CN102656268A

CN102656268A - 普适性抗癌药物及疫苗的开发

Info

Publication number: CN102656268A
Application number: CN2010800373492A
Authority: CN
Inventors: 林希龙; 吴堂熙
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2009-08-26
Filing date: 2010-06-03
Publication date: 2012-09-05
Also published as: JP5852959B2; CA2769289C; EP3222723A1; EP2470655A1; US9394538B2; EP3222723B1; JP6019186B2; JP2013503164A; US20100240126A1; JP2015214570A; WO2011025566A1; CA2769289A1; TW201106977A

Abstract

本发明一般而言有关于一种使用微型核糖核酸(miRNA)及其小发夹型核糖核酸(shRNA)同源物/衍生物来发展新颖的抗肿瘤/癌症药物、疫苗与治疗的设计及方法。具体而言，本发明有关于使用一核酸组合物，该核酸组合物在被传送到人类细胞内之后，能表达类mir-302基因沉默效应子而沉默mir-302标的的细胞周期调节子与致癌基因，产生抑制肿瘤/癌细胞生长及转移的作用。Mir-302是在人类胚胎干(hES)细胞及诱发型多能性干(iPS)细胞中发现到的最主要的微型核糖核酸(miRNA)，然而其功能尚不清楚。本发明证实了在人类细胞中，mir-302同时抑制细胞周期蛋白-E-CDK2及细胞周期蛋白-D-CDK4/6路径，最终抑止超过70％的G1-S期的细胞周期转换。同时，mir-302亦沉默肿瘤干细胞标记，BMI-1，并接着增进p16Ink4a及p14/p19Arf在抑制由CDK4/6所调解的细胞增生上的肿瘤抑制功能。

Description

普适性抗癌药物及疫苗的开发

发明人：林希龙和吴堂熙

要求的优先权

本发明要求以2009年8月26日提交的申请序列号为61/272,169、标题为“用体细胞核转移技术(SCNT)使Mir-302重新编程体细胞具有高度多能性的干细胞性以及化学重新编程的应用”的美国临时申请为其优先权。本发明还要求以2010年8月12日提交的申请序列号为61/323,190、标题为“Mir-302通过共同抑制CDK2和CDK4/6途径抑制人类iPS细胞肿瘤发生”的美国临时申请为其优先权。本申请是以下申请的部分继续申请：2008年5月7日提交的申请序列号为12/149,725、标题为“使用内含子RNA生成人类类胚胎干细胞”的美国专利申请；2009年1月8日提交的申请序列号为12/318,806、标题为“使用可诱导的重组核糖核酸因子生成不含肿瘤的类胚胎干细胞的多能性细胞”的美国专利申请。这些申请以其全部内容引入本文作为参考。

【技术领域】

本发明一般而言关于用于癌症治疗的有治疗功能的DNA/RNA药物和/或疫苗的设计及利用。更明确言之，本发明关于设计及使用一核酸组合物的设计和方法，其中该核酸可产生和表达小型核糖核酸(small RNA)基因沉默效应子，沉默mir-302标的的细胞周期调节子与致癌基因，进而对肿瘤/癌细胞的生长及转移产生抑制作用。小型核糖核酸基因沉默效应子较佳包含微型核糖核酸(microRNA，miRNA)，像是mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d、mir-302e、微型核糖核酸前体(前体微型核糖核酸，pre-miRNAs)和人造重设的小发夹型核糖核酸/小干扰核糖核酸(shRNA/siRNA)的同源物/衍生物，以及其组合。感兴趣的该等人类细胞包括体外(invitro)、离体(ex vivo)及/或体内(in vivo)的体细胞或肿瘤/癌细胞。

【背景技术】

Mir-302是在人类胚胎干细胞(human embryonic stem，hES cell)及诱发型多能性干细胞(induced pluripotent stem，iPS cell)中发现到的最主要的微型核糖核酸(microRNA，miRNA)，然而其功能尚不清楚。先前的研究已显示mir-302的异位表达能将人类癌细胞重新编程为似hES的多能性细胞，其具有明显缓慢的细胞周期速率以及似休眠细胞的细胞型态(Lin等人，2008)。相对静止是这些由mir-302重新编程而成的多能性干细胞(mirPS)的一项清楚的特征；然而，以其它三/四个因子(即Oct4-Sox2-Klf4-c-Myc或Oct4-Sox2-Nanog-Lin28)诱发而得的多能性干细胞(iPS)则具有另人注目的增生能力及不可挡的肿瘤生成倾向(Takahashi等人，2006；Yu等人，2007；Wernig等人，2007)。存在于mirPS细胞的抗增生特性背后的机制尽管大部分仍不甚清楚，我们发现两个mir-302标的的G1检控点调节子(G1-checkpoint regulators)可能参与其中，他们是：细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)及细胞周期蛋白D，(Lin等人，2008)。真核细胞细胞周期的进行是经由细胞周期蛋白依赖性激酶(CDKs)的活化来驱动的，细胞周期蛋白依赖性激酶与正调节次单元(subunits)：细胞周期蛋白，以及负调节子：细胞周期蛋白依赖性激酶抑制子(CKI，像是p14/p19Arf、p15Ink4b、p16Ink4a、p18Ink4c、p21Cip1/Waf1与p27Kip1)形成功能性复合体。在哺乳动物细胞中，不同的细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶复合体参与调节细胞周期中不同时期的转换，像是参与G1期行进的细胞周期蛋白-D-CDK4/6、G1-S期转换的细胞周期蛋白-E-CDK2、S期行进的细胞周期蛋白-A-CDK2，以及参与M期进入的细胞周期蛋白A/B-CDC2(细胞周期蛋白-A/B-CDK1)。由此推测，mir-302的抗增生功能是由于CDK2及细胞周期蛋白D在G1-S期转换期间被共同抑制的结果。

然而，在有关人类mir-302类似物：小鼠mir-291/294/295家族的研究中，显示其与人类mirPS细胞内的mir-302的功能全然不同的结果。在小鼠胚胎干细胞(mES)中，mir-291/294/295的异位表达透过直接沉默p21Cip1(又名CDKN1A)与丝氨酸/苏氨酸蛋白质激酶Lats2(Wang等人，2008)引发细胞快速增生以及G1-S期转换。该肿瘤倾向(tumor-prone)的结果被认为是由于p21Cip1及Lats2肿瘤抑制子的天性使然。缺乏p21Cip1/Waf1的基因的转基因小鼠在缺乏G1检控点的控制下能表现正常的发展(Deng等人，1995)。然而，由于Lats2在有丝分裂开始时具有征召λ-微管蛋白(gamma-tubulin)及参与纺锤体形成等功能，因此其角色仍待理清。此外，小鼠胚胎中Lats2的缺乏已被发现会导致严重的有丝分裂缺陷且具致命性，此亦指出Lats2的沉默会阻碍而非促进细胞分裂(Yabuta等人，2007)。综合来说，p21Cip1的沉默似是mir-291/294/295诱导的肿瘤生成背后的主要机制。然而，我们近来在审查人类p21Cip1基因的mir-302标的位的结果，是阴性的。同样阴性的结果亦可由在线演算程序TARGETSCAN(http://www.targetscan.org/)及PICTAR-VERT(http://pictar.mdc-berlin.de/)预测而得。因此，mir-302及其类似物，mir-291/294/295很可能在hES和mES细胞中各具有不同的功能，而导致人类iPS及小鼠iPS细胞不同的特性。在以上发现的启发下，吾人可以理解mir-291/294/295在mES细胞中的角色不能作为评估mir-302在hES及iPS细胞内的功能的等效模型。

MiRNA是细胞质中的抑制子(inhibitor)，其通常的功能为抑制与其高度互补的标的基因转录物(mRNAs)的翻译。MiRNA与标的基因结合的严谨度决定了该miRNA的真正功能。依据细胞条件的不同，miRNA在基因标的偏好上也会有不一样的表达。然而，至目前并没有与mir-302的浓度效应或mir-302与标的基因交互作用的严谨度相关的报告。为解答此疑问，本发明揭露其中重要的细节并首次揭示mir-302在人类及小鼠细胞中的功能非常不同。在人类细胞中，mir-302强烈地标的CDK2、细胞周期蛋白D1/D2、以及BMI-1，但有趣的是，不包含p21Cip1。与小鼠p21Cip1不同，人类p21Cip1不含任何mir-302的标的位。基因标的上的不同导致两者在细胞周期调节上的重要分歧(schism)。在小鼠胚胎干细胞(mES)中，mir-302沉默p21Cip1并且促进似肿瘤(tumor-like)的细胞增生(Wang等人，2008；Judson，2009)，然而在人类mirPS细胞中，p21Cip1依然维持表达并导致较缓慢的细胞增生与较低的肿瘤生成能力。此外，小鼠的BMI-1也因缺乏适当的标的位，因此非mir-302的标的基因。吾人发现在mirPS细胞中，沉默人类的BMI-1会刺激p16Ink4a/p14ARF表达而减弱细胞增生；反之，mir-302无法沉默小鼠BMI-1在小鼠细胞中引起相同的效应。由于在人类mirPS细胞中p16Ink4a/p14ARF的表达提升而p21Cip1不受影响，因此mir-302在人类细胞中除了共抑制细胞周期蛋白-E-CDK2及细胞周期蛋白-D-CDK4/6途径以外，最有可能再透过p16Ink4a-Rb及/或p14/19ARF-p53途径来达到其抗增生的功能。Mir-302标的人类及小鼠基因偏好的显著差别意味着两者的细胞周期调节机制有根本上的不同。

总而言之，先前技术忽略了微型核糖核酸(miRNA)与其标的基因交互作用的严谨度而对人类mir-302的功能做了错误的假设。为了澄清此误解，本发明采用一诱导性mir-302表达系统而揭示了mir-302在抑制人类肿瘤/癌细胞生长方面的新颖功能。吾人从中的新发现可用于发展针对癌症治疗与预防的普适性抗肿瘤/癌症的药物以及/或疫苗。所以，在发展药物/疫苗及其癌症治疗上，以有效及安全的设计与方法使用mir-302是有其必要的。

【发明内容】

本发明涉及用于癌症治疗的有治疗功能的DNA/RNA药物及/或疫苗的设计与使用。具体而言，本发明使用一重组核酸组合物，其在被传送至人类细胞后能表达小型核糖核酸基因沉默效应子(small RNA gene silencing effector)，抑制mir-302标的的细胞周期调节子以及致癌基因的活性，导致对于人类肿瘤/癌细胞生长及转移的肿瘤抑制效应。小型核糖核酸基因基因沉默效应子较佳包含微型核糖核酸(microRNA，miRNA)，例如mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d、以及其似发夹微型核糖核酸前体(hairpin-like microRNA precursors，pre-miRNAs)、人造重设的小发夹型核糖核酸(small bairpin RNA，shRNA)同源物/衍生物及其组合。小发夹型核糖核酸同源物/衍生物的设计包括在小发夹型核糖核酸(shRNA)与小干扰核糖核酸(small interferingRNA，siRNA)结构中，个别单元或多个单元簇内核酸组合物的失配(mismatched)与完全配对(perfectly matched)，其皆可促进标的专一性并减少传送与治疗所需的mir-302数量(拷贝数，copy number)。

天然微型核糖核酸(miRNA)的大小大约为18～27个核苷酸(nucleotides，nt)长度，并且，依微型核糖核酸(miRNA)与其标的之间的互补情况，能够直接降解其所标的的信使核糖核酸(mRNA)或抑制其标的信使核糖核酸(mRNA)的翻译。Mir-302家族(mir-302s)是一群在许多哺乳动物中高度同源、并且保守的微型核糖核酸(miRNAs)。Mir-302家族(mir-302s)包含四个家族成员，他们一起被转录成非编码核糖核酸簇(non-coding RNA cluster)，由5’端至3’端依序包含mir-302b、mir-302c、mir-302a、mir-302d、以及mir-367(Suh等人，2004)。近来发现了在家族簇之外的第五个mir-302成员，即mir-302e。虽然mir-367与mir-302s共同被表达，但他们的功能实际上彼此不同，吾人倾向重新设计此mir-302簇来只表达mir-302s。此外，吾人亦使用人工重设的发夹环(hairpin loops)，像是5’-GCTAAGCCAGGC-3’(SEQ.ID.NO.1)与5’-GCCTGGCTTA GC-3’(SEQ.ID.NO.2)取代原mir-302前体(pre-mir-302)的环序列，以形成较为紧密的簇而便于传送与表达。通常来说，mir-302仅在小鼠以外的哺乳动物胚胎干细胞(embryonic stem(ES)cell)中大量表达，然后在细胞分化与/或增生后快速减少(Tang等人，2007；Suh等人，2004)。由于miRNA的特征在于其为能够沉默与其高度互补的标的基因的小型抑制性核糖核酸(smallinhibitory RNAs)(Bartel，D.P.，2004)，因此mir-302s很可能是防止ES细胞在早期胚胎发育中迷途生长及过早生长的关键抑制子，并防止干细胞的肿瘤形成。事实上，在桑椹期(morula stage，32～64细胞期)之前的ES细胞通常表现非常慢的细胞周期速率。这些发现指出mir-302在正常干细胞维持与恢复的调控上扮演一重要角色，并有助于抑制肿瘤/癌细胞形成。

所有的mir-302成员在5’最前方的17个核苷酸共有一完全相同的序列，其中包含完整的种子基序(seed motif)5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)；并且在其同样拥有23个核苷酸的成熟微型核糖核酸(miRNA)序列中具有高于85％的序列同源性(homology)。根据在线演算程序TARGETSCAN(http://www.targetscan.org/)及PICTAR-VERT(http://pictar.mdc-berlin.de/)目前的预测结果，这些成员同时标的几乎相同的细胞基因，其中包含超过607个人类基因。此外，mir-302与在功能上也许有某程度相似的mir-93、mir-367、mir-371、mir-372、mir-373及mir-520家族亦共有许多标的基因。大部分的标的基因为有关于早期胚胎发育当中特定细胞系分化(lineage-specific cell differentiation)的起始与/或建立的发育讯号(developmental signals)及转录因子(Lin等人，2008)。另外，许多标的基因也是为人所熟知的致癌基因(oncogenes)。因此，mir-302的功能更可能是抑制发育讯号及分化相关转录因子的总体产生，而不同于先前诱导性多能性干细胞(iPS)方法所做的，在某些胚胎讯息传递路径上刺激转录作用。再者，由于其中许多标的的发育讯号及分化相关的转录因子为致癌基因，因此mir-302具有抑制肿瘤的功能而防止正常hES细胞的生长朝向肿瘤/癌细胞形成的方向进行。

在一较佳实施例中，发明人已设计并发展出一可诱导的pTet-On-tTS-miR302s表达载体(图1A)，再配合病毒感染、电穿孔法或脂质体/多聚体(polysomal)转染以将mir-302传送到正常及/或癌人类细胞中。重新设计的mir-302构建体包含四个小非编码核糖核酸成员(small non-coding RNA members)：同在一个簇中的mir-302a、mir-302b、mir-302c、与mir-302d(mir-302s；图1B)。在多西环素(Doxycycline，Dox)的刺激下，此mir-302s构建体受到一由四环霉素反应组件(tetracycline-responsiveelement，TRE)所控制的巨细胞病毒(cytomegaloviral)(CMV)启动子的驱动而被表达。在感染/转染后，mir-302的表达依自然的微型核糖核酸(miRNA)生物合成路径进行。其中mir-302s构建体与一报告基因，像是红移荧光蛋白基因(red-shiftedfluorescent protein，RGFP)，共同被转录，然后进一步被剪接复合体(spiceosomalcomponents)及/或细胞质内的RNA内切酶III(RNaseIII)岱塞尔(Dicers)(图2A)(Lin等人，2003)加工成个别的mir-302成员。此策略的结果是，在微型核糖核酸微阵列分析中(实施例3)，所有正义(sense)mir-302成员在多西环素的刺激后有效地在被转染的细胞中表达(图1C)。将mir-302表达载体转导至人类细胞的步骤概述于图2B-C。

发明人仿效自然的内含子微型核糖核酸(intronic miRNA)生物合成路径(图2A)，设计了一内含子微型核糖核酸(miRNA)表达系统，即SpRNAi-RGFP，以转录重组RGFP基因；SpRNAi-RGFP包含一人造/人工的剪切胜任内含子(splicing competentintron，SpRNAi)，其能够产生内含子微型核糖核酸(intronic miRNA)及/或类小发夹型核糖核酸(shRNA-like)基因沉默效应子(Lin等人，2003；Lin等人，(2006)Methods MolBiol.342：295-312)。SpRNAi与RGFP共同被第二型RNA聚合酶(Pol-II RNApolymerase)转录而包含在SpRNAi-RGFP基因的信使核糖核酸前体(pre-mRNA)中，并且SpRNAi被RNA剪接复合体(RNA splicing components)剪出。接着，被剪出的SpRNAi进一步被加工为成熟的基因沉默效应子，像是天然的微型核糖核酸(miRNA)以及人造小发夹型核糖核酸(shRNAs)，以引发对于标的基因的特定的核糖核酸干扰效应(RNA interference，RNAi)。同时，在内含子剪出(intron splicing)之后，SpRNAi-RGFP基因转录物(transcript)的外显子(exons)被连接在一起而形成成熟的信使核糖核酸(mRNA)，其接着被翻译成RGFP报告蛋白质，作为鉴别miRNA/shRNA表达之用。在定量上，一倍的RGFP浓度相当于四倍的mir-302浓度。此外，亦可选择性地以一些功能性蛋白的外显子取代RGFP来提供附加的基因功能，例如体细胞重新编程(somatic cell reprogramming，SCR)中的hES基因标记。鉴于目前在脊椎动物中，有超过1000个、功能尚未厘清的天然微型核糖核酸(miRNA)种类已被发现，且更多新的微型核糖核酸亦陆续被识别，因此吾人的内含子微型核糖核酸表达系统能作为一测试微型核糖核酸在体外及体内的功能的一有利工具。

SpRNAi内含子包含数个一致性核苷酸组成分，包括一5’端剪接位(5’-splicesite)、一分支点基序(Branch-Point，BrP)、一多嘧啶段(poly-pyrimidine tract)、以及一3’端剪接位(3’-splice site)。另外，并有被插入在5’剪接位及分支点基序之间的一发夹形微型核糖核酸(miRNA)或小发夹型核糖核酸(shRNA)前体。此内含子部份在RNA剪接及加工过程当中通常形成一套索(lariat)构造。再者，SpRNAi的3’端包含一多样的翻译终止密码子区域(translational stop codon region(T codon))，以增加内含子RNA剪接(intronic RNA splicing)与加工的准确度。当T密码子信号表现于细胞质内的信使核糖核酸(mRNA)，该T密码子信号会通知细胞内无意义调节的衰败(nonsense-mediated decay，NMD)系统的活化，降解任何累积在细胞中、非结构化的核糖核酸以防止细胞毒性的产生。然而，高度结构化的小发夹型核糖核酸(shRNA)及微型核糖核酸前体(pre-miRNA)将被保留，并接着经岱塞尔(Dicers)切割而分别形成成熟小干扰核糖核酸(siRNA)及微型核糖核酸(miRNA)。为了表达内含子miRNA/shRNA，吾人人工地将SpRNAi并入到RGFP基因的DraII限制位点中(Lin等人，2006与2008)，如此形成了重组SpRNAi-RGFP基因。以DraII限制酶切割RGFP可在每一端产生具有三个内凹核苷酸的AG-GN核苷酸断口，其在SpRNAi插入后，将分别形成5’端与3’端剪接位。内含子插入中断了RGFP蛋白质的完整性，但由于其能藉由内含子剪接而恢复完整性，因此吾人能透过在被转染细胞中出现的红色红移荧光蛋白(RGFP)来测定成熟miRNA/shRNA的表达。RGFP基因亦包含复数个外显子剪接增强子(exonic splicing enhancers，ESEs)以增加RNA剪接的准确度及效率。

详细来说，SpRNAi内含子包含一5’端剪接位(5’-splicing site)，其与5’-GTAAGAGK-3’(SEQ.ID.NO.4)或GU(A/G)AGU基序(即5’-GTAAGAGGAT-3’、5’-GTAAGAGT-3’、5’-GTAGAGT-3’与5’-GTAAGT-3’)同源；该SpRNAi内含子3’端为一3’端剪接位(3’-splicing site)，其与GWKSCYRCAG(SEQ.ID.NO.5)或CT(A/G)A(C/T)NG基序(即5’-GATATCCTGC AG-3’，5’-GGCTGCAG-3’与5’-CCACAG-3’)同源。此外，一分支点基序(branch pointsequence)位于5’端及3’端剪接位之间，其与5’-TACTWAY-3’(SEQ.ID.NO.6)基序，像是5’-TACTAAC-3’与5’-TACTTAT-3’高度同源。分支点基序的腺嘌呤核苷酸(adenosine)，“A”核苷酸，在几乎所有的剪接体内含子(spliceosomal introns)中，能藉由细胞2’-5’寡腺苷酸合成酶((2’-5’)-oligoadenylate synthetases)与剪接体(spliceosomes)形成一通过(2’-5’)键结连接的套索内含子RNA(intron RNA)的一部份。再者，一多嘧啶段(poly-pyrimidine tract)位在接近分支点基序与3’端剪接位之间，为一高T(胸线嘧啶核苷酸)或高C(胞嘧啶核苷酸)含量的序列，其与5’-(TY)m(C/-)(T)nS(C/-)-3’(SEQ.ID.NO.7)或5’-(TC)nNCTAG(G/-)-3’(SEQ.ID.NO.8)基序同源。其中符号“m”及“n”表示多个重复，其≥1；m的数量最佳等于1～3且n的数量等于7～12。符号“-”是指在该序列中可被略过的核苷酸。另外，序列中亦包含一些链接核苷酸序列，其用来连接所有合成的内含子成分。根据37CFR 1.822中有关表示核苷酸及/或氨基酸序列数据的符号及格式的准则，符号W指腺嘌呤(A)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号K指鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号S指胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)，符号Y指胞嘧啶(C)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)，符号R指腺嘌呤(A)或鸟嘌呤(G)，且符号N指腺嘌呤(A)、胞嘧啶(C)、鸟嘌呤(G)或胸腺嘧啶(T)/尿嘧啶(U)。

在其它较佳实施例中，本发明是一直接的(外显子)mir-302miRNA/shRNA表达系统，其能从表达系统中直接产生类mir-302基因沉默效应子而不需通过细胞内的RNA剪接及/或NMD机制。然而，此方式的缺点为类mir-302基因沉默效应子的表达不受到任何细胞内监视系统(surveillance system)，像是无意义调节的衰败(NMD)的调控，因此可能造成自然微型核糖核酸生物合成路径的过度饱和而导致细胞毒性的产生(Grimm等人，2006)。此方法所使用的表达系统可以是线型或环型的核酸组合物，其选自质粒、病毒载体、慢病毒载体(lentiviral vector)、转位子(transposon)、反转位子(retrotransposon)、跳跃基因(jumping gene)、蛋白质编码基因(protein-codinggene)、非编码基因(non-coding gene)、人工重组转基因(artificially recombinanttransgene)，以及其组合。类mir-302基因沉默效应子，包含微型核糖核酸、小发夹型核糖核酸、小干扰核糖核酸，及其前体和同源物/衍生物，受到组织特异性或非特异性的RNA启动子的控制而表达。RNA启动子选自第二型RNA聚合酶(Pol-II)、病毒聚合酶(viral polymerase)、第三型RNA聚合酶(Pol-III)、第一型RNA聚合酶(Pol-I)，及四环霉素反应组件控制的RNA聚合酶(TRE)启动子。病毒启动子为类第二型RNA启动子，其分离自但不限于巨细胞病毒(cytomegalovirus，CMV)、反转录病毒长末端重复序列(retrovirus long-terminal region，LTR)、B型肝炎病毒(hepatitis Bvirus，HBV)、腺病毒(adenovirus、AMV)、以及腺相关病毒(adeno-associated virus，AAV)。举例来说，一慢病毒LTR启动子在每细胞中能够生产五十万个前体信使核糖核酸转录物(pre-mRNA transcript)(拷贝)。此外，基因沉默效应子的转录速率亦可藉由在RNA聚合酶启动子前方插入一药敏感抑制子(drug-sensitive repressor，即tTS)来控制。抑制子可以被化学药物或选自G418、新霉素(neomycin)、四环霉素(tetracycline)、多西环素(doxycycline)、安比西林(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、嘌呤霉素(puromycin)，及其衍生物等等的抗生素抑制。

在另一方面，亦可使用表达数个内含子基因沉默效应子的复数个转基因(transgenes)以及/或载体来达成对mir-302标的基因的基因沉默效应。此外，复数个基因沉默效应子亦可从一个内含子插入子(intronic insert)产生。举例来说，有报导指出，斑马鱼中一含有抗EGFP(anti-EGFP)的微型核糖核酸前体(pre-miRNA)的内含子的异位表达(ectopic expression)能产生两个不同大小的miRNA，即miR-EGFP(282/300)与miR-EGFP(280/302)，因此显示出1个SpRNAi插入子能产生复数个基因沉默效应子(Lin等人(2005)Gene 356：32-38)。在某些例子中，内含子基因沉默效应子能与一标的的基因转录物(即，信使核糖核酸，mRNA)杂合，形成双股小干扰核糖核酸(siRNAs)而引发次级核糖核酸干扰效应(RNAi)。由于这些基因沉默效应子由转基因载体持续地被产生，因此可减轻对于RNA在体内快速降解的顾虑。此策略的好处在于载体转基因转染或者病毒感染的稳定传递能提供一可靠、长效的基因沉默效力。

由于某些天然前体微型核糖核酸(pre-miRNAs)的茎环(stem-loop)结构太大及/或太复杂而不适合用于微型核糖核酸表达系统/载体，因此发明人常使用人工重设甲硫氨酸的转运核糖核酸环(tRNA^metloop，即5’-(A/U)UCCAAGGGGG-3’)取代天然前体微型核糖核酸的环。tRNA^met环能有效使得人工重设的微型核糖核酸(miRNA)通过与天然微型核糖核酸相同的运送机制，借着Ran-GTP与输出蛋白5(Exportin-5)，由细胞核输出至细胞质(Lin等人，2005)。本发明的优点在于使用一对人工改良的pre-mir-302环，包括5’-GCTAAGCCAG GC-3’(SEQ.ID.NO.1)与5’-GCCTGGCTTAGC-3’(SEQ.ID.NO.2)，该等环能提供人工重设的微型核糖核酸(pre-miRNA)与天然前体微型核糖核酸输出相同的核输出(nucleus export)效率，同时不干扰tRNA输出。再者，此改良亦促进mir-302a-mir-302a*双股及mir-302c-mir-302c*双股的形成，因而增加mir-302s总体的功能与稳定度。此新颖的前体微型核糖核酸环的设计是修饰tRNA^met环与mir-302b/mir-302a短茎环的组合而完成，其中mir-302b/mir-302a的短茎环在人类ES细胞中高度表达但在其它已分化组织的细胞内则否。如此，在mir-302构建体中使用该重组/人造/人工发夹环不会干扰人体中自然的miRNA路径，因而降低细胞毒性且增加安全性。

Mir-302前体微型核糖核酸的家族簇是经由杂合与链接/连结合成的mir-302同源物而形成，该簇由5’端至3’端包含四个部分：mir-302a、mir-302b、mir-302c，及mir-302d的前体微型核糖核酸(pre-miRNAs，图1B)。所有人工重设的mir-302mirRNA/shRNA分子在其5’端最前面具有相同的17个核苷酸[例：5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)]。用于Mir-302的前体微型核糖核酸簇的DNA重组的合成寡核苷酸如下所列：包含mir-302a-正义，5’-GTCACGCGTTCCCACCACTT AAACGTGGAT GTACTTGCTT TGAAACTAAA GAAGTAAGTGCTTCCATGTT TTGGTGATGG ATAGATCTCT C-3’(SEQ.ID.NO.9)；mir-302a-反义，5’-GAGAGATCTA TCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT CTTTAGTTTCAAAGCAAGTA CATCCACGTT TAAGTGGTGG GAACGCGTGA C-3’(SEQ.ID.NO.10)；mir-302b-正义，5’-ATAGATCTCT CGCTCCCTTC AACTTTAACATGGAAGTGCT TTCTGTGACT TTGAAAGTAA GTGCTTCCAT GTTTTAGTAGGAGTCGCTCA TATGA-3’(SEQ.ID.NO.11)；mir-302b-反义，5’-TCATATGAGCGACTCCTACT AAAACATGGA AGCACTTACT TTCAAAGTCA CAGAAAGCACTTCCATGTIA AAGTTGAAGG GAGCGAGAGA TCTAT-3’(SEQ.ID.NO.12)；mir-302c-正义，5’-CCATATGGCT ACCTITGCTT TAACATGGAG GTACCTGCTGTGTGAAACAG AAGTAAGTGC TTCCATGTTT CAGTGGAGGCGTCTAGACAT-3’(SEQ.ID.NO.13)；mir-302c-反义，5’-ATGTCTAGACGCCTCCACTG AAACATGGAA GCACTTACTT CTGTTTCACA CAGCAGGTACCTCCATGTTAAAGCAAAGGT AGCCATATGG-3’(SEQ.ID.NO.14)；mir-302d-正义，5’-CGTCTAGACA TAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCTAAGCCAGGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGCGATCGC AT-3’(SEQ.ID.NO.15)；及mir-302d-反义，5’-ATGCGATCGC GAACACTCAAACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGTTATGTCTAGA CG-3’(SEQ.ID.NO.16)。或者，吾人亦使用人工重设的小发夹型核糖核酸(shRNA)。该人工重设的小发夹型核糖核酸是由合成的miR-302s-正义，5’-GCAGATCTCG AGGTACCGAC GCGTCCTCTT TACTTTAACA TGGAAATTAAGTGCTTCCAT GTTTGAGTGGTGTGGCGCGA TCGATATCTC TAGAGGATCCACATC-3’(SEQ.ID.NO.17)与mir-302s-反义，5’-GATGTGGATC CTCTAGAGATATCGATCGCG CCACACCACT CAAACATGGA AGCACTTAAT TTCCATGTTAAAGTAAAGAG GACGCGTCGG TACCTCGAGA TCTGC-3’(SEQ.ID.NO.18)杂合形成，取代mir-302前体微型核糖核酸的簇(mir-302 pre-miRNA cluster)，作简单的内含子插入。Mir-302小发夹型核糖核酸(mir-302shRNA)与所有天然的mi-302成员共有超过85％的同源性并且标靶相同的人类细胞基因。在设计mir-302同源物时，胸腺嘧啶可以被尿嘧啶取代，反之亦然

在mir-302的前体miRNA/shRNA的内含子插入(intronic insertion)的部份，由于在重组SpRNAi-RGFP转基因插入位的侧翼分别有5’端的PvuI与3’端的MluI限制/克隆位，因此最初的插入子能被移除、再以各种前体miRNA/shRNA插入子取代的(例：mir-302的前体miRNA/shRNA)，其中该等前体miRNA/shRNA插入子具有与PvuI及MluI限制位相匹配的黏性末端(cohesive ends)。借着更换标的不同的基因转录物的内含子插入子，本发明的内含子mir-302s(intronic mir-302s)表达系统能作为在体外(in vitro)、离(ex vivo)、及体内(in vivo)中引发标的基因沉默的一个有力工具。在内含子插入后，此在内含子插入位含有mir-302的SpRNAi-RGFP转基因接着再被插入至一能受到多西环素诱导的pSingle-tTS-shRNA载体的限制/克隆位(即：一XhoI-HinDIII限制/克隆位)，形成能在细胞内表达的pTet-On-tTS-miR302s表达载体(图1A)。

将表达mir-302的核酸组合物传送到人类细胞的方法是使用一非转基因或转基因方法，其选自脂质体/多聚体/化学转染法(liposomal/polysomal/chemicaltransfection)、DNA重组(DNA recombination)、电穿孔法(electroporation)、基因枪穿透(gene gun penetration)、转位子/反转位子插入(transposon/retrotransposon insertion)、跳跃基因整合(jumping gene integration)、显微注射(micro-injection)、病毒感染(viralinfection)、反转录病毒/慢病毒感染(retroviral/lentiviral infection)，及其组合。为了预防转基因随机的插入及细胞突变的风险，本发明较佳使用脂质体或多聚体转染法来将pTet-On-tTS-miR302s载体传送至标的人类细胞中(即，肿瘤/癌细胞)。Mir-302s的表达取决于在各种浓度的多西环素下，pTet-On-tTS-miR302s载体上由TRE调控的CMV启动子的活化。因此，本发明提供了通过明确药物(即，多西环素)进行的一可诱导式机制，来控制mir-302s在体外、离体和/或体内的表达；其亦为除了细胞内NMD系统以外的第二防线。藉由多西环素的调节控制，吾人在受测细胞中未观察到由于RNA累积或过饱和所造成的任何细胞毒性。另外，本发明亦提供一组成型mir-302表达系统，其能在一期间内持续表达类mir-302基因沉默效应子。类mir-302基因沉默效应子的表达较佳通过一CMV启动子驱动，其在人类细胞中经常在为期一个月的活化状态之后，因DNA甲基化而静止。此活化一个月的机制因能防止被处理的细胞中RNA的累积或过度饱和而有益于癌症治疗。

总而言之，本发明采用一新颖设计与策略，在被转染的细胞中可诱导地或组成型地表达类mir-302基因沉默效应子。类mir-302基因沉默效应子包括mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d及他们的似发夹微型核糖核酸前体(pre-miRNAs)、人工重设的小发夹型核糖核酸(shRNA)同源物/衍生物，以及其组合。在较佳实施例中，本发明提供使用一在标的人细胞中能被传送、被转录及被加工成类mir-302基因沉默效应子，从而引发mir-302标的的细胞周期调节子与致癌基因的特定基因沉默效应的重组核酸组合物的设计与方法。其包含以下步骤：a)提供一重组核酸组合物，其能被传送、被转录、被加工成至少一基因沉默效应子以干扰复数个mir-302标的的细胞基因，以及b)以该重组核酸组合物处理一细胞底物。类mir-302基因沉默效应子的转录通过一组成型启动子(即，CMV)或药物诱导式启动子(即，TRE-CMV)来驱动。该受药物诱导的重组核酸组合物较佳为一Tet-On载体，其包含插入有重组mir-302家族簇(mir-302s；SEQ.ID.NOs.9-16的杂合物)或一人工重设的mir-302小发夹型核糖核酸同源物(shRNA，即，SEQ.ID.NOs.17与18的杂合物)的一重组转基因。该细胞底物能在体外、离体或体内表达mir-302的标的基因。通过沉默mir-302标的的细胞周期调节子与致癌基因，本发明能抑制细胞肿瘤生成能力并能将受试细胞重新编程为非肿瘤/癌细胞。

发明人由本发明在六个方面获得mir-302介导的肿瘤/癌症治疗的成功证明：第一，转染mir-302至正常人类细胞(mirPS-hHFC)中，导致细胞周期减弱但不引起细胞凋亡或细胞死亡(图1D-F与图3A-C)。第二，转染mir-302至正常人类细胞能将细胞重新编程为类干细胞状态；有益于治愈受损组织(图4A-B与图5A-D)。第三，将mir-302转染至肿瘤/癌细胞(mirPS-MCF7，mirPS-HepG2与mirPS-NTera2)会强烈抑制肿瘤/癌细胞的肿瘤生成能力并导致＞98％细胞的死亡或细胞凋亡(图6A-E)。第四，mir-302不仅能藉由共同抑制数种细胞周期调节子，像是细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)，细胞周期蛋白D1/D2(cyclin D1/D2)与BMI-1，亦能借着活化肿瘤抑制者：p16INK4a与p14/p19Arf来抑制肿瘤/癌细胞的活化(图7A-D)。第五，在体内将mir-302传送至肿瘤中能抑制＞90％的肿瘤细胞生长(图8A-C)。最后一点，mir-302不会引起端粒缩短(telomere shortening)所导致的细胞衰老(cell senescence)(图9A-C)。此外，发明人已成功地使用多聚体/脂质体(polysome/liposome)将类mir-302基因沉默效应子转染至体内标的的肿瘤细胞中，因此能预防反转录病毒感染与转基因基因突变的风险(图8A-C)。这些发现提供了能使用类mir-302基因沉默效应子作为肿瘤/癌症治疗的治疗药物及/或疫苗的有力证明。另外，考虑到mir-302亦有回复人类细胞的干细胞性(stemness)的功能(Lin等人，2008)，因此本发明皆有益实施于干细胞与癌症治疗。

【附图简单说明】

明确言之，以下说明的图示仅供举例说明之用而非限制本发明：

图1A-F描述可诱导的mir-302表达及其对正常人类毛囊细胞(hHFC)增生的效应。(A)可受多西环素(Dox)诱导的pTet-On-tTs-miR302s载体的构建体。(B)mir-302家族(mir-203s)簇的结构。(C)以10μM多西环素(Dox)处理后(n＝3，p＜0.01)经6小时，诱导表达的mir-302经微型核糖核酸微阵列分析的结果。(D)RNA与蛋白质印迹分析法分析mir-302对核心重新编程转录因子Oct3/4-Sox2-Nanong与黑色素细胞(melanocytic)标记基因TRP1的蛋白质产物、细胞角蛋白16(cytokeratin 16)的表达型式的剂量相关效应(n＝5，p＜0.01)。(E)流式细胞仪分析结果的长条图显示mir-302对mirPS-hHFC细胞族群有丝分裂(M期)与休眠(G0/G1期)改变的剂量相关效应。(F)以10μM多西环素(Dox)处理后，各mirPS细胞株在mir-302诱导下发生的细胞凋亡DNA断裂的DNA梯度(DNA laddering)特征。

图2A-C描述mir-302s的生物合成以及mirPS细胞的产生。(A)内含子mir-302生物合成的机制。Mir-302家族簇与一编码红色荧光蛋白的基因(RGFP)一同被转录并进一步被剪接复合体(spliceosomal components)及细胞质酶：RNA内切酶III(RNaseIII)，岱塞尔(Dicers)，剪切成单个的mir-302成员。其中红色荧光蛋白作为mir-302产量的指标。1倍的红色荧光蛋白浓度相当于有四倍浓度的mir-302生产。(B)以脂质体/多聚体/电穿孔法转染mir-302的步骤示意。诱导式的mir-302表达载体pTet-On-tTs-miR302s(图1A)在-低渗性pH缓冲液(200μl；Eppendorf)中以电穿孔法在150微秒的300～400伏特的下被导入成熟(adult)hHFC细胞。在每一试验中使用10μg pTet-On-tTs-miR302s载体转染200,000个源自两个人类毛囊(真皮乳头)的培养的hHFC细胞。经多西环素(Dox)诱导而表达后，mir-302的生物合成依照自然的内含子微型核糖核酸(intronic miRNA)途径进行。

图3A-C描述经多西环素(Dox＝5或10μM)诱导后表达的mir-302对mirPS-hHFC细胞特性的改变。(A)在多西环素诱导细胞重新编程之前与之后，细胞形态及细胞周期速率的改变。每细胞周期阶段与相对的细胞DNA含量的流式细胞仪分析结果以一图表表示于细胞形态学上方(n＝3，p＜0.01)。表中第一(左)与第二(右)高峰分别表示停滞期(G0/G1)细胞与有丝分裂期(M)细胞和全部的受试细胞族群的比率。比例尺＝l00μm。(B)单一mirPS-hHFC细胞在限数稀释后形成类胚胎体(EB)的细胞周期。细胞周期估计起先约为20～24小时，但在72小时的后逐渐加速。比例尺＝100μm。

图4A-B描述多能性标记表达的分析与活体内多能性分化及同化。(A)人类胚胎干细胞(hES)标记基因在mirPS细胞中以高浓度mir-302诱导后的表达型式与在人类胚胎干细胞WA01-H1(H1)及WA09-H9(H9)中的表达型式经RNA印迹分析后的比较(n＝5，p＜0.01)。以7.5μM多西环素(Dox)处理后，mir-302在mirPS细胞中的浓度与其在H1及H9细胞内的浓度增加超过30％(是未经处理的hHFC的＞30倍)并且开始引发主要多能性标记Oct3/4、Sox2、Nanog、Lin28与未分化胚胎细胞转录因子1(UTFl)的共同表达。(B)将mirPS细胞植入免疫功能不足SCID-beige小鼠后经过一个星期，由mirPS细胞分化而来的组织同化为注射位置附近的周围组织。白色箭头指示注射方向。闰盘(intercalated disks)位置以黄色三角形标示。衍生自mirPS-hHFC的组织囊肿不会在小鼠子宫及腹腔以外的器官/组织生长。吾人进一步在植入后一周解剖及检查注射位置周围的组织形成。在解剖前一天，小鼠经尾部静脉注射方式被施以10μg多西环素。吾人观察到呈RGFP阳性的mirPS细胞分化成为与注射位置周围组织相同的细胞类型，包括在腹膜内注射后形成肠上皮组织、心脏注射后的心肌、以及在腰背(dorsal flank)注射后形成骨骼肌。此外，同化的mirPS细胞亦表达与周围组织相同的组织特异性标记，例如肠上皮的MUC2、心肌的第二型肌钙蛋白T(troponin T type 2，cTnT)、以及骨骼肌的肌球蛋白重链(myosin heavychain，MHC)。

图5A-D表示多西环素(Dox＝10μM)诱导下的mirPS-hHFCs得到类人类胚胎干细胞(hES-like)的特性。(A)使用人类基因组基因芯片(Human genome GeneChipU133 plus 2.0 array，Affymetrix)分析mir-302诱导体细胞重新编程(SCR)之前与之后的全基因表达型态(n＝3，p＜0.01～0.05)。(B)在限制酶HpaII切割后，较小DNA片段的出现与增加证实了以10μM而非5μM多西环素(Dox)处理后，mirPS细胞内基因组范围的总体CpG甲基化的大量减少。(C)以二亚硫酸盐DNA测序法测序Oct3/4与Nanog的启动子区域后，得到详细的甲基化地图。黑色圆形与白色圆形分别代表甲基化与未甲基化的胞嘧啶位置。(D)由mirPS-hHFCs多能分化成的似畸胎瘤组织囊肿(teratoma-like tissue cysts)包含源自三个胚层(embryonic germ layers)的各种组织。

图6A-E显示，10μM多西环素(Dox)诱导mir-302表达后，源自各种肿瘤/癌细胞的mirPS细胞的体外肿瘤生成能力分析。(A)以多西环素(Dox)诱导mir-302表达之前与之后，细胞形态与细胞周期速率的改变。细胞周期各阶段与相对的DNA含量的流式细胞仪分析结果以图表表示于细胞形态学上方(n＝3，p＜0.01)。(B)流式细胞仪分析结果的长条图显示mir-302对于源自各种肿瘤/癌细胞的mirPS细胞族群在有丝分裂(M期)及休眠(G0/G1期)变化上的剂量相关效应。(C)Mir-302抑制肿瘤侵入Matrigel小室中的功能性分析(h＝4，p＜0.05)。(D)在多西环素诱导mir-302表达之前与之后，比较细胞贴附于人类骨髓内皮细胞(hBMECs)单层的百分比(h＝4，p＜0.05)。

图7A-D荧光素酶3’非翻译区报告基因试验(luciferase 3’-UTR reporter geneassay)显示mir-302在标的的G1检控点调节子(G1-checkpoint regulators)引发的基因沉默效应。(A)荧光素酶3’非翻译区报告基因的构建体为在3’非翻译区带有两个正常(T1+T2)、或两个突变(M1+M2)、或正常与突变混合(T1+M2或M1+T2)的mir-302标的位置。突变位置含有一错配(mismatched)TCC基序，其取代正常标的位置的一致的3’-CTT端。(B)多西环素(Dox)诱导的mir-302表达对荧光素酶表达的影响(n＝5，p＜0.01)。Dox浓度＝5或10μM。CCND1与CCND2分别表示细胞周期蛋白D1与细胞周期蛋白D2。(C)与(D)以蛋白质印迹分析法比较在高浓度(10μM Dox)及低浓度(5μM Dox)mir-302诱导下，mir-302主要标的的G1检控点调节子在mirPS细胞与在人类胚胎干细胞：WA01-H1(H1)及WA09-H9(H9)中的变化(n＝4，p＜0.01)。

图8A-C的活体内(in vivo)肿瘤生成能力分析显示mirPS-NTera2细胞对组成型表达的mir-302s(NTera2+mir-302s)或mir-302d*(NTera2+mir-302d*)(n＝3，p＜0.05)的反应。被转染的肿瘤细胞NTera-2中的mir-302s及mir-302d*分别转录自pCMV-miR302s及pCMV-miR302d*载体。(A)实施原位注射(post-is)后经过三周，对平均肿瘤大小进行型态学评估。所有的肿瘤皆位于原本植入的位置(黑色箭头所指的处)。在所有受试小鼠中皆没有观察到恶病质或肿瘤转移的症候。(B)RNA印迹分析与蛋白质印迹分析以及(C)免疫组织化学染色分析图显示体内mir-302对于核心重新编程转录因子Oct3/4-Sox2-Nanog与mir-302标的的G1检控点调节子：细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白D1/D2、BMI-1、以及p16Ink4a和p14Arf表达型态的效应。

图9A-C为mir-302在10μM多西环素的诱导而表达下，mirPS-hHFC与衍生自各种肿瘤/癌细胞的mirPS细胞株的端粒酶活性分析。(A)以端粒重复序列扩增试验(TRAP)分析端粒酶活性(n＝5，p＜0.01)。端粒酶活性会受到RNase处理的影响(hHFC+RNase)。(B)蛋白质印迹法的分析证实人类端粒酶反转录酶(hTERT)在各种mirPS细胞株中的表达为一致的增加，而AOF2与HDAC2的表达减少(n＝5，p＜0.01)。(C)以端粒酶PCR ELISA试验测量端粒酶活性(OD470-OD680；n＝3，p＜0.01)。

图10A-D的分析结果显示mir-302对其标的外源基因(epigenetic gene)的沉默效应的。(A)荧光素酶3’非翻译区报告基因的构建体为在3’非翻译区带有两个正常(T1+T2)或两个突变(M1+M2)、或正常与突变混合(T1+M2或M1+T2)的mir-302标的位置。突变位置包含一错配的TCC基序，取代正常标的位置上一致的3’CTT端。(B)多西环素(Dox)诱导表达的mir-302对荧光素酶表达的影响(n＝5，p＜0.01)。(C)与(D)以蛋白质印迹分析法比较在高浓度(10μM Dox)与低浓度(5μM Dox)mir-302诱导下，mir-302主要标的外源基因(epigenetic gene)在mirPS细胞与在人类胚胎干细胞WA01-H1(H1)及WA09-H9(H9)中表达的变化(n＝4，p＜0.01)。

图11为mir-302介导的体细胞重新编程(somatic cell reprogramming，SCR)与细胞周期调节机制的示意图。基于先前与目前的研究，吾人发现了两并行事件。第一，mir-302通过对多种外源基因调节子(epigenetic regulators)：AOF1/2、MECP1/2与HDAC2强烈的沉默作用而开始了重新编程并引发全基因组DNA的去甲基化，藉此再活化诱发SCR所需(灰色标记)的人类胚胎干细胞细胞标记基因。第二，通过对G1检控点调节子细胞周期蛋白依赖性激酶(CDK2)、细胞周期蛋白D1/D2与BMI-1的共同抑制以及p16Ink4a与p14/p19Arf的活化而造成细胞周期的减弱，以抑制所有细胞活动来为SCR作准备(黑色标记)。休眠期(G0/G1)的停滞亦防止可能的随机生长(random growth)与/或被重新编程的多能性干细胞的类肿瘤转形(transformation)。整体而言，此两事件协同效应的结果为一更精确与安全的重新编程过程；亦能同时抑制预先成熟(pre-mature)细胞分化与肿瘤生成。

【具体实施方式】

尽管现将参考附图描述本发明的特定具体实施例，但应了解此等具体实施例仅作为实施例之用，并仅示例性举出少数的许多可能特定具体实施例，其可代表本发明的原理的应用。熟习本技术者人士显然应了解各种改变及修正皆属随附权利要求中所进一步定义的本发明的精神、范畴及构想内。

本发明提供一新颖核酸组合物以及利用重组的类mir-302基因沉默效应子来抑制人类肿瘤/癌细胞增生与肿瘤生成的方法。不同于先前小发夹型核糖核酸(shRNA)的设计，本发明的小发夹型核糖核酸包含一错配的茎臂(mismatched stem-arm)，其相似于天然mir-302的前体(pre-mir-302)。再者，本发明的小发夹型核糖核酸含有一改良的pre-mir-302茎环：例如5’-GCTAAGCCAG GC-3’(SEQ.ID.NO.1)与5’-GCCTGGCTTA GC-3’(SEQ.ID.NO.2)，其能提供与输出天然微型核糖核酸前体(pre-miRNAs)相同的核输出(nucleus export)效率，但不干扰转运核糖核酸(tRNA)的输出。不受任何特定理论的约束，本发明的抗增生、抗肿瘤生成的效应指出一新发现的、藉由转染一可表达mir-302家族簇(mir-302s)或mir-302同源性小发夹型核糖核酸的重组核酸组合物所引发的mir-302介导的基因沉默机制。所有人工重设的mir-302miRNA/shRNA分子，其5’最前方的17个核苷酸具有相同的序列，5’-UAAGUGCUUC CAUGUUU-3’(SEQ.ID.NO.3)。构筑类mir-302基因沉默效应子及表达mir-302的核酸组合物的步骤将在实施例2与3中描述。在设计与mir-302同源的序列时，胸腺嘧啶(T)可用来取代尿嘧啶(U)。

为了定位mir-302在人类细胞周期中的角色，吾人设计了一可诱导式的pTet-On-tTS-miR302s表达载体(图1A；实施例2)并将其转染到正常的人类癌细胞中。Mir-302s为一hES特有的微型核糖核酸(miRNA)家族，该家族含有四个小非编码(non-coding)RNA成员：mir-302b、mir-302c、mir-302a、及mir-302d(mir-302s，它们形成一簇；图1B)(Suh等人，2004)。本发明中，mir-302s的表达在多西环素(Dox)的刺激下，通过一藉由四环霉素反应元件(TRE)控制的巨细胞病毒启动子(cytomegaloviral(CMV)promoter)来驱动。在转染之后，mir-302的生物合成依照自然的内含子微型核糖核酸生合成途径进行，其中mir-302与编码红荧光蛋白的报告基因(RGFP)一起被转录，并进一步被剪接复合体(spliceosomal components)及细胞质RNA内切酶RNaseIII岱塞尔(Dicers)切割成单独的mir-302成员(图2A)(Lin等人，2008)。在定量上，一倍的RGFP浓度相当于有四倍浓度的mir-302存在。微型核糖核酸微阵列分析确认了在多西环素(Dox)刺激下，mir-302b*以外的所有mir-302成员皆能在被转染的细胞中有效表达(图1C；实施例3)。以pTet-On-tTS-miR302s表达载体转染细胞的步骤概述于图2B-C。

此外，表达mir-302的核酸组合物，像是pTet-On-tTS-miR302s，含有：用以增加真核细胞翻译效率的Kozak一致性翻译起始位(Kozak consensus translationinitiation site)、位于表达mir-302的构建体(mir-302 construct)的下游的多个SV40聚腺苷酸化讯息(SV40 polyadenylation signals)、在原核细胞中繁殖用的一pUC复制起始点、用来将表达mir-302的构建体(即，SpRNAi-RGFP)合并至该核酸组合物的至少两个限制位、在表达SV40T抗原的哺乳动物细胞中复制所需的-选择性的SV40复制起始点、以及在一复制胜任原核细胞中表达抗生素抗药性基因所需的-选择性SV40早期启动子。抗生素抗药性基因的表达作为一筛选标记，用来分离有转基因基因的表达的阳性群落。该等抗生素选自G418、新霉素(neomycin)、嘌呤霉素(puromycin)、盘尼西林G(penicillin G)、安比西林(ampicillin)、卡那霉素(kanamycin)、链霉素(streptomycin)、红霉素(erythromycin)、壮观霉素(spectromycin)、磷霉素(phophomycin)、四环霉素(tetracycline)、多西环素(doxycycline)、利福平(rifapicin)、两性霉素B(amphotericin B)、庆大霉素(gentamycin)、氯霉素(chloramphenicol)、头孢霉素(cephalothin)、泰乐菌素(tylosin)及其组合。

Mir-302减弱正常细胞细胞周期而不引起细胞凋亡

吾人先前的研究显示在人类黑色素细胞瘤细胞Colo-829与前列腺癌细胞PC3中，mir-302表达增加会将这些恶性癌细胞重新编程至一似hES的多能(pluripotent)状态(Lin等人，2008)。在体细胞重新编程(SCR)的过程中，mir-302导致大于98％(＞98％)的癌细胞细胞凋亡并且大幅减低余下(＜2％)重新编程细胞的增生速率。虽然这些特性有益于癌症治疗，但是mir-302在正常人类细胞中的功能仍然是不确定的。为了评估其效应，吾人将可被诱导的pTet-On-tTs-miR302s表达载体导入正常人类毛囊细胞(hHFCs)中。选择hHFCs的原因是由于其量充足、具可及性、并且生长快速。随着多西环素(Dox)浓度增加至10μM，吾人观察到在多西环素浓度大于7.5μM(＞7.5μM)(图1D，实施例5)的阈值下，核心重新编程因子(core reprogramming factors)Oct4-Sox2-Nanog一致受到促进，同时增生的细胞族群下降70％，即，由原先的37％±2％降至11％±2％(图1E，M期；实施例7)。相应之下，休眠的细胞族群增加了41％，即，由原先的56％±3％增至79％±5％(图1E，G0/G1期；实施例7)，因而反映出相似于吾人先前在mir-302重新编程多能性干细胞(mir-302-reprogrammed pluripotent stem cells)所发现的(mirPS cells；Lin等人，2008)一强烈的抗增生作用。然而mir-302重新编程的hHFC细胞(mirPS-hHFC)不表达任何能够测得的细胞凋亡的DNA梯状条带(DNA laddering)或细胞死亡的征象(图1F，实施例6)，这表示相较于肿瘤/癌细胞，正常细胞更可以忍受mir-302造成的抗增生作用。可以想见肿瘤/癌细胞旺盛的新陈代谢及快速的生长扩张使其很难以在这样的休眠状态下存活。

值得注意的是，当以浓度大于7.5μM的多西环素处理后，mirPS-hHFC的形态由纺锤状转变成类似休眠细胞的球状(图3A-B，红色RGFP阳性细胞)。在7.5μM多西环素刺激下所产生的细胞mir-302浓度大约是人类胚胎干细胞H1及H9细胞中mir-302浓度水平的1.3倍(图4A；实施例4)。在此更高的浓度水平之下，mirPS-hHFCs强烈表达Oct3/4、Sox2、Nanog、及其它标准人类胚胎干细胞(hES)标记(图4A)。全基因表达的微阵列分析进一步显示大约一半的转录体(transcriptome)由hHFC体细胞的形式转变为一致的似hES的表达形式，并且平均与H1/H9细胞有超过93％(＞93％)的相似度(图5A；实施例8)。体细胞重新编程(SCR)起始的第一征象：全基因组DNA的去甲基化亦能清楚地在这些mirPS-hHFCs中测得，且去甲基化型式亦与H1/H9细胞中的相同(图5B与5C；实施例9)。此外，每一单独的mirPS-hHFC细胞能长成一单一似类胚胎体群落，并且其每周期20～24小时的细胞分裂速率亦符合mir-302的抗增生效应(图3C)。吾人特别注意到这些mirPS-hHFCs为多能的(pluripotent)但非具有肿瘤生成能力(tumoregenetic)，因为这些mirPS-hHFCs只在假性怀孕免疫功能不足的SCID-beige小鼠子宫与腹腔中形成似畸胎瘤组织囊肿。这些似畸胎瘤囊肿包含各种源自三种胚层(embryonic germ layer)：外胚层、中胚层、及内胚层的组织(图5D；实施例10)。另外，当mirPS-hHFCs被异种移植至正常雄性小鼠体内，mirPS-hHFCs则被周围组织同化并与其表达相同的组织标记；这亦表示了将mir-302用于治愈受伤细胞的可能(图4B)。以上发现综合显示mir-302能将体细胞hHFCs重新编程为似hES的iPS细胞(诱导多能干细胞)。Oct3/4与Sox2等转录因子对mir-302的表达而言具重要性(Marson等人，2008；Card等人，2008)，mir-302或许能取代Oct3/4-Sox2来诱导体细胞重新编程(SCR)的发生。

由Mir-302所诱导SCR，其与细胞周期减弱的并行取决于mir-302的浓度。吾人发现当mir-302浓度超过其在人类胚胎干细胞H1/H9中浓度的1.3倍时，这两件事几乎同时发生，因此而指出了此特殊浓度为起始该两事件的最小阈值。先前实验中，使用单一个mir-302成员或者使用相当于H1/H9细胞中的较低浓度的mir-302无法引发前述事件。并且，吾人证实了以较低浓度的5μM多西环素所诱导的mir-302，其浓度无法沉默报告基因的标的位置或是标的的G1检控点调节子。与自然发生相较，桑椹期(morula stage，32～64细胞时期)之前的胚胎细胞常呈现与mirPS细胞的情况相似的非常慢的细胞周期速率。然而，这样的细胞周期调节作用并未在源自囊胚(blastocyst-derived)的hES细胞中发现。由此可推测，hES细胞质中较低浓度的mir-302不足以沉默标的的G1检控点调节子以及致癌基因。这可能也解释了源自囊胚的hES为何具有戏剧性的增生能力以及发展成肿瘤的倾向。因此，本发明可应用于在干细胞治疗中降低hES细胞的肿瘤生成能力(tumorigenecity)。

Mir-302抑制肿瘤生成能力并导致不同肿瘤/癌细胞的细胞凋亡

鉴于mir-302具有导致癌细胞细胞凋亡与细胞周期减弱的功能，吾人接着研究使用mir-302作为普适性人类肿瘤/癌细胞治疗用药的可能性。吾人先前的研究已显示此方式在黑色素瘤(melanoma)及前列腺癌细胞上有可行性(Lin等人，2008)；在目前的研究中，吾人进一步测试其在乳癌细胞MCF7、肝癌细胞Hep G2、以及胚胎性畸胎瘤细胞NTera-2中的可行性。如图6A-B所示，三种肿瘤/癌细胞在以pTet-On-tTS-miR302s载体转染并在10μM多西环素的刺激下，皆被重新编程为休眠mirPS细胞并形成似类胚胎体群落(embryoidbody-like colonoes)。此浓度水平的mir-302在所有三种肿瘤/癌细胞中亦引发显著的细胞凋亡(＞95％)(图1F；实施例6)。以流式细胞仪进一步分析细胞周期各时期的DNA含量之后，结果显示在所有mirPS细胞中有丝分裂的细胞族群显著地减少(图6C；实施例7)。有丝分裂的细胞族群(M期)在mirPS-MCF7细胞中减少了78％：由49％±3％降低至11％±2％；在mirPS-HepG2细胞中减少了63％：由46％±4％降低至17％±2％；在mirPS-NTera2细胞中减少了62％：由50％±6％降低至19％±4％；反之，停滞/休眠的细胞族群(G0/G1期)在mirPS-MCF7、mirPS-HepG2与mirPS-NTera2细胞中分别增加了80％、65％与72％：在mirPS-MCF7细胞中由41％±4％增加至74％±5％，在mirPS-HepG2细胞中由43％±3％增加至71％±4％；在mirPS-NTera2细胞中由40％±7％增加至69％±8％。这些结果指出mir-302能有效地减弱这些肿瘤/癌细胞快速的细胞周期速率，并导致显著的细胞凋亡。

细胞侵犯试验(使用Matrigel小室)以及细胞贴附试验(细胞贴附于人类骨髓内皮细胞(hBMEC)的单细胞层)等体外肿瘤生成能力试验(In vitrotumorigenecity assays)显示mir-302除了抗增生特性以外，再两种抗肿瘤生成的效应。细胞侵犯试验(Cell invasion assay)显示所有三种休眠的mirPS-肿瘤/癌细胞失去其迁移的能力(降低至＜1％)，而原本的肿瘤/癌细胞侵略性地侵入补充有较高营养物的间隔区：在MCF7细胞中占了超过9％±3％、在Hep G2细胞中占了16％±4％、在NTera-2细胞中占了3％±2％的细胞族群(图6D；实施例11)。细胞贴附试验(Cell adhesion assay)亦一致显示该些mirPS-肿瘤/癌细胞不能贴附hBMEC单细胞层，然而原本的MCF7、Hep G2细胞在经过50分钟的培养之后，其中显著的细胞族群(MCF77％±3％、Hep G220％±2％)快速转移至hBMEC单细胞层(图6E；实施例12)。总结来说，迄今所有的发现强烈且一再显示mir-302是一人类肿瘤抑制子，其能减弱快速的细胞生长、导致肿瘤/癌细胞细胞凋亡、以及抑制肿瘤/癌细胞侵入(invasion)及转移(metastasis)。最重要的是，此新颖的mir-302功能可以提供一种能对抗多种人类肿瘤/癌，包括但不限于恶性的皮肤癌(Colo-829)、前列腺癌(PC-3)、乳癌(MCF7)、肝癌(HepG2)、以及以畸胎瘤(NTera-2)中的各不同组织的各种肿瘤的普适性治疗。

Mir-302调解的抗增生功能藉由其对CDK2、细胞周期蛋白-D1/D2、与 BMI-1的共同抑制达成

为确认mir-302与其标的的G1检控点调节子之间实际的交互作用，吾人进行荧光素酶3’非翻译区报告基因(luciferase 3’UTR region reporter)试验(图7A；实施例15)。结果显示以不同浓度的mir-302处理，将对标的的G1检控点调节子，包括细胞周期蛋白依赖性蛋白2(CDK2)、细胞周期蛋白D1/D2(cyclins-D1/D2)、及BMI-1多梳环指致癌基因(BMI1 polycomb ring fingeroncogene)造成很不一样的抑制效应。在10μM多西环素存在下，mir-302有效地与CDK2、cyclins D1/D2、及BMI-1转录物的标的位置结合并且在所有标的中成功地沉默超过80％(＞80％)的报告荧光素酶的表达(图7B；实施例15)。Mir-302在mirPS细胞中对真正的标的基因的抑制作用则藉由蛋白质印迹分析法来确认，其结果与荧光素酶3’非翻译区报告基因试验(图7C；实施例5)的结果一致。相反地，在5μM多西环素诱导下的mir-302，其较少量的mir-302表达，无论对于报告基因的标的位或者对细胞周期蛋白D2以外的标的的G1检控点调节子，皆无法引发任何显著的沉默效应(图7B与7D)。这指出了mir-302表达的剂量相关性(dose-dependent manner)及其基于该剂量性微调细胞周期速率的能力。在哺乳动物细胞周期中，G1-S期的转换正常来说是以两个补偿性细胞周期蛋白-细胞周期蛋白依赖性激酶复合体(cyclin-CDK complexes)：细胞周期蛋白-D-CDK4/6及细胞周期蛋白-E-CDK2所控制(Berthet等人，2006)。吾人则发现高浓度的mir-302通过对CDK2及细胞周期蛋白D 1/D2的共同抑制使两复合体失去活性，于是阻碍两个控制G1-S期转换的路径并减弱重新编程mirPS细胞中的细胞周期速率。在hHFCs及mirPS细胞中，细胞周期蛋白D3有限的表达量使其不足以补偿mirPS细胞中细胞周期蛋白D1/D2的损失。

伴随BMI-1的沉默，吾人进一步侦测到p16Ink4a及p14Arf表达的轻微增加(在hHFCs中上升的百分比分别为63％±17％与57％±13％)，然而没有发现p21Cip1的表达有改变(图7C)。致癌性癌症干细胞(oncogenic cancer stem cell)标记：BMI-1的缺乏，会藉由增强p16Ink4a及p14Arf等肿瘤抑制子的活性，抑制G1-S期转换(Jacobs等人，1999)。在这种情况下，16Ink4a直接抑制依赖细胞周期蛋白-D的CDK4/6(cyclin-D-dependent CDK4/6)磷酸化视网膜母细胞瘤蛋白(retinoblastoma protein，Rb)的活性，于是防止Rb释放进入S期所需的E2F，而进行E2F依赖性转录(E2F-dependent transcription)(parry等人，1995；Quelle等人，1995)。另外，p14Arf防止HDM2与p53结合而允许p53依赖性转录(p53-dependent transcription)，其负责G1期的停滞或细胞凋亡(Kamijo等人，1997)。然而，就目前所知，胚胎干细胞不受细胞周期蛋白-D依赖性CDK(cyclin-D-dependent CDK)的调节(Burdon等人，2002；Jirmanova等人，2002；Stead等人，2002)，因此目前对hES细胞细胞周期调节的认知是为CDK2是发生G1-S期转换的主要决定因素。因此，CDK2的沉默很可能在造成mirPS细胞的G1停滞(G1-arrest)上有最大的影响，而细胞周期蛋白-D与BMI-1的共同抑制以及p16Ink4a及p14Arf的共同活化则附加地抑制肿瘤生成讯号所诱发(tumorigenetic signal-induced)的细胞增生。此外，细胞周期蛋白-D的损失以及p16Ink4a的活化也解释了在胚胎干细胞中依赖细胞周期蛋白-D(细胞周期蛋白-D-dependent)的CDK其活性的缺乏。

因此，微型核糖核酸(miRNA)与标的基因交互作用的严谨度能决定微型核糖核酸真正的功能。依细胞条件不同，微型核糖核酸会表达不同的基因标的偏好。本发明洞悉此重要细节并首次揭示mir-302在人类及小鼠细胞中的功能非常不同。在人类细胞中，mir-302强烈标的CDK2、细胞周期蛋白D1/D2、以及BMI-1，但有趣的是，不包括p21Cip1。与小鼠p21Cip1不同，人类p21Cip1不含任何的mir-302标的位。不同的基因标的导致两者在细胞周期调节上的重要分歧(schism)。在小鼠胚胎干细胞(mES)中，mir-302沉默p21Cip1并且促进类肿瘤(tumor-like)细胞增生(Wang等人，2008；Judson，2009)，然而p21Cip1的表达在人类mirPS细胞中保留下来并导致较慢的细胞增生与较弱的肿瘤生成能力。此外，小鼠的BMI-1也因缺乏适当的标的位而不是mir-302的标的基因。吾人已揭示在mirPS细胞中，人类BMI-1的沉默会轻微刺激p16Ink4a/p14ARF的表达，而减弱细胞增生，反之mir-302无法沉默小鼠BMI-1来引起相同的效应。由于在mirPS细胞中p16Ink4a/p14ARF的表达上升了而p21Cip1不受影响，因此可理解的是人类mirPS细胞中的抗增生及抗肿瘤生成效应最有可能在共同抑制细胞周期蛋白-E-CDK2及细胞周期蛋白-D-CDK4/6路径以外，还通过p16Ink4a-Rb及/或p14/19ARF-p53途径来达成。Mir-302标的人类及小鼠基因偏好的显著区别意味着两者的细胞周期调节机制有根本上的不同。

Mir-302的处理减消超过90％的体内肿瘤细胞的生长并且不改变干细胞的多能性

在确认mir-302的肿瘤抑制功能及其在正常与肿瘤/癌细胞间不同的作用之后，吾人接着试验是否可以mir-302作为一治疗八周大雄性无胸线小鼠(BALB/c-nu/nu品系)体内一NTera2衍生的畸胎瘤的药物(实施例13)。肿瘤Tera-2细胞株(neoplastic Tera-2，NTera-2)是一多能性人类胚胎畸胎癌细胞株(human embryonal teratocarcinoma cell line)，其能在体内分化成多种原始的体细胞组织(primitive somatic tissue)，特别是原始腺组织及原始神经组织(Andrews等人，1984)。由于其多能性，NTera-2衍生的畸胎瘤可作为体内各种肿瘤形式治疗的模型。在药物投递方面，吾人采原位注射(in situ)将以聚乙烯亚胺(polyethylenimine，PEI)配制的pCMV-miR302s表达载体注射到一极接近肿瘤的位置。pCMV-miR302s载体是将由四环霉素所控制的(TRE-controlled)CMV启动子换成一般的CMV启动子而构成(实施例2)；由于DNA甲基化的缘故，pCMV-miR302s在人类细胞中表达的时间持续接近一个月。在注射上限至10μg/g小鼠重(一次注射的最大量)的pCMV-miR302s载体后，吾人观察到小鼠无患病或恶病质(cachexia)的征象，因此证明此方法的安全性。组织学检查亦显示在脑、心、肺、肝、肾、及脾脏中不可测得组织损害(lesion)。

本发明实施例测得以2μg/g小鼠重的pCMV-miR302s载体进行五次处理(相邻处理间隔三天)对畸胎瘤生长具有显著的抑制作用。如图8A(实施例13)所示，以pCMV-miR302s载体处理后，NTera2衍生的畸胎瘤的平均尺寸(11±5mm³，n＝6)与未处理的组(104±23mm³，n＝4)相较之下减少超过89％(＞89％)。相反地，施予相同量的由PEI配制的反义-mir-302d(antisense-mir-302d)表达载体(pCMV-miR302d*)将使畸胎瘤大小增为原来的140％(250±73mm³，n＝3)。基于以上的结果，本发明发现NTera-2细胞表达中等水平的mir-302(图8B)。RNA印迹分析的结果亦显示在这些受到不同处理的畸胎瘤细胞中，mir-302的表达与肿瘤大小(图8B)呈现负相关，亦即，调控mir-302的表达能有效控制体内畸胎瘤的生长。为证实先前在体外(in vitro)的发现，吾人进行蛋白质印迹分析法来确认在处以mir-302处理的畸胎瘤中，G1检控点调节子CDK2-细胞周期蛋白-D1/D2-BMI-1被共同抑制以及核心重新编程因子Oct3/4-Sox2-Nanog的共同活化(图8B)。以免疫组织化学(immunochemical，IHC)染色法分析畸胎瘤组织切片中的该些蛋白质，亦证实了相同的结果(图8C；实施例14)。最值得注意的是，吾人发现mir-302能抑制畸胎瘤细胞生长而不影响其天然的多能分化能力。此亦指出高浓度的mir-302扮演肿瘤抑制者与重新编程因子的双重角色。基于mir-302的双重功能以及从体内与体外(invitro，in vivo)得到的相符合的结果，吾人因此可推论：发现于体外的mir-302抗增生机制可以被应用于抑制体内畸胎瘤生长，因此能作为可针对各种肿瘤的一可能治疗方式。

Mir-302藉由p16Ink4a/p14ARF的活化而非端粒缩短引发细胞老化(cell senescence)

有报告指出，人类诱导式多能干细胞(iPS)会有提早老化与有限扩张的问题(Banito等人，2009；Feng等人，2010)。正常成熟细胞亦进行一有限数量的分裂并最终达到一静止状态(quiescence state)，称为复制性老化(replectivesenescence)。逃避复制性老化的细胞常常变成永生细胞(immortal cells)，像是肿瘤/癌细胞；因此，复制性老化是对抗肿瘤/癌细胞形成的正常防御机制。在本发明中，吾人发现mir-302能直接沉默BMI-1而引发p16Ink4a/p14ART相关的细胞周期调控。其它研究进一步指出BMI-1能活化人类端粒酶反转录酶(human telomerase reverse transcriptase，hTERT)的转录作用，端粒酶的活性因此增加而绕过复制性老化，并且增加细胞寿命(Dimri等人，2002)。由此可见，mir-302的过度表达会导致mirPS细胞的hTERT相关性老化(hTERT-associatedsenescence)。为了厘清这点，吾人进行端粒重复序列扩增试验(telomeric repeatamplification protocol，TRAP)(实施例16)，来测量端粒酶活性。如图9A所示，所有经10μM多西环素处理的mirPS细胞意外地与其原本的肿瘤/癌细胞及hESH1/H9细胞相似，展现强烈的端粒酶活性。此外，蛋白质印迹分析亦显示在这些mirPS细胞中，hTERT表达增加而非减少(图9B)。端粒酶PCR ELISA试验亦证实相对端粒酶活性的增加(图9C)。另外，吾人进一步测得mirPS细胞中赖氨酸特异性组蛋白去甲基酶(lysine-specific histone demethylase AOF2，又名KDM1/LSD1)与组蛋白去乙酰基酶(histone deacetylase HDAC2)的沉默(图9B)。先前的研究指出，AOF2为抑制hTERT转录所需，而AOF2及HDAC2两者的缺乏将引起hTERT过度表达(Won等人，2002；Zhu等人，2008)。吾人在本最近的研究中亦发现AOF2与HDAC2为mir-302的强大标的且在mirPS细胞中皆被沉默了(图10)。因此，mir-302在mirPS细胞中实际上增加mirPS细胞的端粒酶的活性而非引起hTERT相关性老化。然而，hTERT活性增加的效应会被mir-302所引起的BMI-1抑制与p16Ink4a/p14ARF活化所中和，而在mir-302细胞中达到防止肿瘤/癌细胞形成的平衡。

总结来说，本发明使用一具新颖肿瘤抑制功能的mir-302作为癌症治疗药物。吾人发现mir-302介导的细胞周期调控，包含共同抑制G1检控点调节子与活化CDK抑制子之间高度协调的机制。这些基因事件必须同时发生以防止在G1-S行进当中出现任何漏洞。细胞周期中G0/G1期的停滞对体细胞重新编程(SCR)的起始很重要。在该休眠状态，体细胞基因组大量地被去甲基化，并且有超过91％的细胞转录体被重新编程为似hES的基因表达形态。吾人经由破解mir-302与其标的基因之间的交互作用，认识到与mir-302相关的细胞周期调控在SCR期间错综复杂的机制(图11)。吾人先前的研究证实mir-302沉默其标的外源基因调节子(epigenetic regulators)，而活化Oct3/4-Sox2-Nanog的共同表达，这些核心重新编程转录因子接着再引发SCR(Lin等人，2008)。本发明进一步率先揭示mir-302在SCR期间同时沉默CDK2、细胞周期蛋白D1/D2、与BMI-1而减弱细胞分裂。适当控制细胞周期速率对于防止时常在SCR期间活化的致癌基因的肿瘤生成能力具有生物学上的重要性。对此，mir-302在关键时刻沉默CDK2与细胞周期蛋白D1/D2并阻碍G1-S期转换。同时，BMI-1的抑制进一步增强p16Ink4a与p19Arf的肿瘤抑制活性。通过这些细胞周期途径的协同调控，mir-302能起始体细胞重新编程(SCR)的进行而不使细胞恶化成具有肿瘤生成能力(tumorigenecity)。

本发明至少有五项正面突破。第一，一类mir-302基因沉默效应子可取代所有四个核心重新编程转录因子Oct-Sox2-Klf-c-Myc与Oct4-Sox2-Nanog-Lin28以将人类细胞重新编程为似hES干细胞。这些重新编程细胞有助于干细胞疗法。第二，由于类mir-302基因沉默效应子具有小尺寸(含有约23个核糖核苷酸)，因此此小尺寸类mir-302基因沉默效应子的表达载体在结构上可更为紧致而提高体内转染的效率。第三，细胞内的无意义调节的衰败(NMD)系统以及诱导式的表达系统能防止与RNA有关的细胞毒性。第四，mir-302介导的细胞凋亡只发生于肿瘤/癌细胞而不发生于正常人类细胞。最后，本发明使用多聚体(polysomal)、脂质体(liposomal)及电穿孔法转染取代反转录/慢病毒感染，来将表达mir-302的核酸组合物传送至肿瘤/癌细胞中，以确保安全性及类mir-302基因沉默效应子在体外(in vitro)及体内(invivo)治疗上的使用。总而言之，这些突破显示了使用类mir-302基因沉默效应子及表达该类mir-302基因沉默效应子的组合物来治疗肿瘤/癌症的可行性，并且提供了一能发展为普适性癌症药物及/或疫苗的新颖设计。

A.定义

为促进对本发明的了解，以下定义一些术语

核苷酸(Nucleotide)：一单分子的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)，其包含：一糖部份(戊糖pentose)、一磷酸根(phosphate)及一含氮杂环碱基(nitrogenousheterocyclic base)。该碱基经由糖苷碳(glycosidic carbon，该戊糖的1’端碳)与该糖部份链接，且该碱基及糖的组合为一核苷(nucleoside)。于该戊糖的3’或5’位置键结至少一个磷酸的一核苷为一核苷酸(nucleotide)。

寡核苷酸(Oligonucleotide)：包含两个或以上的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)的一个分子，其较佳为超过三个，而通常包含超过十个。确切的长度取决于许多因素，其并且依照该寡核苷酸的最佳功能或用途而定。寡核苷酸可用任何方式生成，包括：化学合成、DNA复制、反转录、或其组合。

核酸(Nucleic Acid)：可为单股或双股的一核苷酸(nucleotide)聚合物。

核苷酶相似物(Nucleotide Analog)：一嘌呤(purine)或嘧啶(pyrimidine)核苷酸，其在结构上A(腺嘌呤)、T(胸腺嘧啶)、G(鸟嘌呤)、C(胞嘧啶)或U(尿嘧啶)核苷酸不同但足够相似，因此可在一核酸分子中取代正常核苷酸。

核酸组合物(Nucleic Acid Composition)：一核酸组合物指多核苷酸(polynucleotide)，如：以单股或双股分子结构的形式存在的脱氧核糖核酸(DNA)或核糖核酸(RNA)。

基因：一核酸，其核苷酸序列针对一RNA及/或一多肽(蛋白质)编码。一基因可以是RNA或DNA。

碱基对(bp)：于一双股DNA分子中的腺嘌呤(adenine，A)与胸腺嘧啶(thymine，T)，或胞嘧啶(cytosine，C)与鸟嘌呤(guanine，G)的配对(partnership)。在RNA中，尿嘧啶(uracil，U)取代胸腺嘧啶(thymine，T)。一般来说，该配对通过氢键(hydrogen bonding)来连接。

前体信使核糖核酸(Precursor messenger RNA，pre-mRNA)：一基因经由一细胞内机制在真核细胞中通过第二型RNA聚合酶(Pol-II)而产生的初级核糖核苷酸转录物(primary ribonucleotide transcript)，其中该机制称为转录(transcription)。一前体信使核糖核酸序列包含：5’非翻译区(5’-end untranslatedregion)、3’非翻译区(3’-end untranslated region)、外显子(exon)及内含子(intron)。

内含子(Intron)：一基因转录物序列的一部分或多个部分，其编码非蛋白质读框。如：同一读框内含子(in-frame intron)、5’非翻译区(5’-UTR)及3’非翻译区(3’-UTR)。

外显子(Exon)：一基因转录物序列的一部分或多个部分，其编码蛋白质读框(cDNA)，如：细胞基因、哺乳动物基因、胚胎干细胞标记基因、荧光蛋白质标记基因、荧光素酶基因、lac-Z乳糖报告基因、病毒基因、跳跃基因、转位子、及其组合的cDNA。

信使核糖核酸(Messenger RNA，mRNA)：由前体信使核糖核酸的外显子组合而成。前体信使核糖核酸在经由核内剪接机制(intranuclear spliceosomalmachineries)移除内含子之后形成，并且在蛋白质合成中作为编码蛋白质的RNA。

互补脱氧核糖核酸(cDNA)：与一mRNA序列互补且不含任何内含子序列的单股脱氧核糖核酸(DNA)。

同义核酸(Sense)：一核酸分子，其序列顺序及组成与同源的mRNA相同。以「+」、「s」或「sense」符号来表示此同义核酸构建体形态。

反义核酸(Antisense)：与各自mRNA分子互补的一核酸分子。以「-」符号来表示此反义核酸构建体形态，或是在DNA或RNA之前加上「a」或「antisense」，例如：「aDNA」或「aRNA」。

5’端(5’-end)：在连续核苷酸的5’端位置缺少一核苷酸的一端。在该连续核苷酸中，一个核苷酸的5’羟基以一磷酸二酯键连接至下一个核苷酸的3’羟基。在该端可以有其它基团，如一或多个磷酸根。

3’端(3’-end)：连续核苷酸的3’端位置缺少一核苷酸的一端。在该连续核苷酸中，一个核苷酸的5’羟基以一磷酸二酯链接连接至下一个核苷酸的3’羟基。在该端可以有其它基团，通常为一氢氧根。

模板(Template)：能以一核酸聚合酶复制的一核酸分子。根据不同的聚合酶，一模板可为单股、双股或部分双股。合成后的复制物与该模板、双股模板中的至少一股、或部分双股模板互补。RNA与DNA皆以由5’往3’的方向合成。一核酸双链体(duplex)的两股总是排列在一起，使得该等两股的5’在该双链体的相对端上(必要的话，该等两股的3’亦然)。

核酸模板(Nucleic Acid Template)：一双股DNA分子、双股RNA分子、杂合分子(如：DNA-RNA或RNA-DNA杂合物)、或单股DNA或RNA分子。

一致性(Conserved)：若一核苷酸序列与一预选(参考)序列的确切互补物非随机地杂合，则两者的序列为一致性。

互补(Complemetary或complementarity或complementation)：为依碱基对原则(base-pairing rule)而产生关联的多核苷酸(即：一序列的核苷酸)。例如：序列「A-G-T」与序列「T-C-A」及「T-C-U」互补。互补可以发生于两股DNA的间、一股DNA与一股RNA之间、或是在两股RNA之间。互补可以是「部分」或「完全」或是「整体」的。当仅一些核酸碱基根据该等碱基对原则相配对，则发生部分互补(partial complementarity或complementation)。当碱基在该等核酸股之间完全相配时，则发生完全或整体互补(Complete or totalcomplementarity or complementation)。在核酸股之间的互补程度对于核酸股之间的杂合效率及强度有重要的影响。此对于扩增(amplification)反应特别重要，且对于依据核酸间的键合(binding)来达成的侦测方法也很重要。互补率(Percent complementarity或complementation)是指在该核酸的一股中失配碱基数与全部碱基数的比。因此，50％的互补率意指一半的碱基失配，而另一半的碱基相配对。即使核酸的两股其碱基数不同，核酸的两股也能互补。在此情况下，互补发生于部分的较长股间，该较长股的部分碱基与较短股的碱基成对。

同源(homologous或homology)：意指一多核苷酸序列，其与一基因或信使核糖核酸(mRNA)序列相似。例如：一核酸序列可能与一特定基因或mRNA序列完全或部分同源。同源也可用相似核苷酸数与全部核苷酸数的比率(百分比)表示。

互补碱基(complemetary base)：当DNA或RNA形成一双股结构时正常配对的核苷酸。

互补核苷酸序列(Complemetary Nucleotide Sequence)：在一单股分子的DNA或RNA中的一核苷酸序列，其与在另一单股上的核苷酸序列充份互补，以致两股之间藉由氢键而专对地杂合。

杂合(Hybridize及Hybridization)：双链体的形成，其为核苷酸序列之间充分地互补并藉由碱基配对形成复合体。当一引物(或剪接模板)与标的(模板)「杂合」，则杂合所形成的复合体(或杂合物，hybrids)为充分地稳定以提供一DNA聚合酶引发DNA合成所需的引物功能。在两条互补多核苷酸之间有一竞争性抑制(competitively inhibited)的专一的(即：非随机)交互作用。

后转录基因沉默(Posttranscriptional Gene Silencing)：一标的基因在mRNA降解或翻译抑制水平剔除(knockout)或减弱(knockdown)的效应，其通常为外来/病毒DNA转基因或小型抑制性RNA任一者所触发。

核糖核酸干扰(RNA interference，RNAi)：一种在真核细胞中的后转录基因沉默机制，其可用小型抑制性RNA分子触发，如：微型核糖核酸(miRNA)、小发夹型核糖核酸(shRNA)及小干扰核糖核酸(siRNA)。该等小RNA分子通常可作为基因沉默子，其干扰细胞内与该等小型RNA完全或部分互补的基因的表达。

非编码核糖核酸(Non-coding RNA)：无法以之用来经由细胞内翻译机制合成肽类或蛋白质的一RNA转录物。

微型核糖核酸(MicroRNA，miRNA)：能够与和该微型核糖核酸(miRNA)部分互补的标的基因转录物结合的单股RNA。MiRNA通常长约17到27个寡核苷酸，并能依照在该miRNA与其标的mRNA之间的互补程度来直接降解细胞内的mRNA标的，或抑制其标的mRNA的蛋白质翻译。几乎在所有的真核细胞中都能发现天然的miRNA，其作用有如对抗病毒感染的防卫物，并且能在动植物发育期间调节基因表达。

前体微型核糖核酸(Pre-miRNA)：似发夹型单股核糖核酸，其包含用来与细胞内RNA内切酶RNaseIII交互作用的干臂(stem-arm)及干环(stem-loop)区域，以产生一或多个微型核糖核酸(miRNAs)。微型核糖核酸可沉默该等微型核糖核酸的标的基因，或与该等微型核糖核酸序列互补的基因。前体微型核糖核酸(pre-miRNA)的干臂区域可形成一完全(100％)或部分(失配)的杂合双链体，而其干环区域连接至该干臂双链体的一端而形成一圆形或一发夹环型环状构建体形态。

小干扰核糖核酸(small interfering RNA，siRNA)：短双股核糖核酸，其为具有约18到25个完全碱基对的核糖核苷酸双链体，并可降解与之几乎完全互补的标的基因转录物。

小发夹型或短发夹型核糖核酸(small hairpin或short hairpin RNA， shRNA)：单股核糖核酸，其包含一对部分或完全相配的干臂核苷酸序列，该序列以一失配寡核苷酸环分隔开而形成一似发夹型结构。许多天然微型核糖核酸(miRNAs)源自似发夹型核糖核酸前体，即：前体微核型糖核酸(pre-miRNA)。

载体(Vector)：能于不同基因环境中移动或滞留的一重组核酸组合物，如：重组DNA(recombinant DNA，rDNA)。一般来说，另外的核酸分子操作性地连结于此。该载体能于一细胞中自动复制，其中该载体及所贴附的片段也会复制。一较佳类型的载体为一游离基因体(episome)，即：可染色体外复制的一核酸分子。较佳的载体为可自动复制及表达的核酸。能引导可编码一或多个多肽及/或非编码(non-coding)RNA的基因的表达的载体在此称为「表达载体(expression vector)」。特别重要的载体能够使用反转录酶(reverse transcriptase)来由mRNAs克隆选殖cDNA。一载体的成份可包含一病毒的启动子、或第二型(Type-II)RNA聚合酶(Pol-II)启动子或两者、Kozak一致性翻译起始位(Kozak consensus translation initiation site)、聚腺苷酸化讯息(polyadenylationsignals)、复数个限制/克隆位(restriction/cloning site)、一pUC复制起始点(pUCorigin of replication)、提供来于复制胜任原核细胞中表达至少一个抗生素抗药性基因的一SV40早期启动子(SV40 early promoter)、一选择性的SV40复制起始点(SV40 origin)以供于哺乳动物细胞中复制、及/或一四环霉素反应元件。

顺反子(Cistron)：在一DNA分子中的一核苷酸序列，其编码一氨基酸残基序列并包含上游及下游的DNA表达控制元件。

启动子(Promoter)：一核酸，其被一聚合酶分子所辨识(或与其结合)并引发合成。针对本发明的目的，一启动子可以是一已知的聚合酶结合位置、一增强子及类似者，以及任何可使用一所需聚合酶来引发合成的序列。

抗体(Antibody)：一肽类或蛋白质分子，其具有一预选的一致范围结构，该结构编码一可结合一预选配位子(ligand)的受体。

初级核糖核酸转录物(Primary RNA Transcript)：一核糖核苷酸序列，其选自信使核糖核酸(mRNA)、核内异质核糖核酸(hnRNA)、核糖体核糖核酸(rRNA)、转运核糖核酸(tRNA)、核仁小核糖核酸(snoRNA)、核内小核糖核酸(snRNA)、前体微型核糖核酸(pre-microRNA)、病毒核糖核酸(viral RNA)及其前体和衍生物。

内含子切除(Intron Excision)：一负责RNA加工、成熟、及降解的细胞机制，包含RNA剪接(RNA splicing)、外体消化(exosome difestion)、无意义调节的衰败过程(nonsense-mediated decay，NMD)，及其组合。

剪接授位(Donor Splice Site)：一核酸序列其包含SEQ.ID.NO.4序列、SEQ.ID.NO.4同源序列，或序列5’-GTAAG-3’。

剪接受位(Acceptor Splice Site)：一核酸序列，其包含SEQ.ID.NO.5序列、SEQ.ID.NO.5同源序列，或序列5’-CTGCAG-3’。

支点基序(Branch Point)：一位于一核酸序列中的腺嘌呤核苷酸，其中该核酸序列包含SEQ.ID.NO.6序列、SEQ.ID.NO.6同源序列，或序列5’-TACTAAC-3’。

多嘧啶段(Poly-Pyrimidine Tract)：一含高比例胸腺嘧啶核苷酸或胞嘧啶核苷酸的核酸序列，该核酸序列包含SEQ.ID.NO.7或SEQ.ID.NO.8序列或其同源序列。

标的细胞(Targeted Cell)：单一或复数个人类细胞，其选自一体细胞、一组织、一干细胞、一生殖细胞、一畸胎瘤细胞、一肿瘤细胞、一癌细胞，及其组合。

癌组织(Cancerous Tissue)：一肿瘤组织，其来自皮肤癌、前列腺癌、乳癌、肝癌、肺癌、脑瘤/癌、淋巴癌、血癌，及其组合。

表达胜任载体(Expression-Competent Vector)：一线型或环型的单股或双股DNA，其选自质粒、病毒载体、转位子、反转位子、DNA转基因、跳跃基因，及其组合。

抗生素抗药性基因(Antibiotic Resistance Gene)：一基因，该基因的表达具有使抗生素降解的能力，该抗生素选自盘尼西林G、安比西林、新霉素、G418、巴龙霉素(paromycin)、卡那霉素、链霉素、红霉素、壮观霉素、磷霉素、四环霉素、利福平、两性霉素B、庆大霉素、氯霉素、头孢霉素、泰乐菌素及其组合。

第二型RNA聚合酶相等物(Type-II RNA Polymerase Equivalent)：一转录机构，其选自第二型(Pol-II)、第三型(Pol-III)、第一型(Pol-I)及病毒RNA聚合酶。

限制/克隆位(Restriction/Cloning Site)：一DNA基序(DNA motif)，其系限制酶切割的位置；该等限制/克隆位包含但不限于AatII，AccI，AlfII/III，AgeI，ApaI/LI，AseI，Asp718I，BamHI，BbeI，BclI/II，BglII，BsmI，Bsp120I，BspHI/LU11I/12I，BsrI/BI/GI，BssHII/SI，BstBI/U1/XI，ClaI，Csp6I，DpnI，DraI/II，EagI，Ecl136II，EcoRI/RII/47III/RV，EheI，FspI，HaeIII，HhaI，HinPI，HindIII，HinfI，HpaI/II，KasI，KpnI，MaeII/III，MfeI，MluI，MscI，MseI，NaeI，NarI，NcoI，NdeI，NgoMI，NotI，NruI，NsiI，PmlI，Ppu10I，PstI，PvuI/II，RsaI，SacI/II，SalI，Sau3AI，SmaI，SnaBI，SphI，SspI，StuI，TaiI，TaqI，XbaI，XhoI，XmaI的切割位置。

基因传送(Gene Delivery)：基因工程方法，其选自多聚体(polysomal)转染、脂质体(liposomal)转染、化学转染、电穿孔法、病毒感染、DNA重组、转位子插入、跳跃基因插入、显微注射、基因枪穿透，及其组合。

基因工程(Genetic Engineering)：DNA重组方法，其选自DNA限制酶反应及接合反应、同源重组、转基因基因并入、转位子插入、跳跃基因插入、反转录病毒感染，及其组合。

细胞周期调节子(Cell Cycle Regulator)：细胞基因，其参与控制细胞分裂及细胞增生的速率，该等基因包含但不限于细胞周期蛋白依赖性激酶2(CDK2)、细胞周期蛋白依赖性激酶4(CDK4)、细胞周期蛋白依赖性激酶6(CDK6)、细胞周期蛋白(cyclins)、BMI-1、p14/p19Arf、p15Ink4b、p16Ink4a、p18Ink4c、p21Cip1/Waf1和p27Kip1，及其组合。

肿瘤抑制(Tumor Suppression)：细胞抗肿瘤及抗癌症的机制，其包含但不限于细胞周期减弱、G0/G1检控点停滞、肿瘤抑制、抗肿瘤生成、癌细胞凋亡，及其组合。

基因沉默效应(Gene Silencing Effect)：一基因功能被抑制后的一细胞反应，其包含但不限于细胞周期减弱、G0/G1检控点停滞、肿瘤抑制、抗肿瘤生成、癌细胞凋亡，及其组合。

B.组合物和方法

关于使用一重组核酸组合物的设计及方法，该重组核酸组合物能被传送至标的人类细胞，并且被转录及加工成为类mir-302基因沉默效应子，其引起细胞中mir-302标的的细胞周期调节子及致癌基因的特定基因的沉默效应；所述方法包含以下步骤：

a)提供一重组核酸组合物，其能被传送，并且被转录及加工为至少一基因沉默效应子，该基因沉默效应子干扰复数个mir-302标的的细胞基因；及

b)以该重组核酸组合物处理一细胞底物。

上述的重组核酸组合物进一步包含：

a)复数个外显子，其中该等外显子可被连结而形成一具有所需功能的一基因转录物；及

b)至少一个内含子，其中该内含子包含一重组mir-302同源物，并可经由细胞内RNA剪接及加工机制切割后而与该等外显子分开。

上述重组基因组合物的内含子进一步包含：

a)用于剪接体结合的一5’剪接授位；

b)与该mir-302家族成员同源的一基因沉默效应子插入子；

c)用于剪接体辨识的一分支点基序；

d)用于剪接体交互作用的一多嘧啶段；

e)用于剪接体结合的一3’剪接受位；及

f)复数个连接子，其用来以一5’至3’方向连接上述每一成分。

较佳地，本发明采用一新颖设计与策略来让类mir-302基因沉默效应子在被转染的细胞中可诱导地或持续地表达。类mir-302基因沉默效应子包含mir-302a、mir-302b、mir-302c、mir-302d，以及他们的似发夹型(hairpin-like)微型核糖核酸前体(pre-miRNAs)和人造重设小发夹型(shRNA)同源物/衍生物，及其组合。Mir-302基因沉默效应子的转录由一持续表达的(即CMV)或以药物诱导的(即TRE-CMV)启动子所驱动。该药物诱导式的重组核酸组合物较佳为一Tet-On载体，其包含一被插入有一重组mir-302家族簇(mir-302s；SEQ.ID.NOs.9-16的杂合物)或一人造重设mi-302shRNA同源物(即SEQ.ID.NOs.17与18的杂合物)的重组转基因。该细胞底物在体外(in vitro)、离体(ex vivo)或体内(in vivo)表达mir-302的标的基因。借着沉默该mir-302标的的细胞周期调节子与致癌基因，本发明能抑制细胞的肿瘤生成能力，以及将被处理的细胞重新编程为非肿瘤/癌细胞。

实施例

以下实施例作为举例说明本发明的某些较佳具体实施例及态样，其不应视为限制本发明的范畴。

在以下揭示的实验文件中，所用的简称如下：M(摩尔，molar)；mM(毫摩尔，millimolar)；μm(微摩尔，micromolar)；mol(摩尔，moles)；pmol(皮摩尔，picomole)；gm(克，grams)；mg(毫克，milligrams)；μg(微克，micrograms)；ng(纳毫微克，nanograms)；L(升，liters)；ml(毫升，milliliters)；μl(微升，microliters)；℃(摄氏度，degrees Centigrade)；cDNA(DNA的拷贝或互补；copyor complementary DNA)；DNA(脱氧核糖核酸，deoxyribonucleic acid)；ssDNA(单股DNA，single stranded DNA)；dsDNA(双股DNA，double-strandedDNA)；dNTP(脱氧核糖核苷三磷酸，deoxyribonucleotide triphosphate)；RNA(核糖核酸，ribonucleic acid)；PBS(磷酸盐缓冲液，phosphate buffered saline)；NaCl(氯化钠，sodium chloride)；HEPES(N-2-羟乙基哌嗪-N-2-乙烷磺酸，N-2-hydroxyethylpiperazine-N-2-ethanesulfonic acid)；HBS(HEPES缓冲液，HEPES buffered saline)；SDS(十二烷基硫酸钠，sodium dodecyl sulfate)；Tris-HCl(三羟甲基胺基甲烷-盐酸盐，tris-hydroxymethyl-aminomethane-hydrochloride)；ATCC(美国菌种保存中心，American TypeCulture Collection，Rockville，MD)；hES(人类胚胎干细胞，human embryonicstem cells)；iPS(诱发型多能性干细胞，induced pluripotent stem cells)；以及SCR(体细胞重新编程，somatic cell reprogramming)。

实施例1

细胞培养与转染

人类癌症细胞株NTera-2、HepG2、MCF7、PC3与Colo829取得自美国菌种培养中心(ATCC，Rockville，MD)；而人类毛囊细胞(hHFCs)则以4mg/ml胶原蛋白酶分解自最少两个毛真皮乳头(hair dermal papillae)，其中胶原蛋白酶的消化环境为在补充有20％胎牛血清(FBS)的新鲜RPMI 1640培养液中作用45分钟。黑色素细胞(melanocytes)则于37℃及5％CO₂下，培养于添加有人类黑色素细胞生长补充剂-2(HMGS-2，Invitrogen，Carlsbad，CA)，并且不含有抗生素的254培养液(Medium 254)中。当细胞生长达70％-80％满盘(confluency)时，则将细胞暴露在胰酶-EDTA溶液1分钟以分离细胞，并以无酚红的DMEM培养液(phenol red-free DMEM medium，Invitrogen)淋洗一次，再将该等分离的细胞以1∶10稀释后于新鲜含HMGS-2补充剂的254培养液中传代培养。关于电穿孔法，将pTet-On-tTS-miR302s(10μg)与pTet-On-Adv-Neo(-)(50μg)的混合物加入到一低渗性缓冲溶液(200μl；Eppendorf，Westbury，NY)中的分离细胞(20,000-50,000)当中，且电穿孔以EppendorfMultiporator在300～400伏特下实行150微秒以将该等载体传送进该等细胞内。经电穿孔后的细胞先于无酚红、含20％血清替代品(Knockoutserum)、1％MEM非必需氨基酸、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、1mM GlutaMax、及1mM丙酮酸钠的DMEM培养液(Invitrogen)中，于37℃及5％CO₂的条件下培养24小时。接着加入850μg/ml G418及大于3.75μg/ml浓度的多四环素(Dox)，每天更新，持续3至5天，直到细胞表达强烈的红色荧光(RGFP)。接下来，以TE200倒置显微镜系统(Nikon，Melville，NY)监测单独的红色荧光细胞(mirPS)，并以MO-188NE 3D显微操作系统(Nikon)将其分别收集至一96孔盘当中。在缺少多西环素的条件下(Dox)，将mirPS细胞培养于一含20％血清替代品(Knockout serum)、1％MEM非必需氨基酸、100μM β-巯基乙醇、1mM GlutaMax、1mM丙酮酸钠、10ng/ml碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、100IU/ml盘尼西林/100μg/ml链霉素/250μg/ml G418、0.1μM A83-01、以及0.1μM丙戊酸(Stemgent，San Diego，CA)的DMEM/F-12培养基，以37℃及5％CO₂的条件培养。另一方面，在多西环素(Dox，3.75-5μg/ml；Sigma-Aldrich，St.Louis，MO)存在下，将mirPS细胞培养于同样的无饲养层(feeder-free)培养条件，并且再另外添加0.05μM GSK抑制剂SB216763(Stemgent)。GSK抑制剂的添加将促进mirPS的增殖但轻微的神经分化倾向。在神经细胞诱导方面，则将mirPS细胞培养于含有0.05μMSB216763、并且不包含多西环素(Dox)的上述无饲养层培养条件。

实施例2

表达mir-302s的重组载体的构筑

Mir-302家族簇(mir-302s)的产生如先前的报导中所描述(Lin等人，2008)。Mir-302s簇含有四个部分，包括mir-302a、mir-302b、mir-302c、与mir-302d的前体微型核糖核酸(pre-miRNAs)。构筑mir-302s簇所用的合成寡核苷酸(Sigma-Genosys，St.Louis，MO)如下方所列。在表达载体的构筑上，吾人混合相等量(1∶1)的mir-302s及一先作好的SpRNAi-RGFP重组基因(Lin等人，2006与2008)，接着以MluI/PvuI限制酶在37℃消化此混合物4小时。接下来以一胶体萃取过滤器(Qiagen，CA)将该消化后的混合物纯化并收集于30μl双蒸水中(ddH₂O)，并且使用T4DNA接合酶(T4 ligase)在8℃作用16小时以接合该混合物。该步骤形成一重组的表达mir-302的SpRNAi-RGFP基因，其能进一步经XhoI/HindIII限制酶切割后，插入到一可以多西环素诱导的pSingle-tTS-shRNA载体(Clontech，Palo Alto，CA)中，而形成一可诱导式的pTet-On-tTS-miR302s表达载体。接着，吾人进一步修改该pTet-On-tTS-miR302s载体，即，用一分离自pTRE-Tight质粒(Clontech)的TRE-CMV启动子取代pTet-On-tTS-miR302s载体原先的U6启动子。为了产生一非诱导式的pCMV-miR302s连续表达载体，吾人以EcoRI限制酶切割该修改后的pTet-On-tTS-miR302s载体，再通过胶体电泳移除tTS-TRE上游序列(1.5kb)，并且自该胶体重新获得该被切割的载体以进行DNA接合(ligation)步骤，完成一非诱导式pCMV-miR302s载体的构筑。

用于mir-302家族前体核糖核酸(pre-miRNA)簇的DNA重组的合成寡核苷酸列于下方：mir-302a-正义，5’-GTCACGCGTT CCCACCACTT AAACGTGGATGTACTTGCTT TGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGGATAGATCTCT C-3’(SEQ.ID.NO.9)；mir-302a-反义，5’-GAGAGATCTATCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT CTTTAGTTTC AAAGCAAGTACATCCACGTT TAAGTGGTGG GAACGCGTGA C-3’(SEQ.ID.NO.10)；mir-302b-正义，5’-ATAGATCTCT CGCTCCCTTC AACTTTAACA TGGAAGTGCTTTCTGTGACT TTGAAAGTAA GTGCTTCCAT GTTTTAGTAG GAGTCGCTCATATGA-3’(SEQ.ID.NO.11)；mir-302b-反义，5’-TCATATGAGC GACTCCTACTAAAACATGGA AGCACTTACT TTCAAAGTCA CAGAAAGCAC TTCCATGTTAAAGTTGAAGG GAGCGAGAGA TCTAT-3’(SEQ.ID.NO.12)；mir-302c-正义，5’-CCATATGGCT ACCTTTGCTT TAACATGGAG GTACCTGCTGTGTGAAACAG AAGTAAGTGC TTCCATGTTT CAGTGGAGGCGTCTAGACAT-3’(SEQ.ID.NO.13)；mir-302c-反义，5’-ATGTCTAGACGCCTCCACTG AAACATGGAA GCACTTACTT CTGTTTCACA CAGCAGGTACCTCCATGTTA AAGCAAAGGT AGCCATATGG-3’(SEQ.ID.NO.14)；mir-302d-正义，5’-CGTCTAGACA TAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCTAAGCCAGGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGCGATCGC AT-3’(SEQ.ID.NO.15)；以及mir-302d-反义，5’-ATGCGATCGC GAACACTCAAACATGGAAGC ACTTAGCCTG GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGTTATGTCTAGA CG-3’(SEQ.ID.NO.16)。另外，吾人使用由合成的miR-302s-正义，5’-GCAGATCTCG AGGTACCGAC GCGTCCTCTT TACTTTAACA TGGAAATTAAGTGCTTCCAT GTTTGAGTGG TGTGGCGCGA TCGATATCTC TAGAGGATCCACATC-3’(SEQ.ID.NO.17)及mir-302s-反义，5’-GATGTGGATC CTCTAGAGATATCGATCGCG CCACACCACT CAAACATGGA AGCACTTAAT TTCCATGTTAAAGTAAAGAG GACGCGTCGG TACCTCGAGA TCTGC-3’(SEQ.ID.NO.18)杂合而成的一人工重设的shRNA，来取代mir-302前体微型核糖核酸(pre-miRNA)簇以进行简易内含子插入。在设计mir-302同源物时，可用胸线嘧啶(T)取代尿嘧啶(U)，反之亦然。所有该等合成序列在进行接合反应(ligation)之前，皆经过聚丙烯酰胺胶体电泳(PAGE)萃取纯化。

重组的mir-302家族的前体微型核糖核酸簇(mir-302s)是连接四个mir-302a-d杂合物而形成的，包括mir-302a-正义与mir-302a-反义，mir-302b-正义与mir-302b-反义，mir-302c-正义与mir-302c-反义，以及mir-302d-正义与mir-302d-反义。该等杂合物mir-302a、mir-302b、mir-302c、以及mir-302d皆分别经由PvuI/XhoI、XhoI/NheI、NheI/XbaI以及XbaI/MluI限制酶消化，再经胶体萃取，然后以过滤管柱(Qiagen，CA)共同收集于35μl的灭菌双蒸水中。接着以T4DNA接合酶(ligase)(Roche，20U)接合该混合的杂合物，使其形成一簇。最后将该mir-302家族的前体微型核糖核酸簇插入到经由PvuI/MluI限制酶线性化的SpRNAi-RGFP重组基因中。另外，可以杂合SEQ.ID.NO.17及SEQ.ID.NO.18，再使用PvuI/MluI限制酶切割该杂合物并将切割后的杂合物插入到以PvuI/MluI线性化的SpRNAi-RGFP中，形成mir-302shRNA。

将DH5α大肠杆菌菌株培养于含有100μg/ml浓度的安比西林(SigmaChemical，St.Louis，MO)的LB培养基中以增殖pTet-On-tTS-miR302s及CMV-miR302s载体。再使用一无内毒素大量质粒萃取试剂盒(Endo-Free Maxi-Prep PlasmidExtraction Kit，Qiagen，CA)分离及纯化增殖后的pTet-On-tTS-miR302s及CMV-miR302s载体。

实施例3

微型核糖核酸(miRNA)微阵列分析

在70％细胞满盘下，使用mirVana^TM微型核糖核酸分离试剂盒(mirVana^TMmiRNA isolation kit，Ambion)自每一细胞培养物中分离小RNAs。使用1％甲醛-琼脂凝胶电泳及光谱仪量测(Bio-Rad)来评估该等分离的小RNAs的纯度及含量，然后立刻以干冰冷冻并送往LC Sciences(San Diego，CA)进行微型核糖核酸微阵列分析。每一微阵列芯片分别与标示以Cy3或Cy5的一单一样本杂合，或是与标示以Cy3与Cy5的一对样本杂合。接着进行背景相减(backgroundsubtraction)与正规化(normalization)。在一双重样本测验方面，执行p值计算，超过3倍的差异表达的转录物显示于一列表。结果如图1C所示。

实施例4

RNA印迹分析法

以mirVana^TM微型核糖核酸分离试剂盒(Ambion，Austin，TX)分离出总体RNAs(10μg)后，再以15％TBE-尿素聚丙烯酰胺凝胶或3.5％低熔点琼脂凝胶电泳分馏该总体RNAs，并将该分馏后的总体RNAs电转印至尼龙膜(nylon membrane)上。接着以[LNA]-DNA探针(5’-[TCACTGAAAC]ATGGAAGCAC TTA-3’)(SEQ.ID.NO.19)侦测mir-302；侦测其它基因的探针则进一步合成，其序列如表1所列。所有的探针经过高效液相层析法(HPLC)纯化并且在[³²P]-dATP(＞3000Ci/mM，Amersham International，ArlingtonHeights，IL)存在下以末端转移酶(terminal transferase，20 units)进行尾端标示。杂合反应于50％的新鲜去离子甲酰胺(freshly deionized formamide，pH 7.0)、5倍Denhardt’s溶液、0.5％SDS、4倍SSPE及250mg/mL的变性鲑鱼精子DNA片段的混合物中进行(18小时，42℃)。接着将膜在2倍SSC、0.1％的SDS中连续清洗两次(15分钟，25℃)，并在0.2倍SSC、0.1％的SDS中清洗一次(45分钟，37℃)，然后进行自动放射显影。结果示于图1D、图4A及8B。

实施例5

蛋白质印迹分析法

如制造商建议，以补充有蛋白酶抑制剂(protease inhibitor)、亮抑酶肽(Leupeptin)、TLCK、TAME及PMSF的CelLytic-M裂解/萃取试剂(CelLytic-Mlysis/extraction reagent，Sigma)溶解细胞(1,000,000)。接着以12,000rpm于4℃离心该裂解液20分钟，然后再取得离心后的上清液。然后以改良过的SOFTmax蛋白质测定软件包在一E-max微量盘测读仪(microplate reader，Molecular Devices，CA)上测量蛋白质浓度。在还原(reducing，+50mM DTT)及非还原(non-reducing，无DTT)的条件下，各将每30μg的细胞裂解后产物加入SDS-PAGE样本缓冲液中，并在装载到6％～8％聚丙烯酰胺凝胶上之前沸腾3分钟。接着以SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳法(SDS-PAGE)解析蛋白质，而后将蛋白质电转印至一硝酸纤维膜上(nitrocellulose membrane)，并将膜于奥德塞阻断试剂(Odyssey blocking reagent；Li-Cor Biosciences，Lincoln，NB)中在室温下培育2小时。然后，在该试剂中加入一初级抗体并在4℃下培育该混合物。使用的初级抗体包括：Oct3/4(Santa Cruz Biotechnology，Santa Cruz，CA)、Sox2(Santa Cruz)、Nanog(Santa Cruz)、Lin28(Abcam Inc.，Cambridge，MA)、UTF1(Abcam)、Klf4(Santa Cruz)、TRP1(Santa Cruz)、keratin 16(Abcam)、CDK2(Santa Cruz)、细胞周期蛋白D1(Santa Cruz)、细胞周期蛋白D2(Abcam)、BMI-1(Santa Cruz)、AOF2(Sigma)、HDAC2(Abcam)、hTERT(SantaCruz)、β-肌动蛋白(Chemicon，Temecula，CA)，以及RGFP(Clontech)。经过一夜后，以TBS-T漂洗该膜三次，然后在室温下将其暴露在山羊抗小鼠IgG(goat anti-mouse IgG)中1小时。该山羊抗小鼠IgG和Alexa Fluor 680反应性染料(1∶2,000；Invitrogen-Molecular Probes)结合形成二级抗体。再经三次TBS-T漂洗后，使用Li-Cor奥德塞红外线影像仪(Li-Cor Odyssey Infrared Imager)及奥德塞软件第10版(Li-Cor)来处理免疫转印的荧光扫描及影像分析。结果如图1D、图4B、图7C-7D、图8B及9B所示。

实施例6

凋亡细胞DNA梯度带试验

依照制造商的建议，使用一凋亡细胞DNA梯度带试剂盒(Apoptotic DNA LadderKit，Roche Biochemicals，Indianapolis，IA)从约2,000,000颗细胞中分离出基因组DNA，然后取2μg分离的DNA，并以2％的琼脂凝胶电泳法进行评估。结果显示于图1F。

实施例7

DNA含量的流式细胞仪分析

将细胞以胰蛋白酶水解、离心成粒状，并将其再悬浮于1ml预冷的含70％甲醇的PBS中，以在-20℃下固定该等细胞1小时。将该等细胞离心成粒状并以1ml的PBS清洗一次。将该等细胞再次离心成粒状并于37℃下再悬浮于1ml含1mg/ml碘化丙啶(propidium iodide，PI)、0.5μg/ml核糖核酸酶(RNase)的PBS溶液中30分钟。然后，在BD FACSCalibur流式细胞仪(San Jose，CA)上分析约15,000个细胞。藉由绘制脉冲宽度对脉冲面积的图并圈选该等单一细胞来排除细胞双连体。使用软件包Flowjo以“Watson Pragmatic”算法来分析所收集的资料。结果如图3A-B、图6A-B及6C所示。

实施例8

全基因组微阵列分析

使用人类基因组GeneChip U133 plus 2.0数组(Affymetrix，Santa Clara，CA)侦测受试细胞中超过47,000个人类基因表达型式的变化。依据制造商的建议，使用mirVana^TM微型核糖核酸分离试剂盒(mirVana^TM miRNA Isolation Kit，Ambion)分离每一受试样本中的总体RNA。分离的RNA的纯度及含量则由1％甲醛-琼脂凝胶电泳及光谱仪量测(Bio-Rad)来评估。使用完全相配探针与失配探针之间总平均的差来将该等样本讯号正规化。之后，使用Affymetrix Microarray Suite 5.0版、ExpressionConsole^TM 1.1.1版(Affymetrix)及Genesprings(Silicon Genetics)软件来分析全基因组基因表达型式的变化。基因表达变化超过一倍被视为阳性分化基因。在基因簇试验(gene clustering)中，搭配使用外挂程序Genetrix(Epicenter Software)与Affymetrix软件。以每一微阵列中的对照组内部管家基因的平均正规化该样本的讯号。结果表示于图5A。

实施例9

DNA去甲基化试验

约2,000,000颗细胞中的基因组DNA以一DNA分离试剂盒(DNA isolationkit，Roche)来分离。取1μg分离的DNA，并根据制造商建议的方式处以二亚硫酸盐(CpGenome DNA modification kit，Chemicon，Temecula，CA)。另一方面，取2μg未处理的DNAs，并以CCGG切割限制酶HpaII来解消，然后再经由1％琼脂凝胶电泳法判别全基因组的去甲基化(图5B)。以二亚硫酸盐处理DNA，会将所有未甲基化的胞嘧啶转变成尿嘧啶，而己甲基化的胞嘧啶则仍维持为胞嘧啶。在二亚硫酸盐DNA定序分析方面，吾人使用聚合酶连锁反应(PCR)扩增Oct3/4及Nanog的启动子区域。扩增Oct3/4启动子区域所使用的引物包含5’-GAGGCTGGAG CAGAAGGATT GCTTTGG-3’(SEQ.ID.NO.20)及5’-CCCTCCTGAC CCATCACCTC CACCACC-3’(SEQ.ID.NO.21)；扩增Nanog启动子区域所使用的引物包含5’-TGGTTAGGTT GGTTTTAAAT TTTTG-3’(SEQ.ID.NO.22)及5’-AACCCACCCT TATAAATTCT CAATTA-3’(SEQ.ID.NO.23)。首先，将二亚硫酸盐修饰后的DNAs(50ng)与该等引物(总共100pmole)混合在1倍PCR缓冲液中，加热至94℃后持续2分钟，然后立即于冰上冷却。其后，进行25个如下的PCR循环：在94℃下进行1分钟，在70℃下进行3分钟，使用一高准确度PCR试剂盒(Expand High Fidelity PCR kit，Roche)进行。扩增反应结束后，进一步地以3％琼脂凝胶电泳法分馏出具有正确长度的DNA扩增产物，接着以胶体萃取试剂盒(Qiagen)纯化该DNA产物，然后进行DNA定序。DNA甲基化位的详细图谱藉由比较在已经过二亚硫酸盐修饰的DNA序列中的未改变的胞嘧啶、与在未经过二亚硫酸盐修饰的DNA序列中的未改变的胞嘧啶来产生。结果如图5C所示。

实施例10

移植与畸胎瘤形成

将大约5-10个衍生自mirPS细胞的类胚胎体(4～8细胞阶段)悬浮于50μl的DMEM培养液与基底膜基质(Matrigel)的2∶1混合液中，接着将该等衍生自mirPS细胞的类胚胎体移植到一六周大雌性假性怀孕免疫功能不足的SCID-beige小鼠的子宫中。产生该假性怀孕小鼠的方法为：在腹膜内注射1IU的人类停经后促性腺激素(human menopausal gonadotrophin，HMG)两天，然后再注射人类绒毛膜性腺激素(human chorionic gonadotrophin，hCG)一天。该细胞及该小鼠在移植前或移植后不以多西环(Dox)处理。在移植期间，使用2.5％的三溴乙醇(Avertin)溶液，以每只小鼠0.4ml的剂量麻醉小鼠。在移植后或者当该移植细胞团发展至超过100mm³大小时，监看该异种皮移植团(Xenografted masses)3至4周。将该囊肿/畸胎瘤切下之后，使用公式：(长×宽²)/2计算其体积，并且对其再进行计数、秤重及进一步的组织学分析。似畸胎瘤组织囊肿的形成(teratoma-like tissue cysts)通常在移植后大约2.5周可观察到。结果如图5D所示。

实施例11

细胞侵犯试验

首先，单独使用200μg/ml Matrigel或使用补充有含20％FBS及1％左旋谷氨酰胺(L-Glutamine)的无酚红DMEM培养液的Matrigel来涂覆插入腔(chamber inserts，孔径12μm，Chemicon)，并且将其置于无菌环境下变干，直到隔天。使用无酚红DMEM培养液收集、淋洗、并再悬浮细胞，以达最终的100,000颗细胞/毫升的细胞密度。取500μl该细胞悬浮液分配到上层腔(topchamber)内，而将1.5ml DMEM条件培养液加入到下层腔当中以制造一趋化梯度(chemotactic gradient)。经过37℃隔夜培养16小时后，接着对侵犯情况进行测量。首先以脱脂棉将上层腔擦干，然后使用100％甲醇固定位在膜下侧的侵犯细胞10分钟、风干，以甲酚紫(cresyl violet)染色20分钟，再和缓地以水清洗。待其变干之后，使用含1∶1100％乙醇及0.2M柠檬酸钠(NaCitrate)的洗液洗提膜上的甲酚紫染色20分钟，并以Precision微量盘测读仪(PrecisionMicroplate Reader，Molecular Dynamics)读取波长570nm的吸光值。表示细胞侵犯率的方式为以受测样本的吸光值对比于不擦干插入腔膜层(总细胞数)之后所得吸光值的百分比。结果表示于图6D。

实施例12

细胞贴附试验

细胞贴附试验的进行如先前报导所描述(Lin等人，2007)。将人类骨髓内皮细胞(hBMECs)以100,000颗细胞/毫升的密度种于96孔盘中，并且在进行试验之前以贴附培养液(adhesion medium)[RPMI 1640/0.1％BSA/20mM HEPES(pH7.4)]淋洗。使用胰蛋白酶(用于肿瘤/癌细胞)或胶原蛋白酶(用于mirPS细胞)将受测细胞分离下来，以无菌生理食盐水淋洗细胞，然后让细胞以1,000,000颗细胞/毫升的密度再悬浮于含有10μM fura-4乙酰氧甲基酯的荧光探针(acetoxymethyl ester，fluorescent probe，Sigma)的PBS中，在37℃的黑暗环境下经过1小时。接着将该细胞离心并以含有1％(v/v)丙璜舒(probenecid，100mM)的无血清的培养液淋洗细胞，然后将该细胞培养于贴附培养液及37℃的黑暗环境20分钟，以活化细胞内的荧光探针。之后，将该100,000颗细胞(在300μl的细胞悬浮液/孔)加入至满盘的(confluent)hBMEC内皮细胞单层上，并在37℃培养50分钟。使用250μl的贴附培养基淋洗两次将未贴附的细胞移走。使用一荧光盘测读仪(fluorescent plate reader，Molecular Dynamics)在37℃以激发波长485nm及发射波长530nm来读取荧光。结果表示于图6E。

实施例13

活体内肿瘤生长试验

吾人将NTera-2细胞(在总体积为100μl的Matrigel-PBS中的2,000,000颗细胞)异种移植到八周大雄性小鼠(BALB/c-nu/nu品系)的胁腹中(即，右后肢)。对该肿瘤进行每周监测，并且在异种移植NTera-2后一周，以原位注射将pCMV-miR302s载体或pCMV-miR302d*载体导入其中。以2μg(每克小鼠重)经由聚乙烯亚胺(PEI)制备的pCMV-miR302s或pCMV-miR302d*载体(总重10μg)，进行五次处理(两次处理之间间隔三天)。依照制造商的使用建议，使用体内-jetPEI传送试剂(Polyplus-transfectionInc.，New York，NY)。在注射完三周后或当未经载体处理的肿瘤生长至大约100mm³的平均大小后始收集样本。主要器官像是血液、脑、心、肺、肝、肾和脾，以及异种移植瘤皆被取出以进行肿瘤的组织学评估及免疫反应细胞毒性测试。其中，以触诊监测肿瘤的形成，并以公式：(长×宽²)/2计算肿瘤体积。此外，亦对肿瘤进行计数、解剖、与秤重，并以苏木紫-伊红染色(H&E)及免疫染色试验进行组织学检验。组织学检验未显示在脑、心、肺、肝、肾和脾中有侦测得到的组织病变。结果显示于图8A。

实施例14

免疫染色试验

将组织样本以4％多聚甲醛(paraformaldehyde)在4℃固定过夜。在将该等样本包埋入石蜡中前，先将该等样本相继地以1倍PBS、甲醇、异丙醇及四氢萘(tetrahydronaphthalene)清洗。接着将包埋后的样本以切片机(microtome)依照7～10μm的厚度切割并固定在干净、以TESPA涂布的载玻片上。然后，以二甲苯(xylene)去除该等玻片的蜡，并使用封片胶(mounting media；RichardAllan Scientific，Kalamazoo，MI)固定于盖玻片下；接着以苏木精(hematoxylin)及曙红(eosin)(H&E，Sigma)染色以进行形态观察。免疫组织化学(IHC)染色试剂盒购自Imgenex(San Diego，CA)。根据制造商的建议实行抗体稀释及免疫染色法的程序。所用的初级抗体包括：Oct3/4(Santa Cruz)，Sox2(Santa Cruz)，Nanog(Santa Cruz)，CDK2(Santa Cruz)，细胞周期蛋白D1(Santa Cruz)，细胞周期蛋白D2(Abcam)，BMI-1(Santa Cruz)，与RGFP(Clontech)。二级抗体则采用生物素键结的山羊抗兔(goat anti-rabbit)或生物素键结的马抗小鼠(horse anti-mouse)抗体(Chemicon，Temecula，CA)。加入作为三级抗体的带有链霉亲合素的辣根过氧化酶(Streptavidin-HRP)。将载玻片以PBT洗过三次之后，接着以DAB底物(DAB substrate)侦测已结合的抗体。在具全场扫描的100倍显微镜下观察到阳性结果，并以一Metamorph影像处理程序(Nikon80i显微镜定量分析系统)在200倍的放大倍率下测量以作定量分析。散布图的结果如图8C所示。

实施例15

荧光素酶3’非翻译区报告基因试验

荧光素酶试验使用一修饰过的pMir-Report miRNA表达报告载体系统(pMir-Report miRNA Expression Reporter Vector system，Ambion)来进行。Mir-302的标的位(正常与/或突变)被插入到pMir-Report Luciferase Reporter报告载体的3’非翻译区(3’-UTR)的克隆位。以12个-CAGT-重复序列分隔开两个合成的标的位。另一个pMir-Repor tβ-gal Control载体则用来作为一无报导(no reporter)对照载体。在有或无多西环素(Dox)处理下，使用FuGene HD试剂(Rche)，依照制造商建议的方式，以200ng的报告载体转染50,000个mirPS细胞。在转染后48小时收集细胞裂解液；荧光素酶的降解程度被正规化(normalize)并以相对荧光素酶活性(relative luciferaseactivity，RLA)来表示；其计算方式为将经过多西环素处理(Dox-on)的mirPS细胞的荧光素酶活性水平除以未经多西环素处理(Dox-off)的mirPS细胞的荧光素酶活性水平。另外，表达mir-434的细胞则经由电穿孔法将pTet-On-tTS-miR434-5p导入hHFCs来产生以作为阴性对照组。结果表示于图7B。

实施例16

端粒重复序列扩增试验

依照制造商提供的建议，使用一补充有蛋白酶抑制剂、亮抑酶肽(Leupeptin)、TLCK、TAME以及PMSF的细胞裂解/萃取试剂(CelLytic-M lysis/extraction reagent，Sigma)溶解约1,000,000颗细胞。以12,000rpm的转速在4℃离心该裂解液20分钟，并收集离心后的裂解液(上清液)。接着以改良过的SOFTmax蛋白质测定软件包在一E-max微量盘测读仪(microplate reader，Molecular Devices，CA)上测量蛋白质浓度。使用一标记有红外荧光染剂(infrared Alexa Fluor 680 dye，TS引物；Sigma-Genosys)的寡核苷酸5′-AATCCGTCGAGCAGAGTT-3′(SEQ.ID.NO.24)以及序列5′-GTGTAACCCTAACCCTAACCC-3′(CX引物；30μM)(SEQ.ID.NO.25)来侦测聚合酶连锁反应(PCR)产物。端粒酶抑制剂被直接加入主要混合液中。对于所有受试细胞株，每反应使用50ng蛋白质可达最佳结果。在30℃下经过30分钟的培育之后，将样本置于聚合酶连锁反应器中加热至94℃持续2分钟，然后进行35个如下的PCR循环：在94℃进行变性反应(denaturation)30秒、在57℃进行合成反应(synthesis)30秒。最后再于57℃进行一单一合成后步骤30秒。接着以6％非变性聚丙烯酰胺凝胶(Nondenaturing polyacrylamide gel)电泳法分馏PCR产物，并使用Li-Cor奥德塞红外线影像仪(Li-Cor Odyssey Infrared Imager)及奥德塞软件第10版(Odyssey Software v.10)(Li-Cor)来进行影像侦测及分析。结果表示于图9A。

实施例17

统计分析

在免疫染色、蛋白质印迹以及RNA印迹的分析上，任何大于75％的讯号强度变化即被视为一阳性结果，该等结果被分析后以平均值±标准差(mean±SE)表示。数据的统计分析以单因子变异数分析(one-way ANOVA)来计算。当主要效应显著时，使用杜纳的事后比较(Dunnett’s post-hoc test)来鉴别与对照组有显著差异的群。在两处理组之间进行配对比较时，使用双尾司徒顿t检验(two-tailed student t test)。对于包含超过两处理组的实验，则在ANOVA后进行一事后多变域测验(post-hoc multiplerange test)。机率值p＜0.05被认为是具有统计上的意义。所有p值由双尾检定来决定。

参考文献

以下参考文献以其全文的形式引入本文作为参考：

1.Lin et al.(2008).Mir-302 reprograms human skin cancer cells into a pluripotentES-cell-like state.RNA 14，2115-2124.

2.Takahashi et al.(2006).Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonicand adult fibroblast cultures by defined factors.Cell 126，663-676.

3.Yu et al.(2007).Induced pluripotent stem cell lines derived from human somaticcells.Science 318，1917-1920.

4.Wernig et al.(2007).In vitro reprogramming of fibroblasts into a pluripotentES-cell-like state.Nature 448，318-324.

5.Wang et al.(2008).Embryonic stem cell-specific microRNAs regulate the G1-Stransition and promote rapid proliferation.Nat.Genet.40，1478-1483.

6.Deng et al.(1995).Mice lacking p21Cip1/Waf undergo normal development，butare defective in G1 checkpoint control.Cell 82，675-684.

7.Yabuta et al.(2007).Lats2 is an essential mitotic regulator required for thecoordination of cell division.J Biol Chem.282，19259-19271.

8.Judson et al.(2009).Embryonic stem cell-specific microRNAs promote inducedpluripotency.Nat Biotechnol.27，459-461.

9.Suh et al.(2004).Human embryonic stem cells express a unique set ofmicroRNAs.Dev.Biol.270，488-498.

10.Tang et al.(2007).Maternal microRNAs are essential for mouse zygoticdevelopment.Genes Dev.21，644-648.

11.Lin et al.(2003).A novel RNA splicing-mediated gene silencing mechanismpotential for genome evolution.Biochem Biophys Res Commun.310，754-760.

12.Lin et al.(2006)Gene silencing in vitro and in vivo using intronic microRNAs.Methods Mol Biol.342，295-312.

13.Grimm et al.(2006).Fatality in mice due to oversaturation of cellularmicroRNA/short hairpin RNA pathways.Nature 441，537-541.

14.Lin et al.(2005).Asymmetry of intronic pre-microRNA structures in functionalRISC assembly.Gene 356，32-38.

15.Marson et al.(2008).Connecting microRNA genes to the core transcriptionalregulatory circuitry of embryonic stem cells.Cell 134，521-533.

16.Card et al.(2008).Oct4/Sox2-regulated miR-302 targets cyclin D1 in humanembryonic stem cells.Mol.Cell Biol.28，6426-6438.

17.Jacobs et al.(1999).The oncogene and Polycomb-group gene bmi-1regulates cellproliferation and senescence through the ink4a locus.Nature 397，164-168.

18.Parry et al.(1995).Lack of cyclin D-Cdk complexes in Rb-negative cellscorrelated with high levels ofp16INK4/MTS1 tumor suppressor gene product.EMBO J.14，503-511.

19.Quelle et al.(1995).Alternative reading frames of the NK4a tumor suppressorgene encode two unrelated proteins capable of inducing cell cycle arrest.Cell 83，993-1000.

20.Kamijo et al.(1997).Tumor suppression at the mouse INK4a locus mediated bythe alternative reading frame product p19ARF.Cell91，649-659.

21.Burdon et al.(2002).Signaling，ceLL cycle and pluripotency in embryonic stemcells.Trends Cell Biol.12，432-438.

22.Jirmanova et al.(2002).Differential contributions of ERK and PI3-kinase to theregulation of cyclin D1 expression and to the control of the G1/S transition in mouseembryonic stem cells.Oncogene 21，5515-5528.

23.Stead et al.(2002).Pluripotent cell division cycles are driven by ectopic Cdk2，cyclin A/E and E2F activities.Oncogene 21，8320-8333.

24.Andrews et al.(1984).Pluripotent embryonal carcinoma clones derived from thehuman teratocarcinoma cell line Tera-2.Differentiation in vivo and in vitro.Lab Invest.50，147-162.

25.Banito et al.(2009).Senescence impairs successful reprogramming to pluripotentstem cells.Gene Dev.23，2134-2139.

26.Feng et al.(2010).Hemangioblastic derivatives from human induced pluripotentstem cells exhibit limited expansion and early senescence.Stem Cell in press.

27.Dimri et al.(2002).The Bmi-1 oncogene induces telomerase activity andimmortalizes human mammary epithelial cells.Cancer Res.62，4736-4745.

28.Won et al.(2002).sp1 and Sp3 recruit histone deacetylase to repress transcriptionof human telomerase reverse transcriptase(hTERT)promoter in normal human somsticcells.J Biol Chem.277，38230-38238.

29.Zhu et al.(2008).Lysine-specific demethylase 1(LSD1)is required for thetranscriptional repression of the telomerase reverse transcriptase(hTERT)gene.PloS One3，e1446.

30.U.S.Pat.No.5,843,780，6,200,806，7,029,913，and 7,220,584 to Thomson.

31.U.S.Pat.No.6,090,622，6,245,566，and 6,331，406 to Gearhart.

32.U.S.Pat.No.6,875,607 to Reubinoff.

33.U.S.Pat.No.7,250,255 to Shinya Yamanaka.

应当理解的是：本文中描述的实施例和实施方式仅仅用于说明的目的，根据它们所做的各种修饰或改变对于本领域的技术人员来说都是能够想到的，并且包含在本发明的所附权利要求的精神和范围内。所有的出版物和专利文献以其全部内容引入本文作为各种目的的参考。

序列表

(1)一般信息：

(iii)序列数：18

(2)SEQ ID NO：1的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：12碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：不是

(iv)反义：不是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：1：

GCTAAGCCAG GC 12

(2)SEQ ID NO：2的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：12碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：不是

(iv)反义：不是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：2：

GCCTGGCTTA GC 12

(2)SEQ ID NO：3的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：17碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：RNA

(iii)假定的：不是

(iv)反义：不是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：3：

UAAGUGCUUC CAUGUUU 17

(2)SEQ ID NO：4的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：8碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：不是

(iv)反义：不是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：4：

GTAAGAGK 8

(2)SEQ ID NO：5的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：10碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：不是

(iv)反义：不是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：5：

GWKSCYRCAG 10

(2)SEQ ID NO：6的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：7碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：不是

(iv)反义：不是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：6：

TACTWAY 7

(2)SEQ ID NO：7的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：17碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：不是

(iv)反义：不是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：7：

TYTYCTTTTT TTTTTTS 17

(2)SEQ ID NO：8的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：19碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：不是

(iv)反义：不是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：8：

TCTCTCTCTC TCTCNCTAG 19

(2)SEQ ID NO：9的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：91碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：9：

GTCACGCGTT CCCACCACTT AAACGTGGAT GTACTTGCTT

TGAAACTAAA GAAGTAAGTG CTTCCATGTT TTGGTGATGG

ATAGATCTCT C 91

(2)SEQ ID NO：10的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：91碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：10：

GAGAGATCTA TCCATCACCA AAACATGGAA GCACTTACTT

CTTTAGTTTC AAAGCAAGTA CATCCACGTT TAAGTGGTGG

GAACGCGTGA C 91

(2)SEQ ID NO：11的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：95碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：11：

ATAGATCTCT CGCTCCCTTC AACTTTAACA TGGAAGTGCT

TTCTGTGACT TTGAAAGTAA GTGCTTCCAT GTTTTAGTAG

GAGTCGCTCA TATGA 95

(2)SEQ ID NO：12的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：95碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：12：

TCATATGAGC GACTCCTACT AAAACATGGA AGCACTTACT

TTCAAAGTCA CAGAAAGCAC TTCCATGTTA AAGTTGAAGG

GAGCGAGAGA TCTAT 95

(2)SEQ ID NO：13的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：90碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ IDNO：13：

CCATATGGCT ACCTTTGCTT TAACATGGAG GTACCTGCTG

TGTGAAACAG AAGTAAGTGC TTCCATGTTT CAGTGGAGGC

GTCTAGACAT 90

(2)SEQ ID NO：14的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：90碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：14：

ATGTCTAGAC GCCTCCACTG AAACATGGAA GCACTTACTT

CTGTTTCACA CAGCAGGTAC CTCCATGTTA AAGCAAAGGT

AGCCATATGG 90

(2)SEQ ID NO：15的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：82碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：15：

CGTCTAGACA TAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCTAA

GCCAGGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TCGCGATCGC AT 82

(2)SEQ ID NO：16的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：82碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：16：

ATGCGATCGC GAACACTCAA ACATGGAAGC ACTTAGCCTG

GCTTAGCTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGT TATGTCTAGA CG 82

(2)SEQ ID NO：17的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：105碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：17：

GCAGATCTCG AGGTACCGAC GCGTCCTCTT TACTTTAACA

TGGAAATTAA GTGCTTCCAT GTTTGAGTGG TGTGGCGCGA

TCGATATCTC TAGAGGATCC ACATC 105

(2)SEQ ID NO：18的信息：

(i)序列特征：

(A)长度：105碱基对

(B)类型：核酸

(C)链型：单链

(D)拓扑结构：线性

(ii)分子类型：其它核酸

(A)描述：/desc＝″合成的″

(iii)假定的：是

(xi)序列描述：SEQ ID NO：18：

GATGTGGATC CTCTAGAGAT ATCGATCGCG CCACACCACT

CAAACATGGA AGCACTTAAT TTCCATGTTA AAGTAAAGAG

GACGCGTCGG TACCTCGAGA TCTGC 105

表格一：实施例4的相关序列

Claims

1.一种使用重组核酸组合物在标的细胞中引发特定的基因沉默效应的方法，其包含下列步骤：

(a)提供该重组核酸组合物，其被传送、被转录及被加工成至少一基因沉默效应子，以干扰复数个mir-302标的的细胞基因；以及

(b)以该重组核酸组合物处理含有该标的细胞并且表达mir-302标的的细胞周期调节子及致癌基因的细胞底物。

2.如权利要求第1项所述的方法，其中该标的细胞包含人类细胞，该人类细胞的分类属于发现于畸胎瘤当中的肿瘤细胞类型。

3.如权利要求第1项所述的方法，其中该标的细胞包含源自癌组织的人类细胞。

4.如权利要求第1项所述的方法，其中该重组核酸组合物包含表达胜任载体。

5.如权利要求第1项所述的方法，其中该重组核酸组合物包含药物诱导式基因表达启动子。

6.如权利要求第5项所述的方法，其中该药物诱导式基因表达启动子受到四环霉素衍生物或同等物的控制。

7.如权利要求第1项所述的方法，其中该重组核酸组合物包含组成型基因表达启动子。

8.如权利要求第7项所述的方法，其中该组成型基因表达启动子受第二型RNA聚合酶或其同等物所驱动。

9.如权利要求第7项所述的方法，其中该组成型基因表达启动子为病毒启动子。

10.如权利要求第1项所述的方法，其中该细胞底物表达复数个mir-302标的的细胞基因。

11.如权利要求第1项所述的方法，其中处理该细胞底物是在mir-302标的的细胞基因受到抑制的条件下进行。

12.如权利要求第1项所述的方法，其中该重组核酸组合物包含5’端剪接供体位、内含子插入位、分支点基序、多嘧啶段，以及3’端剪接受体位。

13.如权利要求第12项所述的方法，其中该内含子插入位包含与mir-302同源的该基因沉默效应子。

14.如权利要求第1项所述的方法，其中该重组核酸组合物进一步包含复数个外显子。

15.如权利要求第1项所述的方法，其中该基因沉默效应子包含与SEQ.ID.NO.1序列或SEQ.ID.NO.2序列同源的序列。

16.如权利要求第1项所述的方法，其中该基因沉默效应子与SEQ.ID.NO.3序列同源或互补，或两者皆是。

17.如权利要求第1项所述的方法，其中该基因沉默效应子由SEQ.ID.NO.9序列、SEQ.ID.NO.10序列、SEQ.ID.NO.11序列、SEQ.ID.NO.12序列、SEQ.ID.NO.13序列、SEQ.ID.NO.14序列、SEQ.ID.NO.15序列，以及SEQ.ID.NO.16序列的杂合物及其组合以接合作用连接而形成。

18.如权利要求第1项所述的方法，其中该基因沉默效应子为由SEQ.ID.NO.17序列与SEQ.ID.NO.18序列的杂合物所形成的重组核酸序列。

19.如权利要求第1项所述的方法，其中该重组核酸组合物经由基因传送方法被传送至该细胞底物中。

20.如权利要求第1项所述的方法，其中该mir-302标的的细胞周期调节子与致癌基因选自CDK2、CDK4、CDK6、细胞周期蛋白D、BMI-1，及其组合。

21.如权利要求第1项所述的方法，其中该特定的基因沉默效应至少包含细胞周期减弱、G0/G1检控点停滞、肿瘤抑制、抗肿瘤生成，以及癌细胞凋亡的其中一项。

22.如权利要求第1项所述的方法，其中该特定的基因沉默效应起因于RNA干扰。

23.如权利要求第1项所述的方法，其中该重组核酸组合物是由基因工程方法产生。