更低的非特异性组织结合性(Wahl等，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。

应理解，根据本文公开的用于完整抗体分子的方法，本发明中有用的Fab和F(ab′)₂以及其他抗体片段也可用于检测和定量测定B1蛋白。这些片段通常可用木瓜酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)₂片段)进行蛋白水解切割来产生。

如果抗体能特异性地与某分子反应从而使该分子与抗体结合，那么就称该抗体“能够结合”该分子。术语“表位”指任何分子中能被抗体识别且还能被抗体结合的部分。表位或“抗原决定簇”通常由分子表面化学活性基团(如氨基酸或糖的侧链)构成，而且具有特异的三维结构特征和特异的电荷特征。

“抗原”是能被抗体结合、并且还能诱导动物产生能与该抗原表位结合的抗体的分子或分子一部分。抗原可具有一个或多个表位。上述特异反应指抗原会以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不会与大量由其他抗原产生的其他抗体反应。

本发明中有用的抗体(包括抗体片段)可用于定量或定性地检测样品中的B1蛋白，或检测表达本发明B1蛋白的细胞的存在与否。这可以用免疫荧光技术，利用荧光标记的抗体(见下文)并结合光学显微术、流式细胞计量术或荧光计量术检测而实现。

本发明中有用的抗体(或其片段)可在组织学上被采用，例如在免疫荧光或免疫电子显微术中，用来原位检测本发明的B1蛋白。原位检测可这样来实现：从患者体内取一份组织样品，然后将经标记的本发明抗体供给该样品。抗体(或其片段)的提供最好是通过将经标记的抗体(及其片段)施加或覆盖在生物样品上。通过采用这种步骤，不仅可以确定是否存在B1蛋白，而且还能确定其在受检组织中的分布。采用了本发明，一般技术人员容易知道，可对各种组织学方法(例如染色程序)加以改动来实现这种原位检测。

对于本发明B1蛋白的这些试验方法通常包括：使生物样品(如生物液体、组织抽提物、新收获的细胞(如淋巴细胞或白细胞)、或已经在组织培养中培育过的细胞)在能够鉴别B1蛋白的有可检测标记的抗体存在下进行培育，然后用本领域熟知的众多方法中的任一种方法检测抗体。

生物样品可以用固相支持物或载体(如硝酸纤维素、或能固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的其他固相支持物或载体)来处理。然后用合适的缓冲液洗涤支持物或载体，再根据本发明上述那样用有可检测标记的抗体进行处理。再用缓冲液第二次洗涤固相支持物或载体以除去未结合的抗体。然后可用常规方法检测所述固相支持物或载体上所结合的标记的量。

“固相支持物”、“固相载体”、“固体支持物”、“固体载体”、“支持物”或“载体”指能结合抗原或抗体的任何支持物或载体。熟知的支持物或载体包括：玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然的和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁石。出于本发明的目的，载体的特性可以是不溶的，或在某种程度上可溶。载体材料可以有实际上所有可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。因此，支持物或载体的构型可以是球形(如在玻珠内)、圆柱形(如试管的内表面或棒的外表面)。另外，表面可以是平坦的，例如板、测试条带等。较佳的支持物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员会知道用于结合抗体或抗原的其他许多合适的载体，或者能够通过常规实验来确定这些载体。

如上所述的本发明给定批次抗体的结合活性可以用众所周知的方法来测定。本领域技术人员能够通过常规实验来确定每次测定的操作条件和最佳试验条件。

其他的步骤，诸如洗涤、搅拌、振荡、过滤等，可增加到试验方法中，这些步骤都是常规的或是具体情况下所需的。

本发明的抗体能够被可检测地标记的一种方法是将该抗体与酶相连，然后用于酶免疫分析(EIA)。然后，当该酶与合适的底物接触时，酶会与底物反应，从而产生可被检测(例如通过分光光度分析、荧光分析、或肉眼观察)的化学物。可用于可检测地标记抗体的酶包括(但不局限于)：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱脂酶。采用酶的生色团底物，利用比色方法就可以完成检测。检测还可以通过将酶与底物反应的程度与类似制备的标准物进行肉眼比较来实现。

检测可用其他各种免疫试验实现。例如，通过放射活性标记抗体或抗体片段，就可以通过采用放射免疫分析(RIA)来检测R-PTP酶。关于RIA的清楚描述可在《分子生物学试验技术和生物化学》＂Laboratory Techniques and Biochemistryin Molecular Biology＂，Work，T.S.等，North Holland Publishing Company，NY(1978)中找到，尤其参见Chard，T.所写的标题为“An Introduction to Radioimmune Assayand Related Techniques(放射免疫分析和相关技术的介绍)”的章节，该文献纳入本文作参考。放射性同位素可用γ计数器或闪烁计数器等设备或通过放射性自显影来进行检测。

还可以用荧光化合物来标记本发明的抗体。当荧光标记的抗体暴露于适当波长的光下时，就能因荧光而检测出它的存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白(pycocyanin)、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。

抗体还可用发出荧光的金属(如¹⁵²E或其他镧系金属)进行可检测地标记。这些金属可通过这些金属的螯合基团(如二乙三胺五乙酸(ETPA))与抗体连接。

还可通过将抗体偶联化学发光化合物，对抗体进行可检测标记。然后，检测在化学反应过程中产生的发光存在来检测带有化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺(isoluminol)、热(theromatic)吖啶  酯、咪唑、吖啶  盐和草酸酯。

同样，还可以用生物发光化合物来标记本发明的抗体。生物发光是在生物系统中发现的一类化学发光物，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在可通过检测发光的存在来确定。用于标记目的的重要的生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。

本发明的抗体分子可适应用于免疫计量试验，也称为“双位点”或“夹心”试验。在典型的免疫计量试验中，将一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合于固相支持物或载体上，加入一定量的带可检测标记的可溶抗体，从而可以检测和/或定量分析在固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。

典型的且较佳的免疫计量试验包括“正向”试验，在该试验中与固相结合的抗体先与待测试样品接触，通过形成二元固相抗体-抗原复合物，将抗原从样品中抽提出。在培育合适的时间后，洗涤固相支持物或载体以去除液体样品残余物(包括未反应的抗原，如果有的话)，然后再与含有未知量的标记抗体(其功能为“报道分子”)的溶液接触。在第二次培育使标记抗体通过未标记抗体与结合于固相支持物或载体上的抗原复合后，第二次洗涤固相支持物或载体，除去未反应的标记抗体。

在另一种“夹心”试验(该试验也可与本发明的抗原一起使用)中，使用所谓的“同时”和“反向”测定。“同时”测定涉及一次培育步骤，因为和固相支持物或载体结合的抗体和标记抗体被同时加入到测试样品中。在培育结束后，洗涤固体支持物或载体以除去液体样品残余物和未复合的标记抗体。然后象常规的“正向”夹心测定那样，测定与固相支持物或载体结合的标记抗体的存在。

在“反向”测定中，分步先将标记抗体溶液加至液体样品中，然后在培育适当时间后，再加入结合于固相支持物或载体上的未标记抗体。在第二次培育后，以常规方式洗涤固相载体，使其不含被测试样品的残余物和未反应的标记抗体溶液。然后再象“同时”或“正向”测定那样，测定与固相支持物或载体结合的标记抗体的存在。

如上所述，本发明还涉及含有重组动物病毒载体的药物组合物，该载体编码B1蛋白，还编码能结合特定靶细胞(如癌细胞)表面蛋白的病毒表面蛋白，从而能引导B1蛋白序列插入到该细胞中。本发明的其它药物组合物含有下列物质作为活性成分：(a)编码B1蛋白序列的反义序列的寡核苷酸序列；或(b)阻断B1与其它蛋白相互作用的药物。

本发明的药物组合物含有足量的活性成分以达到其所需目的。此外，药物组合物还含有合适的药学上可接受的载体，包括赋形剂和辅助剂，它们可协助将活性化合物加工成可作为药物使用的制剂，并且它们可使这些制剂更稳定，以便给予需要的对象，这些都是本领域技术人员熟知的。

怀疑B1蛋白及其同工型或同种型在不同组织中表达的水平明显不同，其同种型的方式也明显不同，这与上文列出的共同拥有的待批专利申请中所述的参与胞内信号传导通道的其它各种蛋白的表达方式类似。这些差别可能导致了其对Fas/APO1-配体和TNF应答反应的组织特异性。至于其它CED3/ICE同系物(Wang等，1994；Alnermri等，1995)，本发明者早先就在上述专利申请中表明，发现含有不完全CED3/ICE区域的MACH同种型(例如MACHα3)对共同表达的MACHα1或MACHα2分子的活性有抑制作用；还发现它们阻断了Fas/APO1和p55-R(p55-TNF-R)的死亡诱导作用。这些抑制性同种型在细胞中的表达可能构成了细胞自我保护抵抗Fas/APO1和TNF介导的细胞毒性的机制。MACH同种型具有广泛的异质性，该异质性大大超出了CED3/ICE家族其它蛋白酶所见的异质性，应能特别精细地调节活性MACH同种型的功能。还知道BCL2、BCL-X_L和BCL2家族的其它成员在不同细胞类型中表达和活泼的程度不同，从而使不同细胞对诱导的凋亡作用的易感性有差所不同，即一些细胞比其它细胞更可能存活(见Yang和Korsmeyer，1996年的综述)。

如上所述，B1蛋白或其可能的同种型在不同组织中可能有不同的作用。例如，这些不同的作用可能表现在其与发炎、细胞死亡或细胞存活过程中的其它蛋白的相互作用，以及它们对这些通道活性的影响，尤其是它们之间的平衡以及该平衡是否会向一个或另一方向移动。

一些可能的B1蛋白同种型还有可能起其它作用。例如，B1、其类似物、同种型可能也作为参与和上述细胞死亡或存活通道无关的其它胞内通道的分子的停靠位点。

由于Fas/APO1和TNF受体能独特地引起细胞死亡，以及TNF受体能引发其它各种组织破坏性活性，因此这些受体的功能畸变对生物体特别有害。实际上，这些受体的功能过度和不足均已表明会导致各种疾病的病理表现(Vassalli，1992；Nagata和Golstein，1995)。鉴定参与受体信号传导活性的分子，以及寻找方法来调节这些分子的活性，这些都能引出新的治疗方法。由于怀疑TRAF蛋白有重要作用，因此怀疑可能直接或间接与TRAF蛋白相互作用的B1蛋白有重要作用，或怀疑B1和各种蛋白酶类之间有相互作用，所以，设计出能影响或调节B1和B1相互作用于的其它这些蛋白之间的相互作用、从而按需增强或抑制细胞死亡或细胞存活的药物似乎尤其重要。

本发明还涉及可能结合本发明B1蛋白从而调节/介导B1蛋白活性的蛋白或其它配体。这些蛋白或配体可用上述任何方法来筛选、分离和产生。例如，可以分离出许多新的配体，包括能与本发明B1蛋白结合蛋白。

如上所述，这些新的B1结合蛋白/配体可能作为(例如)B1介导活性的抑制剂或增强剂起作用，因此它们会在上述各种病理和其它场合中起重要作用。这些B1结合蛋白/配体的另一个功能是用作纯化B1蛋白的特异性试剂，例如在亲和层析中，这些新的结合蛋白/配体与合适的层析基质连接形成固体或亲和性支持物/基质，含有B1蛋白的溶液、抽提物等通过该基质，从而实现蛋白纯化。这种亲和层析方法现在是本领域中熟知的且通常是标准程序。

同样，所有上述的本发明的B1蛋白、其类似物、片段、同种型和衍生物均可用来亲和纯化它们所结合的发炎、细胞死亡或存活通道的各种蛋白。例如，B1蛋白及其类似物、片段和突变蛋白可用来亲和层析纯化B1结合蛋白。鉴别和产生这些B1结合蛋白的这种方法将包括一个筛选步骤，其中将B1蛋白或至少其特异性部分用作底物或“诱饵”来获得能与之结合的蛋白或其它任何配体；然后是鉴别和特性分析这些所获得的这些蛋白/配体的步骤；随后以基本上分离和纯化的形式产生这些蛋白/配体。所有这些步骤均是本领域技术人员所熟知的，并在上文和下文中有详细描述。

现在本发明将在下列非限制性实施例及其附图中作更详细地描述。

还应注意，下列步骤在本发明者以前关于其它胞内信号传导蛋白和通道的出版物中已有详细描述：i)双杂交筛选和双杂交半乳糖苷酶表达测试；ii)蛋白质的诱导表达、代谢性标记和免疫沉淀；iii)体外结合；iv)细胞毒性的测定；v)Northern分析和序列分析，还有下列实施例中采用的其它程序。这些程序在共同拥有的待批以色列申请No.114615，114986，115319，116588，117932和120367以及相应的PCT申请No.PCT/US96/10521中有详细描述。因此，所有这些出版物和专利申请的全部公开内容均全部被纳入本文作参考，至少涉及其详细的试验步骤。关于NIK蛋白及其在激活NF-κB中的作用，以及细胞存活和TRAF2在该细胞存活通道中所起的作用，例如TRAF2和p55-R、FAS-R、RIP和其它蛋白之间的相互作用，本发明者在上述共同拥有的待批IL和PCT申请以及Malinin等人，1997年中均已详细描述。

实施例1：新的B1蛋白的分离、测序和部分特性分析

利用上述共同拥有的专利申请中描述的各种方法，已经分离出一种新的克隆的DNA，并进行了测序和部分特性分析。该DNA序列编码了一种新的蛋白，该蛋白原先由于与c-IAP蛋白同源且具有激酶结构域而被称为c-IAP结合激酶(CBK)，但是现在命名为B1。

简言之，为了进一步阐述最近发现的凋亡同系物c-IAP1和c-IAP2的细胞抑制剂(见Rothe等人，1995；Uren等人，1996；Hofmann等人，1997)的胞内活性以及它们和哪些胞内蛋白相互作用，用c-IAP序列来筛选各种数据库(包括具有未鉴定(且未完全测序)的表达序列标记(est)的数据库)中其它可能的同源的或相关的序列。这样，就发现一种新的克隆的部分序列与c-IAP1高度同源。采用这种以前没有作过任何特性分析的部分序列，制备PCR引物，用商业上获得的cDNA文库作为模板DNA来PCR克隆该新克隆的全长DNA序列。

结果，获得一个新的全长DNA克隆，该克隆编码了以前未知的蛋白，即命名为B1的新蛋白。首先确定了B1的序列(DNA和氨基酸)。对最初的B1序列作进一步分析和测定，结果揭示氨基酸序列N端部分(核苷酸序列的5′末端)有一些差异，其涉及前19个推定的氨基酸残基。进一步测序确定和分析产生了分别如图3A和B所示的推定的B1氨基酸序列及其核苷酸编码序列。

在分析了图3的氨基酸序列后，发现蛋白的N末端有一个激酶基序，该基序由图3的核苷酸序列开放读框(ORF)前面约1000个核苷酸编码。另外，在朝向氨基酸序列C端有一个前结构域(CARD)结构，该结构是参与凋亡信号传导通道的许多胞内蛋白(如c-IAP1，RAIDD(见Duan和Dixit，1997)、以及其它蛋白酶类如ICE和ICH-1)都具有的。在图3A所示的B1的氨基酸序列中，显示出了N端激酶结构域(有方框的区域)以及C端CARD(下划线表示的区域)。在这两个结构域之间是B1蛋白的中间结构域。

B1的上述激酶结构域与已知的RAF类激酶和RIP激酶结构域有高度同源性(或相似性)。

B1的上述前结构域最近也被命名为CARD(蛋白酶类募集结构域＂caspaserecruitment domain＂)(见Hofmann等人，1997)，它看来是细胞内凋亡信号传导过程中各种蛋白所相互作用的区域。例如，没有前结构域(或CARD)的p55 TNF-R通过它与TRADD两种蛋白都具有的死亡结构域(death domain)与另一个胞内蛋白TRADD(一种衔接蛋白)相互作用。进而，TRADD能与RIP和RAIDD(另一些此类衔接蛋白，另见Hofmann等人，1997；Duan和Dixit，1997；Wallach，1997)相互作用，所有这些蛋白均具有死亡结构域，因此，p55-TNF-R能通过死亡结构域与RAIDD直接或间接复合。RAIDD具有能与一种或多种蛋白酶类(如ICH-1(蛋白酶类-2))相互作用或结合的前结构域(或CARD)(可能还有其它蛋白)，因而能将p55-TNF-R与这些蛋白酶类连接，并通过蛋白酶类的作用引起凋亡。同样，p75-TNF-R能通过共有基序与TRAF2和TRAF1蛋白相互作用，而TRAF蛋白能与c-IAP1和c-IAP2相互作用。按类似的方式(另见Malinin等人，1997，WO97/37016)，利用FAS-R(Fas/APO1)能与MORT1(FADD)相互作用、进而与TRADD相互作用(均通过它们共有的死亡结构域)的能力，因此，TRADD与TRAF2、MORT1相互作用的能力能与c-IAP1、c-IAP2(通过TRAF2)相联，从而与ICE、Mch6和其它蛋白酶类关联，或与ICH-1、FLICE、MACH或其它蛋白酶类(通过上述TRADD-RIP-RAIDD相互作用)连接。还应注意，p55 TNF-R还能通过上述TRADD-TRAF2-cIAP1、c-IAP2-ICE、Mch6的相互作用与ICE、Mch6和其它这类蛋白酶类连接，这利用的是p55 TNF-R与TRADD相互作用的能力。

另外，已经知道，TRAF2还通过诱导NF-κB激活参与促进细胞存活的一个或多个胞内通道。在这些通道中，NIK似乎直接参与I-κB的磷酸化，导致I-κB与NF-κB解离，从而激活NF-κB，然后NF-κB能进入细胞核并启动各种基因的转录(这些基因的表达与细胞存活相联)(另见上文“背景技术”部分)。

因此，TRAF2参与了细胞死亡和细胞存活通道，并且取决于在应答各种外部刺激(例如结合各种受体的配体)期间与TRAF2起主要相互作用的是何种蛋白，细胞可能经历细胞死亡或细胞存活诱导。显然，在各种胞内信号传导蛋白之间有精妙的平衡，该平衡能向相反的细胞死亡或细胞存活通道移动，而TRAF2似乎是维持这一平衡并负责该平衡向一个方向或另一个方向移动的一种关键蛋白。

在图1中示出了TRAF2蛋白及其各个结构域的结构，在图2中示出了一些各种细胞受体和胞内信号传导蛋白之间可能的相互作用以及它们参与的细胞死亡或细胞存活(NF-κB激活)通道。

因此，本发明的新的B1蛋白很有可能在发炎、细胞死亡和细胞存活通道中起重要的调节作用。B1具有的前结构域(或CARD结构域)可能甚至能与c-IAP1、c-IAP2、RAIDD以及各种蛋白酶类(ICE、ICH-1等)的前结构域间接地相互作用，因此它甚至可能与TRAF2以及与TRAF2直接或间接相互作用的各种蛋白(包括RIP、TRADD、p75 TNF-R、p55 TNF-R、MORT-1和FAS-R)间接地相互作用。B1还具有激酶结构域，因此它可能直接或间接参与了MAP激酶通道(NIK似乎是该通道的一员)，从而还可能参与NF-κB激活通道。

另外，B1凭借其与c-IAP1的同源性还可能通过调节c-IAP1的生物活性或调节c-IAP1与其它蛋白的结合可能是c-IAP1(和c-IAP2)活性的调节剂。在这方面(另见下文实施例2)，B1通过间接地与c-IAP蛋白(c-IAP1，c-IAP2)相互作用、破坏或减少c-IAP1蛋白募集蛋白酶类的能力和限制其蛋白水解活性，结果是更多蛋白酶类能自由地进行蛋白水解作用，B1也可能起增强凋亡作用。

另一个可能性是，B1通过其上述能力与细胞死亡的各种中介体(包括TRAF-1和TRAF2、RAIDD、RIP、TRADD、p55-TNF-R、p75-TNF-R、MORT-1和FAS-R)直接或间接相互作用；并和各种蛋白酶类相互作用，可能起关联这些蛋白和蛋白酶类的作用，从而可能起这些蛋白所属细胞死亡通道的中间因子作用。因此，B1可能是凋亡的重要中介体。

还有一个可能是，通过如上所述的B1可能与c-IAP蛋白的相互作用(即使是间接的)，B1可能阻止c-IAP与TRAF2结合或相互作用，从而可能阻断TRAF2对于MAP激酶通道的活性，例如，TRAF2-c-IAP相互作用可能对TRAF2与NIK的相互作用很重要，如果该作用被B1与c-IAP的相互作用所抑制，那么TRAF2介导的NF-κB激活作用就可能被阻断，从而导致细胞存活作用增强减小，而细胞死亡作用则可能增加。

还有一个可能是，B1可能以更直接的方式调节各种蛋白酶类的活性。因此，通过B1和各种蛋白酶类的前结构域之间的直接或间接相互作用，B1可能会导致这些酶活性增加，从而增加了这些酶的细胞毒性。这样，B1就可能通过募集或激活蛋白酶类来直接增强凋亡作用(另见下文实施例2)。

另一个可能是，B1的作用可能是通过与其它未知的蛋白结合或相互作用来调节介导细胞死亡或细胞存活的胞内信号传导通道。

感兴趣的是，注意到(见上文)B1具有类似于RIP激酶的激酶结构域。RIP也是涉及细胞死亡和细胞存活通道之间平衡的一个关键蛋白，其利用的是其连接细胞死亡中介体(如p55 TNF-R、FAS-R、MORT-1、TRADD)和TRAF2，从而激活NF-κB和细胞存活的能力(见图2)。RIP激酶活性可能也是该精确平衡中的一个因素，这取决于该激酶结合何种底物，例如，何种蛋白被RIP磷酸化，并且这种磷酸化是否影响它们对增加凋亡活性、减少凋亡活性、增加NF-κB激活或减少NF-κB激活的活性。类似地，B1还可能在其激酶活性可能是很重要(这取决于该激酶活性的底物是何种蛋白)的过程中起关键作用。

实施例2：B1蛋白的生物活性分析

(i)初步的结合试验以确定哪些已知的蛋白能结合B1

用WO 97/37016中制备并表达DNA构建物的方法以及酵母双杂交结合试验，用B1的构建物来测试它结合参与胞内信号传导通道(细胞死亡和存活通道)的各种已知蛋白的能力，该B1的激酶结构域已被除去，即是仅具有中间区域和C-端CARD区域的截短的B1。最初的初步结果(未显示)看来表明，该截短的B1与BCL2结合。

(ii)细胞毒性分析来确定B1对细胞死亡和细胞存活的效应

采用WO97/37016中制备DNA构建物的方法、用构建物转染/转化细胞的方法、和测定这些构建物的表达产物对细胞死亡和细胞存活的影响的方法，用编码全长B1蛋白的DNA构建物转染培养物中的细胞。另外，在另一组试验中，用编码B1的构建物和编码FAS-R、p55 TNF-R和RIP的其它构建物共转染细胞。

这些转染的结果(未示出)表明，表达的B1蛋白本身不会引起细胞死亡。然而，当B1和FAS-R、p55 TNF-R或RIP一起表达时，它增强了这些已知的细胞死亡诱导剂诱导的细胞死亡水平。

将这些结果与上文(i)的结果(B1可能结合BCL2)结合在一起，提出了这样的可能性，即B1可能作为BCL2活性的抑制剂起作用，即B1可能抑制BCL2保护细胞抵抗凋亡的活性(见上文“背景”部分)，因此，B1显然能增强FAS-R、p55TNF-R和RIP、以及细胞死亡的其它可能的诱导物(如上文“背景”部分所描述的)诱导的细胞死亡通道。在这一方面，B1可能按类似于BAD蛋白的方式作用，BDA蛋白是BCL2家族的一个成员，它与BCL2和BCL-X_L结合，从而导致已知直接参与导致细胞死亡的BAX和BAK的水平增加。另一种可能是，B1可能利用其激酶结构域在BCL2的磷酸化位点上使BCL2磷酸化，这样它就可能影响BCL2保护细胞抵抗凋亡的活性，最终导致所见的B1效应是增强了诱导的细胞死亡。

另外，除了与BCL2可能有相互作用、影响NF-κB激活的诱导(这通过B1的激酶活性作用于导致NF-κB激活的通道)外，B1还有可能与(例如)NIK或NIK为成员的通道中的其它激酶相互作用，或它可能作用于与其相关的其它衔接蛋白(例如TRAF2)，从而导致NF-κB激活减少，并最终减少细胞存活，增加细胞死亡。

因此，总之，看来B1在胞内信号传导通道(无论它们是否导致发炎、细胞死亡或细胞存活)的调节中起作用。因此，B1可被认为是“胞内信号传导的调节剂”，因为它显然具有通过多种方式来影响发炎、细胞死亡和细胞存活通道的能力，这些方式是直接的(募集各种蛋白并激活或抑制它们或通过激酶活性)或间接的(通过与其它各种中间物相互作用，例如BCL2可能还有c-IAP，从而与TRAF2等相互作用；或与RAIDD相互作用，从而与RIP、TRADD等相互作用)。

实施例3：B1生物活性的其它分析

NF-κB活性、细胞死亡试验、Northern分析和JNK活性试验用下列B1和B1突变型构建物(见图6)进行。

B1(见实施例1)

B1 mut：B1的突变体，47位的赖氨酸被丙氨酸代替

ΔCARD：缺少CARD结构域的B1，它通过PCR产生并克隆到表达载体中

ΔXba：缺少CARD结构域但其3′端比ΔCARD短的B1，用限制性位点产生并克隆到表达载体中

ΔBam：以ΔXba类似，并以类似方式用Bam限制性酶产生，

ΔNde：含有激酶结构域的一部分以及CARD结构域，用PCR产生并克隆到表达载体中，和

ΔK，用下列引物通过PCR产生：

1.5′-CAGA ATTCCA GAGTG TTTCA AGTG CCATTC；

2.5′-AACTC GAGA CTTAC ATGCT TTTA TTTT GAA。

将PCR片段克隆到表达载体中并测序确认。

NF-κB激活测定用WO97/37016中描述的报道基因试验进行。简言之，用HIV LTR-萤光素酶基因质粒(1微克)和B1及B1突变体表达载体(3微克)共转染细胞。加入“空”的载体使转染的DNA的量保持恒定。转染24小时后，用PBS洗涤细胞并裂解。如Ausubel等人的Current Protocols in Molecular Biology中描述的那样进行萤光素酶试验。结果可以从图6中看出。

用生长于Dulbecco改进的Eagle最小基本培养基(其中添加了10％胎牛血清、非必需氨基酸、100U/毫升青霉素和100微克/毫升链霉素)中的293-T细胞，进行细胞死亡试验。用磷酸钙沉淀方法，用不同构建物的cDNA和β-半乳糖苷酶一起瞬时转染293-T细胞(6厘米平皿中5×10⁵细胞)。在试验中，每一平皿用1微克p55 TNF-R、RIP或TRADD构建物、1微克各种B1或B1突变体构建物(或空载体作为对照)、以及1微克pSV-β-gal(Promega)转染，结果显示在下图6中。在培育期最后，通过测定β-半乳糖苷酶表达(如Boldin等人，1996所述)来评价细胞死亡的程度。

Northern分析用常规方法进行，例如参见Boldin等人，1995，结果表明B1存在于许多人组织中(图4)。

JNK激活通过用磷酸钙沉淀方法用1.5微克pSV-HA-JNK1构建物(一种HA表位标记的JNK-1表达载体)和4微克各种B1和B1突变体构建物表达载体瞬时转染293-T细胞(6厘米平皿中5×10⁵细胞)来进行。24小时后，在裂解缓冲液(20mMHepes pH7.6，10mM EGTA，40mM β-甘油磷酸酯，.5mM MgCl₂，1mM DTT和1％NP-40)中裂解细胞，用抗HA抗体免疫沉淀Ha-JNK1蛋白(例如参见Rothe等人，1995b)。(克隆12 CA5)。激酶试验在30微升激酶缓冲液(20mM Hepes pH7.6，40mMβ-甘油磷酸酯，2.0mM MgCl₂，2mM DTT，3nmole ATP和3μCiγ-p³²-ATP)中30℃进行20分钟。用细菌产生的GST-Jun蛋白(约10微克)作为底物。加入2x SDS加样缓冲液终止反应，沸腾3分钟，用SDS-PAGE凝胶分析。结果显示在图7中。

图6结果表明，B1能直接诱导NF-κB激活。然而，发现B1必然还诱导NF-κB，该激活作用看来不依赖其激酶结构域，据推测它可能与CARD结构域有关，有或没有部分或全部B1中间结构域的贡献。

另外，细胞毒性分析还表明，不仅是B1(见实施例2(ii))、而且B1 mut，当其和p55-TNF-R、RIP或TRADD一起表达时，增强了细胞死亡的水平。ΔCARD、ΔNde和ΔK此作用的程度较低，而其它构建物则没有。这似乎表明，至少是CARD结构域(可能还有中间结构域)参与了细胞死亡的增强作用。

JNK激活的结果还似乎表明，至少CARD结构域参与该激活作用，中间结构域也可能一起参与。

除了上述内容外，进行的试验已经表明B1会自身磷酸化。这是B1确实是激酶的一个证据。

另外，已经确认B1与RIP有同源性。计算机分析表明，这两种蛋白在氨基酸水平上有37％的相同性和47％的同源性。现已广泛认为RIP主要是NF-κB调节剂，上述结果表明B1的作用类似。

实施例4：结合特性

B1及其突变体的结合特性显示在下列表VI中：

                         表VI

DNA结合的杂交物	激活杂交物	LacZ
			B1	B1	+++
B1	ΔK	+++
			ΔK	B1	+++
ΔK	ΔK	+++
			B1	TRAF2	-
B1	TRAF3	-
			B1	TRAF6	-
TRAF2	B1	-
			TRAF6	B1	+
TRAF1	B1	-
			B1	TANK	-
B1	NIK	-
			NIK	B1	-
B1	CASH	-
			CASH	B1	-

B1	RIP	-
			B1	RAIDD	-
B1	ICE	-
			B1	ICH-1	-
B1	MACHα1(C360S)	-
			B1	MORT-1	-
B1	cIAP-1	-
			cIAP-1	B1	+
RIP	B1	-
			RAIDD	B1	-
ICE	B1	-
			ICH-1	B1	-
MACHα1(C360S)	B1	-

从上表显示结果看出，当B1的作用是诱导NF-κB激活时，它进行这种作用可能不依赖于和已知参与NF-κB激活的其它蛋白(如IRAK、TRAF2、NIK、TRAF6和RIP)的结合。因此，B1可能通过与形成该激活通道的其它一些蛋白相互作用来直接或间接地诱导NF-κB激活。

就B1所见的增强细胞死亡的活性而言，从上表还看出，B1进行这种作用并非是直接与各种细胞死亡中介体(例如p55 TNF-R、Fas-R、MORT1、TRADD、RIP、ICE、ICH-1等)相互作用。

因此，B1还可能通过与这些不同的细胞死亡中介体/调节剂间接地相互作用或通过其它蛋白发挥其增强细胞死亡的功能。

鉴于B1参与了NF-κB的激活以及增强细胞死亡，因此，B1可能是参与导致细胞死亡或细胞存活的胞内通道之间精确平衡的一种关键蛋白。在这方面，B1可能能使细胞死亡和细胞存活间的平衡移动(这取决于它与何种蛋白相互作用)。

用磷酸钙程序，用10微克编码HA-标记的B1蛋白(HA-B1)的质粒以及10微克编码Flag标记的B1蛋白(FL-B1)的质粒、或编码Flag-标记的c-IAP1-蛋白(FL-IAP1)的质粒、或编码Flag标记的TRAF1(FL-TRAF1)的质粒、或编码Flag-标记的TRAF2(FL-TRAF2)的质粒、或和10微克Flag标记的TRAF1和未标记的TRAF2(FL-TR1+TR2)的组合(1∶1)、或和10微克Flag-标记的TRAF1、未标记的TRAF2和c-IAP-1(FL-TR1+TR2+IAP1)的组合(1∶1∶1)瞬时转染293人胚胎肾细胞(5×10⁶；2.5×10⁶/每10厘米平皿)。7小时后，洗涤转染细胞，18小时后在含50mMHEPES pH7.5，250mM NaCl，0.2％NP-40，5mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氟、2.0微克/毫升抑酶肽和20微克/毫升亮抑酶肽的缓冲液(裂解缓冲液)中裂解细胞。使1毫升裂解液等份与抗FLAG表位抗体(5微克/等份)与蛋白G-琼脂糖珠(30微升/等份)一起4℃培育2小时，进行免疫沉淀。用裂解缓冲液洗涤免疫沉淀物三次，用PBS洗涤一次，用10％ SDS-PAGE分级，并转移到硝酸纤维素膜(Schleicher &Schuell，Dassel，Germany)上。用抗HA表位单克隆抗体进行Western印迹分析，采用1∶1000的稀释度和ECL试剂盒(Amersham，Buckinghamshire，England)。

从图8明显可以看出，B1能自身缔合，并能和TRAF1相互作用。相互作用的水平似乎与自身缔合的水平相同。没有发现有和TRAF-2或IAP1直接相互作用。

实施例5 B1结合V-ATP酶的E亚单位

用B1的CARD结构域作为诱饵进行双杂交筛选导致克隆出V-ATP酶的E亚单位(Nelson等人，Experientia 52(1996)1101-1110页)。

将V-ATP酶的E亚单位用荧光标记并在有机分子或肽文库的各种样品存在下和B1的CARD结构域样品一起培育。培育后，B1-CARD基序与特异性抗体发生免疫沉淀，测定与该沉淀相关的荧光量。进一步检查发现了干扰荧光标记的E蛋白沉淀的分子，作为潜在的先导化合物和通过ATP酶E亚单位的作用影响细胞存活或生长和/或发炎的药物。

在全部描述了本发明后，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的思路和范围下，无需过多的实验就可在等同的参数、浓度和条件的广泛范围内进行同样的工作。

尽管本发明已经联系其具体实例作了描述，但是应当知道它还能作进一步的改进。本申请应当覆盖：大致上根据本发明原理、本文公开的内容、利用本发明所属领域已知或常规技术以及如下文所附权利要求范围内提出的必要特征所作的任何变化、用途或改进。

本文中引用的所有文献，包括期刊杂志或摘要、出版的或对应的美国或外国专利申请、授权的美国或外国专利、或任何其它文献，包括引用文献中列举的所有数据、图表和文本，均全部纳入本文作参考。另外，本文引用的文献中所引用的文献的全部内容也全部纳入本文作参考。

参考已知的步骤、常规的步骤、已知的方法或常规方法并不以任何方式表示承认本发明的各个方面、描述或实例已在相关技术领域予以公开、指导或提示。

前述具体实例的描述将完全揭示本发明的总特征，在不脱离本发明的总思路下，其它人可运用本领域技术人员所知的知识(包括本文引用的内容和参考文献)无需过多实验就很容易对这些具体的实例作变化和/或改进用于各种用途。因此，基于本文的理论和指导，这些变化和改进均应在本文所公开的实例的等价意义和范围内。应当理解，本文的措词或术语均只是为了便于描述，而非限制性，因此本说明书的措词或术语可由本领域技术人员根据本文的理论和指导结合本领域普通技术人员的知识来作解释。

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                        序列表(1)一般信息：

(i)申请人：

    (A)姓名：依达研究发展有限公司

    (B)街道：WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE，P.O.B.95

    (C)城市：REHOVOT

    (E)国家：ISRAEL

    (F)邮政编码(邮编)：76100

    (G)电话：972-8-9344093

    (H)电传：972-8-9470739

    (A)姓名：WALLACH，DAVID

    (B)街道：24 BOROCHOV STREET

    (C)城市：REHOVOT

    (E)国家：ISRAEL

    (F)邮政编码(邮编)：76406

    (A)姓名：BOLDIN，MARK

    (B)街道：BEIT CLORE，WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE

    (C)城市：REHOVOT

    (E)国家：ISRAEL

    (F)邮政编码(邮编)：76100

    (A)姓名：MALININ，NIKOLAI

    (B)街道：BEIT CLORE，WEIZMANN INSTITUTE OF SCIENCE

    (C)城市：REHOVOT

    (E)国家：ISRAEL

    (F)邮政编码(邮编)：76100

(ii)发明名称：胞内发炎、细胞死亡和细胞存活通道的调节剂

(iii)序列数目：2

(iv)计算机可读形式：

    (A)记录介质类型：软盘

    (B)计算机：IBM PC兼容型

    (C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

    (D)软件：PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)

(vi)在先申请资料：

    (A)申请号：IL121011

    (B)申请日：1997年6月5日

(vi)在先申请资料：

    (A)申请号：IL121199

    (B)申请日：1997年6月30日

(vi)在先申请资料：

    (A)申请号：IL121746

    (B)申请日：1997年9月11日(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：540氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：蛋白质

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：Met Asn Gly Glu Ala Ile Cys Ser Ala Leu Pro Thr Ile Pro Tyr His1               5                    10                  15Lys Leu Ala Asp Leu Arg Tyr Leu Ser Arg Gly Ala Ser Gly Thr Val

        20                  25                  30Ser Ser Ala Arg His Ala Asp Trp Arg Val Gln Val Ala Val Lys His

    35                  40                  45Leu His Ile His Thr Pro Leu Leu Asp Ser Glu Arg Lys Asp Val Leu

50                  55                  60Arg Glu Ala Glu Ile Leu His Lys Ala Arg Phe Ser Tyr Ile Phe Pro65                  70                  75                  80Ile Leu Gly Ile Cys Asn Glu Pro Glu Phe Leu Gly Ile Val Thr Glu

            85                  90                  95Tyr Met Pro Asn Gly Ser Leu Asn Glu Leu Leu His Arg Lys Thr Glu

        100                 105                 110Tyr Pro Asp Val Ala Trp Pro Leu Arg Phe Arg Ile Leu His Glu Ile

    115                 120                 125Ala Leu Gly Val Asn Tyr Leu His Asn Met Thr Pro Pro Leu Leu His

130                 135                 140His Asp Leu Lys Thr Gln Asn Ile Leu Leu Asp Asn Glu Phe His Val145                 150                 155                 160Lys Ile Ala Asp Phe Gly Leu Ser Lys Trp Arg Met Met Ser Leu Ser

            165                 170                 175Gln Ser Arg Ser Ser Lys Ser Ala Pro Glu Gly Gly Thr Ile Ile Tyr

        180                 185                 190Met Pro Pro Glu Asn Tyr Glu Pro Gly Gln Lys Ser Arg Ala Ser Ile

    195                 200                 205Lys His Asp Ile Tyr Ser Tyr Ala Val Ile Thr Trp Glu Val Leu Ser

210                 215                 220Arg Lys Gln Pro Phe Glu Asp Val Thr Asn Pro Leu Gln Ile Met Tyr225                 230                 235                 240Ser Val Ser Gln Gly His Arg Pro Val Ile Asn Glu Glu Ser Leu Pro

            245                 250                 255Tyr Asp Ile Pro His Arg Ala Arg Met Ile Ser Leu Ile Glu Ser Gly

        260                 265                 270Trp Ala Gln Asn Pro Asp Glu Arg Pro Ser Phe Leu Lys Cys Leu Ile

    275                 280                 285Glu Leu Glu Pro Val Leu Arg Thr Phe Glu Glu Ile Thr Phe Leu Glu

290                 295                 300Ala Val Ile Gln Leu Lys Lys Thr Lys Leu Gln Ser Val Ser Ser Ala305                 310                 315                 320Ile His Leu Cys Asp Lys Lys Lys Met Glu Leu Ser Leu Asn Ile Pro

            325                 330                 335Val Asn His Gly Pro Gln Glu Glu Ser Cys Gly Ser Ser Gln Leu His

        340                 345                 350Glu Asn Ser Gly Ser Pro Glu Thr Ser Arg Ser Leu Pro Ala Pro Gln

    355                 360                 365Asp Asn Asp Phe Leu Ser Arg Lys Ala Gln Asp Cys Tyr Phe Met Lys

370                 375                 380Leu His His Cys Pro Gly Asn His Ser Trp Asp Ser Thr Ile Ser Gly385                 390                 395                 400Ser Gln Arg Ala Ala Phe Cys Asp His Lys Thr Thr Pro Cys Ser Ser

            405                 410                 415Ala Ile Ile Asn Pro Leu Ser Thr Ala Gly Asn Ser Glu Arg Leu Gln

        420                 425                 430Pro Gly Ile Ala Gln Gln Trp Ile Gln Ser Lys Arg Glu Asp Ile Val

    435                 440                 445Asn Gln Met Thr Glu Ala Cys Leu Asn Gln Ser Leu Asp Ala Leu Leu

450                 455                 460Ser Arg Asp Leu Ile Met Lys Glu Asp Tyr Glu Leu Val Ser Thr Lys465                 470                 475                 480Pro Thr Arg Thr Ser Lys Val Arg Gln Leu Leu Asp Thr Thr Asp Ile

            485                 490                 495Gln Gly Glu Glu Phe Ala Lys Val Ile Val Gln Lys Leu Lys Asp Asn

        500                 505                 510Lys Gln Met Gly Leu Gln Pro Tyr Pro Glu Ile Leu Val Val Ser Arg

    515                 520                 525Ser Pro Ser Leu Asn Leu Leu Gln Asn Lys Ser Met

530                 535                 540(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

    (A)长度：2098碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：cDNA

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：GGCCATTATG  GATGGATGGG  CGGCGCTACG  GCGTTGGCAC  CAGTCTCTAG  AAAAGAAGTC      60AGCTCTGGTT  CGGAGAAGCA  GCGGCTGGCG  TGGGCCATCC  GGGGAATGGG  CGCCCTCGTG     120ACCTAGTGTT  GCGGGGCAAA  AAGGGTCTTG  CCGGCCTCGC  TCGTGCAGGG  GCGTATCTGG     180GCGCCTGAGC  GCGGCGTGGG  AGCCTTGGGA  GCCGCCGCAG  CAGGGGGCAC  ACCCGGAACC     240GGCCTGAGCG  CCCGGGACCA  TGAACGGGGA  GGCCATCTGC  AGCGCCCTGC  CCACCATTCC     300CTACCACAAA  CTCGCCGACC  TGCGCTACCT  GAGCCGCGGC  GCCTCTGGCA  CTGTGTCGTC     360CGCCCGCCAC  GCAGACTGGC  GCGTCCAGGT  GGCCGTGAAG  CACCTGCACA  TCCACACTCC     420GCTGCTCGAC  AGTGAAAGAA  AGGATGTTTT  AAGAGAAGCT  GAAATTTTAC  ACAAAGCTAG     480ATTTAGTTAC  ATTTTTCCAA  TTTTGGGAAT  TTGCAATGAG  CCTGAATTTT  TGGGAATAGT     540TACTGAATAC  ATGCCAAATG  GATCATTAAA  TGAACTCCTA  CATAGGAAAA  CTGAATATCC     600TGATGTTGCT  TGGCCATTGA  GATTTCGCAT  CCTGCATGAA  ATTGCCCTTG  GTGTAAATTA     660CCTGCACAAT  ATGACTCCTC  CTTTACTTCA  TCATGACTTG  AAGACTCAGA  ATATCTTATT     720GGACAATGAA  TTTCATGTTA  AGATTGCAGA  TTTTGGTTTA  TCAAAGTGGC  GCATGATGTC     780CCTCTCACAG  TCACGAAGTA  GCAAATCTGC  ACCAGAAGGA  GGGACAATTA  TTTATATGCC     840ACCTGAAAAC  TATGAACCTG  GACAAAAATC  AAGGGCCAGT  ATCAAGCACG  ATATATATAG     900CTATGCAGTT  ATCACATGGG  AAGTGTTATC  CAGAAAACAG  CCTTTTGAAG  ATGTCACCAA     960TCCTTTGCAG  ATAATGTATA  GTGTGTCACA  AGGACATCGA  CCTGTTATTA  ATGAAGAAAG    1020TTTGCCATAT  GATATACCTC  ACCGAGCACG  TATGATCTCT  CTAATAGAAA  GTGGATGGGC    1080ACAAAATCCA  GATGAAAGAC  CATCTTTCTT  AAAATGTTTA  ATAGAACTTG  AACCAGTTTT    1140GAGAACATTT  GAAGAGATAA  CTTTTCTTGA  AGCTGTTATT  CAGCTAAAGA  AAACAAAGTT    1200ACAGAGTGTT  TCAAGTGCCA  TTCACCTATG  TGACAAGAAG  AAAATGGAAT  TATCTCTGAA    1260CATACCTGTA  AATCATGGTC  CACAAGAGGA  ATCATGTGGA  TCCTCTCAGC  TCCATGAAAA    1320TAGTGGTTCT  CCTGAAACTT  CAAGGTCCCT  GCCAGCTCCT  CAAGACAATG  ATTTTTTATC    1380TAGAAAAGCT  CAAGACTGTT  ATTTTATGAA  GCTGCATCAC  TGTCCTGGAA  ATCACAGTTG    1440GGATAGCACC  ATTTCTGGAT  CTCAAAGGGC  TGCATTCTGT  GATCACAAGA  CCACTCCATG    1500CTCTTCAGCA  ATAATAAATC  CACTCTCAAC  TGCAGGAAAC  TCAGAACGTC  TGCAGCCTGG    1560TATAGCCCAG  CAGTGGATCC  AGAGCAAAAG  GGAAGACATT  GTGAACCAAA  TGACAGAAGC    1620CTGCCTTAAC  CAGTCGCTAG  ATGCCCTTCT  GTCCAGGGAC  TTGATCATGA  AAGAGGACTA    1680TGAACTTGTT  AGTACCAAGC  CTACAAGGAC  CTCAAAAGTC  AGACAATTAC  TAGACACTAC    1740TGACATCCAA  GGAGAAGAAT  TTGCCAAAGT  TATAGTACAA  AAATTGAAAG  ATAACAAACA    1800AATGGGTCTT  CAGCCTTACC  CGGAAATACT  TGTGGTTTCT  AGATCACCAT  CTTTAAATTT    1860ACTTCAAAAT  AAAAGCATGT  AAGTGACTGT  TTTTCAAGAA  GAAATGTGTT  TCATAAAAGG    1920ATATTTATAT  CTCTGTTGCT  TTGACTTTTT  TTATATAAAA  TCCGTGAGTA  TTAAAGCTTW    1980AWWRAARGKT  CTTTSRKTAA  ATATTAGTCT  CCCTCCATGA  CACTGCAGTA  TTTTTTTTAA    2040TTAATACAAG  TAAAAAGTTG  AATTTGAAAA  AAAAAAAAAA  AAAAAAAAAA  AAAAAAAA      2098

Claims (39)

1.一种DNA序列，它编码B1蛋白、其同种型、片段或类似物，所述B1蛋白、其同种型、片段或类似物能与发炎、细胞死亡或细胞存活通道的胞内中介体或调节剂直接或间接地相互作用，所述B1蛋白、其同种型、片段或类似物是所述细胞内发炎、细胞死亡和/或细胞存活通道的细胞内调节剂。

2.根据权利要求1所述的DNA序列，它选自：

(a)衍生自天然B1蛋白编码区的cDNA序列；

(b)序列(a)的片段，它编码能调节发炎、细胞死亡或细胞存活通道的生物活性蛋白；

(c)能在中等严谨条件下与序列(a)或(b)杂交的DNA序列，该序列编码能调节胞内发炎、死亡或细胞存活通道的有生物活性的B1蛋白、类似物或片段；

(d)遗传密码与(a)-(c)所确定的DNA序列简并的DNA序列，该序列编码能调节发炎、细胞死亡或细胞存活通道的具有生物活性的B1蛋白、类似物或片段。

3.根据权利要求1或2所述的DNA序列，它包含图3所示序列的至少一部分并编码至少一种有活性的B1蛋白、同种型、类似物或片段。

4.根据权利要求3所述的DNA序列，它编码的B1蛋白、同种型、类似物或片段具有图3所示氨基酸序列的至少一部分。

5.一种载体，它包含权利要求1-4任一所述的DNA序列。

6.根据权利要求5所述的载体，它能在真核宿主细胞中表达。

7.根据权利要求5所述的载体，它能在原核宿主细胞中表达。

8.转化的真核或原核宿主细胞，它含有权利要求5-7任一所述的载体。

9.一种B1蛋白、其同种型、片段、功能性类似物和衍生物，其由权利要求1-4任一所述的DNA序列编码，所述蛋白、同种型、片段、类似物和衍生物能通过和细胞内发炎、细胞死亡或细胞存活通道的其它细胞内调节剂或中介体关联来直接或间接地调节这些通道。

10.根据权利要求9所述的B1蛋白、其同种型、片段、类似物和衍生物，其中所述蛋白、同种型、类似物、片段和衍生物具有图3所示氨基酸序列的至少一部分。

11.一种生产权利要求9或10所述的B1蛋白、其同种型、片段、类似物或衍生物的方法，该方法包括在适合所述蛋白、其同种型、片段、类似物或衍生物表达、以及按需进行翻译后修饰的条件下使权利要求8所述的转化宿主细胞生长，以获得所述蛋白、其同种型、片段、类似物或衍生物，然后分离所述表达的蛋白、同种型、片段、类似物或衍生物。

12.抗体或其活性片段或衍生物，它对权利要求9或10所述的B1蛋白、其同种型、类似物、片段或衍生物有特异性。

13.一种调节或介导细胞中发炎、细胞死亡或细胞存活通道活性、或由B1或权利要求9或10所述的B1蛋白、其同种型、类似物、片段或衍生物结合或直接或间接相互作用的其它分子直接或间接调节或介导的其它细胞内信号传导活性的方法，所述方法包括：通过将一种或多种所述的B1蛋白、其同种型、类似物、片段或衍生物以适合胞内导入的形式导入所述细胞，或将编码所述一种或多种B1蛋白、其同种型、类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入所述细胞内来处理所述细胞，所述载体能将所述序列插入所述细胞内以使所述序列在所述细胞中表达。

14.根据权利要求13所述的方法，其中所述的细胞处理包括将编码所述B1蛋白、其同种型、片段、类似物或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入所述细胞内，所述载体能将所述序列插入所述细胞内以使所述序列在所述细胞中表达。

15.根据权利要求13或14所述的方法，其中所述细胞的所述处理是用重组动物病毒载体转染所述细胞，该方法包括下列步骤：

(a)构建一个重组动物病毒载体，该载体携带了编码能结合所述待处理细胞表面上特异性细胞表面受体的病毒表面蛋白配体的序列，以及编码选自权利要求9或10所述的B1蛋白、同种型、类似物、片段和衍生物的蛋白的第二序列，该蛋白在所述细胞中表达时能直接或间接地调节/介导发炎、细胞死亡或细胞存活通道的活性或与所述B1蛋白、其同种型、类似物、片段和衍生物直接或间接相互作用的其它胞内分子所调节/介导的其它胞内信号传导活性；和

(b)用(a)所述的载体感染所述细胞。

16.一种调节由B1直接或间接调节的细胞内发炎、细胞死亡或细胞存活通道的方法，该方法包括用权利要求12所述的抗体或其活性片段或衍生物处理所述细胞，所述处理是将含有所述抗体、其活性片段或衍生物的合适组合物施加于所述细胞，其中当所述细胞的B1蛋白或其部分暴露在胞外表面时，所述组合物就配制成用于胞外应用，当所述B1蛋白是胞内蛋白时，所述组合物就配制成胞内应用。

17.一种调节由B1直接或间接调节的细胞内发炎、细胞死亡或细胞存活或其它通道的方法，该方法包括用寡核苷酸序列处理所述细胞，所述寡核苷酸编码权利要求1-4任一所述B1蛋白的DNA编码序列的至少一部分的反义序列，所述寡核苷酸序列能阻断B1蛋白的表达。

18.根据权利要求17所述的方法，其中通过权利要求15所述的病毒将所述寡核苷酸序列导入所述细胞内，其中所述病毒的所述第二序列编码所述寡核苷酸序列。

19.一种调节由B1直接或间接调节的细胞内发炎、细胞死亡、细胞存活或其它通道的方法，该方法包括采用核酶程序，其中将一个载体以允许所述核酶序列在所述细胞内表达的形式导入所述细胞内，该载体编码的核酶序列能与编码权利要求9或10所述的B1蛋白的细胞mRNA序列相互作用，其中当所述核酶序列在所述细胞中表达时，它与所述细胞mRNA序列相互作用并切割所述mRNA序列，导致抑制所述B1蛋白在所述细胞内的表达。

20.一种通过权利要求9或10所述的蛋白中存在的激酶结构域或中间结构域来分离和鉴定权利要求9或10所述的蛋白的方法，该蛋白与具有前结构域或蛋白酶类募集结构域CARD的蛋白或参与细胞内信号传导的其它蛋白或酶同源或能与之直接或间接相互作用，该方法包括采用酵母双杂交程序，其中一个杂交载体携带了具有所述CARD、激酶和中间结构域或这些结构域中至少一个的所述蛋白的编码序列，第二个杂交载体携带了来自cDNA或基因组DNA文库的序列，然后用载体转化酵母宿主细胞，分离阳性转化的细胞，然后抽提所述第二杂交载体，以获得能与所述含有CARD、激酶和/或中间结构域的蛋白结合的蛋白编码序列。

21.根据权利要求13-20任一所述的方法，其中所述蛋白是B1同种型、类似物、片段及其衍生物的至少一种。

22.一种用于调节细胞内由B1直接或间接调节的发炎、细胞死亡、细胞存活或其它通道的药物组合物，该组合物包含权利要求9或10所述的至少一种B1蛋白、其生物活性片段、类似物、衍生物或其混合物作为活性组分。

23.一种用于调节细胞内由B1直接或间接调节的发炎、细胞死亡、细胞存活或其它通道的药物组合物，它包含一种重组动物病毒载体作为活性组分，该载体编码能与细胞表面受体结合的蛋白，并编码权利要求9或10所述的至少一种B1蛋白、同种型、活性片段或类似物。

24.一种用于调节细胞内由B1直接或间接调节的发炎、细胞死亡、细胞存活或其它通道的药物组合物，该组合物包含一种寡核苷酸序列作为活性组分，该寡核苷酸序列编码权利要求1-4任一所述的B1蛋白mRNA序列的反义序列。

25.一种用于预防或治疗病理性状态的药物组合物，所述疾病与权利要求9或10所述的B1蛋白直接或间接结合的一种或多种分子所调节的凋亡作用相关，所述组合物包含有效量的B1蛋白或编码该蛋白的DNA分子、或能破坏所述B1蛋白与能结合B1蛋白或与B1蛋白相互作用的一种或多种分子直接或间接相互作用的分子。

26.一种用于预防或治疗与权利要求9或10所述的B1蛋白直接或间接结合的一种或多种分子所调节的凋亡相关的病理状态的药物组合物，所述组合物包含有效量的B1蛋白、其同种型、片段、类似物或衍生物、或其DNA编码分子、或能破坏所述B1蛋白、其同种型、片段、类似物或衍生物与能结合所述B1蛋白、其同种型、片段、类似物或衍生物的一种或多种分子直接或间接相互作用的分子。

27.一种用于预防或治疗与权利要求9或10所述的B1蛋白直接或间接结合的一种或多种分子所调节的凋亡相关的病理性状态的药物组合物，所述组合物包含一种能干扰B1蛋白激酶活性的分子。

28.一种用于预防或治疗与一种或多种分子所调节的凋亡相关的病理性状态的方法，所述一种或多种分子与权利要求9或10所述的蛋白直接或间接结合，所述方法包括：给予需要的患者有效量的权利要求9或10所述的蛋白或其同种型、片段、类似物和衍生物、或它们的混合物、或其DNA编码分子、或能破坏权利要求9或10所述的B1蛋白或其同种型、片段、类似物和衍生物或它们的混合物与能直接或间接结合权利要求9或10所述的B1蛋白或其同种型、片段、类似物和衍生物或它们的混合物的一种或多种分子直接或间接相互作用的分子。

29.一种调节B1蛋白直接或间接参与的凋亡过程或编程性细胞死亡过程—即细胞死亡通道—的方法，该方法包括用权利要求9或10所述的一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物处理所述细胞，其中所述细胞的所述处理包括将所述一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物以适合胞内导入的形式导入所述细胞内，或将编码所述一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入所述细胞内，所述载体能将所述序列插入所述细胞内以使所述序列在所述细胞内表达。

30.一种调节B1蛋白直接或间接参与的并包括调节细胞存活的细胞存活过程的方法，该方法包括用权利要求9或10所述的一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物处理所述细胞，其中所述细胞的处理包括将所述一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物以适合胞内导入的形式导入所述细胞内，或将编码所述一种或多种B1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入所述细胞内，所述载体能将所述序列插入所述细胞内以使所述序列在所述细胞内表达。

31.一种筛选能结合权利要求9或10所述的B1蛋白的配体的方法，该方法包括使连接了所述蛋白的亲和层析基质与细胞抽提物接触，从而使配体与所述基质结合，然后洗脱、分离和分析所述配体。

32.一种筛选能结合权利要求9或10所述B1蛋白的配体的DNA编码序列的方法，该方法包括采用酵母双杂交程序，其中一个杂交载体携带了编码所述B1蛋白的序列，第二个杂交载体携带了来自cDNA或基因组DNA文库的序列，用所述载体转化酵母宿主细胞，分离阳性转化的细胞，抽提所述第二个杂交载体以获得编码所述配体的序列。

33.一种鉴定和产生能调节B1调节/介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：

a)筛选能结合某多肽的配体，该多肽包含B1的至少一部分，具有至少某些图3所示的B1氨基酸残基，该部分基本上包括B1的全部前结构域CARD

b)对于经所述筛选步骤发现的、能进行所述结合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受体家族受体一部分、或具有前结构域CARD的其它已知蛋白的配体，进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述配体。

34.一种鉴定和产生能调节受权利要求9或10所述的B1蛋白调节或介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：

a)筛选能与某多肽结合的配体，该多肽至少包含图3所示的B1序列的羧基端部分，该部分至少包括前结构域CARD；

b)对于经所述筛选步骤发现的、能进行所述结合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受体家族受体一部分、或具有前结构域CARD的其它已知蛋白的配体，进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述配体。

35.一种鉴定和产生能调节受B1调节/介导的细胞活性的配体的方法，该方法包括：

a)筛选能与图3所示B1序列的至少N端部分结合的配体，该N端部分基本上包括了B1所有的激酶结构域；

b)对于所述筛选步骤发现的、能进行所述结合但非BCL2、TRAF2、或TNF/NGF受体家族受体一部分、或其它已知的胞内调节蛋白的配体，进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述配体。

36.一种鉴定和产生能直接或间接调节受B1调节/介导的细胞活性的分子的方法，该方法包括：

a)筛选能调节受B1调节/介导的活性的分子；

b)对所述分子进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述分子。

37.一种鉴定和产生能直接或间接调节受权利要求9或10所述的蛋白调节/介导的细胞活性的分子的方法，该方法包括：

a)筛选能调节权利要求9或10所述的蛋白所调节/介导的活性的分子；

b)对所述分子进行鉴定和特性分析；和

c)产生基本上分离的和纯化形式的所述分子。

38.根据权利要求9所述的片段，该片段是肽。

39.一种调节细胞死亡、细胞存活和/或发炎的方法，该方法包括用能与V-ATP酶的E亚单位相互作用的分子处理细胞。

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