CN103255172A - 一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。所述诱导型shRNA慢病毒表达载体包含shRNA表达框和四环素阻遏蛋白表达框；shRNA表达框包含第一启动子、能与四环素阻遏蛋白结合的四环素应答元件、TATA盒和shRNA编码序列；四环素阻遏蛋白表达框包含第二启动子、四环素阻遏蛋白表达基因、内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和标记基因。与现有的诱导型shRNA表达载体相比，本发明的表达载体的优点包括：用单个载体即可迅速地在多种细胞株里建立诱导性shRNA表达来沉默基因；不需要细胞的克隆选择；可在细胞的体外培养和体内研究中使用。

Description

一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用

技术领域

本发明属于功能基因组学研究领域，涉及一种慢病毒表达载体，尤其是一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用。

背景技术

RNA干扰(RNA interference, RNAi)是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。

近几年来RNAi研究取得了突破性进展。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭目的基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

为了成功地实现RNAi，首先要获得有效的siRNA。RNAi的核心需要siRNA对相应mRNA进行有效的结合和作用。siRNA的设计可以通过检索，优先选用经过验证的siRNA或设计多对siRNA，同时设置阴性对照(排除非特异沉默现象)和阳性对照(确认整个实验体系的有效性)。体外化学合成siRNA最方便的，包括在体外合成相应序列的RNA片段，退火形成双链，再转入细胞内。化学合成方法的主要缺点是价格高，定制周期长。对化学合成法的改进是体外转录法。即合成相应的DNA链，在体外转录成相应的RNA。这样的成本相对化学合成法而言比较低，是一种性价比较高的筛选siRNA的方法并且这种方法能够比化学合成法更快的得到siRNA。以上两种方法都是先合成一定量的siRNA产物，在通过转染等方式进入细胞发挥作用。它们的共同缺点是，随着进入细胞内siRNA的降解，RNA干扰作用很快消失。

为了克服上两种方法的缺点，研究人员构建了siRNA表达载体，转入细胞或体内表达成小发夹RNA (shRNA)，在Dicer酶的作用下形成siRNA。siRNA表达载体的优点在于这是众多方法中唯一可以进行长期研究的方法―带有抗生素标记的载体可以在细胞中持续抑制靶基因的表达，持续数星期甚至更久，因此这种方法在生物学研究中得到广泛应用。随着RNAi技术的发展，研究人员经常需要shRNA能够可控地在细胞中表达，即诱导型表达。

常用的诱导型表达载体为四环素诱导型表达载体。这类载体采用了一种四环素操纵子(Tet Operator，TetO)调控系统。当四环素阻遏蛋白(TetR)存在时，它能有效地结合TetO位点(或称为四环素应答元件)，从而阻止转录起始，当加入四环素(Tc)或其类似物强力霉素Dox (doxycycline)后，它能改变TetR蛋白的构像，这种改变导致TetR蛋白从TetO位点被释放出来，解除了对启动子的转录阻遏，使得siRNA得以表达，并且这种表达为四环素或其类似物剂量依赖的。但是采用这种载体系统，需要TetR表达载体的配合，研究者需要事先用TetR表达载体转染细胞以得到TetR稳定表达细胞株。因而对于绝大多数可诱导性系统，四环素诱导shRNA细胞株的设立需要分两阶段：第一，四环素阻遏蛋白(TetR)由任何转染或转导方法，被引入目标细胞株，筛选最高TetR表达的稳定细胞克隆；第二，向表达TetR的稳定细胞株转染/转导入四环素诱导的shRNA载体。使用这样的系统，通常需要筛选多个克隆细胞，以确定哪些细胞株已经取得成功转录，操作上比较困难。

因而，本领域亟需操作简单的诱导型shRNA表达载体系统，在引入细胞后，可通过四环素的存在与否(或剂量)来控制shRNA的表达，从而影响到目的基因的表达。

发明内容

本发明提供了一种诱导型shRNA慢病毒表达载体，其引入细胞后，可通过四环素或其衍生物强力霉素的存在与否来控制shRNA的表达，也可以通过四环素或其衍生物的剂量来控制shRNA的表达，从而影响到目的基因的表达。在没有四环素或其衍生物的情况下，shRNA表达是被持续性表达的TetR蛋白所抑制，在添加了四环素或其衍生物时，shRNA表达抑制被解除，导致了目的基因被抑制。这个调控系统可以大量产生稳定的感染细胞群，而无需生成和筛选个体克隆细胞，同样，只要用含有强力霉素的饮用水喂养动物，就可以在肿瘤异种移植中在体内诱导shRNA表达。本发明的诱导型shRNA慢病毒表达系统的优异且简便的功能，可用于诱导性基因沉默，并进行功能性缺失表型研究。

本发明提供的诱导型shRNA慢病毒表达载体，包含：

a) shRNA表达框；所述shRNA表达框包含第一启动子、能与四环素阻遏蛋白结合的四环素应答元件、TATA盒和shRNA编码序列，其中当四环素应答元件未与四环素阻遏蛋白(tetR)结合时，第一启动子能够驱动所述shRNA编码序列的表达；

b)四环素阻遏蛋白表达框；所述四环素阻遏蛋白表达框包含第二启动子、四环素阻遏蛋白表达基因、内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和标记基因。

如上所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，优选的是，所述第一启动子为RNA聚合酶III启动子。

更优选的是，所述RNA聚合酶III启动子为H1启动子（SEQ ID 1）或U6启动子(SEQ ID 2)。

在上述任意方案中，优选的是，所述第二启动子为组成型启动子；所述组成型启动子在细胞中可起始四环素阻遏蛋白TetR编码序列的转录，从而在细胞内稳定生成四环素阻遏蛋白，并维持一定水平的四环素阻遏蛋白。在不存在四环素或其衍生物如强力霉素(Dox)时TetR与shRNA表达框中的TetR结合元件结合，阻止了第一启动子起始shRNA编码序列的转录，抑制了shRNA的生成。因此，这种情况下，细胞内该shRNA目的基因的表达不被抑制。当向细胞培养基中加入四环素或其衍生物如强力霉素(Dox)时，这些脂溶性小分子可进入细胞核中与TetR结合，改变其构象，使其脱离shRNA表达框中的TetR结合元件，解除了对第一启动子的抑制作用，使第一启动子得以起始shRNA编码序列的转录，生成shRNA。该shRNA经细胞内Dicer处理后，形成siRNA，最终抑制了其目的基因的表达。

更优选的是，所述组成型启动子为PGK启动子。

在上述任意方案中，优选的是，所述标记基因为PURO(SEQ ID 5)或NEO.

本发明的另一目的，是提供一种诱导型shRNA慢病毒表达载体的构建方法；所述诱导型shRNA慢病毒表达载体的构建方法，步骤如下：

1）.通过限制性内切酶从慢病毒载体中切除聚合酶III启动子，切除启动子后的载体骨架经纯化回收；

2）.化学合成第一启动子，以合成的启动子为模板进行扩增，并引入四环素应答元件TRE序列、TATA盒序列和限制性内切酶酶切位点，产物经限制性内切酶消化后，进行纯化；

3）.步骤1）中的载体骨架与步骤2）中的纯化后的第一启动子进行连接，得到载体骨架pKG^TM；

4）.化学合成TetR融合蛋白的DNA序列(SEQ ID 3)，扩增引入酶切位点,即产生TetR的三联体。

5）.将步骤4）中所得TetR的三联体和步骤3）中所得载体骨架pKG^TM分别经酶切消化，将酶切消化后的TetR的三联体紧接PGK启动子的下游插入到经酶切消化后的表达载体骨架pKG^TM中，即可得到pKG^TM-3xTetR；其中，克隆的TetR序列由Cla1和Xma1确定正确方向。

6）.内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列由化学合成(SEQ ID 4)并由聚合酶链反应扩增并引入酶切位点；

7）.将步骤6）所得内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和步骤5）中所得pKG^TM -3xTetR分别经酶切消化，然后，将酶切消化后的内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列插入到经酶切消化后的pKG^TM -3xTetR载体中，经DNA测序可证实该表达载体的正确序列。

8）.化学合成带有酶切位点的shRNA编码序列，可根据不同目的基因设计不同的shRNA编码序列，如特异性抑制癌基因PIK3CA的shRNA编码序列(SEQ ID 6)和特异性抑制癌基因KRAS基因的shRNA编码序列(SEQ ID 7)。

9）.将步骤8）中所得shRNA编码序列和步骤7）中所得表达载体分别经酶切消化后，分别进行纯化，然后，将纯化后的shRNA编码序列通过链接酶与纯化后的表达载体进行链接，得到本发明的诱导性shRNA慢病毒表达载体。所有阳性克隆由DNA测序证实shRNA的存在及正确序列。

上述方案中，优选的是，步骤1）中所述慢病毒表达载体为通过多步亚克隆改造含有表达载体的基本序列、多克隆位点序列、启动子序列和选择标记基因序列的慢病毒表达载体。

更优选的是，所述多克隆位点包括Xho1酶切位点、Not1酶切位点、BglII酶切位点、Xba1酶切位点、BamH1酶切位点、EcoR1酶切位点、Cla1酶切位点和Xma1酶切位点。

更优选的是所述启动子为PGK启动子；所述选择标记基因为Pure或Neo。

上述任意方案中，优选的是，步骤1）中所述限制性内切酶为为Xho1和Not1。

上述任意方案中，优选的是，步骤1）中所述纯化回收方法为琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶萃取试剂盒(Qiagen)纯化回收。

上述任意方案中，优选的是，步骤2）中所述第一启动子为四环素(Tet)诱导性聚合酶III启动子。

更优选的是，所述聚合酶III启动子为H1启动子（SEQ ID 1）或U6启动子(SEQ ID 2)。

上述任意方案中，优选的是，步骤2）中所述扩增为聚合酶链反应(PCR)技术扩增。

上述任意方案中，优选的是，步骤2）中所述限制性内切酶切位点为限制性内切酶Xho1和Not1酶切位点；所述限制性内切酶消化为限制性内切酶Xho1和Not1酶消化。

上述任意方案中，优选的是，步骤2）中所述纯化为琼脂糖凝胶电泳凝胶纯化。

上述任意方案中，优选的是，步骤4）中所述扩增为聚合酶链反应(PCR)技术扩增。

上述任意方案中，优选的是，步骤4）中所述酶切位点为BglII和Xba1酶切位点；步骤5）中所述酶切消化是经BglII和Xba1酶切消化。

上述任意方案中，优选的是，步骤6）中所述酶切位点为BamH1酶切位点，步骤7）中所述酶切消化为BamH1酶切消化。

上述任意方案中，优选的是，步骤8）中所述酶切位点为EcoR1和Xho1酶切位点，步骤9）中所述酶切消化为EcoR1和Xho1酶切消化。

上述任意方案中，优选的是，步骤8）中所述shRNA编码序列为抑制癌基因PIK3CA的shRNA编码序列（SEQ ID 6）和抑制癌基因KRAS的shRNA编码序列(SEQ ID 7)。

本发明还提供上述诱导型shRNA慢病毒表达载体在细胞里做基因功能缺失的研究方面的应用。pKG系统与传统的基因敲除方法相比，是一个更简单，而且具有诱导性的研究功能性缺失表型的方法，可用于诱导性基因沉默，并进行功能性缺失表型研究。

本发明还提供上述诱导型shRNA慢病毒表达载体在构建shRNA文库方面的应用。随着各种模式生物体基因组计划的完成，研究人员可以非常方便地从大规模数据库中获得全基因组序列，从而找到感兴趣基因的序列，据此设计出使该基因沉默的dsRNA，这是研究疾病机理和鉴定候选药靶的关键步骤，也为将来可控地打开或关闭某一特定疾病相关基因奠定基础，为疾病的治疗开辟了新途径。由于本发明shRNA慢病毒表达载体简单高效，本领域技术人员可想到的是，利用该表达载体来高通量筛选针对目的基因的功能性shRNA，并进一步构建shRNA文库。

本发明还提供上述诱导型shRNA慢病毒表达载体在肿瘤基因治疗药物方面的应用。在一方面，本发明的诱导型shRNA慢病毒表达载体可用于shRNA目的基因功能的研究，探寻特定疾病的药物靶点，另一方面，采用针对特定疾病基因的shRNA，本发明的诱导型shRNA慢病毒表达载体本身可能作为治疗疾病尤其是癌症的药物。

本发明的诱导型shRNA慢病毒表达载体在单一载体下，包含了四环素阻遏蛋白表达序列以及诱导型shRNA表达序列。与现有的诱导型shRNA表达载体相比，本发明的表达载体的优点包括：1、用单个载体即可迅速地在多种细胞株里建立诱导性shRNA表达来沉默基因；2、不需要细胞的克隆选择；3、可在细胞的体外培养和体内研究中使用。

除非另有说明，本文中使用的术语具有本领域技术人员通常所理解的含义。

用在本文时“RNAi”指由RNA介导的基因沉默现象，更具体地，指由双链RNA (dsRNA)介导的由特定酶参与的特异性基因沉默现象,它在转录水平、转录后水平和翻译水平上阻断基因的表达。长度为21～23nt的小RNA分子是引起RNA干扰现象的直接原因。这种小RNA分子被称之为小干扰RNA(small interfering RNA，siRNA)。在RNA干扰中一个非常重要的酶是RNaseIII核酶家族的Dicer。它可与双链RNA结合，并将其剪切成21～23nt及3'端突出的小分子RNA片断，即siRNA。随后siRNA与若干个蛋白组成的，RNA引起的称之为RNA诱导沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)结合，解旋成单链，并由该复合体主导RNAi效应。RISC被活化后，活化型RISC受已成单链的siRNA引导，序列特异性地结合在标靶mRNA上并切断标靶mRNA，引发靶mRNA的特异性分解。

用在本文时，“shRNA”指小单链RNA，其5’段和3’端的RNA序列互补，可形成茎环结构(含19~29nt的茎和3~9nt的环)，在细胞内经Dicer处理也形成21～23nt的siRNA。该siRNA的一条链(正义链)的序列与待抑制目的基因序列或其mRNA的一部分相同，序列特异地发挥RNA干扰作用。

用在本文时，“shRNA编码序列”指编码该shRNA的DNA序列，在其两末端一般具有限制性位点，用于插入本发明的表达载体中。

用在本文时，“慢病毒载体(Lentiviral vector)”主要指在HIV-1病毒基础上改造而成的病毒载体系统，它能高效将目的基因导入动物和人的原代细胞或细胞系。慢病毒载体基因组是正链RNA，其基因组进入细胞后，在细胞质中被其自身携带的反转录酶反转为DNA，形成DNA整合前复合体，进入细胞核后，DNA整合到细胞基因组中。整合后的DNA转录mRNA，回到细胞浆中，表达目的蛋白；或产生RNA干扰。

慢病毒载体介导的基因表达或RNA干扰作用持续且稳定，原因是目的基因整合到宿主细胞基因组中，并随细胞基因组的分裂而分裂。另外，慢病毒载体能有效感染并整合到非分裂细胞中。以上特性使慢病毒载体与其它病毒载体相比，比如不整合的腺病毒载体、整合率低的腺相关病毒载体、只整合分裂细胞的传统逆转录病毒载体，有鲜明的特色。大量文献研究表明，慢病毒载体介导的目的基因长期表达的组织或细胞包括脑、肝脏、肌肉、视网膜、造血干细胞、骨髓间充质干细胞、巨噬细胞等。

用在本文时，“shRNA目的基因”指本发明表达载体shRNA表达后所抑制的基因。一般根据shRNA目的基因序列或其mRMA来设计适合的shRNA编码序列，这在本领域为技术人员所公知，或者一些公司可为研究人员提供适合的shRNA编码序列。

用在本文时，“表达框(expression cassette)”指表达载体上一段相对独立的可表达序列，一般由一个或多个待表达基因和控制其表达的序列构成。通常，表达框包括三个部分：启动子、开放阅读框和3’端不翻译区，在真核细胞中，该3’端不翻译区一般为多聚腺苷酸位点。

附图说明

图1为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体技术示意原理图。

图2为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体shRNA表达被抑制图示。

图3为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体shRNA表达恢复图示。

图4为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体体外沉默癌基因PIK3CA实验结果。

图5为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体体内沉默癌基因PIK3CA实验结果。

图6为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体在体外抑制HCT116结肠癌细胞的生长抑制图。

图7为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体在体内抑制HCT116结肠癌细胞的生长抑制图。

图8为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体用于药物研发的功能性shRNA沉默效率图示。

图9为按照本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体用于药靶基因组shRNA在多组人类癌症细胞的致死分数的热图显示。

具体实施例

如图1所示的本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体技术示意原理图：shRNA表达框包含RNA聚合酶III启动子H7或U6启动子、能与四环素阻遏蛋白结合的四环素应答元件TRE、TATA盒和shRNA编码序列;其中当四环素应答元件未与四环素阻遏蛋白(tetR)结合时，H1或U6启动子能够驱动所述shRNA编码序列的表达。四环素阻遏蛋白表达框包含组成型PGK启动子、四环素阻遏蛋白TetR表达基因、内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和标记基因PURO或Neo。

组成型启动子PGK在细胞中可起始四环素阻遏蛋白TetR编码序列的转录，从而在细胞内稳定生成四环素阻遏蛋白，并维持一定水平的四环素阻遏蛋白。在不存在四环素或其衍生物如强力霉素(Dox)时TetR与shRNA表达框中的TetR结合元件结合，阻止了RNA聚合酶III启动子H1或U6起始shRNA编码序列的转录，抑制了shRNA的生成（如图2）。因此，这种情况下，细胞内该shRNA目的基因的表达不被抑制。当向细胞培养基中加入四环素或其衍生物如强力霉素(Dox)时，这些脂溶性小分子可进入细胞核中与TetR结合，改变其构象，使其脱离shRNA表达框中的TetR结合元件，解除了对RNA聚合酶III启动子H1或U6的抑制作用，使H1或U6启动子得以起始shRNA编码序列的转录，生成shRNA（如图3）。该shRNA经细胞内Dicer处理后，形成siRNA，最终抑制了其目的基因的表达。

为了更好的理解本发明，以下通过具体实施例进一步阐述本发明；实施例只是对本发明作示例性作用，而不具有任何限制性作用，其他任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

实施例1

诱导型shRNA慢病毒表达载体特异性抑制癌基因PIK3CA，其需经过以下步骤：

1.诱导型shRNA慢病毒表达载体的构建：

本发明提供的shRNA表达载体可通过多步亚克隆改造含有NEO选择基因的慢病毒载体pLKO (来自Sigma)来获得。首先，通过限制性内切酶Xho1和Not1从慢病毒载体切除组成型U6启动聚合酶III启动子。由此产生的载体骨架用琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶萃取试剂盒(Qiagen)纯化回收。四环素(Tet)诱导性聚合酶III启动子U6/TRE由化学合成(SEQ ID 2)，以此为模版用聚合酶链反应(PCR)技术扩增并引入并引入四环素应答元件TRE序列、TATA盒序列和限制性内切酶Xho1和Not1酶切位点。产物经Xho1和Not1消化，凝胶纯化U6/TRE启动子，然后与上述纯化的载体骨架连接，得到含有U6/TRE启动子的表达载体骨架。EcoR1/Xho1限制消化通过切下含有U6/TRE启动子的表达载体骨架352bp片断，来验证U6/TRE启动子与载体骨架连接的正确方向。

接下来，TetR融合蛋白的DNA序列(SEQ ID 3)由化学合成并用PCR扩增引入BglII和Xba1酶切位点。所得到的产物经BglII和Xba1消化，然后紧接PGK启动子的下游插入到经同样消化的表达载体骨架中，将得到的产物称为pKG-3xTetR。克隆的TetR序列由Cla1/Xma1确定正确方向。最后，内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列由化学合成(SEQ ID 4)并由聚合酶链反应扩增并引入编码BamH1的酶切位点。然后插入pKG-3xTetR中3xTetR与Puro选择基因序列之间的相应BamH1酶切位点。DNA测序证实了该表达载体的正确序列。

最后，将编码序列引入表达载体。化学合成的带有EcoR1/Xho1限制性位点的shRNA编码序列(SEQ ID 6)。以EcoR1和Xho1DNA限制酶消化该shRNA编码序列并纯化。同样以EcoR1和Xho1DNA限制酶消化以上得到的表达载体，纯化的片段通过连接酶与shRNA编码序列的纯化片段连接，得到本发明的诱导型shRNA慢病毒表达载体。所有阳性克隆由DNA测序证实了shRNA的存在及正确序列。所有试剂按厂商建议条件操作。

2.生成慢病毒

通过以本发明提供的shRNA慢病毒表达载体、pVSV-G质粒(来自Sigma)和pCMV-VPR-8-7质粒(Sigma)共转染HEK293T细胞(HIGH GLUCOSE DMEM+10%FBS, Invitrogen)来制备慢病毒；用通过多步亚克隆改造含有NEO标记基因的慢病毒载体pLKO (来自Sigma)，与pVSV-G质粒(来自Sigma)和pCMV-VPR-8-7质粒(Sigma)共转染HEK293T细胞(HIGH GLUCOSE DMEM+10%FBS, Invitrogen)作对照试验。下述实验过程进行同样处理。使用的转染试剂为Lipofectamine2000 (Invitrogen)，按常规方法转染。12小时后替换细胞培养液。含有慢病毒的上清液于48小时后收获。经过滤及高速离心后纯化并于-80 °C保存。所有试剂按厂商建议条件操作。

3.感染并建立稳定表达的靶细胞株

将慢病毒液与聚凝胺（polybrene终浓度 8μg/ml)在细胞培养液中混合并培养5分钟。加入培养中的细胞株后(MOI=1，贴壁或悬浮皆可)，离心感染(spinfection, 2500 rpm×60分钟)靶细胞株，然后替换入新鲜的细胞培养液。在培养箱内24小时后，视靶细胞株而定，加入0.5-1.5 μg/ml Puromycin筛选3-4天或0.25-1.5 mg/ml G418筛选5-10天。然后培养稳定整合了本发明表达载体的靶细胞株至足够量，可立刻为实验用或冻存后供以后实验用。所有试剂按厂商建议条件操作。

采用这种方式，我们已测试了40多个人类和小鼠细胞系，其中绝大多数为肿瘤细胞株，实验结果证明了我们的载体系统具有建立稳定的诱导型shRNA细胞株的普遍能力。下表为一个成功诱导shRNA表达细胞株的名单：

4.细胞培养

靶细胞株按照常规培养于补充了10% 胎牛血清(无四环素及其衍生物，Invitrogen)相应细胞培养液(Clontech)。据实验设计和具体的生物学问题，shRNA诱导表达可由在细胞培养液内加入四环素或强力霉素(doxycycline，Sigma)(10-1000ng/ml终浓度)来完成。一般检测mRNA水平可在加入强力霉素24-28小时后进行，检测蛋白质水平可于48-96小时后进行。表型(Phenotypes)出现的时间则视具体情况而定。所有试剂按厂商建议条件操作。

5.Western印迹分析

收获的细胞经冰冷PBS清洗后用含有蛋白酶抑制剂(Roche)和磷酸酶抑制剂(Pierce)的RIPA缓冲液裂解(4°C)。继变性凝胶电泳分离后，将蛋白质转移到硝酸纤维素膜。蛋白质表达水平用常规方法，以PI3 Kinase p110α (C73F8) Rabbit mAb（Cell Signaling Technology， #4249）第一抗体和辣根过氧化物酶酶(HRP)标记的第二抗体，及使用ECL检测免疫印迹检测系统(GE Healthcare)完成。所有试剂按厂商建议条件操作。

6.定量RT – PCR (应用Taqman)

使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从细胞中分离总RNA，经DNase处理后，使用Superscript II试剂盒(Invitrogen公司)合成cDNA。mRNA水平采用实时荧光定量法，按Demand??程序使用ABI公司PRISM 7900 HT序列检测系统(Applied Biosystems)完成。所有TaqMan探针和引物购买于ABI公司。β-肌动蛋白作为上样对照。所有数据收集一式三份，特定基因的表达规范化到相应β-肌动蛋白的水平。特定基因的表达水平相对计算由标准方程[2^-(CT样本-CT对照) ]（标准方程解释：2的(CT样本-CT对照)次方）而得来。所有试剂按厂商建议条件操作。

7.小鼠植瘤实验及体内诱导

在肿瘤异种移植的研究中，所有涉及小鼠的实验严格按照制度和地方政府对实验动物处理的指导方针。用于此项研究的稳定的诱导型shRNA表达细胞株已证明无支原体和病毒污染。雌性裸鼠(6-8周龄)在无菌条件下皮下注射(2-10x10⁶)细胞。当平均肿瘤体积最少达到100mm³时随机分组，各组6-8只小鼠(n=6-8)，用三组小鼠进行测试。实验裸鼠或用饮用水(自由进食5%葡萄糖溶液)或盐酸强力霉素溶液(每天灌胃口服25mg/kg，或自由采食2 mg/ml强力霉素/5％葡萄糖溶液)。每周两次测量肿瘤体积和体重，使用测量卡尺确定肿瘤体积。在这项研究中，收集最终的肿瘤组织做Western 印迹分析和定量RT-PCR。使用SigmaStat(Jandel)进行肿瘤大小和群体之间的显著性统计学分析。

实验结果：

本发明shRNA慢病毒表达载体在HCT116结肠癌细胞中可诱导地沉默癌基因PIK3CA。经本发明shRNA慢病毒表达载体稳定感染的HCT116结肠癌细胞（参见图4），在存在 Dox (100ng/ml, 72 h)时，PIK3CA的表达明显减少(图中p110a指出的带)。同时，由于PIK3CA表达的减少，其下游蛋白激酶AKT的磷酸化减少(p473AKT和p308AKT指出的带)，而蛋白激酶总量不变(总AKT指出的带)；Dox的添加对对照细胞无影响。

将这种稳定表达针对PIK3CA的shRNA的细胞皮下接种裸鼠体内后，以含Dox的水饲喂裸鼠，也明显导致肿瘤内PIK3CA表达及其下游蛋白激酶的磷酸化程度降低（如图5），对照裸鼠不受饮用水是否含有Dox的影响，同时，从图5可看出，TetR在各个裸鼠中都是稳定表达。

实施例2

诱导型shRNA慢病毒表达载体特异性抑制癌基因KRAS基因，其需经过以下步骤：

1. 诱导型shRNA慢病毒表达载体的构建：

本发明的shRNA表达载体可通过多步亚克隆改造含有PURO选择基因(SEQ ID 5)的慢病毒载体pLKO (来自Sigma)来获得。首先，通过限制性内切酶Xho1和Not1从慢病毒载体切除组成型U6启动聚合酶III启动子。由此产生的载体骨架用琼脂糖凝胶电泳和QIAquick凝胶萃取试剂盒(Qiagen)纯化回收。四环素(Tet)诱导性聚合酶III启动子H1/TRE由化学合成(SEQ ID 1)，以此为模版用聚合酶链反应(PCR)技术扩增并引入四环素应答元件TRE序列、TATA盒序列和限制性内切酶Xho1和Not1酶切位点。产物经Xho1和Not1消化，凝胶纯化H1/TRE启动子，然后与上述纯化的载体骨架连接，得到含有H1/TRE启动子的表达载体骨架。EcoR1/Xho1限制消化通过切下含有H1/TRE启动子的表达载体骨架162bp片断，来验证H1/TRE启动子与载体骨架连接的正确方向。

接下来，TetR融合蛋白的DNA序列由化学合成(SEQ ID 3)并用PCR扩增引入BglII和Xba1酶切位点。所得到的产物经BglII和Xba1消化，然后紧接PGK启动子的下游插入到经同样消化的表达载体骨架中，将得到的产物称为pKG-3xTetR。克隆的TetR序列由Cla1/Xma1确定正确方向。最后，内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列由化学合成(SEQ ID 4)并由聚合酶链反应扩增并引入编码BamH1的酶切位点。然后插入pKG-3xTetR中3xTetR与Puro选择基因序列之间的相应BamH1酶切位点。DNA测序证实了该表达载体的正确序列。

最后，将编码序列引入表达载体。化学合成的带有EcoR1/Xho1限制性位点的shRNA编码序列(SEQ ID 7)。以EcoR1和Xho1DNA限制酶消化该shRNA编码序列并纯化。同样以EcoR1和Xho1DNA限制酶消化以上得到的表达载体，纯化的片段通过连接酶与shRNA编码序列的纯化片段连接，得到本发明的诱导型shRNA慢病毒表达载体。所有阳性克隆由DNA测序证实了shRNA的存在及正确序列。所有试剂按厂商建议条件操作。

2.生成慢病毒

通过以本发明的shRNA慢病毒表达载体、pVSV-G质粒(Sigma)，和pCMV-VPR-8-7质粒(Sigma)共转染HEK293T细胞(HIGH GLUCOSE DMEM+10%FBS, Invitrogen)来制备慢病毒；用通过多步亚克隆改造含有Puro选择基因的慢病毒载体pLKO，与pVSV-G质粒(来自Sigma)和pCMV-VPR-8-7质粒(Sigma)共转染HEK293T细胞(HIGH GLUCOSE DMEM+10%FBS, Invitrogen)作对照试验。下述实验过程进行同样处理。使用的转染试剂为Lipofectamine2000 (Invitrogen)，按常规方法转染。12小时后替换细胞培养液。含有慢病毒的上清液于48小时后收获。经过滤及高速离心后纯化并于-80 °C保存。所有试剂按厂商建议条件操作。

3.感染并建立稳定表达的靶细胞株

将慢病毒液与聚凝胺（polybrene终浓度 8μg/ml)在细胞培养液中混合并培养5分钟。加入培养中的细胞株后(MOI=1，贴壁或悬浮皆可)，离心感染(spinfection, 2500 rpm×60分钟)靶细胞株，然后替换入新鲜的细胞培养液。在培养箱内24小时后，视靶细胞株而定，加入0.5-1.5 μg/ml Puromycin筛选3-4天或0.25-1.5 mg/ml G418筛选5-10天。然后培养稳定整合了本发明表达载体的靶细胞株至足够量，可立刻为实验用或冻存后供以后实验用。所有试剂按厂商建议条件操作。

4.细胞培养

靶细胞株按照常规培养于补充了10% 胎牛血清(无四环素及其衍生物，Invitrogen)相应细胞培养液(Clontech)。据实验设计和具体的生物学问题，shRNA诱导表达可由在细胞培养液内加入四环素或强力霉素(doxycycline，Sigma)(10-1000ng/ml终浓度)来完成。一般检测mRNA水平可在加入强力霉素24-28小时后进行，检测蛋白质水平可于48-96小时后进行。表型(Phenotypes)出现的时间则视具体情况而定。所有试剂按厂商建议条件操作。

5.Western印迹分析

收获的细胞经冰冷 PBS清洗后用含有蛋白酶抑制剂(Roche)和磷酸酶抑制剂(Pierce)的RIPA缓冲液裂解(4°C)。继变性凝胶电泳分离，蛋白质转移到硝酸纤维素膜。蛋白质表达水平用常规方法，以Anti-KRAS Antibody, clone 234-4.2,MABS194（Millipore）第一抗体和辣根过氧化物酶酶(HRP)标记的第二抗体，及使用ECL检测免疫印迹检测系统(GE Healthcare)完成。所有试剂按厂商建议条件操作。

6.定量RT – PCR (应用Taqman)

使用RNeasy试剂盒(Qiagen)从细胞中分离总RNA，经DNase处理后，使用Superscript II试剂盒(Invitrogen)合成cDNA。mRNA水平采用实时荧光定量法，按Demand??程序使用ABI公司PRISM 7900 HT序列检测系统(Applied Biosystems)完成。所有TaqMan探针和引物购买于ABI公司。β-肌动蛋白作为上样对照。所有数据收集一式三份，特定基因的表达规范化到相应β-肌动蛋白的水平。特定基因的表达水平相对计算由标准方程[2^-(CT样本-CT对照) ] （标准方程解释：2的(CT样本-CT对照)次方）而得来。所有试剂按厂商建议条件操作。

7.小鼠植瘤实验及体内诱导

在肿瘤异种移植的研究中，所有涉及小鼠的实验严格按照制度和地方政府对实验动物处理的指导方针。用于此项研究的稳定的诱导型shRNA表达细胞株已证明无支原体和病毒污染。雌性裸鼠(6-8周龄)在无菌条件下皮下注射(2-10x10⁶)细胞。当平均肿瘤体积最少达到100mm³时随机分组，各组6-8只小鼠(n=6-8)，用三组小鼠进行测试。实验裸鼠或用饮用水(自由进食5%葡萄糖溶液)或盐酸强力霉素溶液(每天灌胃口服25mg/kg，或自由采食2 mg/ml强力霉素/5％葡萄糖溶液)。每周两次测量肿瘤体积和体重，使用测量卡尺确定肿瘤体积。在这项研究中，收集最终的肿瘤组织做Western 印迹分析和定量RT-PCR。使用SigmaStat(Jandel)进行肿瘤大小和群体之间的显著性统计学分析。

实验结果：

含有靶向KRAS基因的本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体在体内和体外对HCT116结肠癌细胞的生长抑制。

图6显示了经本发明诱导型shRNA慢病毒表达载体稳定感染后，在体外生长的HCT116结肠癌细胞的克隆形成照片。对照细胞的生长不受Dox的影响(比较左上和左下培养皿)。没有Dox时，本发明载体稳定感染的细胞的生长与对照无差异，向培养基中添加Dox后，细胞生长明显被抑制(比较右上和右下培养皿)。

图7显示了将相同的经感染细胞皮下接种到裸鼠体内后测量的重量体积变化。在接种10天后(肿瘤大小约100 mm³)，接种对照表达载体感染的细胞的小鼠体内，肿瘤体积随时间逐渐增大，不受是否饲喂Dox的影响。与此相反的是，接种了含有靶向KRAS基因的shRNA编码序列（SEQ ID 7）的慢病毒表达载体感染的细胞的小鼠体内，肿瘤生长被显著抑制。

实施例3

诱导型shRNA慢病毒表达载体进行高通量药物靶点的筛选

14K shRNA池中产生慢病毒的过程如下：

将5L的病毒分装成等份试样，并在-80℃下冷冻，以备进行感染实验。所述的感染实验的过程在如下的条件下进行。

为了确定对每个细胞系都能产生0.3~0.5感染复数的病毒的体积，将病毒分为6份不同体积（0~400μL）的试样，用滴度法对细胞进行感染，并将感染后的细胞培养于含有嘌呤霉素和不含嘌呤霉素的环境中。在进行大规模感染前，用40μm细胞过滤器（BD Falcon公司生产）对感染细胞进行过滤。

将感染实验分成四组，每组实验都先将3.7×10⁷个细胞重新悬浮于24mL含有4μg/mL的聚凝胺的培养液中，并添加适量体积的14K文库慢病毒。然后将该混合悬浮液接入每孔为2mL的12孔细胞培养板内，并在30℃下进行离心感染2小时，离心力为930倍重力。在细胞感染后需要适量轻抽出上清液，并向12孔培养板中加入新鲜的培养液以进行悬浮培养细胞。经过20小时后，每组重复感染实验的培养板的每个孔均已聚集了混合细胞，此时将混合细胞移入含有200mL培养液的T175烧瓶内，该培养液含有嘌呤霉素，可进行感染细胞的筛选。对于四组重复实验中的每个实验进行筛选后的第四天，将2×10⁷个细胞接入新的T175烧瓶内，并在200mL的含有嘌呤霉素的培养基内培养。对于接下来进行的传代培养，有1.1×10⁷个细胞存活。收集所有余留的传代细胞，重新悬浮于1mL PBS中，并在-20℃条件储存，以用于基因组DNA分离。

对于贴壁细胞，要在离心感染后适量轻抽出上清液，并向12孔培养板加入新鲜的培养液。经过20小时后，用于重复实验的培养板的每个孔均已胰蛋白酶化，将细胞混合并分别接入两个含有60mL培养基的T225烧瓶内，该培养基含有嘌呤霉素。每个细胞系的持续培养繁殖的总分裂次数至少达到16次，或者至少经历28天，以两者中时间更长的为准。在整个实验过程中，始终存在嘌呤霉素筛选。

对基因组进行分离，并对shRNA进行PCR扩增，然后用Illunima HiSeq-2000对shRNA扩增后的片段进行测序。利用Spotfire软件对shRNA的读取进行分析和可视化。

利用这种方法我们建立了shRNA文库，包含高度验证过的shRNAs，从而用于各种疾病治疗的新药靶向筛选，我们已经测试了7000 个shRNA的基因沉默效率，目标基因包括：激酶，酪氨酸磷酸酶，转录因子等等。针对那些对癌症的细胞活力至关重要的基因，我们做了基因的功能筛选，并确定可用于药物研发的控制癌细胞生长的新靶点。我们针对5K个不同目标基因进行筛选了用于pKG系统和药物研发的功能性shRNA。

实验结果显示了在HCT116人大肠癌细胞中感染shRNA库之后的功能（如图8所示），致死型的ｓｈＲＮＡｓ在细胞群中被剔除，两次独立试验相关性良好。实验结果也显示了药靶基因组shRNA在多组人类癌症细胞的致死分数的热图显示（如图9所示），可以清楚地看到，种系相关的细胞株显示趋近的致死表型。

SEQUENCE LISTING

 

<110>  傅开屏

 

<120>  一种诱导型shRNA慢病毒表达载体及其构建方法与应用

 

<160>  7   

<170>  PatentIn version 3.5

<210>  1

<211>  150

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  1

gtgaacggat ctcgacggta tcgatcacga gactagcctc gagcggccgc aatatttgca       60

 

tgtcgctatg tgttctggga aatcaccata aacgtgaaat ccctatcagt gatagagact      120

 

tataagttcc ctatcagtga tagagacacc                                      150

 

 

<210>  2

<211>  340

<212>  DNA

<213>  人工序列

 

<400>  2

gtgaacggat ctcgacggta tcgatcacga gactagcctc gagcggccgc aatatttgca       60

 

catatttgca tatacgatac aaggctgtta gagagataat tagaattaat ttgactgtaa      120

 

acacaaagat attagtacaa aatacgtgac gtagaaagta ataatttctt gggtagtttg      180

 

cagtttttaa aattatgttt taaaatggac tatcatatgc ttaccgtaac ttgaaagtat      240

 

ttcgatttct tggctttata tatcttgtgg aaaggacgaa aatcaccata ccctatcagt      300

 

gatagagact tataagttcc ctatcagtga tagagacacc                           340

 

 

<210>  3

<211>  606

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  3

ttagataaaa gtaaagtgat taacagcgca ttagagctgc ttaatgaggt cggaatcgaa       60

 

ggtttaacaa cccgtaaact cgcccagaag ctaggtgtag agcagcctac attgtattgg      120

 

catgtaaaaa ataagcgggc tttgctcgac gccttagcca ttgagatgtt agataggcac      180

 

catactcact tttgcccttt agaaggggaa agctggcaag attttttacg taataacgct      240

 

aaaagtttta gatgtgcttt actaagtcat cgcgatggag caaaagtaca tttaggtaca      300

 

cggcctacag aaaaacagta tgaaactctc gaaaatcaat tagccttttt atgccaacaa      360

 

ggtttttcac tagagaatgc attatatgca ctcagcgctg tggggcattt tactttaggt      420

 

tgcgtattgg aagatcaaga gcatcaagtc gctaaagaag aaagggaaac acctactact      480

 

gatagtatgc cgccattatt acgacaagct atcgaattat ttgatcacca aggtgcagag      540

 

ccagccttct tattcggcct tgaattgatc atatgcggat tagaaaaaca acttaaatgt      600

 

gaaagt                                                               606

 

 

<210>  4

<211>  550

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  4

tctccctccc ccccccctaa cgttactggc cgaagccgct tggaataagg ccggtgtgcg       60

 

tttgtctata tgttattttc caccatattg ccgtcttttg gcaatgtgag ggcccggaaa      120

 

cctggccctg tcttcttgac gagcattcct aggggtcttt cccctctcgc caaaggaatg      180

 

caaggtctgt tgaatgtcgt gaaggaagca gttcctctgg aagcttcttg aagacaaaca      240

 

acgtctgtag cgaccctttg caggcagcgg aaccccccac ctggcgacag gtgcctctgc      300

 

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gtgagttgga tagttgtgga aagagtcaaa tggctctcct caagcgtatt caacaagggg      420

 

ctgaaggatg cccagaaggt accccattgt atgggatctg atctggggcc tcggtgcaca      480

 

tgctttacat gtgtttagtc gaggttaaaa aaacgtctag gccccccgaa ccacggggac      540

 

gtggttttcc                                                          550

 

 

<210>  5

<211>  491

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  5

atgaccgagt acaagcccac ggtgcgcctc gccacccgcg acgacgtccc cagggccgta       60

 

cgcaccctcg ccgccgcgtt cgccgactac cccgccacgc gccacaccgt cgatccggac      120

 

cgccacatcg agcgggtcac cgagctgcaa gaactcttcc tcacgcgcgt cgggctcgac      180

 

atcggcaagg tgtgggtcgc ggacgacggc gccgcggtgg cggtctggac cacgccggag      240

 

agcgtcgaag cgggggcggt gttcgccgag atcggcccgc gcatggccga gttgagcggt      300

 

tcccggctgg ccgcgcagca acagatggaa ggcctcctgg cgccgcaccg gcccaaggag      360

 

cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc      420

 

cccgcgtggt tcctggccac cgtcggcgtc tcgcccgacc accagggcaa gggtctgggc      480

 

gagacctccg c                                                        491

 

 

<210>  6

<211>  58

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  6

ccgggcatta gaatttacag caagactcga gtcttgctgt aaattctaat gctttttt        58

 

 

<210>  7

<211>  57

<212>  DNA

<213>  人工合成

 

<400>  7

ccgggagggc tttctttgtg tatttctcga gaaatacaca aagaaagccc tcttttt         57

 

Claims (10)

1.一种诱导型shRNA慢病毒表达载体，包含：

a) shRNA表达框；所述shRNA表达框包含第一启动子、能与四环素阻遏蛋白结合的四环素应答元件TRE、TATA盒和shRNA编码序列；

b) 四环素阻遏蛋白表达框，所述四环素阻遏蛋白表达框包含第二启动子、四环素阻遏蛋白表达基因(SEQ ID 3)、内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列(SEQ ID 4)和标记基因。

2.如权利要求1所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述第一启动子为RNA聚合酶III启动子。

3.如权利要求2所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述RNA聚合酶III启动子为H1启动子(SEQ ID 1)或U6启动子(SEQ ID 2)。

4.如权利要求1所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述第二启动子为组成型启动子。

5. 如权利要求4所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述组成型启动子为PGK启动子。

6.如权利要求1所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体，其特征在于，所述标记基因为PURO(SEQ ID 5)或NEO。

7.一种诱导型shRNA慢病毒表达载体的构建方法,步骤如下：

 1）.通过限制性内切酶从慢病毒载体中切除聚合酶III启动子，切除启动子后的载体骨架经纯化回收；

2）.化学合成第一启动子，以合成的启动子为模板进行扩增，并引入限制性内切酶酶切位点，产物经限制性内切酶消化后，进行纯化；

3）.将步骤1）中的载体骨架与步骤2）中的纯化后的第一启动子进行连接，得到载体骨架pKG^TM；

4）.化学合成TetR融合蛋白的DNA序列(SEQ ID 3)，扩增引入酶切位点,即产生TetR的三联体；

5）.将步骤4）中所得TetR的三联体和步骤3）中所得载体骨架pKG^TM分别经酶切消化，将酶切消化后的TetR的三联体插入到经酶切消化后的表达载体骨架pKG^TM中，即可得到pKG^TM -3xTetR；

 6）.内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列(SEQ ID 4)由化学合成并由聚合酶链反应扩增并引入酶切位点；

7）.将步骤6）所得内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列和步骤5）中所得pKG^TM -3xTetR分别经酶切消化，然后，将酶切消化后的内部核糖体进入位点(IRES)DNA序列插入到经酶切消化后的pKG^TM -3xTetR载体中；

8）.化学合成带有酶切位点的shRNA编码序列；

9）.将步骤8）中所得shRNA编码序列和步骤7）中所得表达载体分别经酶切消化后，分别进行纯化，然后，将纯化后的shRNA编码序列通过链接酶与纯化后的表达载体进行链接，得到诱导性shRNA慢病毒表达载体。

8.如权利要求1所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体在细胞里做基因功能缺失的研究方面的应用。

9.如权利要求1所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体在构建shRNA文库方面的应用。

10.如权利要求1所述的诱导型shRNA慢病毒表达载体在肿瘤基因治疗药物方面的应用。

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