CN103074375A - 一种可诱导慢病毒miRNA表达载体及其构建方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种可诱导慢病毒miRNA表达载体，包含慢病毒转移结构的基因HIV-1RNA包装信号、5’LTR和3’LTR以及四环素反应元件(TRE)和EF-1α启动子。该系统提供了一个能够指导在哺乳动物细胞内合成miRNA的表达载体。载体使用的四环素反应元件(TRE)和EF-1α基因启动子确保该载体在哺乳动物细胞中的高水平表达。载体在无强力霉素(DOX)存在条件下，目的miRNA的表达受抑制，而有Dox存在时，则其被诱导表达。

Description

一种可诱导慢病毒miRNA表达载体及其构建方法

技术领域

本发明属于生物技术及医学领域，具体涉及可诱导慢病毒miRNA表达载体及其构建方法。

技术背景

miRNAs是一种能够调节基因表达长度为21-25个核苷酸的非编码RNA链，具有控制细胞增殖、分化、凋亡、肿瘤形成和药物敏感性等多种细胞功能。众所周知，miRNAs经历过基因扩增、基因删除和表观遗传沉默等基因突变，这些基因突变最终能激活或者灭活疾病基因。在人类多种疾病中，某些miRNAs始终是失调的。这些失调的miRNAs并不局限于特定的疾病类型，而且异常表的miRNAs与临床病情，如肿瘤分期、药物敏感性和病人生存率等相关。此外，最近有研究表明miRNAs有助于细胞转化、肿瘤形成和干细胞维护。最后，miRNAs功能学研究直接观察到特异性miRNAs在体内或者体外具有强大的抗癌活性或致癌活性。由于异常表达的miRNAs在人类疾病的发展中起着关键作用，通过拮抗或者恢复miRNAs的功能来纠正miRNAs的失调和缺陷将会给临床疾病治疗带来巨大的进步。基于miRNA的治疗策略已经成为了一个极具潜力的治疗方法。为了使miRNAs成为有效的治疗方法，它们应该被系统性调控，通过特异且高效的转移系统运送到特定组织，然后被靶细胞摄入胞浆。在胞浆中，它们以完整的形式被细胞使用。miRNAs在哺乳动物细胞系用于短期基因抑制是非常有效的，但是用于转录水平长期稳定的敲除靶基因是有困难的。与其它核苷酸结构类似，miRNAs在临床应用上存在稳定性和转移问题。miRNAs与siRNAs一样，细胞膜穿透能力差、体内稳定性有限和细胞内转移依赖于系统调控。为了使miRNAs从一种实验手段转变成可使病人受益的临床治疗方法，我们需要一种特异性强且有效的基因转移表达系统。

由于慢病毒，如人类免疫缺陷病毒I，能转染分裂细胞或者非分裂细胞并将其DNA整合到宿主细胞基因组中，因而是一种miRNAs治疗的有效运载工具。慢病毒载体通常是通过几种不同的质粒共转染293T人胚胎肾细胞获得的。第一个临床慢病毒载体产物来自双质粒系统。为了进一步改进该系统的生物安全性，慢病毒基因组被分成了4个质粒。这些质粒分别是：自我失活的转移质粒、编码gag-pol蛋白包装质粒、rev质粒和一个可以编码水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包膜糖蛋白质粒。慢病毒载体是将目的基因或者基因沉默序列稳定转移到细胞的最为有效的运载工具。基因转移伴有假构型慢病毒包膜蛋白与靶细胞膜结合和融合。然后，含有miRNAs基因或者基因沉默序列的慢病毒基因组RNA被逆转录成DNA，并以极高的效率与细胞的基因组永久整合。最后，miRNAs基因或者基因沉默序列在细胞内表达，产生细胞在基因水平上永久性改变的预期效果。

严格控制单基因如特异性miRNAs的表达系统将极大的有助于复杂基因环境条件下如哺乳动物细胞miRNAs功能的研究。理想情况下，这样一个系统不仅可以介导miRNAs表达活性的“开关”状态，还可以介导在设定阈值水平下允许其有限的表达。

发明内容

本发明的任务是提供一种可诱导慢病毒miRNA表达载体及其构建方法。

实现本发明的技术方案是：本发明提供的这种可诱导慢病毒miRNA表达载体，包含慢病毒转移结构的基因HIV-1RNA包装信号、5’LTR和3’LTR以及四环素反应元件(TRE)和EF-1α启动子，见图1。本发明方案提供的生产细胞可以是293T肾上皮细胞系、CHO中国仓鼠卵巢细胞、COS非洲猴肾细胞系、HepG2人肝癌细胞系、BHK叙利亚仓鼠肾细胞系、Sf9昆虫卵巢细胞系、Sf21昆虫卵巢细胞系、293人胚肾脏细胞、HEK 293人胚肾细胞系、SODk0、NIH-3T3鼠成纤维细胞系、Vero非洲绿猴肾细胞或PerC6人胚肾脏细胞。本发明可诱导表达的基因是miRNA的RNAs。本发明使用的慢病毒基因表达载体是第三代慢病毒基因转移表达载体，即将整个慢病毒基因组分成四个质粒：自我失活的转移质粒、编码gag-pol蛋白包装质粒、rev质粒和一个可以编码水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包膜糖蛋白质粒，miRNA的表达具有稳定和可遗传性，诱导慢病毒miRNA表达载体常用于构建动物模型，如转基因鼠。

本发明提供的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法包括以下步骤：

(1)构建pCR2.1-EF-α克隆载体和pCR2.1-TRE克隆载体，具体步骤是：

①根据载体pTRE2hyg(BD Life Science)序列(见图.2)，设计TRE序列的PCR引物，上游引物为5’-ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3’，含有Agel酶切位点；下游引物5’-ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有Mlul酶切位点；

②Clal酶切割pTRE2hyg载体(见图3)，用步骤1所述引物PCR扩增TRE序列；(见图4，5)

③采用克隆TA cloning试剂盒，用T4连接酶将PCR产物TRE序列与线性化的pCR2.1载体连接；(见图6.7)

④将步骤3所得到产物pCR2.1-TRE载体转化感受态大肠杆菌DH51，筛选阳性克隆；

⑤扩增质粒，酶切鉴定；

⑥酶切鉴定正确后，送公司测序；

⑦根据pEP-miR载体(Cell Biolabs，Inc)序列(见图.8)，设计EF-α启动子PCR引物，上游5’-ACGCGTGATGCCTCCCCG-3’，含有Mlul酶切位点；下游5’-GTCGACACCCGTTGCGAAA-3’，含有scall酶切位点，然后用PCR扩增EF-α启动子序列，按上述步骤3-6，获得pCR2.1-EF-1α载体。(见图9-13)

(2)构建pLKO.1-TRE-EF-α-MCS-puro表达载体，具体步骤是：

①将双酶切法将TRE与EF-α序列从所构建的pCR2.1-TRE载体和pCR2.1-EF-α载体切下来；(图14，15)

②用Agel和Mlul两个酶切位点切切割pLKO.1-puro(见图16)，并将TRE序列与pLKO.1-puro连接，得到pLKO.1-TRE-puro；(见图17)；

③将步骤2得到的pLKO.1-TRE-MCS-puro，经Mlul和Sal酶切，并与扩增EF-α启动子序列连接，得到pLKO.1-TRE-EF-α-MCS-puro；(图.18)

④将步骤3所得产物pLKO.1-TRE-EF-α-puro转化感受态大肠杆菌DH51，双酶切鉴定；

⑤扩增质粒，酶切鉴定；

⑥送公司测序。

(3)构建EGFP表达载体，具体步骤是：

①根据pEGFP-N1载体(BD Life Science)(见图.19)，设计EGFP序列引物，5’-GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3’，含有Scall酶切位点；下游5’CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位点Xho l；

②PCR扩增EGFP序列；(见图20)

③将步骤2所得到得EGFP序列(图21)，经双酶切后，与pLKO.1连接；(见图.22)

④将步骤3所得到产物pCR2.1-TRE载体转化感受态大肠杆菌DH51，筛选阳性克隆；

⑤扩增质粒，酶切鉴定；

⑥送公司测序。

以慢病毒为基础的基因治疗代表着最新一代强大的、多用途载体，可以将不同的基因转移入几乎所有的哺乳动物细胞，包括原代培养细胞、非分裂细胞、肿瘤细胞和干细胞。依据本发明，构建可诱导表达系统可以调节miRNAs在哺乳动物细胞里的表达。在本系统中，miRNAs的表达受四环素反应元件和EF-1α启动子的控制。上述miRNAs表达系统与Tet-On细胞系联合后可以调节miRNAs在哺乳动物细胞中高水平表达。加入强力霉素后，上述表达系统被激活。miRNAs的表达水平受不同强力霉素浓度的严格调控。由于可诱导慢病毒miRNAs表达系统能够有效地将miRNA表达的结构基因有选择性地整合入细胞基因组DNA，因而该系统可以为建立稳定细胞系或者转基因动物提供方便而有效的方法。实验主要分析细胞或者转基因动物是否能永久地维持和继承这种受严格调控的表型。

本发明具体技术方案包括：

1.构建可诱导慢病毒miRNAs表达载体：所有用于构建哺乳动物细胞可诱导慢病毒miRNAs表达载体的必需元件都被亚克隆入pLKO.1puro载体(Sigma-Aldrich)。供载体还包含受人hPGK启动子调控的嘌呤霉素抗性基因。从pEP-miR载体(Cell Biolabs，Inc)上扩增人EF-1α基因启动子。四环素反应元件来自pTRE2hyg载体(BD Life Science)。所有的PCR扩增片段通过TA Cloning试剂盒(Invitrogen)克隆入pCR2.1载体。随后，EF-1α基因启动子和四环素反应元件通过测序加以确认。然后，EF-1α基因启动子和四环素反应元件用限制性内切酶从pCR2.1载体上切割下来并连接到用相应限制性内切酶消化的pLKO.1puro载体上。EF-1α基因启动子、四环素反应元件和引导序列再次测序确认，最后获得可诱导慢病毒表达系统(强力霉素诱导miRNA表达)。上述表达系统包含四环素反应元件(TRE)，该元件由7个42bp的Tet操纵序列(TetO)构成的直接重复序列组成。TRE元件位于EF-1α基因启动子上游。因此，在无rtTA结合到TRE上时EF-1α基因启动子处于沉默状态，从而阻止了miRNA的“泄露”表达。

2.慢病毒的制备：在转染前24h，将293T细胞置于孔板内培养。细胞用含10％胎牛血清的RPMI1640培养。细胞在无血清培养基或含血清的DMEM或者RPMI培养基中进行转染，感染复数为50-1000pfu/cell。在37度，无血清培养基中孵育4小时或在含血清的DMEM或RPMI培养基中孵育18小时。然后，清洗细胞并更换培养基。转染后48小时，收集含病毒的细胞上清液，然后在室温下，1500rmp离心10min。此外，用来自VSV-G的包膜糖蛋白G修饰慢病毒可以扩大慢病毒转染哺乳动物宿主细胞的范围。

3.慢病毒滴度测定：通过p24抗原ELISA实验测定慢病毒转染颗粒的滴度，并通过换算因数将p24的pg/ml换算成TU/ml(transducing unit per ml)。而且，慢病毒的转染单位(TU/ml)是通过分析可转染KHOS细胞的慢病毒颗粒数量来确定的。滴度计算方法参考Follenzi和Naldini，2002。

U-2OS Tet-On cell Iine：U-2OS骨肉瘤细胞系是一种稳定转染pTet-On质粒的细胞系。pTet-On在强大的巨细胞病毒立早启动子(Pcmv)的控制下表达Tet反应性反式转录激活因子(rtTA)。tTA是由Tet抑制蛋白的第1-207个氨基酸和单纯疱疹病毒VP16的C末端带负电荷的转录激活结构域(130氨基酸)融合而成。pTet-On系统类似于pTet-Off系统，但由于TetR中4个氨基酸的突变而转变成rTetR，相应的tTA转变成了rtTA。在一个由TRE调控的基因载体转染pTet-On细胞系后，在强力霉素(Dox)存在的情况下rtTA就结合到TRE上，从而激活基因转录。当DOX从培养基中去除时，TRE调控的基因转录以高度剂量依赖性的方式被关闭。

4.构建EGFP表达载体：为了使诱导慢病毒载体表达EGFP，该基因编码序列从pEGFP-N1载体(BD Life Science)上克隆下来并插入pKLO.1载体中。在pTet-On系统中，EGFP的表达受rtTA调节。

5.miRNA的长期表达：U-2OS Tet-On细胞(5×10³/ml)接种于96孔板，次日用含miRNA-199a-3p编码序列的慢病毒转染细胞，并将细胞在含强力霉素的培养基中培养至6周。miRNA-199a-3p的表达用miRNA Real-time PCR(Applied Biosystem)每周监测一次。作为对照组，U-2OS Tet-On细胞用表达GFP的pKLO.1-puro-CMV-TurboGFP载体转染，其表达的监测方法同实验组。

6.统计分析：用GraphPadPrism 4软件进行统计学分析。(GraphPad SoftwareInc.，San Diego，Calif.，USA)

可诱导慢病毒miRNA表达系统的优势：1.极其严格的开关调控。该表达系统在无诱导剂的情况下，目的miRNA的背景或者泄露表达是极其低的。2.专一性。原核调节蛋白(rtTA)引进哺乳动物细胞后，只对其特异的靶序列产生作用，其原因很有可能是在真核生物基因组中不存在其调节的DNA序列。3.高度可诱导性和快速反应时间。在Tet系统下，诱导反应在30min就可以检测到。据观察，诱导表达水平可以高达原有水平的1000倍。4.特性明确的诱导剂。强力霉素价格低廉、性质明确，可以产生高度可重复性的实验结果。5.EF-1α启动子伴有限制性酶切位点，便于寡核苷酸的插入。6.该表达系统易于有效转染分裂和静止期的哺乳动物细胞，包括一些难以转染的细胞，如原代细胞、干细胞、神经细胞和内皮细胞。此外，可诱导慢病毒miRNA表达载体可以用构建miRNA过表达的动物模型，如转基因鼠。

本发明的有效效果及特点：1.表达包含原始所有序列的miRNA前体转录本，并在严格的调控机制的控制下确保该前体转录本通过内源性机制加工处理后得到真正成熟的miRNAs。2.基于可诱导慢病毒的表达系统确保了miRNA在广泛的细胞系包括非分裂细胞和难转染细胞中的表达。3.以复制缺陷型HIV和FIV为基础的慢病毒表达系统的生物安全性较高。4.通过共表达EFGP荧光标记蛋白可以监测转染细胞。通过嘌呤霉素筛选标记可以筛选稳定表达miRNA的阳性细胞。

本发明潜在应用方向包括：1.通过miRNA在细胞中的高表达来研究miRNA的功能。2.采用慢病毒表达系统，在原代细胞、肿瘤细胞、干细胞和非分裂细胞中表达miRNA。3.制备稳定表达miRNA的细胞系来研究细胞传道通路和寻找miRNA调节的靶基因。4.miRNA靶向基因治疗的临床试验

附图说明

图1.pKLO.1-TRE-EF-1α载体示意图；图2.pPTREhyg载体结构示意图；图3.ClaI内切酶线性化pPTREhyg载体；图4.酶切后线性化的pPTREhyg载体；图5.PCR引物扩增TRE序列；图6.PCR克隆得到的TRE序列；图7.TRE序列插入pCR2.1载体；图8.pEP-miR结构示意图；图9.BamHI酶切pEP-miR；图10.BamHI线性化后的pEP-miR载体；图11.PCR引物扩曾EF-α序列；图12.PCR扩增得到的EF-α序列；图13.EF-α序列插入pCR2.1载体；图14.Agel和MluI双酶切切下TRE序列；图15.MluI和Sal双酶切下EF-α序列；图16.PLKO.1载体示意图；图17.TRE序列和EF-α序列插入pKLO.1载体；图18为图17连续图；图19.pEGFP-N1载体结构示意图；图20.PCR扩增EGFP基因；图21.EPGF扩增序列；图22.EGFP载体构建流程图；图23.pKLO.1-TRE-EF-1α-miRNA-Puro构建流程图；图24.病毒包装过程流程图；图25.miRNA-199a-3p的表达量。

具体实施方式

实施例1：构建可诱导慢病毒miRNA表达载体

一、实验材料：pTRE2hyg(BD Life Science)，TA cloning试剂盒(Invitrogen)，pEP-miR载体(Cell Biolabs公司)pLKO.1载体(Sigma-Aldrich公司)，pEGFP-N1载体(BD LifeScience公司)，琼脂糖(生命公司)，内切酶(NEB公司)。

二、构建可诱导慢病毒miRNA表达载体：

(一)构建pCR2.1-EF-α克隆载体和pCR2.1-TRE克隆载体

①根据载体pTRE2hyg(BD Life Science)序列，见图2，设计TRE序列的PCR引物，上游引物为5’-ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3’，含有Agel酶切位点；下游引物5’-ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有Mlul酶切位点。

②Clal酶切割pTRE2hyg载体，见图3，用步骤1所述引物PCR扩增TRE序列，见图4和5。

③采用克隆TA cloning试剂盒，用T4连接酶将PCR产物TRE序列与线性化的pCR2.1载体连接，见图6和7。

④将步骤3所得到产物pCR2.1-TRE载体转化感受态大肠杆菌DH51，筛选阳性克隆。

⑤扩增质粒，酶切鉴定。

⑥酶切鉴定正确后，送公司测序。

⑦根据pEP-miR载体(Cell Biolabs，Inc)序列，见图8，设计EF-α启动子PCR引物，上游5’-ACGCGTGATGCCTCCCCG-3’，含有Mlul酶切位点；下游5’

-GTCGACACCCGTTGCGAAA-3’，含有scall酶切位点。然后用PCR扩增EF-α启动子序列，按上述步骤3-6，获得pCR2.1-EF-1α载体，见图9-13。

(二)构建pLKO.1-TRE-EF-α-MCS-puro表达载体

①将双酶切法将TRE与EF-α序列从所构建的pCR2.1-TRE载体和pCR2.1-EF-α载体切下来，图14，15。

②用Agel和Mlul两个酶切位点切切割pLKO.1-puro，见图16，并将TRE序列与pLKO.1-puro连接，得到pLKO.1-TRE-puro。见图17。

③将步骤2得到的pLKO.1-TRE-MCS-puro，经Mlul和Sal酶切，并与扩增EF-α启动子序列连接，得到pLKO.1-TRE-EF-α-MCS-puro，见图18。

④将步骤3所得产物pLKO.1-TRE-EF-α-puro转化感受态大肠杆菌DH51，双酶切鉴定

⑤扩增质粒，酶切鉴定。

⑥测序。

(三)构建EGFP表达载体

①根据pEGFP-N1载体(BD Life Science)，见图.19，设计EGFP序列引物，5’-GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3’，含有Scall酶切位点；下游5’CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位点Xhol。

②PCR扩增EGFP序列，见图20。

③将步骤2所得到得EGFP序列，见图21，经双酶切后，与pLKO.1连接，见图22。

④将步骤3所得到产物pCR2.1-TRE载体转化感受态大肠杆菌DH51，筛选阳性克隆。

⑤扩增质粒，酶切鉴定.

⑥送公司测序。

(四)构建pLKO.1-TRE-EF-α-mi RNA199a-3p-puro表达载体(见图23)

①.通过查阅文献获得miRNA-199a-3p茎环结构，

5’-GCCAACCCAGUGUUCAGACUACCUGUUCAGGAGGCUCUCAAUGUGUACAGUAGUCUGCACAUUGGUUAGGC-3’并送公司合成。

②退火使得包含目的miRNA表达序列寡核苷酸的前向和反向链分开。

③用BamHl和Clal两个酶切位点相对应的内切酶线性化慢病毒miRNA表达载体。

④将退火的寡核苷酸片段连接到慢病毒载体上

⑤将载体转入细菌后筛选阳性克隆。

⑥测序确认，载体构建成功

实施例2：实施例1构建的可诱导慢病毒miRNA表达载体在细胞内表达实验

实验材料：miRNA-199a-3P(invitrogen公司)，Lenti-X HT Packaging Mix试剂盒(clontech公司)，QuickTiter^TM HIV Lentivirus  Quantitation试剂盒(Cell Biolabs公司)，U-2OS Tet-On cell line细胞，PCR引物(invitrogen公司)琼脂糖(生命公司)，内切酶(NEB公司)。

慢病毒包装：

1.慢病毒载体质粒pLKO.1-TRE-EF-α-miRNA-199a-3p-puro和Lenti-X HTPackaging Mix按一定比例转染293T细胞系(实验步骤参照Lenti-X HT Packaging Mix试剂盒说明书)，(见图24)。

2.收集慢病毒，用QuickTiter^TM HIV Lentivirus Quantitation试剂盒(Cell Biolabs公司)。

p24ELISA并确定其效价和TU/ml。病毒滴度可获得高达5×10⁸TU/ml。

U-2OS Tet-On cell line转染：

1.将构建的重组慢病毒转入U-2OS Tet-On cell line细胞系，实验设置3组，空白对照组，不做任何处理；阴性对照组，给予空载体；阳性对照组，给予pLKO.1-TRE-EF-α-miRNA-199a-3p-puro。

2.用四环素处理细胞，诱导miRNA的表达。

用Real-time PCR确定miRNA的表达：

miRNA-199a-3p反转录引物和定量PCR由introvigen公司合成，提取细胞内RNA后先合成cDNA第一链，在以该链和PCR引物，进行PCR反应，反应条件为：95℃1min变性，9515s，6020s，7015s，42次循环。最后，以U6为内参，进行数据分析。

实验数据分析

阳性对照组的miRNA表显著高于阴性对照组和空白组，因此该载体pLKO.1-TRE-EF-α-miRNA-puro构建有效。(见图25)

以下为本专利申请的序列表，序列表中各序列依次为：序列1：TRE序列的PCR上游引物；序列2：TRE序列的PCR下游引物；序列3：EF-α启动子PCR上游引物；序列4：EF-α启动子PCR下游引物；序列5：EGFP序列PCR上游引物；序列6：EGFP序列PCR下游引物’；序列7：miRNA-199a-3p茎环结构；序列8：TRE序列：序列9：EF-1α序列；序列10：PCR克隆得到的TRE序列；序列11：PCR扩增得到的EF-α序列；序列12：EPGF扩增序列。

序列表

<110>华中科技大学同济医学院附属协和医院

<120>一种可诱导慢病毒miRNA表达载体及其构建方法

<160>12

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>1

accggtagac gctgtcgaa    19

<210>2

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>2

acgcgtagca accaggtgt    19

<210>3

<211>18

<212>DNA

<213>人工序列

<400>3

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<210>4

<211>19

<212>DNA

<213>人工序列

<400>4

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<210>5

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>5

gtcgacgcag ggcaataatg at    22

<210>6

<211>22

<212>DNA

<213>人工序列

<400>6

ctcgagcggc gggtcttgta gt    22

<210>7

<211>71

<212>RNA

<213>人工序列

<400>7

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<210>8

<211>313

<212>DNA

<213>人工序列

<400>8

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<210>9

<211>406

<212>DNA

<213>人工序列

<400>9

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<210>10

<211>351

<212>DNA

<213>人工序列

<400>10

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<210>11

<211>426

<212>DNA

<213>人工序列

<400>11

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gtcgac                                                               426

<210>12

<211>745

<212>DNA

<213>人工序列

<400>12

gtcgacgcag ggcaataatg atacaatgta tcatgcctct ttgcaccatt ctaaagaata    60

acagtgataa tttctgggtt aaggcaatag ccgattagtt ctcgaggatc cgactgaagt    120

cgctagctcg agcttttgga gaatatttct gcatataaat atttctgcat ataaattgta    180

actgatgtaa gaggtttcat attgctaata gcagctacaa tccagctacc attctgcttt    240

tattttatgg ttgggataag gctggattat tctgagtcca agctaggccc ttttgctaat    300

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ggcccatcac tttggcaaag cacgtgagat ctgaattctg acacaccatg gtgagcaagg    420

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gccacaagtt cagcgtgtcc ggcgagggcg agggcgatgc cacctacggc aagctgaccc    540

tgaagttcat ctgcaccacc ggcaagctgc ccgtgccctg gcccaccctc gtgaccaccc    600

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tcaagtccgc catgcccgaa ggctacgtcc aggagcgcac catcttcttc aaggacgacg    720

gcaactacaa gacccgccgc tcgag                                          745

Claims (6)

1.一种可诱导慢病毒miRNA表达载体，其特征在于：该载体包含慢病毒转移结构的基因HIV-1RNA包装信号、5’LTR和3’LTR以及四环素反应元件(TRE)和EF-1α启动子。

2.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法，其特征在于：生产细胞是293T肾上皮细胞系、CHO中国仓鼠卵巢细胞、COS非洲猴肾细胞系、HepG2人肝癌细胞系、BHK叙利亚仓鼠肾细胞系、Sf9昆虫卵巢细胞系、Sf21昆虫卵巢细胞系、293人胚肾脏细胞、HEK 293人胚肾细胞系、SODk0、NIH-3T3鼠成纤维细胞系、Vero非洲绿猴肾细胞或PerC6人胚肾脏细胞。

3.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法，其特征在于：可诱导表达的基因是miRNA的RNAs。

4.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法，其特征在于：慢病毒基因表达载体是第三代慢病毒基因转移表达载体即将整个慢病毒基因组分成四个质粒：自我失活的转移质粒、编码gag-pol蛋白包装质粒、rev质粒和一个可以编码水泡型口炎病毒G蛋白(VSV-G)的包膜糖蛋白质粒。

5.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法，其特征在于：miRNA的表达具有稳定和可遗传性，诱导慢病毒miRNA表达载体常用于构建动物模型，如转基因鼠。

6.根据权利要求1所述的可诱导慢病毒miRNA表达载体构建方法如下：

(1)构建pCR2.1-EF-α克隆载体和pCR2.1-TRE克隆载体，具体步包括：

①根据载体pTRE2hyg(BD Life Science)序列，设计TRE序列的PCR引物，上游引物为5’-ACCGGTAGACGCTGTCGAA-3’，含有Agel酶切位点；下游引物5’-ACGCGTAGCAACCAGGTGT-3’，含有Mlul酶切位点；

②Clal酶切割pTRE2hyg载体，用步骤1所述引物PCR扩增TRE序列；

③采用克隆TA cloning试剂盒，用T4连接酶将PCR产物TRE序列与线性化的pCR2.1载体连接；

④将步骤3所得到产物pCR2.1-TRE载体转化感受态大肠杆菌DH51，筛选阳性克隆；

⑤扩增质粒，酶切鉴定；

⑥酶切鉴定正确后，送公司测序；

⑦根据pEP-miR载体(Cell Biolabs，Inc)序列，设计EF-α启动子PCR引物，上游5’-ACGCGTGATGCCTCCCCG-3’，含有Mlul酶切位点；下游5’-GTCGACACCCGTTGCGAAA-3’，含有scall酶切位点，然后用PCR扩增EF-α启动子序列，按上述步骤3-6，获得pCR2.1-EF-1α载体；

(2)构建pLKO.1-TRE-EF-α-MCS-puro表达载体，具体步包括：

①将双酶切法将TRE与EF-α序列从所构建的pCR2.1-TRE载体和pCR2.1-EF-α载体切下来；

②用Agel和Mlul两个酶切位点切切割pLKO.1-puro，并将TRE序列与pLKO.1-puro连接，得到pLKO.1-TRE-puro；

③将步骤2得到的pLKO.1-TRE-MCS-puro，经Mlul和Sal酶切，并与扩增EF-α启动子序列连接，得到pLKO.1-TRE-EF-α-MCS-puro；

④将步骤3所得产物pLKO.1-TRE-EF-α-puro转化感受态大肠杆菌DH51，双酶切鉴定；

⑤扩增质粒，酶切鉴定；

⑥测序。

(3)构建EGFP表达载体，具体步包括：

①根据pEGFP-N1载体(BD Life Science)，设计EGFP序列引物，5’-GTCGACGCAGGGCAATAATGAT-3’，含有Scall酶切位点；下游5’CTCGAGCGGCGGGTCTTGTAGT-3’，含有酶切位点Xhol；

②PCR扩增EGFP序列；

③将步骤2所得到得EGFP序列，经双酶切后，与pLKO.1连接；

④将步骤3所得到产物pCR2.1-TRE载体转化感受态大肠杆菌DH51，筛选阳性克隆；

⑤扩增质粒，酶切鉴定；

⑥测序。

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