CN1155402C

CN1155402C - 一种抑制信号－传导蛋白和glgf(pdz/d hr)区域之间相互作用的化合物及其应用

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Publication number: CN1155402C
Application number: CNB971977690A
Authority: CN
Inventors: ��-��ˡ��Ჩ��; 塔卡－阿克·萨托; -; 朱恩·柳-萨瓦
Original assignee: Columbia University in the City of New York
Current assignee: Columbia University in the City of New York
Priority date: 1996-07-22
Filing date: 1997-07-18
Publication date: 2004-06-30
Anticipated expiration: 2017-07-18
Also published as: US20020058607A1; JP2001505540A; AU735287B2; CN1230120A; AU735287C; KR20000029469A; WO1998005347A1; EP0935467A1; EP0935467A4; US6911526B2; CA2260742A1; KR100565819B1; AU4042497A

Abstract

本发明提供了一种组合物，它能够抑制信号传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合。本发明也提供了一种鉴定一种能够抑制信号传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合的化合物。本发明也提供了一种抑制癌细胞增殖的方法。本发明也提供了用一种化合物以可有效使细胞凋亡的量治疗癌症的方法。本发明也提供了一种抑制病毒感染的细胞繁殖的方法。本发明还提供了一种用一种化合物以可有效使细胞凋亡的量治疗病毒感染患者的方法。本发明也提供了药物组合物。

Description

一种抑制信号-传导蛋白和GLGF(PDZ/DHR) 区域之间相互作用的化合物及其应用

本发明是得到美国政府的支持，由美国卫生与人类事业局的国立卫生研究所(NIH)提供资助。基金号为：R01GM55147-01。因此，美国政府在此发明中拥有特定权利。

背景

在本申请全文中，各种出版物引证了其作者和年代，其全部引文是按字母顺序列于本申请专利说明书的结尾，紧靠在所列的序列和权利要求之前。这些文献的全部内容引入本申请，以便于更全面地叙述在本文所述的发明完成时普通技术人员已知的现有技术。

Fas(AP0-1/CD95)和它的配体被认为是凋亡(apoptosis)中重要的信号中介体(Itoh，et al.1991)，Fas(Apo-1/CD95)的结构组织形式提示它是肿瘤坏死因子受体超家族中的一个成员，该超家族还包括p75神经生长因子受体(NGFR)(Johnson，et al.1986)，T-细胞-活性标记CD27(Camerini，et al..1991)，何杰金-淋巴瘤-相关抗原CD30(Smith，et al.1993)，人类B细胞抗原CD40(Stamenkovic，etal..1989)，T细胞抗原OX40(Mallett，et al.1990).Fas以及它的配体的遗传突变均与小鼠的淋巴组织增殖失调和自身免疫失调有关(Watanabe-Fukunaga，et al.1992；Takahashi，et al.1994)。而且，当T-细胞感染人类免疫缺陷病毒(HIV)时，Fas表达水平改变被认为是诱导凋亡(Westendorp，et al.1995)。用酵母双杂交和生化方法已鉴定出几种Fas-相互作用的信号传导分子，如Fas-结合的磷酸酶-1(FAP-1)(图1)(Sato，et al.1995)，FADD/MORT1/CAP-1/CAP-2(Chinnaiyan，et al.1995；Boldin，etal.1995；Kischkel，et al.1995)和RIP(Stanger，et al.1995)。除了FAP-1以外，所有分子都与Fas功能性细胞死亡区域有关，当细胞转染了这些蛋白质时，还与FADD/MORT1或RIP过量表达诱导凋亡有关。相反，FAP-1是唯一的与Fas的负调控区(C-端15氨基酸)有关(Ito，et al.1993)，并且抑制Fas-诱导的凋亡的蛋白质。

FAP-1(PTPN13)有几种替换的剪接形式与PTP-BAS/hPTP1E/PTPL1一致(Maekawa，et al.1994；Banville，et al.1994；Saras，etal.1994)。并含有一个膜结合区，它与在细胞骨架相关蛋白，ezrin(Gould et al.1989)，radixin(Funayama et al.1991)，moesin(Lankes，et al.1991)，II型神经纤维瘤基因产物(NFII)(Rouleau，et al.1993)，和4.1蛋白(Conboy，et al.1991)，以及在PTP酶PTPH1(Yang，et al.1991)，PTP-MEG(Gu，et al.1991)，和PTPD1(Vogel，et al.1993)中发现的相似。FAP-1包括了令人感兴趣6个GLGF(PDZ/DHR)重复，被认为在蛋白区域中介导分子内和分子间的相互作用。FAP-1的第三个GLGF重复首先被确认为与Fas受体的C-端具有特异的相互作用区域(Sato，et al.1995).提示了GLGF区在将这些蛋白定位于亚膜细胞骨架和/或调节生化活性上起着重要作用。GLGF重复最初是在鸟苷酸激酶和大鼠的后突触密度蛋白中(PSD-95)(Cho，et al.1992)发现的，与果蝇肿瘤抑制蛋白，Letha1-(1)-disc-large-1〔dlg-1〕同源，(Woods，et al.1991；Kitamura，etal.1994)。这些重复可以介导同源和异源二聚化，此二聚化能强烈地影响PTP酶的活性、影响与Fas结合、和/或FAP-1同其他信号传导蛋白的相互作用。最近，报道了这些蛋白的不同PDZ区域与离子通道和其他蛋白C-端的相互作用(图1)(表1)(Kornau，et al.1995；Kim，etal.1995：Matsumine，et al.1996)。

表1.与PDZ区域相互作用的蛋白

蛋白 C-端序列相关蛋白参考文献

Fas(APO-1/CD95) SLV FAP-1 2

NMDA受体 SDV PSD95 3

NR2亚单位

Shaker-型K+通道 TDV PSD95&DLG 4

APC TEV DLG 5

发明概述

本发明提供了一个肽化合物，它能够抑制一种信号-传导蛋白和一种含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)(SEQ ID NO：1号)氨基酸序列的胞浆蛋白间特异结合。而且，该胞浆蛋白可认包括(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列(SEQ ID NO：2号)，其中，“X”代表任何一种从一组包含20种天然存在的氨基酸中选择出来的氨基酸，“n”代表大于等于2小于等于4。在一个优选实施方案，该氨基酸序列是SLGI(SEQ ID NO：3号)。此外，本发明提供了该信号-传导蛋白的羧基端含有(S/T)-X-(V/I/L)(SEQ ID NO：4号)氨基酸序列的一种肽化合物，其中，每个“-”代表一个肽键，每个括号包含了可相互替换的氨基酸，括号内每个斜线分开的氨基酸是可以相互替换的，“X”代表任何一种从一组包含20种天然存在的氨基酸中选择出来的氨基酸。

本发明也提供一种鉴定化合物的方法，该化合物能够抑制信号-传导蛋白和含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列的胞浆蛋白间的特异结合。此外，本发明提供了一个鉴定化合物的方法，该化合物能够抑制羧基端含有(S/T)-X-(V/L/I)氨基酸序列的信号-传导蛋白和胞浆蛋白间的特异结合。

本发明也提供了一个抑制癌细胞增殖的方法，特别是，所述癌细胞来自包括：结肠、肝脏、乳腺、卵巢、睾丸、肺、胃、脾、肾、前列腺、子宫、皮肤、头部、胸腺和颈部的器官，或这些细胞来自T-细胞或B-细胞。

本发明提供了一种对患者以可有效使所述细胞发生凋亡的量的组合物治疗癌症的方法，特别是，癌细胞来源于以下器官，包括：胸腺、结肠、肝脏、乳腺、卵巢、睾丸、肺、胃、脾、肾、前列腺、子宫、皮肤、头部、和颈部，或来自T-细胞或B-细胞。

本发明提供了一种抑制病毒感染细胞增殖的方法，特别是，病毒性感染的细胞是被B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、人类T-细胞亲淋巴性病毒、I型或HIV感染的。

本发明也提供一种药用性组合物，该组合物包含能抑制信号-传导蛋白和胞浆蛋白间的特异结合的肽化合物。

本发明也提供一种药用性组合物，包含被鉴定为能抑制信号-传导蛋白和胞浆蛋白间的特异结合的肽化合物。

附图简要说明

图1.Fas-结合的磷酸蛋白酶-1的图，表明有6个GLGF(PDZ/DHR)区重复；与其他蛋白和含有GLGF(PDZ/DHR)重复的蛋白的膜结合位点进行相似性比较。

图2A，2B，2C和2D。Fas C端与FAP-1结合所需的最小区域图谱。右侧的数字代表每个单独的克隆(图2C和2D)。

2A用酵母双杂交系统筛选随机肽基因文库的策略。

2B人类(SEQ ID NO：5号)，大鼠(SEQ ID NO：6号)，和小鼠(SEQ ID NO：7号)Fas C端15个氨基酸的排列。

2C筛选半随机肽基因文库的结果。顶上一排表示人类和大鼠固定同源的氨基酸。破折号线表示未改变的氨基酸。

2D筛选随机肽文库的结果(分别为：

SEQ ID NO：8号， SEQ ID NO：9号， SEQ ID NO：10号，

SEQ ID NO：11号， SEQ ID NO：12号， SEQ ID NO：13号，

SEQ ID NO：14号， SEQ ID NO：15号， SEQ ID NO：16号，

SEQ ID NO：17号，)

3A，3B和3C.Fas/FAP-1体外结合的抑制试验

3A使用Fas C端15个氨基酸对Fas/FAP-1结合的抑制试验。GST-Fas融合蛋白(191-355)用于体外结合试验(1，3-10泳道)。GST-Fas融合蛋白(191-320)(2泳道)和1mM人类PAMP(肾上腺髓质素原的N-端20个氨基酸，分子量2460.9)(3泳道)作为阴性对照。加入的C-端15个氨基酸浓度是1μM(4泳道)，3μM(5泳道)，10μM(6泳道)，30μM(7泳道)，100μM(8泳道)，300μM(9泳道)，1000μM(10泳道)。

3B使用相应于Fas的C-末端15个氨基酸的肽进行的Fas/FAP-1结合抑制试验。在这个抑制试验中所有的合成肽都被乙酰化(分别为，SEQ ID NO：4号，SEQ ID NO：18号，SEQ ID NO：19号，SEQ ID NO：20号，SEQ ID NO：21号，SEQ ID NO：22号，SEQ ID NO：23号)。

3C将三肽中的一种替换后，对Fas/FAP-1结合的抑制效应。

图4A，4B，4C和4D。

4A在酵母中，Fas C-端3个氨基酸与FAP-1的相互作用。

4B在体外，Fas C-端3个氨基酸与FAP-1的相互作用。

4C天然的Fas和GST-FAP-1的免疫沉淀反应。

4DFas/FAP-1与Ac-SLV或Ac-SLY结合的抑制作用。

图5A，5B，5C，5D，5E和5F。通过微注射将Ac-SLV导入DLD-1细胞系中。三角形表示是可被微注射Ac-SLV的细胞系并表现出可以鉴定的染色质凝集。另一方面，当微注射Ac-SLY后，这个视野内仅有一个细胞出现凋亡。

5A相差显微镜显示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLY的细胞的范例。

5B相差显微镜显示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLV的细胞的范例。

5CFITC染色显示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLY的细胞的范例。

5DFITC染色显示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLV的细胞的范例。

5EHoechst 33342 DNA荧光染色显示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLv的细胞的范例。

5FHoechst 33342 DNA荧光染色显示在500ng/ml CH11存在下微注射Ac-SLY的细胞的范例。

图6在微注射DLD-1的细胞中，细胞凋亡的定量测定。

图7A，7B，7C，7D，7E，7F，7G，和7H。

7A人类神经生长因子受体的氨基酸序列(序列I，D，24号)。

7B人类CD4受体的氨基酸序列(序列I，D，25号)。

7CFas-结合的磷酸蛋白酶-1和神经生长因子受体C-端(NGFR)(p75)的相互作用。

7D人类结肠直肠突变癌蛋白的氨基酸序列(SEQ ID NO：26号)。

7Eα型蛋白激酶C的氨基酸序列。

7F5-羟色胺2A受体的氨基酸序列(SEQ ID NO：27号)。

7G5-羟色胺2B受体的氨基酸序列(SEQ ID NO：28号)。

7H腺上皮结肠息肉瘤蛋白的氨基酸序列(I.D.29号)。

图8p75 NGFR(低-亲和性神经生长因子受体)的结构特征。

图9Fas C-末端和p75 NGFR的比较。

图10³⁵S-标记的FAP-1与各种以GST融合蛋白形式表达的受体在体外的相互作用。该GST融合蛋白是固定在谷胱苷肽-琼脂糖凝胶珠上，与体外转录的，³⁵S-标记的FAP-1蛋白一起孵育。洗过珠以后，通过SDS-PAGE和放射自显影分析保留的FAP-1蛋白。

图11A和11B。³⁵S-标记的FAP-1与GST-p75缺失突变在体外的相互作用。

11A表明含有p75和p75缺失突变的胞浆区的GST融合蛋白图解。右侧所描绘的是FAP-1与具有各种p75缺失突变的GST融合蛋白的结合，根据(11B)的数据。

11B体外转录的³⁵S-标记FAP-1蛋白与固定在谷胱苷肽-琼脂糖凝胶珠上的各种GST融合蛋白的相互作用。洗过珠以后，用SDS-PAGE和放射自显影方法分析保留FAP-1蛋白。

图12p75 NGFR的LexA-C-端胞浆区和VP16-FAP-1之间的结合。酵母株是通过转化构建的，并检测克隆的生长。

+/-表示在His^-板上克隆生长的情况

发明的详细说明

在本发明中，所用的氨基酸残基缩写如下：A，Ala；C，Cys；D，Asp；E，Glu；F，Phe；G，Gly；H，His；I，Ile；K，Lys；L，Leu；M，Met；N，Asn；P，Pro；Q，Gln；R，Arg；S，Ser；T，Thr；V，Val；W，Trp；和Y，Tyr。

为了便于了解以下的实验材料，常规的方法和/或专业术语，请参阅Sambrook，et al.1989。

本发明提供了一种肽化合物，它能够抑制一种信号-传导蛋白和含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列的胞浆蛋白间的特异结合，其中，每个″-″代表一个肽键，每个括号内包括可相互替换的氨基酸，括号内每个斜线分开的氨基酸是可以替换的。此外，该胞浆蛋白可以含(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列，其中，″X″代表任何一种氨基酸，该氨基酸是从一组包含20种天然存在的氨基酸中选择出来的，″n″代表大于等于2小于等于4。特别是，在一优选实施方案中，该胞浆蛋白含SLGI的氨基酸序列。

(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列在现有技术中也被称作“GLGF(PDZ/DHR)氨基酸区域”。如本申请中所用的“GLGF(PDZ/DHR)氨基酸区域”意思是指(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列。

在一优选实施方案中，该信号-传导蛋白在羧基端有(S/T)-X-(V/I/L)氨基酸序列，其中，每个″-″代表一个肽键，每个括号内包括可相互替换的氨基酸，括号里的每一个斜线分开的氨基酸是可以相互替换的。其中，″X″代表任何一种氨基酸，该氨基酸是从一组包含20种天然存在的氨基酸中选择出来的。

本发明的组合物可以是，不仅限于，抗体，无机化合物，有机化合物，肽，模拟肽化合物，多肽或蛋白，共有一些或全部特性的片段或衍生物，如，融合蛋白。该组合物可以是天然存在的并通过纯化得到，或非天然存在通过合成得到的。

特别是，该肽化合物可以是含有(S/T)-X-(V/I/L)-COOH序列的肽，其中，每个″-″代表一个肽键，每个括号内包括可相互替换的氨基酸，括号里的每一个斜线分开的氨基酸是可以替换的。″X″代表任何一种氨基酸，该氨基酸是从一组包含20种天然存在的氨基酸中选择出来的。在一优选实施方案中，该肽包括下列序列之一：DSENSNFRNEIQSLV，RNEIQSLV，NEIQSLV，EIQSLV，IQSLV，QSLV，SLV，IPPDSEDGNEEQSLV，DSEMYNFRSQLASVV，IDLASEFLFLSNSFL，PPTCSQANSGRISTL，SDSNMNMNELSEV，QNFRTYIVSFV，RETIESTV，RGFISSLV，TIQSVI，ESLV。更优选的实施方案是一种有机化合物，它含有Ac-SLV-COOH序列，其中，Ac代表一个乙酰基，每个“-″代表一个肽键。

下文中提供了本发明的一个例子。乙酰化肽可以在改进的ChemTechACT357仪器上，按以前发表的程序以类推的方法自动合成。每个循环用Wang树脂，所有的氨基酸用N^α-Fmoc保护，然后是20％六氢吡啶/DMF，偶联是用DIC/HOBt，随后用HBTU/DIEA完成。最后的氨基酸偶联上后，在树脂上延伸的肽用Ac₂O/DMF乙酰化。用HPLC纯化乙酰化的肽，通过FAB-MS和¹H-NMR鉴定其特征。

而且，本领域普通技术人员通晓上述与非-乙酰基，例如，氨基，偶联的合成肽的构建方法。

本发明也提供了一种肽化合物，它能抑制羧基端带有(S/T)-X-(V/I/L)氨基酸序列的信号-传导蛋白和一种胞浆蛋白间特异结合，其中，每个″-″代表一个肽键，每个括号内包括可相互替换的氨基酸，括号内的每个斜线将可相互替代的氨基酸分开，″X″代表任何一种氨基酸，该氨基酸是从一组包含20种天然存在的氨基酸中选择出来的。

本发明的组合物包括抗体，无机化合物，有机化合物，肽，模拟肽化合物，多肽或蛋白，共有一些或全部特性的片段或衍生物，例如，融合蛋白。

本发明也提供一种鉴定一种化合物的方法，该化合物能抑制一种信号-传导蛋白和含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列的胞浆蛋白间的特异结合，其中，每个″-″代表一个肽键，每个括号内包括可相互替换的氨基酸，括号里的每个斜线分开的氨基酸是可以替换的。该方法包括：(a)在允许一种已知的化合物，该化合物曾经显示能替换结合了胞浆蛋白的信号-传导蛋白，和被结合胞浆蛋白形成复合物的条件下，将已结合了信号-传导蛋白的胞浆蛋白与各种化合物接触；和(b)检测步骤(a)中被替换的信号-传导蛋白或形成的复合物，其中，替换作用表示这种化合物能抑制信号-传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合。

抑制信号-传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合可以影响报告基因的转录活性。

此外，在步骤(b)中，通过比较在步骤(a)中连接化合物前后报告基因的转录活性来鉴定替换的胞浆蛋白或复合物。这种活性的改变表明信号-传导蛋白和胞浆蛋白间特异结合受抑制以及信号-传导蛋白被替换。

正如本文中所用的“报告基因的转录活性”表示当信号-传导蛋白和胞浆蛋白结合时，报告基因的表达可在观察到的水平上改变。人们也可以通过检测基于信号-传导蛋白和胞浆蛋白之间结合的其他生物功能来鉴定这种化合物。报告基因的例子很多而且技术上是众所周知，包括但不仅限于，组氨酸抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，β-半乳糖苷酶基因。

另外，胞浆蛋白是可以结合在固相支持物上。这种化合物也可以结合在固相支持物上并包括一种抗体，一种无机化合物，一种有机化合物，一种肽，一种模拟肽化合物，一种多肽或蛋白。

下面提供一个方法的例子。人们可以用直接鉴定的方法去确认一种化合物，该化合物能抑制信号-传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合，如该胞浆蛋白与结合了一种可检测标记的化合物之间的免疫-沉淀。此外，可以使用非直接检测方法，该方法检测基因表达水平的提高或减少。正如下面所讨论的，人们能构建融合到LexA DNA结合区的合成肽。这些构建物被转化到L40-细胞株的带有报告基因的适当细胞系中。然后可以通过检测报告基因的表达水平检测抑制是否发生。为了检测报告基因的表达水平，技术上熟练的人能应用各种熟知的方法，例如，用酵母、哺乳类或其他细胞中的双杂交系统。

另外，步骤(a)中的接触可以在体外、体内，具体地说是在适当的细胞中，如，酵母细胞或哺乳动物细胞中进行。哺乳动物细胞包括，不仅限于，小鼠成纤维细胞NIH3T3，CHO细胞，HeLa细胞，Ltk^-细胞，Cos细胞等。

其他合适的细胞包括，但不仅限于，原核或真核细胞，如，细菌细胞(包括革兰氏阳性细胞)，真菌细胞，昆虫细胞，或其他动物细胞。

此外，信号-传导蛋白可以是一个细胞表面受体，信号传导蛋白，或肿瘤抑制蛋白。特别是，该细胞表面蛋白是Fas受体，可以在下列细胞中表达，该细胞来源于下列器官，但不仅限于，胸腺，肝脏，肾脏，结肠，卵巢，乳腺，睾丸，脾，肺，胃，前列腺，子宫，皮肤，头部和颈部，或在包含T-细胞和B-细胞的细胞中表达。在一优选实施方案中，T-细胞是Jurkat T-细胞。

另外，细胞表面受体可以是CD4受体，p75受体，5-羟色胺2A受体，或5-羟色胺2B受体。

此外，该信号传导蛋白可以是α-型蛋白激酶C。

另外，肿瘤抑制蛋白可以是腺上皮结肠息肉瘤抑制蛋白或结肠直肠突变癌蛋白。

此外，该胞浆蛋白包含SLGI氨基酸序列，特别是，Fas-结合的磷酸酶-1。

本发明也提供一种鉴定一种化合物的方法，该化合物能抑制羧基端带有(S/T)-X-(V/I/L)氨基酸序列的信号-传导蛋白和一种胞浆蛋白之间的特异结合，其中，每个″-″代表一个肽键，每个括号内包括可相互替换的氨基酸，括号里的每个斜线分开的氨基酸是可以替换的。″X″代表任何一种氨基酸，该氨基酸是从一组包含20种天然存在的氨基酸中选出来的。该方法包括(a)在允许一种已知的化合物，该化合物曾经显示能替换结合了信号-传导蛋白的胞浆蛋白和被结合的信号-传导蛋白形成复合物的条件下，将已结合了胞浆蛋白的信号-传导蛋白与各种化合物接触；和(b)鉴定步骤(a)中被替换的胞浆蛋白或形成的复合物。其中，替换表示这种化合物能抑制信号-传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合。

抑制信号-传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合可以影响报告基因的转录活性。此外，在步骤(b)中，通过比较在步骤(a)中接触化合物前后报告基因的转录活性来鉴定被替换的信号-传导蛋白或复合物，其中，活性的改变表明信号-传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合受抑制和胞浆蛋白被替换。

另外，在步骤(b)中，通过比较在步骤(a)中接触化合物前后报告基因的转录活性来鉴定被替换的胞浆蛋白或复合物，其中，活性的改变表示信号-传导蛋白和胞浆蛋白间特异结合受到抑制和信号-传导蛋白被替换。

正如本文中所用的“报告基因的转录活性”表示当信号-传导蛋白和胞浆蛋白结合时，报告基因的表达可在观察到的水平上改变。人们也可以通过检测基于信号-传导蛋白和胞浆蛋白的结合的其他生物功能来鉴定这种化合物。报告基因的例子很多而且技术上是众所周知，包括，但不仅限于，组氨酸抗性基因，氨苄青霉素抗性基因，β-半乳糖苷酶基因。

另外，胞浆蛋白是可以结合在固相支持物上，或这种化合物也可以结合在固相支持物上，包括一种抗体，一种无机化合物，一种有机化合物，一种肽，一种模拟肽化合物，一种多肽或蛋白。

下面提供一个方法的例子。人们可以用直接鉴定的方法去确认一种化合物，该化合物能抑制信号-传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合，如该胞浆蛋白和结合了一种可检测标记的该化合物的免疫-沉淀反应。此外，人们也可用非直接鉴定方法，该方法检测基因表达水平的增加或减少。正如下面所讨论的，人们能构建融合到LexA DNA结合区的合成肽。这些构建物被转化到L40-株的带有报告基因的适当细胞系。然后，人们通过检测报告基因的表达水平来鉴定是否发生抑制。在本技术中应用各种不同众所周知的方法，例如，用酵母双杂交系统检测报告基因的表达水平。

另外，步骤(a)中的接触可以在体外或体内进行，具体地说是在酵母细胞或哺乳动物细胞中进行。哺乳动物细胞包括，不仅限于，小鼠成纤维细胞NIH3T3，CHO细胞，HeLa细胞，Ltk^-细胞，Cos细胞等。

此外，信号传导蛋白可以是α-型蛋白激酶C。

此外胞浆蛋白包含SLGI氨基酸序列，特别是，Fas-结合的磷酸酶-1。

本发明也提供一种这些细胞的抑制癌细胞增殖的方法，特别是所述癌细胞来源于，但不限于，胸腺，肝脏，肾脏，结肠，卵巢，乳腺，睾丸，脾脏，胃，前列腺，子宫，皮肤，头部和颈部，或这种癌细胞来源于包含T-细胞和B-细胞的细胞。

本发明提供一种包含用上述方法鉴定的化合物的抑制癌细胞增殖的方法，其中，癌细胞来源于以下器官，但不仅限于此，胸腺，肝脏，肾脏，结肠，卵巢，乳腺，睾丸，脾脏，胃，前列腺，子宫，皮肤，头部和颈部，或癌细胞来源于包含T-细胞和B-细胞的细胞。

本发明也提供一种治疗癌症的方法，包括向患者的癌细胞中导入以上描述的，能有效引起细胞凋亡的组合物。其中，癌细胞来源于下列器官，但不仅限于此，胸腺，肝脏，肾脏，结肠，卵巢，乳腺，睾丸，脾脏，胃，前列腺，子宫，皮肤，头部和颈部，或癌细胞来源于包含T-细胞和B-细胞的细胞。

在本文中所用的，“凋亡”为细胞程序死亡。细胞程序死亡的机制和效应不同于细胞溶解。凋亡的一些可观察的效应是：DNA片段化和分解成称之谓凋亡小体的小的膜结合片段。

鉴定组合物是否能有效地诱导细胞凋亡的方法在技术上是众所周知的。一种方法是用相差或荧光显微镜判断染色质形态学变化。

本发明也提供一种抑制病毒感染细胞增殖的方法，包含上面描述的组合物或上述方法鉴定出的化合物，其中，所述病毒感染的细胞包括B型肝炎病毒，EB病毒，流感病毒，乳头瘤病毒，腺病毒，人类T-细胞亲淋巴性病毒，1型或HIV感染的细胞。

本发明也提供了一种治疗病毒-感染患者的方法。包含向患者被病毒感染的细胞中导入以上描述的，能有效诱导细胞凋亡的组合物或以上描述的权利要求27中的方法鉴定的化合物。其中，病毒感染细胞包含B型肝炎病毒，EB病毒，流感病毒，乳头瘤病毒，腺病毒，人类T-细胞亲淋巴性病毒，1型或HIV感染的细胞。

鉴定组合物是否有效抑制细胞凋亡的方法在技术上是众所周知的。一个方法是用相差或荧光显微镜来判断染色质的形态学的变化。

本发明提供了一种药物性组合物，包含有效剂量和在一个合适药物性载体的上述的组合物。

本发明也提供一种药物性组合物，包含有效剂量的上述方法鉴定出的化合物和一种药学可接受的载体。

本发明进一步提供一种肽化合物，它能特异结合羧基端含有(S/T)-X-(V/L/I)氨基酸序列的信号-传导蛋白，其中，每个″-″代表一个肽键，每一个括号内包括了可以相互替换的氨基酸，括号里的每一个斜线分开的氨基酸是可以替换的，″X″代表任何一种氨基酸，该氨基酸是从一组包含20种天然存在的氨基酸中选择出来的。这种肽化合物可以包括(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列，其中，每个″-″代表一个肽键，每个括号内包括可相互替换的氨基酸，括号里的每一个斜线分开的氨基酸是可以替换的。在一优选实施方案中，该肽化合物包括(K/R/Q)-Xn-(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列。其中，″X″代表任何一种氨基酸，该氨基酸是从一组包含20种天然存在的氨基酸中选择出来的。“n”代表大于等于2小于等于4。在另一优选实施方案中，该组合物包括SLGI氨基酸序列。

本发明进一步提供了一种鉴定化合物的方法，该化合物能结合羧基端含(S/T)-X-(V/L/I)氨基酸序列的信号-传导蛋白，其中，每个″-″代表一个肽键，每个括号内包括可相互替换的氨基酸，括号里的每一个斜线分开的氨基酸是可以替换的，″X″代表任何一种氨基酸，该氨基酸是从一组包含20种天然存在的氨基酸中选择出来的。该方法包含(a)，在允许与一种已知的化合物，该化合物曾显示能结合信号-传导蛋白并形成一个复合物，结合的条件下，将信号-传导蛋白与多种化合物接触；和(b)，检测步骤(a)中形成的复合物，以鉴别能与该信号-传导蛋白结合的化合物。特别是，被鉴定的化合物包括(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列。在又一优选实施方案中，被鉴定的化合物包括SLGI氨基酸序列。

此外，以上描述的方法中，该信号-传导蛋白可以结合在一个固相支持物上。该化合物也可以结合在一个固相支持物上，包含抗体，无机化合物，有机化合物，肽，模拟肽化合物，多肽或蛋白。

另外，该信号-传导蛋白可以是一个细胞-表面受体或信号传导体。特别是，该信号-传导蛋白可能是Fas受体，CD4受体，p75受体，5-羟色胺2A受体，5-羟色胺2B受体，或α-型蛋白激酶-C。

本发明也提供了一种恢复细胞中凋亡的负调节的方法，包含以上描述的组合物或被以上方法鉴定的化合物。

在本文中，“恢复凋亡的负调节”是指使细胞能够阻止细胞程序死亡的进行。

例如，具有功能性Fas受体和Fas-结合的磷酸酶-1的细胞由于通过磷酸酶引起Fas的负调节，而不能进入程序细胞死亡或凋亡。然而，如果Fas-结合的磷酸酶1不能结合到Fas受体的羧基端((S/T)-X-(V/L/I)区)，也就是，在(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列中，至少一个发生突变或缺失，细胞进入凋亡。通过导入能结合Fas受体的羧基端的化合物，人们能模拟一个功能性磷酸酶的效应，这样就恢复了凋亡的负调节。

本发明提供了一种预防细胞凋亡的方法，包含上述描述的组合物或被以上描述方法鉴定的化合物。

本发明提供了一种控制由相关细胞凋亡引起的疾病，包含以上所描述的组合物或由以上描述的方法鉴定的化合物。

本发明在以下的具体实验部分中有详细说明。这些是为了有助于了解本发明，但并不意味着，也不应当被解释为，限制本发明的权利要求。

第一部分实验

实验的详细操作

材料和方法

1.筛选半随机和随机肽基因文库

为了在限制性的DNA序列中产生许多突变，根据文献(Hill等，1987)所叙述的程序，用简并寡核苷酸引起突变的PCR方法，基于人与大鼠之间的同源性，设计两种回文序列，用于构建半随机的基因文库。所用的两个引物是

5’-CGGAATTCNNNNNNNNNAACAGCNNNNNNNNNAATGAANNNCAAAGTCTGNNNTGAGGATCCTCA-3’(Seq.I.D.No.：30)和

5’-CGGAATTCGACTCAGAANNNNNNAACTTCAGANNNNNNATCNNNNNNNNNGTCTGAGGATCCTCA-3’(Seq.I.D.：31)

简述如下，经过HPLC纯化的这两种引物(每种200pmol)在70℃退火，5分钟，于23℃冷却60分钟，然后在Klenow DNA聚合酶作用下(5u)，于23℃，60分钟，.用4种核苷酸混合物补平，(每种核苷酸最终浓度为1mM)。加入1μl 0.5M EDTA终止反应。乙醇沉淀来纯化DNA.将得到的双链DNA用EcoRI和BamHI酶切。然后在非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳中进一步纯化然后将双链寡核苷酸与pBTM116质粒在EcoRI-BamHI位点进行连接。将连接混合物电转移到E.Coli XL1-Blue MRF’(Stratagene)菌中以构建质粒基因文库。按以前报道的方法进行大批量转化。质粒基因文库转化到L40细胞中(MATa，trp1，1eu2，his3，ade2，LYS2；(1eAop)⁴-HIS3，URA3：：(LexAop)⁸-LacZ)。该细胞株携带有含有FAP-1 cDNA的PVP16-31质粒(Sato等，1995).将在组氨酸-缺陷的培养基中(His⁺)形成的克隆转移到含有40μg/ml x-gal的平板上，以测定在平板滤膜实验所产生的兰色反应产物(β-gal⁺)。对所筛选的His⁺和β-gal⁺克隆进行检测以用于进一步分析。有回文结构的寡核苷酸5’-CGGAATTC-(NNH)_4-15-TGAGGATCCTCA-3’(seq.I.D.No：32)用于构建随机的肽基因文库。

2.肽的合成

肽的合成是在新型Chemtech ACT357自动合成仪按照以前发表的类似的操作程序自动合成(Schnorrenberg和Gerhardt，1989)。每次循环用Wang树脂(用量为0.2-0.3mmole)，所有氨基酸用N^α-Fmoc进行保护。再用20％六氢吡啶/DMF处理去除保护，用DIC/HOBt然后用HBTU/DIEA进行偶联。当最后一个氨基酸被偶联上之后，用Ac₂O/DMF对树脂上延长的肽进行乙酰化。最后用TFA处理共同去除所有的保护基团将该肽从树脂上分离下来。乙酰化的肽经过HPLC纯化后，通过FAB-MS和¹H-NMR鉴定其特征。

3.利用Fas C端15个氨基酸对Fas/FAP-1结合进行抑制作用的检测

亚克隆到Bluescript pSK-II载体上的HFAP-10 cDNA的体外翻译是利用体外转录/翻译系统(Promega TNT lysate)和T7RNA聚合酶在³⁵S-L-甲硫氨酸存在下，从内部的甲硫氨酸密码子开始翻译，得到的³⁵S-标记蛋白与GST-Fas融合蛋白于4℃共同孵育16小时，该GST-Fas融合蛋白在含150mM NaCl，50mM Tris(pH 8.0)，5mM DTT，2mM EDTA，0.1％NP-40，1mM PMSF，50μg/ml亮抑素，1mM联苯胺和7μg/ml抑肽素的缓冲液中，固定在GST-Sepharose 4B亲和层析珠上(Pharmacia)，用同样的缓冲液彻底洗4次，通过离心回收带有谷胱甘肽-Sepharose珠的结合蛋白，在煮沸的Laemmili缓冲液中洗脱下来，然后通过SDS-PAGE和荧光学的方法进行分析。

4.Fas末端15个氨基酸的抑制作用的检测和利用各种三肽对Fas/FAP-1结合的抑制影响

体外翻译的[³⁵S]HFAP-1经过NAP-5柱的纯化后(pharmacia)，与3μM的GST-融合蛋白在4℃孵育16小时，用结合缓冲液洗4次，在b计数器测定参入的放射性活性。结合抑制的百分率按下式计算：抑制百分数％＝[使用GST-Fas(19-335)和肽参入的放射活性-使用GST-Fas(191-320)和肽参入的放射活性]/[使用GST-Fas(191-335)没有肽时参入的放射活性-使用GST-Fas(191-320)没有肽时参入的放射活性]。n＝3。

5.结合FAP-1的Fas C端3个氨基酸在体外和在酵母中的相互作用。

构建诱饵质粒pBTM116(LexA)-SLV，-PLV，-SLY/，和SLA并转化到带有pVP16-FAP-1或ras的L40菌株中，从每种转化体中挑出6个单独的克隆，在组氨酸-缺陷的培养基中分析其生长情况。用GST-Sepharose4B亲和层析珠(Pharmacia)纯化GST-Fas，-SLV和PLV。体外结合的方法如上所述。

6.天然的Fas与GST-FAP-1的免疫沉淀反应和Fas/FAP-1与Ac-SLV结合的抑制作用

有FAP-和没有FAP-1的GST-融合蛋白与表达Fas的Jurkat T细胞的细胞提取物共同孵育。利用抗-Fas单克隆抗体进行Western杂交分析以检测结合的Fas(F22120，Transduction Lab)。AC-SLV和AC-SLY三肽用于Fas/FAP-1结合抑制作用的检测。

7.显微注射Ac-SLV到DLD-1细胞株。将DLD-1人肠癌细胞在含10％胎牛血清的RPMI1640培养基中培养。微注射时，在35mm的塑料培养皿上，以1×10⁵细胞/2ml的密度，将细胞接种在CELLoate(Eppendorf)上，生长一天。恰好在进行微注射之前，加入500ng/ml的Fas单克隆抗体CH11(MBLinternational)。所有微注射实验均用自动微注射系统操作(Eppendorf transjector 5246 micro-manipalator5171 和Femtotips)(pantel，等，1995)。合成的三肽以100mM的浓度悬浮在0.1％(W/V)FITC-硫酸葡聚糖(Sigma)/K-PBS中。将样品微注射到DLD-1细胞浆内。注射16-20小时后，用PBS洗细胞，然后用PBS配制的10μg/ml Hoechst33342染细胞。37℃孵育30分钟后，对这些细胞进行照相，计数染色质浓缩的细胞作为凋亡的细胞

8微注射的DLD-1细胞中凋亡的定量分析

每次实验，微注射25-100个细胞。微注射后细胞的凋亡的检测是利用相差以及荧光显微镜对形态学改变进行评价(Wang等，1995)(McGahon，等1995)。数据分析是统计2-3次单独测定的平均值+/-标准误。

讨论

为了签定FAP-1结合所必须的Fas受体C端区域的最小肽，我们利用一系列合成的肽和酵母双杂交系统肽的基因文库(图24)，在体外检测Fas/FAP-1结合的抑制作用。首先构建了15种氨基酸融合到LexA DNA结合区域的半随机基因文库(基于人与大鼠之间Fas的同源性)(图2B和2C)，然后与起初作为FAP-1分离的pVP16-31(Sato，等，1995)共同转化到L40酵母菌中。从5.0×10⁶转化体中(Johnson等1986)筛选出200His+克隆后，挑出100个β-半乳糖苷酶阳性的克隆用于进一步分析。编码C端15个氨基酸的文库质粒的序列分析揭示了所有的C端氨基酸或是缬氨酸，亮氨酸或是异亮氨酸残基。第二，构建了4-15个氨基酸与LexADNA结合区域相融合的随机基因文库，然后按图2D的策略进行筛选。令人惊奇的是所有C端的第三个氨基酸都是丝氨酸，而且C端氨基酸分析结果与半随机cDNA文库筛选的结果是一致的。在筛选这些基因文库过程中没有发现其他的有意义的氨基酸序列，提示最后3个氨基酸(ts-X-V/L/I)基序对于与FAP-1的第三PDZ区域的结合非常重要，并且在蛋白-蛋白之间相互作用以及调节由Fas诱导的凋亡过程中起至关重要的作用。为了进一步确定是否这最后的3个氨基酸对于Fas/FAP-1的结合是必需的，而且足以满足其结合，我们构建了LexA-SLV，-PLV，-PLY，-SLY和-SLA融合蛋白的质粒，然后与PVP16-FAP-1共转化到酵母中。结果表明只有LexA-SLV与FAP-1结合，而LexA-PLV，-PLY，-SLY和-SLA不能结合(图4A)。用各种GST-三肽融合体研究体外结合和在体外翻译的FAP-1所得的结果是一致的(图4B)。

除了酵母双杂交系统外，也利用了Fas/FAP-1结合的体外抑制作用检测。首先，检测C-端15个氨基酸的合成肽是否能在体外抑制Fas和FAP-1的结合(图3A)。体外翻译的FAP-1与GST-Fas的结合也显著地降低而且与合成的FAS的15个氨基酸的浓度有关。与这些结果相比，在同样的生物化学条件下，人的PAMP肽(Kitamuta，等1994)作为阴性对照对Fas/FAP-1的结合活性没有影响。第二，检测截短的Fas C-末端合成肽对Fas/FAP-1体外结合的效应。正如图3B所示，对于Fas/FAP-1的结合，在C-端只有3个氨基酸(Ac-SLV)就足以得到与合成的4-15肽所起的抑制影响。进一步利用三肽的替换肽，研究Fas/FAP-1的结合，以决定对抑制作用所必须的重要的氨基酸(图3C)。这些结果揭示了C端的第三个氨基酸和C-末端氨基酸分别为丝氨酸或苏氨酸；以及缬氨酸，亮氨酸，或异亮氨酸时具有最强的抑制效应。但是C端第二个氨基酸中对于它们的Fas/FAP-1结合抑制效应没有显著差异。这些结果与酵母双杂交系统所得结果(图2C，2D)是一致的。因此，结论是C端的三个氨基酸(SLV)对于Fas与FAP-1蛋白的第三个PDZ区域结合是决定性的。

为了进一步研究在更天然条件下PDZ区域与ts/T-X-V/L./I之间相互作用的重要意义，我们检测了GST融合的FAP-1蛋白与JurkatT细胞表达的Fas相互作用的能力。结果揭示了是Ac-SLV三肽，而不是Ac-SLY三肽取消了FAP-1与从Jurkat T细胞中提取的Fas蛋白以剂量依赖的方式相结合的活性(图4C和4D)。这些结果揭示了C-端氨基酸tSLV对于FAP-1是最小的结合位点。而且丝氨酸和颉氨酸对于这种物理性的结合是至关重要的。

为了进一步验证这一推论，即FasC端的3个氨基酸与FAP-1第三个PDZ区域之间的物理结合对于体内FAP-1作为由Fas介导的信号传导的负调控因子的功能是必需的，应用微注射的实验，将合成的三肽注射到大肠癌细胞株DLD-1，该细胞株能表达Fas和FAP-1，并抵抗由Fas诱导的凋亡。这些实验包括直接将合成的三肽注射到单个细胞的胞浆，检测体内由Fas-诱导的凋亡的生理性反映。结果显示，将Ac-SLV微注射到DLD-1细胞时有Fas-单克隆抗体存在的情况下(CH11，500ng/ml)，可以显著地诱导凋亡(图5A，5E，和图6)，但是微注射Ac-S LY和PBS/K则不能诱导凋亡(图5B，5F和图6)。这些结果有力地支持了这种推论，即FAP-1与FasC端物理性结合对于防止细胞被Fas-诱导引起凋亡是必需的。

总之，我们发现了FasC端的SLV对于结合到FAP-1第三个PDZ区域是唯一必须的，并能满足其需要。第二，提出了新的tS/T-X-V/L/I的共用基序，而不是tS/T-X-V，被用于与PDZ区域的结合。因此很可能除了FAP-1与Fas物理性相互作用外，FAP-1在信号传导途径的调节作用中也起很重要的作用。第三，证明了在大肠癌细胞中直接注射三肽Ac-SLV可以定向地诱导由FaS-介导的凋亡。进一步的研究包括确定FAP-1的底物和结构功能的分析，在癌细胞中利用Fas/FAP-1的相互作用用于治疗以及提供证据更好地了解FAP-1对由Fas介导的信号传导的抑制作用。

第二部分实验

FAP-1原是鉴定为膜结合蛋白酪氨酸磷酸酶，它与Fas的C端相结合，有6个PDZ区域(也被称作DHR区域或GLGF重复)。最近研究表明PDZ区域是作为一种新的特异的蛋白-蛋白之间相互作用模件，而且看来在膜蛋白的装配，和在多蛋白的复合物中与信号分子连接的过程中起重要作用。

最近的综合研究结果发现FAP-1的第三个PDZ区域特异地识别一个序列基序t(S/T)-X-V，并与Fas的C-端3个氨基酸相互作用(图9)。为了研究FAP-1也与p75NGFR C端区域相互作用的可能性(图8)，利用体外结合实验以及通过用酵母的双杂交系统将一系列的p75NGFR缺失突变后进行分析。结果揭示p75NGFR C-端胞浆部分与FAP-1相互作用，该p75NGFR C-端胞浆部分在所有的种类中是高度保守的(图10)。而且，p75NGFR C-端的三个氨基酸SPV是必须的，且足以满足与FAP-1的第三个PDZ区域都相互作用(图11A，11B)。由于FAP-1在胎儿脑的表达最高，所以这些结果暗示FAP-1与p75NGFR之间的相互作用在神经细胞中通过p75NGFR的途径进行信号传递的过程中以及在p75NGFR启始信号转变复合物的形成中起重要作用。

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41.Yang，Q.，and Tonks，N.K. Proc.Natl.Acad.Sci U.S.A.88：5949-5953(1991).

序列表

(1)总信息：

(i)申请人：纽约市哥伦比亚大学信托人

(ii)发明名称：-种抑制信号-传导蛋白和

GLGF(PDZ/DHR)区域之间相

互作用的化合物及其应用

(iii)序列数目：33

(iv)通信地址：

(A)收信人：cooper & Dunham LLP

(B)街道：1185 Avenue of the Americas

(C)城市：New York

(D)州：New York

(E)国家：U.S.A.

(F)邮编：10036

(v)计算机可读形式：

(A)介质类型：软盘

(B)计算机：IBM PC兼容

(C)操作系统：PC-DOS/MS-DOS

(D) 软件：PatentIn Release#1.0，Version#1.30

(vi)目前申请状态：

(A)申请号：

(B)申请日：1997年7月18日

(C)分类：

(viii)代理信息：

(A)姓名：White，John P

(B)登记号：28.678

(C)案号：0575/48962-A-PCT/JPW/JKM

(ix)通讯资料：

(A)电话：(212)278-0400

(B)传真：(212)391-0525

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：4氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

Gly/Ser/Ala/Glu Leu Gly Phe/Ile/Leu

1

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

Lys/Arg/Gln Xaa(n) Gly/Ser/Ala/Glu Leu Gly Phe/Ile/Leu

1 5

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：4氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

Ser Leu GlyIle

1

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(ii)分子类型：肽

(iii)假设：否

(iv)反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

Ser/Thr Xaa Val/Ile/Leu

1

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

Asp Ser Glu Asn Ser Asn Phe Arg Asn Glu Ile Gln Ser Leu Val

1 5 10 15

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

Ser Ile Ser Asn Ser Arg Asn Glu Asn Glu Gly Gln Ser Leu Glu

1 5 10 15

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：15氨基酸

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(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

Ser Thr Pro Asp Thr Gly Asn Glu Asn Glu Gly Gln Cys Leu Glu

1 5 10 15

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：4氨基酸

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Glu Ser Leu Val

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(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：6氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

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(ii)分子类型：肽

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(i)序列特征：

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(i)序列特征：

(A)长度：8氨基酸

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(C)链型：单链

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(i)序列特征：

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(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

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1 5 10

(2)SEQ ID NO：13的信息：

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(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

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Lys Leu Asp Asn Val Met Leu Asp Ser Glu Gly His Ile Lys Ile Ala

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Asp Phe Gly Met Cys Lys Glu His Met Met Asp Gly Val Thr Thr Arg

485 490 495

Thr Phe Cys Gly Thr Pro Asp Tyr Ile Ala Pro Glu Ile Ile Ala Tyr

500 505 510

Gln Pro Tyr Gly Lys Ser Val Asp Trp Trp Ala Tyr Gly Val Leu Leu

515 520 525

Tyr Glu Met Leu Ala Gly Gln Pro Pro Phe Asp Gly Glu Asp Glu Asp

530 535 540

Glu Leu Phe Gln Ser Ile Met Glu His Asn Val Ser Tyr Pro Lys Ser

545 550 555 560

Leu Ser Lys Glu Ala Val Ser Ile Cys Lys Gly Leu Met Thr Lys His

565 570 575

Pro Ala Lys Arg Leu Gly Cys Gly Pro Glu Gly Glu Arg Asp Val Arg

580 585 590

Glu His Ala Phe Phe Arg Arg Ile Asp Trp Glu Lys Leu Glu Asn Arg

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(2)SEQ ID NO：28的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：471氨基酸

(B)类型：氨基酸

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(xi)序列描述：SEQ ID NO：28：

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Ser Leu Met Gln Leu Asn Asp Asp Thr Arg Leu Tyr Ser Asn Asp Phe

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Ser Lys Leu Cys Ala Val Trp Ile Tyr Leu Asp Val Leu Phe Ser Thr

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Ala Ser Ile Met His Leu Cys Ala Ile Ser Leu Asp Arg Tyr Val Ala

165 170 175

Ile Gln Asn Pro Ile His His Ser Arg Phe Asn Ser Arg Thr Lys Ala

180 185 190

Phe Leu Lys Ile Ile Ala Val Trp Thr Ile Ser Val Gly Ile Ser Met

195 200 205

Pro Ile Pro Val Phe Gly Leu Gln Asp Asp Ser Lys Val Phe Lys Glu

210 215 220

Gly Ser Cys Leu Leu Ala Asp Asp Asn Phe Val Leu Ile Gly Ser Phe

225 230 235 240

Val Ser Phe Phe Ile Pro Leu Thr Ile Met Val Ile Thr Tyr Phe Leu

245 250 255

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260 265 270

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275 280 285

Leu Ser Ser Glu Lys Leu Phe Gln Arg Ser Ile His Arg Glu Pro Gly

290 295 300

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340 345 350

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Lys Thr Phe Arg Asp Ala Phe Gly Arg Tyr Ile Thr Cys Asn Tyr Arg

385 390 395 400

Ala Thr Lys Ser Val Lys Thr Leu Arg Lys Arg Ser Ser Lys Ile Tyr

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Phe Arg Asn Pro Met Ala Glu Asn Ser Lys Phe Phe Lys Lys His Gly

420 425 430

Ile Arg Asn Gly Ile Asn Pro Ala Met Tyr Gln Ser Pro Met Arg Leu

435 440 445

Arg Ser Ser Thr Ile Gln Ser Ser Ser Ile Ile Leu Leu Asp Thr Leu

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Leu Leu Thr Glu Asn Glu Gly Asp Lys Thr Glu Glu Gln Val Ser Val

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Val

(2)SEQ ID NO：30的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：2843氨基酸

(B)类型：氨基酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：肽

(xi)序列描述：SEQ ID NO：30：

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675 680 685

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Ile Gln Ser Pro Gly Arg Asn Ser Ile Ser Pro Gly Arg Asn Gly Ile

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Ser Pro Pro Asn Lys Ile Ser Gln Leu Pro Arg Thr Ser Ser Pro Ser

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Ser Arg Met Ser Ser Thr Lys Ser Ser Gly Ser Glu Ser Asp Arg Ser

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Glu Arg Pro Val Leu Val Arg Gln Ser Thr Phe Ile Lys Glu Ala Pro

2435 2440 2445

Ser Pro Thr Leu Arg Arg Lys Leu Glu Glu Ser Ala Ser Phe Glu Ser

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Leu Ser Pro Ser Ser Arg Pro Ala Ser Pro Thr Arg Ser Gln Ala Gln

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Thr Pro Val Leu Ser Pro Ser Leu Pro Asp Met Ser Leu Ser Thr His

2485 2490 2495

Ser Ser Val Gln Ala Gly Gly Trp Arg Lys Leu Pro Pro Asn Leu Ser

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Gly Thr Trp Lys Arg Glu His Ser Lys His Ser Ser Ser Leu Pro Arg

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Val Ser Thr Trp Arg Arg Thr Gly Ser Ser.Ser Ser Ile Leu Ser Ala

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Ser Ser Glu Ser Ser Glu Lys Ala Lys Ser Glu Asp Glu Lys His Val

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Lys Thr Leu Ile Tyr Gln Met Ala Pro Ala Val Ser Lys Thr Glu Asp

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Arg Ser Pro Thr Gly Asn Thr Pro Pro Val Ile Asp Ser Val Ser Glu

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(2)SEQ ID NO：31的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：65碱基对

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(iii)假设：否

(iv)反义：否

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CCTCA 65

(2)SEQ ID NO：32的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：65碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(iv)反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：32：

CGGAATTCGA CTCAGAANNN NNNAACTTCA GANNNNNNAT CNNNNNNNNN GTCTGAGGAT 60

CCTCA 65

(2)SEQ ID NO：33的信息：

(i)序列特征

(A)长度：65碱基对

(B)类型：核酸

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(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(iv)反义：否

(xi)序列描述：SEQ ID NO：33：

CGGAATTCNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNNNNNNNN NNNTGAGGAT 60

CCTCA 65

Claims

1.一种包含(S/T)-X-(V/I)-COOH氨基酸序列的肽化合物，在该序列中每个“-”代表一个肽键，每个括号包含可以相互替换的氨基酸，以及括号内斜线分开可相互替换的氨基酸，“X”代表任何除G以外的氨基酸，该氨基酸是从一组含有20种天然存在的氨基酸中选择出来的，其中该肽抑制一种信号-传导蛋白和一种含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列的胞浆蛋白之间的特异结合。

2.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含DSENSNFRNEIQSLV氨基酸序列。

3.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含RNEIQSLV氨基酸序列。

4.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含NEIQSLV氨基酸序列。

5.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含EIQSLV氨基酸序列。

6.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含IQSLV氨基酸序列。

7.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含QSLV氨基酸序列。

8.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含SLV氨基酸序列。

9.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含IPPDSEDGNEEQSLV氨基酸序列。

10.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含DSEMYNFRSQLASVV氨基酸序列。

11.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含SDSNMNMNELSEV氨基酸序列。

12.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含QNFRTYIVSFV氨基酸序列。

13.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含RETIESTV氨基酸序列。

14.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含RGFISSLV氨基酸序列。

15.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含TIQSVI氨基酸序列。

16.权利要求1的肽化合物，其中这种肽含ESLV氨基酸序列。

17.一种鉴定权利要求1的肽化合物的方法，该方法包括：

(a)在允许一种已知物和结合胞浆蛋白的信号-传导蛋白之间结合形成复合物的条件下，所述已知物预先显示能(i)替换结合了胞浆蛋白的信号-传导蛋白和(ii)与胞浆蛋白形成信号-传导蛋白不再结合的复合物，将已结合了信号-传导蛋白的胞浆蛋白与各种肽化合物接触；和

(b)检测步骤(a)中被替换的信号-传导蛋白或复合物，其中，任何被替换的信号-传导蛋白或者来自步骤(a)复合物的存在表示这种肽化合物能抑制信号-传导蛋白和胞浆蛋白之间的特异结合，

其中所述胞浆蛋白含有(G/S/A/E)-L-G-(F/I/L)氨基酸序列。

18.权利要求17的方法，其中，该信号-传导蛋白和该胞浆蛋白之间的特异结合的抑制影响报告基因的转录活性。

19.权利要求17的方法，在步骤(b)中被替换的信号-传导蛋白或该复合物的检测是通过比较步骤(a)中与该肽化合物接触前后报告基因的转录活性来进行的，其中该活性的改变表明该信号-传导蛋白和该胞浆蛋白之间的特异结合被抑制而该信号-传导蛋白被替换。

20.权利要求17的方法，该方法中胞浆蛋白是结合到固相支持物上。

21.权利要求17的方法，该方法中化合物是结合到固相支持物上。

22.权利要求17的方法，该方法中步骤(a)中的接触是在体外进行的。

23.权利要求17的方法，该方法中步骤(a)中的接触是在体内进行的。

24.权利要求22的方法，该方法中步骤(a)中的接触是在酵母细胞中进行的。

25.权利要求22的方法，该方法中步骤(a)中的接触是在哺乳动物细胞中进行的。

26.权利要求17的方法，其中，该信号-传导蛋白是一种细胞表面受体。

27.权利要求26的方法，该方法中细胞表面受体是CD4受体。

28.权利要求26的方法，该方法中细胞表面受体是p75受体。

29.权利要求26的方法，该方法中细胞表面受体是血清素2A受体。

30.权利要求26的方法，该方法中细胞表面受体是血清素2B受体。

31.权利要求1的肽化合物在制备用于抑制癌细胞增殖的药物中的用途。

32.权利要求31的用途，其中癌细胞来自胸腺、肝脏、肾脏、结肠、卵巢、乳腺、睾丸、脾脏、胃、前列腺、子宫、皮肤、头、和颈。

33.权利要求31的用途，其中癌细胞来自T细胞和B细胞。

34.权利要求1的肽化合物在制备用于对患者治疗肿瘤的药物中的用途，其中制备该药物以向患者的癌细胞中以可有效使该癌细胞凋亡的量给药。

35.权利要求34的用途，其中癌细胞来自胸腺、肝脏、肾脏、结肠、卵巢、乳腺、睾丸、脾脏、胃、前列腺、子宫、皮肤、头、和颈。

36.权利要求34的用途，其中癌细胞来自T细胞和B细胞。

37.权利要求1的肽化合物在制备用于抑制病毒感染的细胞的增殖的药物中的用途。

38.权利要求37的用途，其中的细胞被B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、人T细胞亲淋巴病毒1型或HIV感染。

39.权利要求1的肽化合物在制备用于治疗病毒感染患者的药物中的用途，其中制备该药物以向患者的病毒感染的细胞中以可有效使该癌细胞凋亡的量给药。

40.权利要求39的用途，其中的细胞被B型肝炎病毒、EB病毒、流感病毒、乳头瘤病毒、腺病毒、人T细胞亲淋巴病毒1型或HIV感染。

41.一种药物组合物，包含有效量的权利要求1的肽化合物和一种药用可接受的载体。