CN101443022A - 生长刺激蛋白质的用途 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及个体中新发现的生长刺激蛋白质的抑制。此外，本发明涉及用于预防或治疗个体中的癌症，或预防或治疗癌症生长、侵袭或转移，或预防或治疗其他高度增生性疾病的方法，通过下调所述生长刺激蛋白质的表达或通过灭活所述蛋白质。再进一步地，本发明涉及基于所述生长刺激蛋白质用于诊断个体中的癌症或其他高度增生性疾病的方法。
Description
发明领域
本发明涉及个体中新发现的生长刺激蛋白质(growth-stimulating protein)的抑制。此外，本发明涉及用于预防或治疗个体中的癌症，或预防或治疗癌症生长、侵袭或转移，或预防或治疗其它高度增生性疾病的方法，通过下调所述生长刺激蛋白质的表达或通过灭活所述蛋白质。再进一步地，本发明涉及基于所述生长刺激蛋白质用于诊断个体中的癌症或其他高度增生性疾病的方法。
发明背景
本文用于举例说明本发明背景的出版物和其他材料，以及特别地提供关于实践的另外细节的病例通过引用而作为参考。
癌症是影响全世界所有群体的破坏性疾病。据估计2个男性中的1个和3个女性中的1个将在其一生中发展某种形式的癌症。还估计在2005年期间仅在美国超过550,000人将由于癌症而死亡。癌症是关于涉及细胞不受控制的生长、存活和侵袭的复杂和广泛不同的疾病集合的一般术语。尽管存在超过100种不同类型的癌症，以及每种的亚型，但近期研究已揭示良性细胞至癌细胞的转化需要有限数目的遗传成分(Zhao等人，2004)。一般地，已得出结论人细胞转化需要Ras GTP酶的激活、端粒酶的过度表达、肿瘤抑制蛋白质p53和成视网膜细胞瘤蛋白质(Rb)的灭活以及蛋白磷酸酶2A(PP2A)的抑制(Zhao等人，2004)。显而易见的是这些遗传成分的功能的了解可以导致能广泛应用于不同类型的癌症的癌症治疗的发展。
如上所述，PP2A活性的抑制已鉴定为原代人细胞转化的先决条件之一(Zhao等人，2004)。PP2A是由催化亚单位(PP2Ac或C)、支架亚单位(PR65或A)和备选调节B亚单位之一组成的三聚蛋白质复合物(图1A)(Janssens和Goris，2001)。PP2A通过使蛋白激酶及其他信号蛋白的调节ser/thr残基脱去磷酸来调节细胞行为。致癌转录因子c-Myc是关于PP2A的许多底物之一。近期已显示PP2A介导的c-Myc上的丝氨酸62的去磷酸化导致蛋白质的蛋白酶体降解(Yeh等人，2004)。重要的是，灭活PP2A的病毒小t抗原通过c-Myc的稳定来发挥其致癌潜能(Yeh等人，2004)。
尽管PP2A抑制对于人细胞转化的重要性已通过使用病毒抗原作为研究工具牢固地确定，但PP2A抑制经由其在自发转化的人癌细胞中发生的分子机制目前仍不明了。因此存在阐明PP2A经由其抑制转化的机制的经鉴定的需要。
发明简述
本发明基于生长刺激蛋白质的发现。本发明的发明人已发现蛋白质KIAA1524(GenBank登记号AAI30565；SEQ ID NO.1)是蛋白磷酸酶2A(PP2A)的内源性抑制剂，和蛋白质KIAA1524是肿瘤生长和癌细胞增殖所需的，和蛋白质KIAA1524在癌组织中是上调的。
因此，根据一个方面，本发明涉及用于筛选和鉴定抑制KIAA1524的治疗剂的方法，所述方法包括下述步骤：a)提供固定在反应室中的第一种蛋白质，b)向所述室中同时或以任何顺序依次加入候选试剂和标记的第二种蛋白质，c)测定所述第一种蛋白质是否与所述第二种蛋白质结合，和d)当步骤c)中的所述测定是阴性时，鉴定所述候选试剂为抑制KIAA1524的治疗剂，其中所述第一种蛋白质是KIAA1524，和所述第二种蛋白质选自PP2A、其亚单位和c-Myc，或反之亦然。
根据另一个方面，本发明涉及抑制KIAA1524的试剂，例如如权利要求中描述的小干扰RNAs和肽。此外，本发明涉及包含此类试剂的药物组合物。
根据一个进一步的方面，本发明涉及用于生产药物组合物的方法，所述方法包括鉴定抑制KIAA1524的试剂和使所述试剂与任何合适的药学上可接受的赋形剂混合，以及通过此类方法生产的药物组合物。
根据一个进一步的方面，本发明涉及通过施用治疗有效量的权利要求中描述的药物组合物来抑制有此需要的人或动物患者中的KIAA1524的方法。
根据一个进一步的方面，本发明涉及抑制KIAA1524的试剂用于制备用于治疗、预防和/或改善选自癌症及其他高度增生性疾病的疾病的药物组合物的用途。
根据一个再进一步的方面，本发明涉及用于测定怀疑患有癌症的哺乳动物中的恶性改变的侵袭性的方法，所述方法包括a)评估取自所述哺乳动物的被怀疑包含恶性细胞的样品中的KIAA1524表达水平，b)使来自步骤a)的表达水平与非恶性对照样品中的KIAA1524表达水平相比较，和c)当所述样品中的KIAA1524表达水平明显高于非恶性对照样品中的KIAA1524表达水平时，确定所述恶性改变为侵袭性的。
附图简述
图1：KIAA1524是PP2A的内源性抑制剂。图1A)显示了包含PR65支架、PP2Ac催化亚单位和调节B亚单位的PP2A复合物的示意图。显示了在TAP纯化中使用的PR65蛋白质的TAP融合物。图1B)来自HT-1080纤维肉瘤细胞的PR65蛋白质复合物的TAP纯化。PR65TAP洗脱物中的蛋白质通过质谱测定的肽测序进行鉴定。图1C)用PR65抗体的HeLa细胞细胞质提取物的免疫共沉淀分析揭示了内源性KIAA1524、PR65和PP2Ac蛋白质之间的相互作用。PI，免疫前血清；输入，输入材料。图1D)通过免疫共沉淀分析鉴定在PR65结合中的KIAA1524蛋白质缺陷突变体。图1E)用指示的表达构建体转染的HeLa细胞通过共焦显微镜检查就KIA1524-PP2Ac共定位进行分析。图1F)HeLa细胞中siRNA介导的KIAA1524蛋白质表达的耗尽增强免疫沉淀的PP2Ac的丝氨酸/苏氨酸磷酸酶活性。
图2：KIAA1524蛋白质。图2A)KIAA1524蛋白质的预测结构揭示了几种假定的蛋白质-蛋白质相互作用结构域。在图1D和1E中分析的KIAA1524mut蛋白质。图2B)KIAA1524蛋白质的氨基酸序列(SEQ IDNO.1)。
图3：KIAA1524中的PP2A相互作用结构域的鉴定。图3A)KIAA1524缺失构建体与来自HeLa细胞裂解物的内源性PR65的免疫共沉淀。指示的Flag-KIAA1524蛋白质和PP2A复合物的免疫共沉淀通过抗Flag免疫沉淀物由PR65抗体的蛋白质印迹进行分析。KIAA1524缺失的免疫沉淀效率通过KIAA1524免疫印迹加以证实。图3B)KIAA1524中假定的PP2A相互作用结构域的鉴定。图3A中的结果显示野生型KIAA1524与PP2A(PR65)相互作用，而其中461-533结构域被删除的KIAA1524显示出与PP2A受损的相互作用。因此，KIAA1524结构域461-533预期介导KIAA1524和PP2A之间的相互作用。
图4：KIAA1524抑制c-Myc相关的PP2A活性和c-Myc降解。图4A)siRNA诱导的KIAA1524蛋白质的耗尽导致HeLa细胞中的c-Myc蛋白质表达的下调。图4B)siRNA诱导的KIAA1524蛋白质的耗尽不抑制c-MycmRNA表达。图4C)siRNA诱导的KIAA1524蛋白质的耗尽增强c-Myc免疫沉淀物中的PP2A活性。图4D)KIAA1524蛋白质不调节PP2Ac和c-Myc蛋白质之间的相互作用。对用乱序的或KIAA1524siRNA转染的HeLa细胞实施使用c-Myc特异性抗体的免疫共沉淀分析。免疫沉淀物中的蛋白质其后通过指示的抗体进行研究。
图5：c-Myc中的KIAA1524相互作用结构域的鉴定。图5A)使用固定的、重组Flag-KIAA1524蛋白质和重组GST蛋白质或使用GST-oMyc 1-262蛋白质的体外结合测定法，洗脱物与GST(顶部)或KIAA1524(底部)的免疫印迹。输入，用于相互作用测定法的GST蛋白质。显示的是具有相似结果的3次独立实验的代表性印迹。图5B)鉴定c-Myc 105-262为c-Myc.KIAA1524上的KIAA1524结合结构域的图示。
图6：KIAA1524是癌细胞生长所需的。图6(A)用乱序的或KIAA1524siRNA转染72小时的HeLa细胞用于细胞增殖的胸苷掺入。显示的是4次实验的平均值+S.D.。*p<0.05，斯氏t检验。图6B)关于来自HeLa细胞的细胞周期进展的DNA含量的流式细胞检测分析，所述HeLa细胞用乱序的或KIAA1524 siRNA转染72小时。结果是来自具有相似结果的4次重复的代表性实验。图6C)如在KIAA1524 siRNA转染后72小时由免疫印迹检测的，KIAA1524耗尽不诱导HeLa细胞β中的聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)切割。全长(110kD)和半胱天冬酶切割形式的PARP蛋白质的预期分子量显示于右侧。图6D)在用乱序的或KIAA1524 siRNA转染的单层HeLa细胞上的密集灶形成。上方，代表性光学显微镜检查图像。下方，在重新铺板后10天通过Image J软件的灶数目的定量。显示的是4次实验的平均值+S.D.。*p＝0.002，斯氏t检验。图6E)siRNA诱导的KIAA1524蛋白质的耗尽抑制琼脂上的HeLa细胞非停泊性生长。图6F)用乱序的(Scr)或KIAA1524 siRNA转染的HeLa细胞在免疫妥协小鼠中就肿瘤生长进行分析。显示的是来自每组中的6只小鼠的肿瘤体积的平均值+SD。图6G)来自在第27天时类似于图6F)中显示的实验进行的独立实验的肿瘤重量(mg)。*p＝0.034，曼-惠特尼(Mann-Whitney)U检验。
图7：KIAA1524在人头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中过量表达。图7A)KIAA1524 mRNA mRNA表达通过来自正常组织样品的定量RT-PCR分析进行定量。KIAA1524表达相对于β-肌动蛋白呈现。图7B)KIAA1524mRNA表达通过Taqman实时PCR分析由HNSCC细胞系和人表皮角化细胞(HEK)进行研究。图7C)KIAA1524 mRNA表达通过Taqman实时PCR分析由HNSCC肿瘤样品和正常组织对照样品进行研究。图7D)HNSCC组织用KIAA1524抗体的免疫染色分析显示出肿瘤细胞(肿瘤细胞小瘤由箭头指出)中强烈的细胞质KIAA1524染色。图7E)siRNA诱导的KIAA1524蛋白质的耗尽导致HNSCC细胞系中的c-Myc蛋白质表达的下调。
图8：KIAA1524在人结肠癌中过量表达。图8A)结肠癌组织和非恶性结肠组织(对照)中的KIAA1524 mRNA表达的定量RT-PCR分析。显示的是样品的平均表达+S.D.。*p<0.05，曼-惠特尼U检验。图8B)人结肠癌中的KIAA1524表达水平和肿瘤分期之间的关联。观察到在II-IV期与II期(*p<0.0001，曼-惠特尼U检验)和在II-IV期与正常样品(*p＝0.0019，曼-惠特尼U检验)之间在KIAA1524表达中的统计差异。
图9：KIAA1524在人乳腺癌中过量表达。图9A)正常或肿瘤乳房组织中的KIAA1524表达。图9B)KIAA1524表达依赖人乳房肿瘤类型。两样本威尔科克森(Wilcoxon)(曼-惠特尼)秩和检验用于统计分析。与正常乳腺比较*：p<0.05；与粘液性瘤比较**p<0.005。看家基因β-肌动蛋白用于标准化。
发明详述
本发明基于KIAA1524作为生长刺激蛋白质的鉴定，所述KIAA1524与PP2A相互作用且抑制其肿瘤抑制活性。本发明因此提供了KIAA1524作为用于新型抗癌剂或抗增殖剂的靶。
KIAA1524基于与PR65蛋白质的免疫共沉淀、PP2A蛋白质复合物的支架亚单位、和后续质谱测定的肽测序而鉴定为PP2A相互作用蛋白质。KIAA1524与PP2A复合物相互作用的能力通过内源性PR65蛋白质的免疫共沉淀分析和通过使用KIAA1524的缺失突变体进行证实。此外，KIAA1524作为PP2A抑制剂的功能作用通过经由靶向KIAA1524的小干扰RNA(siRNA)寡聚物耗尽KIAA1524得到证实，这导致PP2A磷酸酶活性的刺激。
此外，基于免疫共沉淀实验，KIAA1524鉴定为与转录因子c-Myc直接相互作用的蛋白质。所述相互作用显示为稳定c-Myc蛋白质，从而促进其致癌潜能。
KIAA1524在癌细胞行为调节中的作用例如通过用KIAA1524 siRNA转染细胞且随后测定细胞培养和体内小鼠模型中的细胞增殖进行研究。KIAA1524的耗尽导致细胞增殖的抑制和细胞的非停泊性生长的抑制，以及小鼠中妥协的肿瘤形成。此外，发现KIAA1524在人恶性肿瘤中过量表达，例如头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)、结肠癌和乳腺癌。特别地，当与相同起源的非浸润性肿瘤比较时，KIAA1524过量表达在结肠癌和乳腺癌的浸润性肿瘤中发现。这些和下文公开的其他结果指出KIAA1524促进癌细胞生长且因此KIAA1524充当用于癌症治疗的靶。
本发明涉及用于筛选和鉴定治疗剂的方法，所述治疗剂抑制KIAA1524且因此在治疗、预防和/或减轻癌症，癌细胞增殖、侵袭、转移，以及其他高度增生性疾病，例如牛皮癣、心肌肥大和良性瘤，例如腺瘤、错构瘤和软骨瘤中有用。
如本说明书自始至终使用的，术语“抑制KIAA1524”包括下调KIAA1524的表达，抑制KIAA1524的活性，灭活KIAA1524，以及抑制KIAA1524与PP2A复合物或c-Myc的相互作用。单词抑制和阻断可互换使用。
上文方法包括下述步骤：a)提供固定在反应室中的第一种蛋白质，b)向所述室中同时或以任何方式顺次加入候选试剂和标记的第二种蛋白质，c)测定所述第一种蛋白质是否与所述第二种蛋白质结合，和d)当步骤c)中的所述测定是阴性但在不存在治疗剂的情况下是阳性时，鉴定所述候选试剂为抑制KIAA1524的治疗剂。在该方法中，所述第一种蛋白质是KIAA1524和所述第二种蛋白质选自PP2A，其亚单位，即PP2Ac α或β、PR65 α或β，或任何备选B亚单位(B、B′、B＂)和c-Myc，或反之亦然。
所述第一种蛋白质与反应室例如多孔平板的固定可以通过本领域已知的任何合适的方法来进行。此类方法对于技术人员是显而易见的，所述技术人员也应当理解如何固定所述蛋白质而不影响其构象或结合性质。
本领域已知的任何合适的标记和标记方法可以用于标记所述第二种蛋白质。优选地，所述标记是荧光标记，例如绿色荧光蛋白或化学荧光标记例如德克萨斯红(Texas red)。所述标记还可以是蛋白质，例如当与底物例如荧光素一起温育时发光的萤火虫萤光素酶。此外，所述标记可以是酶，例如当与其底物例如3-氨基、9-乙基-咔唑一起温育时产生比色反应的辣根过氧化物酶。
所述第一种蛋白质在候选试剂的存在下是否与所述第二种蛋白质结合的测定可以通过任何合适的方法依赖使用的标记来进行。例如，如果使用荧光标记，那么蛋白质结合可以通过由光源和传感器组成的光学仪器进行测定，所述光源优选是激光，所述传感器检测响应由光或激光激发由荧光标记发出的光。在比色反应的情况下，例如下述这种情况，当例如辣根过氧化物酶标记与其底物例如3-氨基、9-乙基-咔唑组合使用时，蛋白质结合可以通过目的波长范围中的光吸光度中的改变进行测定。
本领域技术人员应当理解该方法还可以包含各种另外步骤，例如温育和洗涤。例如，洗涤可能是步骤b)后所需的以去除未结合的第二种蛋白质。
在根据本发明的一个实施方案中，该方法可以用于蛋白质-蛋白质相互作用的抑制剂的高通量筛选，通过使第一种蛋白质或靶蛋白固定在96、384孔或任何等价多孔平板上，并且使其与第二种蛋白质一起温育，所述第二种蛋白质与例如绿色荧光蛋白、德克萨斯红或萤光素酶蛋白质融合。使用平板阅读器测量由荧光标记发出的光，并且在相互作用的情况下，光信号由孔进行检测。使此类测定法与肽和小分子化合物文库组合将允许鉴定潜在的药物样分子，其抑制蛋白质相互作用，通过室中荧光信号的丧失检测的。
本发明进一步涉及用于生产药物组合物的方法，所述方法包括鉴定抑制KIAA1524的试剂和使所述试剂与本领域技术人员众所周知的任何合适的药学上可接受的赋形剂混合。在一个实施方案中，所述鉴定使用上文公开的筛选和鉴定方法来进行。
此外，本发明涉及通过施用治疗有效量的根据本发明生产的药物组合物来抑制有此需要的人或动物患者中的KIAA1524的方法。
认为这种方法可以用于治疗任何癌症。然而，这种方法特别适合于治疗或预防位于某些组织中的癌症和通过手术或辐射将难以或无法治疗的癌症。作为此类癌症的例子，可以提及头颈部鳞状细胞癌、结肠癌和乳腺癌。
认为这种方法还可以用于治疗其中表达KIAA1524的高度增生性疾病。此类疾病的例子牛皮癣、心肌肥大和良性瘤，例如腺瘤、错构瘤和软骨瘤。
根据本发明的方法可以作为单独的治疗或预防方法，或作为与其他方法例如细胞毒性剂的施用、手术、放射疗法、免疫疗法等组合的辅助疗法来完成。
可以根据本发明的各种实施方案鉴定和/或在根据本发明的方法中有用的试剂包括但不限于影响KIAA1524的蛋白质构象导致其灭活的寡核苷酸例如反义寡核苷酸、siRNA和核酶分子、肽、拟肽、化学化合物、小分子、针对所述KIAA1524产生的抗体、和适体(寡核苷酸)。
根据一个优选实施方案，所述试剂是下调KIAA1524表达的试剂。
根据一个优选实施方案，KIAA1524的下调是可能的，例如通过使用反义寡核苷酸、经修饰的核苷酸、不同种类核苷酸的组合序列以预防或修饰KIAA1524合成。反义寡核苷酸可以是DNA分子或RNA分子。
还包括切割KIAA1524mRNA的核酶。核酶技术在例如下述出版物中描述：Ribozyme technology for cancer gene targetidentification和validation.Li等人，Adv.Cancer Res.2007；96：103-43。同样小干扰RNA分子(siRNAs)将是有用的。siRNA：s的应用近年来在新疗法的开发中已变得重要。O Heidenreich在文章“Forging therapeutics from small interfering RNAs in EuropeanPharmaceutical Review Issue 1，2005”中呈现了药学应用的概述。该原理已特别建议用于治疗肿瘤和癌、肉瘤、高胆固醇血症、成神经细胞瘤和疱疹基质角膜炎。
siRNA的原理在文献中得到广泛呈现。作为例子可以提及美国专利申请2003/0143732、2003/0148507、2003/0175950、2003/0190635、2004/0019001、2005/0008617和2005/0043266。siRNA双链体分子包含反义区和有义链，其中所述反义链包含与编码某一蛋白质的mRNA序列中的靶区互补的序列，和有义链包含与所述反义链互补的序列。因此，siRNA双链体分子由2个核酸片段装配，其中1个片段包含反义链和第2个片段包含所述siRNA分子的有义链。有义链和反义链可以经由连接分子进行共价连接，所述连接分子可以是多核苷酸接头或非核苷酸接头。反义和有义链的长度一般各为约19-21个核苷酸。然而，还可以使用长度为25-30个核苷酸的合成双链RNA(dsRNA)Dicer底物双链体，其近期已报告比相应的常规21-聚体小干扰RNAs(siRNAs)更有效(Kim等人，2005)。一般地，反义链和有义链都包含少数、一般为2个核苷酸的3′末端突出端。反义的5′末端一般是磷酸基(P)。具有末端磷酸基(P)的siRNA双链体比单链反义更易于施用到细胞内。在细胞中形成活性siRNA反义链，并且它识别靶mRNA的靶区。这依次导致通过RISC核酸内切酶复合物(RISC＝RNA诱导的沉默复合物)，以及在通过RNA依赖性RNA聚合酶(RdRP)的另外RNA合成中的靶RNA切割，其可以激活DICER且导致另外的siRNA双链体分子，从而扩增应答。
与小干扰RNAs相关的挑战之一是关于相应mRNA的有效siRNA的鉴定。应当指出具有不完全的互补性的基因经由siRNA非有意地下调，导致数据解释和潜在毒性方面的问题。然而，这可以通过用设计算法仔细地设计合适的siRNAs得到部分解决。这些计算机程序用一组规则筛选给定靶序列，以发现具有低GC含量的序列串，内部重复的缺乏，富含A/U的5末端和高局部自由结合能，这些是增强siRNA的沉默效应的特征。
为了鉴定在本发明中有用的试剂，几种不同的KIAA1524 siRNAs通过使用商业和非商业算法进行设计。为此，将KIAA1524的全长cDNA序列(GenBank登记号NM_020890)装载到siRNA算法程序(http://www.mwg-biotech.com/html/s_synthetic_acids/s_sirna_design.shtml)和由下述开发的单独链程序：Wenwu Cuia，JianchangNingb，Ulhas P.Naika，Melinda K.Duncana，(OptiRNAi，an RNAidesign tool.Computer Methods and Programs in Biomedicine(2004)75，67-73)。此外，算法产生的siRNA序列随后通过全基因组的DNA序列比对(BLAST)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast)进行筛选以消除免于脱靶的siRNAs。换言之，具有与除靶基因(KIAA1524)外的其他基因匹配的更短序列区域的所有那些siRNAs对于进一步的用途视为无价值的。这种方法导致SEQ ID NO：2-6中描述的5种潜在siRNAs的鉴定。
获得的siRNAs随后转染不同细胞系，并且它们降解mRNA和进一步耗尽KIAA1524翻译的能力在蛋白质水平上进行研究，通过在用KIAA1524特异性抗体的siRNA治疗后测量KIAA1524蛋白质的量。在使用的最低浓度上给出KIAA1524蛋白质的最强下调的那些siRNA序列在表1中用星号进行标记。
表1.下调KIAA1524表达的siRNAs的效率
| SEQ ID NO | 序列 | 长度 | 效率 |
| 2 | AACATCAGTGCTTCACTGATCCTT | 25 | 中 |
| 3 | AACTGTGGTTGTGTTTGCACTTT | 23 | 高* |
| 4 | GGUUGCAGAUUCUGAAUUATT | 21 | 中 |
| 5 | AAUGCCUUGUCUAGGAUUATT | 21 | 低 |
| 6 | ACCAUUGAUAUCCUUAGAATT | 21 | 高* |
本发明因此涉及选自SEQ ID NO：2-6的KIAA1524 siRNAs及其作为药物的用途。提供了在SEQ ID NO：2和4中描述的优选的siRNAs，和在SEQ ID NO：3和6中描述的更优选的siRNAs。显而易见的是在某些应用中，所述siRNAs可以长于21-25个核苷酸或dsRNA dicer底物双链体。
当用作药物时，寡核苷酸(例如反义、siRNA或核酶分子)应引入靶细胞中。递送可以以2种主要不同的方式完成：1)寡核苷酸的外源性递送或2)编码寡核苷酸的DNA序列的内源性转录，其中DNA序列位于载体中。
由于其经由在活细胞中存在的核糖核酸酶的降解，正常的、未修饰的RNA在生理条件下具有低稳定性。如果寡核苷酸应外源性施用，那么高度希望根据已知方法修饰分子，以便增强其针对化学和酶促降解的稳定性。
在体内外源性施用的核苷酸的修饰在本领域中得到广泛描述。基本上可以修饰核苷酸的任何部分，即核糖、碱基和/或核苷酸间磷酸二酯链。例如，来自核糖单位的2′-OH基团的去除以产生2′-脱氧核糖核苷酸导致改善的稳定性。先前公开的还有在这个基团上的其他修饰：用烷基、烯基、烯丙基、烷氧烷基、卤素、氨基、叠氮基或硫氢基替换核糖2′-OH基团。还可以进行在核糖单位上的其他修饰：包含在核糖的2′和4′位置之间的亚甲基连接的锁核酸(LNA)可以用于产生更高的固有稳定性。
此外，核苷酸间磷酸二酯键可以例如这样进行修饰，使得一个或多个氧由硫、氨基、烷基或烷氧基替换。同样可以修饰核苷酸中的碱基。
优选地，寡核苷酸包含在核糖上的一个或多个2′-羟基的修饰，和/或一个或多个核苷酸间磷酸二酯键中的修饰，和/或在核糖的2′和4′位置之间的一个或多个锁核酸(LNA)修饰。
特别优选的修饰是例如经由2′-脱氧、2′-O-甲基、2′-卤素例如氟或2′-甲氧乙基替换一个或多个2′-OH基团。特别优选的是这样的寡核苷酸，其中某些核苷酸间磷酸二酯键也例如通过磷硫酰键替换进行修饰。
应当指出上文提及的修饰仅是非限制性例子。
根据一个优选实施方案，可通过筛选测定法鉴定的或在根据本发明的方法中有用的试剂预防或抑制肿瘤生长和增殖，通过抑制所述KIAA1524与PP2A复合物或转录因子c-Myc相互作用。备选地，所述试剂抑制不依赖KIAA1524与PP2A或c-Myc的相互作用的KIAA1524生长和增殖增强效应。所述试剂可以例如是影响KIAA1524的蛋白质构象导致其灭活的肽、拟肽、小分子、针对所述KIAA1524产生的抗体、或适体(寡核苷酸)。
起因于PR65免疫共沉淀实验的结果显示KIAA1524与PP2A蛋白质复合物的PR65和PP2Ac亚单位相互作用。为了鉴定KIAA1524中介导蛋白质-蛋白质相互作用的区域，研究KIAA1524蛋白质中任何区域的缺失是否将消除其与PP2A的关联。为此，产生具有对应蛋白质编码序列的约50-100个氨基酸的每种缺失的一系列KIAA1524缺失构建体，且瞬时转染到HeLa细胞内。在11种KIAA1524缺失中，如由免疫共沉淀实验证实的，缺乏461-533之间的氨基酸的KIAA1524是在重复实验中显示出与PR65受损的结合的唯一突变体。因此，SEQ ID NO.1中氨基酸461-氨基酸533的区域是用于新型癌症治疗的特别重要的靶。
因此，根据一个特别优选的实施方案，该试剂在KIAA1524上的aa 461到533的区域或任何其他区域中灭活KIAA1524，所述区域参与PP2A复合物和KIAA1524蛋白质之间的相互作用。所述试剂可以例如是影响KIAA1524的蛋白质构象导致其灭活的肽、拟肽、小分子、针对所述KIAA1524产生的抗体、或适体(寡核苷酸)。
更具体而言，本发明提供了包含3-60个氨基酸的任何串的阻断肽，优选3-30个、优选6-18个、优选6-12、或优选9-12个氨基酸，对应SEQ ID NO.1中描述的KIAA1524的区域aa461-533的氨基酸。显而易见的是在某些应用中，所述阻断肽可以长于60个氨基酸。根据本发明的肽与PP2A复合物组分结合，且抑制KIAA1524和PP2A之间的相互作用，从而引起PP2A的肿瘤抑制活性，并且另一方面，抑制或阻断KIAA1524。在根据本发明的其他实施方案中，所述阻断肽包含选自SEQ ID NO：7-30及其保守序列变体的至少1个，优选1-20个、优选1-10个、优选2-6个、优选2-4个、或优选3-4个邻接序列。
为了研究KIAA1524的缺失是否影响PP2A复合物与其底物c-Myc的功能相互作用，c-Myc的稳态表达水平在用KIAA1524 siRNA转染后的HeLa细胞提取物中进行研究。如图3A中所示，siRNA诱导的KIAA1524的耗尽导致HeLa细胞中的c-Myc蛋白质表达的下调，同时，如图3B中证实的，c-Myc mRNA表达未受影响。这些结果指出KIAA1524转录后调节c-Myc蛋白质水平。为了研究c-Myc蛋白质水平中的减少是否由蛋白质去稳定作用引起，KIAA1524缺失对内源性c-Myc蛋白质的半衰期的影响通过脉冲追踪分析进行检查。如实验部分中更详细地描述的，KIAA1524缺失明显减少c-Myc蛋白质稳定性，从而指出KIAA1524是c-Myc稳定性的重要调节剂。
来自细胞提取物的c-Myc和KIAA1524的免疫共沉淀证实这些蛋白质之间的物理关联(图3D)。为了进一步阐明KIAA1524和c-Myc之间的相互作用，全长Flag标记的重组KIAA1524在昆虫细胞中产生，并且执行用c-Myc的重组GST融合的氨基末端部分(在Genbank登记号NP_002458下的序列的氨基酸1-262)的体外蛋白质-蛋白质相互作用测定法。结果指出GST-c-Myc 1-262与KIAA1524相互作用，而对应GST-Myc 1-120的大小、GST-Myc 1-262的蛋白水解降解片段不与KIAA1524相互作用。因此，c-Myc结构域120-262预期介导c-Myc与KIAA1524的直接结合。所述c-Myc结构域120-262包含143个氨基酸，且对应SEQ ID NO.31中描述的氨基酸1-143。
本发明因此提供了在抑制KIAA1524和c-Myc的相互作用中有用的阻断肽。在一个具体实施方案中，提供了包含3-60个氨基酸的任何串、优选3-30个、优选6-18个、优选6-12个、或优选9-12个氨基酸，其对应SEQ ID NO.31中描述的氨基酸1-143且抑制KIAA1524。所述结合导致KIAA1524和c-Myc之间的相互作用的抑制，从而抑制或阻断KIAA1524。在根据本发明的其他实施方案中，所述阻断肽包含选自SEQID NO：32-79及其保守序列变体的至少1个，优选1-20个、优选1-10个、优选2-6个、优选2-4个、或优选3-4个连续序列。
为了测试根据本发明的肽的阻断能力，将所述肽施用于细胞，例如HeLa癌细胞，和依赖肽的性质，a)其阻止KIAA1524与PP2A的结合的能力或b)其阻止KIAA1524与c-Myc的结合的能力通过任何合适的方法进行检测，例如KIAA1524相互作用的免疫沉淀分析或通过细胞裂解物的蛋白质印迹分析使用对c-Myc丝氨酸62磷酸化特异的抗体。阻止所述结合至统计上显著程度的肽被视为阻断肽。
术语“保守序列变体”在本文中意指起于氨基酸序列修饰的变体，其不显著改变根据本发明的肽的结合性质。此类修饰对于本领域技术人员是显而易见的，并且它们包括起于用相似氨基酸的氨基酸置换，以及氨基酸删除和添加的氨基酸序列变体。就根据本发明的更长的肽而言，例如包含超过9个氨基酸的肽，优选超过12个、优选超过12个、优选超过18个、或优选超过30个氨基酸，本发明包括与上文描述的多肽具有至少约90％的同一性、或至少95％、96％、97％、98％或99％同一性的那些。
当用作药物时，根据本发明的阻断肽可以通过任何合适的方法施用，例如静脉内注射、腹膜内注射和鞘内注射。在一个实施方案中，使阻断肽与本领域已知的细胞渗透性肽(CPPs)融合，所述CPPs使融合肽递送通过细胞膜。此类融合肽可以例如通过作为静脉内注射、静脉内注射和鞘内注射进行施用。对于本领域技术人员显而易见的是，随着技术进展，根据本发明的阻断肽和融合肽可以通过任何合适的方法或施用途径进行施用。
除了KIAA1524在人癌组织例如HNSCC、结肠癌和乳腺癌中的发现外，发现KIAA1524表达水平与肿瘤分期相关。例如，乳腺癌的恶性亚型表达比良性亚型统计上明显更多的KIAA1524。此外，具有较高的肿瘤分期的结肠癌表达比具有较低分期的结肠癌统计上明显更多的KIAA1524。
本发明还涉及基于检测或定量组织或体液中的KIAA1524蛋白质水平用于诊断癌症或高度增生性疾病的方法，通过
i)经由RT-PCR或经由杂交技术测定来自所述组织或体液的KIAA1524 mRNA表达，或
ii)对预期包含蛋白质KIAA1524的组织或体液实施识别所述KIAA1524的抗体，和检测和/或定量所述抗体，或经由蛋白组学技术对所述组织或体液实施分析。
杂交技术包括例如DNA杂交和RNA印迹。抗体的检测或定量可以根据标准免疫测定法方案来进行，例如标记连接的免疫吸附测定法、蛋白质印迹和免疫组织化学法。
本发明还涉及基于检测或定量KIAA1524基因中的突变或单核苷酸多态性用于诊断癌症或高度增生性疾病的方法，通过杂交技术或者通过DNA或RNA测序或者通过RNA或DNA的RT-PCR分析。
诊断可以通过单独的KIAA1524或者使其与其他蛋白质或基因组合来进行。
更具体而言，本发明涉及用于测定怀疑患有癌症的哺乳动物中的恶性改变的侵袭性的方法，所述方法包括a)评估取自所述哺乳动物，怀疑包含恶性细胞的样品中的KIAA1524表达水平，b)使来自步骤a)的表达水平与非恶性对照样品中的KIAA1524表达水平相比较，和c)当所述样品中的KIAA1524表达水平明显高于非恶性对照样品中的KIAA1524表达水平时，测定所述恶性改变为侵袭性的。优选地，所述样品中的KIAA1524表达水平高于所述对照样品超过2、优选超过3倍。
在根据本发明的一个实施方案中，上述方法用于确定怀疑患有癌症例如结肠癌的哺乳动物中的恶性改变的分期，通过当KIAA1524表达水平明显高于非恶性对照样品或非侵袭性I和II期样品中的KIAA1524表达水平时，测定步骤c)中所述恶性改变的分期为III或IV期。此外，本发明提供了用于区分侵袭性和转移性III和IV期与非侵袭性和非转移性II期的方法，在其中所述表达水平高于II期或非恶性对照样品超过2和优选3倍的情况下。
在根据本发明的一个进一步的实施方案中，上述方法用于区分乳腺癌的侵袭性肿瘤类型，例如浸润性导管癌(IDC)、浸润性小叶癌(ILC)和IDC与导管内粉刺状癌(IDC+ICC)的浸润性肿瘤类型与粘液癌，在其中KIAA1524表达水平高于非恶性对照样品超过2、优选3倍的情况下。
本发明将通过下述非限制性实验部分进行举例说明。
实验部分
结果
KIAA1524的鉴定
为了鉴定来自HT-1080细胞的PP2A相互作用蛋白质，产生稳定过度表达TAP标记的PR65蛋白质，PP2A复合物的支架单位的细胞克隆(图1A)。模拟转染的对照或PR65TAP表达细胞的细胞质提取物的TAP纯化揭示与PR65TAP共纯化但不存在于来自对照细胞的最终洗脱物中的几种蛋白质(图1B)。这些假定PR65相互作用蛋白质中的几种随后通过质谱测定的肽测序进行鉴定。在由PR65TAP复合物鉴定的蛋白质中是催化亚单位(PP2Ac)和PP2A B亚单位，从而验证了该方法(图1B)。此外，能够鉴定KIAA1524作为新型假定的PP2A相关蛋白质。KIAA1524是具有先前未鉴定的细胞功能的90kDA细胞质蛋白质(图2)(Soo Hoo等人，2002)。下文呈现的结果鉴定KIAA1524为在癌症中特异性上调的PP2A的内源性抑制剂。
来自PR65免疫共沉淀分析的结果显示内源性KIAA1524与内源性PR65和PP2Ac相互作用(图1C)。为了鉴定KIAA1524中介导KIAA1524和PP2A复合物之间的蛋白质-蛋白质相互作用的区域，已构建了编码KIAA1524缺失突变体的一系列cDNA构建体。为此，将一系列Flag标记的KIAA1524缺失构建体瞬时转染到HeLa细胞内48小时，随后与抗Flag抗体一起免疫沉淀。KIAA1524突变体和PP2A复合物之间的相互作用通过PR65亚单位的蛋白质印迹分析进行评估。Flag-KIAA1524野生型(KIAA1524wt)(图2A)构建体的免疫沉淀揭示与内源性PR65蛋白质明确的相互作用(图1D和3A)。相互作用在低(150mM NaCl)或中等(300mM NaCl)严格条件下发生。然而，缺乏461-533之间的氨基酸的KIAA1524的突变体(KIAA1524mut)(图2A)显示与PR65极大减少的相互作用(图1D和3A)。KIAA1524mut是证实在任一严格条件下与PR65受损的结合的11种缺失突变体中唯一的突变体。
接下来研究来自用KIAA1524wt或KIAA1524mut构建体连同HA-PP2Ac共转染的细胞的PP2Ac和KIAA1524的共定位。如图1E中所示，转染细胞的共焦图像分析揭示与PP2Ac和KIAA1524wt的共定位，而对于PP2Ac和KIAA1524mut未观察到共定位(图1E)。为了研究KIAA1524在PP2A功能调节中的作用，使用小干扰RNA(siRNA)oligos抑制HeLa细胞中的KIAA1524表达。重要的是，如由PP2Ac免疫沉淀物测量的，KIAA1524表达经由siRNA刺激的PP2A磷酸酶活性的耗尽(图1F)。总之这些结果证实KIAA1524与培养细胞中的PP2A复合物相互作用且抑制PP2A复合物的催化活性。此外，数据显示相互作用在中等离子强度下是稳定的，和KIAA1524的氨基酸461-533包含KIAA1524的PP2A相互作用结构域。
KIAA1524促进c-Myc蛋白质稳定性
为了探测KIAA1524的未表征的细胞功能，在72小时后比较乱序的和KIAA1524siRNA转染的HeLa细胞的全基因组基因表达谱。值得注意的是，在 Human-6 Expression BeadChip(IlluminaInc.)中包括的仅小部分基因(26091个中的76个)显示在乱序的和KIAA1524 siRNA转染的细胞之间在其表达水平中可再现和统计上显著的(p<0.05，数据未显示)差异(图1F)。PP2A活性已显示调节2种转化相关转录因子p53和c-Myc的活性。为了表征与KIAA1524耗尽细胞的转录谱相关的这2种转录因子，受KIAA1524耗尽影响的76种基因的列表与对于p53和c-Myc公开的靶基因数据库进行比较。基于p53靶基因数据库(http://p53.bii.a-star.edu.sg/aboutp53/targetgene/index.php)，受KIAA1524耗尽影响的仅1/76基因已公开在其启动子中具有p53结合位点或通过p53转录调节。然而，当与c-Myc靶基因数据库(http://www.myc-cancer-gene.org/site/mycTargetDB.asp)比较时，受KIAA1524耗尽影响的16％(12/76)基因发现在其启动子区结合c-Myc。这些发现连同公开的c-Myc蛋白质稳定性的PP2A调节作用，暗示KIAA1524可能调节c-Myc功能。
如上所述，病毒小t抗原通过保护c-Myc丝氨酸62不受PP2A介导的去磷酸化导致c-Myc蛋白质的稳定。为了研究KIAA1524的耗尽是否调节c-Myc表达，通过来自用KIAA1524或乱序的(Scr.)siRNA转染的细胞的蛋白质印迹检查c-Myc稳态蛋白质水平。KIAA1524 siRNA处理导致c-Myc蛋白质表达的明确下调，而c-Myc mRNA表达水平在相同样品中不改变(图4A和4B)。这暗示KIAA1524转录后调节c-Myc蛋白质水平。事实上，KIAA1524耗尽对内源性c-Myc蛋白质的半衰期的影响分析揭示，尽管在放线菌酮处理(100mg/ml)后1小时，在乱序的siRNA转染细胞中约40％的c-Myc蛋白质存在于细胞中，但KIAA1524耗尽显著减少c-Myc蛋白质稳定性。
KIAA1524抑制c-Myc相关的PP2A活性
上文结果证实KIAA1524与PP2A复合物相互作用且促进c-Myc稳定性。为了研究KIAA1524是否真正抑制c-Myc相关的PP2A活性，使用6，8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸盐作为底物对来自乱序的和KIAA1524siRNA转染细胞的c-Myc免疫沉淀物实施体外PP2A测定法(Pastula等人，2003)。重要的是，经由siRNA的KIAA1524耗尽显著增加c-Myc免疫沉淀物中的PP2A活性(图4C)。有趣的是，免疫沉淀物的分析进一步揭示PP2Ac和c-Myc彼此组成性复合，和KIAA1524的耗尽对c-Myc-PP2Ac相互作用没有影响(图4D)。这些结果一起证实KIAA1524抑制c-Myc-PP2A复合物中的PP2A活性且阻止c-Myc的蛋白水解降解。
来自细胞提取物的c-Myc和KIAA1524的免疫共沉淀证实这些蛋白质之间的物理关联(图4D)，但未揭示KIAA1524和c-Myc之间的相互作用是否是直接的。为了进一步表征KIAA1524与c-Myc的相互作用，纯化的Flag-KIAA1524蛋白质在体外蛋白质-蛋白质相互作用测定法中与c-Myc的重组GST-融合的氨基末端部分(aa.1-262)一起使用。发现Flag-抗体树脂免疫共沉淀重组Flag-KIAA1524和GST-Myc，而Flag-KIAA1524不与单独的GST免疫共沉淀(图5A)，证实KIAA1524与c-Myc氨基末端直接结合。有趣的是，KIAA1524不与对应氨基酸1-120的GST-c-Myc缺失免疫共沉淀(图5A)。这些结果指出c-Myc中的KIAA1524相互作用结构域为c-Myc上的氨基酸120-262(图5B)。
这些实验一起提供了KIAA1524抑制c-Myc相关的PP2A活性的可靠的生物化学证据。此外，KIAA1524与c-Myc氨基末端的直接结合提供关于观察到的KIAA1524针对c-Myc相关PP2A活性的选择性的最可行解释。
KIAA1524是肿瘤生长所需的
为了研究KIAA1524在癌细胞行为调节中的作用，用KIAA1524siRNA转染HeLa细胞，且研究细胞培养和体内小鼠模型中的细胞增殖。KIAA1524在调节细胞增殖中的作用接下来通过HeLa细胞中的胸苷掺入测定法进行分析。与乱序的siRNA转染的细胞比较，KIAA1524耗尽导致细胞增殖在转染后72小时的显著抑制(图6A)。然而，KIAA1524siRNA转染在细胞DNA含量的FACS分析中不诱导亚G1部分(图6B)，它也不诱导PARP蛋白质的切割(图6C)，证实KIAA1524耗尽不诱导程序性细胞死亡。
为了评估KIAA1524对HeLa细胞的致瘤潜能的贡献，分析KIAA1524耗尽对这些细胞在单层上形成密集灶的能力，以及其以非停泊性方式生长的能力的影响。为了这个目的，首先研究在转染后10天KIAA1524耗尽经由siRNA的单次转染的效率，且发现约50％的KIAA1524蛋白质表达在10天后仍是减少的。如细胞在琼脂上铺板后10天测量的，KIAA1524耗尽在转染后10天消除HeLa细胞灶形成(图6D)，并且同样明确抑制在琼脂上的HeLa细胞非停泊性生长(图6E)。
为了评估KIAA1524在体内的致瘤作用，用KIAA1524或乱序的siRNA转染72小时的HeLa细胞皮下注射到无胸腺小鼠内，并且肿瘤生长通过测量可触及肿瘤的大小进行监控。重要的是，KIAA1524经由siRNA的耗尽减少了总体肿瘤大小(图6F)，且在第27天时导致肿瘤重量的显著抑制(图6G)。
总之，这些数据证实KIAA1524表达是关于转化的细胞表型的新型维持机制，和KIAA1524促进体内肿瘤生长。
KIAA1524在人恶性肿瘤中过量表达
上文呈现的结果提供了KIAA1524抑制PP2A介导的c-Myc降解且促进癌细胞生长和增殖的证据。基于这些特征，KIAA1524可以是用于癌症治疗的新型药物靶。为了实现用于在癌症治疗中靶向的蛋白质的预期，KIAA1524应优选在人癌组织中过量表达。根据定量RT-PCR分析，KIAA1524mRNA在21种非恶性样品中的大多数中以极低水平表达(<1％的β肌动蛋白mRNA表达水平)，除了骨髓、前列腺、睾丸、小脑和脑外(图7A)。为了比较非恶性和恶性细胞之间的KIAA1524的蛋白质水平，不同细胞类型的全细胞裂解物对于KIAA1524进行免疫印迹。与图7A一致，极低水平的KIAA1524蛋白质在人表皮角化细胞(HEK)、非致瘤MEFs和永生化的NIH3T3小鼠成纤维细胞中进行检测。然而，KIAA1524蛋白质在HeLa细胞和HT-1080纤维肉瘤细胞中以高水平表达，指出KIAA1524表达可能与细胞的致瘤潜能相关。
此外，分析人头颈部鳞状细胞癌(HNSCC)中的KIAA1524表达水平。KIAA1524 mRNA的实时PCR分析显示与用作对照的正常人表皮角化细胞比较，KIAA1524在36种HNSCC细胞系中统计上显著的过量表达(图7B)。与来自机体相同来源的良性对照组织比较，KIAA1524 mRNA在HNSCC肿瘤活组织检查中也是过量表达的(图7C)。重要的是，与周围的间质细胞比较，HNSCC样品的免疫组织化学染色也证实KIAA1524在肿瘤细胞中的较高表达(图7D)。
最后，为了研究KIAA1524是否也调节衍生自HNSCCs的原发性癌细胞系中的c-Myc蛋白质水平，3种不同的HNSCC细胞系用KIAA1524siRNA进行转染，且通过蛋白质印迹就c-Myc表达进行分析。如图7E中所示，KIAA1524耗尽在检查的所有细胞系中导致c-Myc蛋白质水平的明确下调。重要的是，c-Myc免疫沉淀物的分析揭示KIAA1524耗尽也增加HNSCC细胞系中的c-Myc相关的PP2A磷酸盐活性。
为了检查KIAA1524在HNSCC细胞增殖调节中的作用，对UT-SCC-7和UT-SCC-9细胞系实施KIAA1524 siRNA转染，并且这些细胞系的密集灶形成监控10天。在2种细胞系中，KIAA1524的耗尽导致灶形成中的显著减少。重要的是，在转染后21天KIAA1524耗尽还显著减少UT-SCC-7和UT-SCC-9细胞在软琼脂中的非停泊性生长。与KIAA1524siRNAs在HeLa细胞中证实的特异性一致，2种独立的KIAA1524 siRNAs产生UT-SCC-9细胞的软琼脂生长中类似的抑制。
最后，为了评估KIAA1524对于UT-SCC细胞的体内肿瘤生长的作用，用KIAA1524或乱序的siRNAs转染的UT-SCC-7和UT-SCC-9细胞注射到SCID小鼠背部内。与这个工作中呈现的指出KIAA1524对于恶性细胞生长和肿瘤进展的重要性的所有其他数据一致，分别用KIAA1524 siRNA转染的UT-SCC-7和UT-SCC-9细胞注射的5只中的3只和6只小鼠中的2只在第65天实验终止时发展可触及的肿瘤。此外，与乱序的siRNA转染的细胞比较，KIAA1524 siRNA减少具有2种UT-SCC细胞的肿瘤的平均大小。
为了证实上述结果限制于HNSCC，通过RT-PCR分析来自43种人结肠癌样品和来自正常结肠的5种对照样品的KIAA1524表达。与HNSCC数据一致，与对照组织比较，KIAA1524 mRNA在人结肠癌组织中显著过量表达(图8A)。
此外，与非侵袭性II期肿瘤或对照结肠组织比较，与结肠癌肿瘤分期的KIAA1524 mRNA表达的比较揭示KIAA1524表达在侵袭性III期和IV期肿瘤中明显更高(图8B)。用于分析的组织样品的肿瘤分期先前已通过标准病理学标准进行测定。
为了研究KIAA1524是否是过量表达的，除了HNSCC和结肠癌外，还在乳腺癌样品中，KIAA1524表达在159种先前表征的人乳房肿瘤和正常乳腺样品中进行评估(Come等人，2006)。重要的是，当与正常组织比较时，发现KIAA1524在人乳房肿瘤中显著过量表达(图9A)。当比较乳腺癌亚型之间的KIAA1524表达时，KIAA1524的过量表达在所有3种侵袭性乳房癌亚型，浸润性导管癌(IDC)、浸润性小叶癌(ILC)和IDC与导管内粉刺状癌(IDC+ICC)中发现(图9B)。作为对照，其为具有良好预后的乳房肿瘤的粘液癌呈现与正常乳腺相似的KIAA1524 mRNA表达，统计上低于浸润癌(图9B)。
总之，这个结果证实KIAA1524促进肿瘤生长和癌细胞增殖，并且强烈指出c-Myc相关的PP2A活性的抑制是KIAA1524经由其发挥其细胞效应的至少一种分子机制。
材料与方法
抗体
关于KIAA1524的兔多克隆抗体已得到公开(Soo Hoo等人，2002)(由Dr.Chan，University of Florida慷慨提供)。关于PP2Ac、PR65、Flag、HA、GST、PARP、c-Myc和肌动蛋白的抗体得自Santa Cruzbiotechnologies inc。
质粒构建体
PR65TAP-标记载体PR65 α由pRC/CMV.HA PR65a(来自Dr.BrianA.Hemmings，Friedrich Miescher-Institut，Basel，Switzerland的慷慨赠予)进行PCR扩增，且使用XhoI和BamHI位点克隆到TAP载体，JW16(Westermarck等人，2002)内。Flag-KIAA1524wt构建体用PCR由公开的KIAA1524全长cDNA(Soo Hoo等人，2002)(由Dr.Chan，University of Florida慷慨提供)进行构建。Flag-KIAA1524mut cDNA构建体用PCR使用下述oligos由质粒Flag-KIAA1524wt进行构建：5-Ttaatagagaaacttcagtctggaatg(SEQID NO.80)和5-Gtggtaaaggatcagatttgtgatgtgaga(SEQ ID NO.81)。所有克隆其后通过DNA测序进行验证。
患者样品
知情同意后，肿瘤样品由1990-2002年间在Turku UniversityCentral Hospital中来自HNSCC的手术去除肿瘤进行收集。正常样品由经历用于HNSCC研究的悬雍垂腭咽成形术的患者进行收集。样品由29-87岁大的2种性别进行收集。
KIAA1524在结肠癌和正常结肠组织中的表达通过使用TissueScan Real-Time Colon Cancer(HCRT101)cDNA实验对象组(Origene)进行检查，其包含来自结肠癌的43种样品(31-93岁的2种性别)和正常结肠组织的5个样品(37-91岁的2种性别)。由21种不同的正常人组织提取的总RNA得自BD Biosciences(Palo Alto，CA)，并且是来自Prof.Klaus Elenius，University of Turku，Finland的友情赠予。样品由来自单个患者的RNA提取(小脑、脑、心脏、肝和肺)或来自2-84个患者合并的RNA提取(肾上腺、骨髓、肾、胎盘、前列腺、唾液腺、骨骼肌、脾脏、胸腺、甲状腺、气管、子宫、结肠、小肠和乳腺)组成。
KIAA1524在乳腺癌和正常乳房组织中的表达通过使用先前描述的组织样品进行检查(Come等人，2006)。
细胞培养
人SCC细胞系由头颈部SCCs的原发性肿瘤(UT-SCC-8)、再发性肿瘤或转移灶(UT-SCC-7，UT-SCC-9)建立。SCC细胞在补充有6nmol/l谷氨酰胺、非必需氨基酸、100U/ml青霉素、100mg链霉素和10％胎牛血清(FCS)的DMEM中培养。正常人表皮角化细胞在补充有
(Cambrex Bioscience；Walkersville，MD，USA)的Keratinocyte Basal Medium 2
中培养。所有其他细胞系，包括HT-1080、HeLa和HK293在补充有100U/ml青霉素、100mg链霉素和10％FCS的DMEM中培养。
瞬时转染和siRNA处理
亚融合细胞使用FuGene 6 Transfection试剂(Roche)根据制造商的说明书进行瞬时转染。对于siRNA处理，细胞生长至80％融合，和培养基用不含补充物的DMEM替换。双链RNA寡核苷酸(乱序的：5′-UAACAAUGAGAGCACGGCTT-3′(SEQ ID NO.82)和5′-CCUACAUCCCGAUCGAUGAUGTT-3′(SEQ ID NO 83)；KIAA1524：5′-CUGUGGUUGUGUUUGCACUTT-3′(SEQ ID NO.84)和5′-ACCAUUGAUAUCCUUAGAATT-3′(SEQ ID NO 6)；IBA)用OligofectamineTM试剂(Invitrogen)进行制备且加入细胞中。4-6小时温育后，培养基平衡至10％FCS且siRNA处理延伸合适的时间长度。
RNA分离和cDNA合成
总RNA使用TRIzol试剂(Invitrogen)根据制造商的方案从培养细胞中提取。使用酸-胍硫氰酸盐-酚-氯仿法从临床肿瘤样品中提取RNA。为了消除可能的污染DNA，RNA样品用5单位DNA酶I(Roche)进行处理。cDNA根据制造商的方案在25μl的总体积中在反应中进行合成，所述反应包含1μg总RNA作为模板、0.5μg随机六聚物和200单位Moloney鼠白血病病毒RNA酶H minus逆转录酶(两者都来自Promega；Madison，WI，USA)，。
免疫荧光
用HA-PP2Ac和Flag-KIAA1524 cDNA构建体转染后24小时，在玻璃盖玻片上培养的HeLa细胞进行渗透化处理且在PTEMF(100mMPipes(pH 6.8)、10mM EGTA、1mM MgCl2、0.2％ Triton X-100和4％甲醛)中固定10分钟。用PBS洗涤3次后，非特异性抗体结合用溶于PBS的3％ BSA阻断30分钟。盖玻片随后与HA和Flag标记特异性抗体一起在RT下在溶于PBS的2％ BSA中温育1小时。3次洗涤后，结合抗体通过与Cy3和Cy2以及缀合的次级抗体(JacksonImmunoResearch)一起在室温下温育1小时得到显现。用PBS洗涤3次后，盖玻片在50％甘油、PBS和2％ w/v DABCO(Sigma-Aldrich)中固定。对于共定位分析，图像使用共聚焦激光扫描显微镜(LSM 510，Carl Zeiss Inc.)来获得。
免疫沉淀和磷酸酶测定法
Protein G-Sepharose珠在20mM HEPES-KOH pH 7.5、300mM NaCl、0.25mM EGTA、1.5mM MgCl2、0.25％ NP-40、蛋白酶抑制剂(Roche)、10mM b-磷酸甘油和0.5mM DTT中与PR65、PP2Ac、c-Myc抗体或与对照免疫前血清一起在杯子上于4℃搅拌2小时。Flag-KIAA1524突变体的免疫沉淀通过使用Flag抗体树脂(M3，Sigma)来进行。其后，沉淀的珠与细胞裂解物混合且在4℃温育过夜。其后沉淀的珠用50mMTris-HCl pH 7.4、150mM NaCl、0.3％ NP-40和0.5mM DTT洗涤4次，和结合的蛋白质通过蛋白质印迹使用True-blot次级抗体进行分析。对于磷酸酶测定法，免疫复合物保留在珠上且将等量的珠加入磷酸酶测定法中，根据制造商的说明使用Protein Serine/ThreoninePhosphatase Assay试剂盒与6，8-二氟-4-甲基伞形酮磷酸盐(DiFMUP)底物(Molecular Probes，Eugene，Oregon USA)。
为了研究KIAA1524和c-Myc之间的直接相互作用，如先前描述的(Nordlund等人，2005)，Flag-KIAA1524在昆虫细胞中进行杆状病毒表达且通过Flag-抗体树脂(M3，Sigma)亲和纯化至同质性。对于相互作用测定法，Flag-KIAA1524蛋白质通过使用低pH条件从Flag-Ab珠中洗脱。这种KIAA1524蛋白质的纯度和数量在每个步骤中通过SDS-page凝胶和考马斯染色进行分析。在KIAA1524制剂中未鉴定其他污染蛋白质。GST蛋白质根据标准方案细菌产生且亲和纯化，和GST-Myc 1-262购自Santa Cruz Inc。Pull-down测定法通过使固定在抗Flag M3树脂(Sigma)上的1μg Flag-KIAA1524与摩尔当量的可溶性GST-c-Myc和GST蛋白质在0.5ml缓冲液中温育来进行，所述缓冲液包含20mM Tris(pH 7.4)、0.2mM EDTA、0.1M NaCl、0.5mM DTT和Complete蛋白酶抑制剂(Roche)。KIAA1524蛋白质制剂中昆虫PP2A的缺乏通过磷酸酶测定法加以控制。抗Flag M3树脂在所有实验中用作对照蛋白质。结合蛋白质在补充有0.2％ NP-40的结合缓冲液中进行洗涤，且随后在样品缓冲液中煮沸，溶解于SDS-PAGE中并且用GST和KIAA1524抗体进行免疫印迹。
定量逆转录PCR分析
cDNA样品的定量实时逆转录PCR(RT-PCR)分析用使用PrimerExpress软件(PE Biosystems)设计的特异性引物和荧光探针来进行，以特异性定量KIAA1524和β-肌动蛋白mRNA的水平。引物和探针的序列显示于下文：
KIAA1524：
探针：att gct cag cat cgc tgt caa aga act ca(SEQ ID NO.85)
正向：aag ctc tag ccc ttg cac agg SEQ ID NO.86)
反向：gtc cgt gcc tct gtt tca gc(SEQ ID NO.87)
β-肌动蛋白：
探针：atg ccc tcc ccc atg cca tcc tgc gt(SEQ ID NO.88)
正向：tca ccc aca ctg tgc cca tct acg c(SEQ ID NO.89)
反向：cag cgg aac cgc tca ttg cca atg g(SEQ ID NO.90)
PCR在包含300nM引物(Medprobe)、200nM of 5′6-FAM(PEBiosystems)、12.5μl TaqMan通用PCR Master Mix(PE Biosystems)和0.5μl模板cDNA的溶液中以25μl的终体积来进行。热循环用ABI PRISM 7700 Sequence Detector(PE Biosystems)来进行。循环以于50℃2分钟和于95℃10分钟起始，随后为于95℃15秒和于60℃1分钟的40个循环。特异性PCR产物的积聚作为荧光中的增加进行实时检测。观察到的荧光针对循环数目描绘，以产生扩增曲线且测定CT值，即在其上荧光信号超过CT值0.05相对荧光单位的循环数目。CT值的每次测定一式两份地完成，且用由相同样品的β-肌动蛋白表达的同时一式两份测量的CT值进行标准化。2个平行CT值之间的范围是<5％的所有测量中的平均值。分析的基因(靶基因)的相对表达使用下式进行评估：相对表达＝2-ΔCT，其中ΔCT＝CT(靶基因)-CT(β-肌动蛋白)。mRNAs的数量表示为在将相对靶基因表达乘以因子100后β-肌动蛋白mRNA的数量百分比。
软琼脂生长、灶形成和小鼠中的肿瘤形成
对于在软琼脂中的灶形成测定法和非停泊性生长，HeLa细胞进行胰蛋白酶消化且在siRNA处理48小时后在10cm平板上种植至4 x 105细胞。软琼脂测定法如文献中所述在包含10％FBS的培养基中进行。9天后温育培养物进行双盲照相。活集落形成细胞的数目由显微镜检查图像(x5放大率)进行测量。来自每个视野图像的集落的数目和大小使用来自NIH(http://rsb.info.nih.gov/ij/)的ImageJ 1.33u软件进行分析。非停泊性集落根据200-10,000像素之间的数目进行分类。
对于MEFs中的灶形成测定法，200或500个逆转录病毒转导的MEFs细胞与作为饲养者的8.3 x 105NI H3T3细胞/孔在6孔板中进行铺板。细胞生长1-2周。甲醇固定的细胞用Giemsa进行染色。计算每100个感染细胞的灶数目。
对于小鼠实验，将3 x 106转染细胞皮下注入免疫妥协小鼠的侧腹。肿瘤形成其后每第3天通过触诊进行评估，并且可触及肿瘤的大小通过精密仪器进行测量。实验在第28天时终止。使用小鼠的所有实验根据建立的动物管理指导和芬兰Turku大学的动物试验评审委员会的允许来进行。
蛋白质印迹分析
通过SDS-PAGE凝胶电泳的蛋白质分离后，将蛋白质转移至Immobilo-P膜(Millipore；Billerica，MA，USA)。与初级和次级抗体一起温育后，免疫印迹蛋白质通过增强化学发光(ECL；AmershamBiosciences)进行显现。
免疫组织化学
关于KIAA1524的石蜡包埋的肿瘤切片和对照组织切片的免疫染色使用在PBS中1:100稀释的p90抗体(Soo Hoo，等人，2002)来进行。免疫染色用与二氨基联苯胺(DAB)组合的抗生物素蛋白-生物素-过氧化物酶复合物技术(VectaStain；Vector Labs；Burlingame，CA，USA)来完成，且用苏木素进行复染。
用于串联亲和纯化的裂解物的制备
稳定表达PR65TAP蛋白质的HT-1080细胞用磷酸盐缓冲盐水(PBS)进行洗涤，且重悬浮于缓冲液A(10mM Hepes pH 7.9、10mM KCl、0.1mM EDTA、0.1mM EGTA、1.5mM MgCl2、Complete ProteaseInhibitor、20mM b-磷酸甘油、25mM NaF、0.5mM PMSF和0.5mMDTT)中。细胞在冰上进行温育、涡旋且随后在3900rpm下离心3分钟，以获得细胞质裂解物。提取物随后进行调整以包含与IgG结合缓冲液(IBB；10mM Tris HCl pH 8.0，150mM NaCl，0.2％ NP-40，0.5mM DTT)相似水平的NaCl和NP-40。随后将调整的提取物装载到用IBB洗涤的包含IgG sepharose 4 Fast Flow(Amersham)的层析柱(BioRad)上。在经过3×10ml的IBB洗涤后将提取物在4℃温育4小时，珠随后在TEV切割缓冲液(TCB；10mM TrisHCl pH 8.0、150mM NaCl、0.3％ NP-40、0.5mM EDTA和0.5mM DTT)中与重组烟草蚀纹病毒蛋白酶(TEV)于4℃温育过夜。钙调蛋白珠(Startagene)在层析柱中用钙调蛋白结合缓冲液(CBB；10mM b-巯基乙醇、50mM Tris HCl pH 8.0、150mM NaCl、1mM Mg-乙酸盐、1mM咪唑、2mM CaCl2和0.2％ NP-40)进行洗涤。随后从柱中回收TEV洗脱物且就与钙调蛋白珠的结合进行调整(对于每1ml洗脱物4ml 1 M CaCl2和3ml CBB)。调整的洗脱物于4℃温育2小时，且随后用CBB洗涤3 x 10ml。与钙调蛋白珠结合的蛋白质随后用钙调蛋白洗脱缓冲液(CEB；10mM b-巯基乙醇、10mM Tris HClpH 8.0、150mM NaCl、1mM Mg-乙酸盐、1mM咪唑、5mM EGTA和0.2％ NP-40)进行回收或在SDS加样缓冲液中煮沸。
质谱测定的蛋白质鉴定
如先前所述目的蛋白质条带从凝胶中切割、还原、烷基化且用胰蛋白酶消化过夜。提取的肽通过LC-MS/MS在与纳米流HPLC系统(LCPackings，San Francisco，CA，USA)偶联的杂交线性离子肼仪器(Q-Trap，Applied Biosystems，Framingham，MA，USA)上进行表征。所得到的肽片段谱使用Mascot针对综合非冗余蛋白质数据库进行搜索。最低限度3个匹配的胰蛋白酶肽是鉴定每种蛋白质所需的，和必要时正确的碎片离子分配通过人工检查得到保证。
基因表达分析
由用乱序的或KIAA1524 siRNA转染后72小时的HeLa细胞提取的总RNA通过 Human-6 Expression BeadChip阵列(IlluminaInc.)就全基因组基因表达谱进行分析。cDNA扩增、标记和杂交根据制造商的说明书和在Finnish DNA Microarray Centre(Centre forBiotechnology，University of Turku and 
Akademi University，Turku，Finland)的标准操作来完成。得自阵列的数据通过Bioinformatics核心实验室个人在Centre for Biotechnology，University of Turku and 
Akademi University，Turku，Finland进行分析。与乱序的siRNA转染的细胞比较，根据2个实验中的表达水平中至少log 0.5改变的标准过滤其表达响应KIAA1524耗尽显著改变的列出的76种基因。
统计方法
对于图6G、8A、8B、9A和9B，统计显著性通过曼-惠特尼U检验进行测定，和对于显示统计分析的所有其他实验，它通过斯氏t检验来进行。
应当理解本发明的方法可以以各种实施方案的小形式引入，其中仅少数公开于本文中。对于本领域技术人员显而易见的是存在其他实施方案且不背离本发明的精神。因此，所描述的实施方案是举例说明性的且不应解释为限制性的。
参考文献
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序列表
<110>Westermarck，Jukka
Puustinen，Pietri
Junttila，Melissa
<120>生长刺激蛋白质的用途
<130>2062658PC
<160>90
<170>PatentIn version 3.2
<210>1
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Claims (29)
1.用于筛选和鉴定抑制KIAA1524的治疗剂的方法，所述方法包括下述步骤
a)提供固定在反应室中的第一种蛋白质，
b)向所述室中同时或以任何次序相继加入候选试剂和标记的第二种蛋白质，
c)测定所述第一种蛋白质是否与所述第二种蛋白质结合，和
d)当步骤c)中的所述测定是阴性时，鉴定所述候选试剂为抑制KIAA1524的治疗剂，
其中所述第一种蛋白质是KIAA1524，和所述第二种蛋白质选自PP2A、其亚单位和c-Myc，或反之亦然。
2.根据权利要求1的方法，其中所述第二种蛋白质用选自荧光标记、发光标记和色度标记的标记进行标记。
3.根据权利要求1的方法，其中所述步骤c)通过平板阅读器来进行。
4.小干扰RNA，其包含选自SEQ ID NO：2-6的核苷酸序列，且抑制KIAA1524。
5.肽，其包含选自SEQ ID NO：7-30、32-79或其保守序列变体中的至少一个氨基酸序列，且抑制KIAA1524。
6.根据权利要求5的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：32-79及其保守序列变体的1-20个连续的序列。
7.根据权利要求5的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：7-30及其保守序列变体的1-20个连续的序列。
8.用于生产药物组合物的方法，所述方法包括鉴定抑制KIAA1524的试剂和使所述试剂与任何合适的药学上可接受的赋形剂混合。
9.根据权利要求8的方法，其中所述鉴定通过根据权利要求1的方法来进行。
10.药物组合物，其根据权利要求8生产、或包含根据权利要求4的siRNA、或根据权利要求5-7中任一项的肽。
11.抑制有此需要的人或动物患者中的KIAA1524的方法，其通过施用治疗有效量的根据权利要求10的药物组合物。
12.根据权利要求11的方法，其中所述患者患有选自癌症及其他高度增生性疾病的疾病。
13.根据权利要求12的方法，其中所述癌症选自头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌和结肠癌。
14.根据权利要求12的方法，其中所述高度增生性疾病选自牛皮癣、心肌肥大和良性瘤。
15.抑制KIAA1524的试剂用于制备用于治疗、预防和/或改善选自癌症及其他高度增生性疾病的疾病的药物组合物的用途。
16.根据权利要求15的用途，其中所述癌症选自头颈部鳞状细胞癌、乳腺癌和结肠癌。
17.根据权利要求15的用途，其中所述高度增生性疾病选自牛皮癣、心肌肥大和良性瘤。
18.根据权利要求15的用途，其中所述试剂是反义寡核苷酸、小干扰RNA(siRNA)或核酶。
19.根据权利要求18的用途，其中所述siRNA选自SEQ ID NO：2-6。
20.根据权利要求15的用途，其中所述试剂通过抑制所述KIAA1524蛋白质与PP2A复合物或与转录因子c-Myc的相互作用来阻止或抑制细胞增殖和生长，或其中所述试剂抑制不依赖于KIAA1524与PP2A或c-Myc相互作用的KIAA1524增殖和生长效应。
21.根据权利要求15的用途，其中所述试剂是肽、小分子、抗体或适体。
22.根据权利要求21的用途，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：7-30、32-79及其保守序列变体中的至少一个氨基酸序列。
23.根据权利要求22的用途，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：32-79及其保守序列变体的1-20个连续序列。
24.根据权利要求22的肽，其中所述肽包含选自SEQ ID NO：7-30及其保守序列变体的1-20个连续序列。
25.根据权利要求根据权利要求15的用途，其中所述试剂在KIAA1524上的第461到第533位氨基酸的区域或任何其它区域中灭活KIAA1524，所述其它区域参与PP2A复合物和KIAA1524蛋白质之间的相互作用。
26.用于确定怀疑患有癌症的哺乳动物中的恶性改变的侵袭性的方法，所述方法包括
a)评估取自所述哺乳动物的、被怀疑包含恶性细胞的样品中的KIAA1524表达水平，
b)使来自步骤a)的所述表达水平与非恶性对照样品中的KIAA1524表达水平相比较，和
c)当所述样品中的KIAA1524表达水平明显高于非恶性对照样品中的KIAA1524表达水平时，确定所述恶性改变为侵袭性的。
27.根据权利要求26的方法，其进一步包括当所述样品中的KIAA1524表达水平高于非恶性对照样品或非侵袭性I和II期样品超过2倍时，确定所述恶性改变为III或IV期。
28.根据权利要求27的方法，其中所述癌症是结肠癌。
29.根据权利要求26的方法，其进一步包括当所述样品中的KIAA1524表达水平高于非恶性对照样品超过2倍时，区分选自浸润性导管癌(IDC)、浸润性小叶癌(ILC)和IDC与导管内粉刺状癌(IDC+ICC)的浸润性肿瘤类型与非浸润性肿瘤类型。
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