FR2937976A1 - Production du recepteur humain patched fonctionnel par saccharomyces cerevisiae - Google Patents

Abstract

La présente invention se rapporte à un procédé de culture d'une souche de levure Saccharomyces cerevisiae exprimant la protéine humaine Patched fonctionnelle ; à une souche de levure Saccharomyces cerevisiae exprimant la protéine Patched humaine fonctionnelle susceptible d'être obtenue par le procédé de culture ; à un procédé de préparation d'extraits de membranes de levures comportant un récepteur protéique fonctionnel; à des extraits de membranes de levures Saccharomyces cerevisiae comprenant le récepteur humain Patched fonctionnel susceptibles d'être obtenus selon le procédé de préparation d'extraits de membranes de l'invention, à leur utilisation pour identifier des ligands dudit récepteur Patched et à un procédé de criblage de modulateurs de l'activité de la protéine humaine Patched.

Description

Production du récepteur humain Patched fonctionnel par Saccharomyces cerevisiae La présente invention se rapporte à la production par des levures du récepteur humain Patched et trouve une application dans la recherche de modulateurs de l'activité du récepteur Patched qui intervient dans la voie de signalisation Hedgehog.

La voie de signalisation Hedgehog comprend des protéines de signalisation intercellulaires essentielles dans le développement embryonnaire des organismes invertébrés et vertébrés, en particulier dans la différenciation, la prolifération et la survie de nombreux types cellulaires. Cette voie de signalisation est également impliquée dans la régulation des cellules souches adultes et la réparation tissulaire chez l'adulte (Ingham, P.W. & McMahon, A.P. Hedgehog signalling in animal development : paradigms and principles. Genes Dev. 15, 3059-3087(2001)). Plusieurs protéines Hedgehog ont été décrites chez les mammifères (Indian Hedgehog, Desert Hedgehog et Sonic Hedgehog, ci-après aussi désignée Shh), elles ont chacune une expression spatiale et temporelle différentes mais partagent le même mécanisme d'action : elles sont toutes ligands du récepteur membranaire Patched. Le récepteur Patched humain (hPtc) est une protéine membranaire constituée de douze fragments transmembranaires, deux boucles extracellulaires et un domaine intracellulaire. Cette protéine agit comme un récepteur de la protéine sécrétée Hedgehog. Deux homologues, Patched 1 et Patched 2 ont été décrits comme pouvant interagir avec Hedgehog, le rôle de Patched 2 a été moins étudié que celui de Patched 1 et n'est pas encore totalement élucidé (LaRue et al. La voie de signalisation PATCHED/Sonic Hedgehog dans le cancer superficiel de la vessie. M/S, 19, 920-5 (2003); Carpenter D, Stone DM, Brush J, Ryan A, Armanini M, Frantz G, Rosenthal A, de Sauvage FJ. Characterization of two patched receptors for the vertebrate hedgehog protein family. 1998 Nov 10;95(23):13630-4.). Lorsque le ligand Hedgehog n'est pas lié au récepteur Patched, ce dernier inhibe l'activité d'un autre récepteur transmembranaire de la voie de signalisation Hedgehog, Smoothened, qui est une protéine de type GPCR (G Protein-Coupled Receptor) comprenant sept fragments transmembranaires.

A contrario, la liaison de Hedgehog à Patched conduit à la levée de l'inhibition de l'activité de Smoothened, à une augmentation du niveau d'expression des facteurs de transcription Gli et a pour conséquence une régulation de l'expression de gènes impliqués dans la prolifération et la différenciation cellulaire (Riobo N.A. & Mannning D.R. Pathways of signal transduction employed by vertebrate Hedgehogs. Biochem. J. (2007) 403, 369-379). Des dysfonctionnements des récepteurs de cette voie, Patched et Smoothened, sont responsables de nombreux cancers et de maladies neurodégénératives.

En particulier, un défaut d'expression ou de fonctionnalité de Patched conduit à une activation constitutive de Smoothened en l'absence du ligand Hedgehog. Cette activation constitutive de Smoothened est observée dans plusieurs cancers, notamment le carcinome basocellulaire et le médulloblastome (Rubin L.L. & de Sauvage F.J. Targeting the Hedgehog pathway in cancer. Nature. 5, 1026-1032 (2006)).

A l'inverse, lorsque Patched exerce une inhibition permanente de Smoothened, les cellules dégénèrent ; c'est une cause de maladies neurodégénératives (Dellovade T. et al. The Hedgehog Pathway and Neurobiological Disorders. Annu. Rev. Neurosci. 29 :539-563 (2006)). La protéine Patched est donc une cible d'intérêt pour l'identification de modulateurs de la voie de signalisation de Hedgehog et la mise au point de nouveaux médicaments, en particulier pour le traitement de cancers et de maladies neurodégénératives. A l'heure actuelle, la recherche de molécules capables d'agir sur la voie Hedgehog est notamment réalisée grâce à l'observation de l'effet des molécules à tester sur l'inhibition du développement de tumeurs cancéreuses (Rubin L.L. et al,. voir supra) ou plus généralement sur l'activation ou l'inhibition de gènes de la voie Hedgehog dans des cellules le plus souvent humaines, mais ne permet pas de savoir précisément à quel niveau de la voie Hedgehog ces molécules agissent. Il existe donc un besoin de disposer d'outils pour l'étude de la voie de 25 signalisation Hedgehog ; de tels outils pourraient notamment être utiles pour identifier des modulateurs de cette voie de signalisation. C'est dans le but de pourvoir à ce besoin que la Demanderesse a mis au point une souche de levure Saccharomyces cerevisiae modifiée génétiquement ainsi qu'un procédé de culture lui permettant d'exprimer une protéine humaine Patched stable et 30 fonctionnelle. Plus particulièrement, la protéine Patched est exprimée à la surface membranaire des levures et est capable de se lier avec son ligand naturel, Hedgehog. La Demanderesse a également mis au point un procédé d'extraction de la protéine Patched à partir de membranes ; la protéine Patched obtenue est utile pour la recherche de modulateurs de son activité.

La préparation d'une levure Saccharomyces cerevisiae modifiée génétiquement a été décrite pour exprimer la protéine Smoothened (De Rivoyre M. et al. Human receptor Smoothened, a mediator of Hedgehog signalling, expressed in its native conformation in yeast. FEBS Letters 579 (2005) 1529-1533).

L'extrapolation de ces résultats à l'expression de la protéine Patched par Saccharomyces cerevisiae n'est cependant pas évidente car Patched a une séquence, et aussi une structure, très différente de la protéine Smoothened ; en particulier, elle est plus longue et a une configuration tridimensionnelle plus complexe. A ce titre, les conditions de production de la protéine Smoothened décrites dans l'article de De Rivoyre et al. ont été reproduites dans le cadre des travaux de De Rivoyre et al. ( Expression et purification de protéines membranaires mammifères impliquées dans des pathologies de Rivoyre M., Université de Nice-Sophia Antipolis, 2006) avec une souche de levure Saccharomyces cerevisiae modifiée génétiquement pour exprimer Patched ; ces travaux n'ont pas permis d'aboutir à l'expression du récepteur Patched fonctionnel. Ceci s'explique notamment par le fait que l'expression d'une protéine membranaire humaine fonctionnelle demande la mise au point de très nombreux paramètres qui ne peuvent être extrapolés à partir de l'expression d'une autre protéine. En outre, pour pouvoir utiliser ultérieurement la protéine Patched en vue de l'identification de modulateurs de la voie de signalisation Hedgehog, il est également nécessaire de mettre au point un procédé d'extraction du récepteur qui préserve sa stabilité dans une configuration fonctionnelle. C'est l'ensemble de ces difficultés qu'est parvenue à surmonter la Demanderesse en mettant au point un procédé de production par la levure Saccharomyces 25 cerevisiae d'un récepteur humain Patched fonctionnel et un procédé d'extraction du récepteur humain Patched fonctionnel à partir desdites membranes. La souche de Saccharomyces cerevisiae ne possède pas de voie de signalisation Hedgehog endogène ; cette souche, préparée et cultivée selon le procédé de culture de la présente invention, exprime le récepteur Patched humain de façon stable et 30 fonctionnelle et permet de tester l'interaction de molécules directement sur le récepteur humain Patched produit par ces levures. Le procédé de culture selon l'invention offre en outre l'avantage d'utiliser des levures S. cerevisiae qui sont cultivables en grands volumes et à moindre coût contrairement aux cellules humaines ou animales. Il est ainsi possible de préparer de grandes quantités d'extraits de membranes portant le récepteur Patched afin de tester des molécules agonistes ou antagonistes potentielles à grande échelle et aussi de purifier le récepteur Patched. Selon un premier objet, la présente invention se rapporte à un procédé 5 de culture d'une souche de levure Saccharomyces cerevisiae exprimant la protéine humaine Patched fonctionnelle comprenant les étapes suivantes : a) clonage dans un vecteur d'expression de levure d'une première séquence codant pour un polypeptide fusionné à ladite protéine humaine Patched comportant : 10 i) un ou plusieurs fragments protéiques capables de se fixer sur un support de séparation et permettant ainsi la purification de ladite protéine Patched ; ii) un fragment protéique capable de se lier avec au moins un anticorps et 15 iii) un ou plusieurs sites de clivage aux protéases ; et d'une seconde séquence consistant en la séquence d'ADNc codant pour ladite protéine humaine Patched en position 5' de ladite première séquence; b) transfomation de levures Saccharomyces cerevisiae avec ledit vecteur 20 d'expression ; c) culture des levures Saccharomyces cerevisiae obtenues à l'étape b) sur un milieu de culture riche ; ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape c) de culture des levures Saccharomyces cerevisiae est réalisée dans des conditions telles que la culture ne 25 doit pas dépasser une densité optique à 600 nm de 8 et que le milieu est aéré avec un ratio de volume de milieu de culture sur le volume d'air compris entre 1 : 5 et 1 : 10 ou avec un débit d'air introduit sous pression égal à 1 à 3 fois le volume du fermenteur par minute. La densité optique à 600 nm du milieu de culture est la mesure par un spectrophotomètre de l'absorbance du milieu de culture ; la mesure obtenue est 30 représentative de la concentration en levures dans le milieu de culture. De préférence, la densité optique à 600 nm en fin de culture est comprise entre 5 et 8 inclus, cette densité optique est préférentiellement de 7.

Le taux d'aération est adapté selon que la culture est réalisée à une échelle de laboratoire, c'est-à-dire, à titre indicatif, avec des récipients d'une taille comprise entre environ 500 ml et 5 1, ou à l'échelle semi-industrielle ou industrielle. A l'échelle de laboratoire, l'aération est réalisée par agitation de la culture de levures et est exprimée par le ratio du volume de la culture de levures sur le volume d'air compris dans le récipient. De préférence, le ratio du volume de milieu de culture sur le volume d'air est d'environ 1 : 7. Un tel ratio peut par exemple être obtenu dans un erlenmeyer de 2 1 avec un volume de culture compris entre 200 et 400 ml et une agitation comprise entre 100 et 300 tours/minutes.

A une échelle supérieure, c'est-à-dire lorsque la culture est mise en oeuvre dans des fermenteurs de taille semi-industrielle ou industrielle comprise entre 5 1 et 100 1, le taux d'aération est exprimé par un débit d'air qui vaut de préférence entre 1,5 et 2 fois le volume du fermenteur. L'air est introduit dans le fermenteur sous une pression comprise entre 1 et 10 bars, de préférence 2 bars.

A titre d'exemple, dans un fermenteur de 10 1, on introduira avantageusement un débit d'air de 15 à 20 1/min sous 2 bars. Ladite première séquence est de préférence la séquence nucléotidique "multitag affinity purification" (MAP) qui comporte : i) trois séquences codant pour trois fragments protéiques capables de se 20 fixer sur un support de séparation : le domaine de liaison à la calmoduline, un fragment streptavidine et un fragment hexahistidine ; ii) la séquence codant pour trois épitopes de l'hémagglutinine capables de se lier avec des anticorps anti-hémagglutinine ; iii) les sites de clivages, qui sont utiles afin d'éliminer ledit polypeptide 25 après purification de ladite protéine humaine Patched, sont ceux du facteur Xa, de la protéase du TEV et de la thrombine. Une construction de cette séquence MAP est illustrée aux Figures lA et 1B ; elle permet avantageusement de développer une stratégie de purification de Patched sur trois résines d'affinité différentes. 30 Une séquence polypeptidique MAP utilisable est la séquence SEQ ID NO : 1 ; un exemple de séquence nucléotidique codant pour le polypeptide MAP est la SEQ ID NO : 2. De préférence, par protéine Patched, on entend la protéine Patched 1 codée par la SEQ ID NO : 3 ou toute séquence comportant une ou plusieurs substitutions de nucléotides n'ayant pas pour conséquence de modifier la séquence en acides aminés de la protéine Patched après traduction. Dans le cadre de la présente invention, une protéine est dite fonctionnelle si elle se lie à son ligand naturel ; dans le cas présent, la protéine Patched est considérée comme fonctionnelle lorsqu'elle est capable de se lier à la protéine Hedgehog. A titre indicatif, un test pouvant être mis en oeuvre afin de tester une liaison entre Patched et Hedgehog est tel que décrit dans les exemples 2 et 3 ci-après. Le vecteur d'expression, dans lequel l'ADNc codant pour le récepteur Patched humain et la séquence MAP sont clonés, peut être choisi parmi les vecteurs d'expression dans Saccharomyces cerevisiae. Le vecteur préféré selon le présent procédé est le plasmide pYEP-PMA (Figler, R.A., Omote, H., Nakamoto, R.K. and Al-Shawi, M.K. (2000) Use of chemical chaperones in the yeast Saccharomyces cerevisiae to enhance heterologous membrane proteine expression: high-yield expression and purification of human P-glycoprotein.

Arch. Biochem. Biophys. 376, 34-46). De façon préférée, la souche de levure Saccharomyces cerevisiae utilisée est la souche K699 (Mata, ura3, and leu2-3, trpl-1, ade2-1, canl-100, his3-11, ssdl-d2, GAL). La transformation des levures Saccharomyces cerevisiae peut être mise en oeuvre par toute méthode classique connue par l'homme du métier. Une technique de transformation utilisable dans le cadre de la présente invention est celle utilisant les sels de lithium tels que du chlorure ou de l'acétate de lithium selon la procédure décrite par Elble (Elble, R. (1992) A simple and efficient procedure for transformation of yeasts. Biotechniques. 13, 18-20).

La température à laquelle la culture de l'étape c) est mise en oeuvre est généralement comprise entre 15 et 25°C inclus. De préférence, la température est comprise entre 16 et 20°C, encore préférenciellement, elle est ajustée à 18°C. Par milieu riche, on entend un milieu qui comprend un mélange de peptones ; des extraits de levure et du dextrose dans de l'eau ; ces ingrédients étant présents dans des quantités optimales pour la croissance de la levure Saccharomyces cerevisiae. De façon usuelle, les milieux de culture sont stérilisés avant d'être ensemencés avec les levures. Plus précisément, le milieu riche utile pour la mise en oeuvre du procédé selon l'invention, appelé milieu YPD, peut avoir la composition suivante : 5 à 15 g, de préférence 11 g d'extraits de levure par litre ; 15 à 25 g, de préférence 22 g de peptones par litre, de préférence, les peptones sont des bactopeptones ; 50 à 60 mg, de préférence 55 mg d'adénine sulfate par litre et 1 à 5%, de préférence 2% de glucose par litre et de l'eau distillée en quantité suffisante pour un litre.

La présente invention se rapporte également à une souche de levure Saccharomyces cerevisiae exprimant la protéine Patched humaine fonctionnelle susceptible d'être obtenue par le procédé de culture selon l'invention. Selon un autre de ses objets, la présente invention se rapporte à un procédé de préparation d'extraits de membranes de levures comprenant un récepteur protéique fonctionnel, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mélange desdites levures exprimant lesdits récepteurs protéiques membranaires avec un tampon comprenant (i) un mélange d'inhibiteurs de protéases comprenant au moins 2 mM de benzamidine, au moins 1 mM de fluorure de phénylméthanesulfonyl (PMSF) et au moins 1 mM d'acide éthylène-diamine-tétraacétique (EDTA) et (ii) des billes de verre ; b) agitation au vortex à une vitesse comprise entre 1500 et 2500 rpm pendant 10 à 20 minutes ; c) élimination des billes de verre ; d) ultracentrifugation du surnageant obtenu à l'étape c) à au moins 20 18000 g pendant au moins 20 minutes ; et e) récupération du culot constitué de membranes comprenant ledit récepteur protéique. De préférence, la mise en oeuvre de l'étape a) est telle que : - ledit tampon comprend 50 mM de Tris-HC1 pH 7,4 et 5% de glycérol ; 25 selon un mode de mise en oeuvre particulier du procédé selon l'invention, le tampon a pour composition 50 mM Tris-HC1 (pH 7,4), 300 mM NaCl et 5% de glycérol ; et/ou - le ratio du volume de levures sur le volume de tampon est compris entre 1 : 1 et 1 : 3, de préférence il vaut 1 : 2 ; et/ou - le ratio du volume de levures sur le volume de billes de verre est 30 compris entre 2 : 1 et 1 : 2, de préférence il vaut 1 : 1. Le mélange d'inhibiteurs de protéases a avantageusement la composition suivante : entre 2 et 4 mM, de préférence 4 mM de benzamidine, 1 mM de PMSF et 2,5 mM d'EDTA.

Pour la mise en oeuvre de l'étape b), la vitesse d'agitation est 2000 rpm et la durée d'agitation est, de façon préférée, 15 minutes. La mise en oeuvre de l'étape c) peut notamment être réalisée par filtration ou centrifugation, par exemple à une vitesse comprise entre 2000 et 4000 g pendant 5 à 15 minutes, de préférence à 3000 g pendant environ 10 minutes. Cette étape c) a pour effet d'éliminer les billes de verre et optionnellement, les levures intactes, les noyaux et autres débris. De façon préférée, l'étape d) d'ultracentrifugation est réalisée à une vitesse comprise entre 50000 et 200000 g pendant 30 à 60 minutes, de préférence 100000 g l0 pendant 45 minutes. Cette étape d) est renouvelée après avoir resuspendu le culot contenant les membranes dans le tampon comprenant le mélange d'inhibiteurs de protéases utilisé à l'étape a). Ce procédé est particulièrement adapté à l'extraction de membranes de 15 levures Saccharomyces cerevisiae comprenant la protéine hPtc telles qu'elles peuvent être obtenues selon le procédé de culture de l'invention. La présente invention se rapporte également à des extraits de membranes de levures susceptibles d'être obtenus selon le procédé de préparation d'extraits de membranes de l'invention. En particulier, il s'agit des levures Saccharomyces 20 cerevisiae exprimant le récepteur membranaire humain Patched fonctionnel. Ces extraits de membranes comprenant la protéine Patched humaine fonctionnelle constituent un nouvel outil permettant la recherche de médicaments contre les maladies neurodégénératives et divers types de cancer. En effet, ces préparations de membranes peuvent être utilisées pour 25 rechercher des molécules capables d'interagir avec Patched. L'identification d'analogues de la protéine Sonic Hedgehog capables de neutraliser l'effet inhibiteur de Patched sur le récepteur Smoothened pourrait permettre de stimuler la voie Hedgehog au niveau des cellules neurales et de lutter contre certaines maladies neurodégénératives. A contrario, l'identification de molécules capables d'activer l'effet inhibiteur de Patched sur le 30 récepteur Smoothened permettrait de neutraliser la voie Hedgehog impliquée dans la prolifération des cellules cancéreuses, de diminuer les métastases et d'envisager une nouvelle stratégie anti-cancéreuse.

La présente invention se rapporte encore à l'utilisation desdits extraits de membranes comprenant le récepteur humain Patched fonctionnel comme outil de recherche de molécules capables d'interagir avec ledit récepteur Patched. Enfin, la présente invention se rapporte à un procédé de criblage de 5 ligands de la protéine humaine Patched, tels que des modulateurs de l'activité de Patched, comprenant les étapes de : a) mise en contact du récepteur humain Patched et des molécules à tester ; b) détection d'une interaction entre ledit récepteur et lesdites 10 molécules à tester ; et c) sélection desdites molécules à tester pour lesquelles une interaction est mesurée. L'étape a) peut être mise en oeuvre avec les extraits de membranes de levures susceptibles d'être obtenus avec le procédé d'extraction de membranes selon 15 l'invention ou avec la protéine Patched purifiée. La purification de Patched (Ptc) peut notamment être réalisée dans les conditions expérimentales suivantes : l'extrait membranaire de levures portant le récepteur Ptc humain est solubilisé à 5 mg/ml dans le tampon A de composition : Tris-HC1 50 mM pH 7,4, NaCl 150 mM, 10% Glycérol, 4 mM benzamidine, 1 mM PMSF, plus 20 mM de 20 détergent n-dodécyl-b-D-maltoside (DDM), et agité doucement à 4°C pendant 20 à 60 minutes. Le mélange est ensuite ultracentrifugé à 100000 g pendant 1 h à 4°C. Le surnageant contenant Ptc solubilisé est incubé avec la résine Ni-NTA préalablement équilibrée dans le tampon B (de composition : tampon A plus 10 mM imidazole pH8 et 2 mM de DDM) pendant 3h à 4°C sous agitation douce. La résine est centrifugée à 400 g 25 pendant 1 minute et resuspendue dans 10 volumes équivalents résine de tampon B puis centrifugée. Cette étape de lavage de la résine est répétée 3 fois. Les lavages peuvent être l'occasion de changer le détergent DDM par des surfactants fluorés moins agressifs pour les protéines membranaires. La résine est ensuite resuspendue dans 1 volume équivalent résine de tampon d'élution de composition : tampon A plus 2 mM DDM ou 2 mM de 30 surfactant fluoré, plus 300 mM imidazole pH8, puis centrifugée à 400 g pendant 1 minute. Le surnageant contenant Ptc est récupéré. L'imidazole est éliminé ; par exemple, grâce à l'utilisation d'unité de concentration Amicon PM50. Il a été montré que hPtc présent dans les extraits membranaires de Saccharomyces cerevisiae et après purification est capable d'interagir avec son ligand Shh 2937976 'o couplé sur ledit biocapteur, indiquant que Patched humain est exprimé sous forme fonctionnelle à la membrane des leuvres (exemple 3 et Figure 6) et qu'il conserve sa fonctionnalité après purification (voir l'exemple 5 et la Figure 9). L'étape a) peut être mise en oeuvre en phase liquide ou sur un support solide convenable ; l'homme du métier choisira et adaptera ces modalités de mise en oeuvre par exemple selon qu'il utilise le récepteur Patched sous la forme d'extraits de membranes ou sous la forme de protéine purifiée. Lorsque l'étape a) est mise en oeuvre en phase liquide, le procédé de criblage en phase liquide peut être mis ne oeuvre selon les étapes suivantes : a) mise en contact du récepteur humain Patched et des molécules à tester ; b) récupération dudit récepteur humain Patched éventuellement lié à une ou plusieurs molécules à tester ; c) détection d'une interaction entre ledit récepteur humain Patched 15 et lesdites molécules à tester ; et d) sélection desdites molécules à tester pour lesquelles une interaction est mesurée. L'étape a) peut être mise en oeuvre avec des extraits membranaires comprenant le récepteur Patched qui sont alors incubés avec les molécules à tester ; le 20 mélange est ensuite centrifugé ; le culot obtenu après centrifugation est resuspendu dans du tampon puis est centrifugé à nouveau pour éliminer les interactions non spécifiques. La fixation de molécule à tester est alors analysée soit par mesure de fluorescence, soit par mesure de radioactivité suivant le marquage de cette molécule. Dans le cas où le récepteur humain Patched est utilisé purifié, sa 25 récupération à l'étape b) peut notamment se faire grâce à l'un des trois fragments protéiques présent dans le polypeptide MAP fixé à l'extrémité C-terminale de Patched et capable de se fixer sur un support de séparation : le domaine de liaison à la calmoduline, la séquence streptavidine ou la séquence de six histidines. Selon une variante du procédé de criblage en phase liquide, lesdites 30 molécules à tester sont préalablement marquées. Le marquage peut être radioactif par incorporation d'isotopes radioactifs tels que 3H, 1 C, 14C, 32P, 35S, '251 99mTc, '8F, MCu, 76Br, 124I,'3N,'5o ou encore'23I selon les méthodes classiques de l'état de la technique. Le marquage des molécules à tester peut aussi consister en la fixation d'un fluorophore sur lesdites molécules selon les méthodes connues de l'homme du métier. Alors, l'étape c) de détection de l'interaction entre le récepteur Patched et une ou plusieurs des molécules à tester se fait par mesure de la radioactivité, par exemple, à l'aide de radio imageurs sélectionnés en fonction de l'atome radioactif à détecter, ou par mesure de la fluorescence. Selon une autre variante du procédé de criblage en phase liquide, la détection de l'interaction se fait par chromatographie en comparant la position du récepteur humain Patched seul et celle du récepteur humain Patched après mise en contact avec les molécules à tester selon l'étape a), si la position est identique alors il n'y a pas d'interaction ; a contratio, une différence de position indique une interaction. Un exemple non limitatif de mise en oeuvre du procédé de criblage en phase liquide est décrit dans l'exemple 2 ci-après. L'étape a) du procédé de criblage selon l'invention peut alternativement être mise en oeuvre sur un support solide convenable. Par support solide, on entend en particulier un biocapteur constitué d'une membrane qui comprend une espèce biologique, telle qu'une enzyme, un anticorps, un peptide, un micro-organisme, un tissu biologique, un lipide, un acide nucléique..., permettant la liaison avec une molécule à tester et un transducteur permettant de transformer le signal biologique, tel que la fixation d'un ligand sur un récepteur protéique, en un signal physique mesurable, par exemple électrochimique (ampérométrique, potentiométrique, conductimétrique), optique (lumineux), piézoélectrique ou calorimétrique. Selon une variante préférée du procédé de criblage sur support solide, le support solide est un biocapteur de détection d'une liaison par résonance plasmonique dont l'utilisation permet de visualiser et de caractériser (constantes d'affinité, d'association et de dissociation) des interactions entre une protéine et son ligand par changement de masse à la surface du biocapteur. Ce changement de masse se mesure par des variations de l'angle de résonance plasmonique à la surface du biocapteur et ne nécessite pas de ligand radiomarqué ou fluorescent. Lorsque le procédé de criblage sur support solide est mis en oeuvre avec des extraits de membranes comprenant le récepteur Patched selon l'invention, ces extraits peuvent être fixés par injection sur un biocapteur lipophile. Lorsqu'un biocapteur lipophile est utilisé, les extraits membranaires se fixent aux groupements lipophiles liés par des liaisons covalentes au dextran, ce qui permet de suivre l'interaction entre récepteurs membranaires et ligands (Pourshafie MR, Marklund B-I and Ohlson S (2004) Binding interactions of Escherichia coli with globotetraosylceramide (globoside) using a surface plasmon resonance biosensor. J. Microbiol. Meth., 58, 313-320; Wikstrom A and Deinum J (2007) Probing the interaction of coagulation factors with phospholipid vesicle surface plasma resonance. Anal. Biochem. 362, 98-107). Ainsi selon une variante de l'invention, le biocapteur de détection d'une liaison par résonance plasmonique est un biocapteur lipophile tel qu'un biocapteur hydrophobe sensorchip LI de Biacore (GE Healthcare) sur lequel est fixée par injection une préparation de membranes de levures S. cerevisiae exprimant hPtc. Les membranes forment une bicouche lipidique sur le biocapteur. Un test préalable d'interaction a montré par ailleurs que l'injection de Shh purifiée entraîne une augmentation de l'angle de résonance plasmonique (augmentation du nombre de RU) qui témoigne de l'association de Shh sur hPtc (voir l'exemple 3 ci-après et la Figure 7). Alors, selon le même principe, on peut tester la fixation de ligands potentiels, les molécules à tester, sur hPtc. Cette technique est limitée à des molécules à tester ayant une masse molaire supérieure à 400 Da. Lorsque le procédé de criblage sur support solide est mis en oeuvre avec le récepteur protéique Patched purifié, ledit récepteur peut également être fixé sur un biocapteur permettant une mesure de résonance plasmonique de surface qui consiste à détecter une variation de l'indice de l'interface sur laquelle est fixé le récepteur lorsqu'un ligand s'y fixe. Un exemple de mise en oeuvre du procédé de criblage sur support solide avec le récepteur humain Patched (hPtc) purifié utilise de préférence un biocapteur de détection par résonance plasmonique est un biocapteur NTA préalablement traité avec une solution de NiCl2. Il s'agit d'un biocapteur portant un groupement fonctionnel NTA, tel que le biocapteur NTA de Biacore (GE Heathcare), sur lequel un acide nitrilotriacétique est lié de façon covalente à une matrice de dextran carboxyméthylé qui est activé en injectant du NiC12, permettant de chelater des polypeptides possédant une séquence polyhistidine. La surface du biocapteur est facilement régénérée par injection d'EDTA. On peut alors fixer ledit récepteur Patched sur le biocapteur grâce au fragment hexahistidine présent dans le polypeptide MAP positionné dans la partie C-terminale dudit récepteur. Il est ensuite possible de tester la fixation de différentes molécules à tester sur hPtc associée à la sensorchip par mesures de variations de l'angle de résonance plasmonique. Selon une autre variante, le procédé de criblage selon l'invention est mis en oeuvre en testant la capacité de molécules à tester d'entrer en compétition avec le ligand naturel de Patched, Hedgehog ; alors le procédé de criblage par compétition comprend les étapes suivantes : a) fixation de la protéine Hedgehog sur un support solide convenable ; b) mise en contact de ladite protéine Hedgehog avec le récepteur humain Patched ; c) détermination d'une première valeur de liaison ; d) dissociation de Hedgehog et Patched ; e) mise en contact de ladite protéine Hedgehog avec un mélange comprenant le récepteur humain Patched et une ou plusieurs molécules à tester ; f) détermination d'une seconde valeur de liaison ; g) comparaison de la première et de la seconde valeur de liaison et sélection de molécules capables de se lier à Patched. Un exemple de mise en oeuvre du procédé de criblage par compétition sur support solide avec des extraits membranaires contenant la protéine Patched ou avec la protéine Patched purifiée consiste à utiliser un biocapteur sur lequel Sonic Hedgehog (Shh) est fixé par couplage. hPtc, qu'il soit présent dans les extraits membranaires de Saccharomyces cerevisiae ou sous une forme purifiée, est capable d'interagir avec son ligand Shh couplé sur ledit biocapteur, indiquant que Patched humain sur membrane ou purifié est sous forme fonctionnelle (voir l'exemple 3 et la Figure 6 et l'exemple 5 et la Figure 9). Il est ensuite possible de tester la capacité d'une molécule à tester à entrer en compétition avec Shh ou à modifier l'affinité de hPtc pour Shh en mesurant les variations de l'angle de résonance plasmonique à la surface de la sensorchip provoquées par l'action du ligand sur hPtc purifié après incubation. De façon concrète, le biocapteur peut notamment être le biocapteur 25 sensorchip CM3 ou encore le biocapteur sensorchip CM5 de Biacore. L'invention est maintenant décrite plus en détail au regard des figures suivantes : La Figure lA est un schéma de la construction protéique de la séquence Multitag Affinity Purification (MAP) fusionnée à l'extrémité C-terminale du récepteur 30 Patched humain lors de son expression. Cette séquence MAP contient trois domaines permettant la purification sur résine d'affinité : un domaine de liaison à la calmoduline (ou CBD pour calmodulin binding domain), à la streptavidine (séquence streptavidine) et aux métaux divalents comme le nickel (séquence hexahistidine), une séquence hémagglutinine (HA) pour visualiser le récepteur par la technique du Western Blot avec des anticorps anti-HA, et trois sites de clivage spécifiques aux protéases du TEV, Factor Xa et thrombine. La Figure 1B représente la séquence nucléotidique de MAP avec la localisation des différents sites mentionnés ci-dessus.

La Figure 2 représente l'expression du récepteur Patched humain (hPtc) dans la levure S. cerevisiae. A/ Membranes de levures exprimant hPtc (Western blot avec des anticorps anti-HA (piste 1) et anti-Patched (piste 2) sur 40 g de préparation membranaire de levures S. cerevisiae exprimant Patched humain).

B/ Expression de hPtc dans des levures cultivées à 30°C et 20°C, en présence ou non de glycérol dans le milieu. C/ Expression de hPtc en fonction de la densité cellulaire rapportée par la densité optique (OD) à 600 nm. La Figure 3 représente un Western blot permettant de comparer les 15 protéines obtenues selon que les levures sont cultivées et leurs membranes extraites dans les conditions optimisées selon l'invention (cliché B) ou non (cliché A). La Figure 4 représentent des essais de co-immunoprécipitation entre hPtc et Shh avec hPtc obtenu selon les conditions de l'état de la technique, c'est-à-dire les conditions de la thèse de M. De Rivoyre (voir supra). 20 La Figure 5 illustre l'interaction entre le récepteur Patched humain exprimé dans la levure selon les conditions optimisées de l'invention et son ligand Sonic hedgehog (Shh) par Pull-down. A/ Western-blot révélé avec des anticorps dirigés contre la séquence hémagglutinine du polypeptide MAP positionné en C-terminal de hPtc et des anticorps 25 dirigés contre Shh sur des préparations de membranes de levures exprimant (pistes 2, 4, 5) ou n'exprimant pas (pistes 6, 7, 8) le récepteur hPtc et incubées avec 0 ; 1,5 et 6 .tg de ligand Shh purifié. Pistes 1 et 2 : 0,1 et 0,5 g de Shh purifié. B/ Quantification de l'intensité des bandes correspondant à Shh sur différents western blots effectués comme décrit pour la Figure 5A. 30 La Figure 6 représente l'analyse sur un biocapteur à résonance plasmonique (sensorchip CM5 avec l'appareil Biacore 3000) de l'interaction de préparations membranaires de levures S. cerevisiae (100 g) exprimant ou non la protéine humaine Patched sur le biocapteur CM5 sur lequel 50 .tg de Shh purifié ont été immobilisés par couplage amine. Le graphe (sensorgramme) présente les courbes d'interaction des préparations membranaires après déduction du signal de fixation non-spécifique d'association au biocapteur activé avec les réactifs de couplage mais sans Shh. La Figure 7 représente l'analyse de l'interaction de Patched après plusieurs injections de Shh avec la technologie de résonance plasmonique. Dans ce cas, le test d'interaction est mis en oeuvre avec des extraits membranaires obtenus selon l'invention fixés sur un biocapteur hydrophobe L1 (Biacore). La Figure 8 représente un Western blot avec des anticorps anti-HA sur une préparation membranaire de levures S. cerevisiae exprimant Patched humain solubilisée avec 1% de Dodécyl Maltoside. Le solubilisat a été incubé 3 heures avec 100 l to de résine Ni-NTA en présence de 10 mM imidazole ou avec 100 l de résine Calmoduline en présence de 2mM de Calcium. Piste 1 : fractions non retenues sur la résine Ni-NTA. Piste 7 : fractions non retenues sur la résine Calmoduline. Pistes 2 à 6 : fractions éluées de la résine Ni-NTA avec un gradient 15 d'imidazole. Pistes 8 à 10 : fractions éluées de la résine Calmoduline avec 10 mM d'EDTA. La Figure 9 représente l'analyse sur un biocapteur à résonance plasmonique de l'interaction de Patched purifié et de Shh. 20 Exemple 1 ù Construction de la souche de levure Saccharomyces cerevisiae exprimant de façon fonctionnelle le récepteur humain de Sonic Hedgehog, Patched I.A. Construction du vecteur d'expression La séquence MAP (Multitag Affinity Purification ayant pour séquence SEQ ID NO : 1) a été introduite dans le vecteur d'expression pour la levure Saccharomyces 25 cerevisiae pYEP-PMA fourni par Dr. Al-Shawi (Figler, R.A., Omote, H., Nakamoto, R.K. and Al-Shawi, M.K. (2000) Use of chemical chaperones in the yeast Saccharomyces cerevisiae to enhance heterologous membrane proteine expression: high-yield expression and purification of human P-glycoprotein. Arch. Biochem. Biophys. 376, 34-46). Le cDNA du récepteur Ptc humain (SEQ ID NO : 3) a été sous cloné en 30 5' de la séquence MAP donnant le vecteur pYEP-PMA-hPtc-MAP. La séquence MAP possède 3 domaines permettant la purification sur 3 résines d'affinité différentes (Calmoduline, Streptavidin et Ni-NIA), un fragment de l'épitope de l'hémagglutinine pour suivre l'expression et la purification du récepteur par Western Blot avec des anticorps anti-hémagglutinine, et des sites de clivage aux protéases afin d'éliminer la séquence MAP après purification (voir la Figure 1). 1.B. Transformation des levures Les levures Saccharomyces cerevisiae de la souche K699 (Mata, ura3, Leu2-3, trpl-1, ade2-1, canl-100, his3-11, ssdl-d2, GAL) ont été cultivées dans du milieu riche YPD stérile (11 g d'extrait de levure, 22 g de bactopeptone, 55 mg d'adénine sulphate et 2% de glucose par litre) une nuit à 30°C sous agitation à 300 rpm. Les levures sont diluées au tiers dans le même milieu YPD et cultivées encore 3 heures à 30°C. 0,5 ml de levures sont centrifugés 5 secondes dans un tube Eppendorf ; le surnageant est éliminé en laissant 50 à 100 l dans le tube. 10 l d'ADN de sperme de saumon sont ajoutés dans le tube et mélangés aux levures. Puis, 1 g de vecteur d'expression pYEP-PMA-hPtc-MAP est ajouté et mélangé aux levures au vortex. 0,5 ml d'une préparation d'acétate de lithium (90 ml de PEG 4000 45%, 10 ml d'acétate de lithium 1M, 1 ml de Tris-HC1 1M, 0,2 ml d'EDTA 0,5M pour 100 ml) sont ajoutés et mélangés aux levures par vortex. l de DTT (dithiotreitol) 1M sont ajoutés et mélangés au vortex. Les levures sont incubées à température ambiante environ 16 heures. Le lendemain, les levures sont soumises à un choc thermique par incubation 10 minutes dans un bain à 42°C, puis, 50 l de levures sédimentées au fond du 20 tube sont prélevés et étalés sur une boîte de milieu minimum gélosé ne possédant pas de leucine (8 g de Yeast nitrogen base sans acides aminés, 55 mg d'adenine, de tyrosine et d'uracil, 2% de glucose et 20 g d'agar par litre). Seules les levures qui auront intégré le vecteur pYEP-PMA-hPtc-MAP pourront pousser sur ce milieu. I.C. Conditions de culture pour expression optimale du récepteur 25 Patched à la membrane plasmique des levures Après transformation des levures avec le vecteur pYEP-PMA-hPtc-MAP, plusieurs clones ont été obtenus sur milieu minimum gélosé. Plusieurs clones ont été cultivés en milieu liquide minimum, puis des membranes plasmiques ont été extraites pour chaque clone et l'expression de la protéine 30 Patched a alors été analysée par Western blot avec des anticorps dirigés contre le fragment hémagglutine contenu dans la séquence MAP. La Figure 2 présente plusieurs Western blots réalisés sur des préparations de membranes de levures S. cerevisiae exprimant ou non le récepteur Patch humain. La révélation du Western blot avec des anticorps dirigés contre l'épitope hémagglutinine présent dans la séquence MAP en C-terminal du récepteur montre que le récepteur humain Patched est bien présent dans les préparations membranaires de levures S. cerevisiae transformées avec les vecteur d'expression pYEP-PMA-hPtc-MAP. Le clone exprimant le plus fortement le récepteur humain Patched (hPtc) à la membrane des levures a été sélectionné (Figure 2A), et les conditions de culture ont été mises au point pour obtenir le meilleur taux d'expression possible. En particulier, il a pu être montré qu'en diminuant la température de culture de 30 à 20°C en milieu riche YPD, l'expression de la protéine Patched était fortement augmentée à la membrane plasmique des levures (Figure 2B). Il a été montré que la température de culture est optimale à 18°C. La présence de glycérol n'a pas d'impact significatif sur la quantité de protéine Patched exprimée. Ensuite, l'oxygénation des cultures a été étudiée, il a été observé qu'elle avait un effet sur l'expression de la protéine, les meilleures conditions d'agitation et de volume de culture ont été mises au point : 300 ml de culture dans un Erlenmeyer de 2 1 et agitation de 200 RPM. En outre, si les levures sont cultivées au dessus de 7 de densité optique à 600 nm, la quantité de protéines Patched à la membrane plasmique diminue (Figure 2C). 1.D. Préparation des membranes plasmiques Le protocole de préparation des membranes a été optimisé selon les conditions suivantes : Dans un tube Falcon de 50 ml contenant un culot de levures d'environ 5 ml, sont ajoutés 10 ml de tampon Tris-HC1 50 mM, pH 7,5, NaCl 300 mM, EDTA 2,5 mM ; 4 mM de Benzamidine ; 1 mM de phényl méthyl sulfonyl fluoride (PMSF) et 5 ml de billes de verre. Le tube est placé sur un vortex et agité 15 minutes à 2000 rpm. Les billes de verre sont éliminées par filtration. La préparation est centrifugée à 2000 g pendant 5 minutes pour éliminer les levures intactes.

Le surnageant est centrifugé à 10000 g pendant 15 minutes pour éliminer les noyaux et autres débris. Les membranes contenues dans ce second surnageant sont alors récupérées après centrifugation de 30 min à 100000 g.

Sur les Western blot de la Figure 2A réalisés sur des préparations de membranes de levures S. cerevisiae exprimant le récepteur Ptc humain, on observe que le récepteur hPtc est bien présent à la taille attendue de 160 kDa. Exemple 2 ù Effet de l'optimisation des conditions de culture sur l'intégrité et la 5 fonctionalité de la protéine Patched exprimée Le présent exemple a consisté à préparer des levures Saccharomyces cerevisiae obtenues conformément aux conditions décrites dans l'exemple 1 puis de cultiver ces levures selon (i) les conditions de la publication De Rivoyre el al 2005 de FEBS, c'est-à-dire des essais mis en oeuvre au cours de la thèse de De Rivoyre (ci-après 10 conditions de l'art antérieur ) ou (ii) les conditions optimisées de la présente invention (ci-après conditions optimisées ). 2A. Analyse par Western-blot des fragments protéiques obtenus Cette analyse, représentée à la Figure 3, est réalisée avec des anticorps dirigés contre l'épitope hémagglutinine présent sur la séquence MAP fusionnée en C- 15 terminal de la protéine hPtc ; elle est réalisée sur des préparations de membranes de levures S. cerevisiae exprimant la protéine humaine hPtc, - le cliché A représente les résultats selon les conditions de l'art antérieur ; - le cliché B représente les résultats obtenus selon les conditions 20 optimisées. On constate sur le cliché A de nombreuses bandes correspondant à des produits de dégradation de la protéine hPtc, ces bandes ont fortement diminué sur le cliché B. Cela est du à l'amélioration des conditions de culture telles que l'abaissement de la température de culture de 22 à 20°C, voire 18°C, et l'amélioration du protocole de 25 préparation des membranes et notamment par l'optimisation de la composition du mélange des inhibiteurs de protéases, et du processus de cassage. 2B. Etude de la fonctionnalité de la protéine obtenue dans les conditions de l'art antérieur Plusieurs essais de co-immunoprécipitation ont été réalisés avec la 30 protéine Patched obtenue selon les conditions de l'art antérieur : Une préparation membranaire de levures S. cerevisiae exprimant hPtc (pistes 3 et 6) ou non (pistes 2 et 5) est solubilisée puis incubée 2 heures en présence de Shh. La solution est ensuite incubée une nuit à 4°C avec de la sepharose prot G-couplée à l'anticorps anti-hémagglutinine afin de retenir la protéine hPtc et éventuellement Shh en interaction avec hPtc. Les protéines retenues sur la résine sont éluées et déposées sur gel SDS PAGE puis transférées sur membrane pour une détection avec des anticorps dirigés contre Shh. L'analyse du Western blot (Figure 4) montre que la bande à 20 kDa correspondant à Shh n'est pas présent dans les pistes 3 et 6 dans lesquelles Shh a été incubée avec hPtc. Par contre, des bandes correspondant à Shh sont présentes dans la piste 8 correspondant à la fraction non-retenue sur résine du mélange hPtc/Shh. Ceci indique que Shh n'interagit pas avec hPtc telle qu'elle est produite dans les conditions de l'art antérieur.

Par comparaison, les résultats détaillés dans l'exemple 3 et représentés en Figure 5A montrent que la protéine Patched obtenue dans les conditions optimisées interagit avec Shh et est fonctionelle. En effet, un essai de co-immunoprécipitation entre des préparations membranaires de levures S. cerevisiae exprimant hPtc ou non (contrôles) et Shh montre qu'en présence de hPtc, 2,5 fois plus de Shh sont immunoprécipités qu'en absence de hPtc, ce qui indique que hPtc produit dans la levure S. cerevisiae dans les conditions optimisées est capable d'interagir avec son ligand Shh. Exemple 3 - Mesures d'interaction entre le récepteur Patched humain exprimé dans la levure et son ligand, la protéine Sonic Hedgehog purifiée. 3.A. Mesure par Pull-down et Western blot 100 g de préparations membranaires de levures exprimant ou non la protéine Patched ont été incubés avec différentes quantités de ligand Sonic hedgehog purifié (Shh) (0 ; 1,5 et 6 g) 1 heure à 25°C. Les membranes ont ensuite été centrifugées 1 heure à 20000 g. Les culots ont été repris avec du tampon, déposés sur gel SDS-PAGE et transférés sur membrane de nitrocellulose. Les membranes ont été incubées avec des anticorps dirigés contre la séquence hémagglutinine pour confirmer la présence du récepteur hPtc et avec des anticorps dirigés contre la protéine Shh pour mettre en évidence l'interaction hPtc-Shh quand elle a lieu. Le Western blot présenté sur la Figure 5A montre que les culots de membranes de levures exprimant le récepteur Patched ont retenu 2 à 3 fois plus de ligand Shh que les membranes de levures n'exprimant pas le récepteur (contrôle de l'interaction non spécifique de Shh avec les membranes de levures). Le récepteur Patched humain contenu dans les membranes ainsi préparées est capable d'interagir avec son ligand Sonic Hedgehog purifié ; il a pu être évalué que ces préparations membranaires de S. cerevisiae contenaient environ 20 pmoles de récepteur Patched humain par mg de protéines membranaires. 3.B. Mesure par la technologie de résonance plasmonique (Biacore) Cette technologie mesure les variations de masse à la surface d'un 5 biocapteur recouvert d'une couche d'or et de dextran. 50 g de ligand Shh purifiés ont été immobilisés par couplage amine sur une des 4 cellules du biocapteur. Des préparations de membranes de levures exprimant ou non le récepteur hPtc ont été injectées dans l'appareil sur la cellule contenant Shh et sur une cellule ne contenant pas Shh pour pouvoir déduire les interactions non spécifiques. Le l0 sensorgramme de la Figure 6 présente les courbes d'interaction des préparations membranaires après déduction du signal de fixation non-spécifique d'association au biocapteur CM5 de Biacore activée avec les réactifs de couplage mais sans Shh. La courbe hPtc montre que l'unité de résonance (RU) augmente indiquant une augmentation de la masse à la surface du biocapteur due à l'interaction entre 15 Patched et Shh. Ainsi, comme avec la technique du Pull-down, la technologie de résonance plasmonique (mise en oeuvre avec un appareil Biacore 3000) montre que le récepteur humain Patched exprimé à la membrane des levures S. cerevisiae est capable d'interagir avec son ligand, Sonic Hedgehog. 20 Un essai utilisant la même technologie a été mis en oeuvre avec un biocapteur hydrophobe L L Sur la première cellule servant de contrôle (flowcell 1 (FC 1) de référence) ont été injectés 200 g/ml de membranes de levures n'exprimant pas hPtc ; sur la seconde cellule (FC2), 200 g/ml de membranes de levures exprimant hPtc ont été injectés. Des concentrations croissantes de Shh ont été ajoutées sur les deux cellules en 25 même temps. Le sensorgramme présenté à la Figure 7 représente la différence d'unités de résonance (RU) mesurées entre FC2 et FC 1 afin d'éliminer un éventuel bruit de fond. On observe une augmentation du nombre de RU à chaque injection de Shh correspondant à la fixation de Shh sur hPtc. Exemple 4 - Purification du récepteur humain Patched 30 Une préparation des membranes de levures exprimant le récepteur Patched humain (hPtc) a été solubilisée avec 1% de détergent DDM (Dodecyl B-D Maltoside) à 4°C pendant 1 heure, et centrifugé à 100000 g pendant 30 minutes. Le récepteur hPtc solubilisé contenu dans le surnageant a été incubé avec les résines Ni-NTA (en présence de 10 mM d'imidazole) ou Calmoduline (en présence de 2 mM de Calcium).

Les élutions présentées sur le Western Blot de la Figure 8 montrent que le récepteur hPtc peut être purifié en utilisant ces différentes résines. Exemple 5 ù Mesures d'interaction entre le récepteur Patched humain purifié et son ligand Shh Cet exemple utilise le biocapteur CM5 sur lequel 50 g de Shh purifié ont été fixés par couplage covalent (amine) sur la cellule 2. La protéine Patched purifiée a été injectée sur la cellule 1 ne contenant pas Shh et servant de contrôle, et sur la cellule 2 contenant Shh. Le sensorgramme de la Figure 9 présente la différence en unité de résonance plasmonique (RU) entre les deux cellules et permet ainsi de soustraire l'éventuelle fixation non spécifique de Patched purifié avec le biocapteur non couplé à Shh. L'augmentation du nombre d'unités de RU indique que Patched purifié est capable d'interagir avec son ligand Shh. Conclusions L'ensemble de ces exemples montrent qu'il a été mis au point une souche de levures Saccharomyces cerevisiae exprimant le récepteur humain Patched de la voie Hedgehog à leur membrane plasmique sous une conformation fonctionelle, c'est-à-dire, capable d'interagir avec son ligand naturel Sonic Hedgehog. 5 10 15 20

Claims (19)

1. REVENDICATIONS1. Procédé de culture d'une souche de levure Saccharomyces cerevisiae exprimant la protéine humaine Patched fonctionnelle comprenant les étapes suivantes : a) clonage dans un vecteur d'expression de levure d'une première séquence codant pour un polypeptide fusionné à ladite protéine humaine Patched comportant : i) un ou plusieurs fragments protéiques capables de se fixer sur un support de séparation ; ii) un fragment protéique capable de se lier avec au moins un anticorps et iii) un ou plusieurss sites de clivage aux protéases ; et d'une seconde séquence consistant en la séquence d'ADNc codant pour ladite protéine humaine Patched en position 5' de ladite première séquence; b) transfomation de levures Saccharomyces cerevisiae avec ledit vecteur d'expression ; c) culture des levures Saccharomyces cerevisiae obtenues à l'étape b) sur un milieu de culture riche ; ledit procédé étant caractérisé en ce que l'étape c) de culture des levures Saccharomyces cerevisiae est réalisée dans des conditions telles que la culture ne doit pas dépasser une valeur de densité optique à 600 nm de 8 et que le milieu est aéré avec un ratio du volume de milieu de culture sur le volume d'air compris entre 1 : 5 et 1 : 10 ou avec un débit d'air introduit sous pression égal à 1 à 3 fois le volume du fermenteur par 25 minute.
2. 2. Procédé selon la revendication 1, caractérisé en ce que la densité optique à 600 nm du milieu de culture est comprise entre 5 et 8 inclus.
3. 3. Procédé selon la revendication 1 ou 2, caractérisé en ce que ladite séquence codant pour un polypeptide est la séquence MAP de SEQ ID NO : 1. 30
4. 4. Procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 3, caractérisé en ce que dADNc codant pour la protéine Patched humaine a pour séquence SEQ ID NO : 3.
5. 5. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que ledit vecteur d'expression est le plasmide pYEP-PMA et laditeREVENDICATIONS AMENDEES souche de levure Saccharomyces cerevisiae est la souche K699 (Mata, ura3, Leu2-3, trpl-1, ade2-1, canl-100, his3-11, ssdl-d2, GAL).
6. 6. Procédé selon l'une quelconque des revendications précédentes, caractérisé en ce que la température de culture de l'étape c) est comprise entre 15 et 25°C.
7. 7. Souche de levure Saccharomyces cerevisiae exprimant la protéine Patched humaine fonctionnelle susceptible d'être obtenue par le procédé selon l'une quelconque des revendications 1 à 6.
8. 8. Procédé de préparation d'extraits de membranes de levures Saccharomyces cerevisiae comprenant un récepteur protéique Patched fonctionnel, 10 caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) mélange desdites levures exprimant ledit récepteur protéique avec un tampon comprenant (i) un mélange d'inhibiteurs de protéases comprenant au moins 2 mM de benzamidine, au moins 1 mM de PMSF et au moins 1 mM d'EDTA et (ii) des billes de verre ; 15 b) agitation du mélange obtenu à l'étape a) au vortex à une vitesse comprise entre 1500 et 2500 rpm pendant 10 à 20 minutes ; c) élimination des billes de verre ; d) ultracentrifugation du surnageant obtenu à l'étape c) à au moins 18000 g pendant au moins 20 minutes ; et 20 e) récupération du culot constitué de membranes comprenant ledit récepteur protéique.
9. 9. Procédé selon la revendication 8, caractérisé en ce que, à l'étape b), la vitesse d'agitation est d'environ 2000 rpm et la durée d'agitation est d'environ 15 minutes.
10. 10. Procédé selon la revendication 8 ou 9, caractérisé en ce que, à 25 l'étape d), l'ultracentrifugation est réalisée à une vitesse comprise entre 50000 et 200000 g.
11. 11. Extraits de membranes de levures Saccharomyces cerevisiae comprenant le récepteur humain Patched fonctionnel susceptibles d'être obtenus selon le procédé de l'une quelconque des revendications 8 à 10.
12. 12. Utilisation d'un extrait selon la revendication 11 comme outil de 30 recherche de molécules capables d'interagir avec le récepteur humain Patched.
13. 13. Procédé de criblage de ligands de la protéine humaine Patched comprenant les étapes de : a) mise en contact du récepteur humain Patched et des molécules à tester ;REVENDICATIONS AMENDEES b) détection d'une interaction entre ledit récepteur et lesdites molécules à tester ; et c) sélection desdites molécules à tester pour lesquelles une interaction est mesurée ; caractérisé en ce que ledit récepteur humain Patched se présente sous la forme d'extraits de membranes de levure selon la revendication 11 ou sous une forme purifiée obtenu à partir desdits extraits de membranes de levure selon la revendication 11.
14. 14. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape a) est mise en oeuvre en phase liquide et qu'il comporte les étapes suivantes : a) mise en contact du récepteur humain Patched et des molécules à tester ; b) récupération dudit récepteur humain Patched éventuellement lié à une ou plusieurs molécules à tester ; c) détection d'une interaction entre ledit récepteur humain Patched et lesdites molécules à tester ; et d) sélection desdites molécules à tester pour lesquelles une interaction est mesurée.
15. 15. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce que l'étape a) est mise en oeuvre sur un support solide.
16. 16. Procédé selon la revendication 15, caractérisé en ce que ledit support solide est un biocapteur de détection par résonance plasmonique.
17. 17. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit biocapteur de détection par résonance plasmonique est un biocapteur hydrophile.
18. 18. Procédé selon la revendication 16, caractérisé en ce que ledit 25 biocapteur de détection par résonance plasmonique est un biocapteur NTA préalablement traité avec une solution de NiC12.
19. 19. Procédé selon la revendication 13, caractérisé en ce qu'il comprend les étapes suivantes : a) fixation de la protéine Hedgehog sur un support solide 30 convenable; b) mise en contact de ladite protéine Hedgehog avec le récepteur humain Patched ; c) détermination d'une première valeur de liaison ; 10 15 20 5REVENDICATIONS AMENDEES d) dissociation de ladite protéine Hedgehog et dudit récepteur humain Patched ; e) mise en contact de ladite protéine Hedgehog avec un mélange comprenant ledit récepteur humain Patched et une ou plusieurs molécules à tester ; f) détermination d'une seconde valeur de liaison ; g) comparaison de la première et de la seconde valeur de liaison et sélection de molécules capables de se lier audit récepteur humain Patched. io