KR101052621B1 - 세로토닌 ６ 수용체 리간드의 고효율 검색을 위한 ｈａ－５－ｈｔ６ｒ을 안정적으로 발현하는 세포주 - Google Patents

세로토닌 ６ 수용체 리간드의 고효율 검색을 위한 ｈａ－５－ｈｔ６ｒ을 안정적으로 발현하는 세포주 Download PDF

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Abstract

본 발명은 세로토닌 6 수용체 리간드의 고효율 검색방법에 관한 것으로, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 이용한 세로토닌 6 수용체 리간드의 고효율 검색방법에 관한 것이다. 본 발명의 세포주는 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현함으로써, 5-HT6R에 선택적으로 작용하는 리간드의 검색 효율을 증가시키며, 5-HT6R과 결합하는 단백질 연구에 유용하게 이용될 수 있다. 이에, 5-HT6R이 관련된 우울증과 알츠하이머 등의 뇌질환 및 정신질환 예방과 진단 및 치료제 개발에 유용할 것이다.
세로토닌 6 수용체, HA, 리간드, 우울증, 알츠하이머

Description

세로토닌 ６ 수용체 리간드의 고효율 검색을 위한 ＨＡ－５－ＨＴ６Ｒ을 안정적으로 발현하는 세포주{Cell line which is stably expressing the HA-5-HT6R, for HTS of 5-HT6R's ligands}
본 발명은 세로토닌 6 수용체(5-HT6R) 리간드의 고효율 검색 방법에 관한 것이다.
세로토닌 수용체(5-HTR)는 5-HT1R부터 5-HT7R까지 각각의 아형을 포함하여 현재까지 총 15 종이 알려져 있고, 우울증, 정신 분열증, 불안증(anxiety), 수면장애 등의 정신질환 및 알츠하이머 질환 등에 관련되어 있는 것으로 알려져 있다(Martin, Neuropharm., 36(4/5):637-647, 1997). 5-HT1R을 과발현시킨 쥐는 스트레스 상황에서 항우울제를 복용한 것처럼 활동적으로 행동한다는 연구 결과가 있다 (Heisler et al., PNAS 95:15049-15054, 1998). 또한, 5-HT1R과 결합하여 우울증 유발에 핵심적인 역할을 하는 p11 단백질이 우울증과 관련된 뇌의 신경전달물질인 5-HT에 대한 세포의 반응을 조절한다는 사실이 밝혀졌다(Svenningsson et al., Science, 311:77-80, 2006).
5-HT6R은 가장 최근에 염기서열이 밝혀진 5-HTR로서 아직까지 정확한 기전이 밝혀지지 않았으나, 퇴행성 뇌질환과 정신질환 등에 관련되어 있다고 알려져 있다. 최근, 5-HT6R의 자극이 생화학적, 행동학적인 측면에서 항우울증제와 같은 효과를 보인다는 연구가 보고되었고, 또한 뇌 발생(brain development), 기억 & 학습(learning and memory) 및 치매(Alzheimer disease)에 이르기까지 뇌에서 발생할 수 있는 많은 중요한 질병과 밀접하게 연관되어져 있다는 연구보고가 점차적으로 늘고 있다(Grimaldi B et al., Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 357(4):393-400, 1999; Garcia-Alloza M et al., Neuropsychopharmacology 29(2):410-416, 2004; Lorke D et al., BMC Neurosci. 27;7-36, 2006; Greengard et al., J Neurosci. 27(15):4201-4209, 2007). 5-HTR을 작용점으로 하는 약물로는 모든 5-HTR에 비선택적으로 결합하는 클로자핀(clozapine)이 알려져 있고, 5-HT6R에 선택적인 약물로는 SB258585가 있으나, 아직까지 질환의 치료제로 사용되지 않고 있다. 우울증이나 알츠하이머 질환 등과 관련하여, 뇌세포에서 5-HT6R의 정확한 기능 및 5-HT6R이 관여된 신호 전달 기전이 거의 알려지지 않은 상황에서, 그 기능 및 기전 연구와 선택적 리간드 개발을 위해서는 5-HT6R을 선택적으로 연구할 수 있는 시스템이 요구된다.
이에, 본 발명자들은 HA(Hemagglutinin)가 N-말단에 연결된 5-HT6R을 발현하는 세포주를 제작하고, 상기 HA-5-HT6R가 세포 표면 밖에 노출되어 있고, 상기 HA-5-HT6R이 안정적으로 발현되며, 상기 5-HT6R의 활성이 유지되므로, 상기 세포주가 5-HT6R에 선택적인 리간드 개발을 위한 고효율 검색에 활용될 수 있음을 확인함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포주를 이용한 5-HT6R 리간드의 고효율 검색방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 상기 세포주를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색용 조성물을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위하여, 본 발명은 N-말단에 HA(Hemagglutinin)가 연결된 5-HT6R 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터가 숙주세포에 형질도입되어 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 처리된 세포주의 5-HT6R 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 미처리된 세포주와 비교하여, 상기 세포주에서 5-HT6R 활성을 증가 또는 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색방법 을 제공한다.
또한, 본 발명은 1) 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 처리된 세포주의 단백질을 정제하는 단계;
3) 상기 정제된 단백질의 5-HT6R 활성을 측정하는 단계; 및,
4) 미처리된 세포주와 비교하여, 상기 세포주에서 5-HT6R 활성을 증가 또는 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색방법을 제공한다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색용 조성물을 제공한다.
이하, 본 발명에서 사용한 용어를 정의한다.
용어 "5-HT6R 리간드"는 5-HT6R에 결합하여 활성을 조절하는 물질을 의미한다.
이하, 본 발명을 상세히 설명한다.
본 발명은 N-말단에 HA(Hemagglutinin)가 연결된 5-HT6R 유전자 컨스트럭트 를 포함하는 벡터가 숙주세포에 형질도입되어 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, HA 유전자와 인간 융모막암종 세포주로부터 수득한 5-HT6R 유전자가 연결된 HA-5-HT6R 컨스트럭트를 포함하는 벡터(도 1 참조)를 인간 신장 배아세포주(human embryonic kidney cell line; HEK293 세포주)에 형질도입하였다. HA-5-HT6R 유전자를 특이적으로 발현하는 세포주를 PCR 방법으로 스크리닝 한 후(도 2a 참조), 상기 선별된 형질전환 세포주를 1 내지 6세대까지 배양하였다. 각 세대별 HA-5-HT6R 유전자가 특이적으로 발현하는 지 PCR 방법으로 검증하였다(도 2b 참조). 이로써, 본 발명의 세포주는 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 것이 확인되었으며, 상기 검증된 세포주를 서울대 의대 세포주 은행에 2008년 09월 12일자로 기탁하였다(기탁번호: KCLRF-BP-00187).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에 세로토닌(5-HT)을 시간별로 처리한 후, ERK의 인산화가 증가한 것을 확인함으로써(도 3a 참조), 상기 형질전환 세포주가 발현한 HA-5-HT6R이 세포내에서 정상적인 기능을 나타냄을 확인하였다. 또한, 상기 형질전환 세포주에서 5-HT와 EMD386088 자극에 의해 ERK의 인산화가 증가하였으며, SB258585에 의해 그 효과가 감소하는 것을 확인하였다(도 3b 참조). 또한, HA-5-HT6R을 안정적으로 발 현하는 세포주의 세포내 칼슘 유입을 5-HT6R을 발현하는 세포주와 비교함으로써, HA-연결이 5-HT6R의 기능을 바꾸지 않은 것과(도 5a 및 도 5b 참조), 상기 활성이 5-HT 농도 의존적임을 확인하였다(도 5c 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, HA에 특이적인 항체 및 대한민국 공개 특허 제 2008-0004994호에서 5-HT6R의 결합 단백질인 것이 확인된 Fyn에 특이적인 항체를 이용하여, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에서 세포막 내부에 위치하는 5-HT6R의 N-말단에 연결된 HA가 세포 표면 밖에 위치하여(도 4a 참조), HA-5-HT6R이 세포막에서 관찰되는 것을 확인하였다(도 4b 및 도 4c 참조).
아울러, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주와 HA-5-HT6R을 일시적으로 발현하는 세포주의 세포 내 칼슘 유입을 비교한 결과, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주가 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현함으로써, 일시적으로 발현하는 세포주보다 실험의 재현성이 우수한 것을 확인하였다(도 6 참조).
본 발명의 세포주는 기탁번호 KCLRF-BP-00187로 기탁 된 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주인 것을 특징으로 한다.
상기 HA는 세포주에서 5-HT6R과 연결된 형태로 발현하여 세포 표면 밖에 위 치하는 것을 특징으로 하며, 상기 HA를 이용하여 세표 표면에 발현한 5-HT6R을 선택적으로 확인할 수 있다.
상기 형질도입은 리포펙타민(Lipofectamine), Dojindo사의 Hilymax, Fugene, jetPEI, Effectene 및 DreamFect으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나의 상용화된 형질도입용 시약; 칼슘-인산(calcium-phosphate), 양전하성 고분자, 리포좀, 나노입자, 뉴클레오펙션(nucleofection), 전기천공법(electroporation), 열충격(heat shock), 마그네토펙션(magnetofection)을 이용하는 방법; 및, 레트로 바이러스를 이용하는 방법으로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나를 이용하여 수행될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 처리된 세포주의 5-HT6R 활성을 측정하는 단계; 및,
3) 미처리된 세포주와 비교하여, 상기 세포주에서 5-HT6R 활성을 증가 또는 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에서 세포막 내부에 위치하는 5-HT6R의 N-말단에 연결된 HA가 세포 표면 밖에 위치하여(도 4a 참조), HA-5-HT6R이 세포막에서 관찰되는 것을 확인하였다(도 4b 및 도 4c 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 키메라 Gα15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터와 리포펙타민으로 형질 감염시킨 후, 5-HT으로 자극한 결과, 5-HT6R을 발현하는 세포주의 세포내 칼슘 유입과 비교하여 HA-연결이 5-HT6R의 기능을 바꾸지 않은 것을 확인하였고(도 5a 및 도 5b 참조), 또한 상기 활성이 5-HT 농도 의존적임을 확인하였다(도 5c 참조).
아울러, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주와 HA-5-HT6R을 일시적으로 발현하는 세포주의 세포 내 칼슘 유입을 비교한 결과, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주가 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현함으로써, 일시적으로 발현하는 세포주보다 실험의 재현성이 우수한 것을 확인하였다(도 6 참조).
이에, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주는 세포 표면 밖에 위치하는 HA(HA)를 이용하여 세포 표면에 발현한 5-HT6R을 선택적으로 확인할 수 있으므로, 5-HT6R 리간드의 고효율 검색에 유용하게 이용될 수 있다.
단계 1)의 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아의 대사산물 및 진균의 대사산물인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
단계 2)의 5-HT6R 활성의 측정은 이에 제한되는 것은 아니나, 5-HT6R에 의한 세포내 칼슘 농도 유입을 측정하는 방법에 의해 수행될 수 있고, 이때 세포내 칼슘 농도 유입이 측정될 대상 세포주는 피검화합물 처리 전에 키메라 Gα15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터와 리포펙타민으로 형질 감염될 수 있다.
또한, 본 발명은 1) 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
2) 상기 처리된 세포주의 단백질을 정제하는 단계;
3) 상기 정제된 단백질의 5-HT6R 활성을 측정하는 단계; 및,
4) 미처리된 세포주와 비교하여, 상기 세포주에서 5-HT6R 활성을 증가 또는 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색방법을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 5-HT, EMD386088 및 SB258585로 자극한 결과, 상기 형질전환 세포주가 발현한 HA-5-HT6R이 세포내에서 정상적인 기능을 나타냄을 확인하였다(도 3a 및 도 3b 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에서 세포막 내부에 위치하는 5-HT6R의 N-말단에 연결된 HA가 세포 표면 밖에 위치하여(도 4a 참조), HA-5-HT6R이 세포막에서 관찰되는 것을 확인하였다(도 4b 및 도 4c 참조).
이에, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주는 세포 표면 밖에 위치하는 HA(HA)를 이용하여 세포 표면에 발현한 5-HT6R을 선택적으로 확인할 수 있으므로, 5-HT6R 리간드의 고효율 검색에 유용하게 이용될 수 있다.
단계 1)의 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아의 대사산물 및 진균의 대사산물인 것이 바람직하나 이에 한정되는 것은 아니다.
단계 2)의 5-HT6R 활성의 측정은 이에 제한되는 것은 아니나, 상기 5-HT6R에 의해 인산화된 ERK를 측정하는 방법에 의해 수행될 수 있다.
아울러, 본 발명은 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색용 조성물을 제공한다.
본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하 는 세포주에서 세포막 내부에 위치하는 5-HT6R의 N-말단에 연결된 HA가 세포 표면 밖에 위치하여(도 4a 참조), HA-5-HT6R이 세포막에서 관찰되는 것을 확인하였다(도 4b 및 도 4c 참조).
또한, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 Gα15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터와 리포펙타민으로 형질 감염시킨 후, 5-HT으로 자극한 결과 5-HT6R을 발현하는 세포주의 세포내 칼슘 유입과 비교하여 HA-연결이 5-HT6R의 기능을 바꾸지 않은 것을 확인하였고(도 5a 및 도 5b 참조), 또한 상기 활성이 5-HT 농도 의존적임을 확인하였다(도 5c 참조).
아울러, 본 발명의 구체적인 실시예에서, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주와 HA-5-HT6R을 일시적으로 발현하는 세포주의 세포 내 칼슘 유입을 비교한 결과, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주가 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현함으로써, 일시적으로 발현하는 세포주보다 실험의 재현성이 우수한 것을 확인하였다(도 6 참조).
이에, 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주는 세포 표면 밖에 위치하는 HA(HA)를 이용하여 세포 표면에 발현한 5-HT6R을 선택적으로 확인할 수 있으므로, 5-HT6R 리간드의 고효율 검색용 조성물로 이용될 수 있다.
본 발명의 세포주는 기탁번호 KCLRF-BP-00187로 기탁 된 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주인 것을 특징으로 한다.
상기 조성물은 추가로 Gα15 유전자, 리포펙타민, 형광성 칼슘 표지물 및 세척 완충용액을 추가로 포함할 수 있으며, 상기 형광성 칼슘 표지물에는 칼슘 농도에 민감한 플루오-4/AM과 플루로닉 F-127 등이 사용될 수 있다.
본 발명의 세포주는 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현함으로써, 5-HT6R에 선택적으로 작용하는 리간드의 검색 효율을 증가시키며, 5-HT6R과 결합하는 단백질 연구에 유용하게 이용될 수 있다. 이에, 5-HT6R이 관련된 우울증과 알츠하이머 등의 뇌질환 및 정신질환 예방과 진단 및 치료제 개발에 유용할 것이다.
이하, 본 발명을 실시예에 의해 상세히 설명한다.
단, 하기 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 실시예에 의해 한정되는 것은 아니다.
<실시예 1> 형질전환 세포주 제작
<1-1> 야생형 세포주 배양
HEK293 세포주(ATCC CRL 1573)를 10% 태아 소 혈청 및 1% 페니실린/스트렙토마이신(v/v)이 포함된 DMEM(Dulbecco's modified Eagle's medium) 배지에서 37℃, 5% CO2의 가습 조건에서 배양하였다. 상기 배양액은 3-4일에 한 번씩 교환하였고, 세포는 매 주일마다 아배양(sub-culture)하였다. 상기 HEK293 세포주를 10 ㎝ 배양 접시에 5.0 × 106 정도로 도포하여 37℃, 5% CO2의 가습 조건에서 12시간 동안 배양하였다.
<1-2> HA-5-HT 6 R 세포주 제작
HA-5-HT6R-pcDNA3.1(+) 플라스미드(도 1; Missouri S&T cDNA Resource Center, USA)를 BglII 제한효소로 처리하여 선형화한 후, Lipofectamine 2000(Invitrogen, USA)과 1:3의 비율(선형화 HA-5-HT6R-pcDNA3.1(+) 12 ㎍, Lipofectamine 36 ㎕)로 Opti-MEM(Invitrogen, USA) 배지에 넣어 5분 동안 혼합하였고, 30분 후 배양 접시에 상기 혼합액을 넣어 세포주를 형질 감염시켰다. 6시간 후에 배지를 DMEM 배지로 교환하였고, 추가로 24시간 동안 세포를 배양한 후 800 ㎍/㎖의 G418(Invitrogen, USA)을 첨가하여 형질전환된 세포를 선별하였다. 14일간 선택배양한 후 콜로니를 형성한 세포군을 각각 24 웰 플레이트에서 아배양(subculture)하여 성장 시키고 가장 빠른 성장을 보인 세포군을 선별한 결과, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주를 수득하였다. 안정적인 세포주를 얻은 후 점차적으로 G418 농도를 낮춰 400 ㎍/㎖ 첨가된 배지에서 배양하였다.
<1-3> 5-HT 6 R 세포주 제작
5-HT6R-pcDNA3.1(+) 플라스미드(Missouri S&T cDNA Resource Center, USA)를 이용하여, 실시예 1-2의 방법으로 형질전환된 세포주를 수득하였다.
<실시예 2> 형질전환 세포주 확인
<2-1> 형질전환 세포주 선별
실시예 1-2에서 수득한 형질전환 세포주 콜로니 별로 DMEM 배지에서 37℃, 5% CO2 세포배양기에서 배양한 후, 트리졸 시약을 사용하여 RNA를 분리하였다. AMV 역전사 효소를 이용하여 cDNA를 만들고, 서열번호 1로 기재되는 정방향 프라이머(5'-CCACTCTTCATGCGGGACTTC-3) 및 서열번호 2로 기재되는 역방향 프라이머(5'-TCAGTTCGTGGGGATGCCAAG-3')를 사용하여 HA-5-HT6R 유전자를 증폭하였다. 대조군으로는 서열번호 3으로 기재되는 정방향 프라이머(5'-GTCACCAACTGGGACGACATG-3') 및 서열번호 4로 기재되는 역방향 프라이머(5'-GCCGTCAGGCAGCTCGTAGC-3')를 사용하여 β-액틴 유전자를 증폭하였다. PCR 조건은 95℃에서 4분 동안 예비변성시킨 후, 95℃에서 1분, 60℃에서 30초, 72℃에서 30초 동안 30회 반복 수행하고 마지막으로 72℃에서 10분간 반응시킨 후, 4℃로 식혀주었다.
그 결과, 도 2a에서 나타난 바와 같이 HA-5-HT6R 유전자(363 bp)를 특이적으 로 증폭하는 세포주(레인 1)를 수득하였다.
<2-2> HA-5-HT 6 R을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주 검정
실시예 2-1에서 수득한 형질전환 세포주를 실시예 2-1의 방법으로 배양한 후, 배양액은 3-4일에 한 번씩 교환하였고, 세포는 매 주일마다 아배양하여 총 42일 동안 1 내지 6 세대를 수득하였고, 사용 전까지 -70℃에 보관하였다. 대조군으로는, 야생형 세포주의 1 내지 6 세대를 이용하였다.
상기 방법으로 수득한 세포주로부터, 실시예 2-1과 동일한 방법으로 RNA를 수득, cDNA 형성, 및 HA-5-HT6R 유전자를 증폭하였다. 대조군으로 β-액틴 유전자를 증폭하였다.
그 결과, 도 2b에서 나타난 바와 같이 P1에서 P6까지 HA-5-HT6R 유전자를 특이적으로 증폭하는 것을 확인하였다. 이에, 상기 검증된 세포주를 서울대 의대 세포주 은행에 2008년 09월 12일자로 기탁하였다(기탁번호: KCLRF-BP-00187).
<2-3> HA-5-HT 6 R을 일시적으로 발현하는 형질전환 세포주 제작
HA-5-HT6R-pcDNA3.1(+) 플라스미드를 Lipofectamine 2000과 1:3의 비율로 Opti-MEM 배지에 넣어 5분 동안 혼합하였고, 30분 후 배양 접시에 상기 혼합액을 넣어 세포주를 형질 감염시켰다. 6시간 후에 배지를 DMEM 배지로 교환하였고, 추 가로 24시간 동안 세포를 배양하여 HA-5-HT6R을 일시적으로 발현하는 형실전환 세포주를 제작하였다.
<실시예 3> HA-5-HT 6 R의 세포신호전달 과정 분석
<3-1> 5-HT 6 R의 활성제인 세로토닌(5-HT)에 대한 반응성 확인
<3-1-1> 세로토닌(5-HT) 처리
무혈청 DMEM 배지가 포함된 6-웰 배양 접시에, 실시예 2의 방법으로 선별한, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주를 1 × 106 세포/웰로 분주한 후, 37℃, 5% CO2의 가습 조건에서 배양하였다. 3시간 후, 20 μM 5-HT(Sigma, USA)를 0 ~ 60분 동안 정해진 간격(0, 1, 5, 15, 30 및 60분)으로 처리하였다.
<3-1-2> 웨스턴 블랏
5-HT 처리 시간별로 시료를 모아, 상기 세포를 -20℃에 보관하였다가 단백질 분해효소 억제제(protease inhibitor, Complete Mini, Roche Diagnostics GmbH, Germany)를 포함한 차가운 RIPA 용해 완충용액(upstate biotechnology, USA)과 함께 균질기에서 분쇄하여 균질화 시켰다. 균질화 된 시료를 13,000 rpm으로 10분간 원심분리한 뒤 상등액과 불용성 응집체를 분리하였다. 분리된 상등액의 단백질 농도는 바이오-라드 단백질 분석 키트(Bio-Rad protein assay kit, Bio-Rad, USA)를 이용하여 측정하였다. 또한, 상등액을 5×SDS(0.156M Tris-HCl, pH 6.8, 2.5% SDS, 37.5% 글리세롤, 37.5 mM DTT)와 1:4로 섞어 100℃에서 10분간 끓였다. 끓인 시료를 10% SDS-PAGE겔의 웰에 로딩하고 125 V에서 2시간 동안 전기영동 하여 분자량에 따라 분리하였고, 상기 단백질을 20V, 400A이하의 조건으로 1시간 동안 전기영동 하여 PVDF 막으로 옮겼다. 단백질이 옮겨진 막을 12시간 동안 5%의 탈지 우유로 차단하고, 1차 항체(항-ERK/p-ERK 항체; Cell signaling, USA)로 4시간 처리한 후, TBST(Tris Buffered Saline + 0.1% tween)로 10분간 3회 씻어주고, 2차 항체(항토끼-IgG-HRP; Amersham Bioscience, UK)를 1시간 동안 처리하였다. 다시 TBST로 10분간 4회 씻어준 후, ECL 검출 키트(Amersham Biosciences, UK)로 발광반응을 유발하였고 Hyperfilm-MP(Amersham Biosciences, UK)에 노출시켜 결합 반응을 관찰하였다.
그 결과, 도 3a에서 나타난 바와 같이 세로토닌(5-HT) 자극에 의해 ERK의 인산화를 증가시켰으며, 그 영향이 5분에서 최댓값을 보이는 경향을 확인하였다.
<3-2> 5-HT 6 R의 활성제인 EMD386088와 길항제인 SB258585에 대한 반응성 확인
무혈청 DMEM 배지가 포함된 세포주를 6-웰 배양 접시에, 실시예 2의 방법으로 선별한, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주를 1 × 106 세포/웰로 분주한 후, 37℃, 5% CO2의 가습 조건에서 배양하였다. 3시간 후, 20 μM 5-HT, 1 μM EMD386088(Tocris, USA) 및 10 μM SB258585(Tocris, USA)를 5분 동안 정해 진 간격으로 각각 처리하였다. EMD386088/SB258585의 경우, SB258585를 30분 동안 선처리 한 후 EMD386088을 처리하였다. 상기 화학물질 처리에 의한 ERK 인산화를 실시예 3-1-2의 웨스턴 블랏 방법으로 확인하였다.
그 결과, 도 3b에서 나타난 바와 같이 5-HT와 EMD386088 자극에 의해 ERK의 인산화를 증가시켰으며, SB258585는 그 효과를 감소시키는 것을 확인하였다.
<실시예 4> HA-5-HT 6 R의 세포 표면 발현 분석
<4-1> Fyn 과발현 전 분석
본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에서 세포막 외부에 위치하는 5-HT6R의 N-말단에 연결된 HA가 세포 표면 밖에 위치하는 것을 확인하고자(도 4a), 대한민국 공개 특허 제 2008-0004994호에서 5-HT6R의 결합 단백질인 것이 확인된 Fyn을 이용하였다.
구체적으로, 세포 전체 또는 표면 단백질 분석은 면역형광세포화학법 (immunofluorescence)을 사용하여 수행하였다. 코팅된 커버 글라스에서 키운 실시예 2의 방법으로 선별한, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주를 차가운 PBS로 3회 세척하였고, PBS에 녹인 4% 파라포름알데히드를 이용하여 4℃에서 30분 동안 세포를 고정한 후 차가운 PBS로 3회 세척하였다. 이후 세포전체로 항체를 투입시켜서 세포전체를 관찰하기 위해 20분 동안 PBST(PBS + 0.2% Triton X-100)를 첨가하거나, 상기 단계를 생략함으로써 항체가 세포내부로 유입되지 않도록 하여 세포표면을 분석하였다. 이후 1시간 동안 5%의 BSA로 차단하였고 1차 항체, anti-HA(1:500; Cell Signaling, USA)와 anti-Fyn(1:500; Cell Signaling, USA)으로 6시간 반응한 후, PBS로 10분간 3회 세척하였고 2차 항체를 1시간 동안 처리하였다. PBS로 3회 씻어 준 후 CRYSTAL/MOUNT(Biomeda Corp., USA)로 슬라이드 상에 커버 글라스를 고정시켰다. 항체로 표지된 두 가지 특정 단백질의 세포내 위치를 관찰하기 위하여 confocal LSM 510 laser scanning microscope(Zeiss, Gottingen, Germany)로 영상을 분석하였다.
그 결과, 도 4b에서 나타난 바와 같이 본 발명의 형질전환 세포주에서 안정적으로 발현하는 HA-5-HT6R의 숙주세포인 HEK293 세포주에서 자체적으로 발현하는 Fyn 단백질의 분포를 확인할 수 있었다. 또한, HA 항체가 세포표면 막을 투과하지 못하도록 처리하여 이용하였을 때, HA-5-HT6R이 세포막에서 관찰되었다.
<4-2> Fyn 과발현 후 분석
무혈청 DMEM 배지가 포함된 100 ㎜ 플레이트에, 실시예 2의 방법으로 선별한, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 형질전환 세포주를 1 × 106 세포/웰로 분주한 후, 37℃, 5% CO2의 가습 조건에서 배양한 후, Fyn-pcDNA3.1(+)과 Lipofectamine 2000을 1:3의 비율로 Opti-MEM 배지에 넣어 5분 동안 혼합하였고, 30분 후 배양 접시에 상기 혼합액을 넣어 세포주를 형질 감염시켰다. 6시간 후에 배지를 DMEM 배 지로 교환하였고, 추가로 24시간 동안 세포를 배양하여 Fyn을 과발현 시켰다.
이후, 실시예 4-1의 방법으로 세포전체를 관찰하기 위해 20 분 동안 PBST(PBS + 0.2 % Triton X-100)를 첨가하여 세포전체를 관찰하였고 또는 이 단계를 생략함으로써 세포표면을 관찰하였다.
그 결과, 도 4c에서 나타난 바와 같이 HA 항체가 세포표면 막을 투과하지 못하도록 처리하였을 때, Fyn 과발현 시에도 세포막에서 Fyn은 관찰되지 않고, HA-5-HT6R만이 관찰된 것을 확인하였다.
<실시예 5> HA-5-HT 6 R의 활성측정
<5-1> 세포 처리 조건
무혈청 DMEM 배지가 포함된 100 ㎜ 플레이트에, 실시예 2의 방법으로 선별한, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주와 HA-5-HT6R을 일시적으로 발현하는 세포주, 야생형 HEK293 세포주 및 5-HT6R을 발현하는 세포주를 5 × 106 세포/웰로 96-웰 플레이트 하나를 3구역으로 나누어 분주한 후, 37℃, 5% CO2의 가습 조건에서 배양하였다. 24시간 후, Gα15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터(Evi Kostenis, Institute for Pharmaceutical Biology, Nussallee 6, 53115 Bonn, Germany)와 Lipofectamine 2000과 1:3의 중량비로 혼합하여 상기 세포주에 형질 감염시킨 후, 1% FBS가 포함된 DMEM에서 16시간 이상 배양하였다. 활성 검색 하루 전 폴리-L-라 이신(0.05 ㎎/㎖)으로 처리한 96-웰 플레이트에 상기 형질 감염시킨 세포를 한 웰 당 5 × 104의 밀도로 분주하였다. 수용체 내재화(internalization)를 억제하기 위해 혈청 고갈(serum starvation) 조건을 이용하였다. 상기 수용체 내재화가 세포질 내로 내재화(internalization)하면 분해되거나 불활성화되어 수용체를 하향조절하기도 한다.
<5-2> FDSS6000 이용한 형광 칼슘 측정
세포 기반 HTS 기기 FDSS6000(Hamamatsu Photonics, JP)을 이용하여 형광 칼슘을 측정하였다. 이때, 칼슘 농도에 민감한 플루오-4/AM과 0.001% 플루로닉 F-127(Sigma, USA)을 형광성 칼슘 표지물로 사용하였다. 세포를 480 ㎚에 선택적으로 노출시켰고 515 ㎚를 통과하는 방출 형광을 CCD 카메라로 찍어서 데이터를 얻었다.
구체적으로, 실험 당일 96-웰 플레이트에 부착된 세포를 HEPES 완충용액(150 mM NaCl, 5 mM KCl, 1 mM MgCl2, 2 mM CaCl2, 10 mM HEPES, 10 mM Glucose, pH 7.4)으로 3회 세척하였고, HEPES 완충용액에 녹인 4 μM 플루오-4/AM과 0.001% 플루로닉 F-127로 배양기에서 1시간 반응시킨 다음, HEPES 완충용액으로 다시 2회 세척 한 후, 세포를 480 ㎚에 선택적으로 노출시켰고 515 ㎚를 통과하는 방출 형광을 CCD 카메라로 찍어서 데이터를 얻었다.
<5-3> HA-연결의 영향 조사
실시예 5-1에서 Gα15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로 형질 감염시킨, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주와 5-HT6R을 발현하는 세포주에, 10 μM 5-HT를 각각 처리한 후, 실시예 4-2의 방법으로 활성을 측정하였다. 음성 대조군으로는 HA-태그만 들어있는 공벡터로 형질전환된 세포주를 이용하였다. F는 480 ㎚에서의 형광 세기이고, F0는 초깃값을 나타낸다.
그 결과, 도 5a에서 나타난 바와 같이, N-말단에 위치한 HA-연결이 5-HT6R의 기능을 바꾸지 않은 것을 확인하였다. 또한, 상기 형광 세기의 변화(F/F0)를 평균값으로 나타낸 결과, 도 5b에서 나타난 바와 같이, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주는 0.111 ± 0.003, 5-HT6R을 발현하는 세포주는 0.105 ± 0.003, 및 HA-태그만 들어있는 공벡터로 형질전환된 세포주는 0.014 ± 0.007 (n = 4) 이었다.
<5-4> 5-HT 농도-의존성 활성
실시예 5-1에서 Gα15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로 형질 감염시킨 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주에, 96-웰 플레이트와는 별도로 5-HT6 수용체를 활성화시킬 상이한 농도(10-11~ 10-5 M)의 5-HT6 수용체 활성제를 포함한 1 개의 96-웰 약물 플레이트를 준비하였다. 대부분의 세포 기반 HTS 기기의 경우 약물 주 입에 필요한 액체 애플리케이션 시스템은 있지만 액체 흡입 시스템은 없기 때문에 검색하고자 하는 5-HT 및 다른 활성제 약물을 5 배의 고농도로 HEPES 완충용액에 20 ㎕씩 준비하여 최종 부피인 100 ㎕(부착 상태 배양세포 80 + 5X 5-HT 및 다른 활성제 약물)에서 1/5 희석되어 측정하였다. 최종적으로 25초 기준 측정, 90초간 약물 처리 조건 하에서 5-HT6 수용체 활성제인 5-HT를 10-10~ 10-5 M 농도 범위에서 형광표지 염료인 플루오-4를 이용하여 5-HT6 수용체 활성에 대한 Ca2+ 시그널을 %로 구하였다. 480 nm에서 최고 비율값의 면적을 100%로 잡고 5-HT의 활성 효과를 구한 후 세포에 대한 농도-의존성 그래프와 이로부터 EC50 값을 구하였다(도 5c). 이때, 5-HT에 대한 EC50 값은 y/ymax = 1/(1+(K1/2/[5-HT]nH) 식을 이용하여 구하였다 (ymax는 최대 반응, K1/2는 EC50 값, nH는 Hill 상수).
<5-5> HA-5-HT 6 R을 안정적으로 발현하는 세포주의 확인
실시예 5-1에서 Gα15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터로 형질 감염시킨, HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주(S1~S3)와 HA-5-HT6R을 일시적으로 발현하는 세포주(T1~T3)에, 10 μM 5-HT를 각각 처리한 후, 실시예 4-2의 방법으로 활성을 측정하였고, Integration Ratio Max(Hamamatsu Photonics program, JAPAN)로 세포 내 칼슘 유입 수치(Integrate ratio max values)를 계산하였다.
그 결과, 도 6에서 나타난 바와 같이 본 발명의 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주가 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현함으로써, 일시적으로 발현하는 세포주보다 실험의 재현성이 우수한 것을 확인하였다.
도 1은 N-말단 HA-연결된 인간 5-HT6R의 유전자를 포함하는 플라스미드의 개열지도를 나타낸 도이다.
도 2는 RT-PCR 방법으로 HA-5-HT6R이 형질도입된 세포주를 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: HA-5-HT6R이 형질도입된 세포주 선별; 및,
b: P1에서 P6까지 안정적인 HA-5-HT6R 발현 검정.
도 3은 본 발명의 HA-5-HT6R이 형질도입된 HEK293 세포주의 HA-5-HT6R의 기능을 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: 세로토닌(5-HT)의 자극에 의한 ERK의 인산화; 및,
b: 5-HT6R의 활성제인 5-HT 및 EMD386088, 및 길항제인 SB258585의 효과 확인.
도 4는 본 발명의 HA-5-HT6R이 형질도입된 HEK293 세포주의 세포 표면에서 HA-5-HT6R의 발현양상을 분석한 결과를 나타낸 도이다(Total: 세포 내부 및 표면에서 발현 양상을 확인):
a: 5-HT6R의 N-말단에 연결된, 세포 표면 밖으로 위치한 HA를 나타내는 모식도;
b: Fyn 과발현전의 Fyn 및 HA-5-HT6R의 분포; 및,
c: Fyn을 과발현시킨 경우, Fyn 및 HA-5-HT6R의 분포.
도 5는 본 발명의 세포주가 발현한 HA-5-HT6R의 기능이 HA-연결에 의해 변하지 않은 것을 확인한 결과를 나타낸 도이다:
a: 세포내 칼슘 양의 변화;
b: 세포내 칼슘 양의 평균; 및,
c: HA-5-HT6R의 농도-의존적 활성.
도 6은 일시적으로 또는 안정적으로 HA-5-HT6R을 발현하는 세포주의 재현성의 차이를 나타낸 도이다.
<110> Korea Instititue of Science and Technology <120> Cell line which is stably expressing the HA-5-HT6R, for HTS of 5-HT6R's ligands <130> 8P-08-04 <160> 4 <170> KopatentIn 1.71 <210> 1 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-5-HT6R forward primer <400> 1 ccactcttca tgcgggactt c 21 <210> 2 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> HA-5-HT6R reverse primer <400> 2 tcagttcgtg gggatgccaa g 21 <210> 3 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin forward primer <400> 3 gtcaccaact gggacgacat g 21 <210> 4 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> beta actin reverse primer <400> 4 gccgtcaggc agctcgtagc 20

Claims (14)

  1. N-말단에 HA(Hemagglutinin)가 연결된 5-HT6R 유전자 컨스트럭트를 포함하는 벡터가 숙주세포에 형질도입되어 HA-5-HT6R을 안정적으로 발현하는 세포주.
  2. 제 1항에 있어서, 기탁번호 KCLRF-BP-00187로 기탁 된 것을 특징으로 하는 세포주.
  3. 삭제
  4. 제 1항에 있어서, 상기 숙주세포는 HEK293, COS7, CHO-K1 및 CHO-G5A으로 이루어진 군으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 세포주.
  5. 1) 제 1항의 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
    2) 상기 처리된 세포주의 5-HT6R 활성을 측정하는 단계; 및,
    3) 미처리된 세포주와 비교하여, 상기 세포주에서 5-HT6R 활성을 증가 또는 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색방법.
  6. 제 5항에 있어서, 단계 1)의 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아의 대사산물 및 진균의 대사산물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고효율 검색방법.
  7. 제 5항에 있어서, 5-HT6R 활성의 측정은 상기 5-HT6R에 의한 세포내 칼슘 농 도 유입을 측정하는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  8. 제 7항에 있어서, 세포내 칼슘 농도 유입이 측정될 대상 세포주는 피검화합물을 처리 전에 Gα15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터와 리포펙타민으로 형질 감염되는 것을 특징으로 하는 방법.
  9. 1) 제 1항의 세포주에 피검화합물을 처리하는 단계;
    2) 상기 처리된 세포주의 단백질을 정제하는 단계;
    3) 상기 정제된 단백질의 5-HT6R 활성을 측정하는 단계; 및,
    4) 미처리된 세포주와 비교하여, 상기 세포주에서 5-HT6R 활성을 증가 또는 감소시킨 피검화합물을 선별하는 단계를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색방법.
  10. 제 9항에 있어서, 단계 1)의 피검화합물은 천연화합물, 합성화합물, RNA, DNA, 폴리펩티드, 효소, 단백질, 리간드, 항체, 항원, 박테리아의 대사산물 및 진균의 대사산물로 이루어진 군으로부터 선택되는 어느 하나인 것을 특징으로 하는 고효율 검색방법.
  11. 제 9항에 있어서, 5-HT6R 활성의 측정은 상기 5-HT6R에 의해 인산화된 ERK를 측정하는 방법에 의해 수행되는 것을 특징으로 하는 방법.
  12. 제 1항의 세포주를 포함하는 5-HT6R 리간드의 고효율 검색용 조성물.
  13. 제 12항에 있어서, 상기 세포주는 기탁번호 KCLRF-BP-00187로 기탁 된 것을 특징으로 하는 고효율 검색용 조성물.
  14. 제 12항에 있어서, 상기 조성물은 추가로 Gα15 단백질을 발현시킬 수 있는 벡터, 리포펙타민, 형광성 칼슘 표지물 및 세척 완충용액을 추가로 포함하는 것을 특징으로 하는 고효율 검색용 조성물.
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