CN111154761A - 一种敲降circRNA的siRNA序列及检测方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明属于技术领域，具体涉及一种敲降circRNA的siRNA序列及检测方法和应用。siRNA序列能特异性降低hsa_circ_0000437的表达量。本发明公开了siRNA序列，经设计，合成，转染，提取RNA，反转录，qPCR检测hsa_circ_0000437的表达变化以及敲低hsa_circ_0000437表达水平后对喉鳞癌细胞增殖的影响。本发明优势在于找到一个能特异性降低hsa_circ_0000437的siRNA序列，可用于制备特异性强的抗喉鳞癌药物。

Description

一种敲降circRNA的siRNA序列及检测方法和应用
技术领域
本发明属于分子诊断技术领域，具体涉及一种敲降circRNA的siRNA序列及检测方法和应用。
背景技术
喉癌的发病率逐年上升，喉鳞癌占到喉癌发病率的大多数，约占93％-99％，多为晚期发现，放疗，化疗及手术治疗效果不佳，预后效果不好，因此更深入地研究癌症发生发展的分子机制具有重要意义。目前认为喉鳞癌发生发展由多因素共同作用。非编码RNA家族中的环状RNA(circular RNA,circRNA)为无5’末端帽子和3’ploy A尾的结构的共价闭合环结构，在生物中广泛表达，并参与各种生物过程和信号通路调节。circRNA具有高度时空特异性、保守性和稳定性。此外，表达丰度高的特点。
RNA干扰(RNA interference，RNAi)技术是通过内源性或外源性双链RNA(oublestrand RNA，dsRNA)介导，特异性降解目的基因或抑制目的基因表达。RNAi已成为功能基因组研究的有力工具，具有特异性、选择性、高效性、作用迅速等特点。RNAi技术可以高效、特异的降低原癌基因的表达，从而抑制癌症的发生发展。因此，RNAi技术在肿瘤治疗中具有广阔的应用前景。
发明内容
针对上述问题本发明提供了一种敲降circRNA的siRNA序列及检测方法和应用。
为了达到上述目的，本发明采用了下列技术方案：
一种敲降circRNA的siRNA序列，所述siRNA序列由正义链和反义链组成；
正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：5’-AGAUUGCCAGAAAAAUAUGCA-3’；
反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：5’-UGCAUAUUUUUCUGGCAAUCU-3’。
一种敲降circRNA的siRNA序列的检测方法，包括以下步骤：
步骤1，设计合成siRNA序列：根据hsa_circ_0000437序列设计siRNA：
根据环状RNA的siRNA设计原则，使得siRNA序列跨过环状RNA的反向连接位点，首先让反向连接位点置于siRNA序列中间，降低siRNA的脱靶效应，然后将设计好的正义链：5’-AGAUUGCCAGAAAAAUAUGCA-3’和反义链：5’-UGCAUAUUUUUCUGGCAAUCU-3’通过化学方法合成，同时在siRNA的3’端添加两个TT脱氧核糖核苷酸，呈单链悬挂结构，增强siRNA序列的在体内和体外的稳定性，防止siRNA序列发生降解；
步骤2，siRNA转染细胞：
首先准备112.8μL opti-MEM+7.2μL siRNA(20uM)，用移液器吹打5～6次并混匀，室温下孵育5min得到120μL siRNA混合物备用；准备114μL opti-MEM+6μLlipofectamine3000，用移液器吹打5～6次并混匀，室温下孵育5min，得到120μLlipofectamine3000混合物备用；
然后向120μL siRNA混合物中加入120μL lipofectamine3000混合物，混匀，室温孵育15min，得240μL转染混合物；孵育过程中，移去细胞培养基，加入1200μL无抗生素完全培养基；每孔加入准备的240μL转染混合物，此时每个孔体积为1440μL；6h后更换含有双抗完全培养基培养；在转染48h后进行敲降效率检测；
步骤3，RNA抽提：细胞转染48h后，每个板用1mL TRIZOL溶解细胞；室温下静置5min。随后4℃，转速12,000g，离心15min；转移上清至新1.5mL EP管中，加200μL氯仿，用力震荡15s；然后待乳化混匀后静置5min，4℃，转速12,000g，离心15min，转移上清至新1.5mLEP管；加入与上清等体积的异丙醇后轻摇混匀，室温静置10min；4℃，转速12,000g，离心10min，离心管底部有白色沉淀产生，弃上清；继续向EP管中加入1mL用RNase free水配制的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀；4℃，转速12,000g，离心5min，弃上清，用移液枪吸尽水和乙醇；最后将有沉淀的EP管置于超净台中，干燥5min；沉淀溶解，提取Total RNA于-80℃保存；
步骤4，RT-PCR：在4℃下配制反转录反应液，然后加入Total RNA样品进行反转录；
步骤5，qPCR：配制PCR反应液，设置3个复孔，然后进行PCR反应，增加熔解曲线。
步骤6，细胞活力检测。
进一步，所述步骤2siRNA转染细胞中siRNA用量为：20μM为siRNA储存浓度，100nM为siRNA最终浓度，siRNA稀释后按需要量进行分装，避免反复冻融；
所述细胞铺板为：6孔板接种3×105的TU-177细胞，第二天细胞密度为60％～70％进行转染，转染前在显微镜下观察细胞状态和密度。
进一步，所述步骤4RT-PCR中RT反应液为HiScript 1st Strand cDNA SynthesisKit；
反转录体系由20μL RNase free ddH2O、10μL 2×RT Mix、2μL HiScript IIEnzyme Mix、1μL Oligo dT23VN(50μM)、1μL Random hexamers(50ng/μL)、1000ng TotalRNA组成；
反转录反应条件为:在25℃下反转录5min；然后在50℃下反转录15min；最后在85℃下反转录5min。
进一步，所述步骤5qPCR中所述PCR反应液由10μL AceQ qPCR SYBR Green MasterMix、0.4μL Primer1(10μM)、0.4μL Primer2(10μM)、2μL Template cDNA、7.2μL ddH2O组成，总体积为20μL；
所述PCR反应条件为：在95℃下反应5min，然后在95℃下反应10sec；再在60℃下反应30sec；对在95℃下反应10sec，在60℃下反应30sec，持续40个循环；
增加熔解曲线的条件为：在95℃下熔解15s，在60℃下熔解60s，然后以每升0.3℃收集一次荧光信号直到温度达到95℃，再在95℃下熔解15s。
再进一步，所述步骤5qPCR中所用引物为正向引物和反向引物：
正向引物q-circ-0000437-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-AAGGGTGACAGCAGTATTC-3’；
反向引物q-circ-0000437-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-GTCATAGAAAGGCAGCAAC-3’。
进一步，所述步骤6细胞活力检测的具体操作为：
首先将转染24h后的各组细胞胰酶消化后制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105个/mL，分别加到96孔板中，每孔100μL，即每孔细胞为1×104个细胞；然后收集各个时间点的细胞，加入CCK-8溶液；比例为1/10；即100μL培养液加入10μL检测液；孵育1h后，酶标仪检测溶液450nm吸光度值。
一种敲降siRNA序列的应用，应用于敲低hsa_circ_0000437表达水平后抑制喉鳞癌细胞增殖。
与现有技术相比本发明具有以下优点：
因为siRNA脱靶效应的缺陷，找到一个能降低目的基因表达的siRNA序列十分重要。本发明的siRNA序列能高效、特异性地抑制Hsa_circ_0000437水平表达，进而抑制喉鳞癌细胞TU-177生长，具有制备治疗喉鳞癌药物的潜能和应用前景。
附图说明
图1为circRNA的敲降效率图；
图2为细胞活力检测图。
具体实施方式
实施例1
设计合成siRNA序列
根据hsa_circ_0000437序列设计siRNA，包括包括
正义链：5’-AGAUUGCCAGAAAAAUAUGCA-3’；
反义链：5’-UGCAUAUUUUUCUGGCAAUCU-3’。
siRNA序列设计过程：
根据环状RNA的siRNA设计原则，siRNA序列必须跨过环状RNA的反向连接位点，最好让反向连接位点置于siRNA序列中间，降低siRNA的脱靶效应，本发明中设计的siRNA序列，其中以正义链为例：5’-AGAUUGCCAGAAAAAUAUGCA-3’，下划线的GA碱基即为环状RNAHsa_circ_0000437的反向连接位点，位于siRNA序列的中间位置。
将设计好的正义链：5’-AGAUUGCCAGAAAAAUAUGCA-3’和反义链：5’-UGCAUAUUUUUCUGGCAAUCU-3’委托上海吉玛公司通过化学方法合成，同时在siRNA的3’端添加两个TT脱氧核糖核苷酸，呈单链悬挂结构，增强siRNA序列的在体内和体外的稳定性，防止发生降解。
siRNA转染细胞：
siRNA用量：20μM为siRNA储存浓度，100nM为siRNA最终浓度，siRNA稀释后按需要量进行分装，避免反复冻融。
细胞铺板：6孔板接种3×105的TU-177细胞，第二天细胞密度为60％-70％进行转染。
细胞转染：
对于6孔板中的一个孔，按照以下程序进行转染，转染完成后每孔总体积1440μL：
1)112.8μL opti-MEM+7.2μL siRNA(20uM)，移液器吹打5-6次混匀，室温孵育5分钟。
2)114μL opti-MEM+6μL lipofectamine3000，移液器吹打5-6次混匀，室温孵育5分钟。
3)向上述120μl siRNA混合物中加入120μl lipofectamine3000混合物，混匀，室温孵育15min。
4)孵育过程中，移去细胞原先培养基，加入1200μL无抗生素的完全培养基。
5)每孔加入步骤3)准备的240μL转染混合物，此时每个孔体积为1200μL+240μL＝1440μL。
6)6小时后更换含有双抗完全培养基培养。
7)转染48hr后提取RNA进行qPCR检测，敲降组相对于对照组归一之后，敲降组中Hsa_circ_0000437的表达量降低80％左右(附图1)，表明该siRNA片段能够高效、特异性敲降circRNA表达水平。
RNA抽提：
1、细胞转染48h后，每个板直接用1mL TRIzol溶解细胞；
2、室温静置5min，12,000g，4℃离心15min。
3、用移液枪将上清转移至新的1.5mL EP管中，后加入200μl氯仿，用力震荡15s，待乳化混匀后静置5min；
4、4℃条件下转速12,000g，离心15min，将上清转移到新的1.5mL EP管；加入与上清等体积的异丙醇后轻摇混匀，室温下静置10min；
5、4℃，转速12,000g离心10min，离心管底部有白色沉淀产生，弃上清；
6、向EP管中加入用RNase free水配制的75％乙醇1mL，轻轻上下颠倒洗涤沉淀；
7、4℃，转速12,000g离心5min，弃上清；
8、将有沉淀的EP管置于超净台中打开风机，干燥约5min；
9、沉淀溶于适量的RNase-free ddH2O中，溶解沉淀；
10、提取的Total RNA直接进行下一步反转录实验或于-80℃保存。
RT-PCR：
按下列组份配制RT反应液。为了保证反应液配制的准确性,减少分装时造成的误差，应按照比实际用量稍大的体积配制反应液，最后加入RNA样品。
试剂：HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit
反转录体系：
Figure BDA0002375947280000071
反转录反应条件如下:
25℃ 5min
50℃ 15min
85℃ 5min
实时荧光定量PCR
1、配制PCR反应液，设置3个复孔：
Figure BDA0002375947280000081
2、进行PCR反应，程序如下：
Figure BDA0002375947280000082
增加熔解曲线
95℃，15s，
60℃，60s，
95℃，15s；
在60℃升到95℃过程中，每升0.3℃收集一次荧光信号；
细胞活力检测(cell cloning kit，CCK8)
1、将各组细胞胰酶消化后吹打混匀制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105个/ml，分别加到96孔板中，每孔100μl，即每孔细胞为1×104个细胞。
2、贴壁细胞需待细胞贴壁后，再收集各时间点细胞进行检测。
3、收集各个时间点的细胞(0h，24h，48h，72h，96h)加入CCK-8溶液(YEASEN,Cat.No.40203ES80)
比例为1/10。即100μl培养液加入10μl检测液。
4、孵育1h后，酶标仪读板，CCK8检测读取450nm吸光度值。
5、计算：生长曲线＝(规定时间点OD值-空白值)/(刚接种细胞时的OD值-空白值)，依据此做出细胞在不同时间的增长曲线，如图2细胞活力检测图所示，在喉鳞癌细胞TU-177中转染siRNA和对照序列，24h后将转染的两组细胞消化制成悬液，重新铺于96孔板，待细胞贴壁后，分别在0h，24h，48h，72h，96h加入CCK-8溶液，检测450nm吸光度值。不同时间的吸光度值与0h的吸光度值归一后，发现敲降Hsa_circ_0000437表达水平后，喉鳞癌细胞的增殖能力明显减弱(附图2)。
上述内容对实施例做了详细的说明，但本发明不受上述实施方式和实施例的限制，在不脱离本发明宗旨的前提下，在本领域技术人员所具备的知识范围内还可以对其进行各种变化和改进，这些变化和改进均落入本发明要保护的范围之内。
序列表
<110> 山西医科大学第一医院
<120> 一种敲降circRNA的siRNA序列及检测方法和应用
<160> 4
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 21
<212> RNA
<213> 人种(Artificial synthesis)
<400> 1
agauugccag aaaaauaugc a 21
<210> 2
<211> 21
<212> RNA
<213> 人种(Artificial synthesis)
<400> 2
ugcauauuuu ucuggcaauc u 21
<210> 3
<211> 19
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 3
aagggtgaca gcagtattc 19
<210> 4
<211> 19
<212> DNA
<213> 人种(Homo sapiens)
<400> 4
gtcatagaaa ggcagcaac 19

Claims (8)

1.一种敲降circRNA的siRNA序列，其特征在于：所述siRNA序列由正义链和反义链组成；
正义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示：
5’-AGAUUGCCAGAAAAAUAUGCA-3’；
反义链的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示：
5’-UGCAUAUUUUUCUGGCAAUCU-3’。
2.一种敲降circRNA的siRNA序列的检测方法，其特征在于：包括以下步骤：
步骤1，设计合成siRNA序列：根据hsa_circ_0000437序列设计siRNA：
根据环状RNA的siRNA设计原则，使得siRNA序列跨过环状RNA的反向连接位点，首先让反向连接位点置于siRNA序列中间，降低siRNA的脱靶效应，然后将设计好的正义链：5’-AGAUUGCCAGAAAAAUAUGCA-3’和反义链：5’-UGCAUAUUUUUCUGGCAAUCU-3’通过化学方法合成，同时在siRNA的3’端添加两个TT脱氧核糖核苷酸，呈单链悬挂结构，增强siRNA序列的在体内和体外的稳定性，防止siRNA序列发生降解；
步骤2，siRNA转染细胞：
首先准备112.8μL opti-MEM+7.2μL siRNA(20uM)，用移液器吹打5～6次并混匀，室温下孵育5min得到120μL siRNA混合物备用；准备114μL opti-MEM+6μL lipofectamine3000，用移液器吹打5～6次并混匀，室温下孵育5min，得到120μL lipofectamine3000混合物备用；
然后向120μL siRNA混合物中加入120μL lipofectamine3000混合物，混匀，室温孵育15min，得240μL转染混合物；孵育过程中，移去细胞培养基，加入1200μL无抗生素完全培养基；每孔加入准备的240μL转染混合物，此时每个孔体积为1440μL；6h后更换含有双抗完全培养基培养；在转染48h后进行敲降效率检测；
步骤3，RNA抽提：细胞转染48h后，每个板用1mL TRIZOL溶解细胞；室温下静置5min。随后4℃，转速12,000g，离心15min；转移上清至新1.5mL EP管中，加200μL氯仿，用力震荡15s；然后待乳化混匀后静置5min，4℃，转速12,000g，离心15min，转移上清至新1.5mL EP管；加入与上清等体积的异丙醇后轻摇混匀，室温静置10min；4℃，转速12,000g，离心10min，离心管底部有白色沉淀产生，弃上清；继续向EP管中加入1mL用RNase free水配制的75％乙醇，轻轻上下颠倒洗涤沉淀；4℃，转速12,000g，离心5min，弃上清，用移液枪吸尽水和乙醇；最后将有沉淀的EP管置于超净台中，干燥5min；沉淀溶解，提取Total RNA于-80℃保存；
步骤4，RT-PCR：在4℃下配制反转录反应液，然后加入Total RNA样品进行反转录；
步骤5，qPCR：配制PCR反应液，设置3个复孔，然后进行PCR反应，增加熔解曲线。
步骤6，细胞活力检测。
3.根据权利要求2所述的一种敲降circRNA的siRNA序列的检测方法，其特征在于：所述步骤2siRNA转染细胞中siRNA用量为：20μM为siRNA储存浓度，100nM为siRNA最终浓度，siRNA稀释后按需要量进行分装，避免反复冻融；
所述细胞铺板为：6孔板接种3×105的TU-177细胞，第二天细胞密度为60％～70％进行转染。
4.根据权利要求2所述的一种敲降circRNA的siRNA序列的检测方法，其特征在于：所述步骤4RT-PCR中RT反应液为HiScript 1st Strand cDNA Synthesis Kit；
反转录体系由20μL RNase free ddH2O、10μL 2×RT Mix、2μL HiScript II EnzymeMix、1μL Oligo dT23VN(50μM)、1μL Random hexamers(50ng/μL)、1000ng Total RNA组成；
反转录反应条件为：在25℃下反转录5min；然后在50℃下反转录15min；最后在85℃下反转录5min。
5.根据权利要求2所述的一种敲降circRNA的siRNA序列的检测方法，其特征在于：所述步骤5qPCR中所述PCR反应液由10μL AceQ qPCR SYBR Green Master Mix、0.4μL Primer1(10μM)、0.4μL Primer2(10μM)、2μL Template cDNA、7.2μL ddH2O组成，总体积为20μL；
所述PCR反应条件为：在95℃下反应5min，然后在95℃下反应10sec；再在60℃下反应30sec；对在95℃下反应10sec，在60℃下反应30sec，持续40个循环；
增加熔解曲线的条件为：在95℃下熔解15s，在60℃下熔解60s，然后以每升0.3℃收集一次荧光信号直到温度达到95℃，再在95℃下熔解15s。
6.根据权利要求5所述的一种敲降circRNA的siRNA序列的检测方法，其特征在于：所述步骤5qPCR中所用引物为正向引物和反向引物：
正向引物q-circ-0000437-F的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示：5’-AAGGGTGACAGCAGTATTC-3’；
反向引物q-circ-0000437-R的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示：5’-GTCATAGAAAGGCAGCAAC-3’。
7.根据权利要求2所述的一种敲降circRNA的siRNA序列的检测方法，其特征在于：所述步骤6细胞活力检测的具体操作为：
首先将转染24h后的各组细胞胰酶消化后制成细胞悬液，计数，调整细胞浓度为1×105个/mL，分别加到96孔板中，每孔100μL，即每孔细胞为1×104个细胞；然后收集各个时间点的细胞，加入CCK-8溶液；比例为1/10；即100μL培养液加入10μL检测液；孵育1h后，酶标仪检测溶液450nm吸光度值。
8.一种敲降siRNA序列的应用，其特征在于：应用于敲低hsa_circ_0000437表达水平后抑制喉鳞癌细胞增殖。
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