CN103484463A

CN103484463A - 一种沉默人c2orf68基因的shRNA及其医药用途

Info

Publication number: CN103484463A
Application number: CN201310412332.6A
Authority: CN
Inventors: 陈尧; 蒋婷婷
Original assignee: Sichuan University
Current assignee: Sichuan University
Priority date: 2013-09-12
Filing date: 2013-09-12
Publication date: 2014-01-01

Abstract

本发明涉及一种抑制c2orf68基因表达的shRNA及其在医药方面的应用，本发明提供的shRNA片段特异性干扰c2orf68基因，如序列表中SEQIDNO.1所示，靶序列为c2orf68的第460~478位，其脱氧核酸见序列表中的SEQIDNO.3，针对靶序列设计的shRNA的核苷酸为序列表中SEQIDNO.2。本发明通过实验证明，利用shRNA转染结直肠癌细胞，细胞中c2orf68的mRNA转录水平降低，同时，干扰c2orf68后抑制结直肠癌细胞增殖和促进凋亡。因此，针对c2orf68的shRNA可应用于制备抑制结肠癌生长的药物，为治疗结直肠癌新药的开发提供新的途径。

Description

一种沉默人c2orf68基因的shRNA及其医药用途

技术领域

本发明涉及生物医药技术领域，具体为一种能降低c2orf68基因表达的shRNA序列；以及利用该shRNA序列对c2orf68基因特异性干扰后抑制结直肠癌细胞增殖和凋亡。

背景技术

结直肠癌是人类较为常见的恶性肿瘤之一，其发生、发展是一个多基因改变，多阶段致癌的复杂过程，包括癌基因的激活、抑癌基因的失活或缺失、错配修复基因的突变等。最近几年调查显示，结直肠癌的发病居消化道恶性肿瘤的第二位，在我国发病率较高，而且呈现逐年增高的趋势。因此，研究结直肠癌发病相关的基因，可以为结直肠癌的分子诊断、治疗及预后提供潜在有效靶标。

RNA干扰（RNA interference, RNAi）是指双链RNA（double-strand RNA,dsRNA）在细胞内特异性地诱导与之同源互补的mRNA的降解，使相应的基因的表达关闭，从而引发基因转录后水平的沉默现象。RNAi技术具有高度的特异性、沉默效率高、转化效率高等优点，该技术广泛应用于功能基因组的研究领域。利用短发卡shRNA来抑制特定基因的表达，由此可以用于制备治疗结直肠癌的药物。

发明内容

本发明的目的是提供一种新型的短发夹shRNA，并证明所述shRNA片段可在制备治疗结直肠癌的药物中应用。

人c2orf68基因已在GenBank注册，注册号NM_001013649.3，定位于2p11.2，全长4283bp，编码166个氨基酸，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：1所述。人c2orf68基因的组织表达谱分析显示：该基因在结直肠癌等胃肠肿瘤中均有表达。

本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点来源于序列表中SEQ ID NO：1所述的人c2orf68基因，是SEQ ID NO：1中第460位至478位核苷酸序列组成的基因片段，其核苷酸序列见序列表中SEQ ID NO：3。

本发明所述在人结直肠癌细胞中特异表达的RNA干扰靶点的短发夹shRNA由人工设计合成，其核苷酸序列为序列表中SEQ ID NO：2所述。

实验表明，将所述shRNA转染入人直肠癌细胞，shRNA片段作用于人c2orf68基因中的RNA干扰靶点可导致结直肠癌细胞的凋亡并抑制结直肠癌细胞的增殖，因此，本发明所述短发夹shRNA在制备治疗结直肠癌的药物中的应用。

附图说明

图1为荧光定量PCR实验中人c2orf68基因引物的标准曲线图。

图2为荧光定量PCR实验中人内参gapdh基因引物的标准曲线图。

图3为转染人结直肠癌细胞株SW480^-siRNA（转染干扰shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480）、SW480^-NC（转染阴性shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480）、空白对照组SW480（未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW480）的c2orf68基因表达的柱状图。

图4为转染人结直肠癌细胞株SW620^-siRNA（转染干扰shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620）、SW620^-NC（转染阴性shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620）、空白对照组SW620（未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株SW620）的c2orf68基因表达的柱状图。

图5为转染人结直肠癌细胞株LS174T^-siRNA（转染干扰shRNA片段的人结直肠癌细胞株LS174T）、LS174T^-NC（转染阴性shRNA片段的人结直肠癌细胞株LS174T）、空白对照组LS174T（未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株LS174T）的c2orf68基因表达的柱状图。

图6为流式细胞仪检测转染人结直肠癌细胞株LS174T^-siRNA（转染干扰shRNA片段的人结直肠癌细胞株LS174T）、LS174T^-NC（转染阴性shRNA片段的人结直肠癌细胞株LS174T）、空白对照组LS174T（未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株LS174T）的c2orf68凋亡图。

图7为流式细胞仪检测LS174T^-siRNA、LS174T^-NC、LS174T凋亡率柱状图。

图8为MTT实验LS174T^-siRNA、LS174T^-NC、LS174T三株细胞的生长曲线图。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明作进一步说明。下述实施例中，凡未注明具体实验条件的，均为按照本领域技术人员熟知的常规条件、实验室手册（New York:Cold Spring Harbor Laboratory Press,1989）中的条件、按照制造厂商所建议的条件。

实施例1：针对c2orf68基因shRNA的设计与合成：根据c2orf68基因全长mRNA序列，经分析设计，我们以c2orf68基因全长mRNA序列（GeneBank Accession Number:NM_001013649.3）第460~478位为靶位点，该片段有19个核苷酸，即序列表中的SEQ ID NO.3。根据shRNA引物设计原则，应用siRNA在线设计软件（http://www.anbion.com）设计特异性shRNA序列，其核苷酸序列见序列表SEQ ID NO.2，该合适的目标序列进行化学合成，委托广州锐博生物科技有限公司合成shRNA序列。

实施例2：shRNA的干扰效率实验

1、细胞培养

用胎牛血清的体积比为10%的 DMEM高糖培养基(从HyClone公司购买)于37℃、5% CO₂ 的细胞培养箱中培养人结直肠癌SW480、SW620、LS174T细胞株（SW480、SW620、LS174T从美国ATCC公司购买）至铺满培养瓶。

2、shRNA 转染结直肠癌SW480、SW620和LS174T细胞

2.1 分别取培养瓶中1/6人结直肠癌SW480、SW620和LS174T细胞接种于6孔细胞培养板的每一孔中；

2.2 24h后细胞培养板覆盖率约达 70％~80%，丢弃原培养基。将6孔板中的细胞用2ml DMEM高糖培养基(无血清，无抗生素)培养4h；

2.3 A液配置：5μl（20μmol/L）shRNA+250ul DMEM培养基(无血清，无抗生素)，混合均匀；

B液配置：Lipofectamine 2000(invitrogen公司)+250ul DMEM培养基(无血清，无抗生素)，混合均匀；室温静置5min；

C液配置：A液+B液,混合均匀，室温静置25min；

2.4丢弃细胞培养板内原有的培养基，每孔各加入新鲜的1.5ml DMEM高糖培养基 (无血清，无抗生素)；

2.5将C液逐滴逐滴的加入到培养板中，每孔各500μl；

2.6 将转染shRNA的SW480、SW620、LS174T细胞放入37℃、5% CO2细胞培养箱孵育；实验设置3个组，分别为实验组、空白对照组、阴性对照组；

2.7 6h后，弃细胞培养板内原有的培养基，每孔各加入2ml含10%胎牛血清的DMEM高糖培养基；放入37℃、5% CO2细胞培养箱孵育。

3、总RNA的提取

3.1 取转染shRNA片段48h后的结直肠癌SW480、SW620、LS174T细胞，加入TRIzol试剂（invitrogen公司）1ml，然后转移到1.5ml的Eppendorf管中，室温静置5min；

3. 2 加入0.2ml的氯仿，盖紧盖子，摇匀15秒左右，室温静置2-3min ，4℃离心机中离心(12000r/min，15min)；

3.3 将上清转移至新管（1.5ml的Eppendorf管）中，加入0.5ml的异丙醇，充分混匀，室温静置10min，4℃离心机中离心(12000g/min，15min)，弃上清，在管底部可见乳白色小沉淀物，即为RNA；

3.4 加入1ml 质量浓度75%的乙醇，混合震荡，4℃离心机中离心(7500g/min) 5min，弃上清，通风，室温中干燥5min，让乙醇挥发；然后加入50μl质量浓度0.1%的DEPC处理水溶解RNA；

3.5凝胶电泳和分光光度计检测浓度和纯度，保证每个样本的OD260/OD280的值在1.8~2.0之间，并通过琼脂糖电泳检测每个样本的28S及18S条带的灰度值来进一步严格控制RNA质量，并且每个样本的RNA均使用DNA酶进行处理以去除基因组污染。

4、cDNA第一链的合成

取总RNA样品1μg， Oligo dT 1μl入PCR反应管, 再加质量浓度0.1%的DEPC处理水至总体积12μl，65℃，反应5分钟，反应结束后取出置于冰上孵育2min，再加入缓冲液（Buffer ）4μl，RNA抑制剂1μl,，浓度10mmol/L 的dNTP 2μl, 逆转录酶1μl至总体积达到20μl，将混合液置于37℃反应60分钟，再于70℃反应5分钟，之后冰上冷却终止反应，-20℃保存。

5、荧光定量PCR实验

5.1 荧光定量PCR引物设计

根据人（Homo sapiens）c2orf68基因全长cDNA的开放读码框（Open Reading Frame, ORF）序列，设计荧光定量PCR所需引物。所用软件为Primer Premier 5.0及Olig6。保证PCR产物长度在100bp~250bp。引物设计好后，进一步在NCBI上通过BLAST比对验证引物的特异性是否良好。采用人（Homo sapiens）gapdh（脱氧核苷酸序列见NCBI数据库）作为内参，引物序列见下表。

表1 定量PCR 引物

5.2荧光定量PCR扩增

采用SYBR GREEN染料法来进行荧光定量PCR扩增，并根据荧光定量PCR试剂盒操作说明书（TakaRa company）控制实验规范性。依次取2μl的步骤4合成的cDNA模板、25μl的SYBR MIX（定量PCR试剂盒）、21μl的去核酸水、1μl的上游引物、1μl的下游引物，反应总体积50μl，然后放入eppendorf荧光定量PCR仪进行扩增，内参gapdh扩增斜率为-3.329，Y轴截距为25.38，扩增效率为1.00，相关系数为0.999。目的基因c2orf68扩增斜率为-3.397，Y轴截距为26.17，扩增效率为0.97，相关系数为0.999。分别检测实验组、空白对照组、阴性对照组c2orf68基因的mRNA的表达水平。

反应完毕后对实验结果进行分析，c2orf68的基因引物标准曲线图见图1，gapah基因引物标准曲线图见图2。实验结果表明，结直肠癌SW480细胞RNA干扰后， c2orf68基因表达水平比空白对照组下降50.95%（见图3）；结直肠癌SW620细胞RNA干扰后c2orf68基因表达水平比空白对照组下降59.31%（见图4）；结直肠癌LS174T细胞RNA干扰后c2orf68基因表达水平比空白对照组下降49.85%（见图5）。

实施例3：shRNA对人结直肠癌细胞株LS174T凋亡的影响

采用流式细胞术来检测LS174T细胞的凋亡情况。将处于生长指数期的LS174T细胞株，于6孔板中培养，24 h后细胞培养板覆盖率约达 70％～80%，然后进行转染，步骤同实施例2中的步骤1。每种细胞株分别设置三个组:实验组〔用脂质体Lipofectamine 2000(invitrogen公司)转染shRNA〕、阴性对照组〔用脂质体Lipofectamine 2000转染negative control-shRNA〕、空白对照组（转染时只加脂质体Lipofectamine 2000)。转染24h后，收集细胞，在离心机上以2000r/min离心5分钟，弃培养基，调整细胞浓度为 3×10⁵ 个/管。PBS洗涤细胞两次，用400μl结合缓冲液（凯基生物）重悬细胞，加入5μl Annexin V-FITC（凯基生物），混匀，室温反应 10 min，然后加入5μl Propidium iodide（PI）（凯基生物），4℃避光孵育30min。用流式细胞仪（BD FACSAriaⅡ Cell Sorter，美国）检测分析，每个样本收集10000个荧光信号。检测结果见图6，转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株LS174T^-siRNA，阴性对照细胞株LS174T^-NC,未转染shRNA片段的人结直肠癌细胞株LS174T的细胞凋亡率分别为18.13%,12.17%,11.83%，通过T检验发现实验组的凋亡率显著高于阴性对照组及空白对照组（P=0.037，P=0.044），而阴性对照组与空白对照组的凋亡率无明显差异(P=0.507）。实验结果表明，抑制c2orf68基因的表达能够明显促进结直肠癌细胞LS174T的凋亡。

实施例4：shRNA对结直肠癌细胞株LS174T增殖情况的影响

采用MTT实验来检测结直肠癌细胞LS174T的增殖情况。将处于生长指数期的LS174T细胞株，在96孔板中培养，调整细胞浓度为 1×10⁴ 个/孔，24 h后细胞培养板覆盖率约达 70％～80%，然后进行转染，步骤同实施例2中的步骤1。每种细胞株分别设置三个组:实验组〔用脂质体Lipofectamine 2000(invitrogen公司)转染shRNA〕、阴性对照组〔用脂质体Lipofectamine 2000转染negative control-shRNA〕、空白对照组（转染时只加脂质体Lipofectamine 2000)，每组设6个孔。分别于转染后6h,12h,24h,36h,48h 在每个反应孔加入15ulMTT (5mg/ml,用PBS配制，过滤除菌)，继续孵育4h。吸弃原液，加入150ul DMSO。37℃孵育15min后用酶标仪检测各孔 490 nm波长处的吸光值（OD），用各组吸光值的均值表示细胞的增殖情况。检测结果见图8。

MTT实验显示：干扰24小时以后，与空白对照组及阴性对照组相比，实验组LS174T细胞株出现明显的增殖抑制，在LS174T中抑制率为21.2%(P=0.002)，说明抑制c2orf68基因的表达能够明显抑制结直肠癌细胞LS174T的增殖。

四川大学

一种沉默人c2orf68基因的shRNA及其医药用途

3

Patent In version 3.2

1

4283

DNA

人

1

gcggagctct gtgggcgggt ggctgttgtt ggggccgtcg aggcggcggc gactctgcgt 60

ccccggctcc tgatggaggc ggggccgcat ccccggccgg ggcactgctg caagcctggg 120

gggcggctgg acatgaacca cggcttcgtg caccatatcc gacggaacca gatcgctcgg 180

gacgactatg acaagaaggt gaagcaggcg gccaaggaga aggtgaggag gcggcacacg 240

cccgcgccga cgcggccccg caagccagac ctgcaggtgt acctgccgcg acaccgagat 300

gtctctgccc acccacgcaa cccagactat gaagagtccg gtgaaagcag cagtagtgga 360

ggctctgagc tggagccttc tggccatcag ctcttctgct tagaatacga ggcagacagt 420

ggagaggtca catcagttat cgtctatcag ggtgatgac ccaggaaaggt gagtgagaag 480

gtgtcggcac acacgcctct ggatccaccc atgcgagaag ccctcaagtt gcgtatccag 540

gaggagattg caaagcgcca gagccaacac tgaccatgtt gaaggcgttc tctccaggct 600

ggattcactg cactcggaag aattctgccc agggaattta gtgtgggggt accaggacca 660

gtttgtctga tcttgagacc cccagagctg ctgcatccat agggtgttgc aggactacac 720

ctggcctgcc ttgcagtcat tctttcttat atgttgaccc atttgcccag cctgatattc 780

tggaattctt tttttttttt tttttttttt ttttttgagg attttgtgtg gctaatgtgt 840

tctagaagca gagactccag ggagaaccag aatttatgaa gcctcgtgca acatggtgct 900

ttctcaccga ggtcatatgc ctggctgctg ctgttccact cagctccatg agccacgttt 960

gttattttat gtttcttctg tgcttttgct catttccacc catgtgttta tagacctttt 1020

ttcagccctt tttctttgtt cctttccctc atctttttgc ctcaggtaga atccatcagt 1080

tttcctcccc ctccaaatga ctgtgtacct ccagctgctc aggactttgg aggtgggggc 1140

ggggcctggg gatctaccct tctaaaaaac tctccaagta attctgatac caataaagtg 1200

ggagacctcc atttttgagg cctatttgca agcatgtctc cctccctttc catggctttt 1260

tcgtttctcg catgttccac tgctttgcac tgtctagaca ggaaacctag gaagatgttg 1320

gtgctaaact gaaaagattt cttacagcaa aacctgcctc ggccagggct acagaattcc 1380

aactttcaac ttgattccta gccgtgaaca gactgtcctc tgctcagact aaaagggaat 1440

tataaacaag tgggaactta ctctccagtt gtgacttaac agttctgaac atacctacaa 1500

agggaaagtc aatattagca ataattgcct gattgacagc acgccagagg gaatgaaatg 1560

aggccttctc tcctacctcc caggagtatg taactcagat ccttagcata aagatcccca 1620

ggaataccac tgctctaacc cggtgaacat tttttctaat gcagggttag gcttacgtct 1680

gaattccaca agacatcctc cccctccagt acggaagttc caaggcactt gttttccagc 1740

atatcagcct aacctcagtg ccttgaaata tggctttaag cctttgagaa ctgagatttc 1800

ctgaaaccat aggcccttgc cccaggggtt tctccacatc cgggtgttaa gacacctgat 1860

ggcactgttg gtttgtcccc tataccccag aaaatctatc ctgcaaggta gctacttcaa 1920

tcttgtcatt aaaatgtgtc aagtcacagc tcgcaatgcc aaaggaatgc tggggcagta 1980

agtgaggtgg ataagtgaga agggcctggt ggtgaaagcg gccagggacc agaatgctcc 2040

agacctacag agctggtcaa ggttaagtgc cttaaactta ccaatcctgg gctcagttct 2100

cctttgaaag gagaaagtct ttgtcctcta cttaggcagc tgggctagaa gtgccttttg 2160

acttctaatg ttaactaccc tccaaagcct cctgggtcaa gaaggctctc ccaaactcca 2220

cccctgttct tcctggtcag agaaccagtc agtcattcta gtcttctagt ccttaaactg 2280

atctgatgac ttggaacata ggatttcact gcaagtctgg ctttttagtc tggaaataca 2340

tttgaggtct gttttcgcac agctggatca cctgtttcct ggttttatta cacaattcag 2400

aaggctagaa gaggagtttg ggggcttggc acctgaaaat ttagaccgca ttcttattaa 2460

gtaaaggaag aggtagggag gccgaggcgg gcggatcatg aaatcaggag atccagaccg 2520

tcctggctaa cacagaaacc ccgtctctac taaaaataca aaaaattagc tgggcatggt 2580

gacatgtgcc tgtagtccat cccagctact cgggaggccg aggcaagaga atcacctaaa 2640

cctggaaggc ggaggttgca gtgagccgag atcacaccac tgcacttcag gctgggcagc 2700

agagcgagac tccatctcaa aaaaaaaaaa aaaaggaaga ggtaaaaggc aaggcagcat 2760

ttaataagta cctgttgtat ccttttaagt gtttgttgtg gtaatcctca caaagaccgg 2820

gactgatgga aactccttgc tattaaactt tttttcttga ggaattttgc ttttcaagtg 2880

catatacact attaatattt tttacccaag agagcattct aagctaattt atgcagtgtg 2940

actgtattaa gcattaagct tccttcagag ctggcctatc ggagatgcta ctgccctctc 3000

tacagatgtg tctgaaatgc ctgcccaagg atggccctta gccagttaac agctttatag 3060

cccatcctca ttgcttactg ccacccctca gctggggtcc aaggcagtac tattcagttt 3120

attcaccaga cctgcctcca gacatctact tctttcaaaa attagtgttt tccatcaagg 3180

agcatgttcc agagcatttc ccagagatgt cccaaagaac actgtccggt gctgtggcgt 3240

acagtggcaa cagcattaga ctaagtggaa catcccagca ggctgcttta gaatccgctc 3300

atttgactag atacgatgta attggctgtc tttaaaaaac gcgcacacac acacaatctg 3360

ataggcatat ctcatgccca ttcaatatgg aatgttcttc gcttgctgaa tttaagcctg 3420

tattttaagg ttttgtggtt cctcggccac aatgggtgat gtcactgata gaacgaagct 3480

gagtttccaa gggtttgggg ctgtgcaaga gtaaacacta gagcttgagt tgttatccag 3540

ctggcaagca cggaagtctt tgaagaatgt aatgtaaaaa gggaaaagaa tgtaaagctt 3600

tttgtaccaa atgagagttg gagcccagcc aacaaatgct tttccctgtg taaaagtctc 3660

tctggaaggg acattccatc tccatggtgc actctgaggg gcactgtcaa ctagagattg 3720

gccccatcca ggtgggagga acccctttgg gatggtgagt atccaatctg ctgtgcattt 3780

gacaggatct ctgaatggct aggtaatgga tcccaagcag gctcacaaat ttaaatgagg 3840

gctttgtgtg cagaaagagg aataagtaca gattattttc ctaccactag atttttgggg 3900

agagtcacca tggaatgttg acaattactt aaaatatttt aagctccctt gctgaattcc 3960

tgtcctgtcc ctgaggaatc agatggtcat acagccatag gcacccaccc gaaatttccc 4020

taggagttgg agtaatgcta gaattgaaga ccttctgagt aaagggcttc tctgccttct 4080

cagaggcagg agaatttgca ctggttgtgt taaatgtata aaaagctata tgttcaccag 4140

tttactcatt tccaatgtgt agatgaataa aatgtagtgt acaaattatt tgaaaatccc 4200

agaaggaagg tacttttcaa atacagtatt ttttttaaca aataaactta cgatttttac 4260

agcacaaaaa aaaaaaaaaa aaa 4283

2

19

ShRNA

人工合成

2

正义链（5‘-3‘） 5‘ GGAGAGGUCACAUCAGUUA dTdT3‘
	反义链（3‘-5‘） 3‘ dTdT CCUCUCCAGUGUAGUCAAU 5‘

3

19

RNA干扰靶点

DNA

3

ccaggaaaggtgagtgaga 19

Claims

1.一种抑制人结直肠癌基因c2orf68表达的shRNA，其特征在于，其结直肠癌靶序列脱氧核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示，位于c2orf68基因第460~478位。

2.根据权利要求1所述的特异性shRNA，其特征在于，由人工合成的短发卡shRNA核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示的siRNA核苷酸序列。

3.一种如权利要求1所述的针对c2orf68基因设计特异性shRNA，其特征在于能够抑结直肠癌细胞的增殖和促进凋亡。

4.通过实时荧光定量PCR分析结果显示，结直肠癌SW480细胞RNA干扰后， c2orf68基因抑制率为50.01%（见图3）；结直肠癌SW620细胞RNA干扰后c2orf68基因抑制率为49.69%（见图4）；结直肠癌LS174T细胞RNA干扰后c2orf68基因抑制率为50.15%（见图5）；采用MTT实验检测结直肠癌LS174T细胞增殖情况，LS174T^-siRNA细胞的增殖受到明显的抑制作用；采用流式细胞术测结直肠癌LS174T细胞凋亡情况，LS174T^-siRNA细胞凋亡率明显高于LS174T细胞，上述的针对c2orf68基因设计特异性shRNA可用于制备新的抗肿瘤基因药物和抗肿瘤生物制剂。