CN1148446C - 与mort-1和mach结合的多肽及其dna序列、生产方法、药物组合物和用途 - Google Patents

与mort-1和mach结合的多肽及其dna序列、生产方法、药物组合物和用途 Download PDF

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Abstract

本发明提供了能与MORT-1和MACH的一种或多种结合的多肽及编码该多肽的DNA序列，含有该DNA序列的载体和转化的宿主细胞，该多肽的生产方法，含该多肽的药物组合物，用该多肽体外调节细胞死亡或发炎过程的方法和体外调节FAS-R配体或TNF对携带FAS-R或p55-R的细胞的效应的方法，以及该多肽在制备用于调节细胞死亡或发炎过程的药物中的用途和在制备用于调节FAS-R配体或TNF对携带FAS-R或p55-R的细胞的效应的药物中的用途。

Description

与MORT-1和MACH结合的多肽及其DNA序列、生产方法、药物组合物和用途
发明领域
本发明总地涉及属于TNF/NGF受体超家族的受体及其生物功能控制领域。TNF/NGF受体超家族包括的受体例如有p55和p75肿瘤坏死因子受体(TNF-R，也分别称为CD120a和CD120b，但是在本文中称为p55-R和p75-R)和FAS配体受体(也称为FAS/APO1或FAS-R或CD95，但是在本文中称为FAS-R)和其它受体。更具体地说，本发明进一步涉及与本身结合MORT-1(或FADD)蛋白的其它蛋白(它们也称为MORT-1-结合蛋白)结合的新蛋白、或直接结合MORT-1的新蛋白。更具体地说，本发明涉及这样一种蛋白，它在本文中命名为G1(现在也命名为“CASH”，即“CASPASE HOMOLOG(卡斯酶同系物)”，但是在本文中称为G1)，它与MORT-1结合蛋白Mch4(也命名为/称为CASP-10)结合，并且可能还与称为MACH的另一MORT-1结合蛋白(也命名为/称为CASP-8)结合，并且可能本身直接和MORT-1结合。
因此，本发明总地涉及能直接或间接调节或介导MORT-1的功能或结合MORT-1的其它蛋白的功能的新蛋白。具体地说，本发明涉及G1、其制备及其用途以及G1的各种新的同种型、其制备及其用途。
相关技术背景
肿瘤坏死因子(TNF-α)和淋巴毒素(TNF-β)(在下文中TNF指TNF-α和TNF-β)是多功能促炎细胞因子，它主要由单核吞噬细胞形成，对细胞有多种作用(Wallach，D.(1986)，Interferon 7(Ion Gresser编辑)，83-122页，Academic Press，London；和Beutler和Cerami(1987))。TNF-α和TNF-β通过结合特异性细胞表面受体来发挥其作用。其中一些作用可能对生物体有利：它们可能会破坏(例如)肿瘤细胞或感染了病毒的细胞，并增强粒细胞的抗菌活性。通过这种方式，TNF对于保护生物体抵御肿瘤和感染性因子以及从损伤中恢复有贡献。因此，TNF可用作抗肿瘤剂，在该应用中，它结合肿瘤细胞表面上的受体，从而启动了导致肿瘤细胞死亡的行为。TNF还可用作抗感染剂。
然而，TNF-α和TNF-β均有有害的作用。有证据表明，过度产生TNF-α会在几种疾病中起主要致病作用。例如，已经知道，TNF-α主要作用于脉管结构，这是脓毒休克的主要病因(Tracey等，1986)。在一些疾病中，TNF可能会通过抑制脂肪细胞的活性和引起缺乏食欲而导致体重过度减轻(恶液质)，因此TNF-α称为恶液质素。另外，它还被描述成是风湿性疾病中组织损伤的一种中介体(mediator)(Beutler和Cerami，1987)，以及移植物抗宿主反应中所见破坏的主要中介体(Piquet等，1987)。此外，已知TNF参与发炎过程和其它许多疾病。
两种不同的、独立表达的受体p55和p75 TNF-R(它们与TNF-α和TNF-β特异性结合)启动和/或介导了TNF的上述生物学效应。这两种受体在结构上有不相似的胞内结构域，这暗示它们的信号传导方式不同(参见Hohmann等，1989；Engelmann等1990；Brockhaus等，1990；Leotscher等，1990；Schall等，1990；Nophar等，1990；Smith等，1990；和Heller等，1990)。然而，例如涉及p55和p75 TNF-R胞内信号传导的各种蛋白和可能存在的其它因子的细胞机制还没有得到阐明。正是该胞内信号的传导(通常在配体(即TNFα或β)结合受体后发生)致使级联反应开始并最终导致所见的细胞对TNF的反应。
关于上述TNF杀细胞作用，就目前研究的大多数细胞而言，该作用主要由p55 TNF-R引发。抗p55 TNF-R胞外结构域(配体结合域)的抗体本身可引发杀细胞效应(见EP 412486)，该效应与受体交联抗体的效率相关，认为这是胞内信号传导过程产生的第一步。而且，诱变研究(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993)已经表明，p55 TNF-R的生物功能取决于其胞内结构域的完整性，因此，已提出导致TNF杀细胞效应的胞内信号传导启动的发生是p55 TNF-R的两个或多个胞内结构域缔合的结果。而且，TNF(α和β)形成均三聚体，因此，已提出通过p55TNF-R以结合和交联受体分子(即引起受体聚集)的方式来诱导胞内信号传导。
TNF/NGF受体超家族的另一个成员是FAS受体(FAS-R)(也称为FAS抗原)，它是在各种组织中表达的一种细胞表面蛋白，它与许多细胞表面受体(包括TNF-R和NGF-R)同源。FAS-R以细胞编程性细胞死亡(凋亡)方式介导细胞死亡(Itoh等，1991)，并且好象是自身反应T细胞的阴性选择物，即，在T细胞成熟期间，FAS-R介导了识别自身抗原的T细胞发生凋亡。也已发现，FAS-R基因(lpr)中的突变在小鼠中引起了与人自身免疫疾病—系统性红斑狼疮(SLE)—相似的淋巴细胞增生疾病(Watanabe-Fukunaga等，1992)。FAS-R的配体看来是其它细胞中杀伤性T细胞(或细胞毒性T淋巴细胞-CTL)中携带的细胞表面相关分子，因此，当该CTL接触携带FAS-R的细胞，它们能诱导携带FAS-R的细胞编程性细胞死亡。另外，已经制得对FAS-R有特异性的单克隆抗体，该单克隆抗体能诱导携带FAS-R的细胞(包括被编码人FAS-R的cDNA转化的小鼠细胞)编程性细胞死亡(Itoh等，1991)。
尽管淋巴细胞的一些细胞毒性效应是通过淋巴细胞产生的配体与广泛存在的细胞表面受体FAS-R(CD95)(它能引发细胞死亡)的相互作用而诱导的，但是也已发现，除T淋巴细胞外的其它各种正常细胞也在其表面表达FAS-R，并且能通过触发该受体而被杀死。怀疑是由于对该杀死过程的失控性诱导而导致了某些疾病中组织破坏(例如急性肝炎中的肝细胞破坏)。因此，寻找方法来抑制FAS-R的细胞毒性活性可能会有治疗潜力。
相反，由于已经发现某些恶性细胞和HIV感染的细胞在其表面携带了FAS-R，因此可利用抗FAS-R的抗体或FAS-R配体来引发这些细胞中的FAS-R介导的胞毒作用，从而提供了一种抵抗这些恶性细胞或HIV-感染的细胞的方法(见Itoh等，1991)。因此，寻求其它方法来增强FAS-R胞毒活性可能也会有治疗潜力。
提供一种调节对TNF(α或β)和FAS-R配体的细胞反应的方法是人们长期以来的需求。例如，在上述病理场合下，当TNF或FAS-R配体过度表达时，就需要抑制TNF或FAS-R配体诱导的杀细胞效应，而在其它场合，例如伤口愈合的应用中，则希望增强TNF的效应，或在FAS-R情况下，在肿瘤细胞或HIV感染的细胞中，希望增强FAS-R介导的效应。
申请人已经用了各种方法(例如参见欧洲专利申请No.EP 186833，EP 308378，EP 398327和EP 412486)来调节TNF的有害作用，方法是用抗TNF抗体或可溶性TNF受体(基本上是此受体的可溶性胞外结构域)与TNF竞争和细胞表面TNF-R结合，从而抑制TNF与其受体结合。另外，由于TNF与其受体的结合是TNF诱导细胞效应所需的，因此申请人已经设法通过调节TNF-R的活性来调节TNF的作用(例如参见EPO 568925)。
简言之，EPO 568925涉及一种调节信号转导和/或TNF-R中断裂的方法，从而肽或其它分子可与受体本身或与该受体起反应的效应蛋白相互作用，从而调节了TNF-R的正常功能。在EPO 568925中，描述了在p55 TNF-R的胞外、跨膜和胞内结构域中有突变的各种p55 TNF-R突变体的构建和性质分析。这样，p55TNF-R的上述结构域内的区域被确定为受体功能(即与配体(TNF)结合以及随后的信号转导和胞内信号传导，最终导致所见的TNF对细胞的效应)所必需的。而且，该文还描述了许多分离和鉴定蛋白、肽或其它因子的方法，这些蛋白、肽或其它因子能结合TNF-R上述结构域内的不同区域，可能参与了TNF-R活性的调节或调控。在EPO 568925中还描述了分离和克隆编码这些蛋白和肽的DNA序列的一些方法；构建表达载体来产生这些蛋白和肽的方法；与TNF-R或与结合TNF-R不同区域的上述蛋白和肽相互作用的抗体或其片段的制备方法。然而，EPO568925没有指明结合TNF-R(如p55 TNF-R)胞内结构域的实际蛋白和肽，也没有描述用来分离和鉴定结合了TNF-R胞内结构域的这些蛋白和肽的酵母双杂交方法。同样，EPO 568925也没有公开能结合FAS-R胞内结构域的蛋白或多肽。
因此，当希望抑制TNF或FAS-R配体的作用时，需要减少细胞表面的TNF-R或FAS-R的活性量，而当需要增强TNF或FAS-R配体的效应时，希望增加TNF-R或FAS-R的活性量。出于这一目的，已经对p55 TNF-R和p75 TNF-R的启动子进行了测序分析，并且已经发现了许多对不同转录调节因子有特异性的一些关键序列基序，因此可以在其启动子水平来控制这些TNF-R的表达，即通过抑制启动子的转录来减少受体数量，增强启动子转录来增加受体数量(EP 606869和WO9531206)。关于在FAS-R基因的启动子水平上控制FAS-R的相应研究还未有报道。
尽管已经知道肿瘤坏死因子(TNF)受体和结构上相关的受体FAS-R在受白细胞产生的配体刺激时在细胞内引发导致细胞自身死亡的破坏性活性，但是对该引发的机制仍知之甚少。突变研究表明，在FAS-R和p55 TNF受体(p55-R)中，细胞毒性的信号传导涉及其胞内结构域的不同区域(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)。这些区域(“死亡域”或“死亡效应域”，称为“DED”)的序列相似。FAS-R和p55-R的“死亡域”均有自身缔合(self-associate)的趋势。它们的自身缔合明显促进了信号传导作用启动所需的受体聚集(见Song等，1994；Wallach等，1994；Boldin等，1995)，且高水平的受体表达会导致引发不依赖于配体的信号传导(Boldin等，1995)。
一些淋巴细胞的细胞毒性效应受淋巴细胞产生的配体和FAS-R(CD-95)相互作用所介导，FAS-R是一种广泛存在的细胞表面受体，它能引发细胞死亡(另见Nagata和Golstein，1995)；而单核吞噬细胞杀死细胞作用涉及配体-受体结合(TNF及其受体p55-R(CD120))，它们在结构上于FAS-及其配体相关(另见Vandenabeele等，1995)。和其它受体诱导的效应一样，TNF受体和FAS-R通过一系列蛋白-蛋白相互作用(从配体-受体结合到最终激活酶促效应功能)诱导细胞死亡，在研究中已经描述启动细胞死亡信号传导作用的非酶促蛋白-蛋白相互作用：TNF或FAS-R配体三聚体分子与受体结合，其胞内结构域相互作用(Brakebusch等，1992；Tartaglia等，1993；Itoh和Nagata，1993)由于死亡域基序(或死亡效应域，DED)自身缔合的趋势而增强(Boldin等，1995a)，并诱导两种细胞质蛋白(这两种蛋白也能相互结合)与受体胞内结构域结合—MORT-1(或FADD)与FAS-R结合(Boldin等，1995b；Chinnaiyan等，1995；Kischkel等，1995)，TRADD与p55-R结合(Hsu等，1995；Hsu等，1996)。用酵母双杂交筛选程序鉴定出三种蛋白，这些蛋白与FAS-R和p55-R胞内结构域的“死亡域”结合，通过同源区域的异质性缔合来参与受体诱导细胞死亡，并且还能独立地引发细胞死亡。它们中的一种蛋白是MORT-1(Boldin等，1995b)，也称为FADD(Chinnaiyan等，1995)，它能特异性地结合FAS-R。第二种是TRADD(另见Hsu等，1995)，它与p55-R结合，第三种是RIP(另见Stanger等1995)，它于FAS-R和p55-R结合。这些蛋白除了能结合FAS-R和p55-R外，它们还能相互结合，从而在FAS-R和p55-R之间提供了功能性“串话(crosstalk)”。这些结合发生在受体及其缔合蛋白中共有的保守序列基序—“死亡域组件”(也称为“死亡效应域”，即“DED”)中。另外，尽管在酵母双杂交测试中，MORT-1显示出自发结合FAS-R，但是在哺乳动物细胞中，这一结合只有在受体受刺激后才会发生，这暗示MORT-1参与了FAS-R信号传导的启动行为。MORT-1不含酶活性特征的序列基序，因此，它引发细胞死亡的能力看来似乎并不是MORT-1本身固有的活性，而是激活了结合MORT-1的其它一些蛋白，并进一步作用于信号级联途径的下游。分子缺少N端部分的MORT-1突变体的细胞表达已经显示出能阻断FAS/APO1(FAS-R)或p55-R诱导的细胞毒性(Hsu等，1996；Chinnaiyan等，1996)，这说明此N端区域通过蛋白-蛋白的相互作用传递了两种受体杀细胞效应的信号。
最近的研究已经暗示了一组胞质硫醇蛋白酶，它们在各种生理性细胞死亡过程开始时与Caenorhabditis elegans蛋白酶CED3和哺乳动物白介素-1β转化酶(ICE)在结构上相关(回顾见Kumar，1995和Kenkart，1996)。也有一些迹象表明该家族的蛋白酶可能参与了FAS-R和YNF-R诱导的细胞毒性。发现这些蛋白酶的特异性肽抑制剂以及封闭其功能的两种病毒编码的蛋白(牛痘蛋白crmA和杆状病毒p35蛋白)为细胞提供了抗此细胞毒性的保护(Enari等，1995；Los等，1995；Tewari等，1995；Xue等，1995；Beidler等，1995)。某些特异性细胞蛋白的迅速断裂明显是由CED3/ICE家族蛋白酶介导的，这可在FAS-R或TNF-R刺激后不久在细胞内得到证实。
应当注意，这些CED3/ICE蛋白酶(也称为卡斯酶)以无活性前体形式产生，并在诱导死亡时被蛋白水解加工激活。这些卡斯酶是保守的半胱氨酸蛋白酶，它们特异性切割天冬氨酸残基下游的细胞蛋白，从而在所有已知的编程性细胞死亡过程中起关键作用。除了从成熟蛋白酶衍生的同源C端区域，该前体蛋白还含有独特的N-端区域。这些“前域(prodomain)”与特异性调节分子相互作用，使得各种卡斯酶被不同的死亡诱导信号差异性地激活(Boldin等，1996；Muzio等，1996；Duan和Dixit，1997；Van Criekinge等，1996；Ahmad等，1997)。
最近，已经分离、克隆并鉴定出这样一种蛋白酶及其各种同种型(包括抑制性的同种型)，命名为MACH(也称为CASP-8)，它是一种MORT-1结合蛋白，作用是调节MORT-1活性进而调节FAS-R和p55-R的活性，它还能独立地作用于MORT-1，关于其可能的用途在共同拥有的待批以色列专利申请No.IL 114615，114986，115319，116588和117932及其对应的PCT申请No.PCT/US96/10521和本发明者最近的出版文献(Boldin等，1996)中有详细描述，它们全部纳入本文作参考。本发明者(未公开)和其它人(Fernandes-Alnemri等，1996；Srinivasula等，1996)最近还分离和鉴定出另一种此类蛋白酶及其各种同种型(包括抑制的同种型)，其命名为Mch4(也称为CASP-10)。该Mch4蛋白也是一种MORT-4结合蛋白，其作用是调节MORT-1的活性，因此可能也能调节FAS-R和p55-R的活性，它也能独立作用于MORT-1。因此，上述文献中也描述了关于Mch4的所有方面、特征、性质和用途，所有这些文献均全部纳入本文作参考。
还应注意，卡斯酶、MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)具有相似的前域(见Boldin等，1996；Muzio等，1996；Fernandes-Alnemri等，1996；Vincent和Dixit，1997)，它们通过其前域与MORT-1相互作用，该作用是通过MORT-1 N端部分中的、和MACH(CASP-8)与Mch4(CASP-10)中重复存在的“死亡域基序”或“死亡效应域”DED而发生(见Boldin等，1995b；Chinnalyan等，1995)。
还应提到的是，从上文来看，涉及胞内信号传导过程导致细胞死亡的各种蛋白/酶/受体有不同的名称，为了理清混乱，下面是各种名称的一览表，包括这些蛋白的每一个或部分按新规则所确定的新名称、以及为方便起见在本文所用的名称。
常用或首次名称  其它名称          新惯例名称  本文所用名称
p55 TNF受体     p55-R             CD120a       p55-R
p75 TNF受体     p75-R             CD120        p75-R
FAS受体         FAS-R，FAS/APO1   CD95         FAS-R
MORT-1          FADD              -            MORT-1
MACH            FLICE1，Mch5      CASP-8       MACH
Mch4            FLICE2            CASP-10      Mch4
G1              -                 CASH         G1
“死亡域”      死亡域基序，MORT基序，死亡-    死亡域/死亡域基
                效应域(DED)，MORT组件          序/MORT组件
CED3/ICE蛋白酶  卡斯酶            CASP         CED3/ICE蛋白酶
发明概述
本发明一方面提供了一种分子，它包含DNA序列，该DNA序列编码能与MORT-1和/或MACH结合的多肽，该多肽具有以下物质的氨基酸序列：
(a)具有图1B或图2所示氨基酸序列的G1蛋白同种型。
在较佳实施方案中，所述(a)中所述的G1蛋白同种型是具有图1B所示序列的蛋白同种型，编码(a)中所述的G1蛋白同种型的DNA序列是图1A所示的DNA序列。在另一较佳实施方案中，所述(a)中所述的G1蛋白同种型是具有图2所示氨基酸序列的蛋白同种型，编码(a)中所述的G1蛋白同种型的DNA序列是图2所示的DNA序列。
在一个较佳实施方案中，所述分子包含编码G1蛋白同种型的DNA序列，该G1蛋白同种型的序列是图1B或图2所示的氨基酸序列且该G1蛋白同种型能与MORT-1和/或MACH结合。更佳的是，编码所述G1蛋白同种型的DNA序列是图1A或图2所示的DNA序列。
本发明另一方面提供了一种载体，它包含上述分子。所述载体能在真核宿主细胞中表达，也能在原核宿主细胞中表达。所述载体的较佳方案是，所述载体中的分子包含编码G1蛋白同种型的DNA序列，该G1蛋白同种型的序列是图1B或图2所示的氨基酸序列且该G1蛋白同种型能与MORT-1和/或MACH结合。
本发明另一方面提供了一种转化的宿主细胞，它含有上述载体。更佳的是，该宿主细胞所含载体中的分子包含编码G1蛋白同种型的DNA序列，该G1蛋白同种型的序列是图1B或图2所示的氨基酸序列且该G1蛋白同种型能与MORT-1和/或MACH结合。
本发明还有一个方面提供了一种产生多肽的方法，该多肽能与MORT-1和/或MACH结合，该方法包括：
使上述转化的宿主细胞在适合表达产物表达的条件下生长；
对所述表达产物按需进行翻译后修饰，以获得所述多肽；和
分离所述多肽。
较佳的是，在该方法中，所述多肽具有序列为图1B或图2所示序列的G1蛋白同种型的氨基酸序列，所述多肽能与MORT-1和/或MACH结合，该方法包括：
使上述较佳的转化的宿主细胞在适合表达产物表达的条件下生长；
对所述表达产物按需进行翻译后修饰，以获得所述多肽；和
分离所述多肽。
本发明还提供了一种能与MORT-1和/或MACH结合的多肽，该多肽具有以下物质的氨基酸序列：
(a)具有图1B或图2所示氨基酸序列的G1蛋白同种型。
在一个实施方案中，所述(a)的序列是图1B所示的序列。在另一实施方案中，所述(a)的序列是图2所示的氨基酸序列。
在一个较佳的实施方案中，所述多肽具有图2所示的氨基酸序列。
在一个较佳的实施方案中，所述多肽具有图1B或图2所示氨基酸序列的G1蛋白同种型的氨基酸序列，所述多肽能与MORT-1和/或MACH结合。
本发明另一方面提供了一种调节FAS-R配体或TNF对细胞的效应的药物组合物，它包含上述多肽作为活性组分。
本发明还有一方面提供了一种体外调节细胞死亡或发炎过程的方法，该方法包括：通过将一种或多种上述多肽以胞内导入的形式导入所述细胞来处理所述细胞。
本发明另一方面提供了一种体外调节FAS-R配体或TNF对携带FAS-R或p55-R的细胞的效应的方法，该方法包括用一种或多种上述能与MORT-1和MACH结合蛋白结合的多肽处理所述细胞，其中所述细胞的所述处理包括：将所述一种或多种多肽以适合胞内导入的形式导入所述细胞内。
本发明另一方面涉及上述多肽在制备用于调节细胞死亡或发炎过程的药物中的用途以及在制备用于调节FAS-R配体或TNF对携带FAS-R或p55-R的细胞的效应的药物中的用途。
根据本发明，分离出一种新的G1蛋白，它能与本身结合MORT-1的Mch4结合或相互作用，而MORT-1与FAS-R的胞内结构域结合。G1还能和称为MACH的另一MORT-1结合蛋白相互作用，也能直接和MORT-1结合或相互作用。G1可能作为FAS配体与细胞表面FAS-R的结合而启动的细胞死亡通路的调节剂组分而发挥功能，这凭以下事实，即G1具有类似于Mch4和MACH蛋白水解区域的蛋白水解区域而知，因此G1也可以是活性细胞内蛋白酶。而且，根据G1(尤其是其蛋白水解区域)表达中的转录/翻译过程，可能会表达出一些没有活性蛋白水解区域的G1同种型，因此这些同种型可作为(例如)Mch4和MACH介导的蛋白水解活性的拮抗剂。在FAS-R引发的凋亡过程中已经牵连到CED3/ICE家族的蛋白酶。MORT-1(或FADD)在FAS-R激活时与该受体的胞内结构域结合，而本发明的新的G1蛋白则与MORT-1结合蛋白(如Mch4)结合，可能也和MACH结合或直接与MORT-1结合。根据本发明克隆和鉴定出的G1蛋白可能以多种同种型形式存在，其中一些同种型具有CED3/ICE同源区，其具有类似于Mch4和MACH的一些同种型的蛋白水解活性(蛋白水解区域)，当其在细胞中表达时可能会导致细胞死亡。因此，该新的CED3/ICE同系物(即具有蛋白水解区的各种G1同种型)被FAS-R激活(通过直接或间接作用于MORT-1)看来是构成了FAS-R-介导的细胞死亡途径的效应元件。
而且，G1看来还是作为由TNF和细胞表面p55-R结合而启动的细胞死亡途径的效应元件而起作用，其利用的间接机理是：MORT-1与结合p55-R胞内结构域的TRADD(Hsu等，1995)结合，然后是G1与MORT-1结合蛋白(例如Mch4或MACH)结合、或直接与MORT-1结合，从而将G1激活成影响细胞死亡的活性蛋白酶。
应当注意的是，尽管G1表现出至少一些CED3/ICE蛋白酶功能的关键序列特征，但是它也有其自身的某些区别性序列特征，这些区别性序列特征赋予其独特而可能的组织/细胞特异性作用模式。
因此，根据本发明，提供了一种命名为G1的新蛋白。该G1蛋白通过双杂交筛选试验被分离并克隆，并经鉴定是结合Mch4的分子。上述Mch4是一种MORT-1结合蛋白，它能影响细胞的死亡，但是也应注意，Mch4的一些同种型有相反的效应，即，它们抑制细胞的杀伤。而且，对G1进行测序还发现，G1的N端区域有两个所谓的“MORT组件(mort module)(MM)，这两个组件也发现存在于MORT-1结合蛋白MACH和Mch4中。G1中的这些MORT组件看来是其能与Mch4结合的原因，还可能是它能直接结合MORT-1以及结合MACH或特异性MACH同种型(MACH的特异性剪接变体)的基础。在G1序列中，在含有MORT组件的N端区域下游看来还有一个较长的区域，该区域显示出与MACH和Mch4蛋白水解区域有相似性。而且，从G1序列在人染色体中可能位置的原始分析来看，似乎G1位于第2条染色体上，这非常接近Mch4和MACH的位置，这也暗示了G1、MACH和Mch4之间的关系。
更具体地说，根据本发明，至少发现了G1的三种可能的同种型(见下文实施例1)。其中两种已被分离和克隆，看来它们是新蛋白(命名为G1(或CASH))的两种剪接变体。这两种同种型，较大的同种型称为G1α(或CASHα)，较小的同种型称为G1β(CASHβ)(虽然表现出一个以上的短同种型，因此G1β也命名为G1β1，另一个短的同种型被命名为G1β2—见下文实施例1)。这些G1α和β同种型各自含有两个N端死亡域基序/MORT组件，并能通过这些死亡域基序相互结合，还能通过这些死亡域基序与MORT1、MACH和Mch4结合。较长的G1α同种型具有独特的C端部分(与较短的G1β同种型相比)，该独特的C端部分的序列与卡斯酶蛋白酶活性区域的序列同源。关于生物活性，较短的G1β同种型抑制由p55-R和FAS-R介导的细胞死亡/细胞毒性，而相反，较长的G1α同种型对至少一些类型的细胞(如293细胞)有细胞毒性效应，该细胞毒性涉及其蛋白酶同源区域。然而，也应注意，较长的G1α同种型也能抑制其它类型细胞(如HeLa细胞)中FAS-R和p55-R介导的细胞毒性。这些结果表明，G1(即其各种同种型)可作为p55-R和FAS-R介导的细胞死亡信号传导的减毒剂/抑制剂和/或引导剂(initiator)/增强剂。
也应注意，为了描述清楚，G1的各种同种型(例如G1α和G1β)在本文中通常简单地称为“G1”，但是也应理解，在这些情况下，“G1”的意思包括了G1所有的同种型，这样这可以指细胞毒性的诱导剂/增强剂，也可指细胞毒性的抑制剂/减毒剂。当指特定的G1同种型时，则会具体地指出名字，例如G1α或G1β。因此，当用笼统地用“G1”来指各种同种型时，在本文中“G1”也常被称为“调节剂”，这意味着它对所谈论的生物活性有抑制或增强作用。
鉴于上述内容，因此如上文和下文所述的，G1明显是MORT-1活性的调节剂，因此是FAS-R、p55-R、TNF/NGF受体家族中可能的其它受体、以及可能享有共同的胞内信号传导元件和机制的其它受体所介导的细胞效应的调节剂。
因此，由于G1明显有蛋白酶类似区域(至少是其长的同种型)，因此它可能直接负责由各种刺激(包括通过TNF/NGF受体家族的受体和其它可能的受体传递的刺激)引起或诱导的细胞毒性和炎症。
G1还可能通过其作为和其它蛋白形成的复合体中的一部分来起细胞毒性和炎症抑制剂的作用，因此可能影响了这些其它蛋白(如MACH和Mch4或甚至是MORT-1)的细胞毒性或炎性效应，最终导致抑制它们的细胞毒性活性或炎症活性。
G1还可作为细胞毒性和炎症的增强剂或促进剂，它通过与其它蛋白(例如Mch4和MACH或甚至是MORT-1)结合来增强它们的活性，增强它们与MORT-1的结合或独立作用于MORT-1，在这两种情况下，均起着增强各种蛋白的细胞毒性或炎性的作用。
同样，G1还能以类似方式起着也有G1激活所涉及途径的其它胞内中介体或调节剂的抑制剂或增强剂的作用。
MORT-1(“受体毒性的中介体”，Boldin等，1995b)能与FAS-R的胞内结构域结合。该FAS-结合蛋白看来可作为FAS-R配体对细胞效应的中介体或调节剂，它能介导或调节通常发生于FAS-R配体结合到细胞表面之后的胞内信号传导过程。除了其FAS-结合特异性外，MORT-1还显示出有其它特征(见参考实施例1)，例如，它具有与p55-TNF-R和FAS-R“死亡域”(DD)(p55-DD和FAS-DD)同源的区域，从而还能自身缔合。MORT-1还能激活其自身的细胞毒性，该活性可能与其自身缔合的能力有关。还发现，MORT-1中含有“死亡域”同源序列的区域(MORT-DD，存在于MORT-1的C端部分)的共同表达强烈地干扰了FAS诱导的细胞死亡，这可从其能与FAS-IC的“死亡域”结合预计到。而且，在同一实验条件下，发现不含MORT-DD区域的MORT-1部分(MORT-1的N端部分，氨基酸1-117，“MORT-1头部”)的共同表达不会干扰FAS-诱导的细胞死亡，而且还一定程度地增强了FAS-诱导的细胞毒性。
因此，MORT-1可能还与参与胞内信号传导过程的其它蛋白结合。因此，这些MORT-1结合蛋白也可能作为FAS-R配体对细胞效应的间接中介体或调节剂通过介导或调节MORT-1的活性起作用；或者，这些MORT-1结合蛋白可能直接作为MORT-1相关的胞内信号传导过程的中介体或调节剂通过介导或调节MORT-1的活性起作用，如上所述，它具有激活细胞毒性的明显独立的能力。这些MORT-1结合蛋白还可用于各种标准筛选程序中，以分离、鉴定和分析其它蛋白、肽、因子、抗体等，这些蛋白、肽、因子、抗体等可能参与MORT-1相关的或FAS-R相关的信号传导过程，或者可能是其它胞内信号传导过程的元件。已经分离出这些MORT-1结合蛋白，它们在上述的共同拥有待批以色列专利申请No.IL114615，114986，115319，116588和117932及其对应的PCT申请No.PCT/US96/10521(关于MACH及其同种型)和Fernandes-Alnemr等(1996)以及Srinivasula等(1996)(关于Mch4和其它此类＂Mch＂蛋白)的文献中有所描述。这些MORT-1结合蛋白中的一种(上述的MACH)已被先克隆、测序并作了部分性质鉴定，具有下列性质：MACH cDNA编码ORF-B开放读框；MACH以非常强的和特异性方式结合MORT-1；MORT-1中MACH结合位点在MORT-1“死亡域”基序的上游；MACH的ORF-B区是和MORT-1相互作用的部分；MACH能自身缔合并且其自身能诱导细胞毒性。而且，上述共同拥有的、待批专利申请以及Boldin等(1996)中提出的后期分析表明，MACH确实以多种同种型形式存在。而且，上述MACH ORF-B实际上是一种MACH同种型，其命名为位MACHβ1。在关于Mch4的上述出版物中，也表明该蛋白也与MORT-1(或FADD)结合，并直接涉及MORT-1的细胞毒性或不依赖MORT-1而是利用其蛋白水解活性的细胞毒性。
因此，本发明提供了一种DNA序列，该序列编码的G1蛋白、其类似物或片段能直接或间接和MORT-1和/或任何MORT-1结合蛋白(例如Mch4或MACH)结合或相互作用，所述G1蛋白、其类似物或片段能介导由FAS-R或p55-TNF-R介导的胞内效应，所述G1蛋白、其类似物或片段还能介导或调节其能直接或间接结合的其它胞内蛋白的胞内效应。
具体地说，本发明提供了一种选自下列的DNA序列：
(a)衍生自天然G1蛋白编码区的cDNA序列；
(b)能在中度严谨条件下与(a)序列杂交并编码有生物活性的G1蛋白的DNA序列；和
(c)与(a)和(b)所确定的DNA序列遗传密码简并的、且能编码有生物活性的G1蛋白的DNA序列。
本发明上述DNA序列的另一个具体的实例是这样一种DNA序列，它至少包含编码(至少)一种G1蛋白同种型的序列部分。上述DNA序列的另一个实例是编码图1所示G1蛋白(G1α同种型)的序列。另一个这样的实例是图2所示第2种G1同种型(G1β同种型)。
本发明提供的G1蛋白及其类似物、片段或衍生物由本发明上述任一序列编码，所述蛋白、类似物、片段和衍生物能直接或间接和MORT-1和/或任一MORT-1结合蛋白(例如Mch4或MACH)结合或相互作用，能介导由FAS-R或p55-TNF-R或所述G1蛋白、类似物、片段或衍生物能直接或间接与之结合的任何其它细胞毒性诱导介质所介导的胞内效应。
本发明的具体实例是G1蛋白、其类似物、片段和衍生物。另一个实例是G1蛋白、其类似物、片段和衍生物的任一同种型。
本发明还提供了编码本发明上述G1蛋白、其类似物、片段和衍生物的载体，该载体含有本发明的上述DNA序列，这些载体能在合适的真核或原核宿主细胞中表达；本发明还提供了含有这些载体的转化的真核或原核宿主细胞；以及产生本发明的G1蛋白、或类似物、片段或衍生物的方法，该方法是使这些经转化的宿主细胞在适合表达所述蛋白、类似物、片段或衍生物的条件下生长，实现获得所述蛋白所需的翻译后修饰，从所述转化细胞的培养基或所述转化细胞的细胞抽提物中抽提出所述表达的蛋白、类似物、片段或衍生物。上述定义包括G1蛋白的所有同种型。
另一方面，本发明提供了对本发明的G1蛋白、其类似物、片段和衍生物有特异性的抗体或其活性衍生物或片段。
本发明还有一个方面是提供上述DNA序列或其编码蛋白的各种用途，总地来说，根据本发明，这些用途包括下列：
(A)一种调节细胞死亡或发炎过程的方法，该方法包括用本发明上述一种或多种G1蛋白、类似物、片段或衍生物处理所述细胞，其中所述细胞的所述处理包括将所述一种或多种蛋白、类似物、片段或衍生物以适合细胞内导入的方式导入所述细胞内，或将编码所述一种或多种蛋白、类似物、片段或衍生物的核苷酸序列以携带所述序列的合适载体形式导入细胞内，所述载体能以使所述序列在所述细胞内表达的方式将所述序列插入所述细胞内；和
(B)一种调节细胞死亡或发炎过程方法，该方法包括用介导所述细胞死亡或发炎过程的一种或多种蛋白/酶的一种或多种抑制剂处理所述细胞，所述抑制剂选自：(i)能抑制所述细胞死亡或发炎过程的一种或多种本发明的G1蛋白、类似物、片段或衍生物；和(ii)当所述一种或多种G1蛋白促进/增强或介导所述细胞死亡或发炎过程时选自本发明的一种或多种G1蛋白的抑制剂。
更具体地说，本发明的上述方法包括下列具体的实例：
(i)一种调节FAS-R配体或TNF对携带FAS-R或p55-R的细胞效应的方法，该方法包括用本发明的一种或多种G1蛋白、类似物、片段或衍生物处理所述细胞，所述G1蛋白、类似物、片段或衍生物能直接或间接地结合MORT-1或能与MORT-1结合蛋白(如Mch4或MACH)结合，而MORT-1则直接与FAS-R的胞内结构域结合；或能直接或间接与MORT-1结合或与上述MORT-1结合蛋白结合，而MORT-1则与结合p55-R胞内结构域的TRADD结合，从而能调节/介导所述FAS-R或p55TNF-R的活性，其中对所述细胞的所述处理包括将所述一种或多种蛋白、类似物、片段或衍生物以适合细胞内导入的方式导入所述细胞内，或将编码所述一种或多种蛋白、类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入细胞内，所述载体能以使所述序列在所述细胞内表达的方式将所述序列插入所述细胞内。
(ii)一种调节上文(i)所述FAS-R配体或TNF对细胞效应的方法，其中所述细胞的所述处理包括将所述G1蛋白、或其类似物、片段或衍生物以适合细胞内导入的方式导入所述细胞内，或将编码所述G1蛋白、或类似物、片段或衍生物的DNA序列以携带所述序列的合适载体形式导入细胞内，所述载体能以使所述序列在所述细胞内表达的方式将所述序列插入所述细胞内。
(iii)如上文(ii)所述的方法，其中对所述细胞的所述处理是用重组动物病毒载体转染所述细胞，其包括下列步骤：
(a)构建重组动物病毒载体，该载体携带的序列所编码的病毒表面蛋白(配体)能与携带FAS-R或p55-R细胞表面的特异性细胞表面受体结合，该载体携带的第二序列所编码的蛋白选自G1蛋白、及其类似物、片段和衍生物，当其在所述细胞内表达时，它能调节/介导所述FAS-R或p55-R的活性；和
(b)用(a)所述的载体感染所述细胞。
(iv)一种调节FAS-R配体或TNF对携带FAS-R或p55-R的细胞效应的方法，该方法包括用本发明的抗体或其活性片段或衍生物处理所述细胞，所述处理是向所述细胞施加含有所述抗体、其活性片段或衍生物的合适组合物，其中当至少部分G1蛋白暴露在细胞表面时，所述组合物被配制成细胞外应用，当所述G1蛋白完全是细胞内时，所述组合物被配制成胞内应用。
(v)一种调节FAS-R配体或TNF对携带FAS-R或p55-R的细胞效应的方法，该方法包括用编码至少部分本发明G1蛋白序列的反义序列的寡核苷酸序列处理所述细胞，所述寡核苷酸序列能封闭G1蛋白的表达。
(vi)一种上文(ii)所述处理肿瘤细胞或HIV感染的细胞或其它患病细胞的方法，该方法包括：
(a)构建一个重组动物病毒载体，该载体携带的序列所编码的病毒表面蛋白能与特异性肿瘤细胞表面受体或HIV感染的细胞表面受体或其它患病细胞携带的受体结合，载体还包含了编码选自本发明G1蛋白、类似物、片段和衍生物的蛋白的序列，当其在所述肿瘤细胞、HIV感染的细胞或其它患病细胞内表达时它能杀死所述细胞；和
(b)用(a)所述的载体感染所述肿瘤细胞、HIV感染的细胞或其它患病细胞。
(vii)一种调节FAS-R配体或TNF对细胞效应的方法，该方法包括采用核酶步骤，将载体以允许所述核酶序列在所述细胞内表达的形式导入所述细胞内，该载体编码的核酶序列能与编码本发明G1蛋白的细胞mRNA序列相互作用，其中当所述核酶序列在所述细胞内表达时，它与所述细胞mRNA序列相互作用并切割所述mRNA序列，从而抑制所述G1蛋白在所述细胞内的表达。
(viii)一种选自本发明方法的方法，其中所述编码G1蛋白的序列包含本发明的G1同种型、类似物、片段和衍生物中至少一种的编码序列，这些G1同种型、类似物、片段和衍生物能直接或间接和MORT-1或MORT-1结合蛋白(例如Mch4和MACH)结合，而MORT-1再与FAS-IC特异性结合；或能直接或间接和MORT-1或上述MORT-1结合蛋白结合，而MORT-1再结合TRADD，TRADD再结合p55-IC。
(ix)一种分离和鉴定本发明蛋白的方法，该蛋白能直接或间接结合MORT-1蛋白或MORT-1结合蛋白，该方法包括采用酵母双杂交步骤，其中一个杂交载体携带了编码所述MORT-1蛋白或MORT-1结合蛋白的序列，第二个杂交载体携带了来自cDNA或基因组DNA文库的序列，然后用这些载体转化酵母宿主细胞，分离出阳性转化细胞，然后抽提所述第二杂交载体，以获得编码和所述MORT-1蛋白或所述MORT-1结合蛋白结合的蛋白的序列。
(x)根据上文(i)-(ix)所述的方法，其中所述G1蛋白是G1、其类似物、片段和衍生物的任何一种同种型。
(xi)根据上文(i)-(x)所述的方法，其中G1蛋白或其任何同种型、类似物、片段或衍生物参与调节由其它细胞毒性中介体或诱导剂介导或调节的细胞效应，所述G1蛋白、同种型、类似物、片段或衍生物能直接或间接与这些中介体或诱导剂结合。
(xii)一种筛选其它物质(例如肽、有机化合物、抗体等)来获得特异性药物的方法，该药物能抑制G1的活性，例如抑制G1α蛋白酶活性，从而抑制细胞毒性，或抑制G1β活性，从而增强细胞毒性。
上述(xii)的筛选方法的实例包括：
(1)一种筛选能和本发明上述G1蛋白结合的配体的方法，该方法包括使连接了所述蛋白的亲和层析基质与细胞抽提物接触，从而使配体与所述基质结合，然后洗脱、分离并分析所述配体。
(2)一种筛选DNA序列的方法，该序列编码的配体能与本发明G1蛋白结合，该方法包括采用酵母双杂交步骤，其中一个杂交载体携带编码所述蛋白的序列，第二个杂交载体携带了来自cDNA或基因组DNA文库的序列，用这些所述载体转化酵母宿主细胞，分离出阳性转化细胞，并抽提所述第二杂交载体，以获得编码所述配体的序列。
(3)一种鉴定和生产配体的方法，该配体能调节由MORT-1或MORT-1结合蛋白调节/介导的细胞活性，该方法包括：
a)筛选能结合多肽的配体，该多肽包含至少部分MORT-1或MORT-1结合蛋白，该MORT-1或MORT-1结合蛋白选自MACH蛋白、Mch4蛋白和其它MORT-1结合蛋白；
b)对于所述筛选步骤发现的、能进行所述结合、但非MORT-1或所述MORT-1结合蛋白或TNF/NGF受体家族受体一部分的配体，进行鉴定和特性分析；和
c)产生基本上分离的和纯化形式的所述配体。
(4)一种鉴定和产生配体的方法，该配体能调节由本发明G1蛋白调节或介导的细胞活性，该方法包括：
a)筛选出能与多肽结合的配体，该多肽包含图1所示G1α序列的至少一部分或图2所示G1β序列的至少一部分；
b)对于所述筛选步骤发现的、能进行所述结合但非MORT-1或MORT-1结合蛋白或TNF/NGF受体家族受体一部分的配体，进行鉴定和特性分析；和
c)产生基本上分离的和纯化形式的所述配体。
(5)一种鉴定和产生配体的方法，该配体能调节由G1调节/介导的细胞活性，该方法包括：
a)筛选出能与图1所示G1α序列的至少一部分或图2所示G1β序列的至少一部分结合的配体；
b)对于所述筛选步骤发现的、能进行所述结合但非MORT-1或MORT-1结合蛋白或TNF/NGF受体家族受体一部分的配体，进行鉴定和特性分析；和
c)产生基本上分离的和纯化形式的所述配体。
(6)一种鉴定和产生分子的方法，该分子能直接或间接调节由G1调节/介导的细胞活性，该方法包括：
a)筛选出能调节受G1调节/介导的活性的分子；
b)鉴定和特征分析所述分子；和
c)产生基本上分离的和纯化形式的所述分子。
(7)一种鉴定和产生分子的方法，该分子能直接或间接调节由本发明的G1蛋白调节/介导的细胞活性，该方法包括：
a)筛选出能调节受所述G1蛋白调节/介导的活性的分子；
b)鉴定和特征分析所述分子；和
c)产生基本上分离的和纯化形式的所述分子。
本发明还提供了用于调节上述FAS-R配体或TNF对细胞的效应或其它细胞毒性中介体或诱导剂对细胞的效应的药物组合物，该组合物含有下列任何一种物质作为活性组分：
(i)本发明的G1蛋白，及其生物活性片段、类似物、混合性衍生物；
(ii)一种重组动物病毒载体，该载体编码的蛋白能结合细胞表面受体，该载体还编码本发明的G1蛋白或其有生物活性的片段或类似物；
(iii)编码本发明的G1蛋白序列的反义序列的寡核苷酸序列，其中所述寡核苷酸可以是上述(ii)的重组动物病毒载体的第二序列。
本发明还提供：
I.一种调节MORT-1诱导的或MORT-1结合蛋白诱导的细胞效应、或任何其它细胞毒性中介体或诱导剂对细胞的效应的方法，该方法包括根据上述(i)-(x)任一方法，用G1蛋白、其类似物、片段或衍生物或编码G1蛋白、其类似物或片段的序列处理所述细胞，所述处理导致增强或抑制了所述MORT-1介导的效应，从而也增强或抑制了FAS-R或p55-R或所述其它细胞毒性中介体或诱导剂介导的效应。
II.如上所述的一种方法，其中所述G1蛋白、其类似物、片段或衍生物是G1蛋白中参与特异性结合MORT-1或MORT-1结合蛋白、或所述其它细胞毒性中介体或诱导剂的那一部分，或编码G1蛋白中参与特异性结合MORT-1或MORT-1结合蛋白、或所述其它细胞毒性中介体或诱导剂的该部分的所述G1蛋白序列。
III.如上所述的一种方法，其中所述G1蛋白是任何一种G1同种型，所述同种型能增强与MORT-1相关的或与其它细胞毒性中介体或诱导剂相关的对细胞的效应，从而也能增强与FAS-R或p55-R相关的或其它细胞毒性中介体或诱导剂对细胞的效应。
IV.如上所述的一种方法，其中所述G1蛋白是任何一种G1同种型，所述同种型能抑制与MORT-1相关的或与其它细胞毒性中介体或诱导剂相关的对细胞的效应，从而也能抑制与FAS-R或p55-R相关的或其它细胞毒性中介体或诱导剂的细胞效应。
从所有上述内容和下文详细描述可以得出，G1还可以MORT-1非依赖型方式用于处理细胞或组织。G1蛋白的分离及其鉴定和特性分析可用任何用于分离和鉴定蛋白的标准筛选技术(例如酵母双杂交方法、亲和层析方法以及用于此目的的其它任何熟知的标准步骤)来进行。
另外，G1的一些同种型可能只有蛋白酶样区域(与上述其它已知蛋白酶的蛋白酶区域同源)，但是没有真正的蛋白酶活性，结果如上所述，这些同种型可能主要是起抑制作用。
另外，由于G1或其任何同种型可能参与调节MORT-1非依赖型胞内途径，因此G1或其任何同种型可能参与了其它胞内途径或机制的信号传导的调节。
还提供了本发明的其他方面及实例，正如下文中本发明详述中所描述的那样。
应当指出，全文中所使用的下列术语：“FAS-配体或TNF对细胞效应的调节”以及”“MORT-1或MORT-1结合蛋白对细胞效应的调节”应被理解成包括体内处理和体外处理，而且还包括抑制作用或增强/强化作用。
附图简述
图1A示出了实施例1所述G1蛋白的一种同种型的基本核苷酸序列。
图1B示出了从图1A所示同种型推断出的氨基酸序列。
图2示出了实施例1所述G1蛋白的第二种同种型的基本核苷酸序列和推断出的氨基酸序列。
图3示出了人(hCASHα，hCASHβ)G1(或CASH)和小鼠(mCASHα)剪接变体的氨基酸序列比较，以及这些蛋白质中发现的保守性基序。图3中显示了小鼠G1α(mCASHα)、人G1α(hCASHα)和G1β(hCASHβ)、CASP-8(MACH/FLICE1/Mch5)、CASP-10(Mch4/FLICE2)、CASP-3(CPP32/Apopain/Yama)和CASP-1(ICE)的共线氨基酸序列对比。显示出CASP-1和CASP-3没有其“前域(prodomain)”区域。氨基酸残基编号在每个序列的右侧。带点线表示序列中允许最优匹配的间距。“死亡域”组件(DED)用阴影表示。在超过三个蛋白质中相同的氨基酸被框起来。在蛋白酶同源区域中，与CASP-1残基排列对比的经X-射线晶体学方法测得有催化活性的氨基酸表示如下所述：推断参与催化的残基(对应于CASP-1中的His237和Cys285)用深阴影表示，并在对比序列下用实心圆标记。组成P1Asp羧酸侧链的结合口袋的残基(对应于CASP-1中的Arg179，Gln238，Arg341和Ser347)用较浅的阴影表示，并用空心圆标记。已知和建议的Asp-x切割位点以及发现在G1(CASH)相似位置处的潜在切割位点用阴影表示。水平箭头表示小的和大的CASP-1亚单位的N端和C端。蛋白的C端用星号表示。
图4(A，B)显示了Northern印迹法的放射自显影再生结果，其显示了G1转录物在各种人组织(心脏、脑、胎盘、肺、肝、骨骼肌、肾、胰、脾、胸腺、前列腺、睾丸、卵巢、小肠、结肠和外周血淋巴细胞-PBL)中的鉴定。Northern印迹分析按以下方式进行：用T7RNA聚合酶(Promega)制备对应于G1“死亡域”(DED)组件区(G1β中核苷酸编号482-1070(见图2))(克隆的G1(CASH)剪接变体中共有的区域)的放射性标记的mRNA探针，并用于分析含有各种人组织ploy(A)+RNA(每条泳道2μg)的人多组织印迹(Clontech)。
图5显示了G1α(CASHα)和G1β(CASHβ)在转染的酵母中和含有“死亡域”(DED)的其它蛋白(例如MORT1/FADD，MACHα1(CASP-8α1)，MACHβ1(CASP-8β1)，MACHβ4(CASP-8β4)，Mch4(CASP-10)，G1α(CASHα)，G1β(CASHβ)，p55-R(p55ic)，RIP，TRADD和Lamin(阴性对照))相互作用的结果。在酵母SFY526报道物菌株(Clontech)中，用pGBT9-GAL4 DNA结合域和pGAD1318和pGADGH-GAL4激活域载体评价G1β(CASHβ)和G1α(CASHα)的结合性能。如参考实施例1-3中所述的那样，用β-半乳糖苷酶表达过滤试验定量分析酵母中的表达。结果以产生深色所需的时间表示。在测试的所有情况中，当将测试插入物置于组合的DNA结合域和激活域构建物中时，获得相同的结果。检测的插入物与几种对照蛋白(包括人p55-R(CD120a)，p75-R(CD120b)，CD40，核纤层蛋白和Ga14空载体的胞内结构域)均不相互作用。
图6(A-D)显示的结果表示G1α(CASHα)、G1β(CASHβ)和G1α(CASHα)突变体对细胞存活和细胞死亡诱导的效应。如实施例1所述的那样，用所示构建物转染这些细胞，定量分析HeLa-Fas细胞(结果在图6A中以条状图表示)和293-T细胞(结果在图6B和6C中以条状图表示)中诱导的细胞死亡。用所述蛋白以及pCMV-β-gal的cDNA以磷酸钙沉淀方法瞬时转染细胞(每个6cm碟中有5×105293T细胞或3×105HeLa细胞)。每个碟采用5μg感兴趣的pcDNA3构建物转染，或用两种不同的构建物时2.5μg，以及1.5μgβ-半乳糖苷酶表达载体转染。转染后6-10小时清洗细胞，然后进一步培育14小时而不作其它处理。将抗-CD95(抗-Fas-R)单克隆抗体(CH11(Oncor(Gaithersburg，MD))，0.5μg/ml)和人重组TNFα(100ng/ml)和环己酰亚胺(CHX，10μg/ml)一起施加给细胞，再培育4小时。然后用5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷(X-Gal)对细胞染色，用相差显微术检测。在所有所示试验中，对于HeLa-Fas细胞，转染24小时后评价死亡，对于293T细胞，在转染20小时后评价死亡。数据(平均值+SD；n等于至少三次试验)表示所计数的显示出膜泡的蓝色细胞的百分数。
图6D显示了瞬时表达所述构建物的293-T细胞形态的重复显微图片。图片于转染20小时后拍摄。
发明详述
本发明一方面涉及新的G1蛋白，它能直接或间接和MORT-1或MORT-1结合蛋白(例如Mch4和MACH)结合或相互作用，从而能与MORT-1所结合的FAS-受体的胞内结构域结合，或能与p55TNF-R的胞内结构域结合，该胞内结构域与TRADD蛋白结合，而TRADD蛋白与MORT-1结合。因此，认为本发明的G1蛋白是FAS-R的中介体或调节剂，它在由FAS配体与FAS-R的结合所启动的信号传导过程中起作用，同样，它也在由TNF和p55-R结合所启动的信号传导过程中起作用。本发明的G1蛋白包括新发现的G1及其同种型。
更具体地说，本发明公开了一种新的G1蛋白(也称为CASH)，它显然是线虫蛋白酶CED3的一种同系物。这一新的G1蛋白尽管与之密切相关，但是它表现出一些结构差异和底物特异性差异，因此可在哺乳动物细胞中发挥不同功能。实际上，已经知道该蛋白酶的两种不同的活性。ICE(也称为CASP-1)的主要作用看来是加工IL-1β前体，而CED3却已经清楚地表明是作为编程性细胞死亡的效应物起作用。后一作用看来似乎也至少是一些哺乳动物同系物(例如上述共同拥有的待批专利申请中的某些MACH(也称为CASP-8)同种型以及上述的与本发明G1蛋白结合的Mch4(也称为CASP-10))的作用。MACHα1的氨基酸序列显示出与CPP32(已知的最接近CED3的哺乳动物同系物，也称为CASP-3)最相似。MACH的底物特异性也与CPP32相似，只是看来MACHα1具有比CPP32更高的限制性底物特异性。CPP32优先切割底物肽于相应聚(ADP核糖)聚合酶(PARP)中的切割位点，但是对于底物肽中相应于IL-1β前体中的ICE切割位点也具有某些蛋白水解活性。然而，好象MACHα1只能切割PARP衍生的序列。MACHα1与CPP32和CED3的这些关系及其与ICE的不相似之处符合下述观点，即MACHα1类似于CED3，起着细胞死亡调节剂的作用。但是，MACHα1表现出与CED3和CPP32以及CED3/ICE家族中其它所有成员不同的一些序列特征。MACHα1的CED3/ICE同源区上游的C端部分与其它同系物的上游区域一点也不相似。该蛋白的CED3/ICE同源区也有一些独特的序列特征。这些差异表明MACHα1属于该家族的不同进化支系，它对细胞死亡的作用与前述的CED3/ICE同系物稍有不同。同样，本发明的G1蛋白及其可能的同种型在G1序列CED3/ICE同源区中也表现出明显不同，因此这些差别可能是反映G1在哺乳动物细胞中活性特异性的独特特征。
一个重要的差别可能是蛋白酶功能受调节的方式。由于涉及发育中相关的细胞死亡过程和受体诱导的免疫溶细胞作用，CED3/ICE家族的蛋白酶切割蛋白应易受细胞内形成的信号以及细胞表面受体发出的信号的调节。在发育性细胞死亡过程中，这些蛋白酶的激活看来涉及到影响基因表达的机制，从而导致蛋白酶的合成增强，及拮抗其凋亡效应的蛋白(如BCL-2)的合成减少。然而，这显然不是由FAS-R或TNF受体引发细胞毒性所致。细胞甚至可在它们的蛋白合成活性受到完全封闭时被TNF或FAS-R配体杀死(实际上它们被更有效地杀死)，并在这些条件下保持刺激依赖型。因此，TNF受体和FAS-R激活CED3/ICE家族的蛋白酶可能以蛋白质合成非依赖型机制发生。MACHα1的独特序列性质能使其参与该机制。同样，本发明的G1蛋白的独特序列性质也会赋予它参与该机制的能力。
因此，新的G1蛋白可能是最近发现的蛋白酶组中的另一个成员，该蛋白酶组包括上述MACH(及其同种型)以及Mch4，已经发现它们能直接或通过衔接蛋白和细胞表面受体胞内结构域结合。从具有其它酶活性的受体结合蛋白的作用方式推断，G1与Mch4或MACH(或同种型Machα1)结合，然后Mch4或Mach与MORT-1结合，或G1直接和MORT-1结合，从而在FAS-R被Fas配体引发时刺激了G1和/或Mch4和/或MACH蛋白酶活性，看来这似乎是合理的。它还能使蛋白酶被p55-R激活(通过MORT1和TRADD结合，TRADD与p55-R结合)。
发现CED3/ICE家族的其它成员仅仅在蛋白水解加工(通过其自身断裂或该家族其它蛋白酶的作用产生(回顾见Kumas，1995；Henkart，1996))后才表现出全部活性。例如，如上述关于MACH的共同拥有待批专利申请中所述的那样，MACHα1的两种主要的潜在自身断裂产物共同表达产生的细胞毒性作用(与表达全长CED3/ICE同源区的细胞中没有细胞毒性相反)符合这样一个可能性，即MACHα1也只有在加工后才获得全部活性。在表达全长区的细菌裂解液中发现的酶活性显然反映出在这些条件下产生的该蛋白进行了自身加工或被一些细菌蛋白酶加工。关于这种加工在哺乳动物细胞中以何种方式发生以及它怎样由FAS-R和p55-R引发还未知晓，而MACHα1的蛋白酶活性对FAS-R和TNF诱导的细胞毒性的相对贡献也不明确。由于缺少CED3/ICE同源区的MACHβ1的表达也会导致显著的细胞毒性，使得对该作用的评价变得复杂。据推测，该细胞毒性反映了MACHβ1与MACHα1结合的能力。由于这种能力，转染的MACH分子可能会在聚集时使MACHα1分子发生构象变化，而该变化是对于转染细胞来说是内源性的。这种机制还很好地解释了当在MACH上游起作用的分子(MORT-1、TRADD或p55-R或FAS-R的死亡域)在细胞内过度表达时所发现的细胞毒性。然而，此时不能排除在诱导MACH或在其上游起作用的分子表达时所发现的细胞毒性(除MACH中CED3/ICE同源区的蛋白水解活性外)，它反应了还有其它一些激活机制，据信参与了FAS-R和p55-R的细胞毒性效应(例如激活中性或酸性神经鞘磷脂酶)。另外也不能排除CED3/ICE同源区的蛋白水解活性还起着除细胞毒性诱导作用以外的其它功能。鉴定在MACHα1激活时断裂的内源底物蛋白，就能更清楚地了解MACHα1的功能。寻找方法来消除MACHα1活性(例如通过抑制性分子的表达)也有助于了解该蛋白的功能，当需要时，该方法还可作为调节其活性的方法。
因此，本发明的G1蛋白及其可能的同种型能以与上述MACH蛋白的类似方式通过直接或非直接与其它蛋白相互作用来起作用，即，G1可通过结合MORT-1来直接起作用，或可通过结合Mch4和/或MACH、而Mch4和/或MACH再与MORT-1结合来间接起作用，或以其它一些还未阐明的G1特异性机制来起作用。类似地，G1活性的调节可能与上述MACH蛋白调节所预计的类似。
表达此类蛋白所包括的蛋白酶的G1天然抑制剂广泛存在于细胞内。CED3/ICE家族其它成员中有一些成员的其它剪接同种型的存在显示了一种从生理上限制这些蛋白酶功能的方式。据报道，这些其它蛋白酶的一些同种型作为全长同种型的天然抑制剂起作用，它们之间显然形成了元活性的异二聚体。对于G1及其一些可能的同种型(例如N端切割位点丢失的那些同种型)也是如此。这些抑制型同种型的表达可能是细胞自我保护抵抗FAS-R和TNF细胞毒性的一种机制。
G1可能还有其它功能，例如G1或其任何同种型可能对具有酶活性的其它蛋白(例如各种Mch4和MACH同种型的蛋白水解活性)有增强或强化作用，这种活性的增强或强化利用的机制是G1起加强(recruit)其它蛋白(如Mch4和MACH蛋白)与MORT-1结合的作用。另外，G1或其同种型还起着与细胞毒性无关的作用，但是可能作为参与FAS-R和TNF的其它非细胞毒性效应的停靠部位。
下文实施例1中列举了本发明的一些特异性G1同种型。其中一个称为G1α，自人和小鼠中分离而得(分别为hG1α/hCASHα和mG1α/mCASHα)，它显然是具有蛋白酶同源区的1mg剪接变体，至少在一些细胞(例如293细胞)中有胞毒活性。另一种称为G1β(CASHβ)，自人体中分离获得，它显然是一种短的剪接变体，没有蛋白酶同源区，它实际上抑制细胞死亡信号传导途径。
由于FAS-R和TNF受体能独特地引起细胞死亡，以及TNF受体能引发其它各种组织破坏性活性，因此这些受体的功能畸变可能对生物体特别有害。实际上，这些受体的功能过量和不足均已表明会导致各种疾病的病理表现。鉴定参与这些受体信号传导活性的分子，以及寻找方法来调节这些分子的功能，这些都为这些疾病的治疗新方法提供了潜在的线索。由于怀疑G1在FAS-R和TNF毒性中有重要作用，因此设计出能阻遏该分子蛋白水解功能的药物似乎尤其重要，而对CED3/ICE家族的其它一些成员已经采用这种做法。G1分子中包括的CED3/ICE同系物的独特序列特征允许设计出这样的药物，这些药物能提供保护防止过度的免疫介导的细胞毒性，而对CED3/ICE家族其它成员涉及的生理性细胞死亡过程没有干扰。
如上所述，G1或其同种型还能以MORT-1或MORT-1结合蛋白非依赖型方式参与调节其它胞内信号传导途径(例如其它细胞毒性中介体或诱导剂或其它蛋白)。另外，G1或其至少具有蛋白酶样区但没有实际蛋白酶活性的同种型主要是具有抑制功能，即抑制那些途径(例如总的来说是信号传导途径，或具体而言是细胞毒性途径)，其中G1或其同种型直接和这些途径的成员结合，或间接地和其它蛋白结合，而这些蛋白再与这些途径的成员结合。
因此，本发明还涉及编码G1蛋白的DNA序列以及该DNA序列所编码的G1蛋白。
另外，本发明还涉及编码G1蛋白的具有生物活性的类似物、片段和衍生物的DNA序列，以及其编码的类似物、片段和衍生物。这些类似物、片段和衍生物的制备采用标准的步骤(例如参见，Sambrook等，1989)，其中编码G1蛋白的DNA序列中一种或多种密码子可以缺失、加入或被另一种取代，从而产生与天然蛋白至少有一个氨基酸残基发生改变的类似物。
“基本对应于”G1蛋白的多肽或蛋白质不仅包括G1蛋白，也包括G1蛋白类似物的多肽或蛋白。
基本对应于G1蛋白的类似物，是在G1蛋白的氨基酸序列中一个或多个氨基酸被其它氨基酸取代、或被删除、或被插入而形成的多肽，只要所得的蛋白质基本上呈现出与其所对应的G1蛋白同样或更好的生物活性。
为了基本对应于G1蛋白，在G1蛋白序列中的变化(如同种型)通常较小。虽然变化的数目可以多于10个，但较佳的不多于10个，更佳地不多于5个，最佳地不多于3个这样的变化。尽管任何技术都可运用于发现有潜在生物学活性且基本对应于G1蛋白的蛋白质，但是一种这样的方法是对编码该蛋白质的DNA运用常规的诱变方法，产生一些修饰形式。然后，根据它们与各种MORT-1结合蛋白(例如Mch4和MACH)结合的能力、或直接和MORT-1结合的能力，和/或介导FAS-R和p55-R的活性，和/或以上述方式介导其它胞内途径的活性，对这些克隆表达的蛋白加以筛选。
“保守的”变化是指预计不会改变蛋白质活性的那些变化，这些变化通常是首先要筛选的，因为这些变化预计不会明显改变蛋白大小、电荷或构型，因而预计不改变生物特性。
G1蛋白的保守取代形式包括：多肽中至少一个氨基酸残基被不同的氨基酸保守地取代。较佳地，这种取代是根据表1A中下列清单进行，这些取代可用常规实验方法来确定，从而使合成的多肽分子在保持G1蛋白生物活性的同时又在结构和功能性质上有所变化。
                            表  IA
原来的残基                      代表性的取代残基
Ala                             Gly；Ser
Arg                             Lys
Asn                             Gln；His
Asp                             Glu
Cys                             Ser
Gln                             Asn
Glu                             Asp
Gly                             Ala；Pro
His                             Asn；Gln
Ile                             Leu；Val
Leu                             Ile；Val
Lys                             Arg；Gln；Glu
Met                             Leu；Tyr；Ile
Phe                             Met；Leu；Tyr
Ser                             Thr
Thr                             Ser
Trp                             Tyr
Tyr                             Trp；Phe
Val                             Ile；Leu
或者，另一类G1蛋白的取代形式是在多肽中删去至少一个氨基酸残基，然后再根据下表IB在其位置插入不同残基。多肽中可进行的取代类型可依据对不同种类中同源蛋白之间氨基酸变化频率的分析结果，例如Schulz等，G.E.，“蛋白质结构原理”(Principles of Protein Structure)，Springer-Verlag，New York，NY，1978中的表1-2，以及Creighton，T.E.，“蛋白质：结构和分子性能”(Proteins：Structure and Molecular Properties)，W.H.Freeman & Co.，San Francisco，CA 1983中的图3-9中给出的分析结果。根据这一分析，本文另外定义了保守性取代，该取代能在下列5组任一组中进行互换。
                                表IB
1.小的脂族非极性或弱极性残基：Ala、Ser、Thr(Pro，Gly)；
2.极性带负电荷的残基及其酰胺：Asp、Ash、Glu、Gln；
3.极性带正电荷的残基：His、Arg，Lys；
4.大的脂族非极性残基：Met、Leu、Ile、Val(Cys)；和
5.大的芳族残基：Phe、Tyr、Trp。
上述括号中的3个氨基酸残基在蛋白质结构中有特殊作用。Gly是唯一没有侧链的残基，因而它赋予肽链柔韧性。然而，这会倾向于形成除α-螺旋外的二级结构。Pro，因其不同寻常的几何结构，会紧密地约束肽链，并且通常会促进类似于β-转角的结构，而在一些例子中，Cys能够参与二硫键的形成(二硫键的形成在蛋白质折叠中很重要)。应注意，Schulz等(同上)将上面的第1和第2组合二为一。还应注意，Tyr，因其有形成氢键的趋势，因此与Ser和Thr等有显著的亲近关系。
根据本发明进行的保守性氨基酸取代，例如上面所陈述的，都是本领域中已知的，并且预期在氨基酸取代之后可以维持多肽的生物学和结构特性。本发明的大多数缺失和取代是那些不导致蛋白质或多肽分子特性发生根本变化的类型。“特性”以遍举方式(non-inclusive)定义，其定义了二级结构(如α-螺旋或β-折叠)的变化和生物活性(例如与MORT-1结合蛋白或MORT-1的结合或对FAS-R或TNF细胞效应的介导作用)的变化。
可用于本发明来获得G1蛋白类似物的在蛋白质中产生氨基酸替换的例子包括：任何已知的方法步骤，例如在授予Mark等的美国专利RE 33,653、4,959,314、4,588,585和4,737,462；授予Koths等的美国专利5,116,943；授予Namen等的美国专利4,965,195；授予Chong等的美国专利4,879,111；授予Lee等的美国专利5,017,691中给出的方法；以及在美国专利No.4,904,584(Shaw等)中给出的用赖氨酸取代的蛋白质。
除了上述的不会明显改变G1蛋白活性的保守性取代外，那些会增加G1蛋白类似物生物活性的保守性取代或保守性稍低而随机性较高的改变，也在本发明范围之内。
当需要证实取代或缺失的确切效果时，本领域技术人员知道，可以通过常规的结合和细胞死亡试验来评估取代、缺失等的效果。用该标准测试方法进行筛选并不需要过多的实验。
可接受的类似物是至少能如上所述的那样保留了和MORT-1结合蛋白结合或与MORT-1或其它蛋白结合的能力，从而能如上所述的那样介导FAS-R和p55-R或上述其它蛋白活性的那些类似物。通过这种方式，可以产生具有所谓显性阴性效应的类似物，即该类似物在结合MORT-1结合蛋白(如Mch4或MACH)方面或结合MORT-1或其它蛋白方面、或在随后的信号传导或该结合后的蛋白酶活性方面有缺陷。这些类似物可通过与天然的MORT-1结合蛋白或其它蛋白竞争来(例如)抑制FAS-配体的效应或其它蛋白的效应。例如，似乎MACH同种型MACHα2和MACHα3是“天然的”类似物，它们的作用是通过与活性MACH(蛋白酶)同种型竞争结合MORT-1(MORT-1看来是这些MACH同种型激活所必需的)来抑制MACH的活性。一旦活性MACH同种型不能与MORT-1结合，那么由FAS-R和p55-R介导的胞内信号传导途径也会被抑制。G1或其任何同种型也会通过和各种MORT-1结合蛋白竞争结合MORT-1或以防止它们结合MORT-1的方式与它们相互作用，从而以类似的方式作为FAS-配体效应的抑制剂起作用。同样，也可产生所谓的显性阳性G1类似物，该类似物能增强FAS配体或TNF的效应。它们具有相同或更佳的和MORT-1结合蛋白结合的能力，或者甚至相同或更佳的MORT-1结合性能，以及相同或更佳的天然G1蛋白的信号传导性能。
在遗传水平上，这些类似物通常可以这样制得：对编码G1蛋白的DNA中的核苷酸进行定点诱变，从而产生编码类似物的DNA，随后合成DNA并在重组细胞培养中表达多肽。类似物通常表现出与天然存在的蛋白相同或更高的生物活性，Ausubel等，Current Protocols in Molecular Biology，Greene Publications andWiley Interscience，New York，NY，1987-1995；Sambrook等，分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY，1989。
制备本文所述的G1蛋白，或者制备能编码相同多肽但与天然序列不同的其他核苷酸序列(因为遗传密码已知的简并性允许这些变化)，都可以通过定点特异性诱变编码早先制得的G1蛋白类似物或天然G1蛋白的DNA而实现。定点特异性诱变可以利用特异性的寡核苷酸序列来产生类似物，其中该特异性寡核苷酸序列具有所需突变的DNA序列以及足够数目的毗邻核苷酸，以提供具有足够大小和序列复杂度(complexity)的引物序列，从而在被横跨的缺失相接处两侧形成稳定的双链体。通常，较佳的是长度约20-25个核苷酸的引物，伴有在被改变的序列的每一侧有约5-10个互补核苷酸。一般，定点特异性诱变技术是本领域中众所周知的，代表性的例子例如是Adelman等，DNA，2：183(1983)，该文献的公开内容纳入本文作参考。
正如人们所知晓的那样，定点诱变技术通常采用单链和双链形式的噬菌体载体。用于定点诱变的典型载体包括：载体如M13噬菌体，例如公开在Messing等，Third Cleveland Symposium on Macromolecules and Recombinant DNA，A.Walton，Elsevier，Amsterdam编辑(1981)中，该文献纳入本文作参考。这些噬菌体易在商业上购得，且它们的用法通常是本领域技术人员所熟知的。或者，也可用含有单链噬菌体复制起点的质粒载体来获得单链DNA(Veira等，Meth.Enzymol.153：3，1987)。
通常，本文所述的定点诱变这样来进行：先获得一单链载体，该载体序列中含有编码有关多肽的DNA序列。用自动化DNA/寡核苷酸合成法制得携带所需突变序列的寡核苷酸引物。然后将该引物与含有蛋白质编码序列的单链载体退火，然后用有DNA聚合作用的酶(如大肠杆菌聚合酶I的Klenow片段)作用，完成携带突变的链的合成。这样，突变序列和第二条链就带有所需的突变。然后用该异源双链载体转化合适的细胞(如大肠杆菌JM101细胞)，并选出含有带突变序列重排的重组载体的克隆。
在选出了这样的克隆后，可以取出有突变的G1蛋白序列，并置于合适的载体中，该载体通常是可用于转染合适宿主的转移载体或表达载体。
因此，利用已知的DNA或RNA扩增技术(如PCR和化学寡核苷酸合成技术)，在体外、原位和/或体内检测、获得和/或修饰编码G1蛋白的基因或核酸。PCR可以通过重复的DNA聚合酶反应来扩增特异的DNA序列(增加数目)。该反应可用作克隆的替代手段；而所需的只是有关核酸序列的知识。为了进行PCR，可设计与感兴趣的序列互补的引物。然后通过自动化DNA合成法制得这些引物。因为引物可被设计成与基因任何部分杂交，因此可创造一些能够容忍互补碱基对存在错配的条件。扩增这些错配区域会导致合成出诱变的产物，从而产生具有新特性的肽(即定点诱变)。另见例如Ausubel，(同上)，第16章。此外，通过联合互补DNA(cDNA)合成技术，并使用反转录酶和PCR反应，可将RNA用作原料来合成催乳素受体的胞外结构域，而不经过克隆。
此外，PCR引物可被设计成含有新的限制性位点或具有其他特征，例如在待扩增的基因片段末端处的终止密码子。在扩增的基因序列的5′和3′端安置限制性位点，可以使编码G1蛋白或其片段的基因片段能按需进行设计，以便连接其他序列和/或其他载体的克隆位点。
PCR及扩增RNA和/或DNA的其它方法是本领域众所周知的，并且根据此处所讲述和给予的指导，元需过多试验就可根据本发明进行使用。已知的DNA或RNA扩增方法包括(但并不限于)：聚合酶链反应(PCR)和有关的扩增方法(例如参见授予Mullis等的美国专利No.4,683,195、4,683,202、4,800,159、4,965,188；授予Tabor等的美国专利4,795,699和4,921,794；授予Innis的美国专利5,142,033；授予Wilson等的美国专利5,122,464；授予Innis的美国专利5,091,310；授予Gyllensten等的美国专利5,066,584；授予Gelfand等的美国专利4,889,818；授予Silver等的美国专利4,994,370；授予Biswas的美国专利4,766,067；授予Ringold的美国专利4,656,135；和Innis等编辑的PCR Protocols：A Guide to Method and Applications)，以及RNA介导的扩增方法，其中使用对靶序列反义的RNA作为模板来合成双链DNA(授予Malek等的美国专利No.5,130,238，其商品名为NASBA)；以及结合了DNA扩增和抗体标记技术的免疫-PCR(Ruzicka等，Science 260：487(1993)；Sano等，Science 258：120(1992)；Sano等，Biotechniques 9：1378(1991))。这些专利和对比文献的全部内容纳入本文作参考。
按类似的方式，G1蛋白的生物活性片段(例如G1或其同种型的任何片段)，可参考上述G1蛋白类似物所述的方式进行制备。合适的G1蛋白片段是那些保留G1蛋白能力，并能如上所述介导FAS-R和p55-R或其它蛋白生物活性的片段。因此，可以制得上述相对于类似物而言具有显性阴性或显性阳性效应的G1蛋白片段。应注意，这些片段代表了本发明的一类特殊的类似物，即，它们是衍生自全长G1蛋白序列的G1蛋白的确定部分(如任何一种G1或其同种型获得的片段)，每个片段或这样的部分具有任一上述所需的活性。例如，这样的片段可以是肽。
类似地，衍生物还可通过对G1蛋白及其类似物或片段的一个或多个氨基酸残基侧链基团进行标准修饰，或者通过将G1蛋白及其类似物或片段偶联于其他分子(例如抗体、酶、受体等)来制得，这些技术都是本领域中熟知的。因此，本文所用的术语“衍生物”覆盖了用本领域已知手段对位于残基侧链的官能团或N-端或C-端基团进行修饰而制得的衍生物，这些衍生物均包括在本发明内。衍生物可以具有化学分子部分，例如碳水化合物或磷酸残基，只要这样的组份具有与G1蛋白相同或更高的生物活性。
例如，衍生物可包括：羧基的脂族酯、羧基的酰胺(通过与氨或与伯胺或仲胺反应获得)、氨基酸残基的游离氨基与酰基部分(例如烷酰基(alkanoyl)或碳环类的芳酰基)形成的N-酰基衍生物，或游离的羟基(例如丝氨酰或苏氨酰残基)与酰基部分形成的O-酰基衍生物。
术语“衍生物”只包括那些没有一个氨基酸变成20种常见的天然氨基酸中的某一种氨基酸的衍生物。
尽管G1蛋白是蛋白质或多肽，但是它是氨基酸残基序列。根据本文的定义，由包括了G1蛋白全部序列的更长序列所构成的多肽，也被包括在该多肽范围内，只要所添加部分不影响本发明的基本特性和新的特性，即，它们保留或提高了G1蛋白的生物活性，或它们能够被断裂产生具有G1蛋白生物活性的蛋白质或多肽。因此，例如，本发明包括G1蛋白与其他氨基酸或肽形成的融合蛋白。
新的G1蛋白、其类似物、片段和衍生物有许多可能的用途，例如：
(i)在需要增强FAS-R配体或TNF或其它蛋白效应的场合下(例如在抗肿瘤、抗炎、抗HIV等应用中)，在需要FAS-R配体或TNF或其它蛋白诱导细胞毒性的场合下，G1蛋白、其类似物、片段和衍生物可用来模拟或增强MORT-1结合蛋白(例如Mch4和MACH(包括其各种同种型))或者甚至是MORT-1本身的功能，从而模拟或增强FAS-R配体或TNF或其它蛋白的功能。在这种情况下，可用将本来已知的标准技术将增强FAS-R配体或TNF或其它蛋白效应(即胞毒效应)的G1蛋白、其类似物、片段或衍生物导入细胞内。例如，当G1蛋白全部在细胞内(如所怀疑的那样)，并且应仅仅导入需要FAS-R配体或TNF或其它蛋白效应的细胞内时，就需要将该蛋白特异性导入细胞内的导入系统。实现该目的的一种方法是产生一个重组动物病毒(例如从牛痘获得)，在DNA中导入下列两个基因：编码配体的基因，该配体能与细胞特异性表达的细胞表面蛋白(例如一种是与一些细胞(CD4淋巴细胞和相关的白血病细胞)特异性结合的AID(HIV)病毒gp120蛋白)结合，或者是编码与携带FAS-R或p55-R的细胞特异性结合的任何其它配体的基团，这样重组病毒载体将能结合这些携带FAS-R或p55-R的细胞；以及编码G1蛋白的基因。这样，细胞表面结合蛋白在病毒表面上的表达会使病毒特异性地靶向肿瘤细胞或其它携带FAS-R或p55-R的细胞，然后编码G1蛋白的序列(例如G1α序列)会通过病毒导入细胞内，而且它一旦在细胞内表达，就会增强FAS-R配体或TNF效应，导致希望杀死的肿瘤细胞或其它携带FAS-R或p55-R的细胞死亡。这些重组动物病毒可用标准技术来构建(例如参见，Sambrook等，1989)。另一种可能是将G1蛋白的序列(例如G1或其同种型的任何一种)以能被细胞吸收并在其中表达的寡核苷酸形式导入。
增强这类细胞毒性的另一种方法是抑制本身对细胞毒性有抑制作用的G1同种型(例如G1β)的活性。抑制这些G1同种型的方式有各种各样，包括下文(ii)中用来特异性抑制这些抑制性G1同种型(例如G1β)所列举的那些方式。
(ii)例如在脓毒休克、移植物抗宿主排斥反应或急性肝炎中组织破坏的情况下，当需要阻断FAS-R配体或TNF诱导的FAS-R或p55-R胞内信号传导或其它蛋白介导的信号传导时，它们可用来抑制FAS-R配体、TNF或其它蛋白的效应。在这种情况下，例如可用标准步骤将具有G1蛋白反义编码序列的寡核苷酸导入细胞内，这会有效地阻断编码G1蛋白的mRNA的翻译，从而阻断了它的表达，并导致抑制FAS-R配体或TNF或其它蛋白的效应。这些寡核苷酸可用上述重组病毒方法来导入细胞，病毒携带的第二种序列是寡核苷酸序列。
另外，如上文和下文所列举的，已经分离出至少一种G1同种型，它是细胞毒性的“天然抑制剂”，即G1β。因此可将这种G1同种型直接给予细胞，或将携带编码该同种型的核苷酸序列的合适载体导入细胞内，这样，当该G1同种型在细胞内表达时，它能抑制细胞毒性。
另一种可能是采用对G1蛋白有特异性的抗体来抑制其细胞内信号传导活性。
抑制FAS-R配体或TNF效应的还有一种方法是最近开发出来的核酶方法。核酶是具有催化性的RNA分子，它能特异性地切割RNA。核酶可被工程改造成切割所选的靶RNA(例如编码本发明G1蛋白的mRNA)。这种核酶具有对G1蛋白mRNA有特异性的序列，并且能在切割mRNA后与其相互作用(互补结合)，从而导致G1蛋白表达的减少或完全丧失，而表达减少的水平取决于靶细胞中核酶表达的水平。为了将核酶导入所选细胞(例如携带FAS-R或p55-R的那些细胞)内，可以采用任何合适的载体，例如通常用于此目的的质粒、动物病毒(逆转录病毒)载体(另见上文(i)，其中病毒具有的第二序列是编码所选核酶序列的cDNA)。(关于有关核酶方法的回顾参见Chen等，1992；Zhao和Pick，1993；Shore等，1993；Joseph和Burk 1993；Shimayama等，1993；Cantor等，1993；Barinaga，1993；Crisell等，1993和Koizumi等，1993)。
(iii)G1蛋白、其类似物、片段或衍生物还可用来分离、鉴定和克隆同一类的其它蛋白，即与FAS-R胞内结构域或功能上相关的受体结合的那些蛋白、或与上述MORT-1结合蛋白结合的那些蛋白、或与MORT-1结合从而和功能上相关的受体(如FAS-R和p55-R)结合并涉及细胞内信号传导过程的那些蛋白。在这种应用中，可采用上述酵母双杂交系统，或可采用最近开发出的采用非严谨性Southern杂交随后进行PCR克隆的系统(Wilks等，1989)。在Wilks等的出版物中，描述了鉴定和克隆两种推定蛋白-酪氨酸激酶的方法，该方法采用非严谨性的Southern杂交，然后根据激酶基序的已知序列(一种设想出的激酶序列)通过PCR克隆。该方法可用于本发明，用G1蛋白的序列来鉴定和克隆与MORT-1结合蛋白有关的那些蛋白。
(iv)利用本发明的G1蛋白、或其类似物、片段或衍生物的还有一种方法是将它们用于亲和层析方法来分离和鉴定它们能结合的其它蛋白或因子，例如涉及细胞内信号传导过程的MORT-1、MORT-1结合蛋白或其它蛋白或因子。在这种应用中，本发明的G1蛋白、其类似物、片段或衍生物可单独与亲和层析基质连接，然后使其与细胞抽提物或怀疑涉及细胞内信号传导过程的分离的蛋白或因子接触。在亲和层析步骤后，就可洗脱、分离并鉴定和本发明的G1蛋白、或其类似物、片段或衍生物结合的其它蛋白或因子。
(v)如上所述，本发明的G1蛋白或其类似物、片段或衍生物还可用作免疫原(抗原)来生产其特异性的抗体。这些抗体还可用来从细胞抽提物或产生G1蛋白、或其类似物或片段的转化细胞系中纯化G1蛋白(例如G1或其任何同种型)。另外，这些抗体还可用于诊断目的，用来鉴定与FAS-R配体或TNF系统功能异常有关的疾病，例如FAS-R配体或TNF诱导的过度活泼或不够活泼的细胞效应。因此，若这些疾病与涉及MORT-1蛋白、或上述其它各种MORT-1结合蛋白或G1蛋白本身的胞内信号传导系统功能失常有关，那么这些抗体就可作为重要的诊断工具。
还应注意，本发明的G1蛋白的分离、鉴定和特性分析可用任何熟知的标准筛选步骤来进行。例如，这些筛选步骤中的一种(如下文所述的酵母双杂交步骤)可用来鉴定MORT-1蛋白，随后是各种MORT-1结合蛋白以及本发明的G1蛋白。同样，如上文和下文所述，也可采用其它步骤，例如本领域熟知的亲和层析、DNA杂交步骤，来分离、鉴定和特性分析本发明的G1蛋白，或来分离、鉴定和特性分析能与本发明的G1蛋白结合的其它蛋白、因子、受体等。
如上所述，G1蛋白可用来产生对G1蛋白(例如G1及其同种型)有特异性的抗体。这些抗体或其片段可如下文所述使用，应理解，在这些应用中，抗体或其片段是对G1蛋白有特异性的抗体。
根据本发明的发现(即至少一些G1或其可能的同种型是与CED3/IDE蛋白酶家族的蛋白酶有关的蛋白酶)，预计这些G1蛋白和同种型有下列具体的医学用途：已经发现有其它CED3/ICE蛋白酶的特异性抑制剂存在，其中一些可渗入细胞，它们能有效阻断编程性细胞死亡过程。因此，根据本发明，可设计出能够防止G1蛋白酶同种型涉及的FAS-R配体或TNF诱导的细胞死亡的抑制剂。另外，鉴于这些新G1蛋白酶的独特序列特征，看来可以设计出对TNF和FAS-R配体诱导的效应高度特异性的抑制剂。本发明的发现还提供了一种方法来研究“致死性蛋白酶”在对FAS-R配体和TNF应答反应中被激活的机制，这样就能随后开发出控制该激活程度的药物。该药物对许多疾病都有很大的帮助。其中有：急性肝炎，其中肝的急性破坏看来反映了FAS-R配体介导的肝细胞死亡；自身免疫诱导的细胞死亡，例如胰的β郎格罕氏细胞死亡，从而导致糖尿病；移植物排斥反应(例如肾、心脏和肝)中的细胞死亡；大脑多发性硬化中的少突神经胶质细胞的死亡；和引起AIDS病毒增殖从而导致AIDS病的AIDS抑制性T细胞自杀。
如上所述，G1或其一种或多种可能的同种型(例如G1β同种型)可作为G1蛋白酶或G1蛋白酶同种型的“天然”抑制剂，它们可如上所述用作这些G1蛋白酶的特异性抑制剂。同样，还可筛选出其它物质如肽、有机化合物、抗体等，以获得能抑制G1蛋白酶的特异性药物。
如何来设计和筛选G1蛋白酶的肽抑制剂的非限制性实施例所根据的以前的研究是：ICE或ICE样蛋白酶的肽抑制剂，ICE的底物特异性以及用肽合成法分析表位的策略。已发现，ICE有效切割肽的最低要求涉及切割位点左侧的4个氨基酸，并且在P1位置强烈优选天冬氨酸，在P1位的右侧有足够的甲胺(Sleath等，1990；Howard等，1991；Thornberry等，1992)。此外，一种缩写为Ac-DEVD-AMC的荧光底物肽(四肽)乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-甲基-香豆酰(coumaryl)-7-酰胺)，它对应于在FAS-R刺激和其他凋亡过程(Kaufmann，1989；Kaufmann等，1993；Lazebnik等，1994)之后不久在细胞中发现的被切割的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的序列，而且该底物可被CPP32(CED3/ICE蛋白酶家族的一个成员)和MACH蛋白酶有效地切割(同样也可能被G1蛋白酶切割)。
因为底物P1位的Asp显得很重要，因此可快速筛选第四个氨基酸残基为Asp且在前3个残基位置有各种组合的四肽是否与G1蛋白酶活性位点结合，例如采用Geysen开发的方法(Geysen，1985；Geysen等，1987)，在该方法中对固相载体上的大量肽进行筛选，确定它们是否与抗体有特异性的相互作用。MACH蛋白酶与特异性肽的结合可用本领域技术人员技术范围内各种熟知的检测方法(例如对G1蛋白酶作放射标记)来检测。已表明，Geysen的这种方法每个工作日至少能测试4000种肽。
因为设计出选择性抑制G1蛋白酶而不干扰CED3/ICE家族蛋白酶的其它成员参与的生理性细胞死亡过程的肽抑制剂可能是有好处的，所以可以进一步合成上述试验中结合G1蛋白酶的肽库作为荧光底物肽，以测试G1蛋白酶的选择性切割，而不被其它CED3/ICE蛋白酶切割。然后可对经测定可被G1蛋白酶选择性切割的肽进行修饰，以提高细胞通透性并可逆或不可逆地抑制G1的细胞死亡活性。Thornberry等(1994)报道了一种四肽(酰氧基)甲基酮Ac-Tyr-Val-Ala-Asp-CH2OC(O)-[2，6-(CF3)]Ph，它是ICE的强效灭活剂。类似地，Milligan等(1995)报道，具有氯甲基酮的四肽抑制剂(不可逆地)或具有醛基团的四肽抑制剂(可逆地)可抑制ICE。此外，已表明苄氧基羧基-Asp-CH2OC(O)-2，6-二氯苯(DCB)可抑制ICE(Mashima等，1995)。因此，可以用例如醛基、氯甲基酮、(酰氧基)甲基酮或CH2OC(O)-DCB基团对选择性地结合G1蛋白酶的四肽进行修饰，以产生G1蛋白酶活性的肽抑制剂。
尽管其它CED3/ICE蛋白酶的一些特异性抑制剂具有细胞通透性，但是肽抑制剂的细胞通透性可能仍需增强。例如，可对肽作化学修饰或衍生化，以增强其通过细胞膜的通透性，并使这些肽能传递通过膜进入细胞质。Muranishi等(1991)报道了用月桂酸衍生处理促甲状腺释放激素，形成一种亲脂的、具有良好的通过细胞膜性能的月桂酰衍生物。Zacharia等(1991)还报道了将甲硫氨酸氧化成亚砜并用其酮亚甲基异酯(COCH2)(ketomethylene isoester)代替肽键，以帮助肽通过细胞膜。这些方法仅仅是本领域技术人员所知的修饰和衍生方法中的一些而已。
此外，能够抑制G1或其可能的同种型的细胞死亡活性的药物或肽抑制剂可以与促进进入细胞的分子偶联或复合。
美国专利No.5,149,782公开了将待运输通过细胞膜的分子与膜共混剂(blending agent)偶连在一起，这些膜共混剂例如有融合性多肽、离子通道形成多肽、其他膜多肽、和长链脂肪酸如肉豆蔻酸和棕榈酸。这些膜共混剂将分子偶联物插入细胞膜的脂质双层中，并协助它们进入细胞质。
Low等的美国专利5,108,921回顾了通过受体介导的胞吞机制来跨膜运送分子(例如(但不局限于)蛋白质、核酸)的已有方法。这些受体系统包括识别下列物质的那些系统：半乳糖、甘露糖、甘露糖-6-磷酸、运铁蛋白、脱唾液酸糖蛋白、钴胺传递蛋白(维生素B12)、α-2巨球蛋白、胰岛素和其他的肽生长因子如表皮生长因子(EGF)。Low等讲述了，营养物的受体(如生物素和叶酸的受体)可被有利地用于增强通过细胞膜的运输，因为在大多数细胞的膜表面上存在多种生物素和叶酸受体并且有相应受体介导的跨膜运输过程。因此，待输送入细胞质的化合物与配体(如生物素或叶酸)形成的复合物与具有生物素或叶酸受体的细胞膜接触之后，就启动了受体所介导的跨膜运输机制，从而允许所需化合物进入细胞。
已知ICE能容忍P2位置上自由替换，而且对自由替换的这种容忍性可被加以利用，以开发出强效和高选择性的、含有生物素标记的亲和标记(Thornberry等，1994)。因此，可以对四肽抑制剂的P2位以及可能的N-端进行修饰或衍生处理，例如添加生物素分子，从而提高这些肽抑制剂通过细胞膜的通透性。
此外，本领域中已经知道，可以使所需的肽序列与前导肽/信号肽序列融合，以产生“嵌合肽”，这就能使该“嵌合肽”运输通过细胞膜进入细胞质。
正如肽领域技术人员所知道的那样，本发明的抑制G1蛋白水解活性的肽抑制剂包括肽模拟型药物或抑制剂，它们也能根据和G1蛋白酶的结合被迅速筛选，从而设计出可能更稳定的抑制剂。
还应理解，上述用于协助或增强肽抑制剂运输通过细胞膜的相同手段，也可用于G1蛋白或其同种型以及在胞内发挥功效的其他肽和蛋白质。
关于全文中提及的抗体，术语“抗体”包括多克隆抗体、单克隆抗体(mAb)、嵌合抗体、针对能够以可溶或固定形式被标记的抗体的抗独特型(抗-Id)抗体、以及用各种已知技术(例如(但并不限于)：酶切、肽合成或重组技术)所提供的它们的片段。
多克隆抗体是异质的抗体分子群体，它们来自用抗原免疫的动物血清。单克隆抗体含有基本上均质的、对抗原特异的抗体群体，该群体含有基本相似的表位结合位点。单克隆抗体可用本领域技术人员已知的方法来获得。例如参见Kohler和Milstein，自然，256：495-497(1975)；美国专利No.4,376,110；Ausubel等编，Harlow and Lane，抗体：实验手册(ANTIBODIES：A LABORATORYMANUAL)，Cold Spring Harbor Laboratory(1988)；和Colligan等编，CurrentProtocols in Immunology，Greene Publishing Assoc.and Wiley Interscience N.Y.，(1992-1996)，这些文献的内容都全部纳入本文作参考。这些抗体可以是任何种类的免疫球蛋白，包括IgG、IgM、IgE、IgA、GILD及其任何亚类。产生本发明的单克隆抗体的杂交瘤可以在体外、原位或体内培养。在体内或原位生产高效价单克隆抗体的方法是目前较佳的生产方法。
嵌合抗体是这样一种分子，它的不同部分来自不同的动物物种，例如具有鼠单克隆抗体可变区和人免疫球蛋白恒定区的分子。嵌合抗体重要用于降低应用中的免疫原性以及增加产量，例如当鼠单克隆抗体在杂交瘤中有较高的产量但在人中具有较高免疫原性的情况下，可以使用这种人/鼠嵌合单克隆抗体。嵌合抗体及其生产方法是本领域中已知的(Cabilly等，美国科学院院报81：3273-3277(1984)；Morrison等，美国科学院院报81：6851-6855(1984)；Boulianne等，自然，312：643-646(1984)；Cabilly等，欧洲专利申请125023(1984年11月14日公开)；Neuberger等，自然，314：268-270(1985)；Taniguchi等，欧洲专利申请171496(1985年2月19日公开)；Morrison等，欧洲专利申请173494(1986年3月5日公开)；Neuberger等，PCT申请WO 8601533(1986年3月13日公开)；Kudo等，欧洲专利申请184187(1986年6月11日公开)；Sahagan等，J.Immunol.137：1066-1074(1986)；Robinson等，国际专利申请No.WO8702671(1987年5月7日公开)；Liu等，美国科学院院报84：3439-3443(1987)；Sun等，美国科学院院报84：214-218(1987)；Better等，科学240：1041-1043(1988)；以及Harlow和Lane，抗体：实验手册，同上)。这些文献全部纳入本文作参考。
抗独特型(抗-Id)抗体是这样一种抗体，它识别通常与抗体的抗原结合位点相关的独特决定簇。Id抗体可这样制得，免疫与单克隆抗体来源动物相同的物种和基因型的动物(例如小鼠品种)，其中该单克隆抗体就是制备的抗-Id所针对的。被免疫的动物会识别免疫用抗体的独特型决定簇，并通过产生针对这些独特型决定簇的抗体(抗-Id抗体)而进行应答。例如参见美国专利No.4,699,880，该专利全部纳入本文作参考。
抗-Id抗体还可用作“免疫原”，在另一动物中诱导免疫应答，产生所谓的抗-抗-Id抗体。该抗-抗-Id抗体与最初诱导抗-Id的单克隆抗体在表位上相同。因此，通过使用针对mAb独特型决定簇的抗体，就可鉴别出表达具有相同特异性的抗体的其它克隆。
因此，针对本发明的G1蛋白、其类似物、片段或衍生物而产生的单克隆抗体可用于在合适的动物(如BALB/c小鼠)中诱导产生抗-Id抗体。可用该被免疫小鼠的脾细胞来产生分泌抗-Id mAb的抗-Id杂交瘤。此外，抗-Id单克隆抗体还可与载体(如匙孔血蓝蛋白(KLH))偶联，并用于免疫其他的BALB/c小鼠。这些小鼠的血清含有抗-抗-Id抗体，该抗体具有最初单克隆抗体的结合特性，并对上述的G1蛋白、或其类似物、片段或衍生物的表位有特异性。
这样，抗-Id单克隆抗体具有它们自己的独特型表位，或有结构上与被评价表位相似的“独特位”(如GRB蛋白-a)。
术语“抗体”还包括完整的分子及其片段，例如能够结合抗原的Fab和F(ab′)2。Fab和F(ab′)2片段缺少完整抗体的Fc片段，能够更迅速地从循环系统中清除，并且与完整抗体相比具有更低的非特异性组织结合性(Wahl等，J.Nucl.Med.24：316-325(1983))。
应理解，根据本文公开的用于完整抗体分子的方法，本发明中有用的Fab和F(ab′)2以及其他的抗体片段也可用于检测和定量测定G1蛋白。这些片段通常可用木瓜酶(产生Fab片段)或胃蛋白酶(产生F(ab′)2片段)通过蛋白酶水解切割来产生。
如果抗体能特异性地与某分子反应从而使该分子与抗体结合，那么就称该抗体“能够结合”该分子。术语“表位”指任何分子中能被抗体识别且还能被抗体结合的部分。表位或“抗原决定簇”通常由分子表面化学活性基团(如氨基酸或糖的侧链)构成，而且具有特异的三维结构特征和特异的电荷特征。
“抗原”是能被抗体结合、并且还能诱导动物产生能与该抗原表位结合的抗体的分子或分子一部分。抗原可具有一个或多个表位。上述特异反应指抗原会以高度选择性的方式与其相应的抗体反应，而不会与大量由其他抗原产生的其他抗体反应。
本发明中有用的抗体(包括抗体片段)可用于定量或定性地检测样品中的G1蛋白，或检测表达本发明G1蛋白的细胞的存在与否。这可以用免疫荧光技术，利用荧光标记的抗体(见下文)并结合光学显微术、流式细胞计量术或荧光计量术检测而实现。
用于本发明的抗体(或其片段)可在组织学上被采用，例如在免疫荧光或免疫电子显微术中，用来原位检测本发明的G1蛋白。原位检测可这样来实现：从患者体内取一份组织样品，然后将经标记的本发明抗体供给该样品。抗体(或其片段)的提供最好是通过将经标记的抗体(及其片段)施加或覆盖在生物样品上。通过采用这种步骤，不仅可以确定是否存在G1蛋白，而且能确定其在受检组织中的分布。采用了本发明，一般技术人员容易知道，可对各种组织学方法(例如染色步骤)加以改动来实现这种原位检测。
对于本发明G1蛋白的这些试验方法通常包括：使生物样品(如生物液体、组织抽提物、新收获的细胞(如淋巴细胞或白细胞)、或已经在组织培养中培育过的细胞)在能够鉴别G1蛋白的可检测标记抗体存在下进行培育，然后用本领域熟知的众多方法中的任一种方法检测抗体。
生物样品可以用固相支持物或载体(如硝酸纤维素、或能固定细胞、细胞颗粒或可溶蛋白的其他固相支持物或载体)来处理。然后用合适的缓冲液洗涤支持物或载体，再根据本发明上述那样用可检测的标记抗体进行处理。再用缓冲液第二次洗涤固相支持物或载体以除去未结合的抗体。然后可用常规方法检测所述固相支持物或载体上所结合的标记的量。
“固相支持物”、“固相载体”、“固体支持物”、“固体载体”、“支持物”或“载体”指能结合抗原或抗体的任何支持物或载体。熟知的支持物或载体包括：玻璃、聚苯乙烯、聚丙烯、聚乙烯、葡聚糖、尼龙淀粉酶、天然的和改性的纤维素、聚丙烯酰胺、辉长岩和磁铁石。出于本发明的目的，载体的特性可以是不溶的，或在某种程度上可溶。载体材料可以有实际上所有可能的结构构型，只要偶联的分子能够结合抗原或抗体。因此，支持物或载体的结构可以是球形(如在玻珠内)、圆柱形(如试管的内表面或棒的外表面)。另外，表面可以是平坦的，例如板、测试条带等。较佳的支持物或载体包括聚苯乙烯珠。本领域技术人员可知道用于结合抗体或抗原的其他许多合适的载体，或者能够通过常规实验来确定这些载体。
如上所述的本发明给定量抗体的结合活性可以用众所周知的方法来测定。本领域技术人员能够通过常规实验来确定每次测定的操作条件和最佳试验条件。
其他的步骤，诸如洗涤、搅拌、振荡、过滤等，可增加到试验方法中，这些步骤都是常规的或是具体情况下所需的。
本发明的抗体能够被可检测地标记的一种方法是将该抗体与酶相连，然后用于酶免疫分析(EIA)。然后，当该酶与合适的底物接触时，酶会与底物反应，从而产生可被检测(例如通过分光光度分析、荧光分析、或肉眼观察)的化学物。可用于可检测地标记抗体的酶包括(但不局限于)：苹果酸脱氢酶、葡萄球菌核酸酶、δ-5-类固醇异构酶、酵母乙醇脱氢酶、α-甘油磷酸脱氢酶、磷酸丙糖异构酶、辣根过氧化物酶、碱性磷酸酶、天冬酰胺酶、葡萄糖氧化酶、β-半乳糖苷酶、核糖核酸酶、脲酶、过氧化氢酶、葡萄糖-6-磷酸脱氢酶、葡糖淀粉酶和乙酰胆碱脂酶。采用酶的生色团底物，利用比色方法就可以完成检测。检测还可以通过将酶与底物反应的程度与类似制备的标准物进行肉眼比较来实现。
检测可用其他各种免疫试验实现。例如，通过放射性标记抗体或抗体片段，就可以通过采用放射免疫分析(RIA)来检测R-PTP酶。关于RIA的清楚描述可在Laboratory Techniques and Biochemistry in Molecular Biology，Work，T.S.等，NorthHolland Publishing Company，NY(1978)中找到，尤其参见Chard，T.所写的标题为“An Introduction to Radioimmune Assay and Related Techniques(放射免疫分析和相关技术的介绍)”的章节，该文献纳入本文作参考。放射性同位素可用g计数器或闪烁计数器等设备或通过放射性自显影来进行检测。
还可以用荧光化合物来标记本发明的抗体。当荧光标记的抗体被暴露于适当波长的光时，就能因荧光而检测出它的存在。最常用的荧光标记化合物有异硫氰酸荧光素、罗丹明、藻红蛋白、藻青蛋白(pycocyanin)、别藻蓝蛋白、邻苯二醛和荧光胺。
抗体还可用发出荧光的金属(如152Eu或其他镧系金属)进行可检测地标记。这些金属可通过这些金属的螯合基团(如二乙三胺五乙酸(ETPA))与抗体连接。
还可以将抗体偶联化学发光化合物，对抗体进行可检测标记。然后，检测在化学反应过程中发光的存在来检测带有化学发光标记的抗体的存在。特别有用的化学发光标记化合物的例子是鲁米诺、异鲁米诺(isoluminol)、热(theromatic)吖啶鎓酯、咪唑、吖啶鎓盐和草酸酯。
同样，还可以用生物发光化合物来标记本发明抗体。生物发光是在生物系统中发现的一种化学发光，其中催化性蛋白提高了化学发光反应的效率。生物发光蛋白的存在可通过检测发光来确定。用于标记目的的重要的生物发光化合物是萤光素、萤光素酶和水母发光蛋白。
本发明的抗体分子可用于免疫计量试验，也称为“双位点”或“夹心”试验。在典型的免疫计量试验中，将一定量的未标记抗体(或抗体片段)结合于固相支持物或载体上，加入一定量的带可检测标记的可溶抗体，从而可以检测和/或定量分析在固相抗体、抗原和标记抗体之间形成的三元复合物。
典型的且较佳的免疫测量试验包括“正向”试验，在该试验中与固相结合的抗体先与待测试样品接触，通过形成二元固相抗体-抗原复合物从而将抗原从样品中抽提出。在培育合适的时间后，洗涤固相支持物或载体以去除液体样品残余物(包括未反应的抗原，如果有的话)，然后再与含有未知量的标记抗体(其功能为“报道分子”)的溶液接触。在第二次培育使标记抗体通过未标记抗体与结合于固相支持物或载体上的抗原进行复合之后，第二次洗涤固相支持物或载体，以除去未反应的标记抗体。
在另一种“夹心”测定(该试验可与本发明的抗原一起使用)中，使用所谓的“同时”和“反向”测定。同时测定涉及一次培育步骤，因为和固相支持物或载体结合的抗体和标记抗体被同时加入到测试样品中。在培育结束后，洗涤固体支持物或载体以除去液体样品残余物和未复合的标记抗体。然后象常规的“正向”夹心测定那样，测定与固相支持物或载体结合的标记抗体的存在。
在“反向”测定中，按步骤先将标记抗体溶液加至液体样品中，然后在培育适当时间后，再加入固定于固相支持物或载体上的未标记抗体。在第二次培育后，以常规方式洗涤固相载体，使其不含被测试样品的残余物和未反应的标记抗体溶液。然后再象“同时”或“正向”测定那样，测定与固相支持物或载体结合的标记抗体的存在。
本发明的G1蛋白可用标准的重组DNA程序来生产(例如参见，Sambrook等，1989和Ansabel等，1987-1995，同上)，其中用含有编码该蛋白的序列的合适的真核或原核载体来转化本领域熟知的合适的真核或原核宿主细胞。因此，本发明还涉及用来生产本发明蛋白的表达载体和转化宿主。如上所述，这些蛋白还包括它们的具有生物活性的类似物、片段和衍生物，因此，编码这些物质的载体也包括编码这些蛋白的类似物和片段的载体，转化宿主包括产生这些类似物和片段的那些转化宿主。转化宿主产生的这些蛋白的衍生物是通过对蛋白或其类似物或片段进行标准修饰产生的衍生物。
本发明还涉及含有重组动物病毒载体的药物组合物，该载体编码G1蛋白，还编码能结合特定靶细胞(如癌症细胞)表面蛋白的病毒表面蛋白，从而能引导G1蛋白序列插入到细胞中。本发明的其它药物组合含有下列物质作为活性成分：(a)编码G1蛋白序列的反义序列的寡核苷酸序列；或(b)阻断G1蛋白或其同种型蛋白水解活性的药物。
本发明的药物组合物含有足量的活性成分以达到其所需目的。此外，药物组合物还含有合适的药学上可接受的载体，包括赋形剂和辅助剂，它们可协助将活性化合物加工成可作为药物使用的制剂，并且它们可使这种制剂更稳定，以便给予所需对象，这些都是本领域技术人员熟知的。
怀疑G1蛋白及其同种型在不同组织中表达的水平明显不同，其同种型的方式也明显不同，其方式与上述共同拥有的待批专利申请中所述的MACH蛋白及其各种同种型的表达方式类似。这些差别可能导致了其对Fas/APO1-配体和TNF应答反应的组织特异性特征。至于其它CED3/ICE同系物(Wang等，1994；Alnermri等，1995)，本发明者早先就在上述专利申请中表明，发现含有不完全CED3/ICE区域的MACH同种型(例如MACHα3)对共同表达的MACHα1或MACHα2分子的活性有抑制作用；还发现它们阻断了Fas/APO1和p55-R的死亡诱导作用。这些抑制性同种型在细胞中的表达可能构成了细胞自我保护抵抗Fas/APO1和TNF介导的细胞毒性的机制。因此，怀疑至少一些G1同种型有类似的抑制作用。MACH同种型具有广泛的异质性，该异质性应能特别精细地调节活性MACH同种型的功能，同样怀疑G1同种型也有类似的异质性(其大大超过了CED3/ICE家族其它蛋白酶所见的异质性)，因此本发明的活性G1同种型也有类似能力。
还可能，一些可能的G1同种型具有其它功能。例如，以前发现(如本发明者上文所述)MACHβ1能与MORT-1和MACGα1二者结合，这暗示该同种型实际上增强了具有酶活性的同种型的活性。在转染了该同种型的293-EBNA和MCF7培养中发现细胞毒性较弱，而该同种型在HeLa细胞中发挥了相当显著的细胞毒性效应，这可能反映了内源性表达的MACHα分子在结合转染的MACHβ1分子时被激活。可以想象的是，一些MACH同种型还可作为涉及Fas/APO1和TNF受体的其它非细胞毒性效应的分子的停靠位点。因此，G1和/或其同种型可能也以类似的方式具有这种增强活性或作为其它此类分子的停靠位点起作用。
由于Fas/APO1和TNF受体能独特地引起细胞死亡，以及TNF受体能引发其它各种组织破坏性活性，因此这些受体的功能畸变对生物体特别有害。实际上，这些受体的功能过度和不足均已表明会导致各种疾病的病理表现(Vassalli，1992；Nagata和Golstein，1995)。鉴定参与受体信号传导活性的分子，以及寻找方法来调节这些分子的活性，这些都能引出新的治疗方法。由于怀疑G1在Fas/APO1和TNF介导的毒性中起关键作用，因此设计出能阻断G1的可能的蛋白水解功能的药物似乎尤其重要，而对CED3/ICE家族的其它一些成员已经采用这种做法(Thornberry等，1994；Miller等，1995；Mashima等，1995；Milligan等，1995；Enari等，1995；Los等，1995)。G1分子中明显存在CED3/ICE同系物的独特序列特征，这样就允许设计出能特异性地影响其活性的药物。这些药物能提供保护，防止过度免疫介导的细胞毒性，而对CED3/ICE家族其它成员涉及的生理性细胞死亡过程没有干扰。
本发明的其它方面可从下列实施例明显看出。
现在本发明将在下列非限制性实施例及其附图中作更详细地描述。
还应注意，下列步骤同样适用于本发明的G1及其可能的同种型的相应分离、克隆和定性：i)双杂交筛选和双杂交半乳糖苷酶表达测试；ii)蛋白质的诱导表达、代谢性标记和免疫沉淀；iii)体外结合；iv)细胞毒性的测定；和V)Northern分析和序列分析，它们分别表述在下文参考实施例1(另见Boldin等，1995b)、2和3(另见Boldin等，1996)关于MORT-1和MORT-1结合蛋白(例如MACH)部分内。因此，这些步骤被认为充分公开了用于分离、克隆和定性本发明的G1蛋白的相同步骤，如下文实施例1所述(下文参考实施例1-3也以相同或等价的形式出现在共同拥有的待批以色列申请No.114645、114986、115319、116588和117932，以及相应的PCT申请No.PCT/US96/10521中)。而且，在上文标题为“附图简述”章节中也包括了根据本发明所实施的试验步骤的一些细节，在本发明充分公开方面来说，它们是下文实施例1的一部分，因此应被理解成与实施例1一同公开。
参考实施例1：与FAS-R胞内结构域结合的MORT-1蛋白的克隆和分离
(i)双杂交筛选和双杂交β半乳糖苷酶表达测试
为了分离与FAS-R胞内结构域相互作用的蛋白，采用了酵母双杂交系统(Fields和Song，1989)。简言之，这种双杂交系统是一种以酵母为基础的遗传试验，其通过真核转录激活蛋白(如GAL4)的恢复来检测体内蛋白-蛋白特异性相互作用，该激活蛋白具有两个分开的区域，一个DNA结合域和一个激活域，这些区域在被表达并结合在一起形成恢复的GAL4蛋白时能与上游的激活序列结合，而该上游序列再激活控制报道基因(如lacZ或HIS3)表达的启动子，该表达很容易在培养细胞中发现。在该系统中，将相互作用的候选蛋白的基因克隆到分开的表达载体中。在一个表达载体中，克隆入一个候选蛋白的序列与GAL4 DNA结合域的序列同相，从而和GAL4 DNA结合域产生杂交蛋白，而在另一个载体中，克隆入第二候选蛋白的序列与GAL4激活域的序列同相，从而和GAL4-激活域产生杂交蛋白。然后将两种杂交载体共转化到具有lacZ或HIS3受体基因(该基因在上游GAL4结合位点的控制之下)的酵母宿主菌株中。只有两种杂交蛋白被表达并能相互作用的转化宿主细胞(共转化体)才能表达报道基因。至于lacZ报道基因，当培养物中加入X-gal时，表达该基因的宿主细胞会变成蓝色。因此，蓝色菌落表示的事实是两种克隆的候选蛋白能够相互作用。
采用该双杂交系统，将胞内结构域(FAS-IC)分开克隆到pGBT9载体(携带GAL4 DNA-结合序列，由ClONTECH，USA提供，见下文)中，和GAL4 DNA结合域一起形成融合蛋白。为了将FAS-R克隆到pGBT-9中，采用编码FAS-R全长cDNA的克隆(WO 9531544)，通过标准步骤用各种限制性酶从中切除胞内结构域(IC)，然后用标准步骤分离并插入pGBT9载体，该pGBT9载体的多个克隆位点区域(MCS)用相应的合适的限制性酶打开。应注意，FAS-IC为完整FAS-R的氨基酸残基175-319的延伸，而含有残基175-319的这一部分为插入pGBT9载体的FAS-IC。
然后，将上述杂交物(嵌合体)与克隆的人HeLa细胞的cDNA文库(克隆到pGAD GH载体中，携带有GAL4激活域)共同转染到HF7c酵母宿主菌株中(上述所有载体，pGBT9和携带HeLa细胞cDNA文库的pGADGH、以及酵母菌株均购自Clontech Laboratories，Inc.，USA，是MATCHMAKER双杂交系统#PT1265-1的一部分)。选择能在缺少组氨酸的培养基(His培养基)中生长的共转染酵母，生长的菌落表明为阳性转化体。然后，测试所选酵母克隆表达lacZ基因的能力，即它们的LACZ活性，在培养基中加入X-gal来进行测试，X-gal被lacZ基因编码的酶β-半乳糖苷酶分解成蓝色产物。蓝色菌落表明有活性lacZ基因。为了使lacZ基因有活性，GAL4转录激活蛋白必须以活性形式存在于转化的克隆内，即上述杂交载体编码的GAL4-结合域必须适当地与另一杂交载体编码的GAL4激活域结合。如果与GAL4两区域融合的两个蛋白能稳定地相互作用，才可能有这样的结合。因此，分离出的His+和蓝色(LACZ+)菌落是已经被编码FAS-IC的载体以及编码人HeLa细胞来源的蛋白产物(它能与FAS-IC稳定结合)的载体共同转染的菌落。
用标准程序分离出上述His+、LACZ+酵母菌落的质粒DNA，电穿孔到大肠杆菌菌株HB101中，然后选择Leu+和有氨苄青霉素抗性的转化体，这些转化体携带了带AmpR和Leu2编码序列的杂交pGAD GH载体。因此，这些转化体是这样一些克隆，它们所携带的序列可编码最近鉴定出的能结合FAS-IC的蛋白。然后，从这些转化的大肠杆菌分离出质粒DNA，并用下列方式重新进行测试：
(a)使它们和原来的FAS-R胞内结构域杂交质粒(携带FAS-IC的杂交体pGTB9)一起重新转化到上述HF7酵母菌株内。将携带不相关蛋白编码序列的载体(例如pACT-核纤层蛋白或单单pGBT9)作为对照，用来和编码FAS-IC-结合蛋白(即MORT-1)的质粒共转化。然后在单单His培养基或含有不同水平的3-氨基三唑的培养基上测试共转化酵母的生长情况；和
(b)将(a)中所述的质粒DNA、原来的FAS-IC杂交质粒和对照质粒重新转化到菌株SFY526的酵母宿主细胞中，然后测定LACZ+活性(βgal形成即形成蓝色菌落的效率)。
上述测试结果表明，根据菌落颜色来评价，His-培养基中的菌落生长模式与LACZ活性的模式相同，即His+菌落即为LACZ+。而且，在将GAL4 DNA结合域和激活域杂交体转染到SFY256酵母宿主(其用GAL4转录激活蛋白的LACZ诱导性比HF7酵母宿主细胞更佳)中后，评价在液体培养(较佳的培养条件)中的LACZ活性。
采用上述程序鉴别、分离并鉴定出一种以前命名为HF1、现在称为MORT-1(即“受体诱导毒性的介导剂”)的蛋白。
而且，还应提到的是，在上述两种双杂交β-半乳糖苷酶表达的一些测试中，β-半乳糖苷酶的表达还可用较佳的过滤试验来评价。在该筛选中，发现约3×106个cDNA中有5个含有MORT-1插入物。然后，用标准DNA测序程序对这样分离的克隆的MORT-1 cDNA插入物进行测序。从该DNA序列推断出MORT-1的氨基酸序列(关于MORT-1的DNA和氨基酸序列参见共同拥有的待批以色列申请No.112022，112692和114615及其相应的PCT申请No.WO96/18641)。cDNA插入物编码的蛋白中的残基编号如Swiss-Prot数据库中所述。用PCR产生缺失突变体，用寡核苷酸定点诱变产生点突变体(Current Protocol in Molec.Biol.，1994)。
(ii)蛋白的诱导表达、代谢性标记和免疫沉淀
在HeLa细胞中表达N端与FLAG八肽连接的MORT-1(FLAG-MORT-1；Eastman Kodak，New Haven，Ct.USA)、Fas-IC、FAS-R、p55-R、含有p55-R胞外结构域(氨基酸1-168)与FAS-R跨膜和胞内结构域(氨基酸153-319)融合的嵌合体、以及作为对照的萤光素酶cDNA。在表达四环素控制的反式激活蛋白的HeLa细胞克隆(HtTA-1)中用四环素控制的表达载体进行表达(Gossen和Bujard，1992；另见Boldin等，1995)。在转染18小时后，用[35S]甲硫氨酸和[35S]半胱氨酸(DUPONT，Wilmington，DE，USA和Amersham，Buckinghamshire，England)进行代谢性标记，再在缺少甲硫氨酸和半胱氨酸、但添加了2％透析的胎牛血清的Dulbecco改进的Eagle培养基中37℃培育4小时。然后在RIPA缓冲液(10mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，1％NP-40，1％脱氧胆酸盐，0.1％SDS和1mM EDTA)中裂解该细胞，裂解液通过和不相关的家兔抗血清(3μl/ml)和蛋白G Sepharose玻珠(Pharmacia，Uppsala，Sweden；60μl/ml)一起培育来预澄清。免疫沉淀如下进行，用抗FLAG八肽(M2；Eastman Kodak)、p55-R(#18和#20；Engelmann等，1990)、或FAS-R(ZB4；Kamiya Southand Oaks，Ca.，USA)的小鼠单克隆抗体(5μl/等份)4℃培育0.3ml等份裂解液1小时，或用同种型匹配的小鼠抗体作为对照，然后再和蛋白G Sepharose玻珠(30μl/等份)一起培育1小时。
(iii)体外结合
使谷胱甘肽S-转移酶(GST)与野生型或突变型Fas-IC融合，然后吸附到谷胱甘肽-琼脂糖玻珠上；见Boldin等，1995；Current Protocols in Molecular Biology，1994；Frangioni和Neel，1993)。使玻珠与用[35S]甲硫氨酸(60μCi/ml)代谢性标记过的、表达FLAG-MORT-1的HeLa细胞抽提物4℃培育2小时，评价有代谢性标记的FLAG-MORT-1融合蛋白与GST-Fas-IC的结合。抽提物用含有50mMTris-HCl，pH7.5，150mM NaCl，0.1％NP-40，1mM二硫苏糖醇，1mM EDTA，1mM苯甲基磺酰氯，20μg/ml胰蛋白酶肽，20μg/ml亮抑酶肽，10mM氟化钠和0.1mM钒酸钠(每5×105细胞1毫升)的缓冲液配制。
(iv)评价诱导MORT-1表达引发的细胞毒性
将MORT-1、FAS-IC、p55-IC和萤光素酶cDNA插入有四环素控制的表达载体中，并和置于SV40启动子(pSBC-2载体，Dirks等，1993)控制之下的分泌的胎盘碱性磷酸酶cDNA一起转染到HtTA-1细胞(一种HeLa细胞系)(Gossen和Bujard，1992)中。转染40小时后通过中性红摄取试验(Wallach，1984)评价细胞死亡，或通过测定培育最后5小时内分泌到生长培养基中的胎盘碱性磷酸酶(Berger等，1988)的量来具体评价表达转染cDNA的那些细胞的死亡情况。
在分析MORT-1蛋白参与结合Fas-IC的区域的另一组试验中，用有四环素控制的表达载体(pUHD10-3)在含有四环素控制的反式激活蛋白的HeLa细胞(HtTA-1)中表达下列蛋白：单单人FAS-R；人FAS-R以及MORT-1的N端部分(氨基酸1-117，“MORT-1的头部”)；人FAS-R以及MORT-1的C端部分(它含有MORT-1的“死亡域”同源区，氨基酸130-245，“MORT-1 DD”)；FLAG-55.11(蛋白55.11的氨基酸309-900，蛋白55.11的N端与FLAG八肽融合，蛋白55.11是p55-IC特异性结合蛋白)。转染12小时后，用胰蛋白酶消化细胞，并以30000细胞/孔的浓度重新接种。进一步培育24小时后，用各种浓度(0.001-10μg/ml单克隆抗体)抗FAS-R胞外结构域的单克隆抗体(单克隆抗体CH-11，Oncor，Gaithersburg，MD，USA)在10μg/ml环己酰亚胺存在下处理细胞6小时。然后通过中性红摄取试验测定细胞存活率，结果以与单用环己酰亚胺培育的细胞(没有抗-FAS-R单克隆抗体CH-11存在)相比的活细胞百分率％表示。
(v)Nothern分析和序列分析
从HeLa细胞的总RNA(Oligotex-dT mRNA试剂盒，QIAGEN，Hilden，Germany)中分离出Poly A+RNA。用MORT-1 cDNA作为探针，通过常规方法进行Northern分析(见Boldin等，1995)。用双脱氧链终止方法测定两个方向的MORT-1的核苷酸序列。
对双杂交程序克隆的MORT-1 cDNA进行序列分析，结果表明它编码了一个新的蛋白。采用双杂交测试进一步评价该蛋白(MORT-1，即“受体诱导毒性的中介体”)与Fas-IC结合的特异性，并确定Fas-IC中与其结合的特定区域，发现下列结果：(a)MORT-1蛋白与人和小鼠Fas-IC结合，但是不与其它一些测试蛋白(包括TNF/NGF受体家族的三个受体，p55和p75 TNF受体以及CD40)结合；(b)FAS-R“死亡域”中225位(Ile)的取代型突变显示消除了体外和体内的信号传导(lprcg突变(Watanabe-Fukunaga等，1992；Itoh和Nagata，1993))，还阻止了MORT-1与Fas-IC结合；(c)FAS-R中的MORT-1结合位点在该受体的“死亡域”内；和(d)MORT-1与其自身结合。该自身结合，以及MORT-1与FAS-R的结合涉及蛋白的不同区域：对应于残基1-117的MORT-1片段与全长MORT-1结合，但是不与其自身或Fas-IC结合。相反，对应于残基130-245的片段与FAS-R结合，但是不和MORT-1结合。另外，从这些结果还可看出，FAS-R的“死亡域”区域对于Fas-IC自身缔合来说是很关键的，正如p55-R的“死亡域”区域对于p55-IC自身缔合那样。这些“死亡域”两侧的缺失不会影响其自身缔合的能力，但是这些“死亡域”中的缺失却会影响自身缔合。至于MORT-1，MORT-1与Fas-IC的结合还取决于FAS-R的全部“死亡域”，但是不取决于与FAS-IC结合的FAS-R“死亡域”区域以外的区域。
用β-半乳糖苷酶表达过滤试验评价转染的SFT526酵母中Gal4 DNA结合域和激活域构建物(pGBT9和pGAD-GH)编码的蛋白的相互作用。DNA结合域构建物包括四种人Fas-IC构建物，四种小鼠Fas-IC构建物(包括两种全长构建物，它们在225位有Ile到Leu或Ile到Ala的取代型突变(分别为I225N和I225A))，以及三种MORT-1构建物。激活域构建物包括三种MORT-1构建物，与DNA结合域构建物中一样的MORT-1部分；以及全长人Fas-IC构建物，该Fas-IC部分与上述DNA结合域构建物中的一样。人p55 TNF受体(p55-IC残基206-426)、人CD40(CD40-IC，残基216-277)和人p75 TNF受体(p75-IC，残基287-461)的胞内结构域以及核纤层蛋白、细胞周期蛋白D和“空”的Gal4(pGBT9)载体以DNA结合域构建物形式作为阴性对照。SNF-1和SNF4以DNA结合域(SNF1)和激活域(SNF4)构建物的形式作为阳性对照。“空”的Gal4载体(pGAD-GH)还以激活域构建物形式作为阴性对照。上述分析结果表示中，所用的标记“++”和“+”表示在试验30和90分钟内分别产生深的颜色；“-”表示在24小时内不产生颜色。
HeLa细胞蛋白中表达产生了N端与FLAG八肽融合的MORT-1分子(FLAG-MORT-1)，它们有四种不同的大小—约为27、28、32和34kD。通过免疫沉淀转染了FLAG-MORT-1融合蛋白或萤光素酶cDNA(作为对照)的HeLa细胞提取物的蛋白质，发现MORT-1和Fas-IC在体外相互作用，免疫沉淀用抗FLAG抗体(aFLAG)来进行。MORT-1和Fas-IC之间在体外有相互作用还可这样来证明，从转染的HeLa细胞抽提物获得的MORT-1是[35S]甲硫氨酸代谢性标记的FLAG-MORT-1融合蛋白，FAS-IC是人和小鼠GST-FAS-IC融合蛋白，包括FAS-IC的225位有取代型突变的一种融合蛋白，所有GST-FAS-IC融合蛋白均在大肠杆菌中产生。GST-融合蛋白在与含MORT-1-FLAG融合蛋白的抽提物相互作用前先与谷胱甘肽玻珠连接，在该相互作用后，进行SDS-PAGE。因此，通过SDS-PAGE后放射自显影来评价[35S]代谢性标记的MORT-1(以FLAG八肽的融合体形式(FLAG-MORT-1)产生于转染的HeLa细胞中)和GST结合、和GST与人或小鼠Fas-IC的融合体(GST-huFas-IC，GST-mFas-IC)的结合或和GST与225位lle被Ala取代突变的Fas-IC融合体的结合，从而评价体外相互作用。结果表明，所有四种FLAG-MORT-1蛋白均显示出在和GST-Fas-IC融合蛋白一起培育时能结合Fas-IC。当在酵母双杂交测试，MORT-1不与lprcg突变位点有取代(I225A)的GST-Fas-IC融合蛋白结合。
FLAG-MORT-1 cDNA编码的蛋白还显示出，当其和这些受体在HeLa细胞中共同表达时，它能与FAS-R的胞内结构域、以及胞外结构域被p55-R的胞外结构域(p55-FAS)取代的FAS-R嵌合体的胞内结构域结合。在这种情况下，MORT-1和FAS-IC在转染的HeLa细胞中(即体内)的相互作用(从各种转染的HeLa细胞的免疫沉淀观察到)证实在共转染了编码这些蛋白的构建物的细胞中MORT-1和FAS-IC之间在体内有相互作用，且该相互作用有特异性。因此，在HeLa细胞中单独表达FLAG-MORT-1融合蛋白，或和人FAS-R、FAS-R嵌合体(其中FAS-R的胞外结构域被人p55-R的对应区域(p55-FAS)所代替)、或人p55-R(作为阴性对照)一起表达，并用[35S]半胱氨酸(20μCi/ml)和[35S]甲硫氨酸(40μCi/ml)作代谢性标记。用各种特异性抗体使MORT-1和共表达的受体一起进行交叉免疫沉淀。结果表明，当和这些受体在HeLa细胞中共表达时，FLAG-MORT-1能够结合FAS-R的胞内结构域，以及FAS-R-p55-R嵌合体的胞内结构域，该嵌合体具有p55-R的胞外结构域和FAS-R的胞内结构域。另外，从转染细胞的抽提物中免疫沉淀出FLAG-MORT-1也导致共表达的FAS-R或共表达的p55-FAS嵌合体的沉淀。相反，这些受体的免疫沉淀导致FLAG-MORT-1的共同沉淀。
采用MORT-1 cDNA作为探针的Northern分析揭示了在HeLa细胞中有单个杂交转录物。在Northern印迹中，使转染细胞的poly A+RNA(0.3μg)与MORT-1cDNA杂交，发现RNA转录物的大小(约1.8kb)与MORT-1 cDNA的大小(约1702核苷酸)非常接近。
在序列分析中，发现cDNA含有约250个氨基酸的开放读框。在上述共同拥有的待批申请中，示出了MORT-1 DNA和氨基酸序列(见WO 96/18641)。在这些序列中，“死亡域”基序用下划线表示，还示出了可能的起始Met残基(49位；粗体有下划线的M)以及翻译终止密码子(密码子在769-771位有星号)。该“死亡域”基序与已知的p55-R和FAS-R“死亡域”基序(p55DD和FAS-DD)同源。为了精确地确定MORT-1的C端，并获得关于MORT-1的精确N端(起始Met残基)的证据，还进行下列试验。
采用上述方法，构建出多个编码N端与FLAG八肽融合的MORT-1分子(FLAG-MORT-1)构建物，并在HeLa细胞中表达，用35S-半胱氨酸和35S-甲硫氨酸对表达的蛋白质作代谢性标记。MORT-1-FLAG分子用下列含有MORT-1编码序列不同部分的cDNA来编码：
i)FLAG八肽cDNA与MORT-1 cDNA的5′端连接，该MORT-1 cDNA的核苷酸1-45缺失；
ii)FLAG八肽cDNA与MORT-1全长cDNA的5′端连接；
iii)FLAG八肽cDNA与MORT-1 cDNA的5′端连接，该MORT-1 cDNA的核苷酸1-145以及核苷酸832-1701缺失，并且142-144位的密码子GCC被突变成TCC，以防止从该位点开始翻译。
在上述FLAG-MORT-1融合产物表达后，如上所述采用抗FLAG单克隆抗体或抗p75-TNF-R抗体(作为对照)进行免疫沉淀，然后进行SDS-PAGE(10％丙烯酰胺)和放射自显影。上述FLAG-MORT-1融合产物的分析结果确认了MORT-1的C末端，并提供了MORT-1的N末端可能在序列第49位的证据。
实际上，5′端没有融合FLAG八肽的MORT-1的其它表达实验已经表明，Met49是有效的翻译起始位点。
在“基因库”和“蛋白质库”数据库中的检索显示，迄今没有序列与上述分离的MORT-1序列对应。因此，MORT-1代表了一种新的FAS-IC-特异性结合蛋白。
p55-IC的高度表达导致引发杀细胞效应(Boldin等，1995)。Fas-IC在HeLa细胞中的表达也有此效应，虽然程度较低，只能用灵敏的测定才能检测到。因此，分析转染了MORT-1，以及人p55-IC和FAS-IC的细胞中杀细胞效应的配体非依赖型引发。用四环素控制的表达载体评价MORT-1、人Fas-IC、人p55-IC或萤光素酶(作为对照)的瞬时表达对HeLa细胞存活率的效应。在四环素(1μg/ml，以阻断表达)存在或不存在下，用这些cDNA以及编码分泌的胎盘碱性磷酸酶的cDNA进行转染40分钟后，评价细胞存活率。通过中性红摄取试验测定细胞存活率，或者为了特异性测定表达转染DNA的那些特定细胞的存活率，可通过测定分泌到生长培养基中的胎盘碱性磷酸酶的量来测定细胞存活率。
上述分析揭示MORT-1在HeLa细胞中的表达导致了细胞显著死亡，其程度大于FAS-IC表达所引起的程度。p55-IC、FAS-IC和MORT-1的细胞毒性效应看来均与所有这些蛋白中的“死亡域”区域有关，该“死亡域”具有自身缔合的趋势，从而可能促进了细胞毒性效应。
鉴于MORT-1的上述特性，即MORT-1与参与细胞死亡诱导作用的FAS-R的特定区域特异性缔合，并且该区域结构即使微小的变化(会防止信号传导，lprcg突变)也会消除MORT-1的结合这一事实，这表明该蛋白在细胞死亡的信号传导或引发中起作用。这一观点进一步得到以下观察结果的支持，即MORT-1能通过其自身来引发杀细胞效应。因此，MORT-1能够：(i)通过其自身和FAS-R和本身结合的能力来作为FAS-R的自身缔合调节剂，或(ii)作为参与FAS-R信号传导作用的其它蛋白的停靠位点，即，MORT-1可能是“停靠”蛋白，因而能结合FAS-R以外的其它受体，或(iii)构成了与FAS-R信号传导相互作用的不同信号传导系统的一部分。
为了进一步分析涉及FAS-IC结合和调节FAS-R-介导的细胞效应(细胞毒性)的MORT-1区域，进行上述试验，试验采用编码部分MORT-1(“MORT-1头部”，氨基酸1-117和“MORT-1 DD”，氨基酸130-245)(分开)的载体，以及编码人FAS-R的载体，共转染HeLa细胞。在这些试验中，将编码蛋白的序列插入四环素控制的表达载体pUHD10-3中，从而在含有四环素控制的反式激活蛋白的HeLa细胞(HtTA-1)中瞬时表达各种蛋白和蛋白的组合。对照转染采用仅编码FAS-R的载体以及编码FLAG-55.11融合蛋白(55.11蛋白是一种p55-IC特异性结合蛋白，它的一部分含有氨基酸309-900在其N端与FLAG八肽融合)的载体。
在转染和培育后，用各种浓度的抗FAS-R单克隆抗体(CH-11)处理转染的细胞，该单克隆抗体能特异性地结合细胞表达的FAS-R的胞外结构域。与该抗FAS-R抗体的结合诱导细胞表面的FAS-R聚集(与FAS-R配体非常相似)，并且诱导了由FAS-IC介导的胞内信号传导途径，最终导致细胞死亡(FAS-R介导的细胞毒性)。抗FAS-R单克隆抗体(CH-11)所用的浓度在0.01-10μg/ml范围内，通常用的浓度例如是0.005；0.05；0.5和5g/ml。在10μg/ml环己酰亚胺存在下，用该抗-FAS抗体处理细胞。
上述分析的结果表明，FAS-R在转染细胞中的表达增加了细胞对抗FAS-R抗体对杀细胞效应的敏感度。另外，如同从MORT-1“死亡域”(DD)区域结合FAS-R“死亡域”(FAS-DD)的能力所预计的那样，MORT-1中含有“死亡域”同源区的区域以及FAS-R的共表达强烈干扰了FAS诱导(即FAS-R介导)的细胞死亡。而且，MORT-1的N端部分和FAS-R的共表达不干扰FAS-R介导的细胞死亡，而且还一定程度地增强了细胞毒性(即稍稍增加细胞死亡)。
因此，上述结果清楚地表明，就结合FAS-IC和介导FAS-IC的细胞毒性活性而言，MORT-1蛋白有两个不同的区域。
因此，这些结果也为使用MORT-1蛋白不同部分(即活性片段或类似物)来作为不同的药物用途提供了基础。例如，基本上只含MORT-1 C端部分包括其“死亡域”区域的MORT-1蛋白的类似物、片段或衍生物可用来抑制含有FAS-R的细胞或组织中FAS-R介导的细胞毒性效应，从而保护这些细胞或组织免受FAS-R配体的有害作用(例如在急性肝炎情况下)。或者，基本上只含有MORT-1 N端部分的MORT-1蛋白的类似物或片段或衍生物，可用来在含有FAS-R的细胞和组织中增强FAS-R介导的细胞毒性效应，从而在需要时增强对这些细胞或组织的破坏(例如在肿瘤细胞和自身反应T和B细胞情况下)。如上文所详细描述的，通过用各种重组病毒(如牛痘)来将MORT-1区域的编码序列插入需要治疗的特定细胞或组织中，就可实现MORT-1不同区域的上述用途。
另外，还可制得和使用其它各种分子，例如抗体、肽和有机分子，它们具有对应于上述MORT-1区域的序列或分子结构，以便实现这些MORT-1区域介导的所需的相同效应。
而且，MORT-1可用来特异性地鉴别、分离和分析能与MORT-1结合的其它蛋白(即MORT-1结合蛋白)；参见参考实施例2和3。
参考实施例2：MORT-1结合蛋白的分离
(i)双杂交筛选和双杂交β-半乳糖苷酶表达试验
以类似于参考实施例1所述的步骤，用p55 TNF-R(p55IC)和MORT-1的胞内结构域作为诱饵，筛选人B-细胞文库，获得两个cDNA克隆，这两个克隆编码了能与MORT-1和p55-IC结合的蛋白。两个克隆在5′端表现出相同的核苷酸序列(参见共同拥有的待批申请WO96/18641和PCT/US96/10521)。
(ii)新克隆的cDNA在双杂交筛选中的结合性质
采用上述酵母双杂交程序，用含有新的MORT-1结合蛋白cDNA的构建物作为“捕获物”，该“捕获物”构建物在各反应中加入了多个“诱饵”，以测定该cDNA编码的MORT-1结合蛋白的结合特异性。这些“诱饵”所包括构建物能编码MORT-1、MORT-1的一部分(MORT“头部”，氨基酸1-117，MORT“尾部”，氨基酸130-245)、p55 IC(206-426 p55)或其部分(“死亡域”，326-426 p55；以及“死亡域”的其它上游，即206-326)。结果显示在表2中。
                                                              表2
    诱饵     β-半乳糖苷酶表达数据
    MORT-1     +++
    130-245 MORT-1     +
    1-117 MORT-1     -
    206-426 p55     +++
    326-426 p55     +++
    206-326 p55     -
    206-308 p55     -
    206-345 p55     -
    p55 L35INI     -
    Fas IC     -
    233-319 Fas     -
    p75 IC     -
    CD40 IC     -
    pGBT10     -
    SNF1     -
    细胞周期蛋白D     -
    核纤层蛋白     -
克隆与一大组诱饵的结合的双杂交β-半乳糖苷酶表达测试的上述结果证实了该克隆编码的蛋白特异性地结合p55 TNF-R和MORT-1的死亡域。
总之，MORT-1结合蛋白可用来直接调节或介导MORT-1相关的细胞效应，或间接调节或介导FAS-R配体对于细胞的效应(当该效应由MORT-1介导或调节时)。对于其它胞内蛋白或跨膜蛋白的胞内结构域来说也是如此，具体可用本文的p55 TNF-R来加以证实。
MORT-1结合蛋白包括与整个MORT-1蛋白特异性结合的那些蛋白，或是与MORT-1蛋白的不同区域(例如上述的MORT-1的N端和C端区域)结合的那些蛋白。与这些区域特异性结合的MORT-1结合蛋白可用来调节这些区域的活性，因此可以调节这些区域决定的MORT-1的特异性活性。
参考实施例3：另一种MORT-1结合蛋白-MACH蛋白的分离和鉴定
(i)双杂交筛选、双杂交β-半乳糖苷酶试验，测序和序列分析
用上述参考实施例1和2提出的步骤，在酵母双杂交系统中用编码人MORT-1蛋白的全长构建物作为“诱饵”，分离出编码另一新的MORT-1结合蛋白的cDNA克隆。该新的蛋白最初命名为MORT-2，现在根据如下文所述的其特征被重新命名并称为MACH(与MORT-1相关的CED3同系物)。
用上述参考实施例1和2中提到的标准步骤对该cDNA进行测序。标准步骤的序列分析和计算机程序(参见参考实施例1和2)揭示，该cDNA具有新的序列并编码一个新的蛋白(其DNA和氨基酸序列均未在GENBANK和PROTEINBANK序列数据库中发现)。另外，编码MACH的cDNA揭示ORF-B开放读框与MORT-1蛋白“死亡域”基序前面(5′上游)的区域(参见参考实施例1)的同源性非常高。在共同拥有的待批以色列申请No.114615，114986，115319，116588和117932及其对应的PCT申请No.PCT/US96/10521中显示了含有ORF-B(235氨基酸残基)的MACH cDNA克隆的该部分结构；MACH ORF-B据推导的氨基酸序列；以及MACH cDNA分子的核苷酸序列。ORB-F区享有和MORT-1“死亡域”基序上游MORT-1区域非常高的同源性。
进一步用酵母双杂交试验来评价MACH和MORT-1结合的特异性，特别是用来确定MORT-1中与MACH结合的区域，并确定那些MACH ORF与MORT-1相互作用，这些步骤如上文参考实施例1和2中所述。简言之，制得各种MORT-1和MZCH构建物，用来测试由转染的SFY526酵母细胞中Gal4 DNA结合域和激活域构建物编码的蛋白的相互作用，通过β-半乳糖苷酶表达过滤试验来评价。DNA结合域构建物制备在pGBT9载体中，激活域构建物制备在pGAD-GM载体中。对于激活域构建物，采用全长MACH cDNA(MACH)和仅仅编码ORF-B区(MACH B)的构建物。作为对照的激活域构建物是那些含有全长MORT-1编码序列(MORT 1，阳性对照)的构建物和不含插入物(即“空”载体)(pGAD-GM)的构建物。对于DNA结合域构建物，采用全长MORT-1 cDNA(MORT 1)，以及仅仅编码MORT-1上游区域(MORT-1 DD，氨基酸130-245)的构建物。作为对照的DNA结合域构建物(也构建用来测定MACG结合的特异性)包括：编码核纤层蛋白(Lamin)、人p75 TNF-R胞内结构域的残基287-461的构建物(人p75 IC)、细胞周期蛋白D(cycD)、SNF1、人p55 TNF-R胞内结构域残基206-426(人p55 IC)、人Fas-R胞内结构域的“死亡域”区域(人Fas DD)、人CD40胞内结构域的残基216-277(人CD40 IC)、没有插入物的载体或“空”的pGBT9载体(pGBT9，阴性对照)的构建物，以及编码MACH ORF-B区域(MACH B)的构建物。在试验中，测定颜色的产生，颜色产生的越深，则DNA结合域和激活域编码的构建物之间的相互作用就越强。颜色的产生用以下标记表示，＂+++＂和＂+＂分别表示在测定30和90分钟内产生了较深的颜色，而＂---＂表示在测定的24小时内不产生颜色。没有测试相互作用则无表示标记。上述情况下的各种相互作用结果显示在下表3中，而MACH同种型的各种相互作用的结果则显示在上述共同拥有的待批PCT/US96/10521及其IL对应申请中。
                                                                    表3
                                                                         域                    杂交
    DNA激活域杂交     MACH   MACH B     MORT 1   pGAD-GH
    MORT-1     +++   +++     +++   ---
    MORT-1中的结合区
    MORT1(-117)
    MORT1 DD(130-245)     ---   ---
    特异性测试
    核纤层蛋白     ---   ---
    人p75 IC     ---
    cyc D
    SNF1
    人p55 IC
    人FAS DD     ---
    人CD40 IC     ---
    pGBT9     ---
    MACH B   +     +   ---
因此，从上述表3的结果可以明显看出，
(a)MACH以非常强的特异性方式与MORT-1结合；
(b)MORT-1中的MACH结合位点在MORT-1中的“死亡域”基序之前(上游)，即在MORT-1的氨基酸1-117所确定的MORT-1区域内；
(c)MACH的ORF-B区域是MACH蛋白中与MORT-1相互作用的区域；和
(d)MACH ORF-B区域能自身缔合。
(ii)MACH蛋白的自身缔合能力介导的细胞毒性效应
MACH能自身缔合、尤其是MACH的ORF-B区域能自身缔合的观察结果，和以前观察到的p55 TNF-R和FAS-R胞内结构域的自身缔合和细胞毒性之间的关系，以及MORT-1的观察(见参考实施例1)，这些都暗示MACH自身缔合也可能参与细胞毒性效应。
为了测试这一可能性，用四环素控制的表达载体制得编码MACH的构建物(细节参见参考实施例1)。用这些构建物来转染HeLa细胞，载体在该细胞中瞬时表达。除了MACH构建物外，还采用其它构建物来评价瞬时表达对HeLa细胞存活率的影响，并将其与MACH构建物的影响相比较。这些其它构建物包括MORT-1、人FAS-IC和萤光素酶(Luc)。另外，还用MORT-1和MACH构建物来共转染HeLa细胞，以确定这些蛋白之间的相互作用会引起何种效应。转染后，培育HeLa细胞，并在四环素(用来抑制表达)(1μg./ml)存在或不存在下，在转染48小时后评价细胞存活率。用中性红摄取试验测定细胞存活率。
从上述分析的结果可明显看出，MACH在HeLa细胞内诱导出显著的细胞毒性效应，即HeLa细胞中诱导的MACH cDNA过度表达导致了显著的细胞毒性效应。该细胞毒性效应可能与MACH的自身缔合性能相关。
(iii)Northern分析
用熟知的步骤(见参考实施例1)，以MACH cDNA作为探针，对几种细胞系进行Northern分析。该分析结果表明，在许多细胞系中(特别是CEM，Raji，Daudi，HeLA，Alexander，Jurkat和A673细胞系中)，存在大小约为3.2kb的两种杂交转录物。
鉴于上述结果，MACH蛋白、尤其是MACHβ1蛋白(MACH的ORF-B)可用来直接调节或介导MORT-1相关的细胞效应，或间接调节或介导FAS-R配体对于细胞的效应(当该效应由MORT-1来调节或介导时)。MACH与MORT-1上游区域特异性结合且与MORT-1同源的这些事实提供了一种特殊的方式，此方式可用MACH或MACH ORF-B来调节MORT-1的该特异性区域，因而调节由该上游区域确定的MORT-1的特异性活性。另外，MACH或MACH ORF-B还可以类似于MORT-1(见上文)的方式凭借MACH能自身缔合并诱导对自己的细胞毒性的能力用作胞内效应的调节剂或中介体。
如下文所述，进一步分析MACH蛋白及其编码的DNA序列。结果进一步揭示了MACH的ORF-B只是多种MACH同种型中的一种。因此，现在已经对MACH蛋白及其DNA编码序列重新命名，这从下文中可明显看出。
(a)双杂交筛选结合MORT-1的蛋白揭示了一个享有MORT-1序列基序的新蛋白
如上所述，为了鉴别出参与MORT-1诱导细胞死亡过程的蛋白，用双杂交技术来筛选cDNA文库，以便选出与MORT-1结合的蛋白。用MORT-1 cDNA作为诱饵，对人B细胞文库进行双杂交筛选(Dufee等，1993)，产生了MORT-1本身的cDNA克隆，这反映了该蛋白能如同MORT-1有效结合的TRADD克隆一样好地自身缔合(见参考实施例2)。筛选还产生了新序列的cDNA克隆，其产物能特异性地结合MORT-1。该蛋白最初被称为MACH，后来，在发现它存在于多种同种型(见下文)后，就重新命名为MACHβ1，其在双杂交测试中也显示出能与其自身结合，但是不能和FAS-R结合(见上述共同拥有的待批申请PCR/US96/10521，此申请还包括所有下述分析和分析所获得的结果)。
在转染了Gal4 DNA结合域和激活域构建物(pGBT9和pGAD-GH)的SFY526酵母中表达MORT-1和MACHβ1及其缺失的构建物，以及MACHα1(一种MACHα1突变体，此突变体有催化性的半胱氨酸Cys360被Ser代替(MACHα1(C360S)))，和人FAS-R胞内结构域(Fas-IC)。用Boldin等(1995b)所述的β-半乳糖苷酶表达过滤试验评价它们的相互作用。结果用产生较深颜色所需的时间表示。受检测的插入物没有一种和大量测试阴性对照相互作用，包括人p55TNF受体、p75 TNF受体和CD40的胞内结构域，以及核纤层蛋白、细胞周期蛋白D和“空”的Gal4载体。用HF7c酵母报道菌株，通过双杂交筛选Gal4 AD-标记的人B细胞文库(Durfee等，1993)中与MORT-1结合蛋白，克隆获得MACHβ1。除非另有特指，该发现的所有步骤如上所述(另见Boldin等，1995)。缺失分析表明，MACHβ1与参与细胞死亡诱导作用的MORT-1的N端部分结合(Chinnaiyan等，1995)。MACHβ1还在转染的酵母中自身缔合。然而，它不与几种对照蛋白结合，并且与MORT-1不同，不能与FAS-R结合。MACHβ1分子在哺乳动物细胞中的表达产生了34kDa的蛋白，它能与和其共表达的MORT-1分子结合。它还能在体外和GST-MORT-1融合蛋白结合。
比较MACHβ1和MORT-1的氨基酸序列，结果表明这两种蛋白中有一个共同的序列基序(命名为“Mort组件”)，其与死亡基序(MORT-1通过该基序与FAS-R结合)不同。该基序在MORT-1中有一个，在MACHβ1中有两个。另外，在PEA-15(一种功能未知的星形细胞磷蛋白)中也发现了该基序。初步数据暗示，MORT基序参与了MACHβ1(及其它MACH同种型)与MORT-1的结合。
推导的MACHβ1的氨基酸序列在上述PCT/US96/10521及其对应的以色列申请(尤其是IL117932)中有所描述。其中显示了两种MORT组件以及采用的两种MACHβ1缺失突变体的C端。上述共同拥有的待批申请中还描述了MACHβ1、MORT-1和PEA-15基因(登录号为X86809)中的组件序列同源性，其中相同和相似的残基分别用方框和阴影区域表示。
在上述共同拥有的申请中，还示出了死亡域和MORT组件，以及Fas/APO1，MACHβ1和MACHα1中的CED3/ICE同源区。
现已表明，含有该“MORT组件”的MORT-1中的区域参与了该蛋白的细胞死亡诱导作用(见上文参考实施例1)。还表明，它导致MORT-1自身缔合(尽管不充分)(见参考实施例1)。对转染酵母中MACHβ1的缺失构建物的结合性能进行分析，结果也揭示了MORT组件以类似方式参与了MACHβ1的自身缔合以及其与MORT-1的结合：缺失构建物中MORT组件以下(下游)的区域缺失，使它不能相互结合，但是仍保留了与全长MORT-1和全长MACHβ1结合的能力。进一步截短使MORT组件序列的一部分缺失，结果导致该蛋白丧失结合能力。为了进一步评价MORT组件参与这些相互作用，在HeLa细胞中表达与FLAG八肽融合的MACHβ1缺失突变体(FLAG-MACHβ1)，并评价其与细菌产生的谷胱甘肽-S-转移酶-MORT-1融合蛋白(GST-MORT-1)的体外结合。与酵母双杂交测试中所观察到的结合类似，发现这种体外结合也取决于MACHβ1组件内区域的相互作用。在转染的HeLa细胞中产生MACHβ1、N端融合了FLAG八肽的MACHβ1(FLAG-MACHβ1)、FLAG-MACHβ1的C端截短突变体以及对照萤光素酶。表达采用四环素控制的表达载体，在表达四环素控制的反式激活蛋白的HeLa细胞克隆(HtTA-1)中进行。
用抗FLAG抗体对细胞裂解液进行免疫沉淀来评价上述蛋白的表达及其分子大小。所用抗体如下：针对GST-MACHβ1和GST-MORT1融合蛋白产生的家兔抗MACHβ1和抗MORT1抗血清。针对FLAG八肽的小鼠单克隆抗体(M2)以及针对FAS/APO1的单克隆抗体(CH11，Yonehara等，1989)分别购自Eastman Kodak和Oncor(Gaithersburg，MD)。小鼠单克隆抗-HA表位抗体(12C.A5，Field等，1988)和抗TNF抗体由我们实验室根据本领域熟知的常用方法产生。结果显示了这些蛋白与吸附在谷胱甘肽-琼脂糖玻珠上的GST-MORT-1亲和结合(或作为对照，这些蛋白与GST或和Fas-APO1胞内结构域融合的GST结合)；且采用各种特异性抗体时，各种MORT-1和MACH融合构建物发生免疫沉淀，这些结果在上述共同拥有的待批申请中，尤其是在PCT/US96/10521和IL 117932中有所描述。
(b)以多种同种型形式存在的MACH：
用MACHβ1 cDNA作为探针的Northern分析结果表明，在几种不同细胞系中，大小约为3kb的转录物的丰度很低。简言之，用MACHβ1 cDNA作为探针，对几种细胞系的总RNA(14μg/泳道)或poly A+RNA(2μg)进行Northern印迹分析。受检的T47D、CEM、Raji、Daudi、HeLa、Alexander、Jurkat、和A673细胞系均为人源，分别来自乳房导管癌、急性淋巴母细胞T细胞白血病、Burkitt淋巴瘤、Burkitt淋巴瘤、上皮样(epitheloid)癌、人肝瘤、急性T细胞白血病和横纹肌肉瘤。Northern印迹上杂交条带相当扩散的形状表明，这些转录物是异质性的，大小在2.85-3.5Kb范围内。不同人组织的转录物的量和大小均不相同，且与MORT1或FAS/APO1的表达无关(Watanabe等，1992)。例如在睾丸和骨骼肌中，MACH转录物几乎检测不到，尽管这些组织表达了显著量的MORT1。相反在静止的外周血单核白细胞中，MOAT1的表达非常低，而发现MACH的表达水平非常高。用外源凝集素激活白细胞，结果导致MACH转录物的大小模式显著改变，同时还诱导了MORT-1。
为了研究该大小非均一性的特性，筛选cDNA文库，寻求与MACHβ1 cDNA探针杂交的转录物。MACHα1和MACHα2从人胸腺mRNA获得的Charon BScDNA文库中克隆出。用MACHβ1 cDNA探针在严谨条件下筛选该文库，该探针用随机引导试剂盒(Boehringer Mannheim)作标记。其它MACH同种型通过在Raji(MACHα1，α2，α3，β3和β4)和Daudi(MACHα2，β2，β3，β4和β5)的总RNA上进行RT-PCR来克隆获得。逆转录酶反应用寡-dT衔接引物(5′-GACTCG AGTCTAGAGTC GAC(T)17-3′)和SuperScript II逆转录酶(GIBCO-BRL)根据生产商说明进行。PCR的第一轮采用Expand Long Template PCR系统(Boehringer Mannheim)进行，分别用下列有义和反义引物：5′-AAGTGA GCAGA TCAGA ATTGAG-3′(对应于MACHβ1 cDNA的核苷酸530-551)和5′-GACT CGAGT CTAGA GTCGAC-3′。第二轮用Vent聚合酶(NEB)来进行，分别采用下列有义和反义嵌套引物：5′GAGGA TCCCC AAATGC AAACTG GATGA TGAC-3′和5′GCCA CCAGCTAAAAA CATTC TCAA-3′(从MACHβ1 cDNA的序列获得)。为了确认MACHβ3和MCAHβ4具有启动密码子，还从Raji细胞的RNA克隆获得这些同种型的其它5′序列。用上述寡-dT衔接引物进行RT-PCR反应，然后是两轮PCR(用Vent聚合酶(NEB))，采用下列有义和反义寡核苷酸：5′-TTGGA TCCAG ATGGA CTTCAGCAGA AATCTT-3′和5′-ATTCTC AAACCC TGCAT CCAA GTG-3′(从MACHβ1的序列获得)。后一寡核苷酸对β-同种型有特异性。在以该方式获得的克隆中，对发现含有编码＂区段2＂氨基酸的核苷酸(它的存在区分MACHβ3和MACHβ4与MACHβ1和MACHβ2)的那些克隆进行全部测序。用双脱氧链终止方法在两个方向上测定所有克隆的同种型中的核苷酸序列。只获得了MACHa3和MACHβ2的部分cDNA克隆。该筛选揭示了MACH的多种同种型的存在。详细研究这些同种型中的7种的氨基酸序列。在上述共同拥有的待批申请、尤其是PCT/US96/10521和IL 117932中列举性地图示了该结果，其中将同种型中的3种的氨基酸序列与已知同系物作了比较。
MACHα1中编码“区段2”的65个核苷酸的缺失导致MACHβ1和MACHβ2中编码“区段3”的核苷酸读框改变。因此，在那些同种型中，这些核苷酸编码的其它氨基酸共同组成了其独特的C端区域。另一方面，在MACHβ3和MACHβ4中保留了区段3的读框，但是编码CED3/ICE区域和部分3′非编码区核苷酸的缺乏导致更下游的核苷酸读框发生改变。由于这一变化，该非编码下游区的大多数5′部分编码了10个氨基酸，它们组成了这两种同种型特有的C端区。
从人B细胞cDNA文库(MACHβ1)、人胸腺cDNA文库(MACHα1和α2)和人淋巴母细胞瘤(lymphoblastoid)细胞Raji(MACHα1，α2，α3，β3，β4和β5)和Daudi(MACHα2，β2，β3，β4和β5)的mRNA克隆获得同种型。从Raji和Daudi细胞的mRNA克隆用RT-PCR来进行，采用对应于3′非编码区和MACHβ1中第二MORT组件中一个序列的寡核苷酸。因此，以该种方式分离出的克隆的起始密码子位于第二MORT组件内。
不同同种型中的序列的相互关系如下：(a)所有MACH同种型均具有一个共同的182氨基酸的N端区，该区域包括MORT组件，但是这些组件羧基端(3′下游)以及其非编码区不同。(b)根据C端序列，同种型分为两个亚类：四种同种型称为亚类β，由于读框的改变，它们具有不同的C端。两种同种型(MACHβ1和β2)均具有双杂交筛选中最初克隆获得的同种型中所见的C端，另两种(MACHβ3和MACHβ4)则具有不同的C端；三种同种型被称为亚类α，它们具有长得多的C端区，该C端区与CED3/ICE家族的蛋白酶(见下文)非常类似；在MORT组件区和确定亚类的C端区之间的延伸区各同种型相互不同。然而仔细检查发现，这些中间区由相同的三个氨基酸序列区段(区段1、2和3)的不同组合组成。不同克隆之间的氨基酸序列的变化反映了核苷酸序列的两类变化，它们很可能是由可变剪接产生的：(a)在编码Lys184的核苷酸后面，插入或缺失了两种核苷酸序列之一或两者，一个有45个核苷酸，另一个有65个核苷酸；(b)在MACHβ1中组成3′非编码部分的区域中有附加插入物的存在。这些变化对读框以及蛋白长度均有影响。
部分MACH同种型包括CED3/ICE同系物。数据库检索表明，包括区段3及其下游延伸序列的MACHα同种型的C端区，与CED3/ICE家族的蛋白酶非常相似。将MACH中的该区域与该家族的各种已知人成员和Caenorhabditis elegansced3蛋白作序列比较(Ellis和Horvitz，1986；Yuan等，1993)，CED3/ICE蛋白酶家族的已知人蛋白酶是：CPP32(Fernandes-Alnemri等，1994)(也称为apopain(Nicholson等，1995)和Yama(Tewari等，1995b))、Mch2α(Fernandes-Alnemri等，1995)、Ich-1(Wang等，1994；小鼠Nedd2蛋白的人同系物，Kumar等，1994)、ICErelII(＜umday等，1995)、ICErelII(Munday等，1995)(也称为TX和Ich2(Faucheu等，1995；Kamens等，1995))、和ICE(Thornberry等，1992；Cerretti等，1992)。
上述MACH的C端区最近似于CPP32(相同性41％，同源性62％)和CED3(相同性34％，同源性56％)。它表现出与ICE及其密切相关的同系物ICErelII(也称为TX和Ich2)和ICErelIII的相似性明显较低(相同性28％，同源性50％)。在区段3内从Tyr226起至MACHα同种型的C端为止的几乎全部区域内观察到该相似性。
有两点相似性特别值得注意：
(a)CED3/ICE家族的所有已知蛋白酶切割蛋白的位点定位于P1位置有Asp，以及P1′处有小疏水性氨基酸残基。但是对于底物的其它结构特征(包括位置P2-P4的残基的特征)，它们的特异性不同。因此，在这些蛋白酶中，参与催化的活性位点残基(对应于ICE中的His237，Gly238和Cys285)以及涉及针对P1 Asp羧酸侧链的结合袋的活性位点残基(Arg179，Gln283，Arg341，可能还有Ser347)是保守的。这些残基在MACHα1中也是保守的。但是有一个例外，在对应于ICE的Ser347位点处Ser保守性地变为Thr。MACHa同种型和该蛋白酶家族其它成员之间的另一个轻微的但可能很重要的序列差别是，对应于ICE的Arg286残基，Arg被Gln取代。该残基与推导的催化性半胱氨酸残基毗邻，它在其它所有CED3/ICE家族成员中是完全保守的。另外，MACHα同种型中位于底物P2-P4残基附近的部分残基也与CED3/ICE家族其它成员中所见的不同。
(b)CED3/ICE家族的蛋白酶含有自身断裂的位点。已知几种蛋白酶确实能自我加工，并且依靠这种加工来表现出最大的催化活性。它们全部的生物活性形式由大小不同的两个非共价联合的断裂产物组成(ICE中的p20和p17；CPP32中的p17和p12)。该家族其它成员中存在自身断裂的潜在位点，暗示它们也可受类似的加工，并且也能类似地依靠该加工来表现出最大的活性。MACHα1中的这些潜在的自身断裂位点和CPP32中的几乎处于相同的位置处。对应于CPP32的p17亚基N端的位点在氨基酸的第二保守区段内，正好是CED3/ICE-同源区N端上游的几个氨基酸(在Asp216之后)。和已知能被断裂的CED3/ICE家族的其它所有成员中的一样，对应于CPP32两个亚基间断裂点的位点是在催化性半胱氨酸残基下游(在Asp347之后)的几个氨基酸。这种保守提示了MACHα1中的CED3/ICE同源区易受蛋白水解加工。该断裂的两个预计产物的大小与CPP32分子加工后的两个亚基非常相似。
(c)MACH中的CED3/ICE同源区具有蛋白水解活性。
为了确认MACHa中的CED3/ICE同源区是否具有蛋白水解活性，申请人在细菌内表达了从该区域上游潜在断裂位点(在Asp216和Ser217之间)延伸到蛋白C端的区域，作为GST融合蛋白。检测细菌裂解液断裂荧光肽底物的能力，前已表明该底物可被其它CED3/ICE同系物断裂。采用以下两个底物肽：第一个是乙酰-Asp-Glu-Val-Asp-a-(4-甲基-香豆酰-7-酰胺)(AC-DEVD-AMC)，它对应于FAS-R刺激后不久(Tewari等，1995b)和其他凋亡过程(Kaufmann，1989；Kaufmann等，1993；Lazebnik等，1994)中在细胞中发现被切割的一种核蛋白：聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)的序列。该荧光底物可被CPP32有效地切割。第二种荧光底物是乙酰-Tyr-Val-Ala-Asp-AMC(Ac-YVAD-AMC)，它对应于IL-1β前体中针对ICE的底物位点。该荧光底物可被ICE断裂。表达MACHα1中的CED3/ICE同源区的细菌裂解液有效地切割了PARP序列衍生的荧光底物。虽然，它们针对IL-1β前体序列衍生的荧光底物(对照)Ac-YVAD-AMC(它是IL-1β前体中的ICE切割位点(Thornberry等，1992))，却没有可检测的蛋白水解活性。蛋白水解活性被碘代乙酸(5mM)阻断，这确证了它是由硫醇蛋白酶介导的。用含有融合GST的MACHCED3/ICE同源区(其中催化性半胱氨酸残基Cys360被Ser取代)的裂解液没有发现断裂。另外，将全长MACHα1蛋白表达成GST-融合蛋白的细菌的裂解液不切割Ac-DEVD-AMC，这可能是因为没有能加工该全长分子的细菌酶存在。用含有CED3/ICE同源区的两种潜在断裂产物之一的裂解液也没有发生断裂。
与表达全长MACHα1分子或CED3/ICE同源区的两个潜在蛋白水解产物之一(Ser217至Asp374，和Asp374至蛋白C端)的GST-融合蛋白的细菌抽提物没有断裂相比，表达MACHα1中CED3/ICE同源区(Ser217至蛋白C端)的GST融合蛋白的大肠杆菌抽提物，显示出断裂PARP序列衍生的荧光底物(Ac-DEVD-AMC，50mM)的动力学(性能)。
另外，还显示了Ac-DEVD-AMC的断裂对底物浓度的依赖性，该底物和表达与GST融合的MACHα1 CED3/ICE同源区的细菌抽提物一起培育180分钟。在碘代乙酸(5mM)存在下没有发现断裂。此抽提物对于Ac-YVAD-AMC(一种对应于IL-1β前体中ICE底物位点的荧光底物)没有活性。
简言之，用pGEX3表达载体在XL1-蓝色细菌中产生GST-融合蛋白。细菌在含25mM HEPES(pH7.5)，0.1％3-[3-乙醇胺基丙基)二甲氨基]-1-丙磺酸，5mMEDTA和2mM DDT的缓冲液中超声破碎裂解，然后16000Xg离心10分钟。SDS-PAGE分析证实了裂解液中存在相似水平的各种融合蛋白。使50μl等份的抽提物(4mg/ml总蛋白)在总体积为500μl的反应中和指定浓度的荧光底物在室温下培育指定长的时间。用光谱荧光术在380nm的激发波长和460nm的发射波长下测定AMC释放值。AMC的浓度通过标准曲线来确定。两种荧光底物肽均购自Peptide Institute Inc.(Osaka，Japan)。其它CED3/ICE蛋白酶只有在蛋白水解加工后才表现出全部的活性，该加工可通过自身断裂或由其它蛋白酶断裂(回顾见Kumar，1995；Henkart，1996)来产生。申请人观察到，表达GST-MACHα1分子的细菌裂解液不具有酶活性，这与表达CED3/ICE同源区的细菌裂解液所见的活性相反，这暗示了加工也是MACHα活性所需的。关于MACHα加工在哺乳动物细胞内发生的方式，以及该加工怎样由FAS-R或p55-R引发却不知道。已经表明，MORT-1在细胞中结合激活的FAS-R以及其它一些蛋白(Kischkel等，1995)。这些蛋白可能包括MACHα1和其它MACH同种型。和MACHα连接的MORT-1与FAS-R的结合，将几个MACH分子聚在一起，或诱导它们构象发生改变，这些变化或是引发MACHα的自身裂解加工，或是使得MACHα易受其它蛋白酶的断裂，这看来似乎是合理的。p55-R的刺激可能以类似的但更间接的方式来引发MACHα的自身加工，它将几个TRADD分子聚在一起，或诱导它们发生构象变化，从而诱导MORT-1及其相连的MACH分子的形成、状态或聚集发生改变。
MACHα的底物特异性似乎是“有点死亡取向性的”。尽管它能断裂对应于死亡底物PARP(Ac-DEVD-AMC)中的断裂位点的底物肽，但是MACHα对对应于IL-1β前体中的ICE加工位点(Ac-YVAD-AMC)的肽却没有表现出蛋白水解活性。鉴别出作为MACHα断裂底物的细胞蛋白将阐述该蛋白酶诱导死亡过程中更下游的行为。MACHα断裂的可能的底物是CED3/ICE家族的其它成员，如CPP32和ICE。这些蛋白酶中有一些实际上是在FAS-R或TNF受体引发后被加工的(Miura等，1995；Schlegel等，1996；Chinnaiyan等，1996)。不属于CED3/ICE家族的蛋白酶可能也由MACHα直接激活或通过和其它CED3/ICE蛋白酶作用来激活。多种蛋白酶参与细胞死亡过程与各种蛋白酶抑制剂(包括丝氨酸蛋白酶抑制剂和ICE断裂抑制剂以及反义ICE cDNA)所报道的保护细胞免受遭FAS-R和TNF受体诱导的细胞毒性的能力相符(Weitzen和Granger，1980；Ruggiero等，1987；Enari等，1995；Los等，1995)。
其它各种酶，包括磷酸酯酶、鞘磷脂酶和蛋白激酶可能参与了TNF受体和FAS-R诱导的细胞死亡(见Eischen等，1994；Vandenabeele等，1995；Cifone等，1995及其参考文献)。这些酶中有一些可能通过MACHα引发的蛋白水解断裂而激活。然而，看来也有可能其它这些与死亡相关的活性至少一部分由不依赖于MACHα刺激的不同信号传导途径所激发。多种信号级联涉及诱导细胞死亡，一些是p55-R和FAS/APO1共有的，一些只由其中的一种来诱导，这与两种受体诱导的细胞死亡过程的共同和不同特征的报道相符(Grell等，1994；Schulze-Osthoff等，1994；Wong和Goeddel，1994；Clement和Stamenkovic，1994)。
(d)MACHα和MORT1以及MACHβ1结合：
为了确定MACHα1是否象MACHβ1那样与MORT1结合，首先在转染的酵母中检测这些蛋白的相互作用。MACHα1表现出对酵母有显著的细胞毒性效应。该效应通过表达激活域(AD)载体(其表达水平高于DNA结合域(DBD)载体)中的蛋白质的酵母菌落产生率显著降低得以证实。另一方面，催化性半胱氨酸残基Cys360被Ser取代(MACHα1(C360S))的MACHβ1对哺乳动物细胞(见下文)或酵母均没有细胞毒性。MACHα1(C360S)在转染的细胞中与MORT-1结合，还可与自身结合。它还与MACHβ1结合。另外，表达野生型MACHα1以及MORT-1或MACHβ1的酵母显现了转染的蛋白之间有相互作用。然而，在酵母菌落中lacZ-产物颜色的强度不同；在用AD和DBD两载体中的MACHα1转染的酵母中，没有观察到有颜色的产物，这可能是由于野生型MACHα1的细胞毒性效应而致。然而，尽管有此不同，与MORT1组合或和MACHβ1组合表达MACHα1的酵母却清晰呈现出转染蛋白相互作用的明确证据。与MACHβ1不同，MACHα1在双杂交测试中没有表现出自身反应。
MACHα1(C360S)和MACHβ1均能与人胚肾293-EBNA细胞裂解液的MORT-1共同免疫沉淀，这说明它们在哺乳动物细胞中也与MORT-1结合。为了进一步测试MACHα1是否在哺乳动物细胞内也结合MORT1，使与FLAG八肽融合的MACHα1或MACHβ1与HA表位标记的MORT1分子一起表达。在HeLa细胞中表达35[S]代谢性标记的N端与FLAG八肽融合的MACHα1和MACHβ1(FLAG-MACHα1和β1)，以及N端与HA表位融合的MORT1(Field等，1988)。用针对FLAG八肽(M2；Eastman Kodak)、HA表位(12CA5，Field等，1988)或作为对照的p75 TNF受体(#9，Bigda等，1994)的单克隆抗体使细胞裂解液中的蛋白免疫沉淀。用SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(12％丙烯酰胺)分析蛋白，然后进行放射自显影。MACHα1和MACHβ1均与细胞裂解液中的MORT1发生共免疫沉淀，这说明它们均与MORT1结合。MACHα1与MORT1相互作用的效率看来比MACHβ1要低。
(e)含有CED3/ICE同源区的MACH分子可介导细胞死亡：
为了研究MACH参与细胞死亡的诱导作用，检测各种MACH同种型过度表达对细胞存活率的影响。测试这样进行，将MACH表达载体以及作为转染标记的β-半乳糖苷酶表达载体转染到人胚肾293-EBNA细胞和乳房癌MCF7细胞中。
简言之，使293-EBNA细胞、MCF7人乳房癌细胞和HeLa HtTA-1细胞在Dulbecco改进的Eagle最小必需培养基中生长，培养基中添加了10％胎牛血清、非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100μg/ml链霉素。用磷酸钙沉淀方法，用指定蛋白的cDNA和β-半乳糖苷酶表达载体瞬时转染细胞组织培养碟(6cm碟中有5×105293-EBNA细胞，3×105MCF7细胞或3×105HeLa细胞)。在一组试验中，每个碟用3.5μg MACH构建物和1.5μg pSV-β-gal转染；在另一组试验中，每个碟用2.5μg指定的MACH或MORT1构建物(或作为对照的空载体)和1.5μg pSV-β-gal来转染。转染后6-10小时清洗细胞。使293-EBNA和MCF7细胞再培育18小时而不作任何处理。HeLa细胞在转染后培育26小时，然后在抗Fas.APO1抗体(CH11，0.5μg/ml)或TNF(100ng/ml)之一以及环己酰亚胺(10μg/ml)存在下再培育5小时。在培育期最后如Kumar等，1994所述，测定β-半乳糖苷酶的表达来评价细胞死亡程度。
用MACHα1或MACHα2的表达载体转染的培养物显现出有大量细胞死亡，其表现为细胞变圆、起泡、收缩并最终细胞和碟分离。转染20小时后，经β-半乳糖苷酶染色(X-Gal)鉴定，大部分转染的细胞显示出凋亡的典型的固缩形态。相反，表达空载体的细胞仍保持存活。
为了测定MACHα同种型中的CED3/ICE同源区参与它们的凋亡效应，用下列表达载体转染细胞：缺少CED3/ICE同源区的MACHβ1同种型表达载体；缺少CED3/ICE同源区N端部分的MACHα3的表达载体；以及MACHα1(C360S)和MACHα1 C端截短突变体(MACHa1(1-415))的表达载体，它缺少一个据信对于CED3/ICE蛋白酶功能来说关键的残基(对应于ICE中的Ser347)。在用MACHα3、MACHα1(1-415)或MACHα1(C360S)的表达载体转染的293-EBNA或MCF7细胞中没有发生死亡(除了用空表达载体转染的细胞中所观察到的少量死亡外)。而且，转染了MACHα1以及这些载体的细胞还表现出非常少的细胞死亡，这说明含有不完全的CED3/ICE区域的MACH分子对于野生型分子的活性具有阴性显性效应。表达不含CED3/ICE区的MACHβ1的培养物不呈现有少量细胞死亡。出于某些原因，MACHβ1的这种效应(最可能是由于内源MACHα1分子激活)在转染的HeLa细胞中更为显著。而且，在HeLa细胞中，MACHα3、MACHα1(1-415)和MACHα1(C360S)也具有一定程度的细胞毒性。
MACHα活性看来构成了FAS/APO1和p55-R杀细胞效应的信号传导级联中最上游的酶促步骤。MACHβ1与MORT-1和MORTα1结合的能力暗示了该同种型能增强酶促活性同种型的活性。可能一些MACH同种型还有其它功能。MACHβ1与MORT-1和MACHα1结合的能力暗示了该同种型可能增强了酶促活性同种型的活性。用该同种型转染的293-EBNA和MCF7培养物中观察到的细胞毒性较为轻微，而其在HeLa细胞中的细胞毒性效应却相当显著，这可能反映了内源表达的MACHα分子在结合转染的MACHβ1分子时被激活。可以想象的是，一些MACH同种型还可作为涉及FAS/APO1和TNF受体的其它非细胞毒性效应分子的停靠位点而起作用。
(f)MACHα功能的阻断干扰了Fas/APO1和p55-R诱导的细胞死亡。
为了评价MACHα对Fas/APO1和p55-R细胞毒性的作用的贡献，在诱导后能表现其细胞毒性的细胞中表达MACHα3、以及无功能的MACHα1突变体、MACHα1(1-415)和MACHα(C360S)。293-EBNA细胞中p55-R诱导的细胞毒性由该受体的瞬时过度表达而引发(Boldin等，1995b)，而Fas/APo1细胞毒性由嵌合分子的过度表达来引发，该嵌合分子不含p55-R的胞外结构域和正常Fas/APO1的跨膜和胞内结构域。该嵌合体的细胞毒作用比正常的Fas/APO1高得多。在蛋白合成阻断剂环己酰亚胺的存在下，用TNF或抗-Fas/APO1抗体处理HeLa细胞也会在HeLa细胞内诱导出细胞毒性活性。HeLa细胞通过瞬时表达该受体对Fas/APO1作出应答。在检测的所有系统中，MACHα3和无功能的MACHα1突变体提供了有效的保护力抵抗了Fas/APO1或p55-R引发诱导的细胞毒性。如以前所报道的(Hsu等，1996；Chinnaiyan等，1996)，发现在用缺乏MACH结合区的MORT-1 N端缺失突变体(MORT1(92-208))转染的细胞中也有这种保护作用。这些保护效应表明MACHα是Fas/APO1和p55-R诱导的细胞死亡信号传导级联的必需组件。
MACH在不同组织中的表达水平显著不同，并且明显有不同的同种型方式。这些差别可能导致了对FAS/APO1配体和TNF应答反应时的组织特异性特征。在其它CED3/ICE同系物的情况下(Wang等，1994；Alnemri等，1995)，发现含有不完全CED3/ICE区域的MACH同种型(例如MACHα3)抑制了共表达的MACHα1或MACHα2分子的活性；还发现它们阻断了FAS/APO1和p55-R诱导的死亡。这种抑制性同种型在细胞内的表达可能构成了细胞自我保护抵抗FAS/APO1和TNF介导的细胞毒性的机制。MACH同种型的广泛的异质性大大超过了CED3/ICE家族任何其它蛋白酶所见，这就能特别细微地调节活性MACH同种型的功能。
实施例1：与MORT-1结合蛋白Mch4结合的G1蛋白的克隆和分离
(i)双杂交筛选和双杂交β-半乳糖苷酶表达试验
用上述参考实施例1-3中所述的步骤分离出一种新的蛋白，命名为G1，它明显与ICE-样蛋白酶家族同源，因此可能是该家族的一个成员。G1蛋白含有两个组件与MORT组件同源，即与MORT-1 N端部分、MACH蛋白的MORT组件(见上文参考实施例1-3和Boldin等，1996)以及另一相关的MORT-1结合蛋白Mch4的MORT组件(见Fernandes-Alnemri等，1996；Srinivasula等，1996)同源。而且，G1蛋白具有与CED3/ICE家族蛋白酶的酶(蛋白酶)活性区域(例如，MACH蛋白和Mch4及其它蛋白的蛋白酶区)同源的酶(蛋白酶样)活性区域。
简言之，用蛋白Mch4作为“诱饵”，通过双杂交筛选从人Jurkat T细胞cDNA文库中获得一个蛋白G1的克隆(＂克隆G1＂)。采用Gal4激活域标记的人Jurkat T细胞cDNA文库，按照MatchmakerTM双杂交系统程序(Clontech)，在缺少3-氨基三唑下用HF7c酵母报道菌株(Clontech，Palo Alto，Ca.)进行筛选。Mch4序列从EMBL数据库获得。利用获得的此序列，用OLIGOTM软件设计PCR-引物，通过逆转录酶PCR(RT-PCR)从总RNA中获得对应于Mch4编码部分的DNA片段，该总RNA通过标准方法从原代人脐静脉内皮细胞获得。然后将Mch4的该编码部分克隆到pGADGH载体(Clontech)中，并如上所述用作双杂交筛选程序中的诱饵。在此双杂交筛选中，获得11个克隆，它们编码的蛋白均显然是含有与MORT-1同源的两个基序的蛋白的剪接变体。分析G1的基本部分序列以及＂dbest＂数据库和人基因组数据库(Human Genome Database)一级水平中的序列，就能获得许多含有克隆G1部分序列的表达序列标记(est)。对这些表达序列标记(est)进行序列分析，结果揭示了可能有许多蛋白G1的剪接变体含有编码与ICE样蛋白酶同源的蛋白基序的序列段，且该序列段位于双杂交筛选获得的G1序列的3′端。
为了获得含有蛋白酶样酶活性区域的G1同种型的全部序列，用含有15dt序列段和衔接子序列的寡核苷酸作为引物对从各种细胞系获得的总RNA进行逆转录酶反应以产生cDNA分子。然后将这些cDNA分子用作PCR反应中的模板，其中设计和合成的PCR引物具有从G1 5′非编码部分获得的序列和衔接子序列的寡核苷酸形式，这些引物用于第一轮PCR反应。随后，在上述PCR反应第二轮中，采用另一寡核苷酸引物，该引物具有包括起始密码子ATG在内的G1 5′编码部分的序列以及衔接子序列。这样，就可以获得含有酶(蛋白酶样)活性区域的G1蛋白的明显剪接变体的全部序列。这只代表了一种怀疑的G1同种型。
图1示出了这样一种G1同种型(G1剪接变体)的基本序列，其中上方的序列为核苷酸序列，下方的序列为推导的从ATG(核苷酸编号482)起至TAA(核苷酸1921)为止的ORF的氨基酸序列，这些起始和终止密码子核苷酸在核苷酸序列中用星号(*)表示。图1的G1剪接变体也假定称为“G1α”。
图2中示出了另一种G1同种型的基本序列，该同种型是一种短的G1剪接变体，具有两个MORT组件，假定称为“G1β”，图中上方的序列是核苷酸序列，下方的序列是从核苷酸No.482(ATG)起至核苷酸No.1145(TGA)为止的ORF的氨基酸序列，起始和终止密码子在核苷酸序列中用星号(*)表示。
另外应注意，用Mch4序列作为“诱饵”最初分离获得的G1克隆是短的G1剪接变体的至少一部分，称为“G1β”(见图2)。该最初分离获得的G1克隆是新的cDNA的部分克隆，它象MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)一样，在紧靠其N端下游处有两个“死亡域基序/MORT组件(或“死亡效应域”-DED)”。利用该原始的克隆，然后就可以分离和鉴定分析较大的G1α剪接变体和较小的G1β剪接变体的cDNA克隆。较大的剪接变体的C端与卡斯酶的蛋白酶区域同源，因此它可能是卡斯酶家族的新成员。因此，G1也因为是“卡斯酶同系物”而被称为CASH。比较G1α(CASHα)和G1β(CASHβ)序列和其它卡斯酶序列(更详细的内容，尤其是小鼠G1序列的分离见下文以及上文“附图简述”关于图3的描述)。图3示出了这一比较的详细结果，关于附图的全部详细内容、尤其是该附图中对于指定序列最为关键的内容在上文“附图简述”中有所描述。
在上述初始克隆和对G1(尤其是G1α和G1β同种型)测序后，进一步分析这些蛋白：
(ii)Northern分析和其它序列分析：
Northern印迹分析揭示了G1蛋白至少以三个不同转录物大小(2，2.4和4.4kb)形式存在，它们的比例在不同组织中有很大的不同(图4)。为了获得G1(CASH)的全长cDNA，用对应于G1序列的cDNA探针筛选人皮肤成纤维细胞cDNA文库(Clontech)。获得两个cDNA物质，它们显然对应于G1的两个剪接变体(见上文)。这两个cDNA编码的蛋白均有含死亡效应域的N端区，但是它们的C端不同。一个(G1β＝CASHβ)具有短的C端，对应于最初克隆获得的cDNA。另一个(G1α＝CASHα)具有较长的C端。
G1α的这个较长的C端区中的氨基酸序列显示出与MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)中蛋白酶前体区的那些氨基酸序列有相当高的同源性(另见图3)。然而，G1α缺少据认为对于蛋白酶活性来说是关键的几个残基，这提示该蛋白可能没有半胱氨酸蛋白酶活性。令人感兴趣的是，G1α在对应于MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)的蛋白酶区域中的蛋白水解加工位点上含有卡斯酶底物序列(图3中用阴影表示)。基本数据暗示了G1α确实能在该位点被MACH断裂(数据未示出)。
根据EST克隆的核苷酸序列对应于G1中“死亡域”(DED)部分的小鼠同源物这一发现，用RT-PCR从小鼠肝mRNA中克隆出小鼠CASHα和CASHβ剪接变体的cDNA。鉴别出一种EST克隆(GenBank登录号AA198928)是G1中DED区域部分的小鼠同源物。根据该序列，用RT-PCR从小鼠肝mRNA中克隆出小鼠G1α(CASHα)和G1β(CASHβ)剪接变体。按照生产商说明书采用寡-dT衔接子引物(5′-GACTC GAGTC TAGAG TCGAC(T)17-3)和AMV逆转录酶(Promega)进行逆转录酶反应。第一轮PCR采用Expand Long Template PCR System(BoehringerMannheim)，并分别用下列有义和反义引物：5′-GGCTT CTCGTG GTTCCCAGAGC-3′和5′-GACTC GAGTC TAGAG TCGAC-3′(衔接子)。第二轮用Vent聚合酶(NEB)，采用嵌套有义引物：5′-TGCT CTTCC TGTGT AGAGA TG-3′和衔接子。
序列比较揭示，整个G1α(CASHα)分子有高保守性(相同性在DED区中为71％，蛋白酶同源区中为59％)，这暗示了该蛋白中的DED和蛋白酶同源区对其功能均有贡献(见图3)。
(iii)双杂交分析G1同种型的结合特异性：
G1α(CASHα)和G1β(CASHβ)相互作用性能的双杂交测试(图5)揭示了这两种变体均与MORT1/FADD和MACH(CASP8)相互作用，最有可能是通过它们共同拥有的DED区。值得注意的是，虽然通过双杂交筛选初步克隆了结合Mch4(CASP-10)的蛋白，但是在此试验中发现G1β(CASHβ)与Mch4(CASP-10)的结合弱，以及G1α(CASHα)看来只弱结合Mch4。然而应注意，克隆G1蛋白的最初双杂交筛选与测定结合特异性的本次双杂交筛选不同，因此实际上看来，G1α和G1β会象最初克隆结果所显示的那样与MACH和Mch4结合。这两种G1变体还能自身缔合并相互结合，但是不能结合RIP或TRADD(衔接蛋白，它象MORT1/FADD一样含有死亡域但是缺少DED)，它们也不与用作特异性对照的一些无关蛋白(如核纤层蛋白)结合。
为了进一步测定G1的功能，在HeLa和293-T细胞中瞬时表达其两个变体，并评价转染的蛋白对于下列信号传导的影响：p55-R(CD120a)诱导的细胞毒性信号传导，该细胞毒性由TNF或受体过度表达所引发；以及FAS-R(CD95)诱导的细胞毒性信号传导，而这种细胞毒性由FAS-R的抗体交联或嵌合受体的过度表达所引发，该嵌合受体包含p55-R(CD120a)的胞外结构域和FAS-R(CD95)的胞内结构域(见图6)。在两个细胞系中，G1β(CASHβ)的表达本身对细胞活力没有影响，但是它会强烈抑制p55-R(CD120a)和FAS-R(CD95)诱导的细胞死亡。G1α(CASHα)变体的表达对两个细胞系的影响有很大不同。在HeLa细胞中，它抑制了p55-R(CD120a)和FAS-R(CD95)的细胞毒性，这与G1β(CASHβ)相似。然而，在293-T细胞中，它却导致了显著的细胞毒性。当G1α蛋白在293-EBNA细胞中表达时发现有类似的细胞毒性(未示出)。该细胞毒性效应可被p35(一种从杆状病毒衍生的卡斯酶抑制剂)的共表达完全阻断(关于p35另见Clem等，1991；Xue和Horvitz，1995)。
为了评价G1α(CASHα)中同源的蛋白酶区对其杀细胞效应的贡献，检测此蛋白的两个突变体。这些突变体是：G1/CASHα(1-385)和G1/GASHα(1-408)，带有对应于从成熟蛋白酶的小亚基获得的蛋白酶域部分区域的C端缺失。两种突变体均没有任何细胞毒性效应。而且，象G1β(CASHβ)一样，它们可保护293细胞免受p55-R(CD 120a)和FAS-R(cd95)的死亡诱导作用(图6C和D)。
应当注意的是，上述步骤采用了下列方法和材料：
(i)G1α(CASHα)缺失突变体和p55-R/FAS-R(CD120a/CD95)嵌合体用PCR和/或常规克隆技术产生。用pcDNA3表达载体(Invitrogen)，在哺乳动物细胞中表达G1(CASH)剪接变体、FAS-R(CD95)或p55-R(CD120a)信号传导级联蛋白(均为人源)和杆状病毒p35蛋白。β-半乳糖苷酶用pCMV-β-gal载体(Promega)来表达。
(ii)使稳定表达转染的人FAS-R(CD95)(由本发明者实验室建立)的人胚肾293-T细胞、293 EBNA细胞和人宫颈癌HeLa细胞(HeLa-Fas；HtTA-1克隆)在Dulbecco改进的Eagle最小必需培养基中生长，该培养基中添加了10％胎牛血清、非必需氨基酸、100U/ml青霉素和100mg/ml链霉素。
上述发现表明G1能与p55-R和FAS-R的信号传导复合物的组分相互作用，它影响死亡诱导的方式可能不同，这取决于G1剪接变体的特性和表达该变体的细胞类型。
G1β具有抑制细胞毒性诱导作用，对HeLa细胞Gla也有此抑制作用，这显然是由该蛋白中的“死亡域”(DED)区域介导的。它可能反映了G1的DED与MACH(CASP-8)和Mch4(CASP-10)中的相应区域竞争结合MORT1/FADD。
关于CASHα引起293细胞死亡的方式，p35蛋白阻断该细胞毒性效应的能力暗示了该细胞毒性是由卡斯酶的活性介导的。然而，即使G1α表现出与卡斯酶有显著的序列同源性，但实际上它可能缺乏半胱氨酸蛋白酶活性，因为它不含几个保守的卡斯酶活性位点残基。因此，G1α可能通过激活具有卡斯酶活性的其它分子来起作用。
另一种可能性是，尽管G1α不能单独作为蛋白酶起作用，但是它仍能构成部分活性蛋白酶分子。CASP-1和CASP-3结构的晶体图学研究表明每个加工过的酶的小的和大的蛋白酶亚基从不同酶原分子获得(Walker等，1994；Wilson等，1994；Mittl等，1997；Rotonda等，1996)。由于观察到的G1α细胞毒性活性取决于对应于蛋白酶小亚基的区域的完整性(图6C)，可能G1α(CASHα)中的该区域能与某些卡斯酶的大亚基区缔合，从而导致重新构成具有酶活性的分子。然后，获得的活性异质四聚体能激活其它卡斯酶，从而引发细胞死亡。
另外，还得出的结论(结果未示出)是G1与参与IL-1介导的信号传导通路的另一蛋白(称为MYD88)至少有一些同源性。因此，G1还能参与其它细胞因子引发/介导的其它途径。
鉴于上述关于G1蛋白(它的至少两种同种型)的克隆和分离，G1有下列特征和用途：
(i)通过双杂交筛选克隆获得G1，它是结合MORT-1结合蛋白Mch4的一种分子，因此它可能参与调节Mch4和MORT-1的活性，因此，通过上述机制，G1可能参与调节FAS-R和p55-R引发的细胞行为。由于Mch4能结合MORT-1，并直接涉及细胞毒性和最终的细胞死亡，而且还能与已知抑制细胞死亡的一些Mch4同种型结合，因此结果是G1(包括其各种同种型)可直接或间接参与细胞毒性和细胞死亡，并能抑制细胞死亡。
(ii)G1含有的N端区域显然含有与MACH(见上文参考实施例1-3)和Mch4的两个MORT组件同源的两个MORT组件。因此，G1中这些MORT组件的存在似乎解释了G1能结合Mch4的原因，可能也使G1(或它的至少一些同种型)和MACH(或其一些同种型)结合以及直接结合MORT-1。因此，G1可能通过直接结合MORT-1、或结合已知与MORT-1结合的Mch4和/或MACH，来直接或间接地调节MORT-1的活性(从而调节FAS-R和p55-R的活性)。
(iii)在上述数据库和筛选中分析G1序列，结果还揭示了G1显然位于第2条人染色体上的Mch4和MACH基因座附近，这暗示了编码所有这些蛋白的基因之间的关系在染色体水平上也很密切。
(iv)至少一些G1同种型(例如图1的G1α同种型)在MORT组件区的下游具有一个表现出与MACH和Mch4的酶(即蛋白酶)活性区类似的区域，因此，G1可能是CED3/ICE蛋白酶家族的一个成员。
(v)至少一些G1同种型(例如G1α)中存在着蛋白酶样区，这表明G1或它的这些同种型可直接参与由各种刺激引起的细胞毒性和发炎，这些刺激包括TNF/NGF受体家族的受体(例如FAS-R和p55-R)以及直接或间接通过胞内蛋白酶活性引起细胞毒性和发炎而起作用的其它受体。
(vi)在由TNF/NGF受体家族的受体和具有共同胞内效应物的其它蛋白介导的导致细胞毒性、发炎和其它有关作用的胞内机制中，G1可作为其它蛋白(例如MACH和Mch4蛋白(包括它们的各种同种型))活性的增强物或强化物。G1(或至少它的一些同种型)的增强或强化效应可通过G1与这些其它蛋白(如上所述G1与Mch4结合，还可能和MACH以及MORT-1结合)结合来实现，从而增加它们和MORT-1的结合(包括MORT-1自身缔合)，或不依赖MORT-1的作用。
(vii)G1还可作为其它蛋白活性的抑制剂，其作用方式是通过G1作为其结合其它蛋白(例如Mch4，可能还有MACH和MORT-1)而形成的复合体的一部分，从而影响它们的细胞毒性直至抑制该活性。另外，以上述一些MACH同种型以及Mch4的一些同种型的类似方式，G1同种型可能也特异性地具有抑制活性。G1的这样一种同种型可能是图2所示的G1β同种型，它具有两个MORT组件，但是没有与其它已知蛋白酶类似的明显的蛋白酶样区。
在全部描述了本发明后，本领域技术人员应当理解，在不脱离本发明的思路和范围下，无需过多的实验就可在等同的参数、浓度和条件的广泛范围内进行同样的工作。
尽管本发明已经联系其具体实例作了描述，但是应当知道它还能作进一步的改进。本申请应当覆盖：大致上根据本发明原理、本文公开的内容、利用本发明所属领域已知或常规技术以及如下文所附权利要求范围内提出的必要特征所作的任何变化、用途或改进。
本文中引用的所有文献，包括期刊杂志或摘要、出版的或对应的美国或外国专利申请、授权的美国或外国专利、或任何其它文献，包括引用文献中列举的所有数据、图表和文本，均全部纳入本文作参考。另外，本文引用的文献中所引用的文献的全部内容也全部纳入本文作参考。
参考已知的步骤、常规的步骤、已知的方法或常规方法并不以任何方式表示承认本发明的各个方面、描述或实例已在相关技术领域予以公开、指导或提示。
前述具体实例的描述将完全揭示本发明的总特征，在不脱离本发明的总思路下，其它人可运用本领域技术人员所知的知识(包括本文引用的内容和参考文献)无需过多实验就很容易对这些具体的实例作变化和/或改进用于各种用途。因此，基于本文的理论和指导，这些变化和改进均应在本文所公开的实例的等价意义和范围内。应当理解，本文的措词或术语均只是为了便于描述，而非限制性，因此本说明书的措词或术语可由本领域技术人员根据本文的理论和指导结合本领域普通技术人员的知识来作解释。
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Claims (14)

1.一种分子，它包含DNA序列，该DNA序列编码能与MORT-1和/或MACH结合的多肽，该多肽具有以下物质的氨基酸序列：具有图1B或图2所示氨基酸序列的G1蛋白同种型。
2.根据权利要求1所述的分子，其中编码G1蛋白同种型的DNA序列是图1A所示的DNA序列。
3.根据权利要求1所述的分子，其中编码G1蛋白同种型的DNA序列是图2所示的DNA序列。
4.一种载体，它包含权利要求1所述的分子。
5.根据权利要求4所述的载体，它能在真核宿主细胞中表达。
6.根据权利要求4所述的载体，它能在原核宿主细胞中表达。
7.一种转化的宿主细胞，它含有权利要求4所述的载体。
8.一种产生多肽的方法，该多肽能与MORT-1和/或MACH结合，该方法包括：
使权利要求7所述的转化的宿主细胞在适合表达产物表达的条件下生长；
对所述表达产物按需进行翻译后修饰，以获得所述多肽；和
分离所述多肽。
9.一种能与MORT-1和/或MACH结合的多肽，该多肽具有以下物质的氨基酸序列：具有图1B或图2所示氨基酸序列的G1蛋白同种型。
10.一种调节FAS-R配体或TNF对细胞的效应的药物组合物，它包含权利要求9所述的多肽作为活性组分。
11.一种体外调节细胞死亡或发炎过程的方法，该方法包括：通过将权利要求9所述的多肽以胞内导入的形式导入所述细胞来处理所述细胞。
12.一种体外调节FAS-R配体或TNF对携带FAS-R或p55-R的细胞的效应的方法，该方法包括用权利要求9所述的能与MORT-1和MACH结合蛋白结合的多肽处理所述细胞，其中所述细胞的所述处理包括：将所述多肽以适合胞内导入的形式导入所述细胞内。
13.权利要求9所述的多肽在制备用于调节细胞死亡或发炎过程的药物中的用途。
14.权利要求9所述的多肽在制备用于调节FAS-R配体或TNF对携带FAS-R或p55-R的细胞的效应的药物中的用途。
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