FR2823854A1 - Nouveau procede de criblage d'inhibiteurs de la liaison entre la proteine oxyde nitrique synthase neuronale et la proteine inhibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale - Google Patents

Nouveau procede de criblage d'inhibiteurs de la liaison entre la proteine oxyde nitrique synthase neuronale et la proteine inhibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale Download PDF

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Abstract

L'invention concerne un procédé de détection de composés modulant la complexation entre la protéine oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS) ou l'un de ses variants et la protéine inhibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale (PIN), dans lequel :- on incube un mélange comprenant ledit composé, la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, - on détecte la variation significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants par rapport à une valeur de contrôle,- on en déduit, lorsqu'il y a eu variation significative telle que définie ci-dessus, qu'il y a eu liaison entre d'une part le susdit composé et d'autre part la protéine PIN ou la protéine nNOS ou l'un de ses variants, ce qui entraîne la modulation de la complexation entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants.

Description

1 à 17 au contrôle non destructif d'une pièce (10).
1 2823854
,.
NOUVEAU PROCEDE DE CRIBLAGE D'INHIBITEURS DE LA LIAISON
ENTRE LA PROTEINE OXYDE NITRIQUE SYNTHASE NEURONALE ET LA
PROTEINE INHIBITRICE DE L'OXYDE NITRIQUE SYNTHASE
NEURONALE
L' invention concerne un nouveau procédé de criblage d' inhibiteurs de la liaison entre la protéine oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS) et la protéine inhibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale (PIN). L'invention concerne également la forme pancréatique de la protéine nNOS de rat, ainsi que l'acide nacléique codant pour ladite protéine. L' invention concerne également l'utilisation de protéines ou de peptides pour la préparation de médicaments destinés au traitement d'états prédiabétiques ou hyperinsuliniques. La protéine oxyde nitrique synthase (NOS) est l' enzyme qui synthétise du monoxyde d'azote (NO) à partir de son substrat, l'arginine. Cette protéine existe sous trois formes: deux NOS constitutives incluant la NOS endothéliale (eNOS) et la NOS
neuronale (nNOS) ainsi qu'une NOS inductible, induite par les interleukines.
La NOS neuronale a été d'abord identifiée et clonée par D.S. Bredt dans le cerveau de rat en 1991 (Bredt et al., 1991). Au niveau du système nerveux central, elle a un rôle dans le phénomène de mémorisation à long terme (LTP), et au niveau périphérique elle est présente dans les neurones non-adrénergiques et non cholinergiques (NANC) des vaisscaux, de l'intestin, etc. Cependant, dans des situations pathologiques, comme les attaques cérébrales, un excès de production de NO peut avoir un rôle délétère et être responsable de phénomènes de neurotoxicité. Les études actuelles s'orientent plutôt vers la recherche d'inhibiteurs de la nNOS capables de
bloquer les effets toxiques du NO sur la survie neuronale.
S.R. Jaffrey et S.H. Snyder (1996) ont identifié un inhibiteur endogène spécifique de la NOS neuronale: la protéine inhibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale (PIN). Cet inhibiteur interagit avec la NOS neuronale (nNOS) au niveau des acides aminés 163 à 245 de la nNOS et empêche ainsi l'homodimérisation de la nNOS et par là bloque la production de NO. La protéine PIN est donc capable de moduler l'activité de la nNOS et d'empêcher toute surproduction de NO néfaste pour le fonctionnement cellulaire.
2 2823854
i,_ Le brevet américain US 5,908,756 décrit un test de criblage de composés diminnant ou augmentant l'activité catalytique productrice de monoxyde d'azote de la forme neuronale de la NOS (nNOS). En premier lieu, le composé testé est mis en contact avec un mélange de PIN et de deux monomères de nNOS, puis l'activité du composé testé est mesurée par sa capacité à influencer l'homodimérisation des deux monomères de nNOS en compétition avec PIN, qui inUibe cet état dimérique. Ce test consiste donc à rechercher des composés qui modifient l'activité catalytique de la NO
synthase neuronale.
Le diabète de type II ou diabète non insulino-dépendant (DNID) est une maladie hétérogène, d'origine multiLactorielle dont la survenue dépend à la fois de facteurs génétiques mais aussi de facteurs environnementaux tels que l'hygiène alimentaire, la prise de poids excessive, le manque d'exercice ou le tabagisme. Cette maladie, liée au contexte socioéconomique des pays industrialisés, est un problème majeur de santé
publique: on estime à 220 millions le nombre de sujets atteints à l'horizon 2007.
Le diabète de type II est caractérisé par deux défauts majeurs dont l'importance relative est variable: le premier est lié à une baisse de la capacité de l'insuline à augmenter la consommation en glucose des tissus périphériques, c'est-à-dire une insulino-résistance, et le deuxième à un dysfonctionnement sécrétoire de la cellule pancréatique qui rend le pancréas incapable de sécréter suffisamrnent d'insuline pour compenser l'insulino-résistance. Ces deux anomalies sont précédées par une période prodromique silencieuse, appelée prédiabète, de longueur variable, pouvant aller de quelques années à quelques dizaines d'annces. Cet état prédiabétique est caractérisé non pas par un déficit insulinique, mais au contraire, par le développement d'une
hyperactivité sécrétoire résultant en une hyperinsulinémie.
L'hyperinsulinémie est une anomalie très communément associce à l'obésité, qui est un facteur de risque important dans le développement du DNID chez des sujets génétiquement prédisposés, notamment dans certaines populations, comme par exemple les indiens PIMA, o la prévalence de l'obésité et du DNID est très élevée. Si l'hyperinsulinémie se développe fréquemment pour compenser une insulino-résistance, les états d'hyperactivité sécrétoire ou hyperinsulinisme se manifestent également par
des niveaux plasmatiques élevés de proinsuline et de ses intermédiaires de conversion.
Cette sécrétion inapproprice d'insuline non ou mal maturce a été mise en évidence dans la majorité des études sur des sujets présentant une intolérance au glucose, c'est-à-dire sur des sujets prédiabétiques. Cette sécrétion d'insuline non ou mal maturce constitue
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un très mauvais pronostic; en effet, une élévation du rapport proinsuline/insuline est associée au développement d'un DNID et de complications cardio-vasculaires dans les
2 à 5 ans.
La prévalence élevoe du DNID rend indispensable la recherche de médicaments innovants pour offrir aux patients un éventail plus large de thérapeutiques afin de corriger les dysfonctionnements pancréatiques à différents stades de la maladie, et
notamment au stade prédiabétique.
Actuellement, les seuls médicaments utilisés pour corriger le déficit insulinique sont les sulfamides hypoglycémiants et les glinides; ces agents insulino-sécréteurs sont inutilisables pour corriger le dysfonctionnement de la cellule pancréatique chez des
patients prédiabétiques et/ou hyperinsuliniques.
A ce jour, il n'existe donc pas de traitement adapté aux états prédiabétiques et/ou hyperinsuliniques.
Or, l'invention permet notamment d'apporter une solution à ce problème.
L'un des aspects de l'invention est de fournir un nouveau procédé de détection permettant le criblage à haut débit de composés diminuant l'interaction entre les
protéines PIN et nNOS.
L 'un des ankes aspects de l' invention est de fournir un nouveau procédé de détection d' inhibiteurs de l' interaction entre les protéines PIN et nNOS, sans modifier
l'activité catalytique de la NOS neuronale.
L'un des autres aspects de l' invention est de détecter des composés permettant de rétablir une réponse insulinique normale chez des patients prédiabétiques et/ou hyperinsuliniques. L' invention concerne un procédé de détection de composés modulant la complexation entre la protéine oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS) ou l'un de ses variants et la protéine inLibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale (PIN), la modulation de cette complexation entrâînant une modification de la réponse insulinique régulée par la protéine nNOS ou l'un de ses variants, sans modifier substantiellement l'activité catalytique de la protéine nNOS ou de l'un de ses variants, dans lequel: - on incube un mélange comprenant ledit composé, la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, l'étape d'incubation étant effectuée dans des conditions permettant: À la formation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, À la formation d'un complexe entre d'une part le susdit composé et d'autre part la protéine PIN ou la protéine nNOS ou l'un de ses variants, - on détecte la variation significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants par rapport à une valeur de contrôle, correspondant, par exemple: * soit à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants en l'absence du composé soumis au procédé de détection, * soit à l'absence de complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, résultant soit de l'absence de la protéine PIN soit de l'absence de la protéine nNOS ou de l'un de ses variants, * soit à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants en présence d'un inhibiteur de référence, et, - on en déduit, lorsqu'il y a eu variation significative telle que définie ci- dessus, qu'il y a eu liaison entre d'une part le susdit composé et d'autre part la protéine PIN ou la protéine nNOS ou l'un de ses variants, ce qui entrâîne la modulation de la
complexation entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants.
Par "modulation de la complexation entre la protéine oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS) et la protéine inhibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale (PIN)", on désigne: - soit une diminution de la quantité de complexe formé entre la protéine nNOS et la protéine PIN sous l'effet du composé modulant la complexation entre la protéine nNOS et la protéine PIN, cette diminution étant d'au moins environ 20%, et de préférence d'au moins environ 50%, de la quantité dudit complexe par rapport à une valeur de contrôle (100%) correspondant à l'absence de composé testé, - soit une augmentation de la quantité de complexe formé entre la protéine nNOS et la protéine PIN sous l'effet du composé modulant la complexation entre la protéine nNOS et la protéine PIN, cette augmentation étant d'au moins environ 120%, et de préférence d'au moins environ 150%, de la quantité dudit complexe par rapport à
une valeur de contrôle (100%) correspondant à l'absence de composé testé.
Par "la protéine nNOS ou l'un de ses variants", on désigne toutes les NOS neuronales exprimoes dans différents tissus pouvant présenter soit des mutations
ponctuelles, soit un épissage alternatif particulier, soit les deux en même temps.
Par "modification de la réponse insulinique", on désigne soit une diminution de la réponse insulinique sous l'effet du composé modulant la complexation entre la protéine nNOS et la protéine PIN, soit une augmentation de la réponse insulinique sous l'effet du
susdit composé.
La modification de la réponse insulinique induite par le composé modulant la complexation entre la protéine nNOS et la protéine PIN peut être mesurce par des tests cellulaires, et notamment en utilisant la lignée cellulaire INS-1 (Asfari et al., 1992) dans deux types de conditions: - si le composé testé est liposoluble et capable de traverser les membranes cellulaires, les cellules sont stimulées par des concentrations croissantes de glucose (0,5-1-1,5-2 g/l) en présence du composé à tester dans du tampon Krebs Ringer albuminé (Asfari et al., 1992), - si le composé testé n'est pas liposoluble et donc incapable de traverser les membranes cellulaires, les cellules sont perméabilisées en présence de toxine a de Staphylococcus aureus (Maechler et al., 1997) et stimulées avec un composé insulino sécréteur, actif dans ces cellules, en présence ou en absence du susdit composé
(Maechler et al., 1997).
L'expression "sans modifier substantiellement l'activité catalytique de la protéine nNOS ou de l'un de ses variants" désigne la capacité du composé testé à n'influencer
que légèrement l'activité productrice de NO de la nNOS.
Deux cas sont possibles: - une absence de modification de l'activité catalytique si ledit composé se lie uniquement à la protéine PIN, - une absence de modification ou une augmentation ou une diminution ne dépassant pas 20 à 30 /O de l'activité catalytique basale de la nNOS, correspondant à
l'absence dadit composé, si ledit composé se lie à la nNOS.
L'activité catalytique de la nNOS peut être estimée, par exemple, par sa capacité à produire de la citrulline radiomarquée à partir de son substrat: l'arginine radiomarquée
et en présence de cofacteurs tels que BH4, FAD, FMN, NADPH, Ca2+ et la calmoduline.
La citrulline produite peut être séparce de l'arginine par chromatographie échangeuse
d'ions et quantifiée par comptage de la radioactivité.
Par "variation significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants", on désigne soit une augmentation, soit une diminution d' au moins 20% de la quantité de complexe formé sous l'action du composé testé et de préférence de 50% par rapport à une valeur
contrôle correspondant à l'absence de composé testé.
Pour quantifier le taux de complexation entre la protéine PIN et la protéine nNOS, on utilise un procédé de détection impliquant le marquage moléculaire d' au moins un des partenaires, à savoir la protéine PIN et/ou la protéine nNOS, par une substance, telle qu'un élément radioactif, un élément fluorescent, un élément luminescent, une enzyme ou de la biotine. Ce marquage permet une mesure physique quantitative directe ou indirecte, par émission (rayonnement radioactif, luminescent ou fluorescent) ou consommation de signal (absorption de signal lumineux ou fluorescent), spontanément ou après addition d'un substrat enzymatique ou excitation lumineuse. Pour quantifier le taux de complexation entre les protéines PIN et nNOS, on peut également utiliser la technique de résonance plasmonique de surface (par exemple, Biacore AB) qui n'implique pas le marquage de l'un des deux partenaires, à condition que la protéine PIN ou la protéine nNOS soit immobilisce sur un canal du biocapteur. Pour quantifier le taux de complexation entre les protéines PIN et nNOS, on peut également utiliser des techniques de type double hybride sur une levure ou une bactérie, telles que décrites notamment dans les brevets US 5,283,173 et 5,468,614. Cette technique, qui s'effectue
in vivo, ne nécessite pas de produire et de purifier les protéines PIN ou nNOS.
Dans un mode de réalisation de l'invention, la détermination de la quantité de complexe formé (ou sa variation) peut s'effectuer en solution si la protéine PIN et la protéine nNOS sont marquces avec des substances capables d'échanges énergétiques entre elles. La formation du complexe s'accompagne du rapprochement des deux partenaires, ce qui permet un transfert d'énergie entre les deux marqueurs et entra^me alors une augmentation ou une diminution de l'intensité du signal de fluorescence émis
par l'un des deux marqueurs.
Dans un autre mode de réalisation de l' invention, la détermination de la quantité de complexe (ou sa variation) peut s'effectuer en phase solide si l'un des deux partenaires est immobilisé sur le support solide et si la liaison de l'autre partenaire est détectée par résonance plasmonique de surface ou par marquage de ce partenaire par le
système de révélation tel que décrit ci-dessus.
Le premier partenaire, à savoir la protéine nNOS ou la protéine PIN, peut être immobilisé soit de façon covalente (réaction chimique), soit de façon non covalente par des interactions physico-chimiques (adsorption sur une surface plastique hydrophobe) ou par des interactions biospécifiques o le capteur biologique est préalablement
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immobilisé sur la plaque (anticorps spécifique du premier partenaire ou avidine si le
premier partenaire est revêtu de biotine).
Le second partenaire, à savoir la protéine PIN ou la protéine nNOS respectivement, permet de déterminer la quantité de complexe formé (ou sa variation) soit de façon directe par résonance plasmonique de surface, soit de façon indirecte par révélation quantitative de son marqueur. Le marqueur peut être soit un élément fixé sur le second partenaire par liaison chimique (élément radioactif, fluorescent, luminescent, enzyme, biotine) soit une autre substance biospécifique comme un anticorps dirigé contre le deuxième partenaire (lui-même marqué directement ou indirectement) ou de
l'avidine (marquée directement ou indirectement).
Pour obtenir la valeur de contrôle, - soit on effectue l'expérience correspondant à l'incubation d'un mélange comprenant la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS, et à la détection de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS, cette quantité correspondant à ladite valeur de contrôle, soit on effectue l'expérience correspondant à l'incubation de la protéine PIN seule, ce qui entrâîne une absence de complexe formé entre la protéine nNOS et la protéine PIN, - soit on effectue l ' expérience correspondant à l' incubation de la protéine nNOS seule, ce qui entrâîne une absence de complexe formé entre la protéine nNOS et la protéine PIN, - soit on effectue l'expérience correspondant à l'incubation d'un mélange comprenant la protéine PIN, la protéine nNOS ou l'un de ses variants et un inLibiteur de rétérence, dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, et à la détection de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS, cette quantité correspondant à ladite valeur de contrôle, soit on effectue l' expérience correspondant à l ' addition de la protéine PIN, préincubée avec un inhibiteur de référence, à la protéine nNOS immobilisée sur un biocapteur (par exemple, Biacore AB), et à la détection, notamment par résonance plasmonique de surface, de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la
protéine nNOS, cette quantité correspondant à ladite valeur de contrôle.
L'inhibiteur de référence est par exemple choisi parmi les peptides représentés par
les séquences SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4.
Le complexe formé entre PIN et nNOS peut étre détecté selon les techniques
décrites précédemment.
Ce test permet de cibler les stades précoces du diabète de type II et les états hyperinsuliniques, en utilisant les propriétés insulinomodulatrices de la forme
pancréatique de la NOS et de son inhibiteur endogène PIN.
L'invention concerne un procédé de détection de composés diminuant la complexation entre la protéine oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS) ou l'un de ses variants et la protéine inhibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale (PIN), la diminution de cette complexation entrâînant une réduction de la réponse insulinique régulée par la protéine nNOS ou l'un de ses variants, sans modifier substantiellement l'activité catalytique de la protéine nNOS ou de l'un de ses variants, dans lequel: on incube un mélange comprenant ledit composé, la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, l'étape d'incubation étant effectuce dans des conditions permettant: À la formation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, la formation d'un complexe entre d'une part le susdit composé et d'autre part la protéine PIN ou la protéine nNOS ou l'un de ses variants, - on détecte la diminution signifcative éventuelle de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants par rapport à une valeur de contr81e, correspondant, par exemple: * soit à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants en l'absence du composé soumis au procédé de détection, * soit à l'absence de complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, résultant soit de l'absence de la protéine PIN soit de l'absence de la protéine nNOS ou de l'un de ses variants, * soit à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants en présence d'un inLibiteur de référence, et, - on en déduit, lorsqu'il y a eu diminution signifcative telle que définie ci dessus, qu'il y a eu liaison entre d'une part le susdit composé et d'autre part la protéine PIN ou la protéine nNOS ou l'un de ses variants, ce qui entrâîne la réduction de la
complexation entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants.
Par "réduction de la réponse insulinique", on désigne une diminution d' au moins environ 20%, et de préférence d'au moins environ 50%, de la sécrétion d'insuline sous l'effet du composé diminuant la complexation entre la protéine nNOS et la protéine
PIN, par rapport à une valeur de contrôle correspondant à l' absence de composé testé.
Par "diminution significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants", on désigne une variation d'au moins environ 20%, et de préférence d'au moins environ 50%, de la quantité de complexe formé en présence du composé testé par rapport à une valeur de contrôle
correspondant à l'absence de composé testé.
L'invention concerne un procédé de détection, tel que défini ci-dessus, dans lequel la protéine nNOS utilisée est soit la forme présente dans le cerveau soit un variant présent dans les cellules pancréatiques, notamment la forme pancréatique de la
protéine nNOS.
La protéine nNOS utilisoe est notamment la protéine nNOS de rat, présente dans
le cerveau de rat. I1 s'agit de la forme neuronale de la rOS de rat, non mutée.
La protéine nNOS de rat présente dans les cellules pancréatiques est la nNOS
pancréatique: il s'agit de la forme mutée de la NOS neuronale de rat.
La nNOS pancréatique de rat possède trois mutations en acides aminés par rapport à la nNOS du cerveau de rat; ces mutations ne sont localisées ni dans les domaines fonctionnels de l' enzyme (domaines de liaison des cofacteurs tels que mentionnés ci dessus), ni dans la zone d' interaction entre PIN et nNOS, mais elles affectent sa
conformation tridimensionnelle et lui confèrent ainsi une spécificité pancréatique.
Un procédé de détection avantageux selon l'invention est un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel on détecte la variation, notamment la diminution significative éventuelle de la quantité de complexe forrné entre la protéine PIN et la protéine nNOS par rapport à une première valeur de contrôle, à une deuxième valeur de contrôle et à une troisième valeur de contrôle, l'une de ces valeurs de contrôle correspondant à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS en l'absence du composé soumis au procédé de détection, l'autre de ces valeurs de contrôle correspondant à l' absence de complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS, résultant soit de l'absence de la protéine PIN soit de l'absence de la protéine nNOS, et l'autre de ces valeurs de contrôle correspondant à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS en présence d'un inhibiteur de rétérence. La quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un
de ses variants peut être détectée selon l'une des techniques décrites précédemment.
La première valeur de contrôle est obtenue, par exemple, en effectuant l'expérience suivante: - on incube un mélange comprenant la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, dans des conditions permettant la formation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, - on détecte la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine
nNOS ou l'un de ses variants, cette quantité correspondant à ladite valeur de contrôle.
La deuxième valeur de contrôle est obtenue, par exemple, en effectuant l'expérience suivante correspondant: - soit à l'incutation de la protéine PIN seule, ce qui entrâîne une absence de complexe formé entre la protéine nNOS ou l'un de ses variants et la protéine PIN, - soit à l' incubation de la protéine nNOS seule ou l'un de ses variants, ce qui entraîne une absence de complexe formé entre la protéine nNOS ou l'un de ses variants
et la protéine PIN.
La troisième valeur de contrôle est obtenue, par exemple, en effectuant l'expérience suivante: - on incube un mélange comprenant la protéine PIN, la protéine nNOS ou l'un de ses variants et l'inhibiteur de rétérence, on détecte la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine
nNOS ou l'un de ses variants, cette quantité correspondant à ladite valeur de contrôle.
La troisième valeur de contrôle peut également être obtenue en effectuant l'expérience suivante: - on ajoute la protéine PIN, préincubée avec l'inhibiteur de référence, à la protéine nNOS immobilisce sur un biocapteur (par exemple, Biacore AB), - on détecte, notamment par résonance plasmonique de surface, la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, cette
quantité correspondant à ladite valeur de contrôle.
Un procédé de détection avantageux selon l' invention est un procédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel le mélange comprenant la protéine PIN, la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection est préparé:
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- soit en ajoutant simultanément la protéine PIN, la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection, - soit en ajoutant successivement: la protéine PIN, le composé soumis au procédé de détection et la protéine nNOS, ou successivement: la protéine nNOS, le composé soumis au procédé de détection et la protéine PIN, - soit en ajoutant ledit composé préalablement incubé avec la protéine PIN ou la
protéine nNOS, et respectivement soit la protéine nNOS soit la protéine PIN.
Lorsque le mélange comprenant la protéine PIN, la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection est préparé en ajoutant simultanément la protéine PIN, la protéine nNOS et ledit composé, on favorise la détection de composés qui se lient au complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS et qui dissocient ledit complexe, ainsi que des composés liant seulement l'un des deux partenaires, à savoir PIN ou nNOS, et suffisamment efficaces pour entrer en compétition avec la formation
du complexe.
Lorsque le mélange comprenant la protéine PIN, la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection est préparé en ajoutant successivement: la protéine PIN, ledit composé et la protéine nNOS, on favorise la détection de composés qui lient la protéine PIN, mais on favorise aussi la recherche de très bons ligands de la protéine nNOS (ligands ayant une très forte affinité pour la protéine nNOS, de l'ordre du M, et
de préférence du nM), qui sont défavorisés du point de vue cinétique.
Lorsque le mélange comprenant la protéine PIN, la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection est préparé en ajoutant successivement: la protéine nNOS, ledit composé et la protéine PIN, on favorise la détection de composés qui lient la protéine nNOS mais on favorise également la recherche de très bons ligands de la protéine PIN (ligands ayant une très forte affinité pour la protéine PIN, de l'ordre du
M, et de préférence du nM) qui sont détavorisés du point de vue cinétique.
Lorsque le mélange comprenant la protéine PIN, la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection est préparé en ajoutant ledit composé préalablement incubé avec la protéine PIN, et la protéine nNOS, on facilite la liaison dadit composé avec la protéine PIN avant l'addition de la protéine nNOS, ce qui favorise la détection de composés liant la protéine PIN.
Lorsque le mélange comprenant la protéine PIN, la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection est préparé en ajoutant ledit composé préalablement incubé avec la protéine nNOS, et la protéine PIN, on facilite la liaison dudit composé
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avec la protéine nNOS avant l'addition de la protéine PIN, ce qui favorise la détection
de composés liant la protéine nNOS.
Lorsque la protéine PIN, la protéine nNOS et le susdit composé sont ajoutés simultanément, la quantification des complexes formés peut s'effectuer en solution grâce à des marqueurs fluorescents et par polarisation (ou transfert) de fluorescence. Ce procédé présente l'avantage d'être rapide (une seule étape d'incutation, pas de lavages)
et offre un système de détection directe.
Lorsque la protéine PIN, le susdit composé et la protéine nNOS sont ajoutés successivement, ou après préincubation de la protéine PIN ou nNOS avec le susdit composé, l'un des deux partenaires doit être préalablement immobilisé sur un support solide. La quantification des complexes formés est effectuée soit par analyse par résonance plasmonique de surface, soit par marquage de l'autre partenaire. Ce procédé permet de déterminer à quel partenaire le composé se lie, c'est-à-dire la protéine PIN, la
protéine nNOS ou le complexe formé entre les deux protéines.
Un procédé de détection avantageux est un procédé de détection tel que défini ci
dessus, dans lequel la protéine nNOS est préalablement fixée sur un support solide.
L'expression "fixée sur un support solide" désigne un procédé o la protéine nNOS est immobilisée de façon covalente (réaction chimique) ou non covalente (adsorption non spécifique sur plastique, système avidinebiotine, anticorps) sur un
support solide.
Lorsque la protéine nNOS est préalablement fixée sur un support solide, la liaison de la protéine PIN est détectée par résonance plasmonique de surface ou par marquage avec un système de détection (marqueur fluorescent, luminescent, radioactif, enzyme,
biotine) qui permet de mesurer la quantité de complexe formé.
Lorsque la protéine nNOS est préalablement fxce sur un support solide, l' addition simultanée de la protéine PIN et du composé soumis au procédé de détection, non préalablement mélangés, permet de détecter à la fois des ligands de la protéine nNOS, de la protéine PIN et également du complexe formé entre les deux protéines. Ce procédé favorise donc la détection de molécules qui inhibent l' association entre la protéine PIN et la protéine nNOS et permet ainsi la recherche de composés qui dissocient le
complexe entre les deux protéines.
Lorsque la protéine nNOS est préalablement fixce sur un support solide, I' addition successive du composé soumis au procédé de détection et de la protéine PIN permet de détecter des composés inhibant uniquement la protéine nNOS. En effet, si le composé
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testé ne se fixe pas sur la protéine nNOS, il est éliminé lors du lavage qui a lieu avant
l'addition de la protéine PIN.
Lorsque la protéine nNOS est préalablement fixée sur un support solide, l' addition du composé soumis au procédé de détection préalablement incubé avec la protéine PIN permet de détecter à la fois des ligands de la protéine PIN, de la protéine nNOS et également du complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS. Ce mode de réalisation facilite la liaison dudit composé avec la protéine PIN avant incubation avec la protéine nNOS et permet de rechercher des ligands de la protéine PIN. Ce mode de réalisation permet également de sélectionner de très bons ligands de la protéine nNOS (ligands ayant une très forte affinité pour la protéine nNOS, de l'ordre du I1M, et de
préférence du nM), qui sont cinétiquement désavantagés dans ce cas.
L'invention concerne également un procédé de détection tel que défini cidessus
dans lequel la protéine PIN est préalablement fixée sur un support solide.
L' expression "fixée sur un support solide" désigne un procédé o la protéine PIN est immobilisée de façon covalente (réaction chimique) ou non covalente (adsorption
non spécifique sur plastique, système avidine-biotine, anticorps) sur un support solide.
Lorsque la protéine PIN est préalablement fixée sur un support solide, la liaison de la protéine nNOS est détectée par résonance plasmonique de surface ou par marquage avec un système de détection (marqueur fluorescent, luminescent, radioactif,
enzyme, blotine) qui permet de mesurer la quantité de complexe formé.
Lorsque la protéine PIN est préalablement fixée sur un support solide, l' addition simultanée de la protéine nNOS et du composé soumis au procédé de détection, non préalablement mélangés, permet de détecter à la fois des ligands de la protéine nNOS, de la protéine PIN et également du complexe formé entre les deux protéines. Ce procédé favorise donc la détection de molécules qui inhibent l' association entre la protéine PIN et la protéine nNOS et permet ainsi la recherche de composés qui dissocient le
complexe entre les deux protéines.
Lorsque la protéine PIN est préalablement fixce sur un support solide, l'addition successive du composé soumis au procédé de détection et de la protéine nNOS permet de détecter des composés inhibant uniquement la protéine PIN. En effet, si le composé testé ne se fixe pas sur la protéine PIN, il est éliminé lors du lavage qui a lieu avant
l'addition de la protéine nNOS.
Lorsque la protéine PIN est préalablement fixce sur un support solide, l' addition du composé soumis au procédé de détection préalablement incubé avec la protéine nNOS permet de détecter à la fois des ligands de la protéine PIN, de la protéine nNOS et également du complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS. Ce mode de réalisation facilite la liaison dudit composé avec la protéine nNOS avant incubation avec la protéine PIN et permet de rechercher des ligands de la protéine nNOS. Ce mode de réalisation permet également de sélectionner de très bons ligands de la protéine PIN (ligands ayant une très forte affinité pour la protéine PIN, de l'ordre du I1M, et de
prétérence du nM), qui sont cinétiquement désavantagés dans ce cas.
Un procédé de détection avantageux selon l ' invention est un pro cédé de détection tel que défini ci-dessus, dans lequel la protéine PIN et la protéine nNOS sont en
1 0 solution.
Lorsque la protéine PIN et la protéine nNOS sont en solution, la quantification des complexes formés s'effectue par marquage des deux protéines par un composé
fluorescent et par mesure de la polarisation de fluorescence.
L'invention concerne également une protéine caractérisoe en ce qu'elle comprend ou est constituée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou fragment de ladite protéine comprenant au moins 100 acides aminés sous réserve que ledit fragment contienne
l'acide aminé en position (269).
La séquence SEQ ID NO: 2 est une nouvelle protéine, isolée chez le rat correspondant à la forme pancréatique de la NOS neuronale, et est représentée sur la
Figure 1.
La forme pancréatique de la nNOS est une forme mutée de la nNOS. Elle présente quatre mutations nucléotidiques en position (269), (953), (1008) et (1299). La dernière des mutations est une mutation silencieuse; elle n'entraîne donc pas de changement
d'acide aminé.
L'invention concerne les peptides de séquence: - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-GlnVal-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 3), - Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 4), - Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQ ID NO: 5), - Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQ ID NO: 6), - Val-Asp-ThrGly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQ ID NO: 7), - Lys-Asp-Ala-Gly-Ile-Gln-ValAsp-Arg-Asp (SEQ ID NO: 8), - Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQ ID NO: 9), - Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQ ID NO: 10), Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQ ID NO: 11), - Lys-Asp-LysGly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO:12), - Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-ValAsp-Arg-Asp (SEQID NO:13), - Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO: 14), - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Arg-Asp (SEQID NO:15), Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Cys-Arg-Asp (SEQID NO:16), - Lys-Asp-Thr-GlyIle-Gln-Val-Asn-Arg-Asp (SEQID NO:17), - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-AspLeu-Asp (SEQID NO:18), - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Cys-Asp (SEQID NO:l9), - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Phe-Asp (SEQID NO: 20), - LysAsp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Tyr-Asp (SEQID NO:21), - Lys-Asp-Thr-Gly-IleGln-Val-Asp-Arg-Phe (SEQID NO:22), - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-ArgTrp (SEQID NO: 23), - Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Tyr (SEQID NO: 24), - Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Trp (SEQID NO: 25), - Ile-AspVal-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 26), - Ile-Asp-Val-Gly-Ile-GlnThr-Asp-Trp-Trp (SEQID NO: 27), - Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Cys-Trp-Trp (SEQID NO: 28), - Cys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 29), - Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 30), - Val-Asp-ThrGly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 31), - Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-ValAsp-Trp-Asp (SEQID NO: 32), - Cys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 33), - Val-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 34), - Cys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO:35), - Ile-Asp-IleGly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 36), - Val-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-ValAsp-Trp-Asp (SEQID NO: 37), - Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 38), - Cys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 39), - Ile-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO:40), - Val-Asp-PheGly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO:41), - Cys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-ValAsp-Trp-Asp (SEQID NO: 42), - Ile-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 43), - Val-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 44), - Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 45),
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- Cys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO:46 - Ile-Asp-Cys-GlyIle-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO: 47), - Val-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-AspArg-Asp (SEQID NO: 48 - His-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 49 - Ser-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 50 - Thr-AspVal-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 51 - Lys-Glu-Val-Gly-Ile-GlnVal-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 52 - Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 53), - Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 54 - Lys-Asp-Gln-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 55 - Lys-Asp-ValAla-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 56 - Lys-Asp-Val-Gly-Val-Gln-ValAsp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 57 - Lys-Asp-Val-Gly-Thr-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 58 - Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Ile-Asp (SEQID NO: 59), Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Glu (SEQID NO: 60 - Ala-Ile-Glu-ProVal-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 61), - Arg-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-SerIle-Leu-Asn (SEQ ID NO: 62), - Asn-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 63), - Asp-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 64) , - Gln-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 65), - Gly-Ile-GluPro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID N O: 66), - Pro-Ile-Glu-Pro-Val-LeuSer-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 67), - Ser-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 68), - Thr-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 69) , - Glu-Phe-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 70 - Glu-Ile-AsnPro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 71), - Glu-Ile-Asp-Pro-Val-LeuSer-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 72), - Glu-Ile-Cys-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-LeuAsn (SEQ ID NO: 73), - Glu-Ile-Gln-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 74), - Glu-Ile-Glu-Ala-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 75), - GluIle-Glu-Arg-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 76), - Glu-Ile-Glu-AsnVal-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 77), - Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Leu-SerIle-Leu-Asn (SEQID NO: 78), - Glu-Ile-Glu-Gln-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 79),
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- Glu-Ile-Glu-Glu-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 80), - Glu-Ile-GluGly-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 81), - Glu-Ile-Glu-His-Val-Leu-SerIle-Leu-Asn (SEQ ID NO: 82), - Glu-Ile-Glu-Lys-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 83), - Glu-Ile-Glu-Met-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 84) , - Glu-Ile-Glu-Ser-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 85), - Glu-Ile-GluThr-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 86), - Glu-Ile-Glu-Pro-Ile-LeuSer-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 87), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Pro-Ser-Ile-LeuAsn (SEQ ID NO: 88), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ala-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 89), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Val-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO:90), - GluIle-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Leu-Leu-Asn (SEQID NO:91), - Glu-Ile-Glu-Pro-ValLeu-Ser-Phe-Leu-Asn (SEQ ID NO: 92), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-TrpLeu-Asn (SEQ ID NO: 93), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Tyr-Leu-Asn (SEQ ID NO: 94), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Val-Leu-Asn (SEQ ID NO: 95), Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Ala (SEQ ID NO: 96), - Glu-Ile-GluPro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asp (SEQ ID NO: 97), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-LeuSer-Ile-Leu-Gln (SEQ ID NO: 98), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-LeuGlu (SEQ ID NO: 99), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Gly (SEQID NO: 100), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-His (SEQID NO: 101), - GluIle-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Met (SEQ ID NO: 102), - Glu-Ile-Glu-ProVal-Leu-Ser-Ile-Leu-Pro (SEQ ID NO: 103), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-SerIle-Leu-Ser (SEQ ID NO: 104) et - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Thr (SEQ ID NO: 105), lesdits poptides présentant une plus grande affmité pour la protéine PIN que celle présentée par l'une des protéines telles que défmies ci-dessus, vis-à-vis de la protéine PIN. Ces peptides qui miment la nNOS sont des fragments de la protéine nNOS, sélectionnés par analyse mutationnelle simple ou combince, et sont obtenus par
synthèse chimique.
Les deux poptides, représentés par les séquences SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, présentent respectivement une mutation en 9 (Arg mutée en Trp) pour le peptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 et trois mutations pour le peptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 4 (en 1: Lys mutée en Ile, en 3: Thr mutée en Val et en 9: Arg mutée en Trp). Ces deux peptides inhibent l'interaction entre la protéine PIN et la protéine nNOS avec une Kj (IC50) de 4 mol11 (constante d'inhibition correspondant à un pourcentage d'inUibition de 50%) pour le peptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 et de 0,4 mol/1 pour le peptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 4,
comme le démontrent les Exemples 2 et 3.
Les séquences SEQ ID NO: 3 à SEQ ID NO: 105 correspondent à des fragments
de la protéine nNOS mutée.
L'invention concerne également les acides nucléiques codant pour l'une des protéines, l'un des fragments de protéines ou l'un des peptides tels que définis ci dessus. Elle concerne notamment la séquence nucléotidique ayant la séquence SEQ ID
NO: 1.
La séquence SEQ ID NO:1, représentée sur la Figure 1, est une nouvelle séquence d'acide nucléique, identifiée chez le rat, codant pour la nouvelle protéine correspondant à la forme pancréatique de la NOS neuronale, représentée par la séquence
SEQ ID NO: 2.
L'invention concerne une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend une protéine, un fragment de protéine ou un peptide tels que définis ci
dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement acceptable.
Les doses utilisées peuvent varier d'environ 10 mg à 1 g par jour pour un adulte
de poids moyen égal à 60 kg.
L'invention concerne également une composition pharmaceutique caractérisée en ce qu'elle comprend toute substance non peptidique détectée par le procédé de criblage tel que défini ci-dessus, en association avec un véhicule pharmaceutiquement
acceptable.
L'invention concerne également l'utilisation des protéines, des fragments de protéines ou des peptides tels que définis ci-dessus, pour la préparation de médicaments
destinés au traitement des états prédiabétiques ou hyperinsuliniques.
Les doses utilisées peuvent varier d'environ 10 mg à 1 g par jour pour un adulte
de poids moyen égal à 60 kg.
L'invention concerne également l'utilisation de toute substance non peptidique détectée par le procédé de criblage tel que défini ci-dessus, pour la préparation de
médicaments destinés au traitement des états prédiabétiques ou hyperinsuliniques.
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Un état prédiabétique est caractérisé par une légère hyperglycémie basale comprise entre 6 mM et 7 mM. De plus, l'état prédiabétique est caractérisé par une intolérance au glucose, c'est-à-dire des glycémies comprises entre 7,8 mM (140 ng/dl)
et 11 mM (200 ng/dl) deux heures après un test oral au glucose.
L'hyperinsulinisme correspond à une insulinémie représentant 1,5 à 10 fois les taux plasmatiques donnés dans la littérature chez l'homme normal (10 pU/ml 20 pmole/l). Les médicaments, tels que mentionnés ci-dessus et obtenus en utilisant des protéines, des fragments de protéines, des peptides ou des substances non peptidiques tels que définis ci-dessus, sont capables de rétablir chez des patients prédiabétiques
et/ou hyperinsuliniques une réponse insulinique normale et biphasique.
L'expression "réponse insulinique biphasique et normale" désigne une sécrétion d'insuline présentant une première phase de sécrétion de 5 à 10 minutes ainsi qu'une seconde phase plus longue d'intensité variable en fonction de la prise glucosée (environ
1 à 2 heures).
L'invention concerne un kit ou une trousse de détection d'un composé modulant, notamment réduisant la complexation entre la protéine PIN et la protéine nNOS, comprenant: - la protéine nNOS, notamment la forme pancréatique de la protéine nNOS, - la protéine PIN, - des milieux ou des tampons nécessaires à la dilution, - éventuellement des moyens de lavage, - des milieux ou des tampons permettant la formation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS et la formation d'un complexe entre la protéine PIN ou la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection, - des moyens de détection de la variation, notamment de la diminution de la
quantité de complexe formé entre la protéine nNOS et entre la protéine PIN.
Les milieux ou les tampons nocessaires à la dilution sont par exemple - du PBS (137 mM NaCl; 2,7 mM KC1; 4,3 mM Na2HPO4, 1,4 mM K2HPO), - du PBS additionné de 0,1% de Tween 20 et de 1% de BSA (sérum albumine bovine). Les moyens de lavage appropriés sont par exemple du PBS additionné de 0, 1% de
Tween 20.
Les milieux ou tampons permettant la forrnation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS et la formation d'un complexe entre la protéine PIN ou la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection, sont par exemple du PBS
additionné de 0,1% de Tween 20 et de 1% de BSA.
Les moyens de détection de la variation de la quantité de complexe formé entre la protéine nNOS et entre la protéine PIN sont par exemple: utilisation d'un anticorps anti-étiquette (GST ou (HIS)6) marqué à la peroxydase ou à la phosphatase alcaline, - utilisation d'un anticorps anti-nNOS marqué à la peroxydase ou à la phosphatase alcaline, utilisation d'un anticorps anti-étiquette (GST ou (HIS)6) ou anti-nNOS fluorescent, blotinylé ou radiomarqué, - utilisation des deux protéines, radiomarquées ou marquées par un composé fluorescent, - utilisation de la résonance plasmonique de surface avec des protéines nNOS et
PIN non marquées.
DESCRIPTION DES FIGURES
La Figure 1 représente la séquence protélque SEQ ID NO: 2 de la forme pancréatique de la NOS neuronale de rat et la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1
codant pour cette protéine.
La Figure 2 représente l'analyse par RT-PCR de l'expression de PIN dans les îlots pancréatiques de rat et dans les cellules INS-1 (Asfari et al., 1992). Les ARN totaux sont isolés, l'ADN complémentaire est synthétisé par reverse transcription puis il est amplifé par PCR avec des amorces basées sur la séquence de PIN et sur celle de la p2microglobuline (2m), qui est utilisée comme contrôle positif. Un contrôle négatif est réalisé en absence d'ADN complémentaire (C). Des fragments d'ADN de taille connue (2000, 1200, 800, 400, 200 et 100 paires de bases) sont utilisés comme marqueurs de
poids moléculaires (PM).
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La Figure 3 représente l'analyse par transfert de protéine (Western blot) de la présence de la protéine PIN dans les cellules INS-1. Les protéines extraites des cellules INS-1 et du cerveau de rat (Cerv.) sont séparées sur un gel tricine à 13,5%, transférées
sur une membrane de nitrocellulo se et incub ées avec un anticorp s monoclonal anti -PIN.
Le signal est détecté par un anticorps anti-souris couplé à la peroxydase suivi d'une réaction de chimioluminescence. 16 et 7 kDa indiquent des marqueurs de poids moléculaire. Les Figures 4A et 4B représentent la colocalisation de la protéine PIN et de la NO synthase neuronale dans les cellules INS-1 par immunofluorescence. Les cellules INS-1 sont doublement marquées avec un anticorps monoclonal anti-PIN (Figure 4A) et avec un anticorps anti-NO synthase neuronale de lapin (Figure 4B). La fluorescence est révélée par un anticorps anti-souris couplé à la fluorescéine et un anticorps anti-lapin couplé à la rhodamine puis elle est analysée par un microscope confocal à doubles
canaux. La barre d'échelle indique 10m.
Les Figures 5A et 5B représentent l'effet d'une surexpression de PIN dans les
cellules INS-1 sur la sécrétion d'insuline induite par le glucose.
La Figure 5A représente l'analyse par RT-PCR de la surexpression de PIN dans les cellules INS-1. Les cellules INS-1 sont transfectées avec un vecteur d'expression vide (colonne C) ou contenant l'ADN complémentaire de PIN (colonne PIN). Les ARN totaux sont isolés et l'ADN complémentaire est amplifé par RT-PCR avec des amorces basées sur la séquence de PIN. Des fragments d'ADN de taille connue (2000, 1200, 800, 400, 200 et 100 paires de bases) sont utilisés comme marqueurs de poids moléculaires
(colonne PM).
La Figure 5B représente l'analyse de la sécrétion d'insuline des cellules INS-1 surexprimant PIN (colonne PIN) par rapport aux cellules contr81es (colonne C). 48 heures après transfection, les cellules sont incabées en présence de glucose à 1 g/l et la
sécrétion d'insuline est mesurée par un dosage radioimmunologique.
Les Figure 6A et 6B représentent des sensorgrammes correspondant à l'analyse par résonance plasmonique de surface de l'interaction entre PIN et un poptide nNOS normal (Figure 6A) ou un peptide nNOS muté (Figure 6B), représenté par la séquence SEQ ID NO: 3. Les peptides sont immobilisés sur un canal d'un biocapteur CM5 (Biacore AB) et la protéine PIN, issue d'une digestion du GST-PIN par la thrombine, est injectée à des concentrations croissantes: 5 1lg/ml (courbe 4 en pointillés réguliers de la Figure 6A et courbe d en pointillés réguliers de la Figure 6B), 10, ug/ml (courbe 3 en pointillés alternés de la Figure 6A et courbe c en pointillés alternés de la Figure 6B), 20 g/ml (courbe 2 avec des points de la Figure 6A et courbe b avec des points de la Figure 6B) et 40,ug/ml (courbe 1 en trait plein de la Figure 6A et courbe a en trait plein de la Figure 6B). La liaison de PIN sur le peptide normal (Figure 6A) et sur le peptide muté (Figure 6B) est enregistrée sur des sensorgrammes, qui permettent ensuite de déterminer les constantes d' association et de dissociation. Ces sensorgrammes représentent la réponse en RU en fonction du temps. 1 RU (unité de résonance)
correspond à une quantité de protéine liée sur le biocapteur égale à 1 pg/mm2.
Les Figures 7A et 7B représentent l'inhibition de la liaison de la protéine GST PIN sur la protéine nNOS pour différentes concentrations de peptide normal et des poptides mutés, représentés par les séquences SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4. La protéine nNOS est immobilisée sur une plaque ELISA et mise en contact avec la protéine GST-PIN, préalablement incubée avec des concentrations croissantes de peptide. L'interaction entre les deux protéines est révélée par un anticorps anti-GST
couplé à la peroxydase puis par mesure de l' absorbance à 490 nm.
La Figure 7A représente l'absorbance en fonction de la concentration de peptide utilisé (en 1lg/ml). La courbe avec des ronds noirs correspond au peptide normal, celles avec des carrés noirs au poptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 et celle avec
des losanges noirs au poptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 4.
La Figure 7B représente le pourcentage d'inhibition de la liaison de la protéine PIN sur la protéine nNOS en fonction de la concentration de peptide (en I1M). La courbe avec des ronds noirs correspond au peptide normal, celles avec des carrés noirs au peptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 et celle avec des losanges noirs au
poptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 4.
Les Figures 8A, 8B, 8C et 8D représentent des sensorgrammes correspondant à l'analyse par résonance plasmonique de surface de l'inhibition de l'interaction entre la protéine PIN et la protéine nNOS par un poptide nNOS normal (Figure 8A) ou des peptides nNOS mutés représentés par les séquences SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4 (Figures 8B et 8C). Les Figures 8A, 8B et 8C représentent la réponse en RU, qui
correspond à la quantité de protéine liée sur le biocapteur, en fonction du temps.
La Figure 8A représente l'inhibition de la liaison de la protéine PIN sur la protéine nNOS par le poptide normal (Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp). La courbe 1 correspond à l'absence de poptide; les courbes 2, 3 et 4 correspondent respectivement à une concentration du peptide normal égale à 20 g/ml, 50 g/ml et
g/ml.
La Figure 8B représente l'inhibition de la liaison de la protéine PIN sur la protéine nNOS par le peptide mutant, représenté par la séquence SEQ ID NO: 3. La courbe a correspond à l'absence dudit poptide; les courbes b, c, d, e et f correspondent respectivement à une concentration dudit peptide égale à 5 g/ml, 10 g/ml, 20 ug/ml,
g/ml et 40 g/ml.
La Figure 8C représente l'inhibition de la liaison de la protéine PIN sur la protéine nNOS par le peptide mutant, représenté par la séquence SEQ ID NO: 4. La courbe 1 correspond à l'absence dudit peptide; les courbes 2, 3, 4, 5 et 6 correspondent respectivement à une concentration dudit poptide égale à 1 1lg/ml, 2,ug/ml, 3 g/ml, 5
g/ml et 10 1lg/ml.
La Figure 8D représente la courbe d'inhibition de la liaison de la protéine PIN sur la protéine nNOS par le peptide mutant, représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 (courbe a avec des ronds) et le poptide mutant, représenté par la séquence SEQ ID NO: 4 (courbe b avec des carrés). Cette figure représente le pourcentage d'inhibition de la liaison entre la protéine PIN et la protéine nNOS en fonction de la concentration de peptide mutant en M.
MATERIELS ET METHODES
* Séquençage de l'ADN complémentaire de l' isoforme de l' oxyde nitrique synth ase neuronale présente dans les cellules pancréatiques Des fragments chevauchants d'ADN complémentaire (de 450 à 650 paires de bases) sont obtenus par RT-PCR à partir d'îlots de Langerhans de rat et de la lignce cellulaire insulino-sécrétrice INS-1 (Asfari et al., 1992). Les îlots sont isolés à partir du pancréas d'un rat mâle Wistar par une digestion à la collagénase et sont séparés du tissu exocrine par un gradient de Ficoll (Shibata et al., 1976). Les cellules INS-1 sont issues d'un insulinome derat et sont cultivoes dans du RPMI 1640 contenant 10 /0 de sérum de veau f_tal, 100 U/ml de pénicilline, 100,ug/ml de streptomycine, 2 mM de L glutamine, 10 mM d'Hepes, 1 mM de pyruvate de sodium et 50,uM de p mercaptocthanol. Les ARN totaux des lots isolés et des cellules INS-1 sont extraits avec du TRIzol (Life technologies). Le premier brin de l'ADN complémentaire est synthétisé à partir de 10,ug d'ARN totaux en présence de 3!lg d'amorces aléatoires (Life technologies), 1 g d'amorce oligo(dT) (Life technologies) et de la transcriptase reverse Superscript II RNAse H(Life technologies). La PCR est ensuite réalisée en présence de Taq Polymérase (Life technologies) avec les paires d'amorces listées dans le tableau suivant: Liste des amorces sens et antisens utilisées pour le séquençage de la forme pancréatique de la NO synthase neuronale
SENS ANTISENS
' ATGGAAGAGAACACGTTTGGGGTT 3' 5' TTAGCTTGGGAGACTGAGCCAGCT3'
' CCAGTCATTAGCAGTAGACAGAGT3' S'CATCTTCTGGCTTCCGCGTGTGCT3'
'TCCTCAAGGTCAAGAACTGGGAGA 3' 5' AGGTCCTTAAACCAGTCGAACTTG 3'
' ATCCAGCCAATGTGCAGTTCACGG 3' 5' GTTCCATGGATCAGGCTGGTATTC 3'
' CCTGTCTTCCACCAGGAGATGCTC 3' 5' TCCCAGTTCCTCCAGGAGGGTGTC3'
' CCCTGGCCAATGTGAGGTTCTCAG 3' 5' GCATTCACGAGGTCCTCGTGGTTG 3'
' TTCGTGCGTCTCCACACCAACGGG 3' 5' TATTCTGTTGAGCCAGGAGGAGCA3'
' GGTGCACCTCACTGTGGCCATCGT3' 5' TTAGGAGCTGAAAACCTCATCTGC3'
Après une dénaturation initiale de 5 min à 94 C, la PCR va s'effectuer en 40 cycles comportant une étape de dénaturation à 94 C pendant 1 minute, une étape d'hybridation à 60 C pendant 1 minute, une étape d'élongation à 72 C pendant 1
minute puis une élongation finale de 10 minutes.
Les fragments d'ADN complémentaire sont purifiés après migration sur un gel d'agarose à 1,5% à l'aide du kit d'extraction QiaEx II (Qiagen). Les fragments sont ensuite séquencés deux fois manuellement à l' aide de dCTP [aS35] et du kit de séquençage Thermosequenase Cycle Sequencing kit (Amersham) et une fois à l' aide d'un séquenceur automatique (ABI PRISM 377, PE Applied Biosystems) et du kit de séquençage dRhodamine Terminator Sequencing Ready Reaction kit (PE Applied Biosystems). Comme le montre la séquence SEQ ID NO: 2, 4 mutations ponctuelles ont été identifiées dans la séquence de la forme pancréatique de la NO synthase neuronale, ce qui lui confère une homologie de 99,8% par rapport à la séquence de cervelet de rat. Trois de ces mutations modifient la séquence en acides aminés: une valine est mutée en isolencine en position 269, une alanine en proline en position 953 et une sérine en phénylalanine en position 1008. La NO synthase neuronale du pancréas est donc légèrement différente de la NO synthase neuronale précédemment identifiée
dans le cervelet de rat (Bredt et al., 1991).
Présence de l'ARN messager de la protéine PIN dans les cellules F3 du pancréas endocrine Afm de démontrer la présence de l'ARN messager de la protéine inhibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale, PIN (Jaffrey et al., 1996) dans les cellules du pancréas endocrine, des îlots de Langerhans de rat et la lignée cellulaire insulino sécrétrice INS-1, ont été utilisés comme source de cellules pancréatiques. Les ARN totaux des ilots isolés et des cellules INS-1 sont extraits avec du TRIzol (Life technologies). Le premier brin de 1'ADN complémentaire est synthétisé à partir de 10 1lg d'ARN totaux en présence de 3 1lg d'amorces aléatoires (Life technologies), 1 1lg d'amorce oligo(dT) (Life technologies) et de la transcriptase reverse Superscript II RNAse H- (Life technologies). La PCR est ensuite réalisée en présence de Taq Polymérase (Life technologies) avec les paires d'amorces suivantes: pour PIN: - 5 TTGAGCGGCGCCAGCACCTTCCCT3 et
- 5 CGAGGTGTTCCCTTAGCAAGGCTG3
pour la p2-microglobuline: - 5 ATCTTTCTGGTGCTTGTCTC3 et
_ 5 AGTGTGAGCCAGGATGTAG3
Après une dénaturation initiale de 5 min à 94 C, la PCR va s'effectuer en 40 cycles comportant une étape de dénaturation à 94 C pendant 1 minute, une étape d'hybridation à 60 C pendant 1 minute, une étape d'élongation à 72 C pendant 1 minute puis une élongation fmale de 10 minutes. Les produits de PCR sont ensuite
séparés sur un gel d'agarose à 1,5 % et visualisés par coloration au bromure d'éthidium.
Un fragment de la taille attendue (443 paires de bases) est obtenu avec les amorces de
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PIN à la fois dans les îlots pancréatiques et dans les cellules INS-l (voir Figure 2).
L'analyse par RT-PCR met donc en évidence la présence de l'ARN messager de PIN dans les cellules pancréatiques de rat. Ainsi l'expression simultance de la NO synthase neuronale et de son inhibiteur naturel PIN a été démontrée dans les cellules insulino-sécrétrices du pancréas endocrine. Ensuite l'ADN complémentaire de PIN a été séquencé et son homologie totale avec la séquence de PIN issue du cerveau de rat a été
constatée (Jaffrey et al., 1996).
Présence de la protéine PIN dans les cellules INS-1.
Les cellules INS-l et les cerveaux de rat sont homogéncisés dans un tampon de lyse contenant 50 mM de Tris (pH 7,4), 150 mM NaCl, 2 mmol/l d'EDTA, l mmol/l de phenylmethylsultonyl fluoride, lO 1lg/ml de leupoptine et lO g/ml d'aprotinine. Le matériel insoluble est éliminé par centrifugation. La concentration en protéines du surnageant est déterminée grâce au bleu de Coomassie (Coomassie Protein Assay Reagent, Pierce). 80 g de protéines sont séparces par électrophorèse sur un gel tricine à 13,5% puis transférées sur une membrane de nitrocellulose. Les membranes sont d'abord saturées avec du lait en poudre écrémé à 5% dans du PBS additionné de 0,1% de Tween 20 et elles sont ensuite incubées toute la nuit avec un anticorps monoclonal anti-PIN (dilué au 1/250e, Transduction Laboratories). Après 3 lavages dans du PBS tween, la membrane est finalement incubée avec un anticorps anti-souris couplé à la peroxydase (dilué au 1/5000e, Sigma Aldrich). L'immunoréactivité est révélée à l'aide d'une réaction de chimioluminescence (ECL, Amersham Life Science). L'analyse par Western blot met en évidence la présence de la protéine PIN qui possède une taille
identique à la protéine PIN exprimée dans le cerveau de rat (voir Figure 3).
Colocalisation de la protéine PIN avec la NO synthase neuron ale dans les cellules
INS-1.
Les cellules INS-1 sont ensemencées dans des systèmes de lame Lab-Tek et cultivées pendant 4 jours avant utilisation. Elles sont ensuite fixées avec du paraformaldéhyde à 2% dans du PBS (solution saline de tampon phosphate) pendant 20 minutes et perméabilisées 5 minutes avec du Triton X-100 à 0,1%. Après saturation des sites non spécifques avec de la BSA (sérum altumine de b_uf) à 2%, les cellules sont
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incubées avec un anticorps monoclonal anti-PIN (dilué au 1/lOOe, Transduction Laboratories) et un anti-NO synthase neuronale de lapin (dilué au 1/lOOe, Euro Diagnostica) pendant une nuit. Après plusieurs lavages, un anticorps anti-souris couplé à la fluoresccine (dilué au 1/lOOe, Biosys) un anticorps anti-lapin couplé à la rhodamine (dilué au 1/lOOe, Biosys) sont appliqués aux cellules pendant une heure. Après plusieurs lavages, les cellules sont montées dans du Citifluor (Citifluor Ltd) et observées avec un microscope confocal à laser argon et krypton (Biorad). La protéine PIN est présente dans le cytoplasme des cellules INS-1 (Figure 4A). De plus, le signal fluorescent de PIN (Figure 4A) et celui de la NO synthase neuronale (voir Figure 4B) sont fortement superposables, ce qui indique que les deux protéines sont fortement colocalisées dans les cellules pancréatiques de rat. En effet, il a été démontré que la protéine PIN interagit avec la NO synthase neuronale in vitro et in vivo (Jaffrey et al., 1996) au niveau de ses acides aminés 163 à 245. Il semble donc que la NO synthase neuronale et
PIN interagissent à l'intérieur des cellules pancréatiques.
Rôle modulateur de PIN de la sécrétion d'insuline induite par le glucose dans la
lignée cellulaire INS-1.
La protéine PIN est surexprimée dans les cellules INS-1 et la réponse insulinique au glucose est mesurée. L'ADN complémentaire de PIN obtenu après RT-PCR (voir ci dessus) est cloné dans un vecteur d'expression eucaryote pCR3.1 (TA cloning Kit, Invitrogen). Puis les cellules INS-1 (environ 8.105) sont transfectées avec 1,5,ug de plasmide (vide ou contenant PIN) en utilisant le réactif Lipofectamine plus Reagent (Life Technologies). La surexpression de PIN est ensuite vérifiée par RT-PCR en utilisant 5 1lg d'ARN totaux et les amorces mentionnées ci-dessus (voir tableau 1). 48 heures après la transfection, les cellules sont lavées dans du tampon Krebs Ringer bicarbonaté (pH 7,4) (108 mM NaCl; 1,19 mM KH2PO4; 4,74 mM KCl; 2,54 mM CaCl2; 1,19 mM MgSO4, 7H2O; 18 mM NaHCO3) sans glucose, puis préincubées dans ce même tampon pendant une heure à 37 C. Après avoir éliminé le milieu, les cellules sont incubées dans du Krebs additionné d' 1 g/l de glucose pendant une heure à 37 C. Le surnageant est ensuite récupéré et l'insuline sécrétée est mesurée par un dosage radioimmunologique (Herbert et al., 1965). Environ 5 fois plus d'ARN messager de PIN est présent dans les cellules après transfection du vecteur PIN par rapport aux cellules contrôles (Figure 5A). De plus, la sécrétion d'insuline induite par le glucose est augmentée de 25% dans les cellules surexprimant PIN par rapport à celle des cellules contrôles (Figure 5B). I1 semble donc que PIN joue un rôle modulateur positif de la
sécrétion d'insuline induite par le glucose.
REALISATION DU TEST DE CRIBLAGE
Pour produire la protéine PIN, l'ADN complémentaire de PIN obtenu après RT PCR (voir exemple 1 ci-dessous) est cloné dans le vecteur pET21b (contenant l'étiquette polyhistidine en position C-terminale, (HIS)6, fournie par exemple par Novagen) et le vecteur pGEX-2T (contenant l'étiquette glutathion S-transférase en position N-terminale, GST, fournie par exemple par Pharmacia). Après transformation des bactéries BL21(DE3) (fournies par exemple par Novagen) par les plasmides recombinants, les bactéries sont cultivoes à 37 C dans du milieu LB jusqu'à une DO de
0,6. La protéine est ensuite produite après induction par 1 mM d'IPTG (isopropylthio--
D-galactoside) pendant 5 heures à 30 C. Les bactéries sont récupérées par centrifugation et sont lysées selon des conditions standards (Short Protocols in Molecular Biology, 2nd Edition, John Wiley and Son). Le matériel insoluble est éliminé par centrifugation et la protéine est purifiée sur une colonne de nickel pour l'étiquette polyhistidine (par exemple Ni NTA agarose, fournie par Qiagen) ou sur une colonne de glutathion sépharose pour l'étiquette GST (fournie par exemple par Pharmacia) selon
les recommandations du fournisseur. La protéine PIN est ensuite conservée à -80 C.
Pour obtenir la protéine nNOS pancréatique, 1'ADN complémentaire de la nNOS pancréatique comportant une étiquette polyhistidine est cloné dans le vecteur pll9L (Poul et al., 1995) sous contrôle du promoteur viral P10 (Poul et al., 1995). Le virus recombinant est obtenu par cotransfection du vecteur chargé et de 1'ADN de baculovirus dans les cellules d'insecte Sf9 (ATCC CRL 1711) en utilisant la technique de lipofection (DOTAP, Roche Diagnostics). Les clones de virus sont ensuite isolés par plage de lyse et sélectionnés pour leur capacité à produire la protéine nNOS par transfert de protéine (Western Blot) avec un anticorps anti-nNOS (Transduction Laboratories). La protéine est finalement purifiée sur une colonne de nickel (par exemple Ni NTA agarose, fournie par Qiagen) selon les recommandations du
fournisseur. La protéine nNOS pancréatique est ensuite conservoe à -80 C.
Selon un premier mode de réalisation de l'invention, la nNOS pancréatique est immobilisée au fond d'une plaque de plastique Maxisorp (Nunc) à la concentration de 1 à 5 g/ml dans 100 p1 de PBS pendant une nuit à 4 C. Après lavage dans du PBS contenant 0,1% de Tween 20, la plaque est saturée avec 100 p1 de PBS-1% BSA pendant une heure à 37 C puis incubée avec la protéine PIN comportant une étiquette GST (GST-PIN) ou polyhistidine (PIN-(HIS)6) à la concentration de 0,1 à 10,ug/ml dans 100 1ll de PBS-0,1% Tween 20-1% BSA en présence ou en absence de composé à tester pendant une heure et demie à 37 C. La plaque est ensuite lavoe puis incubée avec ,ul d'anticorps anti-étiquette, anti-GST ou anti-(HIS)6 couplé à la peroxydase (dilué au 1/2000e dans du PBS-0,1% Tween 20-1% BSA, Sigma Aldrich) pendant une heure à 37 C. La formation du complexe nNOS- PIN-anticorps est révélée par une réaction colorée en présence du substrat de la peroxydase, l'O-phénylènediamine, pendant 20
minutes à l'obscurité, et l'intensité de la coloration est mesurée à 490 nm.
Selon un second mode de réalisation de l' invention, la protéine PIN, sous forme GST-PIN ou PIN-(HIS)6 est immobilisce au fond d'une plaque en plastique puis mise en contact avec la nNOS pancréatique. La réactivité est détectée par un anticorps anti
nNOS couplé à la peroxydase.
Exemple 1
Cet exemple démontre qu'un peptide mutant de la nNOS, à savoir celui représenté par la séquence peptidique SEQ ID NO: 3, présente une meilleure affinité pour PIN que le même peptide non muté de la nNOS (Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp)
grâce à l'analyse par résonance plasmonique de surface.
Les peptides solubles de la nNOS sont préparés par un robot AMS 422 (Abimed) par synthèse chimique Fmoc sur phase solide (Gausephol, 1992). Ces peptides nNOS de 10 acides aminés correspondent à la zone d'interaction avec PIN (acides aminés 229 à 238 de la nNOS). Les peptides sont ensuite déprotégés et clivés de la résine par un traitement à l'acide trifluoroacétique en présence des capteurs appropriés. Les peptides sont lyophilisés et leur pureté est vérifiée par HPLC analytique. Si nécessaire, les peptides sont ensuite purifiés à 90% par HPLC préparative, puis analysés par
spectrométrie de masse.
La liaison de PIN sur les peptides immobilisés est analysée par BIACORE 2000 (Biacore AB). Les poptides, à la concentration de 10,ug/ml dans un tampon acétate 10 mM pH 4, sont couplés sur un canal d'un biocapteur CM5 (Biacore AB) en utilisant le protocole NHS-EDC (N-hydroxysuccinimide (NHS) , Biacore AB; N-éthyl-N'
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(diméthylaminopropyl)carbodilmide (EDC), Biacore AB), ce qui conduit à une densité de poptides immobilisées d'environ 100 pg/mm2. Des concentrations croissantes de la protéine PIN (5, 10, 20 et 40 1lg/ml), issue de la digestion du GST-PIN avec de la thrombine (Pharmacia), sont injectées sur le biocapteur avec un flux de 30 Ill/min et les sensorgrammes correspondant à la liaison de PIN sur les peptides sont enregistrés avec
un temps d'association de 180 secondes et un temps de dissociation de 400 secondes.
Les constantes d' association et de dissociation sont déterminées à partir du sensorgramme en utilisant le logiciel BIAevaluation 3.0 (Biacore AB) et une méthode d'analyse dite globale (analyse simultanée des constantes cinétiques d'association et de dissociation pour les sensorgrammes correspondant à toutes les concentrations de PIN utilisées). Comme contrôle, le poptide quelconque (Lys Ala Val Asp Leu Ser His Gln Pro Ser Ala Ser Lys Asp Gln Ser Leu), qui est un fragment de la nNOS (délimité de l'acide aminé en position 131 à l'acide aminé en position 147 de la protéine nNOS, voir Figure 1) mais ne correspond pas à la zone d'interaction entre les protéines PIN et nNOS, est immobilisé de la méme manière et mis en présence de PIN aux mêmes concentrations. La protéine PIN présente une affinité deux fois supérieure pour le poptide muté représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 (voir Figure 6B, Ka = 1,86.108; Kd = ,38.10-9) que pour le peptide normal (voir Figure 6A, Ka = 8,43.107; Kd = l,l9.10-g). L'introduction d'une mutation dans un peptide nNOS (SEQ ID NO: 3, arginine mutée
en tryptophane en position 9) augmente son affinité pour la protéine PIN.
Exemple 2
Cet exemple permet de démontrer que des peptides mutants, représentés par SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, présentant une meilleure affinité pour la protéine PIN que la protéine nNOS, sont capables de diminuer l' interaction entre les protéines nNOS et
PIN en utilisant le premier mode de réalisation de l'invention, décrit cidessus.
La nNOS est immobilisée sur une plaque ELISA Maxisorp (Nunc) à la concentration de 1 1lg/ml dans 100 1ll de PBS pendant une nuit à 4 C. Après lavage dans du PBS contenant 0,1% de Tween 20, la plaque est saturée avec 100 p1 de PBS-1% de BSA pendant une heure à 37 C. La protéine GST-PIN, à 0,5 g/ml dans 100 g1 de PBS-0,1% Tween 20-1% BSA, est préalablement incubée avec le poptide quelconque (défini ci-dessus), le peptide normal (Lys Asp Thr Gly Ile Gln Val Asp Arg Asp) ou les
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peptides mutés (SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4) à des concentrations croissantes (de 0,01 à 100,ug/ml pour les peptides mutés et de 10 à 1000, ug/ml pour le poptide non muté) dans le méme tampon pendant une heure à 37 C. Le mélange peptide et protéine PIN est ensuite incubé deux heures sur la plaque. La plaque est ensuite lavée puis incubée avec 100 p1 d'anticorps anti-GST couplé à la peroxydase (dilué au 1/2000e dans du PBS0,1% Tween 20-1% BSA, Sigma Aldrich) pendant une heure à 37 C. La formation du complexe nNOS-PIN est révélée par une réaction colorée en présence du subskat de la peroxydase, l'O-phénylènediamine, pendant 20 minutes à l'obscurité, et l'intensité de la coloration est mesurée à 490 nm. Le contrôle est effectué en utilisant le
poptide quelconque tel que défini ci-dessus.
En présence du peptide nNOS normal (voir Figure 7A), la liaison de la protéine PIN sur la protéine nNOS est inhibée à 14% pour une concentration dudit peptide égale à 50,ug/ml. Par contre, les deux poptides mutants, représentés par les séquences SEQ ID NO: 3 et SEQ ID NO: 4, entranent une inhibition de la liaison de la protéine PIN sur la protéine nNOS atteignant 71% (pour le poptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 3) et 78% (pour le peptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 4) à une
concentration de 50,ug/ml.
D ' après les courbes d' inhibition de la liaison de PIN sur la protéine nNOS (voir Figure 7B), le peptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 présente une constante d'inhibition (K;: IC50) de 5 M et le peptide représenté par la séquence SEQ ID NO: 4 présente une constante d' inhibition de 0,5,uM, alors que le poptide normal n' inhibe cette interaction qu' avec une constante d' inhibition de 3 00 M.
Exemple 3
Cet exemple permet de démontrer que des peptides mutants de la protéine nNOS, représentés par les séquences SEQ ID NO: 3 ou SEQ ID NO: 4, présentant une meilleure affinité pour la protéine PIN que la protéine nNOS, sont capables d'inhiber l'interaction enhe les protéines nNOS et PIN en utilisant l'analyse par résonance
plasmonique de surface.
La liaison de PIN sur la protéine nNOS immobilisce (Alexis) est analysée par BIACORE 2000 (Biacore AB) en présence ou en absence des poptides synthétiques. La protéine nNOS, à la concentration de 10,ug/ml dans 10 mM de tampon acétate pH 5,5, est couplée sur un canal d'un biocapteur CM5 (Biacore AB, par exemple) en utilisant le protocole NHS-EDC, ce qui conduit à une densité de protéine immobilisée d'environ 2000 pg/mm2. La protéine PIN à 5 1lg/ml est préincubée en présence de concentrations croissantes de peptides (1 à 100,ug/ml) pendant 30 minutes puis est injectée sur la puce avec un flux de 30,ul/min. Les sensorgrammes correspondant à la liaison des peptides sur la protéine nNOS sont enregistrés avec un temps d'association de 180 secondes et un temps de dissociation de 400 secondes. Les constantes d' association et de dissociation sont déterminées à partir du sensorgramme en utilisant le logiciel BIAevaluation 3.0 (Biacore AB) et une méthode d'analyse dite globale (analyse simultanée des constantes cinétiques d' association et de dissociation pour les sensorgrammes correspondant à toutes les concentrations de peptides utilisces). Les contrôles sont réalisés en injectant sur la nNOS le peptide quelconque (défini ci-dessus),
préincabé avec PIN.
En présence du peptide nNOS normal (voir Figure 8A), la liaison de PIN sur la protéine nNOS est inhibée à 19% pour 20 g/ml de peptide, inhibition plaDonnant à 45% pour 50 et 100,ug/ml. Par contre, le peptide mutant, représenté par la séquence SEQ ID NO: 3 (voir Figure 8B) entrâîne une inhibition de la liaison de PIN sur la protéine nNOS de 59% à 5 1lg/ml et bloque quasi complètement cette interaction à 30 et ,ug/ml (90 et 91% respectivement). Il en est de même pour le peptide mutant, représenté par la séquence SEQ ID NO: 4 (voir Figure 8C) qui inhibe la liaison de PIN sur la protéine nNOS à 75% dès la concentration de 1 1lg/ml et inhibe totalement cette interaction à 10 1lg/ml (98%). D'après les courbes d'inhibition de la liaison de PIN sur la protéine nNOS en fonction de la concentration de peptide utilisé (Figure 8D), le poptide, représenté par la séquence SEQ ID NO: 3, présente une constante d'inhibition (K;: IC50) de 4 M et le peptide, représenté par la séquence SEQ ID NO: 4, une constante d'inhibition de 0,4 M. Les deux peptides mutants sont donc capables
d'inkiber l'interaction entre les protéines PIN et nNOS.
33 2823854
J
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Claims (13)

REVENDICATIONS
1. Procédé de détection de composés modulant la complexation entre la protéine oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS), représentée par la séquence SEQ ID NO: 2, ou l'un de ses variants et la protéine inhibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale (PIN), la modulation de cette complexation entraînant une modification de la réponse insulinique régulée par la protéine nNOS ou l'un de ses variants, sans modifier substantiellement l'activité catalytique de la protéine nNOS ou de l'un de ses variants, dans lequel: - on incube un mélange comprenant ledit composé, la protéine PIN et la protéine nNOS ou l ' un de ses variants, l' étape d' incubation étant effectuée dans des conditions permettant: À la formation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, À la formation d'un complexe entre d'une part le susdit composé et d'autre part la protéine PIN ou la protéine nNOS ou l'un de ses variants, - on détecte la variation significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants par rapport à une valeur de contrôle, correspondant, par exemple: * soit à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants en l'absence du composé soumis au procédé de détection, * soit à l'absence de complexe entre la protéine:PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, résultant soit de l'absence de la protéine PIN soit de l'absence de la protéine nNOS ou de l'un de ses variants, * soit à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants en présence d'un inhibiteur de référence, et, - on en déduit, lorsqu'il y a eu variation significative telle que définie ci-dessus, qu'il y a eu liaison entre d'une part le susdit composé et d'autre part la protéine PIN ou la protéine nNOS ou l'un de ses variants, ce qui entrâîne la modulation de la
complexation entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants.
? _ 35
2. Procédé de détection de composés diminuant la complexation entre la protéine oxyde nitrique synthase neuronale (nNOS), représentée par la séquence SEQ ID NO: 2, ou l'un de ses variants et la protéine inLibitrice de l'oxyde nitrique synthase neuronale (PIN), la diminution de cette complexation entrâînant une réduction de la réponse insulinique régulée par la protéine nNOS ou l'un de ses variants, sans modifier substantiellement l'activité catalytique de la protéine nNOS ou de l'un de ses variants, dans lequel: - on incube un mélange comprenant ledit composé, la protéine PIN et la protéine nNOS ou l 'un de ses variants, l' étape d 'incubation étant effectuée dans des conditions permettant: la formation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, la formation d'un complexe entre d'une part le susdit composé et d'autre part la protéine PIN ou la protéine nNOS ou l'un de ses variants, - on détecte la diminution significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants par rapport à une valeur de contr81e, correspondant, par exemple: * soit à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants en l'absence du composé soumis au procédé de détection, * soit à l'absence de complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants, résultant soit de l'absence de la protéine PIN soit de l'absence de la protéine nNOS ou de l'un de ses variants, * soit à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants en présence d'un inhibiteur de référence, et, - on en déduit, lorsqu'il y a eu diminution significative telle que définie ci dessus, qu'il y a eu liaison entre d'une part le susdit composé et d'autre part la protéine PIN ou la protéine nNOS ou l'un de ses variants, ce qui entrâîne la réduction de la
complexation entre la protéine PIN et la protéine nNOS ou l'un de ses variants.
3. Procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 2, dans lequel on
détecte la variation, notamment la diminution significative éventuelle de la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine rOS par rapport à une première
ï 2823854
valeur de contr81e, à une deuxième valeur de contrôle et à une troisième valeur de contr81e, l'une de ces valeurs de contr81e correspondant à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine nNOS en l'absence du composé soumis au procédé de détection, l'autre de ces valeurs de contrôle correspondant à l' absence de complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS, résultant soit de l'absence de la protéine PIN soit de l'absence de la protéine nNOS, et l'autre de ces valeurs de contrôle correspondant à la quantité de complexe formé entre la protéine PIN et la protéine
nNOS en présence d'un inhibiteur de réDérence.
4. Procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 3, dans lequel le
mélange comprenant la protéine PIN, la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection est préparé: - soit en ajoutant simultanément la protéine PIN, la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection, - soit en ajoutant successivement: la protéine PIN, le composé soumis au procédé de détection et la protéine nNOS, ou successivement: la protéine nNOS, le composé soumis au procédé de détection et la protéine PIN, - soit en ajoutant ledit composé préalablement incubé avec la protéine PIN ou la
protéine nNOS, et respectivement soit la protéine nNOS soit la protéine PIN.
5. Procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la
protéine nNOS est préalablement fixée sur un support solide.
6. Procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la
protéine PIN est préalablement fixée sur un support solide.
7. Procédé de détection selon l'une des revendications 1 à 4, dans lequel la
protéine PIN et la protéine nNOS sont en solution.
8. Protéine caractérisée en ce qu'elle comprend ou est constituée par la séquence SEQ ID NO: 2 ou fragment de ladite protéine comprenant au moins 100 acides aminés sous réserve que ledit fragment contienne l'acide aminé en position
(269).
7 2823854
9. Peptides de séquence: - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO:3), - Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO:4), - CysAsp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO: 5), - Ile-Asp-Thr-Gly-IleGln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQ ID NO:6), - Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-ArgAsp (SEQ ID NO:7), - Lys-Asp-Ala-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO:8), - Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO:9), - Lys-Asp-GluGly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO:10 - Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-ValAsp-Arg-Asp (SEQ ID NO:11), - Lys-Asp-Lys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQ ID NO: 12 - Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO: 13 Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO: 14 - Lys-Asp-Thr-GlyIle-Gln-Thr-Asp-Arg-Asp (SEQID NO: 15 - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-CysArg-Asp (SEQID NO: 16 - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asn-Arg-Asp (SEQID NO:17 - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Leu-Asp (SEQ ID NO:18 - Lys-AspThr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Cys-Asp (SEQ ID NO:19 - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-GlnVal-Asp-Phe-Asp (SEQ ID NO: 20 - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Tyr-Asp (SEQ ID NO: 21 - Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Phe (SEQID NO: 22 Lys-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Trp (SEQID NO: 23 - Val-Asp-Thr-GlyIle-Gln-Val-Asp-Arg-Tyr (SEQ ID NO:24 - Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-AspTrp-Trp (SEQID NO: 25), - Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 26), - Ile-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Asp-Trp-Trp (SEQID NO: 27), - IleAsp-Val-Gly-Ile-Gln-Thr-Cys-Trp-Trp (SEQID NO: 28), - Cys-Asp-Thr-Gly-IleGln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 29 - Ile-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-TrpAsp (SEQ ID NO: 30), - Val-Asp-Thr-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 31 - Lys-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 32 - C:ys-Asp-ValGly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO:33 - Val-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-ValAsp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 34 - Cys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 35),
38 2823854
Ile-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 36), Val-Asp-Ile-GlyIle-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 37), Lys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-AspTrp-Asp (SEQ ID NO: 38 ys-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 39 - Ile-Asp-Phe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO:40), - Val-AspPhe-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO:41 - Cys-Asp-Glu-Gly-Ile-GlnVal-Asp-Trp-Asp (SEQ IDNO: 42 - Ile-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 43), - Val-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 44 _ Lys-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 45 - Cys-Asp-Cys-GlyIle-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 46 - Ile-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-AspArg-Asp (SEQ ID NO: 47), - Val-Asp-Cys-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Arg-Asp (SEQID NO: 48 - His-Asp-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 49 - Ser-AspVal-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO:50), - Thr-Asp-Val-Gly-Ile-GlnVal-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 51 - Lys-Glu-Val-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 52 - Lys-Asp-Ile-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ ID NO: 53), Lys-Asp-Glu-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQ IDNO: 54 - Lys-Asp-Gln-GlyIle-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 55 - Lys-Asp-Val-Ala-Ile-Gln-Val-AspTrp-Asp (SEQ ID NO: 56 - Lys-Asp-Val-Gly-Val-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 57 - Lys-Asp-Val-Gly-Thr-Gln-Val-Asp-Trp-Asp (SEQID NO: 58 - Lys-AspVal-Gly-Ile-Gln-Val-Asp-Ile-Asp (SEQID NO: 59), - Lys-Asp-Val-Gly-Ile-GlnVal-Asp-Trp-Glu (SEQID NO: 60 - Ala-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 61), - Arg-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 62), - Asn-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 63), - Asp-Ile-GluPro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 64), - Gln-Ile-Glu-Pro-Val-LeuSer-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 65), Gly-Ile-Glu-Pro-Val-Lèu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 66), Pro-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 67), Ser-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQID NO: 68), Thr-Ile-Glu-ProVal-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 69),
39 2823854
Glu-Phe-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 70), Glu-Ile-Asn-ProVal-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO:71), Glu-Ile-Asp-Pro-Val-Leu-Ser-IleLeu-Asn (SEQ ID NO: 72), Glu-Ile-Cys-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 73), - Glu-Ile-Gln-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 74), - GluIle-Glu-Ala-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 75), - Glu-Ile-Glu-ArgVal-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 76), - Glu-Ile-Glu-Asn-Val-Leu-SerIle-Leu-Asn (SEQ ID NO: 77), - Glu-Ile-Glu-Asp-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO:78), - Glu-Ile-Glu-Gln-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 79), - Glu-Ile-Glu-Glu-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO:80), - Glu-Ile-GluGly-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ IDNO:81), - Glu-Ile-Glu-His-Val-Leu-SerIle-Leu-Asn (SEQ ID NO: 82), - Glu-Ile-Glu-Lys-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 83), - Glu-Ile-Glu-Met-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO:84), - Glu-Ile-Glu-Ser-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 85), - Glu-Ile-GluThr-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO:86), - Glu-Ile-Glu-Pro-Ile-Leu-SerIle-Leu-Asn (SEQ ID NO:87), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Pro-Ser-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 88), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ala-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 89) , Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Val-Ile-Leu-Asn (SEQ ID NO: 90), - Glu-IleGlu-Pro-Val-Leu-Ser-Leu-Leu-Asn (SEQ ID NO:91 - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-LeuSer-Phe-Leu-Asn (SEQ ID NO: 92 - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Trp-Leu-Asn (SEQ ID NO: 93 - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Tyr-Leu-Asn (SEQ IDNO:94 Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Val-Leu-Asn (SEQ IDNO:95 - Glu-Ile-Glu-ProVal-Leu-Ser-Ile-Leu-Ala (SEQ ID NO: 96), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-SerIle-Leu-Asp (SEQ ID NO: 97), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Gln (SEQ ID NO: 98), - Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Glu (SEQ ID NO: 99) , Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Gly (SEQ IDNO:100 Glu-Ile-Glu-ProVal-Leu-Ser-Ile-Leu-His (SEQ IDNO:101), Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-IleLeu-Met (SEQ ID NO: 102 Glu-Ile-Glu-Pro-Val-L6u-Ser-Ile-Leu-Pro (SEQ ID NO: 1 03
.:,.. ..
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Glu-Ile-Glu-Pro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Ser (SEQ ID NO: 104) et Glu-Ile-GluPro-Val-Leu-Ser-Ile-Leu-Thr (SEQ ID NO: 105), lesdits poptides étant des composés tels que détectés par le procédé selon l'une des
revendications 1 à 7, et présentant une plus grande affinité pour la protéine PIN que
celle présentée par l'une des protéines selon la revendication 8, vis-àvis de la protéine PIN.
10. Acide naclélque codant pour l'une des protéines, l'un des fragments de
protéines ou 1'un des peptides selon l'une des revendications 8 ou 9, ledit acide
nuclélque ayant notamment la séquence nucléotidique SEQ ID NO: 1.
11 Composition pharmaceutique caractérisoe en ce qu'elle comprend une protéine ou un fragment de protéine selon la revendication 8, en association avec un
véhicule pharmaceutiquement acceptable.
12. Utilisation des protéines ou des fragments de protéines selon la revendication 8, pour la préparation de médicaments destinés au traitement des états
prédiabétiques ou hyperinsuliniques.
13. Kit ou trousse de détection d'un composé modulant, notamment réduisant la complexation entre la protéine PIN et la protéine nNOS, comprenant: la protéine nNOS, représentée par la séquence SEQ ID NO: 2, - la protéine PIN, - des milieux ou des tampons nécessaires à la dilution, éventuellement des moyens de lavage, - des milieux ou des tampons permettant la formation d'un complexe entre la protéine PIN et la protéine nNOS et la formation d'un complexe entre la protéine PIN ou la protéine nNOS et le composé soumis au procédé de détection, - des moyens de détection de la variation, notamment de la diminution de la
quantité de complexe formé entre la protéine nNOS et entre la protéine PIN.
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