CN112322729B - 一种喉鳞癌环状rna分子标记物及其检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种喉鳞癌环状RNA分子标记物及其检测方法和应用。喉鳞癌环状RNA分子标记物hsa_circ_0000033的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；所述hsa_circ_0000033在喉鳞癌患者癌组织中的表达水平上调，应用于制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒；本发明提供的喉鳞癌分子标记物表达量的检测方法是利用荧光染料法实时定量PCR检测，针对其设计的背靠背引物如SEQ ID NO.2‑3所示。本发明提供了靶向hsa_circ_0000033的特异siRNA序列，该siRNA用于敲降喉鳞癌细胞系中hsa_circ_0000033表达，发挥抑制喉鳞癌细胞系增殖能力的生物学功能；本发明的喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0000033具有简单、快捷地进行喉鳞癌辅助诊断的应用前景；本发明设计的siRNA序列可有效使hsa_circ_0000033表达量降低，具有特异性及作用迅速的特点。

Description

一种喉鳞癌环状RNA分子标记物及其检测方法和应用
技术领域
本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种喉鳞癌环状RNA分子标记物及其检测方法和应用。
背景技术
喉鳞状细胞癌是一种来源于喉部上皮组织且有侵袭性的头颈部恶性肿瘤，每年约占全球所有肿瘤的2.4％。近年来由于吸烟和过量饮酒等因素使得喉鳞癌的发病率逐年小幅升高。喉鳞癌是我国北方地区高发的头颈部恶性肿瘤，具有较高的发病率、致残率以及死亡率。尽管对喉鳞癌的研究取得了一定成果，但其发病的分子机制仍未阐明。特别是晚期喉鳞癌患者的预后较差，5年存活率不足50％，生活质量也严重不良，给患者的生理、心理以及家庭造成严重的经济负担。
环状RNA(circular RNA，circRNA)是近年新发现的一类内源性非编码RNA，通过外显子或内含子的环化将3’和5’末端连接起来形成完整的共价环状结构。其具有不编码蛋白质、结构稳定、丰度高等特征。研究发现circRNA并非转录过程中的偶然错配，其在多种生物体内表达并发挥不同的生物学功能，尤其在肿瘤的形成及恶性进展过程中发挥着重要的生物学作用。
小干扰RNA(siRNA)，有时称为短干扰RNA或沉默RNA，是一类双链RNA分子，长度为20-25个碱基对，可靶向降解mRNA，从而阻止其翻译蛋白质。
发明内容
针对上述现有技术现状，本发明直接解决的第一个技术问题是提供一种环状RNA，即hsa_circ_0000033作为喉鳞癌检测的分子标记物，利用该分子标记物可以简单、快捷地进行喉鳞癌辅助诊断。
本发明所要解决的另一个技术问题是提供一种在喉鳞癌组织中检测hsa_circ_0000033的方法。
本发明所直接解决的第二个技术问题是提供一种环状RNAhsa_circ_0000033在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中的应用。
本发明所直接解决的第三个技术问题是提供靶向hsa_circ_0000033的siRNA序列，利用该siRNA序列可以简单、高效地敲降hsa_circ_0000033表达。
本发明所直接解决的第四个技术问题是提供一种在喉鳞癌细胞系中转染hsa_circ_0000033的siRNA方法。
为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
一种用于喉鳞癌检测的环状RNA分子标记物，该环状RNA为hsa_circ_0000033，其在基因组上的定位为：chr1:26584087-26586293，相应的线性基因为CEP85(NM_022778)，该环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
进一步地，所述hsa_circ_0000033在喉鳞癌患者癌组织中表达水平特异性上调，喉鳞癌恶性程度与所述hsa_circ_0000033分子表达量具有相关性，恶性程度越高，hsa_circ_0000033分子表达量越高。
喉鳞癌组织中的环状RNA分子标记物hsa_circ_0000033表达量的检测方法按照如下所述方法，步骤包括：
步骤1：采集喉鳞癌组织，称取组织，提取组织中的总RNA；
步骤2：将总RNA逆转录成cDNA；
步骤3：将cDNA进行荧光染料法实时定量PCR检测，反应结束后检测样品中hsa_circ_0000033和内参基因18s的Ct值；
步骤4：根据Ct值，通过内参基因18s的表达水平来均一化hsa_circ_0000033的表达水平，并使用2—ΔΔCt公式来计算hsa_circ_0000033的PCR相对定量值，式中ΔCt＝Cthsa_circ_0000033-Ct18s，最终计算得到组织中hsa_circ_0000033的相对表达水平。
进一步地，所述步骤3的实时定量PCR检测中hsa_circ_0000033的特异性背对背引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.2，F1：5’-TACAGGAATTGCAGCGAGAA-3’；
SEQ ID NO.3，R1：5’-AAAGCAGCAGGATGGTGGC-3’。
再进一步地，所述步骤(3)在定量中的内参基因18s的
内参基因18s的特异性扩增上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示：
SEQ ID NO.4，F2：5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’；
SEQ ID NO.5，R2：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。
更进一步地，所述步骤(1)中提取组织中的总RNA的流程如下：
(a)将手术切除的新鲜喉鳞癌组织放入含有RNA保存液的无RNA酶的离心管中；
(b)取10mg喉鳞癌组织放入加厚的离心管中，置于冰上，加1mL Trizol，加入2粒小号钢珠，将组织破碎器设定频率70Hz，时间60秒匀浆，室温静置5min，使其充分裂解；
(c)每1mL Trizol加入500μl的氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；4℃下，14000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管中；
(d)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，室温静置10min或-20度沉淀过夜；4℃下，14000g离心10min，去上清，收集RNA沉淀；
(e)加入1mL 75％乙醇，轻轻混匀后4℃下，12000g离心5min，去上清；再次加入1mL75％的乙醇，轻轻混匀后，4℃下，12000g离心5min，去上清；
(f)加入适量的DEPC水或者RNase free water溶解沉淀,测出总RNA浓度和纯度。
更进一步地，所述步骤(2)将总RNA反转录为cDNA；其中，反转录试剂的组分及各组分的比例如表1所示，反转录程序如表2所示：
表1：反转录试剂组分表
表2：反转录程序表
更进一步地，所述步骤(3)中荧光定量PCR反应试剂的组分及各组分的比例如表3所示，实时荧光定量反应程序如表4所示；
表3：实时荧光定量反应试剂组分表
表4：实时荧光定量反应程序表
通过对喉鳞癌组织中hsa_circ_0000033实时荧光定量，结果发现hsa_circ_0000033在人喉鳞癌组织中的表达水平明显高于癌旁正常黏膜组织(图1)，人喉鳞癌组织中hsa_circ_0000033的平均表达量是癌旁正常黏膜组织中的2.68倍，且具有统计学差异(p<0.001)。同时通过分析发现hsa_circ_0000033在喉鳞癌T3和T4期的表达水平显著高于T1和T2期的表达水平(图2)，说明hsa_circ_0000033表达量与喉鳞癌病人的临床分期具有很强的相关性。喉鳞癌分期越晚的患者hsa_circ_0000033的表达量越高，因此hsa_circ_0000033可做为喉鳞癌患者的分子标记物。
本发明的环状RNA分子标记物hsa_circ_0000033可应用于制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒，该试剂盒包括PCR反应常用的酶和试剂，如Taq酶、dNTP混合液、荧光染料试剂、PCR缓冲液、DEPC处理水等。
本发明提供特异靶向hsa_circ_0000033的siRNA序列以及其在喉鳞癌细胞系中的应用，用于敲降喉鳞癌细胞系中hsa_circ_0000033的表达，所述hsa_circ_0000033的siRNA序列如SEQ ID NO.6-9所示：
SEQ ID NO.6，Sense#1：GGAAGAAAGGCUUCAGAAU
SEQ ID NO.7，Anti-sense#1：AUUCUGAAGCCUUUCUUCC
SEQ ID NO.8，Sense#2：AGGAAGAAAGGCUUCAGAA
SEQ ID NO.9，Anti-sense#2：UUCUGAAGCCUUUCUUCCU。
进一步地，所述hsa_circ_0000033在喉鳞癌细胞系中的特异性表达水平上调，通过转染hsa_circ_0000033的siRNA可敲降hsa_circ_0000033在喉鳞癌细胞系中的表达。
本发明还提供一种在喉鳞癌细胞系中转染hsa_circ_0000033的siRNA方法，包括如下步骤：
(1)选用人喉鳞癌细胞系FD-LSC-1、AMC-HN-8，在37℃、5％CO2条件下的培养箱中进行培养，使用含10％胎牛血清的培养基，待细胞达到80％-90％汇合度后进行转染；
(2)更换培养基为无双抗的培养基；使用Opti-MEM培养基按15:1的比例稀释Lipofectamine 3000试剂；
(3)使用Opti-MEM培养基稀释siRNA，制备浓度为1500nM的siRNA预混液；
(4)在每管已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入等体积稀释的siRNA预混液；
(5)室温孵育15min后将siRNA-Lipofectamine3000复合物加入至细胞培养基中，使其终浓度为100nM；在37℃、5％CO2条件下的培养箱中进行培养6小时后换液。
(6)继续培养48小时后提取喉鳞癌细胞系中总RNA。
通过以上实验方法和实验条件的优化，可提高hsa_circ_0000033的siRNA敲降效率。
进一步地，所述步骤(4)中在每管已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入稀释的siRNA；具体加入的siRNA预混液与稀释的Lipofectamine 3000试剂体积比为1：1。
再进一步地，所述步骤(6)中提取喉鳞癌细胞系中总RNA；具体为：
(a)收集细胞：转染siRNA 48小时后取出培养板准备提取RNA；
(b)提取RNA：于冰上加入适量TRIzol，静置10分钟，使细胞中的RNA充分释放至溶液中；
(c)氯仿提取：加入0.2mL氯仿，涡旋震荡混匀，室温静置10分钟；4℃下，13000rpm离心10分钟，此时液体分层，其中上层水相中富集了RNA，吸取上层水相至1.5mL RNase-free离心管中；
(d)异丙醇沉淀：加入等体积异丙醇，涡旋震荡混匀，4℃下静置30分钟，12000rpm在4℃下离心10分钟，弃上清；
(e)乙醇洗涤：加入1mL75％的乙醇，混匀，12000rpm在4℃下离心5分钟，弃上清，最后加入50μl的RNase-free水溶解沉淀，即为细胞中总RNA提取液，-80℃保存备用。
通过以上实验方法和实验条件的优化，可提高所提取的总RNA中hsa_circ_0000033的纯度和浓度。
为了评估hsa_circ_0000033在喉鳞癌系中所发挥的功能，设计两个靶向反向剪接序列的siRNA，转染喉鳞癌细胞系FD-LSC-1和AMC-HN-8发现两条siRNA都可显著将hsa_circ_0000033特异性敲降，而对相应的线性基因CEP85无显著影响(图4-5)。CCK8实验结果显示，敲降hsa_circ_0000033后同NC组相比两种喉鳞癌细胞系的活力状态都显著降低(图6-7)。
与现有技术相比，本发明具有以下有益效果：
1、hsa_circ_0000033在喉鳞癌患者组织中所具有的特异性高表达，可以高效、便捷地作为喉鳞癌辅助诊断的一种新型分子标记物，为临床诊断提供参考。
2、在检测喉鳞癌患者组织中hsa_circ_0000033时可使用TRIzol、氯仿、异丙醇、乙醇等试剂，可提取出浓度、纯度较高的RNA，仅需收集10mg喉鳞癌组织即可检测环状RNA，成为喉鳞癌检测诊断、病理分级、临床分期、治疗疗效判断的有效工具，具有良好的临床应用前景。检测中所使用的实时定量PCR仪器是一种常见仪器，荧光染料法可根据引物的特异性，同时扩增目的环状RNA和内参基因，本发明提供的检测喉鳞癌患者组织中hsa_circ_0000033的方法，对进一步研究喉鳞癌相关环状RNA的生物学机制具有重要意义。
3、在喉鳞癌细胞系中可通过转染靶向hsa_circ_0000033的siRNAhas，可简单、高效地敲降hsa_circ_0000033的表达。进而进行hsa_circ_0000033的细胞功能研究。
4、总之，本发明提供的hsa_circ_0000033引物、靶向siRNA序列，以及检测其表达的方法，转染细胞系的方法等，可应用于辅助诊断喉鳞癌的试剂盒，以及研究hsa_circ_0000033的细胞功能以及上下游调控机制，具有很好的应用前景。采取的实验方法及所涉及的检测仪器成本较低，非常经济和方便。
附图说明
图1为本发明实施例中正常组织和喉鳞癌组织hsa_circ_0000033的表达水平；
图2为实施例中喉鳞癌组织不同分期中hsa_circ_0000033的表达水平；
图3为正常组织和喉鳞癌组织中hsa_circ_0000033和18s的荧光信号曲线图；
图4为本发明喉鳞癌细胞系FD-LSC-1敲降hsa_circ_0000033检测结果图；
图5为本发明喉鳞癌细胞系AMC-HN-8敲降hsa_circ_0000033检测结果图；
图6为喉鳞癌细胞系FD-LSC-1转染siRNA细胞活力的变化图；
图7为喉鳞癌细胞系AMC-HN-8转染siRNA细胞活性的变化。
具体实施方式
下面结合附图并通过具体实施例来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述具体实施方式仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1：
一种用于喉鳞癌检测的环状RNA分子标记物，该环状RNA为hsa_circ_0000033，其在基因组上的定位为：chr1:26584087-26586293，相应的线性基因为CEP85(NM_022778)，该环状RNA的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
一种检测喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0000033的方法，包括如下步骤：
(1)临床采集喉鳞癌组织，称取组织，提取组织中的总RNA；
(2)将总RNA逆转录成cDNA；
(3)将cDNA进行荧光染料法实时定量PCR检测，反应结束后检测样品中环状RNAhsa_circ_0000033和内参基因18s的Ct值；
(4)根据Ct值，通过内参基因18s的表达水平来均一化hsa_circ_0000033的水平，计算得到组织中hsa_circ_0000033的相对表达水平，并使用2—ΔΔCt公式来计算hsa_circ_0000033的PCR相对定量值，式中ΔCt＝Cthsa_circ_0000033-Ct18s；
所述步骤(1)中提取组织中的总RNA的过程如下：
(a)将手术切除的新鲜喉鳞癌组织放入含有RNA保存液的无RNA酶的离心管中；
(b)取10mg喉鳞癌组织放入加厚的离心管中，置于冰上，加1mL Trizol，加入2粒小号钢珠，将组织破碎器设定频率70Hz，时间60秒匀浆，室温静置5min，使其充分裂解；
(c)每1mL Trizol加入500μl的氯仿，剧烈振荡混匀30s，使水相和有机相充分接触，室温静置3-5min；4℃下，14000g离心15min，可见分为三层，RNA在上层水相，移至另一个新的RNase free EP管中；
(d)加入等体积异丙醇，轻柔地充分混匀(颠倒6-8次)，室温静置10min或-20度沉淀过夜；4℃下，14000g离心10min，去上清，收集RNA沉淀；
(e)加入1mL 75％乙醇，轻轻混匀后4℃下，12000g离心5min，去上清；再次加入1mL75％的乙醇，轻轻混匀后，4℃下，12000g离心5min，去上清；
(f)加入适量的DEPC水或者RNase free water溶解沉淀,测出总RNA浓度和纯度。
所述步骤(2)将总RNA反转录为cDNA；其中，反转录试剂的组分及各组分的比例如表1所示，反转录程序如表2所示：
表1：反转录试剂组分表
表2：反转录程序表
所述步骤(3)中荧光定量PCR反应试剂的组分及各组分的比例如表3所示，实时荧光定量反应程序如表4所示
表3：实时荧光定量反应试剂组分表
表4：实时荧光定量反应程序表
所述步骤(3)的实时定量PCR检测中的hsa_circ_0000033的特异性背对背引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3所示：
SEQ ID NO.2，F1：5’-TACAGGAATTGCAGCGAGAA-3’；
SEQ ID NO.3，R1：5’-AAAGCAGCAGGATGGTGGC-3’。
内参基因18s的特异性扩增上下游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.4、SEQ IDNO.5所示：
SEQ ID NO.4，F2：5’-CCTGGATACCGCAGCTAGGA-3’；
SEQ ID NO.5，R2：5’-GCGGCGCAATACGAATGCCCC-3’。
本发明实施例中正常组织和喉鳞癌组织hsa_circ_0000033表达水平结果如图1所示；
喉鳞癌组织不同分期中hsa_circ_0000033表达水平如图2所示；
正常组织和喉鳞癌组织中hsa_circ_0000033和18s的荧光信号曲线如图3所示。
本发明的hsa_circ_0000033在喉鳞癌患者癌组织中的特异性表达水平上调，喉鳞癌恶性程度与所述hsa_circ_0000033分子表达量具有相关性，恶性程度越高，hsa_circ_0000033分子表达量越高。因此喉鳞癌分子标记物hsa_circ_0000033可在制备喉鳞癌诊断试剂盒中的应用。
实施例2：
hsa_circ_0000033的siRNA在喉鳞癌中的应用，用于敲降喉鳞癌细胞系中hsa_circ_0000033的表达，所述hsa_circ_0000033的siRNA序列如SEQ ID NO.6-9所示：
SEQ ID NO.6，Sense#1：GGAAGAAAGGCUUCAGAAU
SEQ ID NO.7，Anti-sense#1：AUUCUGAAGCCUUUCUUCC
SEQ ID NO.8，Sense#2：AGGAAGAAAGGCUUCAGAA
SEQ ID NO.9，-sense#2：UUCUGAAGCCUUUCUUCCU。
所述hsa_circ_0000033在人喉鳞癌细胞系FD-LSC-1、AMC-HN-8中的特异性表达水平上调。
在喉鳞癌细胞系中转染hsa_circ_0000033的siRNA方法，包括如下步骤：
(1)选用人喉鳞癌细胞系FD-LSC-1、AMC-HN-8，在37℃、5％CO2条件下的培养箱中进行培养，使用含10％胎牛血清的培养基，待细胞达到80％-90％汇合度后进行转染；
(2)更换培养基为无双抗的培养基；使用Opti-MEM培养基按15:1的比例稀释Lipofectamine 3000试剂；
(3)使用Opti-MEM培养基稀释siRNA，制备浓度为1500nM的siRNA预混液；
(4)在每管已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入等体积稀释的siRNA预混液；
(5)室温孵育15min后将siRNA-Lipofectamine 3000复合物加入至细胞培养基中，使其终浓度为100nM；在37℃、5％CO2条件下的培养箱中进行培养6小时后换液。
(6)继续培养48小时后提取喉鳞癌细胞系中总RNA，具体为：
(a)收集细胞：转染siRNA 48小时后取出培养板准备提取RNA；
(b)提取RNA：于冰上加入适量TRIzol，静置10分钟，使细胞中的RNA充分释放至溶液中；
(c)氯仿提取：加入0.2mL氯仿，涡旋震荡混匀，室温静置10分钟；4℃下，13000rpm离心10分钟，此时液体分层，其中上层水相中富集了RNA，吸取上层水相至1.5mL RNase-free离心管中；
(d)异丙醇沉淀：加入等体积异丙醇，涡旋震荡混匀，4℃下静置30分钟，12000rpm在4℃下离心10分钟，弃上清；
(e)乙醇洗涤：加入1mL 75％的乙醇，混匀，12000rpm在4℃下离心5分钟，弃上清，最后加入50μl的RNase-free水溶解沉淀，即为细胞中总RNA提取液，-80℃保存备用。
本实施例喉鳞癌细胞FD-LSC-1中转染siRNA后hsa_circ_0000033表达水平结果如图4所示；喉鳞癌细胞系AMC-HN-8中转染siRNA后hsa_circ_0000033表达水平结果如图5所示；敲降hsa_circ_0000033的表达从而抑制喉鳞癌细胞系FD-LSC-1的增殖结果如图6所示；敲降hsa_circ_0000033的表达从而抑制喉鳞癌细胞系AMC-HN-8的增殖结果如图7所示。
序列表
<110> 山西医科大学第一医院
山东省耳鼻喉医院（山东省立医院西院）
高伟
吴勇延
<120> 一种喉鳞癌环状RNA分子标记物及其检测方法和应用
<160> 9
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 438
<212> DNA
<213> 环状RNA(circular RNA)
<400> 1
cttcagaatg gagccatctg ccaccatcct gctgcttttg gtccttcact gcccatctta 60
gagccagcac agtggatcag catcttgaac agtaatgaac accttctgaa ggaaaaagag 120
cttctcattg acaagcagag gaaacacatc tctcagctgg agcagaaagt gcgagagagc 180
gaactgcaag tccacagtgc cctcttgggc cgccctgccc cctttggtga tgtctgcttg 240
ctgaggctac aggaattgca gcgagaaaac actttcttac gtgcacagtt tgcacagaag 300
acagaagcct tgagcagaga aaagattgac cttgaaaaga aactctctgc ttctgaagtt 360
gaagtccagc tcatcagaga gtcgctcaaa gtggcgttgc agaagcattc tgaggaagtg 420
aagaaacagg aagaaagg 438
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> 环状RNA(circular RNA)
<400> 2
tacaggaatt gcagcgagaa 20
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 环状RNA(circular RNA)
<400> 3
aaagcagcag gatggtggc 19
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> 环状RNA(circular RNA)
<400> 4
cctggatacc gcagctagga 20
<210> 5
<211> 21
<212> DNA
<213> 环状RNA(circular RNA)
<400> 5
gcggcgcaat acgaatgccc c 21
<210> 6
<211> 19
<212> RNA
<213> 小干扰RNA(siRNA)
<400> 6
ggaagaaagg cuucagaau 19
<210> 7
<211> 19
<212> RNA
<213> 小干扰RNA(siRNA)
<400> 7
auucugaagc cuuucuucc 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 小干扰RNA(siRNA)
<400> 9
aggaagaaag gcuucagaa 19
<210> 9
<211> 19
<212> RNA
<213> 小干扰RNA(siRNA)
<400> 9
uucugaagcc uuucuuccu 19

Claims (4)

1.一种喉鳞癌环状RNA分子标记物hsa_circ_0000033在制备喉鳞癌辅助诊断试剂盒中的应用，其特征在于：所述hsa_circ_0000033在基因组上的定位为：chr1:26584087-26586293，相应的线性基因为CEP85 NM_022778，所述hsa_circ_0000033的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.一种喉鳞癌环状RNA分子标记物的siRNA，其特征在于：所述喉鳞癌环状RNA分子标记物的siRNA序列如SEQ ID NO.6-9所示：
SEQ ID NO.6，Sense#1：GGAAGAAAGGCUUCAGAAU
SEQ ID NO.7，Anti-sense#1：AUUCUGAAGCCUUUCUUCC
SEQ ID NO.8，Sense#2：AGGAAGAAAGGCUUCAGAA
SEQ ID NO.9，Anti-sense#2：UUCUGAAGCCUUUCUUCCU。
3.一种在喉鳞癌细胞系中转染权利要求2所述siRNA的方法，其特征在于：包括如下步骤：
(1) 选用人喉鳞癌细胞系FD-LSC-1、AMC-HN-8，在37℃、5% CO2条件下的培养箱中进行培养，使用含10%胎牛血清的培养基，待细胞达到80%-90%汇合度后进行转染；
(2) 更换培养基为无双抗的培养基；使用Opti-MEM培养基按15:1的比例稀释Lipofectamine 3000试剂；
(3) 使用Opti-MEM培养基稀释siRNA，制备浓度为1500nM的siRNA预混液；
(4) 在每管已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入等体积稀释的siRNA预混液；
(5) 室温孵育15min后将siRNA-Lipofectamine 3000复合物加入至细胞培养基中，使其终浓度为100nM；在37℃、5% CO2条件下的培养箱中进行培养6小时后换液；
(6) 继续培养48小时后提取喉鳞癌细胞系中总RNA。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于：所述步骤(4)中在每管已稀释的Lipofectamine 3000试剂中加入稀释的siRNA；具体加入的siRNA预混液与稀释的Lipofectamine 3000试剂体积比为1：1；所述步骤(6)中提取喉鳞癌细胞系中总RNA；具体为：
(a) 收集细胞：转染siRNA 48小时后取出培养板用于提取RNA；
(b) 提取RNA：于冰上加入适量TRIzol，静置10分钟，使细胞中的RNA充分释放至溶液中；
(c) 氯仿提取：加入0.2mL氯仿，涡旋震荡混匀，室温静置10分钟；4℃下，13000rpm离心10分钟，此时液体分层，其中上层水相中富集了RNA，吸取上层水相至1.5mL RNase-free离心管中；
(d) 异丙醇沉淀：加入等体积异丙醇，涡旋震荡混匀，4℃下静置30分钟，12000rpm在4℃下离心10分钟，弃上清；
(e) 乙醇洗涤：加入1mL 75％的乙醇，混匀，12000rpm在4℃下离心5分钟，弃上清，最后加入50 ul的RNase-free水溶解沉淀，即为细胞中总RNA提取液，-80℃保存备用。
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