CN101353655B - 抑制血管内皮生长因子受体基因表达的siRNA及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种抑制VEGFR1基因表达的siRNA,其特征是,其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任一种:正义链:5’-CUAGCUGUACCUACUUCAA AGAAGA-3’,反义链:5’-UCUUCUUUGAAGUAGGUACAGCUAG-3’;正义链:5’-CAAUCUUGCUGAGCAUAAA ACAGUC-3’,反义链:5’-GACUGUUUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3’;正义链:5’-GCAGCACGCUGUUUAUUGAAAGAGU-3’,反义链:5’-ACUCUUUCAAUAAACAGCGUGCUGC-3’;或上述三对核苷酸序列的任一对正义链的3’末端、反义链中5’末端对应缺失1-6个碱基的双链RNA分子。因此,本发明所述的siRNA能有效抑制VVEGFR11基因的表达,为制备预防或治疗血管内皮生长因子受体相关疾病的药物或制剂提供了新的,较好的选择。
Description
技术领域
本发明属于分子生物学与生物医药技术领域,具体为抑制血管内皮生长因子受体1(VEGFR1)mRNA表达的siRNA及其应用。
背景技术
RNA干扰(RNA interference,RNAi),又叫基因沉默,是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA,dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。它是一种在动植物中广泛存在的序列特异性转录后水平的基因沉默过程,是生物基因组抵抗病毒之类的外来遗传元件入侵的一种生物保护机制。
生物体内的双链RNA可来自于RNA病毒感染、转座子的转录产物、外源导入的基因。这些来源的双链RNA诱发了细胞内的RNAi机制,结果是病毒被清除,转座子的表达被阻断,外源导入基因表达被阻断,同时,与其内源的细胞基因组中的基因也被阻断。
RNAi还具有很高的特异性。19个核苷酸的双链RNA几乎可以完全抑制基因的表达,而将其中的一个核苷酸突变掉后,它对基因的抑制作用就消失了(Brummelkamp.T.R,Bernads.R.Agami.R.A system for stable expression of short interering RNAs in Mammalian cells.Science.2002;296:550-553),这对双链RNA的应用是非常重要的,这可以避免双链RNA降解与靶mRNA同家族的其他的mRNA。最有效的小分子干扰RNA(small interference RNA,以下简称siRNA)是19个碱基大小、且3’端有两个碱基突出(悬挂碱基)的双链RNA。siRNA的序列专一性要求非常严格,与靶mRNA之间的一个碱基错配都会显著消弱基因沉默的效果(Brown D,Jarvis R,Pallotta V and et al.,RNA interference in mammalian cell culture:design,execution and analysis of the siRNA effect.Technotes,9(1):3-5;MiyagishiM and Taira K.,U-6 promoter-driven siRNAs with four uridine 3’-over hangsefficiently suppress targeted gene expression in mammalian cells.NatureBiotechnology,20:497-500)。
快速发展的RNAi技术为恶性肿瘤机制的研究提供了有力工具,同时也推动了以该技术为基础的肿瘤治疗策略的研发进程。
肿瘤的生长和转移需要生成新的血管。在肿瘤形成的早期,肿瘤细胞主要通过扩散作用获得营养和氧气,但这样肿瘤仅能长至2~3mm3。为了进一步的生长和迁移,必须有新的血管的生成,新生成的血管把还在生长的肿瘤和循环系统直接连接起来,使其供肿瘤生长的物质得以交换。除此之外,肿瘤还利用新生血管通过血液循环将原发癌细胞输送至转移靶器官。因此,血管新生与肿瘤生长、转移有着密切的关系。血管的生成是复杂的过程。它是由内皮细胞、细胞外基质以及正负调控因子相互作用的多步骤过程。其中血管内皮生长因子(VEGF)作为血管生成的正性调控因子在血管生成过程中起到关键作用。VEGF具有增加微血管的通透性、促进不同来源的内皮细胞分裂增殖和血管构建、促进内皮细胞的迁移等多种作用,是已知的最强的血管生成因子。而VEGF的生物学效应均是通过其特异性受体VEGFR介导来实现的。VEGFR可导致由配体介导的二聚体化。受体的二聚体化促使相邻受体亚基自身磷酸化和去磷酸化从而触发信号转导,最终造成内皮细胞分裂增生,血管内皮通透性增加等。所以VEGF及其受体家族被认为是抗肿瘤治疗理想的分子靶点。
发明内容
本发明的目的在于提供能在mRNA水平上抑制血管内皮细胞(HUVEC)VEGFR1基因表达的siRNA.
实现上述目的的技术方案如下:
一种抑制VEGFR1基因表达的siRNA,其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任一种:正义链:5’-CUAGCUGUACCUACUUCAA AGAAGA-3’,反义链:5’-UCUUCU UUGAAGUAGGUACAGCUAG-3’;正义链:5’-CAAUCUUGCUGAGCAUAAA ACAGUC-3’,反义链:5’-GACUGU UUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3’;正义链:5’-GCAGCACGCUGUUUAUUGA AAGAGU-3’,反义链:5’-ACUCUUUCAAUAAACAGCGUGCUGC-3’,或上述三对核苷酸序列的任一对正义链3’末端、反义链中5’末端对应缺失1-6个碱基的双链RNA分子。
优选地,所述抑制VEGFR1基因表达的siRNA为以下双链RNA分子中的任一种:正义链:5’-CUAGCUGUACCUACUUCAA-3’,反义链:5’-UUGAAGUAGGUACAGCUAG-3’;正义链:5’-CAAUCUUGCUGAGCAUAAA-3’,反义链:5’-UUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3’;正义链:5’-GCAGCACGCUGUUUAUUGA-3’,反义链:5’-UCAAUAAACAGCGUGCUGC-3’。
所述双链RNA分子的3’末端还可设有两个脱氧核苷组成的悬挂碱基(Over-hang),所述悬挂碱基例如可为本领域技术人员熟知的dTdT或dTdC或dUdU等,以增加siRNA的活性。
更优选地,所述抑制VEGFR1基因表达的siRNA为正义链:5’-CAAUCUUGCUGAGCAUAAA dTdT-3’,反义链:5’-UUUAUGCUCAGCAAGAUUG dTdT-3’。
优选地,上述抑制VEGFR1基因表达的siRNA为任意部分经化学修饰的双链RNA分子;所述化学修饰包括对连接核苷酸的磷酸二酯键的部分修饰或用其它任何化学建取代;化学修饰包括对这些siRNA分子核酸戊糖的2位上的OH作任何化学的修饰和改变,例如,所述2’位上的OH作化学的修饰为CH3O_,F-,CH3OCH2CH2O_,CH3NHCH2CH2O。
本发明的另一目的是提供上述siRNA在制药中的应用。
实现上述目的的技术方案如下:
上述抑制VEGFR1基因表达的siRNA在制备预防或治疗人类血管内皮生长因子受体相关的疾病的药物或制剂中的应用。
所述疾病为肺癌、肝癌、食管癌、白血病、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、头颈癌、脑瘤、胶质细胞瘤的任一种或多种。
本发明所述抑制VEGFR1基因表达的siRNA序列的长度为19-25bp,这些siRNAs既足够长诱导基因特异性抑制,又足够短,逃避宿主干扰素反应。因此,本发明所述的siRNA能有效抑制VEGFR1基因的表达,为制备预防或治疗血管内皮生长因子受体相关疾病的药物或制剂提供了新的,较好的选择。
附图说明
图1是各实验组和对照组分别作用于HUVEC细胞后Real-time RT-PCR法检测各处理组细胞中VEGFR1 mRNA的表达量;
图2是Real time RT-PCR法检测50nM~1nM浓度梯度的VEGFR1 siRNA2转染后VEGFR1 mRNA表达量;
图3是Real time RT-PCR法检测500pM~50pM浓度梯度VEGFR1 siRNA2转染后VEGFR1 mRNA表达量;
图4是RT-PCR检测不同处理组VEGFR1 mRNA的表达量。
具体实施方式
发明人采用siRNA设计法则,并结合发明人自主开发的设计软件辅助设计抑制VEGFR1基因表达的siRNA序列,通过大量实验筛选多条高效VEGFR1 siRNA序列:其核苷酸序列为以下双链RNA分子中的任一种:正义链:5’-CUAGCUGUACCUACUUCAA AGAAGA-3’,反义链:5’-UCUUCUUUGAAGUAGGUACAGCUAG-3’;正义链:5’-CAAUCUUGCUGAGCAUAAA ACAGUC-3’,反义链:5’-GACUGUUUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3’;正义链:5’-GCAGCACGCUGUUUAUUGA AAGAGU-3’,反义链:5’-ACUCUU UCAAUAAACAGCGUGCUGC-3’。其中,任一对正义链3’末端、反义链中5’末端对应缺失1-6个碱基是指正义链和相应的反义链互补配对,当选择的正义链为具有20个核苷酸时,则其互补配对的反义链也具有20个核苷酸。
上述任一条抑制VEGFR1基因表达siRNA可用于制备预防或治疗人类血管内皮生长因子受体1相关的任何疾病的药物或制剂。
表1 VEGFR1 siRNA-27bp
实施例一:VEGFR1 siRNA的设计与合成。
首先在美国国立生物技术信息中心NCBI数据库中获取人VEGFR1 mRNA的序列全长(序列号:NM_002019),使用本实验室自主开发的siRNA设计软件,设计三条VEGFR1 siRNA和一条阴性对照siRNA(Notarget siRNA)。此外,设计了dTdT悬挂末端,以增加siRNA的稳定性。设计的siRNA由广州市锐博生物科技有限公司合成。(本发明中,其它VEGFR1 siRNA的设计与此相同)
表2设计的VEGFR1 siRNA及阴性对照Notarget siRNA
实施例二:Real time RT-PCR法检测3条VEGFR1 siRNA对VEGFR1 mRNA表达的抑制效果
人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)培养于含2%胎牛血清的EGM-2培养液中,置于5%CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养,用0.25%的胰蛋白酶消化传代。
取第2-8代的HUVEC细胞,转染前24h将细胞接种于6孔培养板,接种密度为1×105/孔,使得次日转染时细胞融合度达30%~50%。根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染,设空白对照组、阴性对照转染组(Notarget siRNA)、VEGFR1 siRNA1转染组、VEGFR1 siRNA2转染组、VEGFR1 siRNA3转染组。转染方案为:在250μL OPTI-MEM中加入5μL 20μM的siRNA,室温孵育5min。在250μL OPTI-MEM中加入5μL LipofectamineTM 2000,室温孵育5min。将上述两种稀释液混匀,室温孵育20min后加入细胞板孔中,细胞置于培养箱常规培养。
收集转染后24-48h的细胞,6孔板每孔加入1mL Trizol,加入氯仿和异丙醇按常规方法抽提细胞总RNA,所提RNA溶于40μL无RNA酶水中,紫外分光光度计检测各处理组RNA的含量和纯度,并进行凝胶电泳,观察RNA完整性。以oligo(dT)15为引物,1μg RNA为模板,按Promega逆转录试剂盒操作生成cDNA。
各取逆转录的cDNA产物1.6μL做模板,利用SYBR Green I染料实时定量PCR试剂盒检测不同转染组细胞中的VEGFR1 mRNA表达,并以无RNA酶水作为阴性模板对照,以β-Actin作为内参。引物序列根据GenBank公布的cDNA序列设计,并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件为:95℃预变性10s;94℃变性5s;退火30s;72℃延伸1s;45个循环。用2-△△CT法计算和分析VEGFR1基因的相对表达量,确定VEGFR1基因的mRNA被siRNA沉默的程度。
①VEGFR1基因PCR扩增长度为262bp,退火温度为55.5℃。
上游引物:5’-GGTATCCCTCAACCTACA-3’
下游引物:5’-CCACAGTCCCAACTTTATT-3’
②β-Actin基因PCR扩增长度为452bp,退火温度为60℃。
上游引物:5’-CGTACCACTGGCATCGTGAT-3’
下游引物:5’-GTGTTGGCGTACAGGTCTTTG-3’
结果见图1。
图1显示,在50nM的转染浓度下,与Notarget siRNA转染组比较,VEGFR1 siRNA1对VEGFR1 mRNA的抑制率达到66%,VEGFR1 siRNA2对VEGFR1 mRNA的抑制率达到96%。
实施例三:Real time RT-PCR法检测50nM~1nM浓度梯度的VEGFR1 siRNA2对VEGFR1 mRNA表达的抑制效果
人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)培养于含2%胎牛血清的EGM-2培养液中,置于5%CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养,用0.25%的胰蛋白酶消化传代。
取第2-8代的HUVEC细胞,转染前24h将细胞接种于6孔培养板,接种密度为1×105/孔,使得次日转染时细胞融合度达30%~50%。根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染,设空白对照组、阴性对照转染组(Notarget siRNA)、VEGFR1 siRNA2 50nM转染组、VEGFR1 siRNA2 20nM转染组、VEGFR1 siRNA2 10nM转染组、VEGFR1 siRNA2 1nM转染组。根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染。
收集转染后24-48h的细胞,6孔板每孔加入1mL Trizol,加入氯仿和异丙醇按常规方法抽提细胞总RNA,所提RNA溶于40μL无RNA酶水中,紫外分光光度计检测各处理组RNA的含量和纯度,并进行凝胶电泳,观察RNA完整性。以oligo(dT)15为引物,1μg RNA为模板,按Promega逆转录试剂盒操作生成cDNA。
各取逆转录的cDNA产物1.6μL做模板,利用SYBR Green I染料实时定量PCR试剂盒检测不同转染组细胞中的VEGFR1 mRNA表达,并以无RNA酶水作为阴性模板对照,以β-Actin作为内参。引物序列根据GenBank公布的cDNA序列设计(同实施例2),并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件为同实施例二。
结果见图2。
图2显示了50nM、20nM、10nM、1nM四个浓度梯度的Real time RT-PCR结果,与转染浓度为50nM的Notarget siRNA比较,VEGFR1 siRNA2转染浓度为1nM时,对VEGFR1 mRNA表达的抑制率仍能达到94%左右。
实施例四:Real time RT-PCR法检测50nM~1nM浓度梯度的VEGFR1 siRNA2对VEGFR1 mRNA表达的抑制效果
人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)培养于含2%胎牛血清的EGM-2培养液中,置于5%CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养,用0.25%的胰蛋白酶消化传代。
取第2-8代的HUVEC细胞,转染前24h将细胞接种于6孔培养板,接种密度为1×105/孔,使得次日转染时细胞融合度达30%~50%。根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染,设空白对照组、阴性对照转染组(Notarget siRNA)、VEGFR1 siRNA2 500pM转染组、VEGFR1 siRNA2 250pM转染组、VEGFR1 siRNA2 100nM转染组、VEGFR1 siRNA2 50pM转染组。根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染。
收集转染后24-48h的细胞,6孔板每孔加入1mL Trizol,加入氯仿和异丙醇按常规方法抽提细胞总RNA,所提RNA溶于40μL无RNA酶水中,紫外分光光度计检测各处理组RNA的含量和纯度,并进行凝胶电泳,观察RNA完整性。以oligo(dT)15为引物,1μg RNA为模板,按Promega逆转录试剂盒操作生成cDNA。
各取逆转录的cDNA产物1.6μL做模板,利用SYBR Green I染料实时定量PCR试剂盒检测不同转染组细胞中的VEGFR1 mRNA表达,并以无RNA酶水作为阴性模板对照,以β-Actin作为内参。引物序列根据GenBank公布的cDNA序列设计(同实施例2),并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件为同实施例二。
结果见图3。
图3显示了500pM、250pM、100pM、50pM四个浓度梯度的Real time RT-PCR结果,与转染浓度为50nM的Notarget siRNA比较,VEGFR1 siRNA2转染浓度为50pM时,对VEGFR1mRNA表达的抑制率仍能达到50%左右。这些结果表明,我们筛选出的针对VEGFR1基因特异的siRNA2在极低的转染浓度下能够达到很好的干扰效果。
上述实施例1-4中,将所述针对VEGFR1 mRNA编码区不同位置的3条VEGFR1 siRNA序列和一条阴性对照siRNA(Notarget siRNA)分别转入人脐静脉血管内皮细胞HUVEC。结果显示,与转入阴性对照siRNA相比,VEGFR1 siRNA转入组HUVEC细胞中VEGFR1的mRNA的表达量均有不同程度的降低,其中VEGFR1 siRNA2的降低效果最明显。虽然针对同一靶基因,但位置不同,效果不同。随后,发明人对效果最好的VEGFR1 siRNA2进行了siRNA的浓度梯度效果检测。结果表明,VEGFR1 siRNA2转染浓度为50pM时,对VEGFR1基因的沉默效果还能达到50%左右。实施例五:27个碱基的siRNA和化学修饰的siRNA对VEGFR1 mRNA沉默效果的监测。
人脐静脉血管内皮细胞(HUVEC)培养于含2%胎牛血清的EGM-2培养液中,置于5%CO2、37℃饱和湿度的孵箱中培养,用0.25%的胰蛋白酶消化传代。
取第2-8代的HUVEC细胞,转染前24h将细胞接种于6孔培养板,接种密度为1×105/孔,使得次日转染时细胞融合度达30%~50%。根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染,设空白对照组、阴性对照转染组(Notarget siRNA)、VEGFR1 siRNA2 50nM转染组、VEGFR1 siRNA2 20nM转染组、VEGFR1 siRNA2 10nM转染组、VEGFR1 siRNA2 1nM转染组。根据LipofectamineTM 2000试剂操作指南进行转染。
收集转染后24-48h的细胞,6孔板每孔加入1mL Trizol,加入氯仿和异丙醇按常规方法抽提细胞总RNA,所提RNA溶于40μL无RNA酶水中,紫外分光光度计检测各处理组RNA的含量和纯度,并进行凝胶电泳,观察RNA完整性。以oligo(dT)15为引物,1μg RNA为模板,按Promega逆转录试剂盒操作生成cDNA。
各取逆转录的cDNA产物1.6μL做模板,利用PCR试剂盒检测不同转染组细胞中的VEGFR1mRNA表达,并以无RNA酶水作为阴性模板对照,以β-Actin作为内参。引物序列根据GenBank公布的cDNA序列设计(同实施例2),并由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。PCR反应条件为同实施例二。
结果见图4。
参见图4:其中,1为VEGFR1 siRNA2 21bp(SEQ7、8,有dTdT悬垂)未修饰组;2为VEGFR1siRNA2 21bp(有dTdT悬垂碱基,正反义链3’、5’末端的三个碱基甲基化,反义链的5’末端磷酸化)修饰组;3为VEGFR1 siRNA5 27bp(SEQ3、4,有dTdT悬垂)未修饰组;4为VEGFR1siRNA2 19bp(无悬垂碱基,正义链所有碱基2’甲基化,反义链5’端磷酸化)修饰组;5为Notarget siRNA组;6:空白对照组。
结果分析:结果显示,与Notarget siRNA组相比,VEGFR1 siRNA2 21bp(有dTdT悬垂)未修饰组对VEGFR1 mRNA的沉默效果最好。VEGFR1 siRNA2 21bp(有dTdT悬垂,正反义链3’、5’末端的三个碱基甲基化,反义链的5’末端磷酸化)修饰组和VEGFR1 siRNA5 27bp未修饰组也有很好的沉默效果,Notarget siRNA组和空白对照组之间无明显差异。
系列表
<110>中国科学院广州生物医药与健康研究院
<120>抑制血管内皮生长因子受体基因表达的siRNA及其应用
<160>14
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>25
212>RNA
<213>人工序列
<400>1
cuagcuguac cuacuucaaa gaaga 25
<210>2
<211>25
<212>RNA
<213>人工序列
<400>2
ucuucuuuga aguagguaca gcuag 25
<210>3
<211>25
<212>RNA
<213>人工序列
<400>3
caaucuugcu gagcauaaaa caguc 25
<210>4
<211>25
<212>RNA
<213>人工序列
<400>4
gacuguuuua ugcucagcaa gauug 25
<210>5
<211>25
<212>RNA
<213>人工序列
<400>5
gcagcacgcug uuuauugaa agagu 25
<210>6
<211>25
<212>RNA
<213>人工序列
<400>6
acucuuucaa uaaacagcgu gcugc 25
<210>7
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>7
cuagcuguac cuacuucaa 19
<210>8
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>8
uugaaguagg uacagcuag 19
<210>9
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>9
caaucuugcu gagcauaaa 19
<210>10
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>10
uuuaugcuca gcaagauug 19
<210>11
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>11
gcagcacgcu guuuauuga 19
<210>12
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>12
ucaauaaaca gcgugcugc 19
<210>13
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>13
uucuccgaac gugucacgu 19
<210>14
<211>19
<212>RNA
<213>人工序列
<400>14
acgugacacg uucggagaa 19
Claims (3)
1.一种抑制VEGFR1基因表达的siRNA,其特征是,其核苷酸序列为以下双链RNA分子:正义链:5’-CAAUCUUGCUGAGCAUAAA ACAGUC-3’,反义链:5’-GACUGU UUUAUGCUCAGCAAGAUUG-3’;所述双链RNA分子的3’末端还设有以两个脱氧核苷组合的悬挂碱基。
2.如权利要求1所述抑制VEGFR1基因表达的siRNA在制备预防或治疗人类血管内皮生长因子受体相关的疾病的药物或制剂中的应用。
3.根据权利要求2所述的应用,其特征是,所述疾病为肺癌、肝癌、食管癌、白血病、宫颈癌、结直肠癌、胰腺癌、肾癌、膀胱癌、乳腺癌、前列腺癌、胃癌、口腔上皮癌、卵巢癌、头颈癌、脑瘤、胶质细胞瘤的任一种或多种。
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