TWI491730B - 穩定表現類大麻素受體ｃｂ２之細胞株及其應用 - Google Patents

Description

穩定表現類大麻素受體CB2之細胞株及其應用

本發明是有關於一種細胞株及其於篩選化合物之應用，特別是有關於一種表現類大麻素受體重組蛋白之細胞株及其應用於篩選類大麻素受體的潛在配位體。

人類基因庫中約有1200種G蛋白偶合受體(G Protein-Coupled Receptors；GPCR)，且目前已發現有許多疾病與G蛋白偶合受體的調控有關，因此G蛋白偶合受體經常被用來作為藥理研究的模式之一。在G蛋白偶合受體超級家族中，類大麻素受體(cannabinoid receptors；CB；或稱CB受體)與免疫系統之調控相關，主要廣泛分布於周邊組織、細胞、免疫細胞。在人體內，CB受體依照其受體初級結構、配位體結合部位及訊息傳遞系統之異同，至少可區分成二種類型，分別為CB1受體及CB2受體。近年來的研究更證實，CB2受體也表現於正常之神經細胞。人類的CB2基因位於第一對染色體上的短臂末端36的位置上，可轉譯出由360個胺基酸所組成的蛋白質。當中央神經系統(central nervous system；CNS)相關的慢性發炎疾病發生時，亦會使小膠質細胞(microglia)上之CB2受體的表現量顯著上升。

過去研究發現，以調控CB1受體為目標所發明的藥物，具有影響中央神經系統等不良的藥物副作用，例如興奮(euphoria)、對時間和空間知覺混亂、嗜睡、頭暈、運動神經不協調(motor discoordination)、記憶喪失(memory lapses)，以致於針對調控CB1受體的藥物在應用上有諸多限制。相較之下，以調控CB2受體為目標所發明的藥物，則沒有上述不良的藥物副作用。

縱謂以調控CB2受體為目標所發明的藥物，沒有上述不良的藥物副作用，然而，實際上在篩選以調控CB2受體為目標的藥物時，卻面臨下述困難。首先，絕大多數的研究仍採用放射性元素標定配位體，來直接分析CB2受體-配位體之結合活性。不過，以放射性元素標定配位體需要昂貴的耗材，且操作者暴露於潛在的輻射活性危險下。雖然標定螢光物質的CB2選擇性配位體，沒有輻射風險，但目前尚未上市販售。如今可望即將上市之標定螢光物質的配位體只有一個，即「近紅外光染劑標定mbc94(near-infrared dye labeled mbc94；NIRmbc94)」，其中mbc94為CB2配位體SR144528之可接合的類似物(conjugable analogue)，其CB2/CB1之相對親合力(affinity)大於700，惟NIRmbc94目前仍無法普遍取得。另外，許多CB2選擇性配位體被標定螢光物質後，雖然降低放射性元素標定的風險，卻有親和力大幅下降的影響。正因如此，關於CB2受體的配位體之進展，至今仍停留在研究階段。

其次，可藉由測定CB2受體之下游訊息傳遞路徑(downstream signal transduction pathway)所涉及之蛋白質含量的改變，例如：磷酸化絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase；MAPK)活性之變化，以間接分析CB2受體-配位體之結合活性。但此方式易受許多外來因子與人為誤差之干擾。

另外，亦有文獻曾利用人類CB2受體基因，與G_αqi5 及G_αqo5 之嵌合型(chimeric)G蛋白基因，二者進行細胞之共轉染(cotransfection)，藉此分析CB2受體-配位體之結合活性。當配位體與CB2受體蛋白結合時，CB2受體蛋白則可與G_αqi5 及G_αqo5 之嵌合型蛋白二者偶合，而進一步活化細胞內磷脂酶C-三磷酸肌醇-二價鈣離子(phospholipase C-inositol trisphosphate-Ca²⁺ ；PLC-IP3-Ca²⁺ )訊息傳遞路徑，導致細胞內二價鈣離子的濃度產生變化，再藉由測量高通透性二價鈣離子影像的方式，來研究CB2受體與激活劑(agonist)及拮抗劑(antagonist)之功能特性。藉由測定二價鈣離子濃度的改變，雖可避免操作者暴露於潛在的輻射活性危險下，惟仍存在以下缺點：(1)只能觀察影像的改變，難以做到定量分析；以及(2)共轉染之細胞株較不容易選殖出穩定表現株，且轉染進入細胞之質體容易被丟失。

綜上所述，以上篩選調節CB2受體之潛在配位體之方法，各有其限制與無可避免之風險。有鑑於此，亟需提出一種穩定表現CB2受體之細胞株，以應用於篩選出調節CB2受體之潛在配位體。

因此，本發明之一態樣是在提供一種穩定表現類大麻素受體2(cannabinoid receptor 2；CB2；或稱CB2受體)重組蛋白之細胞株，其係利用含有CB2受體全長基因之重組質體，轉染至細胞株，以於細胞膜表面穩定表現出CB2受體重組蛋白。

本發明的另一態樣則是在提供一種篩選類大麻素受體之潛在配位體的方法，其係將上述細胞株培養於含或未含樣品溶液之培養液中，培養一段時間後，再檢測、比較並分析細胞株培養於含或未含樣品溶液之特定目標物的含量之差值，並根據此差值判斷樣品溶液是否含有與CB2受體重組蛋白專一性結合之配位體。當前數之差值不為零時，則判斷此樣品溶液含有潛在配位體，藉此從大量樣品中快速、安全且正確篩選調節類大麻素受體CB2之潛在配位體。

根據本發明之上述態樣，提出一種穩定表現類大麻素受體重組蛋白之細胞株。在一實施例中，此細胞株可具有一重組質體，且此重組質體具有如序列辨識編號1所示序列之核酸序列，藉以表現如序列辨識編號2所示序列之類大麻素受體2(cannabinoid receptor 2；CB2)重組蛋白。

依據本發明一實施例，上述之細胞株例如可為人類胚胎腎臟上皮細胞株HEK293(美國典型培養物保存中心[American Type Culture Collection；ATCC]之寄存編號：ATCC CRL-1573)。

根據本發明之其他態樣，另提出一種篩選類大麻素受體之潛在配位體的方法。在一實施例中，首先，可進行一培養步驟，其係將上述細胞株培養於含或未含樣品溶液之培養液中，於37℃、5%二氧化碳下培養1小時至20小時，其中此細胞株係表現如序列辨識編號2所示序列之類大麻素受體2(CB2)重組蛋白。接著，進行一檢測步驟，以檢測經由含上述樣品溶液培養之上述細胞株之一目標物之第一含量，並檢測經由未含上述樣品溶液培養之上述細胞株之此目標物之第二含量，其中上述目標物例如可為環單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate；cAMP)或絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase；MAPK)。之後，進行一比較步驟，以獲得上述第一含量與第二含量之差值。而後，進行一分析步驟，以根據上述之差值判斷前述樣品溶液是否含有與CB2受體重組蛋白專一性結合之一潛在配位體(potential ligand)，其中當上述之差值不為零時，則判斷前述樣品溶液含有潛在配位體。

依據本發明一實施例，上述之潛在配位體可抑制例如由錦紫蘇萃取物(forskolin)刺激前述細胞株產生之cAMP之第一含量。

依據本發明一實施例，上述之潛在配位體可促進例如MARK之第一含量。

應用本發明之穩定表現類大麻素受體CB2之細胞株及其應用於篩選類大麻素受體之潛在配位體的方法，其係利用含有CB2受體全長基因之重組質體，轉染至細胞株並於細胞膜表面穩定表現出CB2受體重組蛋白，並將上述細胞株培養於含或未含樣品溶液之培養液中，然後分析目標物含量變化，以判斷此樣品溶液是否含有與CB2受體重組蛋白專一性結合之潛在配位體，藉此從大量樣品中快速、安全且正確篩選出類大麻素受體之潛在配位體。

承前所述，本發明提供一種穩定表現CB2受體之細胞株及其應用，其係利用含有CB2受體全長基因之重組質體，轉染至人類腎臟細胞株並於細胞膜表面穩定表現出CB2受體重組蛋白，以利用此細胞株從大量樣品中快速、安全且正確篩選出類大麻素受體之潛在配位體。

本發明此處所稱之「類大麻素受體CB2(或稱CB2受體)」係指隸屬於G蛋白偶合受體(G protein-coupled receptors；GPCR)超級家族成員之一。CB2受體主要分布於免疫細胞以及周邊細胞與組織中。近來研究指出，表現在免疫細胞上的CB2受體，可影響內生性配位體的免疫調控。許多文獻更證實CB2受體也表現於人工培養的神經細胞與神經系統中，參與慢性疼痛與神經性退化疾病調控。而在CB2受體全長基因剃除小鼠實驗中，更證實CB2受體具有調節巨噬細胞上共同刺激因子(co-stimulatory factor)的活性。

誠如先前研究指出，以調控CB1受體為目標所研發的藥物，具有影響中央神經系統等不良的藥物副作用，以致於針對調控CB1受體的藥物在應用上有諸多限制。相較之下，以調控CB2受體為目標所發明的藥物，則沒有上述不良的藥物副作用。舉例而言，目前已知紫錐花之活性物質─烷醯胺(alkylamides)以及諾麗果萃取液，二者可結合至CB2受體，進而調控免疫反應。

本發明此處所稱之「CB2受體重組蛋白」，係指從人類cDNA中，例如市售之人類脾臟組織cDNA，利用專一引子對進行聚合酶鏈鎖反應(polymerase chain reaction；PCR)，增幅而得CB2受體全長基因之核酸片段。此處所稱之「CB2受體全長基因」則實指包含CB2受體全長基因之開放讀架(open reading frame；ORF)，亦即當此核酸片段轉錄為mRNA並轉譯為CB2受體時，可表現出包含起始密碼子(start codon)與終止密碼子(stop codon)之間的胺基酸序列。在一實施例中，前述之CB2受體重組蛋白例如可為360個胺基酸所組成的蛋白質及/或標籤序列。在一例示中，CB2受體重組蛋白之標籤序列可由載體提供，其中此標籤序列例如可為其他胺基酸與數個組胺酸(histidine；His)所構成之標籤(tag)序列。在另一例示中，此標籤序列例如可為1個酪胺酸(tyrosine；Tyr)與6個組胺酸所構成之標籤序列。在此補充說明的是，上述導入標籤序列的方法應為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，且經由後述之實施例證明，前述之標籤序列並不影響CB2受體重組蛋白與配位體專一性結合的功能。

在一實施例中，前述之專一引子對可其係依據例如美國國家生物技術資訊中心(National Center for Biotechnology Information；NCBI)網站之基因庫(GenBank)中，由Munro等人於1993年發表之人類的類大麻素受體CB2(hCB2)之基因序列(編號：NM_001841.2，共具有1789個鹼基對(base pairs；b.p.))，利用DNASTAR專業序列分析軟體(Expert Sequence Analysis Software)，例如EditSeq 5.0(DNASTAR Inc.)進行此引子對之序列設計，其中引子對包括上游引子與下游引子，上游引子之5’端設計有第一限制酶切位，且與hCB2受體之基因序列的第1鹼基至第6鹼基互補，如序列辨識編號3所示；而下游引子之5’端設計有第二限制酶切位，且與hCB2受體之基因序列的第1066鹼基至第1083鹼基互補，如序列辨識編號4所示。在一例示中，第一限制酶例如可為Kpn I，第二限制酶例如可為Age I。利用上述引子對可由人類cDNA增幅出如序列辨識編號1所示序列、約1083 bp之hCB2受體的核酸片段。上述例舉之引子對玆整理如後述之第1表所示。

本發明此處所稱之「細胞株」，在一實施例中，係指人類胚胎腎臟上皮細胞株HEK293，其中此細胞株係購自於例如美國典型培養物保存中心[American Type Culture Collection；ATCC]、寄存編號為ATCC CRL-1573之HEK293細胞株。在此實施例中，本發明排除利用HEK293T作為本發明實施的細胞株。

本發明此處所稱之「含有CB2全長基因之重組質體」係指已嵌入CB2全長基因之重組質體(recombinant plasmid)。在一實施例中，此含有CB2全長基因之重組質體可將前述引子對增幅而得之hCB2受體全長基因的核酸片段(如序列辨識編號1所示序列)經限制酶作用，例如Kpn I及/或Age I，截切並純化出hCB2受體全長基因的核酸片段後，再構築並接合(ligate)於例如經同樣限制酶處理並純化之載體中，例如哺乳類動物細胞表現載體，以形成重組質體，並經定序確定構築之序列無誤。

惟需說明的是，此處設計的限制酶切位序列端視欲連接的載體而異，故本發明一實施方式之限制酶切位序列並不限於此處所舉。以上例舉之各引子玆整理如第1表所示：

第1表

在此須另需說明的是，此處所稱之“載體”或“表現載體”等，係指未嵌入基因之載體(vector)。而所稱之“重組質體”或“表現質體”等，則指已嵌入CB2全長基因之重組質體(recombinant plasmid)。

本發明此處所稱之「穩定表現(stable expression)」係指將上述“重組質體”導入(introduce)或轉染(transfect)至上述細胞株後，選殖出之穩定表現CB2受體“細胞株”。上述將重組質體導入細胞株的方式不拘，可使用任何習知熟知的方式，例如磷酸鈣(calcium phosphate)、二乙基胺基乙基-葡聚糖(diethylaminoethyl-dextran；DEAE-dextran)、微脂體(liposome)、電穿孔(electroporation)、顯微注射(microinjection)、病毒感染(retrovirus infection)、基因槍(gene-gun)等方法。此外，由於上述導入或轉染細胞的方法，應為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，且亦可藉由例行性實驗，選殖出穩定表現CB2受體重組蛋白之細胞株，故在此不另贅述。由於本發明之細胞株可穩定表現CB2受體重組蛋白，因此可解決目前CB2受體之配位體的篩選平台過於昂貴，以放射性元素標定配位體會有暴露於輻射線之危險，以螢光物質標定配位體有親和力大幅下降的問題，選殖出的CB2受體之細胞株表現不穩定，又或以間接分析方式不易排除外來干擾之誤差、不易定量分析等問題。

本發明此處所稱之「篩選CB2受體之潛在配位體」，係指利用上述穩定表現CB2受體重組蛋白之細胞株，篩選出與CB2受體專一性結合之潛在配位體。在一實施例中，本發明係將上述細胞株，培養於含或未含樣品溶液之培養液中，經培養一段時間後，檢測、比較並分析經由含此樣品溶液培養之細胞株之目標物之含量變化，以判斷此樣品溶液是否含有與CB2受體重組蛋白專一性結合之潛在配位體(potential ligand)。

在前述實施例中，適用於評估潛在配位體的「目標物」，一般係指潛在配位體與CB2受體專一性結合後，藉由評估CB2受體之下游訊息傳遞路徑所涉及之蛋白質含量的改變，例如環單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate；cAMP)或絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase；MAPK)，以判斷一樣品溶液中是否含有潛在配位體。至於本發明此處所稱之「潛在配位體」，即指可引起上述目標物之含量變化者。

請參閱第1圖，其係繪示根據本發明一實施例之受類大麻素衍生物(或潛在配位體)刺激的CB2受體涉及之部分訊號傳遞途徑的示意圖。一般而言，細胞內105的腺苷酸環化酶(adenylate cyclase；AC)可催化cAMP之生成，而細胞內cAMP累積量可調控蛋白激酶A(protein kinase A；PKA)依賴型的訊息傳遞路徑，進而調控免疫細胞之介白素-2(interleukin-2；IL-2)、誘導型一氧化氮合成酶(inducible nitric oxide synthase；iNOS)等之表現。而細胞膜101上之CB2受體受到細胞外103之類大麻素衍生物(或潛在配位體)刺激後，則可與細胞內105之抑制型G蛋白(Gi)偶合，抑制下游訊息傳遞路徑的腺苷酸環化酶(adenylate cyclase；AC)的活性，進而抑制細胞內cAMP累積量。因此，在一實施例中，藉由測定受類大麻素衍生物(或潛在配位體)刺激之細胞內cAMP累積量的變化，可評估穩定表現CB2受體之細胞株與潛在配位體專一性結合能力。

其次，受細胞外103之類大麻素衍生物(或潛在配位體)刺激的CB2受體，與細胞內105之抑制型G蛋白(Gi)偶合後，亦可刺激下游訊息傳遞路徑的絲裂原活化蛋白激酶(mitogen-activated protein kinase；MAPK)之活化(phosphorylation)，如第1圖之所示，其中MAPK之活化係與免疫細胞的移行(migration)有關。因此，在另一實施例中，藉由測定受類大麻素衍生物(或潛在配位體)刺激之活化態(phosphorylated)的細胞內絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)之活化，可評估穩定表現CB2受體之細胞株與潛在配位體專一性結合能力。此外，受配位體刺激的CB2受體也會刺激細胞內105合成神經醯胺(ceramide)，而使細胞產生前細胞凋亡(pro-apoptotic)的反應，進而抑制多種腫瘤細胞的生長。

在評估穩定表現CB2受體之細胞株與潛在配位體專一性結合能力時，可將上述細胞株，培養於含或未含樣品溶液之培養液中，經培養一段時間後，例如於37℃、5%二氧化碳下培養1小時至20小時，檢測、比較並分析經由含此樣品溶液培養之細胞株之上述目標物之含量變化，以判斷此樣品溶液是否含有與CB2受體重組蛋白專一性結合之潛在配位體(potential ligand)。

在一例示中，上述檢測步驟係檢測經由含上述樣品溶液培養之上述細胞株之cAMP(及/或MAPK)之第一含量，並檢測經由未含上述樣品溶液培養之上述細胞株之cAMP(及/或MAPK)之第二含量。之後，進行比較步驟，以獲得cAMP(及/或MAPK)之第一含量與第二含量的差值。而後，進行分析步驟，以根據上述之差值判斷前述樣品溶液是否含有與CB2受體重組蛋白專一性結合之一潛在配位體，其中當上述之差值不為零時，則判斷前述樣品溶液含有潛在配位體。

在另一例示中，利用cAMP評估時，上述潛在配位體可抑制由例如錦紫蘇萃取物(forskolin)刺激前述細胞株產生之cAMP的含量。在另一例示中，利用MAPK評估時，上述潛在配位體可促進活化態MARK之含量，例如可促進活化態MARK之蛋白質含量。藉由上述cAMP(及/或MAPK)之含量變化，可以判斷一樣品溶液是否含有與CB2受體重組蛋白專一性結合之潛在配位體。由於本發明係利用穩定表現CB2受體之細胞株進行篩選，因此可從大量樣品中快速、安全且正確篩選出調節類大麻素受體CB2之潛在配位體。

以下利用數個實施方式以說明本發明之應用，然其並非用以限定本發明，本發明技術領域中具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾。

實施例一：構築類大麻素受體CB2全長基因之重組質體及大量培養

1.利用聚合酶鏈鎖反應合成hCB2受體全長基因之核酸片段

此實施例係構築hCB2受體蛋白基因之重組質體、轉型株及大量培養。hCB2受體之核酸片段係從市售之人類脾臟組織cDNA(Clontech,California,U.S.A.)，利用引子對進行聚合酶鏈鎖反應增幅而得。申言之，可將前述引子對與人類脾臟組織cDNA，添加至市售商品化之PCR反應試劑(例如10×Easy-A Reaction Buffer，Stratagene，U.S.A.)等中，進行聚合酶鏈鎖反應，以獲得hCB2受體之核酸片段，其中PCR反應之試劑如第2表所例示：

在利用引子對與人類脾臟組織cDNA進行聚合酶鏈鎖反應時，其反應條件可例如但不限於以下所例示：首先，在94℃下進行5分鐘至10分鐘，使雙股模板DNA進行預分離(pre-denaturation)反應。接著，在94℃反應30秒至1分鐘進行分離反應、在50℃至60℃反應30秒至1分鐘進行引子對-模板DNA黏合(annealing)反應、在72℃進行30秒至2分鐘的DNA延長(extension)反應，以此為一個循環，共重複進行30個至40個循環的反應，惟在另一實施例中，上述引子對-模板DNA黏合反應可於例如55℃至60℃反應30秒，再於72℃進行1分鐘至1.5分鐘的延長反應，共重複進行35個循環的反應。

請參閱第2圖，其係根據本發明一實施例之hCB2受體之核酸片段的瓊膠體電泳分析圖，其中第1道表示以100鹼基對級進之DNA梯狀標記(DNA ladder，Bertec公司，台北，台灣)，而第2道表示含有hCB2受體全長基因之核酸片段，如箭頭201之所示。由第2圖第2道之結果可知，利用引子對從人類脾臟組織cDNA中確實可專一性增幅出hCB2受體全長基因的核酸片段(約1083 bp；如箭頭201之所示)。

2.構築含有hCB2受體全長基因之重組質體與製備轉型株

經上述聚合酶鏈鎖反應後，以引子對所得之hCB2受體全長基因的核酸片段經限制酶作用，例如Kpn I與Age I(均為NEW ENGLAND Biolabs,MA. U.S.A.)，截切並純化出hCB2受體全長基因的核酸片段後，可構築並接合於經同樣限制酶處理(例如Kpn I與Age I，均為NEW ENGLAND Biolabs,MA. U.S.A.)並純化之載體中，例如哺乳類動物細胞表現載體pcDNA3.1/V5-His TOPO TA(Invitrogen,U.S.A.)載體，以形成重組質體，以獲得含有hCB2受體全長基因的核酸片段之重組質體(或稱(pcDNA3.1-hCB2)。重組質體亦經PCR及DNA定序確定構築之序列無誤。惟上述有關重組質體之限制酶作用、構築重組質體、接合反應等為本技術領域中任何具有通常知識者所熟知，故在此不另贅述。

上述重組質體可進一步轉型(transform)至適當的宿主，例如大腸桿菌(E. coli )XL-1 Blue菌株之勝任細胞(competent cell)，以作為上述重組質體之轉殖及保存的宿主。之後，進行藍白篩選，即利用異丙基-β-D-硫代半乳醣苷(isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside；IPTG；Amresco,U.S.A.)誘導重組質體之乳糖操作子(lac operon)，並利用5-溴-4-氯-3-吲哚-b-D-半乳糖苷(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-b-D-galactopyranoside；X-gal)使轉型成功之菌落顯色，並經PCR及DNA定序確定構築之序列無誤的菌落後，即可進行大量培養。惟上述有關構築重組質體、轉型至細菌體、大量培養、抽取質體DNA、測光學密度(optical density；O.D. 260)值、建立標準曲線、PCR及DNA定序等為本技術領域中任何具有通常知識者所熟知，故在此不另贅述。

請參閱第3圖，其係根據本發明一實施例之重組質體經限制酶作用的瓊膠體電泳分析圖，其中第1道表示以1000鹼基對級進之DNA梯狀標記(DNA ladder，Bertec公司，台北，台灣)，第2道表示載體經(pcDNA3.1)限制酶作用所得之核酸片段(約5.5 kb)，而第3道表示重組質體經限制酶截切所得之hCB2受體全長基因之核酸片段(約1083 bp)與載體片段(約5.5 kb)。由第3圖第3道之結果可知，重組質體經限制酶作用後，可專一性截切出hCB2受體全長基因的核酸片段(如箭頭301之所示)與載體經(pcDNA3.1；如箭頭303之所示)。

實施例二：穩定表現株之建立並評估

1.製備細胞轉染用之大量重組質體DNA

實施例一所得之第二重組質體經轉型至例如大腸桿菌XL-1 Blue菌株並大量培養後，利用含有陰離子交換樹脂的套組，例如EndoFree^TM Plasmid Maxi Kit(Qiagen Pierce,U.S.A.)、抽取大量質體DNA，且不含細菌內毒素，以利於後續進行細胞株之轉染。

2.細胞株之轉染

將人類胚胎腎臟上皮細胞株HEK293，其係購自於例如美國典型培養物保存中心[American Type Culture Collection；ATCC]、寄存編號為ATCC CRL-1573之HEK293細胞株，培養於低濃度葡萄糖的杜貝可改良之伊格氏培養液(Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium-low glucose；DMEM；Invitrogen/Gibco,U.S.A)。上述細胞培養液另添加10體積百分比之胎牛血清(USDA-grade fetal bovine serum；Biological Industries,Isreal)以及1體積百分比之抗生素(含有盤尼西林與鏈黴素，penicillin-streptomycin；Invitrogen/Gibco,U.S.A)，置於37℃、5%CO₂ 培養箱中進行培養。HEK293係以貼附方式生長，其細胞型態為不規則觸角狀。

將1×10⁶ /mL之細胞種於直徑6 cm之培養皿裡，置於37℃、5%CO₂ 培養箱中培養16小時至18小時，使細胞達約7至8分滿。接著，更換新鮮培養液，再於37℃、5%CO₂ 培養箱中培養3小時。然後，將約5 μg DNA與約10 μL之轉染試劑，例如TurboFect in vitro Transfection Reagent (Fermentas,Canada)，先分別與約250 μL、150 mM之NaCl溶液混合均勻後，再將兩者混合均勻成轉染反應液，於室溫(例如約15℃至35℃)靜置15分鐘至30分鐘。此時，待轉染之細胞需先更換成不含血清與抗生素之培養液，以增加轉染之成功率。之後，將轉染反應液加入待轉染之細胞中，置於37℃、5%CO₂ 培養箱中培養約6小時。反應完成後，更換新鮮培養液，再於37℃、5%CO₂ 培養箱中培養16小時至18小時，並於細胞轉染後24小時內，利用G418硫酸鹽篩選穩定表現細胞株。

3.篩選穩定表現株

細胞轉染後24小時內，將轉染之細胞更換新鮮培養液，並於培養液中加入100 μg/mL之G418硫酸鹽(Calbiochem,U.S.A.；以下簡稱G418)，以篩選轉染成功的細胞株，而未轉染成功的細胞株便會死亡。每次細胞繼代增加100 μg/mL之G418的濃度，繼代培養約一個月後，培養中成功轉染的細胞會生長成群落狀。此時，利用0.5×胰蛋白酶-乙烯二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA)溶液處理細胞，並將處理後之細胞培養至96孔盤中，待其長滿再繼代至48孔盤，依此逐漸將此穩定表現株擴大培養，以備後續實驗的進行。

4.評估hCB2受體全長基因之重組質體於穩定表現株之表現

4.1 　評估穩定表現株內hCB2受體全長基因之mRNA的表現

此例示係利用反轉錄聚合酶鏈鎖反應(reverse transcription-PCR；RT-PCR)，評估實施例二之穩定表現細胞株中，hCB2受體全長基因之mRNA的表現。首先，將實施例二之穩定表現細胞株經磷酸鹽緩衝溶液(phosphate buffer solution；PBS)清洗。接著，加入約1 mL之PBS刮下細胞，收集於1.5 mL之微量離心管後，先加入約600 μL之市售RNA萃取試劑(例如TriSolution^TM Reagent；GeneMark,Canada)破壞細胞膜，再加入約200 μL之市售氯仿(chloroform；Sigma,U.S.A)使DNA、蛋白質與RNA分層，而RNA則存在於水層。離心吸取上清液後，先利用約500 μL之異丙醇(isopropanol；Sigma,U.S.A.)於約-80℃沉澱總RNA，再利用約1 mL之100%乙醇、約1 mL之75%焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate；DEPC；Sigma,U.S.A.)處理過之二次去離子水(DEPC-ddH₂ O)所配置之乙醇(DEPC-ethanol)去除總RNA之雜質。之後，離心去除上清液並使殘餘乙醇揮發後，加入約25 μL之DEPC-ddH₂ O回溶總RNA。上述抽取所得之總RNA，經過RNA電泳確認並以波長260 nm與280 nm進行光學密度(optical density；OD)OD₂₆₀ /OD₂₈₀ 之測量(OD₂₆₀ /OD₂₈₀ ＞1.8)後，所得之總RNA進行後續的RT-PCR，檢測總RNA的濃度以及細胞內hCB2受體全長基因之核酸片段的表現。惟上述有關抽取總RNA、測光學密度(optical density；O.D. 260)值等為本技術領域中任何具有通常知識者所熟知，此處不再贅述。

以上述抽取之總RNA為模板(template)，進行反轉錄(RT)反應，以獲得cDNA，其中反轉錄反應之試劑如第3-1表所例示：

將第3-1表之試劑於65℃反應約5分鐘，使RNA二級結構分離(denaturation)後，立即置於冰上約5分鐘。然後，加入第3-2表所例示之試劑，進行反轉錄反應：

第3-2表

在進行反轉錄反應時，其反應條件可例如但不限於以下所例示：首先，在40℃至50℃反應約30分鐘至2小時進行反轉錄反應，再於70℃進行約10分鐘至30分鐘的不活化反應，以不活化反轉錄酶，之後再於4℃保存其cDNA，以完成其反轉錄作用，獲得cDNA。惟在另一實施例中，上述反轉錄反應可於例如40℃至45℃反應約30分鐘至1小時，再於70℃進行約10分鐘至20分鐘的不活化反應。另在又一實施例中，上述反轉錄反應亦可於例如42℃反應約50分鐘，再於70℃進行約15分鐘的不活化反應。

接下來，進行以上述所得之cDNA為模板，利用引子對進行聚合酶鏈鎖反應，以增幅出hCB2受體之核酸片段，其中聚合酶鏈鎖反應之試劑如第4表所例示：

在利用引子對與實施例二之cDNA進行聚合酶鏈鎖反應時，其反應條件可例如但不限於以下所例示：首先，在94℃下進行5分鐘至10分鐘，使雙股模板DNA進行預分離反應。接著，在94℃反應30秒至1分鐘進行分離反應、在50℃至60℃反應30秒至1分鐘進行引子對-模板DNA黏合反應、在72℃進行30秒至2分鐘的DNA延長反應，以此為一個循環，共重複進行30個至40個循環的反應，惟在另一實施例中，上述引子對-模板DNA黏合反應可於例如55℃至60℃反應30秒，再於72℃進行1分鐘至1.5分鐘的延長反應，共重複進行30個循環的反應。

請參閱第4圖，其係根據本發明一實施例之RT-PCR產物的瓊膠體電泳分析圖，其中第1道表示以100鹼基對級進之DNA梯狀標記(DNA ladder，Bertec公司，台北，台灣)，第2道表示未轉染細胞株之RT-PCR產物(細胞控制組)，第3道表示只轉染質體(pcDNA3.1/V5-His)的細胞株之RT-PCR產物(空載體控制組)，而第4道表示轉染重組載體的細胞株之RT-PCR產物。第4圖之上圖表示利用引子對各細胞株增幅出之核酸片段，而第4圖之下圖則表示利用甘油醛-3-磷酸脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase；GAPDH)基因的引子對從各細胞株增幅而得之核酸片段。

由第4圖第2道至第4道之結果可知，各細胞株之GAPDH均呈現一致的mRNA表現量(第4圖之下圖)，如箭頭405之所示。由第4圖第4道之結果可知，利用引子對確實可從實施例二之穩定表現細胞株專一性增幅出hCB2受體全長基因的核酸片段(約1083 bp)，如箭頭401之所示。由第4圖第2道與第3道之結果可知，利用引子對無法由細胞控制組(第2道)或空載體控制組(第3道)中增幅出hCB2受體全長基因的核酸片段(第4圖之上圖)，代表實施例二之穩定表現細胞株確實可於細胞內穩定表現hCB2受體全長基因的mRNA。

4 .2評估穩定表現株內hCB2受體全長基因之重組蛋白的表現

此例示係利用西方墨點法之分析(Western Immunoblot Analysis)，評估實施例二之穩定表現細胞株中，hCB2受體之重組蛋白的表現。首先，將實施例二之穩定表現細胞株經PBS清洗後，加入約200 μL之溶解緩衝溶液(lysis buffer)，在冰上快速刮下細胞後，置於例如1.5 mL之微量離心管內，於4℃震盪60分鐘。再以6秒劇烈震盪細胞液，然後立即在冰上靜置5分鐘。前述之溶解緩衝溶液係參考Roche R.等學者於2006年於Histochemistry and Cell biology第126卷第2期第177-187頁、標題為「Presence of the cannabinoid receptors,CB1 and CB2,in human omental and subcutaneous adipocytes」的文獻中所揭示之配方，其中溶解緩衝溶液可包含50 mM的三羥甲基胺基甲烷(tris(hydroxymethyl)aminomethane；Tris)-HCl(J.T. Baker,U.S.A.)溶液、1 mM的乙烯二胺四乙酸(ethylenediaminetetraacetic acid；EDTA；Merck,Germany)、150 mM NaCl(Showa,Japan)，pH 7.4，且與使用前再添加1%之辛基苯酚聚氧乙基醇(Triton X-100；J.T. Baker,U.S.A.)以及1/100(v/v)之抗蛋白質酶混合液(anti-protease cocktail；Roche,Sweden)。之後，上述細胞液係以10000×g之離心力、於4℃離心約10分鐘。然後，取上清液經蛋白質定量後，進行後續評估。惟上述有關蛋白質定量可利用例如BCA Protein Assay Reagent Kit(Bio-rad lab,U.S.A.)，可參酌製造商提供之使用手冊進行，且蛋白質定量之方法亦為本技術領域中任何具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。

接下來，上述所得之上清液進一步利用聚丙烯醯胺膠體電泳與西方轉漬法，評估hCB2受體之重組蛋白的表現，以下析述之。

將上述所得之上清液，利用10%之硫酸十二酯鈉-聚丙烯醯胺膠體電泳分析(sodium dodecyl sulfate-polyacrylamide gel electrophoresis；SDS-PAGE)，以120伏特進行約2小時。之後，於含有192 mM的甘胺(glycine)(Biotechnology Grade,aMReSCO,U.S.A.)與25 mM的Tris-HCl溶液(J.T. Baker,U.S.A.)之轉漬液(transfer buffer)平衡。上述SDS-PAGE與相關藥品之製備及其相關設備應為本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。

前述SDS-PAGE電泳膠，可接著進行西方轉漬法分析。在此實施例中，利用例如濕式轉漬槽(例如Bio-Rad Scientific Instruments Transfer Unit；Amersham pharmacia biotech,U.S.A.)，以250 mA進行約75分鐘，以將前述SDS-PAGE電泳膠的蛋白質轉印到轉印膜，其中轉印膜例如可為聚偏二氟乙烯轉印膜(polyvinylidene difluoride membrane，PVDF membrane；Immobilon TM-P Transfer Membrane；Millipore,Ireland)。之後，轉印膜可利用1×PBST(1×PBS含有0.05%(v/v)Tween-20(Showa,Japan))清洗約10分鐘，而後再加入Blocking溶液(20 mM Tris-Base,0.1% Sodium azide,1% BSA(Sigma,U.S.A.),125 mM NaCl,0.2% Tween-20(Showa,Japan)，pH 7.4)，於4℃震盪約1小時。

之後，去除Blocking溶液，加入一級抗體(抗體：1×PBST=1：3500稀釋)與轉印膜反應，於4℃反應至隔夜(約14小時至16小時)。然後，以1×PBST清洗轉印膜6次、每次10分鐘後，加入二級抗體與轉印膜反應(抗體：Blocking溶液=1：15000稀釋)，於4℃震盪約50分鐘。而後，以1×PBST清洗轉印膜6次，每次10分鐘。隨後，避光加入冷光呈色劑，例如增強型化學冷光(Enhanced ChemiLuminescence；ECL)Plus西方轉漬偵測試劑(Western blotting detection reagent；GE Healthcare,UK)，反應約1分鐘，利用底片(例如Kodak,U.S.A.)顯影與定影後判讀呈色反應結果，其結果如第4圖所示。以上西方轉漬法係以β-肌動蛋白(β-actin)作為管家基因(house keeping gene)。

前述使用的一級抗體例如可為兔抗CB2受體之親和純化多株抗體(rabbit anti-CB2 affinity purified polyclonal antibody；Abcam,U.S.A.)，以及小鼠抗β-肌動蛋白之單株抗體(Chemicon,U.S.A.)。前述使用的二級抗體例如可為結合山葵過氧化酶的山羊抗兔IgG(goat anti-rabbit IgG-HRP；Zymed,U.S.A.)，以及結合山葵過氧化酶的山羊抗小鼠IgG(goat anti-mouse IgG-HRP；Chemicon,U.S.A.)。惟上述有關利用冷光呈色、底片顯影與定影等，可參酌製造商提供之使用手冊進行，且為本技術領域中任何具有通常知識者所熟知，在此不另贅述。

請參閱第5圖，其係顯示根據本發明一實施例之穩定表現細胞株之hCB2受體之重組蛋白的表現的西方轉漬法分析結果，其中第1道代表細胞控制組，第2道代表空載體控制組，而第3道代表穩定表現細胞株。第5圖之上圖係分析穩定表現細胞株之hCB2受體之重組蛋白(約46 kDa)的表現。第5圖之下圖表示β-肌動蛋白(約46 kDa)的表現，以作為內部控制組(internal control)。第5圖之左側則標示蛋白質標記的相對位置。

由第5圖之結果可知，各細胞株之β-肌動蛋白均呈現一致的蛋白質表現量(第5圖之下圖)，如箭頭507之所示。由第5圖第3道之結果可知，專一性抗體確實可偵測出hCB2受體的重組蛋白(約46 kDa)，如箭頭501之所示。由第5圖第1道與第2道之結果可知，專一性抗體並未偵測到細胞控制組(第1道)或空載體控制組(第2道)有hCB2受體蛋白(第5圖之上圖)，代表實施例二之穩定表現細胞株確實可於細胞內穩定表現hCB2受體的重組蛋白。

4.3評估hCB2受體之重組蛋白於穩定表現株之分布

此例示係利用共軛聚焦(confocal)顯微鏡進行免疫螢光鏡檢，評估hCB2受體之重組蛋白於穩定表現株之細胞膜上之分布。首先，將實施例二之穩定表現細胞株培養於經1%明膠(gelatin type B；Sigma,U.S.A.)處理過之蓋玻片上，以100%甲醇(Merck,Germany)固定細胞後，加入前述之一級抗體(兔抗CB2受體之親和純化多株抗體；Abcam,U.S.A.)與帶有螢光染劑之二級抗體(例如結合Alexa fluro® 488的山羊抗兔IgG；Molecular Probe,Invitrogen,U.S.A.)與細胞反應後，再利用60%之甘油封片。然後，利用可激發螢光之共軛聚焦顯微鏡(例如CARV II Confocal Imager，BD Bioscience，San Jose,CA.,U.S.A.)，搭配油鏡(例如HCX PL APO 63X/1.32-0.6,BD,U.S.A.)，以二級抗體之螢光染劑適用的光源(例如利用波長約495nm之光源)激發螢光，觀察在細胞表面與抗體結合之情形。

請參閱第6A圖至第6D圖，其係顯示根據本發明一實施例之穩定表現細胞株之共軛聚焦免疫螢光染色(confocal immunofluorescence staining)照片，其中第6A圖與第6B圖為實施例二之穩定表現細胞株，第6C圖與第6D圖則為空載體控制組之HEK293細胞株，第6B圖與第6D圖為共軛聚焦免疫螢光鏡檢照片，而第6A圖與第6C圖則分別為第6B圖與第6D圖對應的光學鏡檢照片。對照第6D圖之空載體控制組的細胞株(沒有呈現螢光)可知，實施例二之穩定表現細胞株經免疫螢光染色後，明顯可於其細胞膜上觀察到螢光的分 布，表示hCB2受體之重組蛋白確實分布於實施例二之穩定表現細胞株的細胞膜上，如第6B圖所示。

實施例三：評估穩定表現細胞株之hCB2受體重組蛋白的活性

此實施例係藉由測定CB2受體之下游訊息傳遞路徑所涉及之目標蛋白之產物含量的變化，評估穩定表現細胞株之hCB2受體重組蛋白的活性。

1.評估配位體抑制之cAMP累積量

在此實施例中，將固定濃度之錦紫蘇萃取物(forskolin)與不同濃度之類大麻素衍生物，共同加入實施例二之穩定表現細胞株。前述之錦紫蘇萃取物可刺激細胞內腺苷酸環化酶(AC)的活性，並增加細胞內環單磷酸腺苷(cAMP)的累積量。而類大麻素衍生物則可結合至CB2受體，使CB2受體與抑制型G蛋白(Gi)偶合，進而抑制腺苷酸環化酶的活性，抑制cAMP的累積量。藉由偵測細胞內cAMP累積量的消長，可分析實施例二之穩定表現細胞株的CB2受體與配位體專一性結合能力。

首先，將實施例二之穩定表現細胞株，以約5×10⁵ /ml之細胞密度培養於12孔培養盤中，於37℃、5%CO₂ 培養箱中培養16小時至18小時，其中培養液含有600μg/mL之G418。待細胞達約7至8分滿，先更換成不含血清之培養液，其中此培養液另含有約100μM之3-異丁基-1-甲基黃嘌呤(3-isobutyl-1-methylxanthine；IBMX)，於37℃反應約30分鐘，以抑制內源性磷酸二脂酶(endogeneous phosphodiesterase)的活性。去除上清液後，將10 μM錦紫蘇萃取物(forskolin；Sigma,U.S.A.)與不同濃度之類大麻素衍生物，以評估CB2受體與配位體專一性結合能力。上述之類大麻素衍生物例如可為0、10⁵ 、10⁶ 、10⁷ 、10⁸ 、10⁹ μM之CP55940(hCB2受體之配位體衍生物之一；(─)-CP55940，5-(1,1-dimethylheptyl)-2-[(1R,2R,5R)-5-hydroxy-2-(3-hydroxypropyl)cyclohexyl]-phenol；Cayman Chemical,U.S.A.)溶液，其中CP55940為CB2受體之激活劑(agonist)，對於CB2受體的專一性親合力相當高，其CB1/CB2之相對親合力為零或僅有邊際選擇性(marginal selectivity)。將錦紫蘇萃取物(forskolin)與CP55940二者共同加入實施例二之穩定表現細胞株中，於37℃反應約30分鐘。

然後，利用300 μL之0.1 M HCl溶液，於室溫(例如約15℃至35℃)反應約10分鐘，終止上述反應。然後，以1000×g之離心力、於4℃離心約10分鐘，收取其上清液。之後，利用市售cAMP酵素免疫分析套組，例如Assay Designs^TM Direct Cyclic AMP Enzyme Immunoassay(EIA)(現併入EnzoLife Science,U.S.A.)，以套組所含的結合藍色呈色物質之cAMP(blue conjugate cAMP)，與細胞內累積之cAMP，二者進行競爭結合測定，以分析上清液中所含之cAMP累積量。

申言之，當待測液之cAMP濃度越高時，代表結合藍色染劑之cAMP所能競爭到的受體結合位置越少，因此經由呈色反應後，其於波長405 nm所測得之吸光值就越低。然而，當CP55940濃度越高，CB2受體與配位體結合活化後會產生負向調控，進而抑制cAMP在細胞內的累積，使得cAMP濃度越低，代表結合藍色染劑之cAMP所能競爭到的受體結合位置越多，因此經由呈色反應後，其於波長405nm所測得之吸光值就越高。

請參閱第7圖，其係根據本發明一實施例之穩定表現細胞株受配位體刺激而抑制細胞內cAMP含量之曲線圖，其中縱軸表示錦紫蘇萃取物(forskolin)刺激之cAMP累積量(pmole/mL)，橫軸則為不同Log濃度(M)之CP55940。由第7圖之結果可知，當CP55940濃度越高時，越能抑制由錦紫蘇萃取物(forskolin)刺激產生cAMP的累積量，代表實施例二之穩定表現細胞株表現的hCB2受體重組蛋白，確實具有與配位體專一性結合能力。

2.評估配位體刺激活化態之MAPK含量

在此實施例中，將類大麻素衍生物加入實施例二之穩定表現細胞株，藉由偵測細胞內活化態(phosphorylated)的細胞內絲裂原活化蛋白激酶(MAPK)的消長，可分析實施例二之穩定表現細胞株的CB2受體與配位體專一性結合能力。

首先，將實施例二之穩定表現細胞株，以約5×10⁵ /ml之細胞密度培養於直徑約6公分之培養皿中，於37℃、5%CO₂ 培養箱中培養16小時至18小時，其中培養液含有600μg/mL之G418。待細胞達約5至6分滿，加入100nM之CP55940分別處理0、1、2、3、4小時後，經1×PBS清洗2次後，加入約100μL之溶解緩衝溶液(例如Gold lysis buffer)，在冰上快速刮下細胞後，置於例如1.5mL之微量離心管內，於4℃震盪30分鐘。再以10000×g之離心力、於4℃離心約10分鐘。然後，取上清液經蛋白質定量後，進行如實施例二4.2西方轉漬法。

請參閱第8圖，其係顯示根據本發明一實施例之穩定表現細胞株之活化態(phosphorylated)MAPK含量的西方轉漬法分析結果，其中左上圖與左下圖顯示空載體控制組，而右上圖與右下圖顯示穩定表現細胞株。左上圖與右上圖係顯示穩定表現細胞株之活化態(phosphorylated)MAPK的表現，如箭頭711之所示。左下圖與右下圖則顯示總胞外調節激酶(total extracellular signal-regulated kinase；total ERK)的表現，以作為內部控制組(internal control)。第8圖之左側則標示蛋白質標記的相對位置。

由第8圖之左下圖與右下圖的結果可知，各細胞株之總胞外調節激酶均呈現一致的蛋白質表現量。由第8圖之左上圖與右上圖可知，專一性抗體可偵測出活化態MAPK的表現，且隨著CP55940處理時間的增加，實施例二之穩定表現細胞株的活化態MAPK的含量亦隨之增加，其含量如含量變化711a之趨勢所示，代表實施例二之穩定表現細胞株表現的hCB2受體重組蛋白，確實具有與配位體專一性結合能力。

此外，需補充的是，本發明雖以特定的引子對、hCB2受體基因、載體、宿主細胞、細胞株、轉染方式、螢光染劑及其分析法為例示，以獲得上述穩定表現hCB2受體重組蛋白之細胞株並以此篩選潛在配位體的方法，惟本發明並不限於此。本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，亦可使用其他引子對、hCB2受體基因、載體、宿主細胞、細胞株、轉染方式、螢光染劑及其他分析法，以獲得上述穩定表現hCB2受體重組蛋白之細胞株並以此篩選潛在配位體的方法。

由上述本發明數個實施例可知，本發明之穩定表現類大麻素受體CB2之細胞株及其應用於篩選類大麻素受體之潛在配位體的方法，其優點在於利用含有CB2受體全長基因之重組質體，轉染至細胞株並於細胞膜表面穩定表現出CB2受體重組蛋白，並將上述細胞株培養於含或未含樣品溶液之培養液中，然後分析目標物含量變化，以判斷此樣品溶液是否含有與CB2受體重組蛋白專一性結合之潛在配位體，藉此從大量樣品中快速、安全且正確篩選出類大麻素受體之潛在配位體。

雖然本發明已以實施方式揭露如上，然其並非用以限定本發明，在本發明所屬技術領域中任何具有通常知識者，在不脫離本發明之精神和範圍內，當可作各種之更動與潤飾，因此本發明之保護範圍當視後附之申請專利範圍所界定者為準。

<110>　國立屏東科技大學

<120>　穩定表現類大麻素受體CB2之細胞株及其應用

<130>　無

<160>　4

<210>　1

<211>　367

<212>　PRT

<213>　人(Homo sapiens )類大麻素受體CB2(巨噬細胞)

<400>　1

<210>　2

<211>　1083

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　2

<210>　3

<211>　21

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　3

<210>　4

<211>　24

<212>　DNA

<213>　人工序列

<400>　4

101‧‧‧細胞膜

103‧‧‧細胞外

105‧‧‧細胞內

201/301/303/401/405/501/507/711‧‧‧箭頭

711a‧‧‧含量變化

為讓本發明之上述和其他目的、特徵、優點與實施例能更明顯易懂，所附圖式之說明如下：

第1圖為根據本發明一實施例之受類大麻素衍生物(或潛在配位體)刺激的CB2受體涉及之部分訊號傳遞途徑的示意圖。

第2圖為根據本發明一實施例之hCB2受體之核酸片段的瓊膠體電泳分析圖。

第3圖為根據本發明一實施例之重組質體經限制酶作用的瓊膠體電泳分析圖。

第4圖為根據本發明一實施例之RT-PCR產物的瓊膠體電泳分析圖。

第5圖為顯示根據本發明一實施例之穩定表現細胞株之hCB2受體之重組蛋白的表現的西方轉漬法分析結果。

第6A圖至第6D圖為顯示根據本發明一實施例之穩定表現細胞株之共軛聚焦免疫螢光染色照片。

第7圖為根據本發明一實施例之穩定表現細胞株受配位體刺激而抑制細胞內cAMP含量之曲線圖。

第8圖為顯示根據本發明一實施例之穩定表現細胞株之活化態(phosphorylated)MAPK含量的西方轉漬法分析結果。

501/507．．．箭頭

Claims (2)

1. 一種穩定表現類大麻素受體之細胞株，其中該細胞株具有一重組質體，且該重組質體具有如序列辨識編號2所示序列之核酸序列，藉以於該細胞株之一細胞膜上表現如序列辨識編號1所示序列之類大麻素受體2(cannabinoid receptor 2；CB2)重組蛋白，且該細胞株是源自於人類胚胎腎臟上皮細胞株HEK293。
2. 一種篩選類大麻素受體之潛在配位體的方法，至少包含：進行一培養步驟，將一細胞株培養於含或未含一樣品溶液之一培養液中，於37℃、5%二氧化碳下培養1小時至20小時，其中該培養液包含10μM之錦紫蘇萃取物(forskolin)，該細胞株包括如申請專利範圍第1項的細胞株，且該細胞株之一細胞膜上係表現如序列辨識編號1所示序列之類大麻素受體2(CB2)重組蛋白；進行一檢測步驟，以利用一呈色反應且不破壞該細胞株之情況下，檢測經由含該樣品溶液培養之該細胞株之該細胞膜上環單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate；cAMP)之一第一含量，並檢測經由未含該樣品溶液培養之該細胞株之該cAMP之一第二含量，其中該目標物為環單磷酸腺苷(cyclic adenosine monophosphate；cAMP)；進行一比較步驟，以獲得該第一含量與該第二含量之一差值；以及進行一分析步驟，以根據該差值判斷該樣品溶液是否 含有與該CB2受體重組蛋白專一性結合之一潛在配位體(potential ligand)，其中當該差值不為零時，則判斷該樣品溶液含有該潛在配位體。