CN102174514B

CN102174514B - 一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其应用

Info

Publication number: CN102174514B
Application number: CN 201010575237
Authority: CN
Inventors: 王启钊; 刁勇; 许瑞安
Original assignee: Huaqiao University
Current assignee: Huaqiao University
Priority date: 2010-11-24
Filing date: 2010-11-24
Publication date: 2013-08-14
Anticipated expiration: 2030-11-24
Also published as: CN102174514A

Abstract

本发明公开了一种siRNA序列，具体为一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA序列，三对siRNA1、2、3序列都能抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的迁移，是很好的治疗肿瘤的药物。

Description

一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其应用

技术领域

本发明涉及siRNA双链序列及其应用，尤其是抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其抗肿瘤应用。

背景技术

RNAi是一种在生物体细胞内，由特异的内源性或外源性双链RNA(double stranded RNA，dsRNA)诱发其同源mRNA降解的基因沉默机制。RNAi现象是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因mRNA存在同源互补序列的dsRNA导入细胞后，能特异性地降解该mRNA，产生相应的功能表型缺失。RNAi首先由Fire等发现于秀丽隐杆线虫中，他们发现将dsRNA注入线虫体内后可抑制序列同源基因的表达，并证实这种抑制主要作用于转录之后，所以又将RNAi称为转录后基因沉默(PTGS)[Fire et al.，1998，FEBS Lett.2007 Jul]。RNAi广泛存在于生物界，从低等原核生物，到植物、真菌、无脊椎动物，甚至哺乳动物。研究发现对哺乳动物细胞，最有效的是21～23个碱基大小，3’端有两个突出碱基的siRNA。RNAi是dsRNA介导的转录后沉默，具有强大的细胞穿透能力，可在不同细胞间长距离传递和维持。RNAi效应具有两个明显的特征，特异性和高效性。siRNA的序列专一性要求非常严谨，与靶mRNA之间一个碱基错配都会显著削弱基因沉默的效果。因此，有效的RNAi依赖于siRNA的准确设计。siRNA的基因沉默效应取决于其靶基因序列的选择，任一碱基的错配都会导致RNAi效率减弱甚至丧失，这种高度的序列特异性使其对点突变、序列插入和缺失的选择性基因沉默具有明显的药理作用。siRNA主要通过脂质体转染、电穿孔、微注射以及质粒、病毒载体导入。RNAi技术发展至今已经超过10年，其在肿瘤中的研究也已经展开，RNAi的靶基因包括癌基因、甲基化相关基因、旁分泌/自分泌环、抗凋亡基因、血管形成相关基因、组织基质金属蛋白酶家族、细胞周期调控相关基因、癌转移相关基因、多药耐药相关基因等[Phalon et al.Expert Rev Mol Med.2010 Aug18；12：e26；Vázquez-Vega et al.Rev Invest Clin.2010；62(1)：81-90]。

Hmga2是人Hmga基因家族的3个主要成员之一。HMGA蛋白家族是一类以AT-hooks的高度保守的DNA结合基序和一个酸性拖尾为特征的小分子非组蛋白染色体蛋白。它们通过识别特定的DNA结构而不是一种特异的核苷酸序列来优先地结合到DNA中AT丰富的小沟内。由于HMGA蛋白家族具有通过改变染色体结构而调节很多目的基因表达的能力，使其通常被认为是结构性转录因子[Reeveset al.Environ Health Perspect，2000，108(Suppl 5)：803-809]。HMGA参与转录调节、胚胎形成、分化、致瘤性转化、病毒基因组的整合和表达等不同的生物学过程。

人的Hmga2基因位于12号染色体的q15区，5个外显子的跨度接近160kb，蛋白结构由109个氨基酸组成，其中外显子1、2、3编码的序列中各含一个AT hook。外显子4和5分别编码连接区和酸性区。这三个碱性八肽的DNA结合基序都能与DNA分子小沟内的AT丰富区结合，因而称为AT hook，其核心结构是BBXRGRXB(B代表碱性氨基酸K或R，X是甘氨酸或脯氨酸)。其中基序中间的保守RGR序列在HMGA2与DNA结合中至关重要。尽管单个DNA结合基序的结合特异性不高，但是如果结合其上的DNA存在间隔一定序列的AT丰富区，则由于多个基序与一个DNA分子结合而使亲和力大大提高。

HMGA2在正常生理活动中发挥着重要作用，当它出现异常时，就会导致疾病发生。1985年，在被病毒转化的大鼠甲状腺细胞株中，Giancotti发现了HMGA2，并首次将它与肿瘤联系起来[Giancotti et al.Cancer Res，1985，45(12 Pt 1)：6051-6057]。后期研究认为，HMGA2基因重排产生的突变蛋白与良性肿瘤有关，如脂肪瘤、肺部软骨错构瘤、多形性腺瘤、子宫平滑肌瘤；而全长蛋白过表达与恶性肿瘤发生发展有关。Hmga2在肺癌、乳腺癌、胰腺癌、白血病等大多数恶性肿瘤中均过表达，HMGA2蛋白的含量与肿瘤的进展相关。Hmga2是最近国内外研究较多的一个基因，除了在多种肿瘤中过度表达外，还与TNM分期、淋巴结转移等肿瘤事件息息相关，并被认为在表皮间质转化(EMT)过程中起到重要作用。它可以调控包括Snail1、Snail2、Twist、Id2等蛋白的转录从而影响EMT进程[Thuault etal.J Cell Biol，2006，174(2)：175-183]。

目前，针对HMGA2的研究逐渐增多，HMGA2参与多个与肿瘤发生发展相关的生理病理过程，因此，HMGA2有望成为肿瘤治疗的一个新靶点。针对Hmga2展开治疗的主要手段有反义核苷酸和RNAi干扰技术。Pentimalli等用腺病毒携带HMGA2反义核苷酸进入高分化脂肪肉瘤细胞，能够引起HMGA2阳性细胞的生长抑制，并诱导其凋亡，但对HMGA2阴性的癌细胞则没有相应作用[Pentimalli et al.Cancer Res，2003，63(21)：7423-7427.]。Malek等用siRNA沉默HMGA2(1146-1164)，能够导致卵巢癌细胞株周期阻滞与凋亡，还能够抑制Ovcar-3细胞在小鼠体内移植瘤的生长[Malek etal.Int J Cancer，2008，123(2)：348-356.]。siRNA还被用于沉默胚胎干细胞中Hmga2基因的表达。此外，HMGA23’UTR具有众多的microRNA结合位点，特别是7个保守的Let-7结合位点，为针对HMGA2的microRNA药物开发提供了合适的靶点。Yu等就使用let-7来抑制HMGA2，从而抑制乳腺癌的发生[Yu et al.Cell，2007，131(6)：1109-1123]。

本发明设计提供了一组针对Hmga2基因的s iRNA，通过筛选得到Hmga2siRNA1(990-1008)、Hmga2 siRNA2(1051-1069)、Hmga2 siRNA3(1113-1131)三对新的有效siRNA序列。所说三对针对Hmga2的siRNA，不但能直接抑制多种肿瘤细胞的增殖，还有削弱内皮细胞的增殖和迁移的能力。因此，本发明提供的三对新的有效siRNA可以从抗肿瘤本身和抗血管形成两个方面发挥治疗作用，具有广谱抗肿瘤功效。本发明提供的所述三对针对Hmga2的siRNA，迄今为止尚未见有国内外的相关报道。

发明内容

本发明的目的在于提供了一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA及其应用。三对siRNA1、2、3序列都能抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的迁移，是很好的治疗肿瘤的药物。

为了达成上述目的，本发明的解决方案是：

一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA，该序列为下列序列中的任意一条或一条以上；

siRNA1：正义链5’-UGGCCACAACAAGUUGUUCtt-3’，

反义链5’-GAACAACUUGUUGUGGCCAtt-3’；

siRNA2：正义链5’-AGCAGAAGCCACUGGAGAAtt-3’，

反义链5’-UUCUCCAGUGGCUUCUGCUtt-3’；

siRNA3：正义链5’-GGAGGAAACUGAAGAGACAtt-3’，

反义链5’-UGUCUCUUCAGUUUCCUCCtt-3’。

一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA用于制造治疗肿瘤的药物。

本发明的有益效果为：本发明针对Hmga2(NM_003483)基因设计了一组siRNA，筛选出三对siRNA序列可以抑制Hmga2基因和蛋白的表达。通过脂质体将合成的siRNA转入A549、NCI-H446、SPC-A1等肿瘤细胞株以及HUEVC、EVC-304血管内皮细胞株，设立对照组。经过MTT法检测siRNA双链对肿瘤细胞和血管内皮细胞生长的抑制，用Hoechst 33258染色检测siRNA对肿瘤细胞凋亡的影响，用RT-PCR验证siRNA对Hmga2表达的抑制作用。通过血管内皮细胞迁移实验检测siRNA对HUEVC和EVC304迁移能力的影响。结果表明：MTT显示Hmga2三对siRNA1、2、3对肿瘤细胞和血管内皮细胞的抑制作用与对照组相比，均有显著性差异(P＜0.05)，其中以Hmga2 siRNA3的抑制作用最为明显。RT-PCR证实，Hmga2 siRNA1、2、3对A549、NCI-H44、HUEVC中的Hmga2 mRNA都具有明显的抑制作用，其中，Hmga2 siRNA3对NCI-H446中Hmga2 mRNA的干扰作用最为明显。细胞迁移实验表明，Hmga2siRNA 1、2、3都能抑制肿瘤细胞和血管内皮细胞的迁移。本发明提供的Hmga2 siRNA不但能用于体外培养细胞的RNAi，同时也能用于体内实验，是很好的治疗肿瘤的药物。

附图说明

图1为本发明Hgma2 siRNA3转染入细胞的荧光照片；

其中：A-A549细胞；B-NCI-H446；C-SPC-A1

图2为本发明Hmga2 siRNA对A549细胞数量的影响形态学观察(结晶紫染色)；

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

图3为本发明Hmga2 siRNA对NCI-H446细胞数量的影响形态学观察；

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

图4为本发明Hmga2 siRNA对SPC-A1细胞数量的影响形态学观察；

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

图5为本发明Hmga2 siRNA1、2、3对EVC-304细胞数量的影响形态学观察(结晶紫染色)；

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

图6为本发明Hmga2 siRNA对HUEVC细胞数量的影响形态学观察(结晶紫染色)；

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

图7为本发明Hmga2 siRNA对A549细胞增殖能力的影响；

其中：1-对照；2-siRNA1；3-siRNA2；4-siRNA3；

-72h

，-96h

图8为本发明Hmga2 siRNA对NCI-H446细胞增殖能力的影响(96h)；

其中：1-siRNA1；2-siRNA2；3-siRNA3；4-对照

图9为本发明Hmga2 siRNA对SPC-A1细胞增殖能力的影响(96h)；

其中：1-siRNA1；2-siRNA2；3-siRNA3；4-对照

图10为本发明Hmga2 siRNA对EVC-304细胞增殖能力的影响(96h)；

其中：1-siRNA1；2-siRNA2；3-siRNA3；4-对照

图11为本发明Hmga2 siRNA对HUEVC细胞增殖能力的影响(96h)；

其中：1-siRNA1；2-siRNA2；3-siRNA3；4-对照

图12为本发明Hmga2 siRNA对A549肿瘤细胞迁移能力的影响；

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

图13为本发明Hmga2 siRNA对NCI-H446细胞迁移能力的影响；

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

图14为本发明Hmga2 siRNA对HUEVC血管内皮细胞迁移能力的影响；

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

图15为本发明Hmga2 siRNA对肺腺癌细胞系A549(左)和NCI-H446(右)Hmga2 mRNA水平的影响；

其中：1-siRNA1；2-siRNA2；3-siRNA3；C-对照；A-Hmga2；B-18S RNA

图16为本发明Hmga2 siRNA3对血管内皮细胞系HUEVC Hmga2 mRNA水平的影响；

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

图17为本发明Hmga2 siRNA对EVC-304细胞小管形成能力的影响。

其中：A-对照；B-siRNA1；C-siRNA2；D-siRNA3

具体实施方式

实施例1

抑制Hmga2基因表达的siRNA设计

siRNA采用Clontech公司软件，

(http://bioinfo.clontech.com/rnaidesigner/)。人Hmga2(NM_003483)基因编码序列由Entrez Gene(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.(fcgi？db＝gene)查找获得，输入编码区并选择限定条件，得到目的序列后进行BLAST分析，确定无同源序列的siRNA作为目的序列。siRNA序列中的A、G、C、U分别表示腺嘌呤核糖核苷酸、鸟嘌呤核糖核苷酸、胞嘧啶核糖核苷酸和鸟嘧啶核糖核苷酸，T表示胸腺嘧啶脱氧核糖核苷酸。阴性对照序列由上海吉玛公司提供。筛选得到针对Hmag2基因的3对Hmga2 siRNA以及对照siRNA如下：

Hmga2 siRNA处理96h后，细胞培养液中加入10μl 5mg/ml MTT，

Hmga2 siRNA1 正义链 5’-UGGCCACAACAAGUUGUUCtt-3’

seq.1

反义链 5’-GAACAACUUGUUGUGGCCAtt-3’

seq.2

Hmga2 siRNA2 正义链 5’-AGCAGAAGCCACUGGAGAAtt-3’

seq.3

反义链 5’-UUCUCCAGUGGCUUCUGCUtt-3’

seq.4

Hmga2 siRNA3 正义链 5’-GGAGGAAACUGAAGAGACAtt-3’

seq.5

反义链 5’-UGUCUCUUCAGUUUCCUCCtt-3’

seq.6

Control siRNA正义链 5’-UUCUCCGAACGUGUCACGUtt-3’

seq.7

反义链 5’-ACGUGACACUGGCGGAGAAtt-3’seq.

8

继续培养4h后吸弃培养液，每孔加入100μl DMSO，震荡使结晶物充分溶解，于酶标仪490nm处测OD值，以630nm作为参比波长，按下列公式计算相对增殖率。

结果如图7、8、9、10、11所示，Hmga2 siRNA1、2、3对肿瘤细胞的抑制作用明显高于对照siRNA，其中尤其以Hmga2 siRNA3最为明显。Hmga2siRNA1、2、3不但抑制肿瘤细胞的增殖，还抑制血管内皮细胞HUEVC和EVC-304细胞的增殖，其中也以Hmga2 siRNA3最为明显。而且Hmga2 siRNA对内皮细胞的抑制作用强于肿瘤细胞。

实施例2

Hmga2 siRNA的标记与转染效率验证

Hmga2 siRNA3作为Cy3标记的对象，Cy3标记采用Ambion siRNA标记试剂盒进行，按说明书进行操作。标记好后，在转染前一天，在无双抗培养基中接种细胞(24孔板，每孔加500μl，转染时细胞的汇合度达30-50％)。用适量无血清OPTI-MEMI培养基稀释经过标记的Hmga2 siRNA3(50μl)，轻轻混匀。摇匀Lipofectamine 2000，取适量用OPTI-MEM I稀释并轻轻混匀后室温孵育5min。将稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine 2000轻轻混合，室温孵育20min；将siRNA/Lipofectamine2000复合物加入24孔板(siRNA的终浓度为40nM)，前后轻轻摇动混合；37℃，CO₂培养箱孵育48h，荧光显微镜下观察细胞转染效率。如图1所示，在A549细胞、NCI-6446细胞以及SPC-A1细胞中，转染阳性的细胞超过80％。

实施例3

Hmga2 siRNA的体外转染及对肿瘤细胞和血管内皮细胞的影响

于转染前一天，在无双抗培养基中接种细胞(96孔板，每孔加100μl，转染时细胞的汇合度达30-50％)。实验中，设Hmga2 siRNA1组、Hmga2 siRNA2组、Hmga2 siRNA3组以及对照siRNA组，每组6孔。用适量无血清OPTI-MEMI培养基稀释Hmga2 siRNA1、2、3和对照siRNA(50μl)，轻轻混匀。摇匀Lipofectamine 2000，取适量用OPTI-MEM I稀释并轻轻混匀后室温孵育5min。将稀释的siRNA和稀释的Lipofectamine 2000轻轻混合，室温孵育20min；将siRNA/Lipofectamine 2000复合物加入24孔板(siRNA的终浓度为40n mol/L)，前后轻摇混合；37℃，CO₂培养箱孵育72h-96h，显微镜下观察细胞细胞的形态。如图2、3、4、5、6所示，Hmga2 siRNA1、2、3均可抑制A549、NCI-6446、SPC-A1、EVC-304、HUEVC细胞增值，其中尤以Hmga2 siRNA3最为明显。

实施例4

Hmga2 siRNA体外转染后对细胞迁移能力的影响

体外转染方法同实施例3，转染siRNA后48h，消化细胞，终止消化后离心弃去培养液，用PBS洗1-2遍，用含1％BSA的无血清培养基重悬；取细胞悬液200μl加入Transwell小室(8μm)；24孔板下室一般加入500μl含5％FBS的DMEM培养基；培养细胞：常规培养12-48h；用棉签擦去上室内的细胞，用0.1％结晶紫染色，拍照，结晶紫检测穿过膜的细胞数。结果如图12、13、14所示，Hmga2 siRNA1、2、3不仅能抑制肿瘤细胞的迁移，还可抑制血管内皮细胞的迁移。

实施例5

Hmga2 siRNA体外转染后的Hmga2基因抑制效率检测

取对数生长期的A549细胞、NCI-H446细胞以及HUEVC细胞，制成5×10⁴个/ml的细胞悬液，加到6孔细胞培养板(Corning公司)，每孔2ml，设Hmga2 siRNA1组、Hmga2 siRNA2组、Hmga2 siRNA3组以及对照siRNA组，每组3孔，按分组转然后，吸去上清，加入胰酶消化并收集细胞，用Trizol法提取细胞总RNA，具体步骤为：每孔加入1ml Trizol，裂解细胞后转移至1.5ml EP管，混匀，室温静置5min；加入0.2ml氯仿，振荡15s，静置2min；4℃离心，12,000g×15min，取上清；加入0.5ml异丙醇，将管中液体轻轻混匀，室温静置10min；4℃离心，12,000g×10min，弃上清；加入1ml 75％乙醇，轻轻洗涤沉淀，4℃，7,500g×5min，弃上清；晾干，加入适量的DEPC水溶解。制备的RNA溶液于260nm及280nm处测定吸光值，计算mRNA的纯度及含量。进一步进行反转录。具体步骤为：在PCR管中配制下列混合液：dNTP混合物(1.0μl)、Oligo dT引物(1.0μl)、RNA模板(1.0μl)，加DEPC水至10μl；在PCR仪上进行变性、退火反应，65℃，5min，4℃放置10min；离心20秒钟使模板RNA/引物等的混合液聚集于PCR管底部；在上述PCR管中配制下列反转录反应液：5×PrimeScript RT缓冲液(4.0μl)、RNase抑制剂(0.5μl)、PrimeScript RT酶(0.5μl)，加DEPC水至20μl。在PCR仪上按下列条件进行反转录反应，30℃10min，42℃30min，95℃5min，4℃放置备用。图15为3对Hmga2 siRNA对A549和NCI-H446细胞中对Hmga2基因抑制的电泳图，图16为3对Hmga2 siRNA对HUEVC细胞中Hmga mRNA抑制作用的QRT-PCR分析结果。结果表明，Hmga2 siRNA对三种细胞中的Hmga2基因的抑制效率都可以超过50％，其中尤其以Hmga2 siRNA3最为明显，对三种细胞中Hmga2基因抑制率都可以达到80％。

实施例6

Hmga2 siRNA体外转染后对血管内皮细胞小管形成能力的影响

体外转染方法同实施例3，转染siRNA后48h，取出ECM(Sigma)4℃融化；在96孔板中每孔加入30μL的ECM，37℃培养箱放置30min；胰酶消化EVC-304细胞，无血清培养基洗3遍后，用1％FBS的培养基重悬，调整细胞密度为2×10⁵个/ml；在已铺好ECM的培养板中加入100μl细胞悬液，37℃培养12-24h观察小管形成。结果如图17所示，3对Hmga2 siRNA均能抑制内皮细胞形成小管。

实施例7

siRNA在制备肿瘤治疗药物中的应用。本发明所得针对Hmga2基因的siRNA1、siRNA2、siRNA3用于制备治疗肿瘤的药物。用于人类体内给药，可单独使用或者与其他药物联合使用。

Claims

1.一种抑制Hmga2基因表达的双链siRNA，其特征是：其核苷酸序列如下；

siRNA2：正义链5'-AGCAGAAGCCACUGGAGAAtt-3’，

反义链5'-UUCUCCAGUGGCUUCUGCUtt-3’。