CN106801057A

CN106801057A - 一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA PCGEM1的siRNA和应用

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Publication number: CN106801057A
Application number: CN201710089010.0A
Authority: CN
Inventors: 赵杨; 宗志红; 陈说; 刘瑶
Original assignee: First Hospital of China Medical University
Current assignee: First Hospital of China Medical University
Priority date: 2017-02-20
Filing date: 2017-02-20
Publication date: 2017-06-06
Anticipated expiration: 2037-02-20
Also published as: CN106801057B

Abstract

本发明属于肿瘤分子生物学领域，尤其涉及一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA PCGEM1的siRNA和应用。所述的siRNA的sense和antisense的核苷酸序列分别为GGAAACAACCUUUAACUUA；UAAGUUAAAGGUUGUUUCC。该长链非编码RNA与癌细胞的增殖、凋亡能力相关，可作为卵巢癌和子宫内膜癌的诊断标志，为两种恶性肿瘤治疗的提供分子靶点，针对其设计的siRNA可应用于抗肿瘤的药物的制备。

Description

一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA PCGEM1的 siRNA和应用

技术领域

本发明属于肿瘤分子生物学领域，尤其涉及一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA PCGEM1的siRNA和应用。

背景技术

卵巢癌和子宫内膜癌是最致命的妇科恶性肿瘤，发病率高，并且近几年呈上升趋势，严重威胁着我国女性的生命健康。早期筛查与及早诊治对卵巢癌和子宫内膜癌患者的预后及疗效至关重要。

近年来，长链非编码RNA（long noncoding RNA, lncRNA）在肿瘤的发生、发展、侵袭、转移、耐药中的作用成为研究热点。长链非编码RNA是一类定位于细胞核或细胞质中，转录本长度大于200 nt，且以RNA的形式调控基因的表达水平的一类非编码RNA。lncRNA 主要可分为5种类型，具体为反义长链非编码RNA ,内含子非编码RNA，基因间长链非编码RNA，启动子相关长链非编码RNA，非翻译区长链非编码RNA。由于不参与编码形成蛋白质分子，早期lncRNA被定义为不具备生物学功能的转录组“噪音”。但近年来发现lncRNA能以RNA形式在表观遗传学、转录及转录后等多种层面调控基因的表达。lncRNA能够与多种生物分子结合，通过多种途径和分子机制调控基因表达，参与多种生物学功能。

前列腺癌的基因表达标记1（PCGEM1）的lncRNA通常过度侵略前列腺癌，并与增殖有密切的关系。此外，PCGEM1外源性过表达抑制细胞凋亡，诱导自噬和刺激的人滑膜细胞增殖的影响。但并没有关于lncRNA PCGEM1在卵巢癌和子宫内膜癌组织中表达情况的相关报道，并且寻找到有效的早期发病的生物标志物，以及相关的分子机制对指导卵巢癌和子宫内膜癌临床诊治及治疗有重要意义。

发明内容

针对上述问题，本发明提供一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNAPCGEM1的siRNA和应用。该长链非编码RNA与癌细胞的增殖、凋亡能力相关，可作为卵巢癌和子宫内膜癌的诊断标志，为两种恶性肿瘤治疗的提供分子靶点，针对其设计的siRNA可应用于抗肿瘤的药物的制备。

为了实现上述目的，本发明提供一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA PCGEM1，其DNA序列如SEQ.ID. NO.1所示；针对该长链非编码RNA设计的siRNA，所述的siRNA的sense和antisense的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示。

SEQ.ID.NO.2 ： GGAAACAACCUUUAACUUA。

SEQ.ID.NO.3 ： UAAGUUAAAGGUUGUUUCC。

所述的与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长非编码RNA PCGEM1的siRNA可以用于制备抗卵巢癌和子宫内膜癌药物。

本发明的有益效果。

本发明首次发现LncRNA PCGEM1在上皮性卵巢癌和子宫内膜癌患者中的表达均高于正常卵巢组织和子宫内膜组织，LncRNA PCGEM1表达异常和卵巢癌、子宫内膜癌的发生、发展密切相关，这为卵巢癌、子宫内膜癌的LncRNA的临床治疗和科学研究提供了基础。

本发明提供的与卵巢癌、子宫内膜癌相关的LncRNA，是通过长链非编码RNA芯片技术分别对3对卵巢癌、正常卵巢组织及子宫内膜癌、子宫内膜正常组织中差异表达的长链非编码RNA进行了分析筛选，获得了在卵巢癌、子宫内膜癌组织中高表达的长链非编码RNA分子。本发明提供的与卵巢癌和子宫内膜癌相关的LncRNA，是由上海SIGMA生物公司独家的Rosetta算法，确保基因设计时的高效特异性基础上设计siRNA序列；其质粒序列由苏州吉玛基因股份有限公司设计。在获取了其具体的序列之后，并设计siRNA序列及质粒序列进行转染；采用该片段敲低/高表达卵巢癌细胞系A2780、OVCAR3及子宫内膜癌细胞系HEC-1B、Ishikawa中该长链非编码RAN分子的表达后，发现肿瘤细胞的增殖活性下降/上升。因此该基因的功能可能与癌细胞的增殖能力相关。

附图说明

图1利用qRT-PCR检测PCGEM1在卵巢癌及正常组织中的表达情况。

图2利用MTT法检测PCGEM1干扰/过表达对卵巢癌细胞增殖的影响。

图3检测PCGEM1干扰/过表达对卵巢癌细胞凋亡的影响。

图4利用qRT-PCR检测PCGEM1在子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达情况。

图5利用MTT法检测PCGEM1干扰/过表达对子宫内膜癌细胞增殖的影响。

图6检测PCGEM1干扰/过表达对子宫内膜癌细胞凋亡的影响。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步的说明。以下实施例将有助于对本发明的了解，但这些实施例仅为了对本发明加以说明，本发明并不限于这些内容。在实施例中未作特殊说明的操作方法均为本技术领域常规操作方法。

实施例1。

一、Lnc RNA PCGEM1在卵巢癌病人及正常卵巢组织、子宫内膜癌及正常子宫内膜组织中的表达情况。

1、标本采集。

在患者知情的情况下，于术中采集卵巢癌及正常卵巢组织、子宫内膜癌及正常子宫内膜组织标本，生理盐水清洗后，保存于液氮或-80℃超低温冰箱中，备用；组织标本于2014年6 月-2015年6 月，在中国医科大学附属第一医院手术室，由陈医生采集。

2、引物设计。

根据位置信息为chr1在UCSC ( Mar.2006 ) 中查找该长非编码RNAEUlncRNA1的部分序列信息，并根据获取的序列信息采用Primer Premier5 . 0设计了PCGEM1的引物PCR引物。

PCR检测所用引物。

上游引物（SEQ.ID.NO.4）：CCACCCAATGCTAATGAAG。

下游引物（SEQ.ID.NO.5）：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG。

3、应用qRT-PCR方法分别检测PCGEM1在卵巢癌、正常卵巢组织及子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织的表达量。

3.1、收集的组织标本总RNA提取。

将收集正常卵巢组织、卵巢癌组织以及正常子宫内膜组织、子宫内膜组织标本用Trizol浸泡，以备提取总RNA；加入Trizol的1/5体积量的氯仿，剧烈振荡15秒，待溶液充分乳化后，室温静置5分钟；4℃条件下，12,000g离心处理20分钟，吸取上清液转移至另一个新的离心管中，向上清液中加入等体积的异丙醇，上下颠倒离心管充分混匀后，在30℃下静置10分钟；4℃条件下，12,000g离心处理20分钟，弃去上清，沿管壁加入lml的75％的乙醇，上下颠倒洗涤离心管管壁，4℃条件下12,000g离心处理10分钟后，弃去乙醇，室温干燥沉淀5-10分钟，加入适量（10-20ul）的RNase-free水溶解沉淀后，用UV-2800A型紫外可见分光光度计测定RNA浓度和纯度（定量RNA浓度1ug/ul， OD260/OD280 1.8-2.0之间表示RNA纯度较高）。

3.2、逆转录合成cDNA。

采用 GoScript 反转录系统（A5000、A5001），按照以下操作步骤进行反转录得到的 cDNA：第一步：取一定量模板 RNA 加入引物。

RNA ( 1µg/μl) 5μl。

Random Primers (0.5 µg /μl) 1 μl。

Oligo(dT)15 Primer (0.5 µg/μl) 1 μl。

Nuclease-Free Water (加至 10 μl) 3μl。

第二步：将模板 RNA 与引物（ Random Primers和Oligo(dT)15 Primer）的混合物进行 70℃、5 min 预变性，完成后取出置于冰上。

第三步：配制 RT -Mix，向每个样品管加入 10 μl。

组分反转录混合液终浓度。

Nuclease-Free Water 1.6 μl 。

GoScript™ 5X Reaction Buffer 4 μl 1X。

MgCl₂ (25 mM) 2 μl 2.5mM。

PCR Nucleotide Mix 1 μl 0.5mM。

Recombinant RNasin® Ribonuclease Inhibitor 0.4 μl 20units。

GoScript™ Reverse Transcriptase 1 μl。

第四步：设置反转录程序，包括退火、延伸、逆转录酶失活三步（退火25℃ 5min，延伸42℃ 60 min，失活70℃ 15 min，4℃ + ∞。程序完成后得到 cDNA。

3.3、Real-time PCR。

（1）按下列配置PCR反应混合液（反应液配置可在室温进行），并分至各反应管，然后加入2ul模板。

组分体积（20ul反应体系）终浓度。

Nuclease-Free Water 7 μl。

上游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

下游引物（10 uM) 0.4ul 0.2uM。

GoTaq®qPCR Master Mix,2X 10ul 1X。

CXR 100X 0.2ul 1X。

（2）采用ABI PRISM®7500 Real-Time PCR System，两步法进行PCR标准扩增程序。

（3）导出数据，Realtime PCR结果用2-△△CT法进行分析。利用Graphad Prism软件分别绘制出卵巢癌和正常卵巢组织、子宫内膜癌及正常子宫内膜组织表达水平的图表，结果如图1和图4；其中图1表示lncRNA PCGEM1表达在上皮性卵巢癌中比在正常卵巢组织中显着更高，^*P <0.05；图4表示lncRNA PCGEM1表达在子宫内膜癌中比在正常子宫内膜组织中显着增高。

以上说明lncRNA PCGEM1与卵巢癌、子宫内膜癌发生、发展相关。

二、体外细胞功能实验。

1、卵巢癌细胞株A2780、OVCAR3购自中科院细胞库，子宫内膜癌细胞株HEC-1B购自中科院细胞库，细胞培养基DMEM/RPMI 1640和胎牛血清均购自HyClone公司，PCGEM1质粒表达载体购自苏州吉玛技术有限公司，siRNA干扰片段序列由上海SIGMA生物公司合成，RNA抽提试剂RNAiso Plus购自宝生物工程有限公司，逆转录试剂盒High Capacity cDNAReverse Transcription Kits购自Invitrogen公司，定量PCR试剂盒Power SYBR GreenPCR Master Mix购自Invitrogen公司，PCGEM1基因和管家基因18S引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。

1.1、细胞培养：卵巢癌和子宫内膜癌细胞用含10%的胎牛血清细胞培养基，于37℃，5%CO₂的培养箱中培养，利用PCGEM1基因RNA干扰和过表达质粒转染卵巢癌细胞系A2780、OVCAR3和子宫内膜癌细胞系HEC-1B，按照lipo2000说明书分别将PCGEM1的siRNA及PCGEM1质粒转入细胞中，进行培养。

2、过表达∕干扰效率检测：转染效率结果采用QRT-PCR检测，干扰效率在50%以上，过表达效率在5倍以上。

2.1、过表达∕干扰PCGEM1后进行细胞增殖实验（MTT）。

增殖实验：选取细胞系中PCGEM1过表达∕干扰作为实验组，转染空载体的细胞作为对照组，进行细胞计数，将细胞种到96孔板中，每孔3000个细胞，加100ul培养液，分别于0，24，48，72小时加入20ul 5 mg/mL MTT溶液细胞培养箱孵育2-4小时后，在37℃孵育4小时，弃掉上清液，再加入150ul DMSO，使用分光光度计在490nm下测OD值,整理数据绘制成折线图，见图2和图5。

2.1.1、过表达PCGEM1后的卵巢癌细胞系及子宫内膜癌细胞系细胞增殖实验结果见图2-1至图2-4和图5-1；其中图2-1至图2-2表示在卵巢癌A2780和OVCAR3细胞中转染PCGEM1 质粒，其表达升高；图2-3至图2-4表示PCGEM1表达升高，细胞增殖能力显著增强；其中图5-1表示转染PCGEM1质粒提高其在子宫内膜癌细胞中的表达水平。

可见，过表达PCGEM1基因后, 卵巢癌及子宫内膜癌细胞增殖能力增强。

2.1.2、PCGEM1干扰后的卵巢癌细胞系及子宫内膜癌细胞细胞增殖实验结果见图2-5至2-8和图5-2至图5-4，其中图2-5至图2-6表示卵巢癌细胞系转染si- PCGEM1降低其表达；图2-7至图2-8表示沉默PCGEM1，细胞增殖能力明显下降；图5-2表示利用siRNA能够沉默其表达；图5-3表示PCGEM1表达增加，细胞增殖能力显著提高；图5-4表示沉默表达，细胞增殖能力受到抑制。

可见，干扰掉PCGEM1基因后,卵巢癌及子宫内膜癌细胞增殖能力下降。

2.2 、干扰∕过表达PCGEM1后细胞凋亡实验。

实验前将细胞在6cm盘培养，加入处理因素(PCGEM1基因RNA干扰或过表达质粒)转染48小时后，进行实验。细胞用不含EDTA胰蛋白酶消化，1500r离心处理5分钟后收集细胞，预冷的PBS洗涤两次，离心后，收集细胞约5×10⁵个，加入1×Binding Buffer，重悬细胞100ul，加入5μL Annexin V-FITC和5uL PI Staining Solution(干扰)或者5μL AnnexinV-7AAD和5uL PE Staining Solution（高表达），轻轻混匀，室温避光孵育10分钟，再加入400μL 1×Binding Buffer，轻轻混匀；样品在1小时内流式细胞仪检测。

2.2.1、过表达PCGEM1后的卵巢癌细胞系及子宫内膜癌细胞系细胞凋亡实验结果，见图3-1至3-2和图6-1；其中图3-1至图3-2表示PCGEM1表达上升，卵巢癌细胞凋亡比例明显下降；图6-1表示在子宫内膜癌细胞系中，PCGEM1表达升高，细胞凋亡比例明显下降。

可见，过表达PCGEM1基因后，卵巢癌及子宫内膜癌细胞凋亡能力减弱。

2.1.2、PCGEM1干扰后的卵巢癌细胞系及子宫内膜癌细胞系凋亡实验结果见图3-3至3-4和图6-2；其中图3-3至图3-4表示利用siRNA沉默PCGEM1的表达，卵巢癌细胞系凋亡率增加显著；图6-2表示沉默PCGEM1显著促进子宫内膜癌细胞凋亡。

可见，干扰掉PCGEM1基因后，卵巢癌及子宫内膜癌细胞凋亡能力增加。

序列表

＜110＞中国医科大学附属第一医院

＜120＞一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA PCGEM1的siRNA和应用

＜160＞5

＜210＞1

＜211＞427

＜212＞DNA

＜213＞长链非编码RNA PCGEM1的核苷酸序列

＜400＞1

tctagaaagg actagaaagt gtgaaatcta ttagtcttcg atatgaaatt ctctgtctct gtaaaagcat 70

ttcatattta caagacacag gcctactcct agggcagcaa aaagtggcaa caggcaagca gagggaaaag 140

agatcatgag gcatttcaga gtgcactgtc ttttcatata tttctcaatg ccgtatgttt ggttttattt 210

tggttgcatt ctgaaatgcc cttgttgcaa atattggtta tattgattaa atttacactt aatggaaaca 280

acctttaact taccagatga acaaacccac aaaagcaaaa aatcaaaagc cctacctttg atttcatatt 350

ttctgtgtaa ctggattaaa ggattcctgc ttgcttttgg gcataaatga taatggaata tttccaggta 420

ttctaga 427

＜210＞2

＜211＞19

＜212＞RNA

＜213＞外引物sense

＜400＞2

ggaaacaacc uuuaacuua 19

＜210＞3

＜211＞19

＜212＞RNA

＜213＞外引物antisense

＜400＞3

uaaguuaaag guuguuucc 19

＜210＞4

＜211＞19

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞4

ccacccaatg ctaatgaag 19

＜210＞5

＜211＞22

＜212＞DNA

＜213＞人工序列

＜400＞5

cgtcgccgtc cagctcgacc ag 22

Claims

1.一种与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码RNA PCGEM1的siRNA，其特征在于，所述的siRNA的sense和antisense的核苷酸序列分别如SEQ.ID.NO.2和SEQ.ID.NO.3所示：

SEQ.ID.NO.2 ：UAAGUUAAAGGUUGUUUCC；

SEQ.ID.NO.3 ：GGAAACAACCUUUAACUUA。

2.如权利要求1所述的长链非编码RNA PCGEM1的siRNA，其特征在于，应用qRT-PCR方法分别检测PCGEM1在卵巢癌、正常卵巢组织及子宫内膜癌组织、正常子宫内膜组织的表达量。

3.如权利要求1所述的长链非编码RNA PCGEM1的siRNA，其特征在于，所述的qRT-PCR方法检测所用的引物核苷酸序列分别为：上游引物：CCACCCAATGCTAATGAAG；下游引物：CGTCGCCGTCCAGCTCGACCAG。

4.如权利要求1所述的与卵巢癌和子宫内膜癌相关的长链非编码的siRNA用于制备抗卵巢癌和子宫内膜癌药物。