CN1543570A - 神经元一氧化氮合酶蛋白质与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质键合抑制剂筛选新方法 - Google Patents

神经元一氧化氮合酶蛋白质与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质键合抑制剂筛选新方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及一种检测化合物的方法，该化合物能够调节神经元一氧化氮合酶(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用，其中：温育含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物，检测与对照值相比PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物量的显著变化，由此推断当存在如上所述的显著变化时，上述化合物与PIN蛋白质之间或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体之间存在键合作用，这导致调节PIN蛋白质与nNOS蛋白质和其中一种变体的复合作用。

Description

神经元一氧化氮合酶蛋白质与
神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质键合抑制剂筛选新方法
本发明涉及神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)键合(liaison)抑制剂筛选新方法。本发明还涉及鼠和任何其它种类动物，其中包括人的nNOS蛋白质的胰腺形式，以及编码所述蛋白质的核酸。本发明还涉及在制备用于治疗糖尿病前期和胰岛素分泌过多的药物中蛋白质或肽的用途。
一氧化氮合酶蛋白质(NOS)是一种酶，该酶由其底物即精氨酸合成一氧化氮(NO)。这种蛋白质存在三种形式：两种基本NOS形式，其中包括内皮一氧化氮合酶(eNOS)和神经元一氧化氮合酶(nNOS)以及由白细胞介素诱导的诱导型NOS。
神经元NOS首先曾由D.S.Bredt于1991年在鼠脑中鉴定和克隆(Bredt et al.，1991)。在中枢神经系统中，神经元NOS在长期记忆现象(LTP)中和末梢神经系统中起作用，其存在于脉管(vessel)、肠等非肾上腺素能的非胆碱能神经元(NANC)中。然而，病理学状态下，如中风，过量产生NO可能是有害的，而且是造成神经毒性现象的原因。现在的研究更多的关注于研究可阻断在神经残留物上NO毒性作用的nNOS抑制剂。
S.R.Jaffery和S.H.Snyder(1996)鉴定了神经NOS的特异性内源抑制剂：神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)。在nNOS的163-245位氨基酸上，该抑制剂与神经NOS(nNOS)相互作用，因此可预防nNOS均二聚作用并阻断NO的生成。因此，PIN蛋白质可调节nNOS活性，并阻止过量产生有害于细胞功能的NO。
美国专利US 5908756描述了提高或降低在生成NOS神经元形式(nNOS)的一氧化氮过程中催化活性的化合物的筛选试验。首先，将试验化合物与PIN蛋白质和两种nNOS单体的混合物接触，然后，通过测量其与PIN蛋白质竞争时影响两种nNOS单体的均二聚作用的能力测定试验化合物的活性而PIN蛋白质抑制其均二聚作用。因此，该试验用于研究修饰神经元NO合酶催化活性的化合物。
II型糖尿病，以前称为非胰岛素依赖型糖尿病(DNID)，是一种多因素起因的异源疾病(hetergeneous disease)，其突然暴发同时取决于遗传和环境因素，如饮食卫生、超重、缺乏锻炼和抽烟。与工业化国家的社会经济背景相关，该疾病是一个公共健康的主要难题：估计在2007年将影响220百万人。
II型糖尿病的特征在于两种主要不足，其相对重要性是不同的：第一个不足与胰岛素增加末梢组织对葡萄糖的吸收能力降低，即胰岛素抗性相关，第二个不足与胰腺β-细胞中的分泌异常相关，这种异常致使胰腺不能分泌足够量的胰岛素以补偿胰岛素抗性。这两种异常是在称为糖尿病前期的无症状前驱期之前的，该前驱期可以持续几年至几十年。此糖尿病前期状态的特征不是胰岛素不足，而相反地是分泌高活性，该分泌高活性导致血胰岛素过多症。
血胰岛素过多症通常是与肥胖相联系的，在具有遗传缺陷的受试者中，特别是某些肥胖和II型糖尿病发生率非常高的人群中，如比马人印第安人(Pima Indians)，这是非常重要的危险因素。通常如果高血胰岛素过多症发展以补偿胰岛素抗性，异常的高活性或胰岛素过多症在转化过程中还伴随着前胰岛素和其转化中间体(intermediaire)的高血浆水平。在大部分具有不耐受葡萄糖的受试者，即糖尿病前期受试者的研究中，已证明这种不适当分泌未成熟或成熟得不好的胰岛素。其分泌未成熟或成熟得不好的胰岛素形成了非常不好的预兆；事实上，前胰岛素/胰岛素的比例增高与2-5年后II型糖尿病和心血管并发症的发展是相关联的。
II型糖尿病的高发生率使得有必要研究一种药物，提供给病人更宽治疗选择，以便调整在糖尿病前期和II型病人糖尿病期的功能障碍。
实际上，用于调整胰岛素缺乏的唯一药物是低血糖的硫酰胺和glinides；然而，这些胰岛素分泌剂不可用于调整糖尿病前期病人或胰岛素过多症病人的胰腺β-细胞功能障碍。
迄今为止，还没有适合于治疗糖尿病前期或胰岛素过多症状态的治疗药物。
不过，本发明尤其提供一个这个难题的解决方法。
本发明的一方面提供一种新型检测方法，该方法有可能快速筛选能降低PIN蛋白质和nNOS相互作用的化合物。
本发明的另一方面还提供一种PIN蛋白质与nNOS相互作用抑制剂的新检测方法，而该方法不会改变神经元NOS的催化活性。
本发明的另一方面是检测在糖尿病前期、胰岛素过多或II型糖尿病病人中重建正常胰岛素反应的化合物。
本发明涉及一种化合物检测方法，该化合物可以调节用序列SEQID NO：2表示的神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用，该复合作用的调节作用可导致由nNOS蛋白质或其中一种变体调整的胰岛素反应的改变，其中：
-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤可在一定条件下进行，该条件可以：
    ·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，
    ·使上述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或上述化合物与
nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物；
-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物量的可能显著变化，例如对应于：
    *在没有经经检测方法检测的化合物的情况下，PIN蛋白质与
nNOS蛋白质或其中一种变体之间生成复合物的量，或
    *没有PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合物，
这是没有PIN蛋白质，或者没有nNOS蛋白质或其中一种变体造成
的，或
    *在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一
种变体形成的复合物的量；和
-当没有如上所定义的明显变化时，由此可推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体是键合的，这样可导致调节PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体之间的复合作用。
“调节神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用”是指：
-在调节nNOS蛋白质与PIN蛋白质复合作用的化合物的作用下，降低在nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间形成的复合物的量，与没有试验化合物存在下的对照值(100％)相比，这种降低是所述复合物量的至少约20％，优选地至少约50％，或
-在调节nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间复合作用的化合物的作用下，增加在nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间形成的复合物的量，与没有试验化合物存在下的对照值(100％)相比，这种增加是所述复合物量的至少为约120％，优选地至少约150％。
“nNOS蛋白质或其中一种变体”是指在不同组织中表达的所有物种，尤其是人的所有神经元nNOS，其组织可以存在点突变或特殊的可变基因剪接或同时为两者。
“胰岛素反应的改变”是指在调节nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间复合作用的化合物的作用下，降低胰岛素反应，或在上述化合物作用下增加胰岛素反应。
由调节nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间复合作用的化合物所诱导的胰岛素反应的改变可以通过细胞试验进行测量，尤其在下述2种条件下通过使用INS-1细胞系(Asfari等人，1992)进行测量：
-如果试验化合物是脂溶性的，并可以穿过细胞膜，在待试验化合物存在下，在清蛋白盐Krebs-Ringer缓冲液中，使用浓度递增的葡萄糖(0.5-1-1.5-2g/L)刺激这些细胞(Asfari等人，1992)，
-如果试验化合物不是脂溶性的，并因此不能穿过细胞膜，在Staphylococcus aureus α-毒素(Maechler等人，1997)存在下，渗透这些细胞，在有或没有上述化合物存在下，用胰岛素分泌化合物(composé insulino-sécréteur)刺激这些细胞。
“在PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体之间形成的复合物的可能显著变化”是指与相应于没有试验化合物的对照值相比，在试验化合物作用下所生成的复合物量增加或降低至少20％，优选地50％。
为了对PIN蛋白质和nNOS之间的复合作用率进行定量，本发明使用一种检测方法，该方法涉及使用一种物质，如放射性元素、荧光元素或发光元素、酶或生物素，分子标记至少一种配偶体(即PIN蛋白质和/或nNOS蛋白质)。这种标记，通过发射(放射性射线、光线或荧光光线)或信号的消耗(光信号或荧光信号的吸收)，自发地或在加入酶底物或光激发后有可能直接或间接的物理定量测量。为了对PIN蛋白质和nNOS之间的复合作用率进行定量，还可以使用表面等离子共振技术(résonance plasmoniqe de surface)(如Biacore AB)，该技术不涉及标记两种配偶体中的一种配偶体，其条件是将PIN蛋白质或nNOS蛋白质固定在生物传感器通道中。为了对PIN蛋白质和nNOS之间的复合作用率进行定量，还可以使用酵母或细菌双杂交(doublehybride)类型的技术，如特别在美国专利US5283173和5468614中描述的技术。该技术在生物体内实施，不需要生成和纯化PIN蛋白质或nNOS。
在本发明的一种实施方式中，如果使用可进行能量交换的物质标记PIN蛋白质和nNOS蛋白质，可以在溶液中检测形成复合物(或其变体)的量。复合物的形成伴随着两种配偶体接近，这样有可能在二种标记物之间进行能量转换，这时可引起2种标记物中的一种标记物所发射荧光信号强度增加或降低。
在本发明的另一种实施方式中，如果2种结合配偶体中的一种配偶体固定在固态支持物(support solide)上，如果采用表面等离子共振或采用如上所述的显示系统标记该配偶体，检测另一个配偶体的键合，则可在固相中检测复合物(或其变体)的量。
第一种配偶体，即nNOS蛋白质或PIN蛋白质，可以以下述方式固定：共价方式(化学反应)，或通过物理化学相互作用(疏水塑料表面上的吸附)，或通过生物特异性相互作用，其中生物传感器预先被固定在板上(如果第一配偶体涂覆生物素时，第一配偶体的特异性抗体或卵白素)非共价方式。
第二种配偶体，即PIN蛋白质或nNOS蛋白质，可以以下述方式检测所生成的复合物(或其变体)的量：采用表面等离子共振直接方式，或通过测量其标记物的量间接方式。该标记物可以是通过化学键与第二配偶体连接的元素(放射性元素、荧光或发光元素、酶、生物素)，或可以是其它的生物特异性物质，如对着第二种配偶体的抗体(它自身直接或间接被标记)或卵白素(直接或间接标记)。
对照值可以通过下述途径获得：
-进行一种试验，将包含PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物在一定条件下温育，该条件有可能使PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物，并测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物的量，该量对应于所述的对照值；或
-进行一种试验，仅温育PIN蛋白质，这样导致与PIN蛋白质和nNOS蛋白质之间不形成复合物；或
-进行一种试验，仅温育nNOS蛋白质，这样导致在PIN蛋白质与nNOS蛋白质之间不形成复合物；或
-进行一种试验，含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物与参照抑制剂在一定条件下温育，该条件有可能使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物，并测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物的量，该量对应于所述的对照值；或
-进行一种试验，将与参照抑制剂一起预温育的PIN蛋白质加入到已固定在生物传感器(如Biacore AB)上的nNOS蛋白质中，并尤其采用表面等离子共振技术测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物的量，该量对应于对照值。
参照抑制剂例如可以选自用序列SEQ ID NO：3和序列SEQ ID NO：4所代表的肽。
PIN与nNOS生成的复合物可以根据上述技术进行检测。
该试验运用NOS胰腺形式的胰岛素调节性质及其内源PIN抑制，选择II型糖尿病早期、胰岛素过多症和明显II型糖尿病。
本发明还涉及上述定义的检测方法，其特征在于该化合物基本上不改变nNOS蛋白质或其中一种变体的催化活性。
术语“基本上不改变nNOS蛋白质或其中一种变体的催化活性”是指试验化合物仅轻微影响由nNOS产生NO的活性。
有两种可能的情况：
-如果所述化合物仅结合PIN蛋白质，则不改变催化活性，
-如果所述化合物结合nNOS，则相应于没有所述化合物，不改变或增加或降低不超过20-30％的nNOS基本催化剂活性。
可以，例如通过由其底物，即放射性标记的精氨酸，并在辅因子如BH4、FAD、FMN、NADPH、Ca2+和钙调节蛋白的存在下产生放射标记瓜氨酸的能力可以评估nNOS催化剂活性。产生的瓜氨酸可以通过离子交换色谱从精氨酸中分离出来，并且通过放射活性计数进行定量。
本发明涉及一种化合的检测方法，该化合物可降低神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)复合作用，这种复合作用降低可导致由nNOS或其中一种变体调节的胰岛素反应减弱，其中：
-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤在一定条件下进行，该条件有可能：
   ·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，
   ·使所述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或所述化合物与
nNOS或其中一种变体形成复合物；
-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量或许明显降低，例如对应于：
    *在没有用检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS
蛋白质或其中一种变体形成的复合物的量，
    *PIN蛋白质或nNOS蛋白质或其中一种变体之间没有复合
物，这是没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质或其中一种变体造
成的，或
    *在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一
种变体形成复合物的量；和
-当存在如上所定义的明显的降低时，推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体之间是键合的，这样导致PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合作用的降低。
“胰岛素反应的降低”是指在降低nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间复合作用的化合物的作用下，与相应于没有试验化合物的对照值相比，胰岛素分泌降低至少约20％，优选至少约50％。
“PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量可能明显降低”是指，与相应于没有试验化合物的对照值相比，试验化合物存在时生成复合物的量变化至少约20％，优选地至少约50％。
本发明还涉及一种化合物的检测方法，该化合物能增加神经元一氧化氮合酶(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用，该复合作用的增加可导致nNOS蛋白质或其中一种变体所调节的胰岛素反应增大，其中：
-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤可在一定条件下进行，该条件有可能：
    ·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，
    ·使上述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或上述化合物与
nNOS或其中一种变体形成复合物；
-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成的复合物量的可能明显增加，例如对应于：
    *在没有进行检测方法的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS
蛋白质或其中一种变体形成的复合物的量，
    *没有PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体存在，这是
由没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质或其中一种变体造成的，
    *在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一
种变体形成的复合物的量；和
-当如上所述明显增加时，推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体是键合的，这样导致PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体之间的复合作用增加。
“胰岛素反应增大”是指在可增大nNOS蛋白质与PIN蛋白质的复合作用的化合物的作用下，与相应于没有试验化合物的对照值相比，胰岛素分泌增加至少约20％，优选地至少约50％。
本发明还涉及如上所定义的检测方法，其中所使用的nNOS蛋白质是nNOS蛋白质的胰腺形式，或存在于脑中的形式。
存在于胰腺细胞中的鼠nNOS蛋白质是胰腺nNOS：涉及鼠神经元NOS的突变形式。
相对于鼠脑nNOS蛋白质，鼠胰腺nNOS具有三个突变的氨基酸；当这些突变没有定位于酶功能结构域(如上所述的辅因子键合区域)，或没有定位于PIN与nNOS相互作用的区域，但是它们影响其三维构象，因此赋予其胰腺特异性。
所使用的nNOS蛋白质还可以是存在于鼠脑中的nNOS蛋白质。
一种本发明有利的检测方法是如上定义检测方法，其中测试变体，尤其测试与第一对照值、第二对照值和第三对照值相比，PIN蛋白质与nNOS蛋白质形成复合物量的可能明显降低，其中一个对照值相应于在没有用检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量；这些对照值中的另一个对照值对应于PIN蛋白质与nNOS之间没有复合物，这是由没有PIN蛋白质或没有nNOS造成的，这些对照值中的另一个对照值对应于在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量。
PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量可以使用上述技术中的一种技术进行检测。
例如，进行下述试验可以得到第一对照值：
-在一定条件下温育含有PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物，在该条件下有可能使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物，
-测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物的量，该量对应于所述的对照值；
例如，进行下述试验可以得到第二对照值，该试验相应于：
-仅温育PIN蛋白质，导致PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体不形成复合物；
-仅温育nNOS蛋白质或其中一种变体，这导致nNOS蛋白质或其中一种变体与PIN蛋白质不形成复合物；
例如，进行下述试验可以得到第三对照值：
-温育含有PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体和参比抑制剂的混合物，
-测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体生成复合物的量，该量对应于所述对照值。
例如，还可以通过进行下述试验得到第三对照值：
-将与参比抑制剂一起预温育的PIN蛋白质加入到已固定在生物传感器(如Biacore AB)上的nNOS蛋白质中，
-尤其采用表面等离子共振技术测量PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物的量，该数量对应于对照值。
本发明有利的检测方法是如上定义中的方法，其中制备含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和用检测方法检测的试验化合物的混合物：
-同时加入PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物，或
-依次加入PIN蛋白质、经检测方法检测的化合物和nNOS蛋白质，或依次加入nNOS蛋白质、经检测方法检测的化合物和PIN蛋白质，
-加入预先与PIN蛋白质或nNOS蛋白质温育的所述化合物，然后分别加入nNOS蛋白质或PIN蛋白质。
当同时加入PIN蛋白质、nNOS蛋白质和所述化合物，可以制备含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物，有利于检测化合物，该化合物与在PIN蛋白质nNOS蛋白质所形成的复合物连接，并离解所述的复合物，还有利于检测仅连接两种配偶体(即PIN或nNOS)中一种配偶体的化合物，而这些化合物对参与同复合物生成竞争是充分有效的。
当含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物是通过依次加入PIN蛋白质、所述化合物和nNOS蛋白质制备得到的时，有利于检测连接PIN蛋白质的化合物，但也有利于寻找非常好的nNOS蛋白质配体(对nNOS蛋白质具有非常强亲合力的配体，约μM，优选地nM)，从动力学方面来看这是不利的。
当含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物是通过依次加入下述物质制备得到的：nNOS蛋白质、所述化合物和PIN蛋白质时，有利于检测键合nNOS蛋白质的化合物，但同样有利于寻找非常好的PIN蛋白质配体(对nNOS蛋白质具有非常强亲合力的配体，约μM，优选地nM)，这其从动力学方面看是不利的。
当含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物是通过加入预先与PIN蛋白质温育的所述化合物和nNOS蛋白质制备得到时，在加入nNOS蛋白质之前促进所述化合物与PIN蛋白质的键合，从而有利于检测键合PIN蛋白质的化合物。
当含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物是通过加入预先与nNOS蛋白质温育的所述化合物和PIN蛋白质制备得到时，在加入PIN蛋白质之前促进所述化合物与nNOS蛋白质的键合，从而有利于检测键合nNOS蛋白质的化合物。
当同时加入PIN蛋白质、nNOS蛋白质和上述化合物时，可以在溶液中使用荧光标记物和采用荧光偏振法(或转移)定量所生成的复合物。该方法具有快速的优点(仅一步温育的步骤，不洗涤)，并提供直接检测系统。
当依次加入PIN蛋白质、上述化合物和nNOS蛋白质，或在PIN蛋白质或nNOS蛋白质与上述化合物预温育之后，两种配偶体中的一种配偶体必须先被固定在固体支持物上。可以采用表面等离子共振方法分析或标记其它配偶体定量所生成的复合物。该方法能够测定与化合物键合的任何配偶体，即PIN蛋白质、nNOS蛋白质或这两种蛋白质之间生成的复合物。
一种有利的检测方法是如上定义的一种检测方法，其中nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上。
术语“固定在固体支持物上”是指一种方法，其中nNOS蛋白质以共价方式(化学反应)或非共价方式(在塑料上非特异性吸附，卵白素-生物素系统，抗体)固定在固体支持物上。
当nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上时，采用表面等离子共振方法或使用检测系统标记(放射性、发光或荧光标记物，酶，生物素)检测PIN蛋白质键，这样可以测量所生成的复合物的量。
当nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上时，同时加入并没有预混合的PIN蛋白质和经检测方法检测的化合物，可以同时检测nNOS蛋白质、PIN蛋白质和两种蛋白质所生成复合物的配体。该方法有助于检测抑制PIN蛋白质与nNOS蛋白质缔合的分子，并因此可以研究离解两种蛋白质所生成的复合物的化合物。
当nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上时，依次加入经检测方法检测的化合物和PIN蛋白质，可以检测仅抑制nNOS蛋白质的化合物。实际上，如果试验化合物没有与nNOS蛋白质固定，它将在加入PIN蛋白质前洗涤时被除去。
当nNOS蛋白质预先被固定在固体支持物上时，加入与PIN蛋白质预温育的经检测方法检测的化合物，可以同时检测PIN蛋白质、nNOS蛋白质和PIN蛋白质与nNOS蛋白质所生成复合物的配体。此实施方式促进所述化合物与PIN蛋白质在所述化合物与nNOS温育前键合，并可以研究PIN蛋白质的配体。该实施方式还可以选择非常好的nNOS蛋白质配体(对nNOS蛋白质非常强亲合力的配体，约μM，优选地nM)，这在此情况下是不利于动力学的。
本发明还涉及如上述定义的检测方法，其中PIN蛋白质预先被固定在固体支持物上。
术语“固定在固体支持物上”是指一种方法，其中PIN蛋白质以共价方式(化学反应)或非共价方式(在塑料上非特异性吸附，卵白素-生物素系统，抗体)固定在固体支持物上。
当PIN蛋白质预先固定在固体支持物上时，采用表面等离子共振方法或利用检测系统标记(放射性、发光或荧光标记物，酶，生物素)检测nNOS键，这可以测量所生成复合物的量。
当PIN蛋白质预先固定在固体支持物上时，同时加入并没有预混合的nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物，可以同时检测nNOS蛋白质、PIN蛋白质和两种蛋白质所生成复合物的配体。该方法因此有助于检测抑制PIN蛋白质与nNOS蛋白质缔合的分子，并还可以研究解离由两种蛋白质所生成复合物的化合物。
当PIN蛋白质离先固定在固体支持物上时，依次加入经检测方法检测的化合物和nNOS蛋白质，可以检测仅抑制PIN蛋白质的化合物。实际上，如果试验化合物没有固定在PIN蛋白质上，它会在加入nNOS蛋白质前洗涤时被除去。
当PIN蛋白质预先被固定在固体支持物上时，加入与nNOS蛋白质预温育的经检测方法检测的化合物，可以同时检测PIN蛋白质、nNOS蛋白质和PIN蛋白质与nNOS蛋白质所生成复合物的配体。此实施方式促进在与PIN蛋白质温育前所述化合物与nNOS蛋白质键合，并可以研究nNOS蛋白质配体。该实施方式还可以选择非常好的PIN蛋白质配体(对PIN蛋白质具有非常强亲合力的配体，约μM，优选地nM)，这在此情况下是不利于动力学的。
一种本发明有利的检测方法是如上述定义的检测方法，其中PIN蛋白质和nNOS蛋白质是处于溶液中。
当PIN蛋白质和nNOS蛋白质处在溶液中时，使用荧光化合物标记这两种蛋白质，并测量荧光偏振作用，可定量测定所生成的复合物。
本发明还涉及一种蛋白质，其特征在于它含有或由序列SEQ IDNO：2或由包含至少100个氨基酸的所述蛋白质片段组成，其条件是所述片段会有位(269)的氨基酸。
序列SEQ ID NO：2是从鼠中分离出的新蛋白质，对应于神经元NOS的胰腺形式。
nNOS的胰腺形式是nNOS的突变形式。它在位(269)、(953)、(1008)和(1299)有四个核酸突变。最后一种突变是不活动突变；因此，它没有引起氨基酸的变化。
本发明涉及下述序列的肽：
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：3)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：4)，
-Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：5)，
-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：6)，
-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：7)，
-Lys-Asp-Ala-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：8)，
-Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：9)，
-Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：10)，
-Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：11)，
-Lys-Asp-Lys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：12)，
-Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：13)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：14)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：15)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Cys-Arg-Asp(SEQ ID NO：16)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asn-Arg-Asp(SEQ ID NO：17)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Leu-Asp(SEQ ID NO：18)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Cys-Asp(SEQ ID NO：19)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Phe-Asp(SEQ ID NO：20)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Tyr-Asp(SEQ ID NO：21)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Phe(SEQ ID NO：22)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Trp(SEQ ID NO：23)，
-Val-Asp-Thr-GIy-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Tyr(SEQ ID NO：24)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO：25)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：26)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO：27)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Cys-Trp-Trp(SEQ ID NO：28)，
-Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：29)，
-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：30)，
-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：31)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：32)，
-Cys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：33)，
-Val-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：34)，
-Cys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：35)，
-Ile-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：36)，
-Val-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：37)，
-Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：38)，
-Cys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：39)，
-Ile-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：40)，
-Val-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：41)，
-Cys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：42)，
-Ile-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：43)，
-Val-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：44)，
-Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：45)，
-Cys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：46)，
-Ile-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：47)，
-Val-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：48)，
-His-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：49)，
-Ser-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：50)，
-Thr-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：51)，
-Lys-Glu-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：52)，
-Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：53)，
-Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：54)，
-Lys-Asp-Gln-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：55)，
-Lys-Asp-Val-Ala-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：56)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Val-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：57)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Thr-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：58)；
-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Ile-Asp(SEQ ID NO：59)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Glu(SEQ ID NO：60)，
-Ala-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：61)，
-Arg-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：62)，
-Asn-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：63)，
-Asp-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：64)，
-Gln-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：65)，
-Gly-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：66)，
-Pro-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：67)，
-Ser-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：68)，
-Thr-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：69)，
-Glu-Phe-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：70)，
-Glu-Ile-Asn-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：71)，
-Glu-Ile-Asp-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：72)，
-Glu-Ile-Cys-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：73)，
-Glu-Ile-Gln-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：74)，
-Glu-Ile-Glu-Ala-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：75)，
-Glu-Ile-Glu-Arg-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：76)，
-Glu-Ile-Glu-Asn-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：77)，
-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：78)，
-Glu-Ile-Glu-Gln-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：79)，
-Glu-Ile-Glu-Glu-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：80)，
-Glu-Ile-Glu-Gly-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：81)，
-Glu-Ile-Glu-His-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：82)，
-Glu-Ile-Glu-Lys-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：83)，
-Glu-Ile-Glu-Met-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：84)，
-Glu-Ile-Glu-Ser-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：85)，
-Glu-Ile-Glu-Thr-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：86)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Ile-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：87)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Pro-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：88)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ala-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：89)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Val-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：90)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Leu-Leu-Asn(SEQ ID NO：91)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Phe-Leu-Asn(SEQ ID NO：92)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Trp-Leu-Asn(SEQ ID NO：93)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Tyr-Leu-Asn(SEQ ID NO：94)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Val-Leu-Asn(SEQ ID NO：95)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Ala(SEQ ID NO：96)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asp(SEQ ID NO：97)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Gln(SEQ ID NO：98)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Glu(SEQ ID NO：99)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Gly(SEQ ID NO：100)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-His(SEQ ID NO：101)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Met(SEQ ID NO：102)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Pro(SEQ ID NO：103)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Ser(SEQ ID NO：104)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Thr(SEQ ID NO：105)和
-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Leu-Ser-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：106)，
所述肽是可以采用如上述定义的方法检测的化合物，其化合物对PIN蛋白质的亲合力大于如上述定义的其中一种蛋白质对PIN蛋白质的亲合力。
这些模拟nNOS的肽是nNOS蛋白质的片段，可采用简单或组合的突变分析方法进行选择，可采用化学合成得到。
用序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4表示的这两种肽，用序列SEQID NO：3表示的肽在位9有一个突变(Arg突变为Trp)，用序列SEQ IDNO：4表示的肽有三个突变(在位1：Lys突变为Ile；在位3：Thr突变为Val；在位9：Arg突变为Trp)。这两种肽抑制PIN蛋白质与nNOS蛋白质的相互作用，用序列SEQ ID NO：3表示的肽，Ki(IC50)(对应于抑制作用百分比为50％时的抑制常数)为4μmol/L；用序列SEQ IDNO：4表示的肽，Ki(IC50)为0.4μmol/L，如在实施例2和3中所证实的。
序列SEQ ID NO：3至序列SEQ ID NO：106对应于突变nNOS蛋白质的片段。
本发明还涉及编码如上述定义的其中一种蛋白质、其中一种蛋白质片段或其中一种肽的核酸。本发明还涉及具有序列SEQ ID NO：1的核苷酸序列。
SEQ ID NO：1是已在鼠中得到鉴定的新核酸序列，编码对应于用序列SEQ ID NO：2表示的神经元NOS胰腺形式的新蛋白质。
本发明涉及药物组合物，其特征在于它含有如上定义的蛋白质、蛋白质片段或肽，和药物可接受的赋形剂。
对于平均体重为60kg的成人，使用的剂量可以是每天约10mg至1g。
本发明还涉及药物组合物，其特征在于它含有所有通过如上所述筛选方法检测的非肽物质，和药物可接受的赋形剂。
本发明还涉及药物组合物，其特征在于它含有下式分子和药物可接受的赋形剂。
本发明还涉及如上定义的蛋白质、蛋白质片段或肽在制备用于改变前期糖尿病、胰岛素过多状态或明显II型糖尿病胰岛素反应治疗的药物中的用途。
对于平均体重为60kg的成人，使用的剂量可以是每天约10mg至1g。
本发明还涉及采用如前面定义的筛选方法检测的所有非肽物质在制备用于改变前期糖尿病、胰岛素过多状态和明显II型糖尿病胰岛素反应治疗的药物中的用途。
本发明还涉及下式分子在制备用于改变前期糖尿病、胰岛素过多状态和明显II型糖尿病胰岛素反应治疗的药物中的用途：
前期糖尿病状的特征在于略微高的基础血糖，为6mM(108mg/dl)-7mM(126mg/dl)。此外，前期糖尿病状的特征还在于葡萄糖不耐受性，即在口服葡萄糖试验两小时后血糖为7.8mM(140mg/dl)-11mM(200mg/dl)。
胰岛素过多症相应于文献中所给出的正常人血浆水平(10μU/ml≈20pmole/L)的1.5-10倍的胰岛素血。
II型糖尿病的特征在于禁食血糖大于或等于7mM(126mg/dl)。II型糖尿病的特征还在于口服葡萄糖耐受试验两小时后血糖高于11mM(200mg/dl)。
如上所提到的，使用上述定义的蛋白质、蛋白质片段、肽或非肽物质得到的药物，可以在前期糖尿病或胰岛素过多的病人中重建正常和双阶段的胰岛素分泌。
术语“双阶段和正常的胰岛素反应”是指胰岛素分泌具有5-10分钟的第一分泌期，和较长的第二分泌期，该第二分泌期中其强度随葡萄糖摄入而变化(约1-2小时)。
如上所提到的使用如上述定义的蛋白质、蛋白质片段、肽或非肽物质得到的药物，可以在II型糖尿病人中重建其量正常的胰岛素分泌。
本发明涉及试剂盒或包(trousse)，该试剂盒或包用于检测调节，尤其降低PIN蛋白质与nNOS复合作用的化合物，其中包括：
-nNOS蛋白质，特别是胰腺形式nNOS蛋白质，
-PIN蛋白质，
-稀释所需的介质或缓冲液，
-任选地洗涤介质，
-介质或缓冲液，其可以在PIN蛋白质和nNOS蛋白质之间生成复合物，和PIN蛋白质或nNOS蛋白质与检测化合物之间生成复合物，
-检测变化的设备，尤其是nNOS蛋白质和PIN蛋白质之间所生成复合物量降低的检测设备。
稀释所需的介质或缓冲液例如是：
-PBS(137mM NaCl；2.7mM KCl；4.3mM Na2HPO4；1.4mMK2HPO4)，
-在PBS中添加0.1％Tween 20和1％BSA(牛血清蛋白)。
合适的洗涤介质是例如添加0.1％Tween 20的PBS。
在PIN蛋白质与nNOS蛋白质之间生成复合物以及在PIN蛋白质或nNOS蛋白质与经检测方法检测的化合物之间生成复合物的介质和缓冲液是例如添加0.1％Tween 20和1％BSA的PBS。
用于检测在PIN蛋白质与nNOS蛋白质之间生成复合物量的变化的方法例如是：
-使用过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗标记抗体(GST或(HIS)6)，
-使用过氧化物酶或碱性磷酸酶标记的抗nNOS抗体，
-使用荧光、生物素酰化或放射性标记的抗标记抗体或(GST或(HIS)6)或抗nNOS抗体，
-使用两种放射性标记或用两种荧光化合物标记的蛋白质，
-使用未标记的nNOS和PIN蛋白质的表面等离子共振。
附图说明
图1显示在鼠胰腺胰岛(lot pancréatique)和INS-1细胞中使用RT-PCR进行的PIN蛋白质表达分析(Asfari等人，1992)。分离全部RNA，通过逆转录合成互补DNA，然后用基于PIN蛋白质序列和β2微球蛋白(β2m)细胞的引物通过PCR扩增，它用作阳性对照。阴性对照在没有互补转录DNA(C)的情况下得到。已知大小(2000、1200、800、400、200和100碱基对)的DNA片段用作分子量(PM)的标记物。
图2显示采用蛋白质转移分析在INS-1细胞中存在PIN蛋白质(Western blot)。从INS-1细胞和鼠脑(Cerv.)中提取的蛋白质在13.5％麦黄酮凝胶上分离，转移至硝基纤维素膜上，然后与单克隆抗PIN抗体温育。信号是使用与过氧化酶偶联的抗小鼠抗体进行检测得到的，随后进行化学发光反应。16和7kDA显示分子量标记物。
图3A和3B显示通过免疫荧光法在INS-1细胞中PIN蛋白质和神经元NO合酶的共定位作用(colocalisation)。使用单克隆抗PIN抗体(图3A)和使用兔的神经元抗NO合酶抗体(图3B)双重标记INS-1细胞。使用荧光素偶联抗兔抗体和罗单明偶联抗小鼠抗体检测荧光，然后使用双道聚焦显微镜(microscope confocal àdoubles canaux)分析其荧光。刻度指示为10μm。
图4A和图4B显示在INS-1细胞中葡萄糖诱导胰岛素分泌的PIN蛋白质过表达的效果。
图4A显示采用RT-PCR分析在INS-1细胞中PIN蛋白质过表达。INS-1细胞用空表达载体(C柱)或含有PIN蛋白质互补DNA(PIN柱)的表达载体转染。分离全部RNA，并采用RT-PCR用基于PIN序列的引物通过PCR扩增互补DNA。已知大小(2000、1200、800、400、200和100碱基对)的DNA片段用作分子量的标记物(PM柱)。
图4B显示与对照细胞(C柱)相比，过表达PIN的INS-1细胞胰岛素分泌分析结果(PIN柱)。转染后48小时，这些细胞在1g/L葡萄糖存在下温育，采用放射免疫测量测定胰岛素分泌。
图5A和图5B显示对应于表面等离子共振分析得到的传感图，所述分析是分析PIN蛋白质与正常nNOS肽(图5A)之间的相互作用，或PIN蛋白质与用序列SEQ ID NO：3表示的突变nNOS肽(图5B)之间的相互作用。这些肽被固定在CM5生物传感器的通道(canal)上(Biacore AB)，以递增的浓度注入源自用凝血酶消化GST-PIN产生的PIN蛋白质：5μg/ml(图5A有规律的虚线曲线4和图5B有规律的虚线曲线d)；10μg/ml(图5A交错虚线曲线3，图5B交错虚线曲线c)；20μg/ml(图5A带点的曲线2，图5B带点的曲线b)；40μg/ml(图5A实线曲线1，图5B实线曲线a)。PIN蛋白质与正常肽(图5A)的键合以及PIN与突变肽的键合(图5B)记录在传感图上，随后可以检测缔合与离解常数。这些传感图给出以RU表示的反应随时间的变化，1RU(共振单位)相应于生物传感器上结合的蛋白质数量为1pg/mm2。
图6A和图6B显示对于不同浓度的用序列SEQ ID NO：3和序列SEQID NO：4表示的正常和突变的肽，GST-PIN蛋白质与nNOS蛋白质键合的抑制作用。将nNOS蛋白质固定在ELISA板上，并与浓度递增的肽预先温育的GST-PIN蛋白质接触。通过过氧化酶偶联抗GST抗体，然后测量在490nm处的吸收率这样可以检测这两种蛋白质之间的相互作用。
图6A显示吸收率随使用肽浓度(以μg/ml表示)的变化。黑色圆球的曲线相应于正常肽，黑色正方块的曲线相应于用序列SEQ ID NO：3表示的肽，黑色菱形块的曲线相应于用序列SEQ ID NO：4表示的肽。
图6B显示PIN蛋白质与nNOS键合的抑制作用百分比随肽浓度(以μM表示)的变化。黑色圆球的曲线相应于正常肽，黑色正方块的曲线相应于同序列SEQ ID NO：3表示的肽，黑色菱形块的曲线相应于用序列SEQ ID NO：4表示的肽。
图7A、7B、7C和7D表示采用表面等离子体方法分析正常nNOS肽(图7A)或用SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4表示的突变nNOS肽(图7B和7C)抑制PIN蛋白质与nNOS肽之间相互作用所对应的传感图。图7A、7B和7C给出其反应(以RU表示)随时间的变化，其反应相应于生物传感器上结合蛋白质的量。
图7A显示正常肽(Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp)对PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合的抑制作用。曲线1为没有肽的情况；曲线2、3和4分别为正常肽浓度为20μg/ml、50μg/ml和100μg/ml的情况。
图7B显示用序列SEQ ID NO：3表示的突变肽对PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合的抑制作用。曲线a为没有所述肽的情况；曲线b、c、d、e和f分别为所述肽浓度为5μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml和40μg/ml。
图7C显示用序列SEQ ID NO：4表示的突变肽对PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合的抑制作用。曲线1为没有所述肽的情况；曲线2、3、4、5和6分别为所述肽浓度为1μg/ml、2μg/ml、3μg/ml、5μg/ml和10μg/ml。
图7D显示用序列SEQ ID NO：3(曲线a，圆球)和SEQ ID NO：4(曲线b，正方块)表示的突变肽对PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合的抑制作用曲线。该图显示了PIN蛋白质与nNOS蛋白质肽键合抑制作用百分数随突变肽浓度(以μM表示)的变化。
图8显示在递增浓度的分子C24H18N4O5S存在下，与没有所述分子的存在下得到的胰岛素分泌相比，Zucker fa/fa鼠胰岛的胰岛素分泌的分析结果。分离后，首先在0.75g/L葡萄糖存在下稳定鼠胰岛，然后在有或没有所述分子存在下，在刺激浓度为2g/L的葡萄糖存在下分三组温育。然后采用放射免疫测定测量胰岛素的分泌。
在图8中，显示胰岛素的分泌(以ng/ml表示)随所述分子浓度的变化。黑色柱为对照测量结果(没有所述分子)；灰色柱相应于在所述分子浓度为20μM存在下的测量结果；白色柱相应于在所述分子浓度为50μM存在下的测量结果；垂直阴影线柱相应于在所述分子浓度为100μM存在下的测量结果。与对照组相比(重复数n＝5)，P＜0.05(*)P＜0.001(***)表示显著性。
原料与方法
存在于胰腺β-细胞中的神经元一氧化氮合酶对碘氧基苯甲醚(isoforme)互补转录DNA排序
互补转录DNA互锁片段(fragment chevanchant d’ANDcomplémentaire)(450-650碱基对)是采用RT-PCR由Langerhans鼠胰岛和胰岛素分泌细胞系INS-1得到(Asfari et al.，1992)。通过胶原酶消化作用从雄性Wistar鼠胰腺分离该胰岛，并通过菲柯尔梯度(gradient de Ficoll)从外分泌组织分离(Ahibata等人，1976)。INS-1细胞来自鼠胰岛素瘤(insulinome)，而且在RPMI1640中温育，该RPMI1640含有10％胎牛血清、100 U/ml青霉素、100μg/ml链霉素、2mM L-谷酰胺、10mM Hepes、1mM丙酮酸钠和50μM β-巯基乙醇。使用TRIzol(Life technologies)提取分离胰岛和INS-1细胞的全部RNA。互补转录DNA的第一条链(brin)是在3μg无规引物(amorces aléatoires)(Life technologies)、1μg Oligo引物(dT)(Life technologies)和Superscript II Rnase H-逆转录酶(Life technologies)存在下由10μg全部RNA合成得到(Lifetechnologies)。在Taq聚合酶(Life technologies)存在下使用下表所列的引物对进行PCR。
用于胰腺形式神经元一氧化氮合酶序列的有义和反义引物表
    有义     反义
    5’ATGGAAGAGAACACGTTTGGGGTT 3’   5’TTAGCTTGGGAGACTGAGCCAGCT 3’
    5’CCAGTCATTAGCAGTAGACAGAGT 3’   5’CATCTTCTGGCTTCCGCGTGTGCT 3’
    5’TCCTCAAGGTCAAGAACTGGGAGA 3’   5’AGGTCCTTAAACCAGTCGAACTTG 3’
    5’ATCCAGCCAATGTGCAGTTCACGG 3’   5’GTTCCATGGATCAGGCTGGTATTC 3’
    5’CCTGTCTTCCACCAGGAGATGCTC 3’   5’TCCCAGTTCCTCCAGGAGGGTGTC 3’
    5’CCCTGGCCAATGTGAGGTTCTCAG 3’   5’GCATTCACGAGGTCCTCGTGGTTG 3’
    5’TTCGTGCGTCTCCACACCAACGGG 3’   5’TATTCTGTTGAGCCAGGAGGAGCA 3’
    5’GGTGCACCTCACTGTGGCCATCGT 3’   5’TTAGGAGCTGAAAACCTCATCTGC 3’
在94℃下5分钟开始变性后，运行40周期PCR，其中包括以下步骤：在94℃下变性步骤持续1分钟，在60℃下杂交步骤持续1分钟，在72℃下延伸步骤持续1分钟，然后最后的延伸步骤持续10分钟。
迁移至1.5％琼脂糖凝胶后，使用QiaEx II提取试剂盒(Qiagen)纯化互补转录DNA片段。然后，使用dCTP[αS35]和Thermo SequenaseCycle Sequencing试剂盒(Amersham)对这些片段手工排序两次，使用自动测序仪(ABI PRISM 377，PE Applied生物系统)和dRhodamineTerminator Sequencing Ready Reaction试剂盒(PE Applied生物系统)排序一次。正如SEQ ID NO：2所表明，已鉴定在胰腺形式神经元一氧化氮合酶序列中具有四个点突变，这意味着99.8％与鼠脑序列同源。这些突变中的三个突变修饰氨基酸序列：在位269缬氨酸突变为异亮氨酸；在位953丙氨酸突变为脯氨酸；以及在位1008丝氨酸突变为苯丙氨酸。因此，胰腺神经元NO合酶与先前在鼠脑中所鉴定的神经元NO合酶具有轻微差别(Bredt et al.，1991)。
在内分泌胰腺β-细胞中存在PIN蛋白质信使RNA
为了证实在内分泌胰腺β-细胞中存在的神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)信使RNA(Jaffrey等人，1996)，Langerhans鼠胰岛和胰岛素分泌细胞系INS-1被用作胰腺β-细胞源。使用TRIzol(Life technologies)提取分离胰岛的全部RNA和INS-1细胞。互补转录DNA的第一股是在3μg无规引物(Life technologies)、1μg Oligo引物(dT)(Life technologies)和Superscript II RnaseH-逆转录酶(Life technologies)存在下由10μg全部RNA合成得到的。然后在Taq聚合酶(Life technologies)存在下使用下述引物对进行PCR：
对于PIN：-  5’TTGAGCGGCGCCAGCACCTTCCCT3’和
         -  5’CGAGGTGTTCCCTTAGCAAGGCTG3’
对于β2-微球蛋白：  -5’ATCTTTCTGGTGCTTGTCTC3’和
                    -5’AGTGTGAGCCAGGATGTAG3’
在94℃下开始5分钟变性后，PCR运行40个周期，其中包括在94℃下变性步骤持续1分钟，在60℃下杂交步骤持续1分钟，在72℃下延伸步骤持续1分钟，然后最后的延伸步骤持续10分钟。然后，在1.5％琼胶糖凝胶上分离PCR产物，并采用溴化乙锭染色法进行目测。在胰腺胰岛和INS-1细胞中同时使用PIN引物得到预期大小(443个碱基对)的片段(参看图1)。因此，RT-PCR分析证实了在鼠胰腺β-细胞中存在PIN的信使RNA。因此，证实了在内分泌胰腺胰岛素分泌细胞中神经元NO合酶以及PIN自然抑制剂的同时表达。PIN互补转录DNA被排序，并观察到它与源自鼠脑的PIN序列完全同源(Jaffrey等人，1996)。
在INS-1细胞中存在PIN蛋白质
在溶胞缓冲液中使INS-1细胞和鼠脑匀化，该溶胞缓冲液含有50mM三羧甲基氨基甲烷(Tris)(pH为7.4)、150mM NaCl、2mmol/LEDTA、1mmol/L苯基甲基磺酰基氟、10μg/ml亮抑蛋白酶肽和10μg/ml抑肽酶。通过离心去除不溶物质。通过考马斯蓝染色法(Bleu deCoomassie)(考马斯蛋白质试剂，Pierce)测定上清液中的蛋白质浓度。通过电泳在13.5％两性离子缓冲凝胶上分离80μg蛋白质，并转移至硝基纤维素膜。首先，使用在添加0.1％Tween 20的PBS中5％脱脂乳粉饱和这些膜，然后使用单克隆抗-PIN抗体(稀释1∶250，Transduction Laboraories)温育过夜。在PBS-Tween中洗涤3次后，最后该膜与过氧化物酶偶联抗小鼠抗体(稀释1；5000，SigmaAldrich)一起温育。通过化学发光试验测定免疫反应性(ECL，Amersham Life Science)。蛋白质印迹(Western blot)分析证实PIN的存在，该PIN蛋白质的大小与在鼠脑中表达的PIN蛋白质是相同的(参看图2)。
在INS-1细胞中PIN蛋白质与神经元NO合酶共定位
将INS-1细胞植入Lab-Tek载玻片系统(systèms delameLab-Tek)中，并在使用前培养4天。然后使用在PBS中2％仲甲醛(磷酸酸缓冲溶液)固定20分钟，并使用0.1％Triton X-100浸渍5分钟。在用2％BSA(牛血清白蛋白)饱和非特异性位点后，使用单克隆抗-PIN抗体(稀释1∶100，Transduction Laboraories)和兔神经元抗-NO合酶抗体(稀释1∶100，Euro-Diagnostica)温育这些细胞过夜。在洗涤几次后，使用荧光素-偶联抗小鼠抗体(稀释1∶100，Biosys)和罗丹明-偶联抗兔抗体(稀释1∶100，Biosys)作用于细胞1小时。在洗涤几次后，将这些细胞放置于Citifluor(CitifluorLtd.)中，并用氩和氪激光器(Biored)共焦显微镜进行观察。PIN蛋白质存在于INS-1细胞的细胞质中(图3A)。此外，PIN的荧光信号(图3A)和神经元NO合酶的荧光信号(图3B)是严重重叠的，这表明这两种蛋白质被牢固地共定位于鼠胰腺β-细胞中。实际上，已证实在生物体外和体内，在163-245位氨基酸，PIN蛋白质与神经NO合酶相互作用(Jaffrey et al.1996)。从而看来神经元NO合酶和PIN在胰腺β-细胞内部相互作用。
在INS-1细胞系中用葡萄糖诱导胰岛素分泌的PIN的调节剂作用
在INS-1细胞中过表达PIN蛋白质，并测定胰岛素对葡萄糖的反应。在真核细胞表达媒介物pCR 3.1中克隆在RT-PCR(见上述内容)后得到的PIN互补转录DNA(TA克隆试剂盒，Invitrogen)。然后以1.5μg(空的或含有PIN的)质粒使用Lipofectamine plus Reagent试剂(Life Technologies)转染INS-细胞(约8.105)。然后采用RT-PCR使用5μg全部RNA和上述所列的引物(参看表1)验证PIN的过度表达。转染48小时后，在没有葡萄糖的含碳酸氢盐的Krebs-Ringer缓冲液(pH为7.4)(108mM NaCl、1.19mM KH2PO4、4.74mM KCl、2.54mM CaCl2、1.19mM MgSO4·7H2O和18mM NaHCO3)中洗涤这些细胞，然后在37℃下在相同的缓冲液中预温育1小时。除去介质后，将这些细胞在37℃下在含有1g/L葡萄糖的Krebs中温育1小时。然后回收上清液，并通过放射免疫测定法测定胰岛素的分泌(Herbert等人，1965)。与对照细胞相比，PIN媒介物转染后，在细胞中存在多约5倍的PIN信使RNA(参看图4A)。此外，与对照细胞相比，在过表达PIN的细胞中，葡萄糖诱发的胰岛素分泌增加25％(参看图4B)。因此看来PIN在葡萄糖-诱发胰岛素分泌中起着积极的调节作用。
筛选试验实施
为了产生PIN蛋白质，在媒介物pET21b(在C-端位含有多组氨酸标记，(HIS)6，如由Novagen提供)和媒介物pGEX-2T(在N-端位含有谷胱甘肽s-转移酶标记，GST，如由Pharmacia提供)中克隆在RT-PCR(见下述实施例1)后得到的PIN互补转录DNA。在通过重组质粒转变BL21细菌(DE3)(如由Novagen提供)后，该细菌在37℃下在LB介质中培养至OD为0.6。然后在30℃下用1mM IPTG(异丙基硫基-β-D-半乳糖苷)诱导5小时后产生蛋白质。离心回收该细菌，然后在标准条件下将其溶解(Short Protocols in Molecular Biology，2nd Edition，John Wiley and Son)。离心除去不溶物质，并按照提供者的建议，多组氨酸标记(如Ni NTA琼脂糖，Qiagen提供)使用nickel柱，GST标记(如Pharmacia提供)使用谷胱甘肽琼脂糖凝胶柱纯化蛋白质。然后PIN蛋白质存储在-80℃下。
为了得到胰腺nNOS蛋白质，在病毒启动子P10控制下，在媒介物p119L中克隆含有多组氨酸标记的胰腺nNOS互补转录DNA(Poul等人1995)。采用脂转染技术(DOTAP，Roche Diagnostics)，在Sf9昆虫细胞(ATCC CRL 1711)中，共转染负荷媒介物和杆状病毒得到重组病毒。然后采用溶胞噬菌斑方法分离的病毒克隆，选择它们用抗nNOS抗体(Transduction Laboraories)，通过转移蛋白质(Western Blot)产生nNOS蛋白质的能力。最后按照提供者的建议，在nickel柱(如，Ni NTA琼脂糖，Qiagen提供)上纯化蛋白质。然后，将nNOS蛋白质存储在-80℃下。
根据本发明的第一种实施方式，在4℃下以在200μl PBS中1-5μg/ml的浓度，胰腺nNOS固定在塑料MaxiSorp板(Nunc)底部一夜。在含有0.1％Tween20的PBS中洗涤后，在37℃下使用100μl PBS/1％BSA饱和该板1小时，然后在存在或不存在待试验化合物的情况下，在37℃下以在100μl PBS/0.1％Tween20-1％BSA中0.1-10μg/ml的浓度，与含有GST(GST-PIN)-或多组氨酸(PIN-(HIS)6)标记的PIN蛋白质温育2小时。然后洗涤该板，再在37℃下与100μl抗标记抗体、抗GST或过氧化物酶-偶联抗(HIS)6(在PBS/0.1％Tween20-1％BSA中稀释1∶2000，Sigma Aldrich)温育1小时。在黑暗中，在过氧化物酶底物，即邻-苯二胺的存在下，通过30分钟的显色反应测定nNOS-PIN-抗体复合物的生成，在490nm处测量颜色的强度。
根据本发明第二种实施方式，将呈GST-PIN或PIN-(HIS)6形式的PIN蛋白质固定在塑料板底部，然后与胰腺nNOS接触。然后使用过氧化物酶-偶联抗nNOS抗体测定反应活性。
实施例1
此实施例证实采用表面等离子共振分析，用序列SEQ ID NO：3表示的nNOS突变肽与nNOS未突变的同样肽(Lys Asp Thr Gly Tie GinVal Asp Arg Asp)相比，对PIN具有较好的亲合力。
通过在固相上Fmoc化学合成(Gausephol，1992)，用AMS 422自动装置(robot AMS422)(Abimed)制备nNOS的可溶肽。这些具有10个氨基酸的nNOS肽对应于与PIN相互作用的区域(nNOS的229-238位氨基酸)。然后，这些肽去保护，并采用合适的传感器用三氟乙酸处理除去其树脂。这些肽经冻干，用分析HPLC检验它们的纯度。如果需要，随后采用制备HPLC纯化这些肽至90％，然后采用质谱进行分析。
采用BIACORE 2000(Biacore AB)分析PIN与固定肽的键合。采用NHS/EDC方案(N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)，Biacore AB；N-乙基-N’-(二甲基氨基丙基)碳化二亚胺(EDC)，Biacore AB)将这些在10mM(pH为4)乙酸缓冲液中浓度为10μg/ml-的肽偶联在CM5生物传感器(Biacore AB)的通道上，这样得到固定肽密度约100pg/mm2。由GST-PIN(Pharmacia)与凝血酶(Pharmacia)消化作用产生的浓度递增的PIN蛋白质(5，10，20和40μg/ml)以30μl/min流速注入生物传感器中，并记录相应于PIN-肽键合的传感图，其缔合时间为180秒，离解时间为400秒。利用BIA评估3.0软件(Biacore AB)和所谓的全程分析法(méthode d’analyse dite globale)(同时分析相应于全部使用PIN浓度的传感图的动力学缔合和离解常数)由传感图确定缔合和离解常数。作为对照，几种肽(Lys Ala Val Asp LeuSer His Gln Pro Ser Ala Ser Lys Asp Gln Ser Leu)是nNOS片段(nNOS蛋白质的131位氨基酸至147位氨基酸)，但是不对应于PIN蛋白质与nNOS蛋白质之间相互作用区域，这样的肽以相同的方式固定并以相同浓度加入至PIN中。
PIN蛋白质对用序列SEQ ID NO：3表示的突变肽(参看图5B，Ka＝1.86×108；Kd＝5.38×10-9)的亲合力为正常肽(参看图5A，Ka＝8.43×107；Kd＝1.19×10-8)的2倍。在nNOS肽中引入突变(SEQ IDNO：3，在位9精氨酸突变为色氨酸)增加对于PIN蛋白质的亲合力。
实施例2
此实施例可证实使用上述本发明的第一种实施方式用序列SEQ IDNO：3和SEQ ID NO：4表示的突变肽，能够减小nNOS蛋白质与PIN蛋白质的相互作用，其中该突变肽对PIN蛋白质的亲合力高于nNOS蛋白质。
4℃下，nNOS在100μl PBS中以浓度为1μg/1ml被固定在ELISAMaxisorp板(Nunc)上过夜。在含有0.1％Tween 20的PBS中洗涤后，在37℃下使用100μl PBS-1％BSA饱和该板1小时。在相同缓冲液中，在37℃下在100μl PBS-0.1％Tween20-1％BSA中0.5μg/mlGST-PIN蛋白质预先与递增浓度(突变肽为0.01-100μg/ml；非突变肽为10-1000μg/ml)的几种肽(如上定义的)、正常肽(Lys Asp ThrGly lIe Gln Val Asp Arg Asp)或突变肽(SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4)温育1小时。在板上温育肽和PIN蛋白质混合物2小时。洗涤该板，然后在37℃下与100μl过氧化物酶-偶联抗GST抗体(在PBS-0.1％Tween20-1％BSA中稀释1∶2000，Sigma Aldrich)温育1小时。在过氧化物酶底物即邻-苯二胺存在下，在黑暗中通过20分钟显色反应，以证实PIN和nNOS之间复合物的形成在490nm处测量着色强度。使用如上述定义的几种肽进行对照。
在正常nNOS肽(参看图6A)存在下，对于所述肽浓度为50μg/ml，抑制PIN蛋白质与nNOS蛋白质键合达到14％。相反，对于50μg/ml的浓度，用序列SEQ ID NO：3和SEQ ID NO：4表示的两种突变肽导致PIN与nNOS键合的抑制作用达到71％(用SEQ ID NO：3表示的肽)和78％(用SEQ ID NO：4表示的肽)。
根据PIN与nNOS蛋白质键合的抑制作用曲线(参看图6B)，用序列SEQ ID NO：3表示的肽的抑制作用常数(Ki：IC50)为5μM，用序列SEQ ID NO：4表示的肽的抑制作用常数为0.5μM，而正常肽抑制这种相互肽作用的抑制常数仅为300μM。
实施例3
此实施例使用表面等离子共振分析可以证实，用序列SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：4表示的nNOS突变肽，该突变肽对nNOS蛋白质的亲合力高于PIN蛋白质，可以抑制nNOS蛋白质与PIN蛋白质之间的相互作用。
采用Biacore 2000(Biacore AB)在合成肽存在或不存在下分析PIN与固定的nNOS蛋白质(Alexis)的键合。采用NHS/EDC方案，将在10mM(pH为5.5)乙酸缓冲液中浓度为10μg/ml的nNOS蛋白质偶联(couplée)在CM5生物传感器的通道上(如Biacore AB)，这样得到固定蛋白质密度为约6000pg/mm2。浓度为5μg/ml的PIN蛋白质在浓度递增的肽(1-100μg/ml)存在下预温育30分钟，然后以30μl/min流速注射至切片上。记录肽与nNOS蛋白质键合的传感图，缔合时间180秒，离解时间400秒。采用BIA评估3.0软件(BiacoreAB)和所谓全程分析法(同时对于分析相应于整个使用肽浓度的传感图的动力学缔合和离解常数)由传感图确定缔合和离解常数。将一些与PIN预温育的肽注射到nNOS上进行对照。
在正常nNOS肽存在下(参看图7A)，肽浓度为20μg/ml时，抑制PIN与nNOS蛋白质键合达到19％，肽浓度为50μg/ml和100μg/ml时，抑制作用达到极限45％。相反，用序列SEQ ID NO：3表示的突变肽(参看图7B)在肽浓度为5μg/ml时抑制PIN与nNOS蛋白质键合达59％，而肽浓度为30μg/ml和40μg/ml时几乎完全阻断其相互作用(分别为90％和91％)。用序列SEQ ID NO：4表示的突变肽(参看图7C)同样如此，在肽浓度为1μg/ml时抑制PIN与nNOS蛋白质键合达75％，而肽浓度为10μg/ml时完全抑制其相互作用(达98％)。根据PIN与nNOS键合抑制作用随所使用的肽浓度变化的曲线(图7D)，用序列SEQ ID NO：3表示的肽所具有的抑制常数(Ki：IC50)为4μM，用序列SEQ ID NO：4表示的肽的抑制常数为0.4μM。因此，两种突变肽可以抑制PIN和nNOS蛋白质之间的相互作用。
实施例4
此实施例可证实，根据上述本发明的方法在生物体外筛选3000化学化合物库(Chembridge)所得到的化学式C24H18N4O5S分子，该分子可以降低胰岛素过多症和胰岛素抗性的肥胖动物中的胰岛素分泌(Zucker fa/fa鼠：鼠的细胞系具有称为fa的基因突变(“fatty”的简写))。
所使用的化学分子具有如下式：
Figure A0281225200381
根据上述方法得到的重组nNOS(100ng)在4℃，在100μl PBS中浓度为1μg/ml下被吸收于微温育板底部过夜。在37℃下在200μl1％PBS-1％BSA中饱和该板1小时，然后在37℃下，nNOS与5μl该分子(最终浓度为10μM)和0.5μg/ml GST-PIN蛋白质混合2小时。在37℃下与抗-GST抗体(稀释1/2000)温育1小时以测定PIN-nNOS复合物的生成，然后通过与邻苯二胺温育30分钟进行显色，并在490nm处读数。认为是阳性的这些分子是导致抑制该相互作用约达30-50％的分子。
根据Lacy等人的技术，(Diabetes，1967)，用胶原酶消化后术分离Zucker fa/fa鼠Langerhans的胰岛。分离后，在37℃下该胰岛在包含有0.75g/L葡萄糖的Krebs-Ringer中稳定化45分钟。然后在37℃下在含有递增浓度分子C24H18N4O5S(20-100μM)的2g/L葡萄糖Krebs-Ringer中温育多组胰岛，每组为三种，温育1小时。然后回收液体上清液，并采用放射免疫学技术(参看图8)测量胰岛素分泌。
降低PIN-nNOS相互作用的式C24H18N4O5S分子式以与剂量相应的方式(起始浓度为50μM)阻断在从胰岛素过多症鼠分离的胰岛中用2g/L葡萄糖所诱发的胰岛素分泌。实际上，浓度分别为50和100μM时，胰岛素反应分别降低36％和79％。
因此，该化学分子可以降低在这些糖尿病前期动物中的胰岛素过度分泌。
                          参考文献
-Asfari et al.(1992)内分泌学，130，167-178，
-Bredt et al.(1991)自然，351，714-718，
-Gausephol(1992)肽研究(Peptide Research)，5，315-320，
-Herbert et al.(1965)J.Clin.Endorinol.Metabol 25，1375-1384，
-Jaffrey et al.(1996)科学(Science)，274，774-776，
-Lacy et al.(1967)糖尿病(Diabetes)，16(1)，35-39，
-Maechier et al.(1997)Embo J，16n°3，3833-3841，
-Poul et al.(1995)免疫技术(Immunotechnology)，1，189-196，
-Shibata et al.(1976)糖尿病(Diabetes)，8，667-672，
-Short Protocols in Molecular Biology，2ndEdition，JohnWiley and Son.
                序列表
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<120>神经元一氧化氮合酶蛋白质与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白
     质键合抑制剂筛选新方法
<130>WOB 00 BD CNR IABE
<140>
<141>
<150>FR 01 05248
<151>2001-04-18
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<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>4290
<212>ADN
<213>黑家鼠
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(4287)
<223>
<400>1
atg gaa gag aac acg ttt ggg gtt cag cag atc caa ccc aat gta att        48
Met Glu Glu Asn Thr Phe Gly Val Gln Gln Ile Gln Pro Asn Val Ile
1               5                   10                  15
tct gtt cgt ctc ttc aaa cgc aaa gtg gga ggt ctg ggc ttc ctg gtg        96
Ser Val Arg Leu Phe Lys Arg Lys Val Gly Gly Leu Gly Phe Leu Val
            20                  25                  30
aag gaa cgg gtc agc aag cct ccc gtg atc atc tca gac ctg att cga       144
Lys Glu Arg Val Ser Lys Pro Pro Val Ile Ile Ser Asp Leu Ile Arg
        35                  40                  45
gga ggt gct gcg gag cag agc ggc ctt atc caa gct gga gac atc att       192
Gly Gly Ala Ala Glu Gln Ser Gly Leu Ile Gln Ala Gly Asp Ile Ile
    50                  55                  60
ctc gca gtc aac gat cgg ccc ttg gta gac ctc agc tat gac agt gcc       240
Leu Ala Val Asn Asp Arg Pro Leu Val Asp Leu Ser Tyr Asp Ser Ala
65                  70                  75                  80
ctg gag gtt ctc agg ggc att gcc tct gag acc cac gtg gtc ctc att       288
Leu Glu Val Leu Arg Gly Ile Ala Ser Glu Thr His Val Val Leu Ile
                85                  90                  95
ctg agg ggc cct gag ggc ttc act aca cat ctg gag acc acc ttc aca       336
Leu Arg Gly Pro Glu Gly Phe Thr Thr His Leu Glu Thr Thr Phe Thr
            100                 105                 110
ggg gat gga acc ccc aag acc atc cgg gtg acc cag ccc ctc ggt cct       384
Gly Asp Gly Thr Pro Lys Thr Ile Arg Val Thr Gln Pro Leu Gly Pro
        115                 120                 125
ccc acc aaa gcc gtc gat ctg tct cac cag cct tca gcc agc aaa gac       432
Pro Thr Lys Ala Val Asp Leu Ser His Gln Pro Ser Ala Ser Lys Asp
    130                 135                 140
cag tca tta gca gta gac aga gtc aca ggt ctg ggt aat ggc cct cag       480
Gln Ser Leu Ala Val Asp Arg Val Thr Gly Leu Gly Asn Gly Pro Gln
145                 150                 155                 160
cat gcc caa ggc cat ggg cag gga gct ggc tca gtc tcc caa gct aat       528
His Ala Gln Gly His Gly Gln Gly Ala Gly Ser Val Ser Gln Ala Asn
                165                 170                 175
ggt gtg gcc att gac ccc acg atg aaa agc acc aag gcc aac ctc cag       576
Gly Val Ala Ile Asp Pro Thr Met Lys Ser Thr Lys Ala Asn Leu Gln
            180                 185                 190
gac atc ggg gaa cat gat gaa ctg ctc aaa gag ata gaa cct gtg ctg       624
Asp Ile Gly Glu His Asp Glu Leu Leu Lys Glu Ile Glu Pro Val Leu
        195                 200                 205
agc atc ctc aac agt ggg agc aaa gcc acc aac aga ggg gga cca gcc       672
Ser Ile Leu Asn Ser Gly Ser Lys Ala Thr Asn Arg Gly Gly Pro Ala
    210                 215                 220
aaa gca gag atg aaa gac aca gga atc cag gtg gac aga gac ctc gat       720
Lys Ala Glu Met Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
ggc aaa tcg cac aaa gct ccg ccc ctg ggc ggg gac aat gac cgc gtc       768
Gly Lys Ser His Lys Ala Pro Pro Leu Gly Gly Asp Asn Asp Arg Val
                245                 250                 255
ttc aat gac ctg tgg ggg aag gac aac gtt cct gtg gtc ctt aac aac       816
Phe Asn Asp Leu Trp Gly Lys Asp Asn Val Pro Val Val Leu Asn Asn
            260                 265                 270
ccg tat tca gag aag gaa cag tcc cct acc tcg ggg aaa cag tct ccc       864
Pro Tyr Ser Glu Lys Glu Gln Ser Pro Thr Ser Gly Lys Gln Ser Pro
        275                 280                 285
acc aag aac ggc agc cct tcc agg tgc ccc cgt ttc ctc aag gtc aag       912
Thr Lys Asn Gly Ser Pro Ser Arg Cys Pro Arg Phe Leu Lys Val Lys
    290                 295                 300
aac tgg gag acg gac gtg gtc ctc acc gac acc ctg cac ctg aag agc       960
Asn Trp Glu Thr Asp Val Val Leu Thr Asp Thr Leu His Leu Lys Ser
305                 310                 315                 320
aca ctg gaa acg ggg tgc aca gag cac att tgc atg ggc tcg atc atg      1008
Thr Leu Glu Thr Gly Cys Thr Glu His Ile Cys Met Gly Ser Ile Met
                325                 330                 335
ctg cct tcc cag cac acg cgg aag cca gaa gat gtc cgc aca aag gac      1056
Leu Pro Ser Gln His Thr Arg Lys Pro Glu Asp Val Arg Thr Lys Asp
            340                 345                     350
cag ctc ttc cct cta gcc aaa gaa ttt ctc gac caa tac tac tca tcc      1104
Gln Leu Phe Pro Leu Ala Lys Glu Phe Leu Asp Gln Tyr Tyr Sar Ser
        355                 360                 365
att aag aga ttt ggc tcc aag gcc cac atg gac agg ctg gag gag gtg      1152
Ile Lys Arg Phe Gly Ser Lys Ala His Met Asp Arg Leu Glu Glu Val
    370                 375                 380
aac aag gag att gaa agc acc agc acc tac cag ctc aag gac acc gag      1200
Asn Lys Glu Ile Glu Ser Thr Ser Thr Tyr Gln Leu Lys Asp Thr Glu
385                 390                 395                 400
ctc atc tat ggc gcc aag cat gcc tgg cgg aac gcc tct cga tgt gtg      1248
Leu Ile Tyr Gly Ala Lys His Ala Trp Arg Asn Ala Ser Arg Cys Val
                405                 410                 415
ggc agg atc cag tgg tcc aag ctg cag gtg ttc gat gcc cga gac tgc      1296
Gly Arg Ile Gln Trp Ser Lys Leu Gln Val Phe Asp Ala Arg Asp Cys
            420                 425                 430
acc aca gcc cac ggc atg ttc aac tac atc tgt aac cat gtc aag tat      1344
Thr Thr Ala His Gly Met Phe Asn Tyr Ile Cys Asn His Val Lys Tyr
        435                 440                 445
gcc acc aac aaa ggg aat ctc agg tcg gcc atc acg ata ttc cct cag      1392
Ala Thr Asn Lys Gly Asn Leu Arg Ser Ala Ile Thr Ile Phe Pro Gln
    450                 455                 460
agg act gac ggc aaa cat gac ttc cga gtg tgg aac tcg cag ctc atc      1440
Arg Thr Asp Gly Lys His Asp Phe Arg Val Trp Asn Ser Gln Leu Ile
465                 470                 475                 480
cgc tac gcg ggc tac aag cag cca gat ggc tct acc ttg ggg gat cca      1488
Arg Tyr Ala Gly Tyr Lys Gln Pro Asp Gly Ser Thr Leu Gly Asp Pro
                485                 490                 495
gcc aat gtg cag ttc acg gag atc tgt ata cag cag ggc tgg aaa gcc      1536
Ala Asn Val Gln Phe Thr Glu Ile Cys Ile Gln Gln Gly Trp Lys Ala
            500                 505                 510
cca aga ggc cgc ttc gac gtg ctg cct ctc ctg ctt cag gcc aat ggc      1584
Pro Arg Gly Arg Phe Asp Val Leu Pro Leu Leu Leu Gln Ala Asn Gly
        515                 520                 525
aat gac cct gag ctc ttc cag atc ccc cca gag ctg gtg ctg gaa gtg      1632
Asn Asp Pro Glu Leu Phe Gln Ile Pro Pro Glu Leu Val Leu Glu Val
    530                 535                 540
ccc atc agg cac ccc aag ttc gac tgg ttt aag gac ctg ggg crc aaa      1680
Pro Ile Arg His Pro Lys Phe Asp Trp Phe Lys Asp Leu Gly Leu Lys
545                 550                 555                 560
tgg tat ggc ctc ccc gct gtg tcc aac atg ctg ctg gag atc ggg ggc      1728
Trp Tyr Gly Leu Pro Ala Val Ser Asn Met Leu Leu Glu Ile Gly Gly
                565                 570                 575
ctg gag ttc agc gcc tgt ccc ttc agc ggc tgg tac atg ggc aca gag      1776
Leu Glu Phe Ser Ala Cys Pro Phe Ser Gly Trp Tyr Met Gly Thr Glu
            580                 585                 590
atc ggc gtc cgt gac tac tgt gac aac tct cga tac aac atc ctg gag     1824
Ile Gly Val Arg Asp Tyr Cys Asp Asn Ser Arg Tyr Asn Ile Leu Glu
        595                 600                 605
gaa gta gcc aag aag atg gat ttg gac atg agg aag acc tcg tcc ctc     1872
Glu Val Ala Lys Lys Met Asp Leu Asp Met Arg Lys Thr Ser Ser Leu
    610                 615                 620
tgg aag gac caa gca ctg gtg gag atc aac att gct gtt cta tat agc     1920
Trp Lys Asp Gln Ala Leu Val Glu Ile Asn Ile Ala Val Leu Tyr Ser
625                 630                 635                 640
ttc cag agt gac aag gtg acc atc gtt gac cac cac tct gcc acg gag     1968
Phe Gln Ser Asp Lys Val Thr Ile Val Asp His His Ser Ala Thr Glu
                645                 650                 655
tcc ttc atc aaa cac atg gag aat gaa tac cgc tgc aga ggg ggc tgc     2016
Ser Phe Ile Lys His Met Glu Asn Glu Tyr Arg Cys Arg Gly Gly Cys
            660                 665                 670
ccc gcc gac tgg gtg tgg att gtg cct ccc atg tcg ggc agc atc acc     2064
Pro Ala Asp Trp Val Trp Ile Val Pro Pro Met Ser Gly Ser Ile Thr
        675                 680                 685
cct gtc ttc cac cag gag atg ctc aac tat aga ctc acc ccg tcc ttt     2112
Pro Val Phe His Gln Glu Met Leu Asn Tyr Arg Leu Thr Pro Ser Phe
    690                 695                 700
gaa tac cag cct gat cca tgg aac acc cac gtg tgg aag ggc acc aac     2160
Glu Tyr Gln Pro Asp Pro Trp Asn Thr His Val Trp Lys Gly Thr Asn
705                 710                 715                 720
ggg acc ccc acg aag cgg cga gct atc ggc ttt aag aaa ttg gca gag     2208
Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys Leu Ala Glu
                725                 730                 735
gcc gtc aag ttc tca gcc aag cta atg ggg cag gcc atg gcc aag agg     2256
Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met Ala Lys Arg
            740                 745                 750
gtc aag gcg acc att ctc tac gcc aca gag aca ggc aaa tca caa gcc     2304
Val Lys Ala Thr Ile Leu Tyr Ala Thr Glu Thr Gly Lys Ser Gln Ala
        755                 760                 765
tat gcc aag acc ctg tgt gag atc ttc aag cac gcc ttc gat gcc aag     2352
Tyr Ala Lys Thr Leu Cys Glu Ile Phe Lys His Ala Phe Asp Ala Lys
    770                 775                 780
gca atg tcc atg gag gag tat gac atc gtg cac ctg gag cac gaa gcc     2400
Ala Met Ser Met Glu Glu Tyr Asp Ile Val His Leu Glu His Glu Ala
785                 790                 795                 800
ctg gtc ttg gtg gtc acc agc acc ttt ggc aat gga gac ccc cct gag     2448
Leu Val Leu Val Val Thr Ser Thr Phe Gly Asn Gly Asp Pro Pro Glu
                805                 810                 815
aac ggg gag aaa ttc ggc tgt gct tta atg gag atg agg cac ccc aac     2496
Asn Gly Glu Lys Pha Gly Cys Ala Leu Met Glu Met Arg His Pro Asn
            820                 825                 830
tct gtg cag gag gag aga aag agc tac aag gtc cga ttc aac agc gtc      2544
Ser Val Gln Glu Glu Arg Lys Ser Tyr Lys Val Arg Phe Asn Ser Val
        835                 840                 845
tcc tcc tat tct gac tcc cga aag tca tcg ggc gac gga ccc gac ctc      2592
Ser Ser Tyr Ser Asp Ser Arg Lys Ser Ser Gly Asp Gly Pro Asp Leu
    850                 855                 860
aga gac aac ttt gaa agt act gga ccc ctg gcc aat gtg agg ttc tca      2640
Arg Asp Asn Phe Glu Ser Thr Gly Pro Leu Ala Asn Val Arg Phe Ser
865                 870                 875                 880
gtg ttc ggc ctc ggc tct cgg gcg tac ccc cac ttc tgt gcc ttt ggg      2688
Val Phe Gly Leu Gly Ser Arg Ala Tyr Pro His Phe Cys Ala Phe Gly
                885                 890                 895
cat gcg gtg gac acc ctc ctg gag gaa ctg gga ggg gag agg att ctg      2736
His Ala Val Asp Thr Leu Leu Glu Glu Leu Gly Gly Glu Arg Ile Leu
            900                 905                 910
aag atg agg gag ggg gat gag ctt tgc gga cag gaa gaa gct ttc agg      2784
Lys Met Arg Glu Gly Asp Glu Leu Cys Gly Gln Glu Glu Ala Phe Arg
        915                 920                 925
acc tgg gcc aag aaa gtc ttc aag gca gcc tgt gat gtg ttc tgc gtg      2832
Thr Trp Ala Lys Lys Val Phe Lys Ala Ala Cys Asp Val Phe Cys Val
    930                 935                 940
ggg gat gac gtc aac atc gag aag gcg aac aac tcc ctc att agc aat      2880
Gly Asp Asp Val Asn Ile Glu Lys Ala Asn Asn Ser Leu Ile Ser Asn
945                 950                 955                 960
gac cga agc tgg aag agg aac aag ttc cgc ctc acg tat gtg gcg gaa      2928
Asp Arg Ser Trp Lys Arg Asn Lys Phe Arg Leu Thr Tyr Val Ala Glu
                965                 970                 975
gct cca gat ctg acc caa ggt ctt tcc aat gtt cac aaa aaa cga gtc      2976
Ala Pro Asp Leu Thr Gln Gly Leu Ser Asn Val His Lys Lys Arg Val
            980                 985                 990
tcg gct gct cga ctc ctc agc cgc  caa aac ctg caa agc  cct aag tcc    3024
Ser Ala Ala Arg Leu Leu Ser Arg  Gln Asn Leu Gln Ser  Pro Lys Ser
        995                 1000                 1005
agc cga  tcg acc atc ttc gtg  cgt ctc cac acc aac  ggg aat cag       3069
Ser Arg  Ser Thr Ile Phe Val  Arg Leu His Thr Asn  Gly Asn Gln
    1010                 1015                 1020
gag ctg  cag tac cag cca ggg  gac cac ctg ggt gtc  ttc ccc ggc       3114
Glu Leu  Gln Tyr Gln Pro Gly  Asp His Leu Gly Val  Phe Pro Gly
    1025                 1030                 1035
aac cac  gag gac ctc gtg aat  gca ctc att gaa cgg  ctg gag gat       3159
Asn His  Glu Asp Leu Val Asn  Ala Leu Ile Glu Arg  Leu Glu Asp
    1040                 1045                 1050
gca ccg  cct gcc aac cac gtg  gtg aag gtg gag atg  ctg gag gag       3204
Ala Pro  Pro Ala Asn His Val  Val Lys Val Glu Met  Leu Glu Glu
    1055                 1060                 1065
agg aac  act gct ctg ggt gtc  atc agt aat tgg aag  gat gaa tct       3249
Arg Asn  Thr Ala Leu Gly Val  Ile Ser Asn Trp Lys  Asp Glu Ser
    1070                 1075                 1080
cgc ctc  cca ccc tgc acc atc  ttc cag gcc ttc aag  tac tac ctg       3294
Arg Leu  Pro Pro Cys Thr Ile  Phe Gln Ala Phe Lys  Tyr Tyr Leu
    1085                 1090                 1095
gac atc  acc acg ccg ccc acg  ccc ctg cag ctg cag  cag ttc gcc       3339
Asp Ile  Thr Thr Pro Pro Thr  Pro Leu Gln Leu Gln  Gln Phe Ala
    1100                 1105                 1110
tct ctg  gcc act aat gag aaa  gag aag cag cgg ttg  ctg gtc ctc       3384
Ser Leu  Ala Thr Asn Glu Lys  Glu Lys Gln Arg Leu  Leu Val Leu
    1115                 1120                 1125
agc aag  ggg ctc cag gaa tat  gag gag tgg aag tgg  ggc aag aac       3429
Ser Lys  Gly Leu Gln Glu Tyr  Glu Glu Trp Lys Trp  Gly Lys Asn
    1130                 1135                 1140
ccc aca  atg gtg gag gtg ctg  gag gag ttc ccg tcc  atc cag atg       3474
Pro Thr  Met Val Glu Val Leu  Glu Glu Phe Pro Ser  Ile Gln Met
    1145                 1150                 1155
ccg gct  aca ctt ctc ctc act  cag ctg tcg ctg ctg  cag cct cgc       3519
Pro Ala  Thr Leu Leu Leu Thr  Gln Leu Ser Leu Leu  Gln Pro Arg
    1160                 1165                 1170
tac tac  tcc atc agc tcc tct  cca gac atg tac ccc  gac gag gtg       3564
Tyr Tyr  Ser Ile Ser Ser Ser  Pro Asp Met Tyr Pro  Asp Glu Val
    1175                 1180                 1185
cac ctc  act gtg gcc atc gtc  tcc tac cac acc cga  gac gga gaa       3609
His Leu  Thr Val Ala Ile Val  Ser Tyr His Thr Arg  Asp Gly Glu
    1190                 1195                 1200
gga cca  gtc cac cac ggg gtg  tgc tcc tcc tgg ctc  aac aga ata       3654
Gly Pro  Val His His Gly Val  Cys Ser Ser Trp Leu  Asn Arg Ile
    1205                 1210                 1215
cag gct  gac gat gta gtc ccc  tgc ttc gtg aga ggt  gcc cct agc       3699
Gln Ala  Asp Asp Val Val Pro  Cys Phe Val Arg Gly  Ala Pro Ser
    1220                 1225                 1230
ttc cac  ctg cct cga aac ccc  cag gtg cct tgc atc  ctg gtt ggc       3744
Phe His  Leu Pro Arg Asn Pro  Gln Val Pro Cys Ile  Leu Val Gly
    1235                 1240                 1245
cca ggc  act ggc atc gca ccc  ttc cga agc ttc tgg  caa cag cga       3789
Pro Gly  Thr Gly Ile Ala Pro  Phe Arg Ser Phe Trp  Gln Gln Arg
    1250                 1255                 1260
caa ttt  gac atc caa cac aaa  gga atg aat ccg tgc  ccc atg gtt       3834
Gln Phe  Asp Ile Gln His Lys  Gly Met Asn Pro Cys  Pro Met Val
    1265                 1270                 1275
ctg gtc  ttc ggg tgt cga caa  tcc aag ata gat cat  atc tac aga       3879
Leu Val  Phe Gly Cys Arg Gln  Ser Lys Ile Asp His  Ile Tyr Arg
    1280                 1285                 1290
gag gag  acc ctg cag gct aag  aac aag ggc gtc ttc  aga gag ctg      3924
Glu Glu  Thr Leu Gln Ala Lys  Asn Lys Gly Val Phe  Arg Glu Leu
    1295                 1300                 1305
tac act  gcc tat tcc cgg gaa  ccg gac agg cca aag  aaa tat gta      3969
Tyr Thr  Ala Tyr Ser Arg Glu  Pro Asp Arg Pro Lys  Lys Tyr Val
    1310                 1315                 1320
cag gac  gtg ctg cag gaa cag  ctg gct gag tct gtg  tac cgc gcc      4014
Gln Asp  Val Leu Gln Glu Gln  Leu Ala Glu Ser Val  Tyr Arg Ala
    1325                 1330                 1335
ctg aag  gag caa gga ggc cac  att tat gtc tgt ggg  gac gtt acc      4059
Leu Lys  Glu Gln Gly Gly His  Ile Tyr Val Cys Gly  Asp Val Thr
    1340                 1345                 1350
atg gcc  gcc gat gtc ctc aaa  gcc atc cag cgc ata  atg acc cag      4104
Met Ala  Ala Asp Val Leu Lys  Ala Ile Gln Arg Ile  Met Thr Gln
    1355                 1360                 1365
cag ggg  aaa ctc tca gag gag  gac gct ggt gta ttc  atc sgc agg      4149
Gln Gly  Lys Leu Ser Glu Glu  Asp Ala Gly Val Phe  Ile Ser Arg
    1370                 1375                 1380
ctg agg  gat gac aac cgg tac  cac gag gac atc ttt  gga gtc acc      4194
Leu Arg  Asp Asp Asn Arg Tyr  His Glu Asp Ile Phe  Gly Val Thr
    1385                 1390                 1395
ctc aga  acg tat gaa gtg acc  sac cgc ctt aga tct  gag tcc atc      4239
Leu Arg  Thr Tyr Glu Val Thr  Asn Arg Leu Arg Ser  Glu Ser Ile
    1400                 1405                 1410
gcc ttc  atc gaa gag agc aaa  aaa gac gca gat gag  gtt ttc agc      4284
Ala Phe  Ile Glu Glu Ser Lys  Lys Asp Ala Asp Glu  Val Phe Ser
    1415                 1420                 1425
tcc taa                                                             4290
Ser
<210>2
<211>1429
<212>PRT
<213>黑家鼠
<400>2
Met Glu Glu Asn Thr Phe Gly Val Gln Gln Ile Gln Pro Asn Val Ile
1               5                   10                  15
Ser Val Arg Leu Phe Lys Arg Lys Val Gly Gly Leu Gly Phe Leu Val
            20                  25                  30
Lys Glu Arg Val Ser Lys Pro Pro Val Ile Ile Ser Asp Leu Ile Arg
        35                  40                  45
Gly Gly Ala Ala Glu Gln Ser Gly Leu Ile Gln Ala Gly Asp Ile Ile
    50                  55                  60
Leu Ala Val Asn Asp Arg Pro Leu Val Asp Leu Ser Tyr Asp Ser Ala
65                  70                  75                  80
Leu Glu Val Leu Arg Gly Ile Ala Ser Glu Thr His Val Val Leu Ile
                85                  90                  95
Leu Arg Gly Pro Glu Gly Phe Thr Thr His Leu Glu Thr Thr Phe Thr
            100                 105                 110
Gly Asp Gly Thr Pro Lye Thr Ile Arg Val Thr Gln Pro Leu Gly Pro
        115                 120                 125
Pro Thr Lys Ala Val Asp Leu Ser His Gln Pro Ser Ala Ser Lys Asp
    130                 135                 140
Gln Ser Leu Ala Val Asp Arg Val Thr Gly Leu Gly Asn Gly Pro Gln
145                 150                 155                 160
His Ala Gln Gly His Gly Gln Gly Ala Gly Ser Val Ser Gln Ala Asn
                165                 170                 175
Gly Val Ala Ile Asp Pro Thr Met Lye Ser Thr Lys Ala Asn Leu Gln
            180                 185                 190
Asp Ile Gly Glu His Asp Glu Leu Leu Lys Glu Ile Glu Pro Val Leu
        195                 200                 205
Ser Ile Leu Asn Ser Gly Ser Lys Ala Thr Asn Arg Gly Gly Pro Ala
    210                 215                 220
Lys Ala Glu Met Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp Leu Asp
225                 230                 235                 240
Gly Lys Ser His Lys Ala Pro Pro Leu Gly Gly Asp Asn Asp Arg Val
                245                 250                 255
Phe Asn Asp Leu Trp Gly Lys Asp Asn Val Pro Val Val Leu Asn Asn
            260                 265                 270
Pro Tyr Ser Glu Lys Glu Gln Ser Pro Thr Ser Gly Lys Gln Ser Pro
        275                 280                 285
Thr Lys Asn Gly Ser Pro Ser Arg Cys Pro Arg Phe Leu Lys Val Lys
    290                 295                 300
Asn Trp Glu Thr Asp Val Val Leu Thr Asp Thr Leu His Leu Lys Ser
305                 310                 315                 320
Thr Leu Glu Thr Gly Cys Thr Glu His Ile Cys Met Gly Ser Ile Met
                325                 330                 335
Leu Pro Ser Gln His Thr Arg Lys Pro Glu Asp Val Arg Thr Lys Asp
            340                 345                 350
Gln Leu Phe Pro Leu Ala Lys Glu Phe Leu Asp Gln Tyr Tyr Ser Ser
        355                 360                 365
Ile Lys Arg Phe Gly Ser Lys Ala His Met Asp Arg Leu Glu Glu Val
    370                 375                 380
Asn Lys Glu Ile Glu Ser Thr Ser Thr Tyr Gln Leu Lys Asp Thr Glu
385                 390                 395                 400
Leu Ile Tyr Gly Ala Lys His Ala Trp Arg Asn Ala Ser Arg Cys Val
                405                 410                 415
Gly Arg Ile Gln Trp Ser Lys Leu Gln Val Phe Asp Ala Arg Asp Cys
            420                 425                 430
Thr Thr Ala His Gly Met Phe Asn Tyr Ile Cys Asn His Val Lys Tyr
        435                 440                 445
Ala Thr Asn Lys Gly Asn Leu Arg Ser Ala Ile Thr Ile Phe Pro Gln
    450                 455                 460
Arg Thr Asp Gly Lys His Asp Phe Arg Val Trp Asn Ser Gln Leu Ile
465                 470                 475                 480
Arg Tyr Ala Gly Tyr Lys Gln Pro Asp Gly Ser Thr Leu Gly Asp Pro
                485                 490                 495
Ala Asn Val Gln Phe Thr Glu Ile Cys Ile Gln Gln Gly Trp Lys Ala
            500                 505                 510
Pro Arg Gly Arg Phe Asp Val Leu Pro Leu Leu Leu Gln Ala Asn Gly
        515                 520                 525
Asn Asp Pro Glu Leu Phe Gln Ile Pro Pro Glu Leu Val Leu Glu Val
    530                 535                 540
Pro Ile Arg His Pro Lys Phe Asp Trp Phe Lys Asp Leu Gly Leu Lys
545                 550                 555                 560
Trp Tyr Gly Leu Pro Ala Val Ser Asn Met Leu Leu Glu Ile Gly Gly
                565                 570                 575
Leu Glu Phe Ser Ala Cys Pro Phe Ser Gly Trp Tyr Met Gly Thr Glu
            580                 585                 590
Ile Gly Val Arg Asp Tyr Cys Asp Asn Ser Arg Tyr Asn Ile Leu Glu
        595                 600                 605
Glu Val Ala Lys Lys Met Asp Leu Asp Met Arg Lys Thr Ser Ser Leu
    610                 615                 620
Trp Lys Asp Gln Ala Leu Val Glu Ile Asn Ile Ala Val Leu Tyr Ser
625                 630                 635                 640
Phe Gln Ser Asp Lys Val Thr Ile Val Asp His His Ser Ala Thr Glu
                645                 650                 655
Ser Phe Ile Lys His Met Glu Asn Glu Tyr Arg Cys Arg Gly Gly Cys
            660                 665                 670
Pro Ala Asp Trp Val Trp Ile Val Pro Pro Met Ser Gly Ser Ile Thr
        675                 680                 685
Pro Val Phe His Gln Glu Met Leu Asn Tyr Arg Leu Thr Pro Ser Phe
    690                 695                 700
Glu Tyr Gln Pro Asp Pro Trp Asn Thr His Val Trp Lys Gly Thr Asn
705                 710                 715                 720
Gly Thr Pro Thr Lys Arg Arg Ala Ile Gly Phe Lys Lys Leu Ala Glu
                725                 730                 735
Ala Val Lys Phe Ser Ala Lys Leu Met Gly Gln Ala Met Ala Lys Arg
            740                 745                 750
Val Lys Ala Thr Ile Leu Tyr Ala Thr Glu Thr Gly Lys Ser Gln Ala
        755                 760                 765
Tyr Ala Lys Thr Leu Cys Glu Ile Phe Lys His Ala Phe Asp Ala Lys
    770                 775                 780
Ala Met Ser Met Glu Glu Tyr Asp Ile Val His Leu Glu His Glu Ala
785                 790                 795                 800
Leu Val Leu Val Val Thr Ser Thr Phe Gly Asn Gly Asp Pro Pro Glu
                805                 810                 815
Asn Gly Glu Lys Phe Gly Cys Ala Leu Met Glu Met Arg His Pro Asn
            820                 825                 830
Ser Val Gln Glu Glu Arg Lys Ser Tyr Lys Val Arg Phe Asn Ser Val
        835                 840                 845
Ser Ser Tyr Ser Asp Ser Arg Lys Ser Ser Gly Asp Gly Pro Asp Leu
    850                 855                 860
Arg Asp Asn Phe Glu Ser Thr Gly Pro Leu Ala Asn Val Arg Phe Ser
865                 870                 875                 880
Val Phe Gly Leu Gly Ser Arg Ala Tyr Pro His Phe Cys Ala Phe Gly
                885                 890                 895
His Ala Val Asp Thr Leu Leu Glu Glu Leu Gly Gly Glu Arg Ile Leu
            900                 905                 910
Lys Met Arg Glu Gly Asp Glu Leu Cys Gly Gln Glu Glu Ala Phe Arg
        915                 920                 925
Thr Trp Ala Lys Lys Val Phe Lys Ala Ala Cys Asp Val Phe Cys Val
    930                 935                 940
Gly Asp Asp Val Asn Ile Glu Lys Ala Asn Asn Ser Leu Ile Ser Asn
945                 950                 955                 960
Asp Arg Ser Trp Lys Arg Asn Lys Phe Arg Leu Thr Tyr Val Ala Glu
                965                 970                 975
Ala Pro Asp Leu Thr Gln Gly Leu Ser Asn Val His Lys Lys Arg Val
            980                 985                 990
Ser Ala Ala Arg Leu Leu Ser Arg  Gln Asn Leu Gln Ser  Pro Lys Ser
        995                 1000                 1005
Ser Arg  Ser Thr Ile Phe Val  Arg Leu His Thr Asn  Gly Asn Gln
    1010                 1015                 1020
Glu Leu  Gln Tyr Gln Pro Gly  Asp His Leu Gly Val  Phe Pro Gly
    1025                 1030                 1035
Asn His  Glu Asp Leu Val Asn  Ala Leu Ile Glu Arg  Leu Glu Asp
    1040                 1045                 1050
Ala Pro  Pro Ala Asn His Val  Val Lys Val Glu Met  Leu Glu Glu
    1055                 1060                 1065
Arg Asn  Thr Ala Leu Gly Val  Ile Ser Asn Trp Lys  Asp Glu Ser
    1070                 1075                 1080
Arg Leu  Pro Pro Cys Thr Ile  Phe Gln Ala Phe Lys  Tyr Tyr Leu
    1085                 1090                 1095
Asp Ile  Thr Thr Pro Pro Thr  Pro Leu Gln Leu Gln  Gln Phe Ala
    1100                 1105                 1110
Ser Leu  Ala Thr Asn Glu Lys  Glu Lys Gln Arg Leu  Leu Val Leu
    1115                 1120                 1125
Ser Lys  Gly Leu Gln Glu Tyr  Glu Glu Trp Lys Trp  Gly Lys Asn
    1130                 1135                 1140
Pro Thr  Met Val Glu Val Leu  Glu Glu Phe Pro Ser  Ile Gln Met
    1145                 1150                 1155
Pro Ala  Thr Leu Leu Leu Thr  Gln Leu Ser Leu Leu  Gln Pro Arg
    1160                 1165                 1170
Tyr Tyr  Ser Ile Ser Ser Ser  Pro Asp Met Tyr Pro  Asp Glu Val
    1175                 1180                 1185
His Leu  Thr Val Ala Ile Val  Ser Tyr His Thr Arg  Asp Gly Glu
    1190                 1195                 1200
Gly Pro  Val His His Gly Val  Cys Ser Ser Trp Leu  Asn Arg Ile
    1205                 1210                 1215
Gln Ala  Asp Asp Val Val Pro  Cys Phe Val Arg Gly  Ala Pro Ser
    1220                 1225                 1230
Phe His  Leu Pro Arg Asn Pro  Gln Val Pro Cys Ile  Leu Val Gly
    1235                 1240                 1245
Pro Gly  Thr Gly Ile Ala Pro  Phe Arg Ser Phe Trp  Gln Gln Arg
    1250                 1255                 1260
Gln Phe  Asp Ile Gln His Lys  Gly Met Asn Pro Cys  Pro Met Val
    1265                 1270                 1275
Leu Val  Phe Gly Cys Arg Gln  Ser Lys Ile Asp His  Ile Tyr Arg
    1280                 1285                 1290
Glu Glu  Thr Leu Gln Ala Lys  Asn Lys Gly Val Phe  Arg Glu Leu
    1295                 1300                 1305
Tyr Thr  Ala Tyr Ser Arg Glu  Pro Asp Arg Pro Lys  Lys Tyr Val
    1310                 1315                 1320
Gln Asp  Val Leu Gln Glu Gln  Leu Ala Glu Ser Val  Tyr Arg Ala
    1325                 1330                 1335
Leu Lys  Glu Gln Gly Gly His  Ile Tyr Val Cys Gly  Asp Val Thr
    1340                 1345                 1350
Met Ala  Ala Asp Val Leu Lys  Ala Ile Gln Arg Ile  Met Thr Gln
    1355                 1360                 1365
Gln Gly  Lys Leu Ser Glu Glu  Asp Ala Gly Val Phe  Ile Ser Arg
    1370                 1375                 1380
Leu Arg  Asp Asp Asn Arg Tyr  His Glu Asp Ile Phe  Gly Val Thr
    1385                 1390                 1395
Leu Arg  Thr Tyr Glu Val Thr  Asn Arg Leu Arg Ser  Glu Ser Ile
    1400                 1405                 1410
Ala Phe  Ile Glu Glu Ser Lys  Lys Asp Ala Asp Glu  Val Phe Ser
    1415                 1420                 1425
Ser
<210>3
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>3
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>4
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>4
Ile Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>5
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>5
Cys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>6
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>6
Ile Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>7
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>7
Val Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>8
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>8
Lys Asp Ala Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>9
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>9
Lys Asp Cys Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>10
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>10
Lys Asp Glu Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>11
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>11
Lys Asp Ile Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>12
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>12
Lys Asp Lys Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                  10
<210>13
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>13
Lys Asp Phe Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>14
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>14
Lys Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>15
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>15
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Thr Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>16
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>16
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Cys Arg Asp
1               5                   10
<210>17
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>17
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asn Arg Asp
1               5                   10
<210>18
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>18
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Leu Asp
1               5                   10
<210>19
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>19
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Cys Asp
1               5                   10
<210>20
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>20
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Phe Asp
1               5                   10
<210>21
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>21
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Tyr Asp
1                5                   10
<210>22
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>22
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Phe
1               5                   10
<210>23
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>23
Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Trp
1               5                   10
<210>24
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>24
Val Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Tyr
1               5                   10
<210>25
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>25
Ile Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Trp
1               5                   10
<210>26
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>26
Ile Asp Val Gly Ile Gln Thr Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>27
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>27
Ile Asp Val Gly Ile Gln Thr Asp Trp Trp
1               5                   10
<210>28
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>28
Ile Asp Val Gly Ile Gln Thr Cys Trp Trp
1               5                   10
<210>29
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>29
Cys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
l               5                   10
<210>30
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>30
Ile Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>31
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>31
Val Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>32
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>32
Lys Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>33
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>33
Cys Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>34
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>34
Val Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>35
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>35
Cys Asp Ile Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>36
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>36
Ile Asp Ile Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>37
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>37
Val Asp Ile Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>38
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>38
Lys Asp Phe Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>39
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>39
Cys Asp Phe Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>40
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>40
Ile Asp Phe Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>41
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>41
Val Asp Phe Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>42
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>42
Cys Asp Glu Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>43
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>43
Ile Asp Glu Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>44
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>44
Val Asp Glu Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>45
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>45
Lys Asp Cys Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>46
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>46
Cys Asp Cys Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>47
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>47
Ile Asp Cys Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>48
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>48
Val Asp Cys Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp
1               5                   10
<210>49
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>49
His Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>50
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>50
Ser Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>51
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>51
Thr Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>52
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>52
Lys Glu Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>53
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>53
Lys Asp Ile Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>54
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>54
Lys Asp Glu Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>55
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>55
Lys Asp Gln Gly Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>56
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>56
Lys Asp Val Ala Ile Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>57
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>57
Lys Asp Val Gly Val Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>58
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>58
Lys Asp Val Gly Thr Gln Val Asp Trp Asp
1               5                   10
<210>59
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>59
Lys Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Ile Asp
1               5                   10
<210>60
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>60
Lys Asp Val Gly Ile Gln Val Asp Trp Glu
1               5                   10
<210>61
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>61
Ala Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>62
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>62
Arg Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>63
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>63
Asn Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>64
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>64
Asp Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>65
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>65
Gln Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>66
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>66
Gly Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>67
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>67
Pro Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>68
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>68
Ser Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>69
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>69
Thr Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>70
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>70
Glu Phe Glu Pro Val Leu Ser IIe Leu Asn
1               5                   10
<210>71
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>71
Glu Ile Asn Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>72
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>72
Glu Ile Asp Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>73
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>73
Glu Ile Cys Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>74
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>74
Glu Ile Gln Pro Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>75
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>75
Glu Ile Glu Ala Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>76
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>76
Glu Ile Glu Arg Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>77
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>77
Glu Ile Glu Asn Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>78
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>78
Glu Ile Glu Asp Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>79
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>79
Glu Ile Glu Gln Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>80
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>80
Glu Ile Glu Glu Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>81
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>81
Glu Ile Glu Gly Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>82
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>82
Glu Ile Glu His Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>83
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>83
Glu Ile Glu Lys Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>84
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>84
Glu Ile Glu Met Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>85
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>85
Glu Ile Glu Ser Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>86
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>86
Glu Ile Glu Thr Val Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>87
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>87
Glu Ile Glu Pro Ile Leu Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>88
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>88
Glu Ile Glu Pro Val Pro Ser Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>89
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>89
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ala Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>90
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>90
Glu Ile Glu Pro Val Leu Val Ile Leu Asn
1               5                   10
<210>91
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>91
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Leu Leu Asn
1               5                  10
<210>92
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>92
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Phe Leu Asn
1               5                    10
<210>93
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>93
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Trp Leu Asn
1               5                   10
<210>94
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>94
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Tyr Leu Asn
1               5                   10
<210>95
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>95
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Val Leu Asn
1               5                   10
<210>96
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>96
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Ala
1               5                   10
<210>97
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>97
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Asp
1               5                   10
<210>98
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>98
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Gln
1               5                   10
<210>99
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>99
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Glu
1               5                   10
<210>100
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>100
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Gly
1               5                   10
<210>101
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>101
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu His
1               5                   10
<210>102
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>102
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Met
1               5                   10
<210>103
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>103
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Pro
1                                   10
<210>104
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>104
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Ser
1               5                   10
<210>105
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>105
Glu Ile Glu Pro Val Leu Ser Ile Leu Thr
1               5                   10
<210>106
<211>10
<212>PRT
<213>人工序列
<220>
<223>突变nNOS蛋白质片段
<400>106
Glu Ile Glu Asp Val Leu Ser Phe Leu Gly
1               5                   10

Claims (14)

1.检测化合物的方法，该化合物调节用序列SEQ ID NO：2表示的神经元一氧化氮合酶蛋白质(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)的复合作用，调节该复合作用可导致由nNOS蛋白质或其中一种变体调整的胰岛素反应的改变，其中：
-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤可在一定条件下进行，该条件可以：
·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，
·使上述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物；
-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量的可能显著变化，例如对应于：
*在没有经检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量，或
*没有PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合物，这是由没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质或其中一种变体造成的，或
*在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量；和
-当具有如上所定义的明显变化时，由此可推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体之间是键合的，这样可导致调节PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合作用。
2.根据权利要求1所述的检测方法，其特征在于该化合物基本上不改变nNOS蛋白质或其中一种变体的催化活性。
3.检测化合物的方法，该化合物可降低用序列SEQ ID NO：2表示的神经元一氧化氮合酶(nNOS)或其中一种变体与神经元一氧化氮合酶抑制蛋白质(PIN)之间的复合作用，该复合作用的降低导致由nNOS蛋白质或其中一种变体调整的胰岛素反应的降低，其中：
-含有所述化合物、PIN蛋白质和nNOS蛋白质或其中一种变体的混合物进行温育，其温育步骤可在一定条件下进行，该条件可以：
·使PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物，
·使上述化合物与PIN蛋白质形成复合物，或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物；
-与对照值相比，检测PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物量的可能显著降低，例如对应于：
*在没有经检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量，或
*没有PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合物，这是由没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质或其中一种变体造成的，或
*在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体形成复合物的量；和
-当具有如上所定义的明显降低时，由此可推断出上述化合物与PIN蛋白质或上述化合物与nNOS蛋白质或其中一种变体之间是键合的，这样可导致降低PIN蛋白质与nNOS蛋白质或其中一种变体的复合作用。
4.根据权利要求1-3的任一权利要求所述的检测方法，其中检测其变化，尤其与第一对照值、第二对照值和第三对照值相比，PIN蛋白质与nNOS蛋白质形成复合物的量可能显著降低，其中一个对照值相应于在没有经检测方法检测的化合物存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质形成复合物的量；这些对照值中的另一个对照值相应于没有PIN蛋白质与nNOS蛋白质的复合物，这是由没有PIN蛋白质，或没有nNOS蛋白质造成的；这些对照值中的另一个对照值相应于在参比抑制剂存在下，PIN蛋白质与nNOS蛋白质形成复合物的量。
5.根据权利要求1-4的任一权利要求所述的检测方法，其中含有PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物的混合物可如下制备得到：
-或者同时加入PIN蛋白质、nNOS蛋白质和经检测方法检测的化合物，
-或者依次加入PIN蛋白质、经检测方法检测的化合物和nNOS蛋白质，或依次加入nNOS蛋白质、经检测方法检测的化合物和PIN蛋白质，
-或者加入预先与PIN蛋白质或nNOS蛋白质温育的所述化合物，和分别或者加入nNOS蛋白质或者PIN蛋白质。
6.根据权利要求1-5的任一权利要求所述的检测方法，其中nNOS蛋白质被预先固定在固体支持体上。
7.根据权利要求1-5的任一权利要求所述的检测方法，其中PIN蛋白质被预先固定在固体支持体上。
8.根据权利要求1-5的任一权利要求所述的检测方法，其中PIN蛋白质与nNOS蛋白质是在溶液中。
9.蛋白质，其特征在于它含有序列SEQ ID NO：2或包含至少100个氨基酸的所述蛋白质片段或是由序列SEQ ID NO：2或由包含至少100个氨基酸的所述蛋白质片段组成，其条件是所述片段含有位(269)的氨基酸。
10.具有下述序列的肽：
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：3)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：4)，
-Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：5)，
-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：6)，
-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：7)，
-Lys-Asp-Ala-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：8)，
-Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：9)，
-Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：10)，
-Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：11)，
-Lys-Asp-Lys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：12)，
-Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：13)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：14)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：15)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Cys-Arg-Asp(SEQ ID NO：16)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asn-Arg-Asp(SEQ ID NO：17)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Leu-Asp(SEQ ID NO：18)，
-Lys-Asr-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asr-Cys-Asp(SEQ ID NO：19)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Phe-Asp(SEQ ID NO：20)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Tyr-Asp(SEQ ID NO：21)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Phe(SEQ ID NO：22)，
-Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Trp(SEQ ID NO：23)，
-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Tyr(SEQ ID NO：24)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO：25)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：26)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Trp(SEQ ID NO：27)，
-Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Cys-Trp-Trp(SEQ ID NO：28)，
-Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：29)，
-Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：30)，
-Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：31)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：32)，
-Cys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：33)，
-Val-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：34)，
-Cys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：35)，
-Ile-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：36)，
-Val-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：37)，
-Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：38)，
-Cys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：39)，
-Ile-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：40)，
-Val-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：41)，
-Cys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：42)，
-Ile-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：43)，
-Val-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：44)，
-Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：45)，
-Cys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：46)，
-Ile-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：47)，
-Val-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp(SEQ ID NO：48)，
-His-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：49)，
-Ser-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：50)，
-Thr-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：51)，
-Lys-Glu-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：52)，
-Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：53)，
-Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：54)，
-Lys-Asp-Gln-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：55)，
-Lys-Asp-Val-Ala-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：56)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Val-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：57)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Thr-Gln-Val-Asp-Trp-Asp(SEQ ID NO：58)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Ile-Asp(SEQ ID NO：59)，
-Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Glu(SEQ ID NO：60)，
-Ala-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：61)，
-Arg-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：62)，
-Asn-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：63)，
-Asp-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：64)，
-Gln-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：65)，
-Gly-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：66)，
-Pro-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：67)，
-Ser-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：68)，
-Thr-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：69)，
-Glu-Phe-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：70)，
-Glu-Ile-Asn-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：71)，
-Glu-Ile-Asp-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：72)，
-Glu-Ile-Cys-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：73)，
-Glu-Ile-Gln-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：74)，
-Glu-Ile-Glu-Ala-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：75)，
-Glu-Ile-Glu-Arg-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：76)，
-Glu-Ile-Glu-Asn-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：77)，
-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：78)，
-Glu-Ile-Glu-Gln-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：79)，
-Glu-Ile-Glu-Glu-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：80)，
-Glu-Ile-Glu-Gly-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：81)，
-Glu-Ile-Glu-His-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：82)，
-Glu-Ile-Glu-Lys-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：83)，
-Glu-Ile-Glu-Met-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：84)，
-Glu-Ile-Glu-Ser-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：85)，
-Glu-Ile-Glu-Thr-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：86)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Ile-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：87)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Pro-Ser-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：88)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ala-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：89)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Val-Ile-Leu-Asn(SEQ ID NO：90)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Leu-Leu-Asn(SEQ ID NO：91)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Phe-Leu-Asn(SEQ ID NO：92)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Trp-Leu-Asn(SEQ ID NO：93)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Tyr-Leu-Asn(SEQ ID NO：94)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Val-Leu-Asn(SEQ ID NO：95)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Ala(SEQ ID NO：96)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asp(SEQ ID NO：97)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Gln(SEQ ID NO：98)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Glu(SEQ ID NO：99)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Gly(SEQ ID NO：100)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-His(SEQ ID NO：101)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Met(SEQ ID NO：102)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Pro(SEQ ID NO：103)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Ser(SEQ ID NO：104)，
-Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Thr(SEQ ID NO：105)和
-Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Leu-Ser-Phe-Leu-Gly(SEQ ID NO：106)，
所述肽是如根据权利要求1-8的任一权利要求所述的方法检测的化合物，所述肽对PIN蛋白质的亲合力大于权利要求9所述其中一种蛋白质对PIN蛋白质的亲合力。
11.核酸，该核酸编码权利要求9或10所述的其中一种蛋白质、其中一种蛋白质片段或其中一种肽，所述核酸尤其具有核苷酸序列SEQID NO：1。
12.药物组合物，其特征在于它含有权利要求9所述的蛋白质或蛋白质片段，或符合下式的分子和药物可接受的赋形剂。
13.权利要求9所述的蛋白质或蛋白质片段或符合下式的分子在制备用于治疗前期糖尿病、胰岛素过多状态或明显II型糖尿病状态中胰岛素反应变化的药物中的用途。
Figure A028122520008C1
14.检测化合物的试剂盒或包，该化合物调节，尤其是降低PIN蛋白质与nNOS的复合作用，其中包括：
-nNOS蛋白质，它用序列SEQ ID NO：2表示，
-PIN蛋白质，
-稀释所需的介质或缓冲液，
-任选洗涤设备，
-介质或缓冲液，它们可以使PIN蛋白质与nNOS蛋白质生成复合物，PIN蛋白质或nNOS蛋白质与经检测方法检测的化合物生成复合物，
-检测变化的设备，尤其是检测nNOS蛋白质与PIN蛋白质生成复合物的量降低的设备。
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