CN102181445A

CN102181445A - 一种靶向lin28基因的干扰小分子rna及其抗胶质瘤增殖的用途

Info

Publication number: CN102181445A
Application number: CN2011100674458A
Authority: CN
Inventors: 夏清梅; 车丽花; 殷珊; 黄红军; 陈国泽; 潘讴东
Original assignee: SHANGHAI SHENGBO BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Current assignee: SHANGHAI SHENGBO BIOMEDICAL TECHNOLOGY Co Ltd
Priority date: 2011-03-21
Filing date: 2011-03-21
Publication date: 2011-09-14

Abstract

本发明涉及一种靶向LIN28基因干扰小分子RNA及其抗胶质瘤迁移的用途。该干扰小分子RNA为SEQNO.1所示的碱基序列。本发明设计对抑制胶质瘤增殖有作用的基因的干扰小分子RNA，应用胶质瘤细胞模型研究其对胶质瘤增殖的抑制作用，为胶质瘤的基因治疗提供了一种新方法。

Description

一种靶向LIN28基因的干扰小分子RNA及其抗胶质瘤增殖的用途

技术领域

本发明涉及一种靶向LIN28基因的干扰小分子RNA及其抗胶质瘤增殖的用途。

背景技术

Lin28最早在线虫中发现控制发育时段的异常基因。大量的研究表明，Lin28和Lin28B在发育和疾病领域有广泛而重要的作用。在人类纤维母细胞被诱导为多功能干细胞的过程中，Lin28是四个关联诱导因子之一，在诱导分化过程发挥调节作用，同时发现Lin28和Lin28B的表达在多种癌中激活，他们的过表达常诱导细胞形状的改变。已有研究揭示在胚胎细胞生物学、细胞再分化、发育和癌症的探索过程中Lin28都具有重要的生物学作用。Lin28基因对肿瘤细胞的增殖方面的研究，在国内外尚未见诸报道。

脑胶质瘤是中枢神经系统中最常见的原发性脑肿瘤，起源于神经胶质细胞。由于恶性脑胶质瘤具有生长迅速，侵袭性强，手术后容易复发，病死率高等的特点，尽管包括手术切除术，放疗以及化疗在内的脑胶质瘤综合治疗水平在不断提高，但其总体疗效仍不理想。患上多形性胶质母细胞瘤（WHO IV级）的病人的平均存活时间仅仅为12-15个月，而患上间变性星形细胞瘤（WHO Ⅲ级）的病人的平均存活时间为2-5年。因此，寻找有效的脑胶质瘤治疗方法仍是神经外科领域关注的焦点。LIN28是一种高度保守的RNA结合蛋白(RBP), 在线虫和高等物种中有着复杂的调节机制和表达方式，对微小RNA表达的调节、骨髂肌及心肌分化、肿瘤形成、多潜能诱导等多种发育的重要事件中起关键作用。近年来，多项研究显示，LIN28在多种肿瘤中起到关键的作用，并且有研究认为LIN28可能是一种调节细胞生长和发育的重要的原癌基因。

RNA干扰(RNA interference，RNAi)是指由双链RNA介导的细胞内与其序列同源的mRNA发生特异性降解，从而导致基因表达沉默的现象，这是一种转录后水平的基因沉默机制。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一种靶向LIN28基因干扰小分子RNA。

本发明的目的之二在于提供该干扰小分子RNA的制备方法。

本发明的目的之三在于提供该干扰小分子RNA的应用。

为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：

一种用于抗胶质瘤增殖的干扰小分子RNA，其特征在于该基因为SEQ NO.1所示的碱基序列。

一种制备上述的用于抗胶质瘤增殖的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据MAGic载体设计的具体要求，设计对应于Lin28基因388-406位，即: GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为58bp，送华大基因研究中心进行合成；所述的shRNA的寡核苷酸序列为：

SEQ NO.1:

Sense: 5’-CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3’

Anti-sense: 5’-AAT TCA AAA AAG GTG AGA CAT GGA ATC CAT TCT CTT GAA ATG GAT TCC ATG TCT CAC C-3’；

根据MAGic载体设计的具体要求，将设计的shRNA的寡核苷酸序列引物和MAGic质粒进行连接，得到用于抗胶质瘤增殖的干扰小分子RNA。

一种上述的用于抗胶质瘤增殖的干扰小分子RNA在制备抗胶质瘤增殖的药物中的应用。

本发明设计对抗胶质瘤增殖有关联的基因的RNAi，并应用胶质瘤细胞模型研究其对抗胶质瘤增殖的用，为RNAi在胶质瘤的治疗应用提供了一种新方法。

附图说明

图1为shRNA的寡核苷酸序列引物和P^MAGic质粒的连接图。

图2 Lin28下调抑制了胶质瘤细胞的增殖；感染Lin28干扰病毒3天为day1，图中U251-pLVT148为Lin28干扰病毒。

具体实施方式：

一、胶质瘤细胞的培养：胶质瘤细胞U251细胞系培养于37℃，5%CO₂恒温培养箱。对数生长期的细胞用胰酶消化脱壁，之后加入适量培养液并反复吹打以混匀细胞；将得到的细胞悬液移入15ml离心管中，1500rpm离心3min；去上清；用5ml无菌1×PBS将细胞悬起，吹打混匀；加约1ml细胞悬液于装有5ml新鲜培养基的新培养瓶中，放入37℃，5%CO₂培养箱中培养，约2天左右传代1次（主要查看细胞有无铺满培养瓶）。

二、人脑胶质瘤细胞的分离：取人脑胶质瘤手术标本, 浸入4℃的KRBB溶液（Krebs-Ringer碳酸氢盐缓冲液）中. 清洗二次,然后将标本剪成小块, 转移至盛有5mL 消化酶液的三角瓶中, 于恒温摇床中37 ℃保温, 摇床转速100r/min, 每10min玻璃管反复吹打一次,放置30min。将该悬液离心500-1000rpm， 5min, 最后剩下为胶质瘤细胞. 用细胞培养液悬起沉淀，在黑背景的显微镜下观察可发现到呈圆形的胶质瘤细胞。

三、 LIN28-RNAi质粒的设计和感染：

1. LIN28-RNAi质粒的设计

根据MAGic载体设计的具体要求，设计对应于LIN28基因388-406 位，即: GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为58bp，送华大基因研究中心进行合成；

所述的shRNA的寡核苷酸序列序列为：

SEQ NO.1

根据MAGic中载体设计的具体要求，将设计的LIN28 -RNAi的干扰片段和MAGic质粒连接，参见图1，然后感染进胶质瘤细胞。图1为MAGic质粒原理的图解，使用基于RNA的CMV启动子和优化的终止子，从而在靶细胞内可以精确地形成小分子干扰RNA(shRNA)。 shRNA的表达质粒是一个预切好的备用载体。通过质粒上携带的筛选标记，进行哺乳动物细胞的共转染，可建立shRNA表达的稳定细胞系。通过两个MAGic的质粒各自与正义的DNA插入片段及反义的DNA插入片段相连接，便可介导shRNA的产生。或者单个质粒与一个具有发夹结构的DNA插入片段相连接，也可介导shRNA的产生。无论哪种方法，首先必须合成两段互补的DNA片段。而CMV启动子则控制着shRNA的生成（参附图1）。对于需要进行干扰的目的基因，选择一段靶序列为A2GN17C的DNA片段（靶序列的正义序列），其GC含量接近30-50％。

2.LIN28-RNAi质粒的感染

感染前一天，用0.25%trpsin消化10cm培养皿中汇合率达到85%左右的U373-MG 细胞1min，然后吹打制备单细胞悬液，使细胞悬液终密度达到3×10⁵ cells/ml 细胞。用该细胞悬液铺24孔板；每孔铺500ul，细胞贴壁24h后，用pLVT148病毒以MOI=20的浓度感染U373-MG 细胞。感染24h对U373-MG 细胞进行换液操作，并以每孔2x10³ cells/well的密度将U373-MG细胞传代到5块96孔板中，从3^rdd开始检测细胞增殖的变化，如图2。

四、实验分组与检测指标

正常对照组：胶质瘤细胞,培养液为胶质瘤细胞培养液；

RNAi组：感染过LIN28-RNAi的胶质瘤细胞,培养液为胶质瘤细胞培养液。

胶质瘤细胞增殖的检测：将感染后的各组细胞悬液置于37 ℃，5% CO2的培养箱中培养。5d后，以每孔2x10³ cells/well的密度将U251细胞铺到5块96孔板中，从6^thd开始采用MTS实验检测U251细胞增殖的变化。如图2。

五、实验结果

感染过LIN28-RNAi干扰质粒的胶质瘤的细胞增殖从第三天开始生长趋势和对照相比呈现抑制趋势。该实验结果表明，通过RNAi技术下调胶质瘤中的LIN28表达抑制了胶质瘤的增殖。

SEQUENCE LISTING

<110> 上海生博生物医药科技有限公司

<120> 一种靶向LIN28基因的干扰小分子RNA及其抗胶质瘤增殖的用途

<130> default

<160> 2

<170> PatentIn version 3.3

<210> 1

<211> 58

<212> DNA

<213> 人工序列

<220>

<221> miscRNA

<222> (1)..(58)

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<221> miscRNA

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<223> shRNA

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<221> misc_RNA

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<223> shRNA

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aattcaaaaa aggtgagaca tggaatccat tctcttgaaa tggattccat gtctcacc 58

Claims

1.一种靶向LIN28基因的干扰小分子RNA及其抗胶质瘤增殖的用途，其特征在于该基因为SEQ NO.1所示的碱基序列。

2.一种制备根据权利要求1所述的用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：根据MAGic载体设计的具体要求，设计对应于LIN28基因388-406 位，即: GGT GAG ACA TGG AAT CCA T的shRNA的寡核苷酸序列，各为58bp，送华大基因研究中心进行合成；

所述的shRNA的寡核苷酸序列序列为：

SEQ NO.1: Sense: 5’-CCG GGG TGA GAC ATG GAA TCC ATT TCA AGA GA ATG GAT TCC ATG TCT CAC CTT TTT TG-3’

依据pMAGic载体设计的要求，将设计的shRNA序列和MAGic质粒进行连接，得到用于抗胶质瘤迁移的干扰小分子RNA。

3.根据权利要求1所述的用于抗胶质瘤增殖的干扰小分子RNA及其在制取抗胶质瘤增殖药物中的应用。