FR2968013A1 - Methode de retention conditionnelle d'une proteine d'interet dans le reticulum endoplasmique - Google Patents

Abstract

L'invention concerne un acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant un domaine de rétention conditionnelle constitué d'un domaine FRB suivi d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique. Les vecteurs d'expression et cellules transformées par de tels vecteurs font également partie de la présente invention. Sous un autre aspect, l'invention comprend également des méthodes de rétention conditionnelle dans le réticulum endoplasmique de protéine d'intérêt mettant en œuvre ces vecteurs ainsi que des kits ou trousse de réactifs comprenant de tels acides nucléiques ou vecteurs.

Description

L'invention est relative à une méthode de rétention conditionnelle dans le réticulum endoplasmique de protéines d'intérêt.

Les techniques permettant de réguler les processus biologiques mis en oeuvre par les cellules sont très précieuses pour l'étude et la compréhension des mécanismes de fonctionnement de la cellule. Par exemple, les méthodes de régulation de l'expression des protéines permettent d'en apprécier le rôle dans le contexte d'une cellule vivante. Ces méthodes sont largement basées sur l'introduction dans les cellules de vecteurs d'expression comprenant la séquence d'une protéine d'intérêt, ou bien celle d'une protéine dont la présence dans la cellule va réguler, de manière directe ou indirecte, l'expression d'une autre protéine d'intérêt.

Les auteurs de la demande internationale de brevet WO94/18317 de l'Université de Stanford ont par exemple proposé une approche permettant de réguler certains événements biologiques basée sur l'utilisation de constructions moléculaires chimériques comprenant d'une part un domaine effecteur et d'autre part au moins un domaine permettant leur dimérisation en présence d'un ligand donné. Selon cette méthode, l'ajout au milieu extracellulaire du ligand approprié entraine la formation de dimères de protéines chimériques, et le rapprochement des domaines effecteurs qui vont pouvoir activer certains processus biologiques, comme par exemple la transcription d'une séquence nucléique cible. Dans cette demande de brevet, les ligands sont en fait constitués d'au moins deux ligands liés par liaison covalente, chacun étant capable de se lier à l'une des protéines chimériques.

La demande internationale de brevet WO96/41865 d'Ariad Gene Therapeutics décrit une méthode similaire basée sur l'interaction entre les protéines FKBP et FRB en présence de rapamycine ou d'un de ses dérivés. Cette méthode consiste à introduire dans une cellule deux constructions moléculaires codant chacune pour une protéine de fusion comprenant d'une part, la protéine FKBP liée à un premier domaine effecteur et d'autre part la protéine FRB liée à un deuxième domaine effecteur. L'ajout de rapamycine au milieu extracellulaire provoque la formation d'un complexe FRB-rapamycine-FKBP, ce qui va avoir pour effet de rapprocher les domaines effecteurs et par la même de déclencher ou réguler un processus biologique donné, notamment la transcription d'un gène d'intérêt ou l'agrégation de protéines pour en provoquer l'activation.

Cette technique est commercialisée par la société Ariad sous le nom commercial ArgentTM Des analogues de rapamycine présentant un effet immunosuppresseur moins important que celui de la rapamycine ont été décrits dans la demande internationale de brevet WO99/36553. Des analogues de l'épirapamycine ont été publiés dans la demande internationale de brevet WO01/14387. Ces dérivés de la rapamycine peuvent potentiellement être utilisés dans la méthode générale décrite dans la demande WO96/41865. Alors que les techniques de régulation de l'expression protéique au niveau transcriptionnel sont largement connues et ont donné lieu à la commercialisation de nombreux réactifs, il en va différemment des méthodes permettant de contrôler la migration des protéines du réticulum endoplasmique vers le compartiment où elles sont normalement adressées, pour lesquelles très peu de procédés existent. Ce type d'approche a l'avantage, par rapport aux systèmes de contrôle de la transcription, d'offrir un bien meilleur contrôle temporel de la sécrétion d'une protéine d'intérêt ou de sa migration du compartiment golgien vers la membrane plasmique. La demande internationale de brevet WO00/23602 décrit une méthode permettant de contrôler la sécrétion de protéines d'intérêt, ainsi que des produits utiles à la mise en oeuvre de cette méthode, basés sur l'utilisation de domaines de rétention conditionnelle (« CRD »). Ces domaines sont exprimés sous forme de protéine de fusion avec une protéine d'intérêt et ont la propriété de retenir ladite protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique, à moins qu'un ligand particulier ne soit ajouté au milieu cellulaire. Quelques exemples de domaines CRD sont présentés dans la demande, comme la protéine de liaison du rétinol (RBP, pour « Retinol Binding Protein » en langue anglaise), le mutant Z de l'antitrypsine alpha 1, et un mutant de l'alpha-galactosidase A. La méthode est illustrée en détail avec le mutant F36M de la protéine hFKBP12. Les protéines comportant cette mutation ont la capacité de former des dimères, et cette dimérisation est réversible en présence de dérivés de la rapamycine qui se lient à hFKBP12. Ce mutant, lorsqu'il est exprimé sous forme de protéine de fusion avec une protéine d'intérêt normalement sécrétée, entraine l'agrégation de ces protéines dans le réticulum endoplasmique, empêchant ainsi leur sécrétion. En présence d'un dérivé de la rapamycine, les dimères se désagrègent et la protéine d'intérêt est sécrétée à la surface de la cellule. Les auteurs ont également essayé d'utiliser cette technique avec une protéine membranaire (le récepteur LNGFR, «Low-affinity nerve growth factor receptor» en langue anglaise) pour en réguler la migration du compartiment golgien vers la membrane cellulaire. Cependant, cette technique a fonctionné avec un succès mitigé dans ce contexte puisque une quantité importante de protéine n'est pas retenue dans le réticulum endoplasmique [p.71 1.25], sans doute en raison de contraintes physiques qui limitent l'agrégation des protéines d'intérêt quand celles-ci sont des protéines membranaires. Par ailleurs, cette méthode est très mal adaptée à l'étude de l'oligomérisation des récepteurs membranaires puisque elle peut perturber les mécanismes naturels de formation d'oligoméres. De plus, les auteurs préconisent d'inclure dans la protéine de fusion un site de clivage par des enzymes du compartiment golgien (telle que la furine), ce qui rajoute un paramètre de variabilité à l'utilisation de cette méthode. La société Ariad Gene Therapeutics exploite cette technologie à travers un produit vendu sous le nom commercial de «RPF TM Regulated Secretion / Aggregation Kit».

Il serait particulièrement utile de disposer d'une technique permettant de contrôler la rétention d'une protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique, sans utiliser l'agrégation de ces protéines comme mécanisme de rétention, notamment pour pouvoir étudier l'oligomérisation naturelle des récepteurs membranaires. La présente invention fournit une méthode et des produits permettant de résoudre ce problème. La demanderesse a mis en évidence qu'il était possible de retenir de manière conditionnelle une protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique d'une cellule animal en fusionnant cette protéine d'intérêt avec une domaine FRB suivi d'un signal de rétention endoplasmique, ladite protéine d'intérêt pouvant être ensuite rapidement libérée de l'intérieur du réticulum endoplasmique pour migrer notamment vers la surface de la cellule en présence de rapamycine. De plus, la demanderesse a mis en évidence qu'il n'était pas nécessaire de coexprimer cette protéine de fusion avec la protéine FKBP interagissant avec FRB, la concentration endogène intracellulaire de FKBP dans ces cellules étant suffisante pour obtenir le masquage réversible du signal de rétention endoplasmique.

La présente invention a pour objet une protéine de fusion dont la libération du réticulum endoplasmique est conditionnée par la présence dans l'environnement de la cellule de rapamycine, ou d'un de ses dérivés. L'invention est également relative à un acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon l'invention, ainsi qu'à des vecteurs d'expression et des cellules les contenant. L'invention concerne aussi une méthode de rétention conditionnelle d'une protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique, permettant ainsi de contrôler la translocation d'une protéine vers la membrane plasmique, le cytosol, ou bien sa sécrétion dans le milieu extracellulaire. Cette approche est particulièrement utile pour étudier les phénomènes d'oligomérisation des protéines membranaires, mais également et de manière beaucoup plus générale, dans tous les cas où l'on souhaite augmenter l'expression d'une protéine d'intérêt donnée tout en limitant les effets nocifs potentiels liés à l'augmentation de l'activité de cette protéine, qui grâce à l'invention peut être stockée dans le réticulum endoplasmique. Ce type d'outil est particulièrement intéressant dans le cadre du criblage de médicament sur cellules vivantes, puisqu'il permet d'induire la translocation de la protéine étudiée juste avant le test, et cela de manière relativement rapide par rapport aux techniques de l'art antérieur basées sur l'induction de la transcription de gènes d'intérêt. L'invention porte enfin sur des kits ou trousse de réactifs comprenant de tels vecteurs ou cellules transformées avec ces vecteurs pour la mise en oeuvre de ces méthodes de rétention ou de criblage.

Dans un premier aspect, l'invention concerne un acide nucléique codant pour une protéine de fusion dans un même cade de lecture, ladite protéine de fusion comprenant une protéine d'intérêt, cette protéine de fusion ayant la particularité de n'être libérée par le réticulum endoplasmique que lorsque de la rapamycine ou un de ces analogues (connus sous le terme de «rapalogues ») est introduite dans l'environnement de la cellule, par exemple dans le milieu extracellulaire.

Les protéines de fusion qui forment le deuxième aspect de la présente invention comprennent : (i) une protéine d'intérêt que l'on souhaite étudier et, à son extrémité C-terminale, (ii) un domaine de rétention conditionnelle comprenant - un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle-même constituée par - un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique.

Les inventeurs ont découvert que lorsque de telles protéines de fusion sont exprimées dans la cellule, elles sont retenues dans le réticulum endoplasmique, à moins que de la rapamycine ou un rapalogue ne soit ajouté au milieu extracellulaire. Dans ce cas, un complexe de rapamycine (ou rapalogue)-FKBP endogène se forme et va se lier au domaine FRB de la protéine de fusion de l'invention. La formation du complexe FRB-rapamycine(ou rapalogue)-FKBP a pour effet de masquer le motif de rétention dans le réticulum endoplasmique et la protéine de fusion est alors libérée de ce compartiment, pour gagner par exemple la membrane plasmique s'il s'agit d'une protéine membranaire, ou bien encore dans le cas d'une protéine soluble gagner le cytosol ou être excrétée par la cellule. De manière surprenante, il n'est pas nécessaire d'augmenter la quantité de FKBP intracellulaire pour que la protéine de fusion soit retenue dans le réticulum endoplasmique : A l'inverse de ce qui a été décrit dans l'art antérieur lorsque les systèmes FRB-FKBP ont été utilisés (notamment dans les produits de la société Ariad), il n'est pas nécessaire de transfecter dans la cellule un plasmide d'expression de FKBP, puisque les inventeurs ont découvert que la FKBP endogène est suffisante à la mise en oeuvre de l'invention.

Dans un troisième aspect, l'invention est relative à des vecteurs, en particulier des plasmides d'expression contenant les acides nucléiques selon l'invention.

Dans un dernier aspect, l'invention concerne une méthode de contrôle de la rétention d'une protéine d'intérêt dans le réticulum endoplasmique

Les caractéristiques essentielles communes aux différents aspects de l'invention sont décrites ci-après.

Ainsi, sous un premier aspect, la présente invention a pour objet un acide nucléique, de préférence isolé, codant, dans un seul cadre de lecture, pour une protéine de fusion, ladite protéine de fusion comprenant: a) une protéine recombinante d'intérêt, et b) à l'extrémité C-terminale de ladite protéine recombinante d'intérêt, un domaine de rétention conditionnelle constitué d'une protéine comprenant un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle-même constituée d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique.

Une autre caractéristique essentielle des protéines de fusion codées par les acides nucléiques selon l'invention est la présence d'un domaine FRB. Les domaines FRB sont connus de l'homme du métier et ont été décrit notamment dans les demandes internationales de brevet WO99/36553, WO99/010510 et le brevet Européen EP833894. Les domaines FRB sont des domaines polypeptidiques, généralement d'au moins environ 89 à 100 acides aminés, qui sont capables de former un complexe tripartite avec une protéine FKBP et la rapamycine (ou un de ses analogues, également appelé «rapalogue »). Les domaines FRB sont présents dans un certain nombre de protéines naturelles, notamment les protéines FRAP (également connues sous les noms RAPT 1 ou RAFT) humaines ou d'autres espèces, les protéines de levure Torl et Tor2, et un analogue de FRAP de que l'on trouve chez les levures de type Candida. Les séquences nucléiques codant pour ces protéines sont connues et permettent la synthèse ou le clonage de leurs domaines FRB : - FRAP humaine (ADNc de séquence SEQ ID NO. 23 et protéine de séquence SEQ ID NO. 24, (Brown et al, 1994, Nature 369, 756-758; GenBank numéro Accession #L34075, Seq ID 508481; Chiu et al, 1994, PNAS USA 91, 12574-12578; Chen et al. 1995. PNAS USA 92. 4947-4951) - RAPT1 murine Chiu et al. supra (Protéine de séquence SEQ ID NO. 29, GenBank numéro d'accession NP_064393)

- Torl levure, S. cerevisiae (ADNc de séquence SEQ ID NO. 25 et Protéine de séquence SEQ ID NO. 26, Helliwell et al, 1994, Mol Cell Bio15. 105-118; EMBL 30 Accession #X74857. NCBI Seq Id #468738

- Tor 2 levure, S. cerevisiae (ADNc de séquence SEQ ID NO. 27 et Protéine de séquence SEQ ID NO. 28, Kunz et al. 1993, Cell 73, 585-596: EMBL Accession #X71416, NCBI Sea ID 298027 35 - Homologue FRAP Candida (voir la demande internationale de brevet WO95/33052).

La figure 2 de Chiu et al, supra, montre un alignement de 160 acides aminés correspondant aux domaines FRB des protéines FRAP humaine, FRAP murine, Torl et Tor2 de S. cerevisiae. De préférence, le domaine FRB utilisé dans la présente invention comprendra les 89 acides aminés compris entre les résidus Glu-39 et Lys/Arg-127 des séquences de cette figure. Pour référence, en utilisant la numérotation de Chen et al ou Sabitini et al, ce domaine FRB de 89 acides aminés est compris entre les résidus numéroté Glu-2025 à Lys-2113 dans le cas FRAP humaine, Glu-1965 à Lys-2053 dans le cas de Tor2, et Glu-1962 à Arg-2050 dans le cas de la Torl.

Le domaine FRB utilisé dans les produits et méthodes selon l'invention est donc choisi pour sa capacité à se lier à un complexe de FKBP avec la rapamycine ou un rapalogue, et comprends une des séquences peptidiques naturelles constituée des 89 acides aminés mentionnés ci-dessus, ou encore les domaines correspondant dans des protéines analogues. Selon un mode également préférée, ce domaine FRB peut contenir jusqu'à une dizaine, de préférence de 1 à 5, substitutions d'acides aminés, des insertions ou des suppressions au sein de cette région par rapport à la séquence naturelle; il peut être codé par une séquence d'ADN capable de s'hybrider spécifiquement et de manière sélective à une molécule d'ADN codant pour le domaine FRB d'une protéine naturelle, sous réserve de la dégénérescence du code génétique.

Une hybridation spécifique signifie que l'hybridation est réalisée dans des conditions de forte stringence, en particulier dans des conditions de température et de force ionique telles qu'elles permettent le maintien de l'hybridation entre deux fragments d'ADN globalement complémentaires. A titre illustratif, des conditions de forte stringence de l'étape 30 d'hybridation aux fins de définir les séquences nucléotidiques décrites ci-dessus, sont avantageusement les suivantes. L'hybridation est réalisée à une température préférentielle de 65°C, en présence de tampon 6 x SSC, 5 x de solution de Denhardt, 0,5 % SDS et 100 µg/ml d'ADN de sperme de saumon. 1 x SSC correspond à 0,15 M NaCl et 0,05 M de citrate de sodium et une solution de 1 x Denhardt correspond à 0,02 % Ficoll, 0,02 % de polyvinylpyrrolidone et 0,02 % de sérum albumine bovine. Les étapes de lavage peuvent, par exemple, être effectuées pendant 5 à 5 30 min. à 65°C, dans un tampon 2 x SSC ou 1 x SSC et à 0,1 % SDS. Les conditions d'hybridation de forte stringence décrites ci-avant pour un polynucléotide de taille définie, seront adaptées par l'homme du métier pour des oligo-nucléotides de taille plus grande ou plus petite, selon l'enseignement de Sambrook et al., 1989. 10 De préférence, les conditions d'hybridation seront dites spécifiques dés lors que seules les séquences présentant au moins 90 % d'identité avec la séquence complémentaire de la séquence ciblée pourront hybrider, de préférence celles présentant au moins 92,5 %, 95 %, 97,5 %, 98 %, 99 %, 99,5 % avec cette séquence complémentaire de la séquence cible. 15 De préférence, le domaine FRB comprend une séquence d'acide de 89 acides-aminés correspondant aux acides aminés 2025-2113 de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24. Dans une autre mise en oeuvre préférée, le domaine FRB comprends une 20 séquence de 93 acides aminés correspondant aux acides aminés 2021-2113 de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24. Ces domaines se lient à la protéine FKBP complexée avec la rapamycine.

Des mutants de ces domaines peuvent également être utilisés ; ces 25 mutants présentent l'avantage de se lier à des complexes de FKBP avec des rapalogues, de manière préférentielle par rapport aux domaines FRB endogènes.

Les rapalogues correspondant à la rapamycine dont le carbone 7 a été substitué par autre chose qu'un groupe -OMe peuvent reconnaitre 30 préférentiellement les domaines FRB dont un ou plusieurs des acides aminés suivant ont fait l'objet de substitution : Tyr2038, Phe2039, Thr2O98, G1n2099, Trp21 01 et Asp2102. On peut citer à titre d'exemple les domaines FRB de hFRAP portant les mutations suivantes : Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2102A, T2098A, T2098N, T2098L et T2098S. 35 Le domaine FRB constitué des acides aminés 2021-2113 de hFRAP est un domaine FRB préféré. Le même domaine mais portant la mutation T2098L (dénommé « FRB* » de séquence SEQ ID NO ; 2) est également préféré, en particulier lorsque le rapalogue AP21967 (voir Figure 1) est utilisé.

Les rapalogues correspondant à la rapamycine dont le carbone 28 a été substitué par autre chose qu'un groupe -OH, ou bien dont le carbone 30 a été substitué par autre chose qu'un groupe =0 peuvent reconnaitre préférentiellement les domaines FRB dont l'acide aminé G1u2032 a été substitué par un autre acide aminé. On peut citer à titre d'exemple les mutations E2032A et E2032S.

Dans un mode de réalisation préféré de l'invention, le domaine FRB est choisi parmi les domaines suivants : a) - le domaine FRB de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24, ou 15 l'un de se fragments capable de fixer la rapamycine ; - le domaine FRB de la protéine RAPT1 murine de séquence SEQ ID NO. 29, - le domaine FRB de la protéine Torl de levure de séquence SEQ ID NO. 26 ; ou - le domaine FRB de la protéine Tor 2 de levure de séquence SEQ ID NO. 28, b) un domaine FRB dont la séquence présente au moins 80 % d'identité avec l'une 20 des séquence de domaine FRB tel que défini en a) et capable de se fixer à la protéine FKBP, ou encore c) un fragment de domaine tel que défini en a) ou b), ledit fragment étant capable de se fixer à la protéine FKBP.

25 Selon un mode de réalisation également préféré de l'invention le domaine FRB est choisi parmi les domaines suivants : a) - le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2025 et 2113 » de la séquence SEQ ID NO. 24 ; - le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2021 et 30 2113 de la séquence SEQ ID NO. 24 ; - le fragment de la protéine Torl de levure compris entre les acides aminés 1962 et 2050 de séquence SEQ ID NO. 26 ; ou - le fragment de la protéine Tor2 de levure compris entre les acides aminés 1965 et 2053 de séquence SEQ ID NO. 28, b) un domaine FRB dont la séquence présente au moins 80 % d'identité avec l'une des séquence de domaine FRB tel que défini en a) et capable de se fixer à la protéine FKBP, ou encore c) un fragment de domaine tel que défini en a) ou b), ledit fragment étant capable de 5 se fixer à la protéine FKBP.

De manière encore plus préférée, le domaine FRB est choisi parmi les fragments de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24 compris entre les acides aminés 2021 et 2113 et comportant en outre une des mutations suivantes 10 Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2102A, T2098A, T2098N, T2098L, T2098S, E2032A et E2032S.

De manière encore plus préférée, le domaine FRB choisi le domaine de séquence SEQ ID NO. 2. 15 Par «pourcentage d'identité» entre deux séquences d'acide nucléique ou deux séquences d'acide aminé au sens de la présente invention, on entend désigner un pourcentage de nucléotides ou d'acides aminés identiques entre les deux séquences à comparer, obtenu après le meilleur alignement (alignement optimal), ce 20 pourcentage étant purement statistique et les différences entre les deux séquences étant réparties au hasard et sur toute leur longueur. Les comparaisons de séquences entre deux séquences d'acide nucléique sont traditionnellement réalisées en comparant ces séquences après les avoir alignées de manière optimale, ladite comparaison étant réalisée sur toute la longueur de la séquence de référence. 25 L'alignement optimal des séquences pour la comparaison peut être réalisé, outre manuellement, au moyen de l'algorithme de similarité locale mais surtout au moyen de logiciels informatiques utilisant ces algorithmes (GAP, BESTFIT, FASTA et TFASTA ou encore par les logiciels de comparaison BLAST N ou BLAST P (disponibles en ligne sur le site de NCBI)). 30 Le pourcentage d'identité entre deux séquences d'acide nucléique ou d'acide aminés est déterminé en comparant ces deux séquences alignées de manière optimale et est calculé en déterminant le nombre de positions pour lesquelles le nucléotide ou l'acide aminé est identique entre les deux séquences, en divisant ce nombre de positions identiques par le nombre total de positions et en multipliant le 35 résultat obtenu par 100 pour obtenir le pourcentage d'identité entre ces deux séquences.

Par exemple, on pourra utiliser le programme BLAST, «BLAST 2 sequences» (Tatusova et al., "Blast 2 sequences - a new tool for comparing protein and nucleotide sequences", FEMS Microbiol Lett. 174:247- 250) disponible sur le site http://www.ncbi.nlm.nih.gov/gorflbl2.htm1, les paramètres utilisés pouvant être ceux donnés par défaut (en particulier pour les paramètres «open gap penaltie»: 5, et «extension gap penaltie»: 2; la matrice choisie étant par exemple la matrice «BLOSUM 62» proposée par le programme), le pourcentage d'identité entre les deux séquences à comparer étant calculé directement par le programme.

Les protéines de fusion codées par les acides nucléiques selon l'invention comportent également un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique, constituant l'extrémité C-terminale de ces protéines.

Plusieurs motifs de rétention des protéines dans le réticulum endoplasmique ont été décrits. Dong et al (Biochim Biophys Acta. 2007 April ; 1768(4): 853-870) rappellent l'existence de 3 types de motifs de rétention identifiés dans les domaines intracellulaires de plusieurs protéines : les motifs KDEL (SEQ ID NO. 10), RXR (SEQ ID NO. 11) et KKXX (SEQ ID NO. 12), auxquels il faut rajouter le motif KXKXX (SEQ ID NO. 13) ou XKXX (SEQ ID NO. 14) décrit notamment pas par Jackson et al (EMBO Journal vol 9 no 10 pp3153-3162, 1990). Dans ces motifs, X représente un acide aminé quelconque.

Les motifs KKXX, KXKXX, XKXX et KDEL, qui doivent se trouver à l'extrémité C-terminale du domaine de rétention conditionnelle, sont préférés aux fins de l'invention.

Lorsque la protéine d'intérêt est une protéine soluble, le motif de rétention KDEL est préféré, alors que lorsqu'elle est une protéine membranaire, les motifs de rétention préférés sont: KKXX, KXKXX, XKXX.

Des exemples particuliers du motif de rétention sont les suivants : - le motif KKTN (SEQ ID NO. 15), - le motif RSR qui contrôle le trafic intracellulaire de la sous-unité GB1 du récepteur GABAB - la protéine E3/19k de l'adénovirus comporte le motif KKMP, - les motifs KKLL (SEQ ID NO. 16), KKRT (SEQ ID NO. 17), KKRD (SEQ ID NO. 18), KKFQ (SEQ ID NO. 19), KKSP (SEQ ID NO. 20), et KKGY (SEQ ID NO. 21), décrits par Vincent et al (J Biol Chel 1998).

Selon l'invention, le motif de rétention est situé immédiatement après le domaine FRB, c'est-à-dire qu'il est localisé immédiatement après l'acide aminé C-terminal de ce domaine.

Dans une mise en oeuvre alternative également préférée, l'acide nucléique selon l'invention est caractérisé en ce que la dite protéine de fusion comprend entre le domaine FRB et le motif de rétention, un fragment peptidique dont le nombre de résidus d'acide aminé est compris ente 1 et 20 acides aminés, de préférence entre 1 et 10 acides aminés.

Les protéines de fusion codées par les acides nucléiques selon l'invention comprennent tout d'abord une protéine recombinante d'intérêt. Cette protéine est une protéine sauvage connue ou l'un de ses mutants dont l'homme du métier souhaite contrôler la rétention dans le réticulum endoplasmique, ou bien une protéine sauvage dont l'extrémité C-terminale a été tronquée. Dans ce dernier cas, l'homme du métier veillera à ce que la troncature n'entraine pas la suppression d'un domaine ou un acide aminé essentiel à la fonction ou au mécanisme auquel il s'intéresse.

Selon la présente invention, la protéine recombinante d'intérêt peut être choisie indifféremment parmi : un récepteur membranaire, un canal ionique, une immunoglobuline, une protéine soluble ou d'autres protéines, comme les protéines thérapeutiques ou diagnostiques. Les produits et méthodes selon l'invention sont néanmoins particulièrement adaptés à l'étude des protéines membranaires, en particulier des récepteurs transmembranaires tels que les récepteurs couplés aux protéines G. Parmi ces derniers, l'invention est avantageusement utilisée avec les RCPG de classe C ou les RCPG de classe A.

Ainsi, selon l'invention ladite protéine recombinante d'intérêt est choisie parmi une protéine intracellulaire, une protéine membranaire ou transmembranaire, ou une protéine soluble, les protéines membranaires ou transmembranaires étant les plus préférées.

Selon un mode particulièrement préféré, la protéine recombinante d'intérêt est choisie parmi les récepteurs couplés aux protéines G de classe C ou de classe A, les récepteurs canaux ou les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque ou associée. Parmi les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque ou associée, on peut encore citer les récepteurs tyrosine kinase, ceux de la superfamille des immunoglobulines, les récepteurs des cytokines, les récepteurs des chimiokines, les récepteurs du TNF ou encore les récepteurs d'adhésion cellulaire.

Parmi ces protéines d'intérêt, on peut citer aussi de façon particulière : - les protéines Ga et (3y - les P-arrestines - les protéines intracellulaires contenant un domaine PDZ - les RAMPs, les GTPases, les Phospholipases (PLC), les Cyclases (adénylate cyclase), les phosphatases, les Kinases (MAPkinases, AKT/PKB, Cycline-CDK, PKA, PKC, c-Src, GRK), - les facteurs de transcription (p53/mdm2, NF-xB, Fos/Jun) - les Immunoglobulines, Selon un autre mode de réalisation préféré, l'acide nucléique selon la présente invention code pour une protéine de fusion qui comporte en outre un domaine d'une enzyme suicide situé en amont de la protéine recombinante d'intérêt.

De préférence, ladite enzyme suicide est choisie parmi 1'06-alkylguanine DNA alkyltransférase ou un de ses mutants, telles que les enzymes SNAP-tag ou CLIP-tag; une déhalogénase ou un de ses mutants, telle que l'enzyme Halotag ; la protéine ACP ou l'un de ses mutants, telle que la protéine ACP-tag.

Il peut être particulièrement utile d'intégrer à la protéine de fusion une séquence correspondant à une enzyme suicide capable de former une liaison covalente avec son substrat. Lorsque le substrat en question comprend un marqueur, tel qu'une molécule fluorescente, cette approche permet en effet de marquer la protéine de fusion avec ladite molécule fluorescente.

Par enzymes suicides on entend des protéines qui ont une activité enzymatique modifiée par des mutations spécifiques qui leur confèrent la capacité de lier rapidement et de façon covalente un substrat. Ces enzymes sont dites «suicides» car chacune ne peut lier qu'une seule molécule fluorescente, l'activité de l'enzyme étant bloquée par la fixation du substrat. Ces enzymes constituent par conséquent un outil de choix pour marquer spécifiquement des protéines d'intérêt avec un rapport d'une molécule fluorescente pour une protéine. Dans cette approche, une enzyme suicide est fusionnée, par les techniques classiques de biologie moléculaire, avec la protéine d'intérêt -de préférence dans sa partie N-terminale si cette protéine est un récepteur couplé aux protéines G ou un récepteur à activité tyrosine-kinase- et le substrat de l'enzyme lié de manière covalente à un marqueur, tel qu'un composé fluorescent, qui est introduit dans le milieu extracellulaire. La réaction enzymatique a pour conséquence la liaison covalente du substrat marqué à l'enzyme, et donc le marquage de la protéine d'intérêt par le composé fluorescent.

On peut citer à titre d'exemple non limitatif les enzymes suivantes : - les mutants de 1'06-alkylguanine DNA alkyltransférase (AGT). Les enzymes SNAP-tag (Juillerat et al, Chemistry & biology, Vo1.10, 313-317 Avril 2003) et CLIP-tag (Gautier et al, Chemistry et Biology, 15, 128-136, février 2008) commercialisées par la société NEB sont des mutants de l'AGT humaine dont les substrats sont respectivement, 1'06-benzylguanine (ci-après abrégée BG) et 1'02-benzylcytosine (ci-après abrégée BC). L'enzyme N-AGT (Gronemeyer et al (Protein engineering, design & selection, vol. 19, no 7, pp 309-3016, 2006) est un autre mutant de cette enzyme dont la réactivité avec 1'06-benzylguanine est meilleure que celle de l'enzyme SNAP-tag. - les mutants d'une déhalogénase (telle que l'enzyme HaloTag commercialisée par Promega) qui génère également une réaction enzymatique du type suicide (voir WO2004/072232), dont certains des substrats sont des composés de la famille des chloroalcanes, en particulier les chloroalcanes comportant le motif -NH-CHzCHz-O-CHzCHz-O-(CHz)6-Cl. Dans ce cas, le donneur/accepteur sera conjugué à ce type de motif. - La protéine ACP (« Acyl Carrier Protein »), protéine transporteur d'acyles, sur laquelle est transféré, en présence de phosphopantéthéine transférase, le résidu 4'-phosphopantéthéine du coenzyme A sur une sérine de l'ACP (N.George et al, Journal of the American Chemical society 126 (2004) p 8896-8897). Lorsque cette approche est utilisée pour marquer le récepteur membranaire par le donneur ou l'accepteur, il est nécessaire de rajouter au milieu réactionnel de la phosphopantéthéine transférase. La société NEB commercialise un fragment de l'ACP sous le nom commercial «ACP-Tag » pour le marquage de protéines.

Selon un autre mode de réalisation également préféré, l'acide nucléique selon la présente invention code pour une protéine de fusion qui comporte en outre en outre à son extrémité N-terminale un motif d'adressage membranaire, tel que celui du peptide signal T8 ou du peptide signal du récepteur mG1uR5.

En effet, lorsque la protéine d'intérêt est une protéine membranaire, il peut être utile d'inclure dans le plasmide d'expression, en amont de la séquence codant pour la protéine d'intérêt et de celle codant pour l'enzyme suicide -le cas échéant-, une séquence codant pour un peptide d'adressage membranaire, tels que le peptide signal T8 ou le peptide signal du récepteur mG1uR5, dont l'utilisation à cet effet est connue de l'homme du métier. Enfin, il peut également être souhaitable de s'assurer que la séquence codant pour la protéine d'intérêt ne comporte pas de séquence d'adressage membranaire native qui pourrait faire l'objet d'un clivage post-traductionnel de la liaison entre la protéine d'intérêt et l'enzyme suicide : si c'est le cas, il est préférable de ne pas introduire ce domaine dans le plasmide d'expression.

Dans le cas ou l'on travaille sur des cellules intactes, que la protéine d'intérêt est une protéine membranaire, et pour que la réaction enzymatique ait lieu avec le substrat de l'enzyme présent dans le milieu extracellulaire, il est nécessaire que l'enzyme suicide soit exposée au milieu extracellulaire : lorsque la partie N-terminale de la protéine d'intérêt naturelle est exposée au milieu extracellulaire, ce qui est le cas pour les GPCR et les RTK, la protéine de fusion sera construite de telle sorte que l'enzyme suicide soit exprimée dans la partie N-terminale de la protéine de fusion, mais toujours en aval du peptide d'adressage membranaire s'il est présent.

La séquence nucléique codant pour la protéine de fusion selon l'invention peut enfin comprendre en amont de l'ADN codant pour ces protéines, l'ADN codant pour une étiquette telle que par exemple l'épitope FLAG, l'épitope myc, ou encore celui de l'hémagglutinine de l'influenza (HA). Ces étiquettes ne sont pas essentielles mais facilitent la manipulation de la protéine de fusion à des fins de contrôle ou de purification.

Les protéines de fusion codées par les acides nucléiques selon l'invention comportant une enzyme suicide sont très avantageuses lorsque la protéine d'intérêt est une protéine membranaire, en particulier un récepteur tel qu'un récepteur couplé aux protéines G (RCPG), un récepteur a activité tyrosine kinase ou encore une immunoglobuline. Dans ce cas précis, les protéines selon l'invention permettent non seulement de contrôler l'adressage de la protéine d'intérêt vers la membrane plasmique, mais également de la marquer par un composé fluorescent et permettre ainsi toute sorte d'études, notamment relatives à l'oligomérisation des protéines d'intérêt à la surface de la membrane plasmique. Les techniques de l'art antérieur étaient basées sur la rétention contrôlée de protéines d'intérêt par un phénomène d'agrégation de ces protéines dans le réticulum endoplasmique, ce qui pouvait interférer avec les phénomènes d'oligomérisation naturels que l'homme du métier peut étudier avec la présente invention.

La construction de tels acides nucléiques selon l'invention, à partir de séquences connues relève des connaissances générales de l'homme du métier : la séquence de l'acide nucléique codant pour la protéine d'intérêt est disponible dans les diverses base de données, et celles des domaines FRB et motifs de rétention sont également connues et facilement accessibles (voir également description, cf. infra). Les techniques mises en oeuvre pour la construction d'un acide nucléique selon l'invention reposent sur la technique de PCR pour amplifier les différents fragments d'ADN constitutifs de l'acide nucléique selon l'invention, et sur l'utilisation de DNA ligases et d'enzymes de restrictions pour découper et lier ces différents fragments d'acides nucléiques. Les réactifs nécessaires à cette construction sont disponibles dans le commerce et l'homme du métier est familiarisé avec leur utilisation. Il veillera en particulier à ce que les séquences codant pour les différentes parties de la protéine de fusion selon l'invention soient toutes dans le même cadre de lecture.

Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet les protéines de fusion, de préférence isolées, codées par les acides nucléiques selon l'invention.

Compte tenu de la dégénérescence du code génétique, les acides 35 nucléiques codant pour les protéines de fusion selon l'invention sont également compris dans l'invention, ainsi que leur acide nucléique complémentaire.

L'invention est aussi relative à des vecteurs, en particulier des plasmides d'expression contenant les acides nucléiques selon l'invention. Là encore, la préparation de ces vecteurs relève des connaissances générales de l'homme du métier. Des plasmides d'expression sont disponibles dans le commerce, accompagnés d'instruction pour l'introduction d `un fragment d'ADN, tel que celui selon l'invention.

Ces plasmides d'expression peuvent être utilisés pour le développement de cultures cellulaires exprimant les protéines de fusion selon l'invention. Les différentes techniques d'introduction d'un ADN hétérologue dans une cellule vivante sont bien connues de l'homme du métier. Elles comprennent des méthodes basées sur l'utilisation d'agents de transfection (tels que les lipides cationiques, les liposomes, les polyamines, les dendriméres), de techniques mécaniques (électroporation, micro injection ou choc thermique), ou encore de virus (notamment des rétrovirus des adénovirus ou des lentivirus).

Les cellules dans lesquelles sont transfectés les vecteurs d'expression selon l'invention sont des cellules eucaryotes, de préférence des cellules animales, et 20 de manière préférée des cellules de mammifères.

Il faut enfin noter que l'invention est aussi relative à des vecteurs d'expression ne comportant pas de protéines d'intérêt mais comportant simplement une séquence nucléique codant pour un domaine de rétention conditionnelle 25 constitué d'un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle même constituée d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique. Ces domaines FRB et ces motifs de rétention dans le réticulum endoplasmique étant ceux tels que définis ci-avant avec leur préférence. Ce type de vecteurs peut être utilisé par l'homme du métier pour 30 fabriquer des plasmides d'expression selon l'invention avec la protéine d'intérêt de son choix et constitue un produit particulièrement intéressant, tant au niveau technique que commercial.

Ainsi, sous un autre aspect, la présente invention a pour objet un vecteur 35 pour l'expression d'une protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte ou une construction nucléique comprenant un acide nucléique selon l'invention.

La présente invention a aussi pour objet une cellule eucaryote, de préférence une cellule animale, de préférence encore une cellule de mammifère, transformée par un vecteur ou une construction nucléique selon l'invention.

Les cellules humaines et murines sont particulièrement préférées.

Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une méthode in vitro de rétention conditionnelle d'une protéine recombinant d'intérêt dans le réticulum endoplasmique d'une cellule eucaryote en suspension dans un milieu, cette méthode comprenant les étapes suivantes : a) la transfection dans ladite cellule d'un vecteur d'expression selon la l'invention, b) l'ajout dans ledit milieu de rapamycine ou d'un rapalogue, c) l'incubation de la cellule, de préférence pendant une période de 1 15 heure à 4 heures, une période de 3 heures ± 30 min étant préférée.

Cette incubation à l'étape c) provoque la libération de la protéine recombinante d'intérêt du réticulum endoplasmique de la cellule par masquage du motif de rétention par le complexe rapamycine (ou rapalogue) - FKBP. 20 Dans une mise en oeuvre particulière, les cellules sont également transfectées avec un plasmide comprenant une séquence nucléique codant pour la protéine FKBP, et cela pour augmenter la quantité de cette protéine dans la cellule. Comme mentionné plus haut et illustré dans les exemples expérimentaux, les 25 inventeurs ont néanmoins démontré que la présence de ce vecteur additionnel n'est pas indispensable à la mise en oeuvre de la méthode selon l'invention. Des vecteurs codant pour la protéine FKBP sont disponibles auprès de la société Ariad Pharmaceuticals (trousse «Argent»).

30 Les caractéristiques des vecteurs d'expression, et des cellules ont été décrites précédemment, cf. supra.

Le rapalogue peut être l'un de ceux décrit dans les demandes internationales de brevets WO99/36553 ou WO01/14387. Comme indiqué 35 précédemment, le choix du rapalogue peut dépendre du domaine FRB utilisé. L'homme du métier pourra utiliser des rapalogues distribués dans le commerce, qui sont généralement vendus avec des plasmides comprenant la séquence du domaine FRB approprié.

De manière préférée, la méthode selon l'invention est mise en oeuvre avec un vecteur d'expression comportant une séquence nucléique codant pour le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2021 et 2113 de cette protéine et dont la thréonine 2098 a été remplacée par une leucine (domaine FRB de séquence SEQ ID NO.2), et le rapalogue est le composé AP21967 de formule (I) suivante : Sous un autre aspect, la présente invention a pour objet une trousse de réactifs caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un vecteur, une construction nucléique ou une cellule transformée selon l'invention, b) le cas échéant, un vecteurs codant pour la protéine FKBP ; et c) le cas échéant, de la rapamycine ou un rapalogue.

De préférence, la trousse de réactifs selon l'invention est caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un vecteur ou une construction nucléique selon l'invention codant pour une protéine de fusion comprenant une enzyme suicide, de préférence une 06-alkylguanine DNA alkyltransférase ou un de ses mutants, telles que les enzymes SNAP-tag ou CLIP-tag, b) un ou plusieurs marqueurs, de préférence choisi parmi les fluorophores ou les 25 cryptates d'Europium, c) le cas échéant, un vecteurs codant pour la protéine FKBP, et d) le cas échéant, de la rapamycine ou un rapalogue. (I) Selon un autre aspect particulier, les kits ou trousses de réactifs comprenant de tels vecteurs ou acides nucléiques comportant simplement une séquence nucléique codant pour un domaine de rétention conditionnelle constitué d'un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle même constituée d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique (sans la protéine recombinante d'intérêt) font également partie de la présente invention. Les domaines FRB et les signaux de rétention endoplasmiques étant ceux définis ci-avant avec les mêmes préférences.

D'autres caractéristiques et avantages de l'invention apparaissent dans la suite de la description avec figures et les exemples décrits ci-après. Légendes des figures Figure 1 : Formule du composé AP21967. Figure 2 : Organisation topologique de la construction dénommée GB2 WT et des quatre constructions dénommées GB2-FRB*-KKXX (#1 à #4) dans lesquelles les différents domaines protéiques et les sites de fusion FRB*-KKXX dans la partie C-terminale sont indiqués.

Figure 3 : Schéma construction plasmides FLAG-ST-betalAR (aux positions 433 et 462, plasmides #1-#2 respectivement). Figure 4 : Dosage ELISA de l'épitope FLAG effectué sur des cultures cellulaires exprimant FLAG-GB1 ou FLAG-GB2 ou l'une des 4 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-GB2-FRB*-KKXX #1 à 4), avec ou sans perméabilisation préalable. Figure 5 : Dosage ELISA de l'épitope FLAG effectué sur chacune des 4 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-GB2-FRB*-KKXX #1 à 4, en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967 Figure 6 : Dosage ELISA, effectué avec un anticorps monoclonal anti-HA en 30 présence et en l'absence le rapalogue AP21967 su une culture cellulaire exprimant la protéine FLAG-GB2-FRB*-KKXX #2. Figure 7 : Dosage ELISA de l'épitope HA effectué sur culture de cellules présentant deux populations de récepteurs GABAB : une première constituée de dimères HA-ST-GB1 / Myc-GB2 (pop 1), et une seconde constituée de dimères HA-ST-GB1 / FLAG-GB2-FRB*-KKXX (pop2), en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967. Figure 8: Schéma montrant le signal de TR-FRET éventuel résultant du rapprochement de deux populations.

Figure 9 : Signal de FRET évalué par marquage avec un mélange de BGLUMI4TMet BG-D2 sur cellules, effectué après incubation avec le rapalogue et translocation des dimères HA-ST-GB1/FLAG-GB2-FRB*-KKXX à la surface cellulaire. Figure 10 : Schéma montrant le signal de TR-FRET éventuel permettant de vérifier si le rapprochement des sous-unités GB1 observé découle de la formation de nouveaux tétramères ou de l'échange entre les sous-unités GB1 de deux populations 1 et 2. Figure 11 : Mesure de l'expression de l'épitope HA par dosage ELISA, en présence ou pas de rapalogue AP21967 effectuée sur culture de cellules présentant deux 15 populations de récepteurs GABAB. Figure 12 : Signal de FRET (transfert d'énergie Lumi4TM - D2) mesuré au sein de d'une populationl résultant de la formation de tétramères de récepteurs GABAB, après adressage membranaire des d'une population 2. Figure 13 : Signal de FRET observé correspondant au rapprochement de sous unités 20 GB1 des deux populations. Figure 14 : Dosage ELISA de l'épitope FLAG effectué sur des cultures cellulaires exprimant FLAG-GB2-FRB*-KKXX (contrôle) ou l'une des 2 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-ST-betalAR-FRB*-KKXX #1 à 2), en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967. 25

EXAMPLES : Etude de l'oligomérisation de récepteurs membranaires

Les exemples suivants sont relatifs à l'étude de la formation et de la 30 dissociation d'oligoméres de récepteurs membranaires couplés aux protéines G. Ces exemples mettent en oeuvre les produits et méthodes selon l'invention, pour induire l'adressage membranaire de récepteurs, et leur marquage par différents composés fluorescents donneurs ou accepteurs partenaires de FRET (transfert d'énergie par résonance Fôrster). 35 Une première population de récepteurs (pop 1) a été marquée avec des fluorophores TR-FRET compatibles (donneur et accepteur rouge) et l'évolution du signal de TR-FRET de cette population a été enregistrée avant et après le déclenchement de l'adressage membranaire d'une deuxième population (pop2) de récepteurs, marquée par un accepteur vert compatible avec le donneur ayant servi à marquer la première population. Le signal de TR-FRET éventuel résultant du rapprochement des deux populations a également été enregistré.

Cette méthode a été utilisée pour étudier la dynamique et la stoechiométrie des complexes GABAB, qui sont des hétérodimères obligatoires formés des sous-unités GB1 et GB2. Les résultats obtenus suggèrent que le récepteur GABAB forme des tétramères stables, mais que des hétérodiméres GB 1-GB2 existe également à la surface de la cellule dans une moindre proportion. Ces résultats permettent également d'exclure la formation d'oligomères constitués de plus de 4 sous-unités. Le récepteur béta adrénergique betalAR, que certains auteurs ont décrit comme formant des oligomères transitoires, a été étudié avec la même approche.

Les abréviations suivantes sont utilisées : FLAG : épitope Flag HA : épitope HA RE : réticulum endoplasmique ST : enzyme SNAP-tag, forme une liaison covalente avec son substrat Benzylguanine (BG).

GB 1 : sous unité GB 1 du récepteur GABAB GB2 : sous unité GB2 du récepteur GABAB betalAR : récepteur beta 1 adrénergique tampon Tris-KREBS : 20 mM Tris pH 7,4, 118 mM NaCl, 5,6 mM de glucose, 1,2 mM KH2PO4, 1,2 mM de MgSO4, 4,7 mM de KCI, 1,8 mM CaClz BG-Lumi4TM : substrat de l'enzyme SNAP-tag, conjugué avec un cryptate de Terbium - commercialisé par Cisbio Bioassays sous la dénomination commerciale Tag-Lité SNAP-Lumi4Tb BG-d2 : substrat de l'enzyme SNAP-tag, conjugué avec un dérivé de cyanine d2 - commercialisé par Cisbio Bioassays sous la dénomination commerciale Tag-Lité 35 SNAP-rouge BG-fluorescéine : substrat de l'enzyme SNAP-tag, conjugué avec un dérivé de la fluorescéine - commercialisé par Cisbio Bioassays sous la dénomination commerciale Tag-Lité SNAP-green VFT : Venus Flytrap, domaine extracellulaire GABAB HD : domaine heptahélicoïdal CC : hélice superenroulée (CC pour « coiled-coil »)

Exemple 1 : Préparation des plasmides Les plasmides codant pour les protéines de fusion suivantes ont été préparés : Plasmide 1 #1: FLAG-GB2-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 3). Plasmide 1 #2: FLAG-GB2-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 4). Plasmide 1 #3: FLAG-GB2-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 5). Plasmide 1 #4 FLAG-GB2-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 6).

Plasmide 2: FLAG-CT-GB2-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 7). Plasmide 3 #1: FLAG-ST-betalAR-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 8). Plasmide 3 #2 : FLAG-ST-betalAR-FRB*-KKXX (SEQ ID NO. 9).

Les plasmides codant pour les protéines de fusion décrites ci-dessus 20 comportent le peptide signal du récepteur métabotropique du glutamate mGlu5.

Les plasmides codant pour les sous-unités GABABia et GABAB2 portant une étiquette HA, FLAG ou c-Myc à leur extrémité N-terminale ont été décrits précédemment (Kniazeff et al., 2004, Nat. Str. Mol. Biol. 11, 706-713). Le sous- 25 clonage de la séquence Snap-tag (obtenu à partir du plasmide de pSST26m, Covalys, Genève, Suisse) dans ces plasmides au niveau d'un site de restriction M1uI unique situé dans le bras de liaison en aval des étiquettes HA ou FLAG a également été décrit précédemment (Maurel et al., 2008, Nat. Methods. 5(6), 561-567).

30 Un site de restriction Mlul a été ajouté en utilisant la stratégie QuikChange® (Stratagene) en amont de l'ADNc codant pour la betalAR et le fragment M1uI-HindIII a été sous-cloné dans un plasmide pRK5 comportant la séquence codant pour l'étiquette FLAG et l'enzyme SNAP-tag. Un site NotI a ensuite été inséré à l'extrémité C-terminale de la séquence 35 codant pour FLAG-GB2, le FLAG-CT-GB2 (aux positions 834, 878, 905 et 940, plasmides #1-#4 respectivement, voir Figure 2) et le FLAG-ST-betalAR (aux positions 433 et 462, plasmides #1-#2 respectivement voir Figure 3) en utilisant la stratégie QuikChange (Stratagene). La séquence codant pour FRB*-KKXX (kit ARGENTTM Regulated Heterodimerization Kit), suivie d'un codon stop a ensuite été sous clonée entre Notl et HindIII (voir Figures 2 et 3).

EXEMPLE 2 : Cultures cellulaires Des cellules HEK-293 ont été cultivées en milieu Dulbecco Eagle modifié (DMEM, GIBCO/BRL/Life Technologies) supplémenté avec 10% de FBS sérum de veau fétal) et transfectées par lipofection de manière transitoire avec les plasmides de l'exemple 1 avec de la Lipofectamine 2000 selon les instructions du fabricant (Invitrogen) (par exemple : 50 ng de HA-ST-GBla avec 50 ng de Flag-GB2-FRB*-KKXX par point (d'une plaque 96 puits) ou 50 ng de Flag-ST-betalARFRB*-KKXX par point (d'une plaque 96 puits)). Ces cellules ont ensuite été ensemencées dans une plaque 96 puits (plaque noire avec fond noir, Greiner, CellStar) à 100.000 cellules par puits. Le milieu de culture, le FCS, et autres produits utilisés pour la culture cellulaire (Les acides aminés non essentiels et les antibiotiques pénicilline/streptomycine) ont été achetées chez Gibco / BRL / Life Technologies (Cergy Pontoise, France). Cette méthode a été utilisée pour préparer des cultures contenant 20 chacune un des plasmides de l'exemple 1.

EXEMPLE 3 : Rétention conditionnelle de GB2 à l'aide du domaine FRB* et du motif KKXX Un dosage ELISA de l'épitope FLAG a été effectué sur des cultures 25 cellulaires de l'exemple 2 (cultures cellulaires exprimant FLAG-GB1 ou FLAGGB2 ou l'une des 4 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-GB2-FRB*-KKXX #1 à 4), avec ou sans perméabilisation préalable.

Les dosages ELISA sur cellules intactes ont été réalisés comme décrit 30 précédemment (Maurel et al., 2008, Nat. Methods. 5(6), 561-567). Les cellules ont été fixées avec du paraformaldéhyde 4% puis bloquées par ajout de tampon phosphate salin + 1% de sérum de veau foetal pendant 30 min. Un anticorps monoclonal anti-Flag-M2 (Sigma-Aldrich, Saint-Louis, MO, USA), conjugué à la peroxydase de raifort, a ensuite été appliqué pendant 30 min à 0,5 mg / 1 et les 35 cellules ont été lavées. Les anticorps liés ont été détectés par chimioluminescence en utilisant des substrats SuperSignal (Pierce, Rockford, IL, USA) et un compteur Victor2 Wallac (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA). Les résultats de ce dosage sont présentés sur la Figure 4, qui montre un signal très faible sur cellules non-perméabilisées, et un signal important sur cellules perméabilisées. Cela confirme que les protéines de fusion comportant le motif de rétention conditionnelle sont bien retenues dans la cellule.

Un autre dosage ELISA de l'épitope FLAG a été effectué sur ces cultures cellulaires, en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967 (préincubation 3H00, 1 gM). Les résultats de ce dosage (Figure 5) montrent que les quatre protéines de fusion comportant le domaine de rétention conditionnelle sont correctement adressées à la surface des cellules en présence du rapalogue AP21967.

Enfin, un dosage ELISA de l'épitope HA a également été effectué sur des cultures cellulaires obtenues par cotransfection de plasmides comportant les séquences codant pour les protéines de fusion HA-GB1 et FLAG-GB2-FRB*-KKXX. Le monomère GB 1 est naturellement retenu dans le réticulum endoplasmique et n'est transloqué vers la membrane cellulaire que lorsqu'il est associé au monomère GB2, pour former l'hétérodimère GB1-GB2 (récepteur GABAB). Ce dosage ELISA, effectué dans les mêmes conditions que celui de l'épitope FLAG, mais cette fois avec un anticorps monoclonal anti-HA (clone 3F10, Roche Bioscience, Bâle, Suisse), en présence et en l'absence le rapalogue AP21967 (précinubatiojn 3h00, 1gM) montre (Figure 6) que l'hétérodimère GB1-GB2 est retenu dans le RE, et qu'en présence de rapalogue il est transloqué vers la membrane plasmique.

EXEMPLE 4 : Etude des réce teurs GABA; et de leur association dans la membrane plasmique sous forme de tétramères - Rétention dans le RE et libération en présence de rapalo2ue Des cellules comportant les 3 protéines d'expression FLAG-GB2-FRB*-KKXX, HA-ST-GB 1 et Myc-GB2 ont été préparées selon la technique décrite dans l'exemple 2, en transfectant des plasmides de l'exemple 1 (50 ng de HA-ST-GB1 + 50 ng de Flag-GB2-FRB*-KKXX + 4,5 ng de Myc-GB2 par point d'une plaque 96 puits). Ces cellules comprennent donc deux populations de récepteurs GABAB : une première constituée de dimères HA-ST-GB1 / Myc-GB2 (pop 1), et une seconde constituée de dimères HA-ST-GB1 / FLAG-GB2-FRB*-KKXX (pop2) Un dosage ELISA de l'épitope HA a été effectué sur ces cellules selon le protocole de l'exemple 4, en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967 (préincubation 3h00, 1µM). Les résultats de ce dosage (Figure 7) montrent que les dimères HA-ST-GB1/Myc-GB2 ne sont pas retenus dans les cellules et sont exprimés à leurs surfaces (cf Signal obtenu en l'absence de AP21967), alors que l'adressage membranaire des dimères HA-ST-GB1/FLAG-GB2-FRB*-KKXX est conditionné par l'étape de préincubation avec le rapalogue AP21967 (Figure 7). Les conditions de transfection permettent d'obtenir environ 50% de dimères HA-ST- GBl/Myc-GB2 et 50% de dimères HA-ST-GB1/FLAG-GB2-FRB*-KKXX après traitement avec le rapalogue.

EXEMPLE 5 : Etude des réce teurs GABA; et de leur association dans la membrane plasmique sous forme de tétramères - Etude de FRET Dans cet exemple, une première population de récepteurs (pop 1) a été marquée avec un fluorophore donneur (BG-Lumi4TM) ; après le déclenchement de l'adressage membranaire d'une deuxième population (pop2) de récepteurs, cette deuxième population a été marquée par un accepteur rouge (BG-d2) compatible avec le donneur ayant servi à marquer la première population. Le signal de TR- FRET éventuel résultant du rapprochement des deux populations a été enregistré. (Figure 8)

Marquage de la population 1 : Les cellules de l'exemple 5 ont été lavées dans du DMEM puis incubées avec un conjugué fluorescent donneur BG-LUMI4TM dilué dans du DMEM (concentration finale par puits : 0.3 µM) pendant 1 h à 37 ° C, dans une atmosphère à 5% de CO2, afin de marquer les dimères HA-ST-GB1/Myc-GB2 (popl) (Maurel et al., 2008, Nat. Methods. 5(6), 561-567).

Après 4 lavages avec le tampon Tris-KREBS, le signal de FRET a été enregistré à 665 nm (longueur d'onde d'émission de l'accepteur d2) sur un lecteur de plaque RubyStar (BMG Labtechnologies), pour déterminer le signal de FRET non-spécifique.

Les cellules ont ensuite été incubées avec 50 µl de 2X-AP21967 à 2µM 35 en solution dans du DMEM (ou bien avec du DMEM pour le contrôle négatif) pendant 2 h pour provoquer l'adressage membranaire des dimères HA-STGB1/FLAG-GB2-FRB*-KKXX (pop2).

Marquage de la population 2 : Ensuite, 50µ1 de conjugué fluorescent accepteur 2X BG-d2 (concentration finale par puits : 1,2 gM) ont été ajoutés pour marquer ces dernies dimères, et les cellules incubées pendant 1h00. Après 4 lavages avec le tampon Tris-Krebs, le signal de FRET à 665 nm a été enregistrés sur un lecteur de plaque RubyStar (BMG Labtechnologies) après excitation à 320 nm.

Calcul du signal de FRET : Le signal de FRET a été calculé comme la différence entre le FRET mesuré et le FRET non-spécifique, dus à des collisions aléatoires et la contamination faibles du donneur à la longueur d'onde démission de l'accepteur. En fait, l'intensité de FRET = (signal à 665 nm mesuré sur les cellules co-marqués avec le donneur et l'accepteur) - (signal enregistré sur les mêmes cellules marquées avec le donneur, en l'absence de l'accepteur).

Par ailleurs, pour tenir compte de internalisation du récepteur, du recyclage et de la néo-synthèse lors de l'incubation de trois heures, des cellules ont été traitées en parallèle et de la même façon avec un milieu de culture (DMEM) au lieu du rapalogue, et le signal mesuré a été soustrait à celui mesuré sur les cellules traitées avec AP21967.

FRETmax : Le signal FRETmax correspondant à toutes les interactions possibles sur la population totale des récepteurs (pop 1 et pop2) a été évalué en parallèle par une étape unique de marquage avec un mélange de BG-LUMI4TMet BG-D2 (concentrations finales 0,1 gM et 0,6 gM respectivement) sur les mêmes cellules, effectué après incubation avec le rapalogue et translocation des dimères HA-ST-GB1/FLAG-GB2-FRB*-KKXX à la surface cellulaire Les conditions expérimentales assurent des quantités équivalentes de dimères des populations 1 et 2 (mesure de l'expression de l'épitope HA par dosage ELISA, en présence ou pas de rapalogue AP21967, Figure 7).

Les résultats de cette expérience sont présentés sur la Figure 9 : un signal de FRET faible mais significatif entre les deux populations de dimères est observé (environ 15% du FRETmax), ce qui indique qu'une partie des sous-unités GB1 de la population 1 s'est assemblée, d'une manière ou d'une autre, avec les sous-unités GB1 de la population 2, nouvellement adressée à la surface cellulaire. Ce signal de FRET entre les sous-unités GB1 peut correspondre soit au rapprochement de dimères de la population 1 avec des dimères de la population 2 (par exemple formation de tétramères), soit résulter de l'échange de sous-unités GB1 au sein des populations de dimères 1 et 2.

EXEMPLE 6 : Etude des réce teurs GABA; et de leur association dans la membrane plasmique sous forme de tétramères - Etude de FRET Pour vérifier si le rapprochement des sous-unités GB1 observé dans l'exemple 5 découle de la formation de nouveaux tétramères ou de l'échange entre les sous-unités GB1 des populations 1 et 2, la population 1 a été marquée par un couple de partenaires de FRET (donneur BG-LUMI4TMet accepteur BG-D2, se liant aux sous-unités GB1) pour obtenir un signal correspondant aux tétramères de la population 1 (HA-ST-GBl/Myc-GB2), mesuré à la longueur d'onde d'émission de D2 (665 nm). Après adressage de la population 2 à la membrane, un conjugué BG-fluorescéine a été ajouté au milieu et les signaux de FRET ont été mesurés aux longueurs d'onde de la fluorescéine et du D2 en FRET (Figure 10).

Marquage de la population 1 : Les sous-unités GB1 ont été marquées selon le protocole de l'exemple 6, en utilisant les conjugués BG-LUMI4TM (concentration finale : 0,1µM) et BG-D2 (concentration finale : 0,6 gM), puis les cellules incubées en présence d'AP21967 pour induire l'adressage des dimères de la population 2.

Marquage de la population 2 : Les sous-unités GB1 de la population 2 ont été marquées selon le protocole de l'exemple 6, mais cette fois en utilisant le conjugué BG-fluorescéine (concentration finale : 0,12 gM). Après incubation et lavage, les signaux de FRET à 665 nm (longueur d'onde démission du fluorophore accepteur D2) et 520 nm (longueur d'onde d'émission de la fluorescéine) ont été enregistrés sur un lecteur de plaque RubyStar (BMG Labtechnologies) et un lecteur Infinite 500 (Tecan), respectivement.

FRETmax : ce signal é été obtenu de la même manière que dans 35 l'exemple 6, mais cette fois avec les conjugués BG-fluorescéine (concentration finale : 0,06 gM) et BG-Lumi4TM (concentration finale : 0,1 gM).

Les conditions expérimentales assurent des quantités équivalentes de dimères des populations 1 et 2 (mesure de l'expression de l'épitope HA par dosage ELISA, en présence ou pas de rapalogue AP21967, Figure 11).

Les résultats de cette expérience sont présentés sur les Figures 12 et 13 : le signal de FRET au sein de la population 1 (transfert d'énergie Lumi4TM - D2), résultant de la formation de tétramères de récepteurs GABAB, n'est pas affecté par l'adressage membranaire des dimères de la population 2, ce qui confirme qu'une fois formés, les tétramères GABAB sont stables. La Figure 13 montre qu'un signal de FRET correspondant au rapprochement de sous unités GB1 des deux populations est observé (transfert d'énergie Lumi4TM-fluorescéine), confirmant les données obtenues dans l'exemple 5.

EXEMPLE 7 : Rétention conditionnelle du récepteur béta 1 adrénergique à l'aide du domaine FRB* et du motif KKXX L'exemple 3 a été reproduit avec les plasmides suivants : - FLAG-GB2-FRB*-KKXX (contrôle) - FLAG-ST-betalAR-FRB*-KKXX (2 plasmides différents ont été préparés, 50 ng 20 pour chaque plasmide testé, voir Figure 3). Un dosage ELISA de l'épitope FLAG a été effectué sur des cultures cellulaires de l'exemple 2 (cultures cellulaires exprimant FLAG-GB2-FRB*-KKXX (contrôle) ou l'une des 2 cultures cellulaires exprimant les protéines FLAG-ST-betalAR-FRB*-KKXX #1 à 2), en présence ou en l'absence du rapalogue AP21967 (préincubation 3h00, 1 µM), comme dans l'exemple 2. Les résultats de ce dosage (Figure 14) montrent que les deux protéines de fusion comportant le domaine de rétention conditionnelle sont correctement adressées à la surface des cellules en présence du rapalogue AP21967.

Claims (22)

1. REVENDICATIONS1. Acide nucléique codant pour une protéine de fusion comprenant : a) une protéine recombinante d'intérêt, et b) à l'extrémité C-terminale de ladite protéine recombinante d'intérêt, un domaine de rétention conditionnelle constitué d'une protéine comprenant un domaine FRB dont l'extrémité C-terminale est elle-même constituée d'un motif de rétention dans le réticulum endoplasmique.
2. 2. Acide nucléique selon la revendication 1, caractérisé en ce que le domaine FRB est choisi parmi les domaines suivants : a) - le domaine FRB de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24, ou l'un de se fragments capable de se fixer à la protéine FKBP; - le domaine FRB de la protéine RAPT1 murine de séquence SEQ ID NO. 29, - le domaine FRB de la protéine Torl de levure de séquence SEQ ID NO. 26 ; ou - le domaine FRB de la protéine Tor 2 de levure de séquence SEQ ID NO. 28, b) un domaine FRB dont la séquence présente au moins 80 % d'identité avec l'une des séquence de domaine FRB tel que défini en a) et capable de se fixer à la protéine FKBP, ou encore c) un fragment de domaine tel que défini en a) ou b), ledit fragment étant capable de se fixer à la protéine FKBP.
3. 3. Acide nucléique selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que le domaine FRB est choisi parmi les domaines suivants : a) - le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2025 et 2113 de la séquence SEQ ID NO. 24 ; - le fragment de la protéine FRAP humaine compris entre les acides aminés 2021 et 2113 de la séquence SEQ ID NO. 24 ; - le fragment de la protéine Torl de levure compris entre les acides aminés 1962 et 2050 de séquence SEQ ID NO. 26 ; ou - le fragment de la protéine Tor2 de levure compris entre les acides aminés 1965 et 30 2053 de séquence SEQ ID NO. 28, b) un domaine FRB dont la séquence présente au moins 80 % d'identité avec l'une des séquence de domaine FRB tel que défini en a) et capable de se fixer à la protéine FKBP, ou encorec) un fragment de domaine tel que défini en a) ou b), ledit fragment étant capable de se fixer à la protéine FKBP.
4. 4. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que le domaine FRB est choisi parmi les fragments de la protéine FRAP humaine de séquence SEQ ID NO. 24 compris entre les acides aminés 2021 et 2113 et comportant en outre une des mutations suivantes : Y2038H, Y2038L, Y2038V, Y2038A, F2039H, F2039L, F2039A, F2039V, D2102A, T2098A, T2098N, T2098L, T2098S, E2032A et E2032S.
5. 5. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 4, caractérisé en ce que le domaine FRB est le domaine de séquence SEQ ID 2.
6. 6. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le 15 motif de rétention dans le réticulum endoplasmique est choisi parmi les motifs de séquence SEQ ID NOs. 10 à 14.
7. 7. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 5, caractérisé en ce que le motif de rétention dans le réticulum endoplasmique est choisi parmi les motifs de 20 séquence SEQ ID NOs. 15 à 22.
8. 8. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 7, caractérisé en ce que la dite protéine de fusion comprend entre le domaine FRB et le motif de rétention, un fragment peptidique dont le nombre de résidus d'acide aminé est compris entre 1 et 25 20 acides aminés, de préférence entre 1 et 10 acides aminés.
9. 9. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 8, caractérisé en ce que ladite protéine recombinante d'intérêt est choisie parmi une protéine intracellulaire, une protéine membranaire ou transmembranaire, ou une protéine soluble.
10. 10. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 9, caractérisé en ce que le ladite protéine recombinante d'intérêt est une protéine membranaire ou transmembranaire. 35
11. 11. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 10, caractérisé en ce que ladite protéine recombinante d'intérêt est choisie parmi les récepteurs couplés aux 30protéines G de classe C ou de classe A, les récepteurs canaux ou les récepteurs à activité enzymatique intrinsèque ou associée.
12. 12. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 11, caractérisé en ce que 5 ladite protéine de fusion comporte en outre un domaine d'une enzyme suicide situé en amont de la protéine recombinante d'intérêt.
13. 13. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 12, caractérisé en ce ladite enzyme suicide est choisie parmi : 1'06-alkylguanine DNA alkyltransférase ou un 10 de ses mutants, telles que les enzymes SNAP-tag ou CLIP-tag; une déhalogénase ou un de ses mutants, telle que l'enzyme Halotag ; la protéine ACP ou l'un de ses mutants, telle que la protéine ACP-tag.
14. 14. Acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 13, caractérisé en ce que 15 ladite protéine de fusion comporte en outre à son extrémité N-terminale un motif d'adressage membranaire, tel que celui du peptide signal T8 ou du peptide signal du récepteur mG1uR5.
15. 15. Protéine de fusion codée par un acide nucléique selon l'une des revendications 1 20 à 14.
16. 16. Acide nucléique codant pour une protéine de fusion selon la revendication 15, ou son acide nucléique complémentaire. 25
17. 17. Vecteur pour l'expression d'une protéine recombinante d'intérêt dans une cellule hôte ou construction nucléique comprenant un acide nucléique selon l'une des revendications 1 à 14 et 16.
18. 18. Cellule eucaryote, de préférence cellule animale, de préférence encore de 30 mammifère, transformée par un vecteur ou une construction nucléique selon la revendication 17.
19. 19. Méthode in vitro de rétention conditionnelle d'une protéine recombinant d'intérêt dans le réticulum endoplasmique d'une cellule eucaryote en suspension 35 dans un milieu, cette méthode comprenant les étapes suivantes :a) la transfection dans ladite cellule d'un vecteur d'expression selon la revendication 17, b) l'ajout dans ledit milieu de rapamycine ou d'un rapalogue, c) l'incubation de la cellule, cette incubation provoquant la libération de la protéine 5 recombinante d'intérêt du réticulum endoplasmique de la cellule.
20. 20. Méthode selon la revendication 19, caractérisée en ce que le domaine FRB codé par ledit vecteur d'expression comprend ou est constitué du domaine FRB de séquence SEQ ID NO.2 et en ce que le rapalogue est le composé AP21967 de 10 formule (I) suivante :
21. 21. Trousse de réactifs caractérisée en ce qu'elle comprend : a) un vecteur ou une construction nucléique selon la revendication 17 ou une cellule transformée selon la revendication 18, 15 b) le cas échéant, un vecteurs codant pour la protéine FKBP ; et c) le cas échéant, de la rapamycine ou un rapalogue.
22. 22. Trousse de réactifs selon la revendication 21, caractérisée en ce qu'elle comprend : 20 a) un vecteur ou une construction nucléique selon la revendication 17 codant pour une protéine de fusion comprenant une enzyme suicide, de préférence une 06-alkylguanine DNA alkyltransférase ou un de ses mutants, telles que les enzymes SNAP-tag ou CLIP-tag, b) un ou plusieurs marqueurs, de préférence choisi parmi les fluorophores ou les 25 cryptates d'Europium, c) le cas échéant, un vecteurs codant pour la protéine FKBP, et d) le cas échéant, de la rapamycine ou un rapalogue. (I)